universidade federal dos vales do jequitinhonha e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal

Yrllan Ribeiro Sincurá

AÇÃO INSETICIDA DE EXTRATOS DE FOLHAS E CASCAS DE Protium

heptaphyllum (AUBL.) MARCHAND (BURSERACEAE) SOBRE Lutzomyia longipalpis

(LUTZ & NEIVA, 1912)

Diamantina

2018

http://www.scielo.br/pdf/rsbmt/v39n4/a04v39n4.pdf





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Animal da Universidade

Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como

requisito parcial para obtenção de título de Mestre.

Orientador: Dr. Ricardo Andrade Barata

Diamantina

2018






Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Animal da Universidade

Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como

requisito parcial para obtenção de título de Mestre.

Orientador: Dr. Ricardo Andrade Barata

Data da Aprovação____/____/_______.

____________________________________________________

Dr. Gustavo Fontes Paz

Fundação Oswaldo Cruz – Minas Gerais

____________________________________________________

Dra. Patrícia Machado de Oliveira

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

____________________________________________________

Dr. Ricardo Andrade Barata

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

Diamantina

2018


Dedico ao

meu pai Avam Sincurá Ribeiro e

à minha mãe Lucimar Ap. de Oliveira Ribeiro.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Ricardo Andrade Barata, não só pela orientação acadêmica, mas também

pela amizade e confiança;

À minha mãe Lucimar Ap. de Oliveira Ribeiro, pelo apoio, incentivo e confiança;

Ao meu pai Avam Sincurá Ribeiro, pelo apoio, confiança e indicação da planta que foi objeto

de estudo neste trabalho;

Aos meus irmãos Yowdirllan, Admo, Joylly, Kacielle pelo apoio e motivação;

Ao Luiz Carlos e mais uma vez a Yowdirllan pela ajuda na coleta do material vegetal;

À Amanda de Oliveira Baracho, pelo apoio no desenvolvimento do trabalho e mais importante

do que isso, pela amizade;

À Ana Paula e Índio, por permitirem a coleta de Protium heptaphyllum em sua propriedade e

mais importante do que isso, pela boa conversa sobre a planta, compartilhando seus

conhecimentos sobre os diversos usos e formas de beneficiamento, desta e outras plantas;

À Sr.ª Maria que cedeu o espaço do seu galinheiro para a coleta dos flebotomíneos, sempre

prestativa e bem humorada, nos recebendo muito bem em sua casa;

Ao técnico Daniel J. Silva Viana, pela ajuda no preparo dos materiais e nas análises;

Ao técnico Abraão J. S. Viana do LEPENVale, pelo auxilio no preparo do material vegetal;

À técnica Michele Cabral do Herbário DIAM, pelo auxílio no registro das exsicatas, finalização

dos extratos e prontidão em ajudar;

À técnica Kelly Cristina Kato, pelo auxilio na produção dos extratos;

À Nara Rúbia Pereira, pelo auxilio na produção dos extratos;

À Cecilia de Souza Oliveira Bento, pelo auxílio na realização dos testes fitoquímicos;

À professora Cristiane Fernanda Fuzer Grael, pelas orientações sobre produtos naturais;

À minha namorada, Camila Cruz, pela ajuda, apoio, incentivo e companheirismo em todos os

momentos, dentro e fora da universidade;

Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Animal – PPGBA e seus integrantes, professores,

secretário e colegas;

À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri pela infraestrutura e bolsa

concedida.

“Crescimento significa mudança, e toda mudança implica o risco de

passar do conhecido ao desconhecido”

George Shinn

RESUMO

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença altamente letal quando não tratada e de caráter

reemergente. É transmitida através da picada do flebotomíneo fêmea da espécie Lutzomyia

longipalpis, inseto com grande distribuição nas Américas. O controle vetorial é realizado

através da aplicação de inseticidas piretróides sintéticos residuais de ação rápida sobre os

insetos como a α-cipermetrina e a deltametrina. Nos últimos tempos tem se observado o

surgimento de populações resistentes o que tem aumentado o interesse pela descoberta de novas

moléculas que possam ser utilizadas no controle de vetores. As plantas são um importante e

promissor campo de pesquisa, uma vez que já produzem moléculas com ação inseticida. Este

estudo objetivou analisar a ação inseticida de extratos de folhas e cascas de Protium

heptaphyllum sobre Lutzomyia longipalpis selvagens. Para isso foram confeccionados extratos

hidroalcoólicos, etanólicos e ciclo- hexânicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum.

Nestes foram realizados estudos fitoquímicos para prospecção de classes de compostos

secundários com ação biológica. Os bioensaios foram realizados em potes plásticos adaptados

e utilizou-se flebotomíneos Lu. longipalpis selvagens, oriundos da comunidade de Aroeira em

Diamantina- MG. Obtivemos como resultado dos estudos fitoquímicos, diversas classes de

metabólitos secundários como terpenos, esteroides, taninos, flavonoides, alcaloides e

saponinas, com destaque para os extratos de folhas onde foi observado um maior número de

classes em relação às cascas. Os bioensaios realizados evidenciaram uma ação inseticida dos

extratos hidroalcoólicos e ciclo- hexânicos que tiveram resultados estatisticamente semelhantes

à α-cipermetrina. Apesar de composição química semelhante as demais, os extratos etanólicos

apresentaram uma baixa atividade sobre os insetos. Com isso, concluímos que Protium

heptaphyllum, possui atividade inseticida sobre Lu. longipalpis. Dessa forma, este estudo

contribui com o desenvolvimento de métodos de controle de insetos mais eficientes e menos

agressivos aos humanos e outros animais.

Palavras chave: Leishmaniose visceral, flebotomíneos, bioprodutos, controle de vetores.

ABSTRACT

Visceral leishmaniasis (VL) is a highly lethal disease when untreated and reemerging. It is

transmitted through the bite of the female sand fly Lutzomyia longipalpis, a large-dose insect

in the Americas. Vector control is performed through the application of fast acting residual

synthetic pyrethroids on insects such as cypermethrin and deltamethrin. In recent times has been

observed the emergence of resistant populations which has increased interest in the discovery

of new molecules that can be used in the control of vectors. Plants are an important and

promising field of research, since they already produce molecules with insecticidal action. This

study aimed to analyze the insecticidal action of leaves and bark extracts of Protium

heptaphyllum on wild Lutzomyia longipalpis. Hydroalcoholic, ethanolic and cyclohexanic

extracts of the leaves and bark of Protium heptaphyllum were made. In these, phytochemical

studies were found to identify groups of individuals with biological action. The bioassays were

carried out in adapted plastic pots and wild Lu. longipalpis were used, originating from the

community of Aroeira in Diamantina-MG. We obtained as a result of the phytochemical

studies, several classes of secondary metabolites such as terpenes, steroids, tannins, flavonoids,

alkaloids and saponins, especially leaf extracts where a greater number of classes were observed

in relation to the bark. The bioassays performed showed an insecticidal action of hydroalcoholic

and cyclohexane extracts that had statistically similar results to cypermethrin. Despite chemical

composition similar to the others, the ethanolic extracts presented a low activity on the insects.

From this investigation, we conclude that Protium heptaphyllum has insecticidal activity on Lu.

longipalpis. Thus, this study contributes to the development of insect control methods that are

more efficient and less aggressive to humans and other animals.

Key words: visceral leishmaniasis, sand flies, bioproducts, vector control.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Geolocalização dos pontos de coleta da planta Protium heptaphyllum e dos

flebotomíneos Lutzomyia longipalpis na porção meridional da Cadeia do Espinhaço no estado

de Minas Gerais, Brasil. ........................................................................................................... 20

Figura 2: Representação das análises fitoquímicas realizadas. A: Observação de triterpenos e/ou

esteroides pela presença da cor verde no extrato ciclo- hexânico de folhas; B: Observação da

presença de flavonoides pela presença de cor amarela no extrato etanólico das folhas; C:

Observação de alcaloides pela presença de precipitados no extrato de folhas hidroalcoólico; D:

Placa observada sob UV, na investigação de cumarinas. ......................................................... 22

Figura 3: A: Armadilha luminosa do tipo HP, utilizada para captura dos flebotomíneos; B:

Galinheiro localizado na comunidade Aroeira, onde foram coletados os exemplares

pertencentes a espécie Lutzomyia longipalpis. ......................................................................... 23

Figura 4: A: Capturador de Castro utilizado para transferência dos flebotomíneos da gaiola para

os potes utilizados no teste; B: Pote plástico translucido com papel filtro ao fundo, tampa de

tecido organza e tampão de algodão; C: Aplicação dos extratos e controles no papel filtro. .. 24

Figura 5: Gráfico da evolução da mortalidade total (Machos + Fêmeas) de Lu. longipalpis nos

bioensaios com extratos, A: hidroalcoólicos, B: etanólicos e C: ciclo- hexânicos. ................. 27

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classes de metabólitos secundários identificados nos extratos hidroalcoólicos (HA),

etanólicos (ET) e ciclo- hexânicos (CH) das folhas e cascas de Protium heptaphyllum .......... 25

Tabela 2: Porcentagem de mortalidade de Lu. longipalpis em relação ao tempo de exposição às

concentrações dos extratos hidroalcoólicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum ..... 28


concentrações dos extratos ciclo- hexânicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum ... 29


concentrações dos extratos etanólicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum ............. 30

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 10

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 19

2.1 Geral ................................................................................................................................ 19

2.2 Específicos ...................................................................................................................... 19

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 20

3.1 Coleta, identificação e preparo do material vegetal ........................................................ 20

3.2 Preparo dos extratos vegetais .......................................................................................... 21

3.3 Prospecção fitoquímica dos extratos ............................................................................... 21

3.4 Coleta e identificação de Lutzomyia longipalpis ............................................................ 22

3.5 Bioensaio sobre Lutzomyia longipalpis .......................................................................... 23

3.6 Análises estatísticas ........................................................................................................ 24

4. RESULTADOS .................................................................................................................... 25

4.1 Caracterização fitoquímica ............................................................................................. 25

4.2 Bioensaio sobre Lutzomyia longipalpis .......................................................................... 26

5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 31

6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 37

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 38

8. APÊNDICE .......................................................................................................................... 46

Effect of Aqueous Extract of Protium heptaphyllum (Burseraceae) on Lutzomyia longipalpis

(Diptera: Psychodidae), a Proven Vector of Visceral Leishmaniasis in Brazil .................... 46

10

1. INTRODUÇÃO

As doenças negligenciadas constituem um importante grupo de enfermidades que

afetam milhares de pessoas em todo o mundo. Dentre elas, está presente a leishmaniose

visceral (LV), uma zoonose altamente letal quando não tratada (WHO, 2017). Possui uma

grande área de dispersão, estando presente em quatro dos cinco continentes, com uma

estimativa de ocorrência de 200 a 400 mil novos casos ao ano, sendo que, mais de 90%

dos casos registrados estão presentes na Índia, Bangladesh, Sudão, Sudão Sul, Etiópia e

Brasil (ALVAR et al., 2012).

Nas Américas, a leishmaniose visceral ocorre em 12 dos 35 países com 51.176

casos humanos registrados de 2001 a 2015. O Brasil ocupa uma posição de destaque por

registrar 96% dos casos (PAHO, 2017). No Brasil, a LV está distribuída em todo o

território nacional, em 26 das 27 unidades federativas com maior concentração nas

regiões nordeste e sudeste (BRASIL, 2014; DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO,

2006; GONTIJO; MELO, 2004). Em todo o continente, o agente etiológico da LV é o

protozoário Leishmania infantum chagasi (LAINSON, 2010). Este possui duas formas

biológicas diferentes; podendo ser intracelular obrigatório, amastigota, que parasita

preferencialmente os macrófagos dos seus hospedeiros vertebrados, como canídeos e

humanos. Ou pode ser flagelado e móvel, neste caso denominado de promastigota, fase

que sobrevive no meio extracelular do seu hospedeiro invertebrado, o flebotomíneo

(ALMEIDA et al., 2003).

A manutenção do ciclo de vida do protozoário depende diretamente de seus

hospedeiros e transmissores. Os mamíferos são considerados os reservatórios da

Leishmania infantum chagasi, classificados como reservatórios silvestres e urbanos.

Mamíferos como roedores, canídeos e marsupiais são os principais reservatórios da

Leishmania infantum chagasi no meio silvestre. Já no meio urbano, o cão doméstico

(Canis familiaris) é o principal reservatório presente no espaço domiciliar e

peridomiciliar (MICHALICK; GENARO, 2005). A principal forma de transmissão do

protozoário ocorre de forma vetorial através da picada do flebotomíneo fêmea da espécie

Lutzomyia longipalpis (LUTZ; NEIVA, 1912), que ao realizar a hematofagia, transfere

os protozoários de um animal ao outro inclusive ao homem.

Os flebotomíneos são insetos dípteros caracterizados morfologicamente pela

coloração palha, corpo delgado e piloso com pernas longas, com tamanho de dois a três

milímetros e presença de dimorfismo sexual. Possuem um vôo característico em pequenos

11

saltos e pouso típico com as asas eretas em posição entreabertas. Essas características lhes

conferem os nomes populares de mosquito palha, cangalhinha, asa dura, asinha branca

entre outros, variando de acordo com a região (BRASIL; BRASIL, 2003; LEWIS, 1974).

Segundo a classificação taxonômica são posicionados na classe Insecta, ordem Diptera,

família Psychodidae, sendo a subfamília Phlebotominae a única de importância médica

nas Américas em relação a LV. Lutzomyia cruzi (MANGABEIRA, 1938) e Lutzomyia

longipalpis, são as únicas espécies incriminadas como transmissoras da Le. infantum

chagasi no Brasil (GALATI, 2003).

Para ser incriminada como vetora da leishmaniose visceral, uma espécie deve ser

abundante no foco da doença, ser altamente antropofílica; suportar o desenvolvimento de

parasitas na ausência de sangue no intestino; mostrar alta taxa de infecção natural, ser

capaz de transmitir o parasito por meio de picada e o parasita isolado do flebotomíneo

deve ser indistinguível daqueles isolados de casos humanos (KILLICK-KENDRICK,

1990). Lutzomyia cruzi foi recentemente incriminada como vetor na região Centro-Oeste

brasileiro (MISSAWA et al., 2011). Já Lutzomyia longipalpis, há mais tempo é

considerada a principal espécie transmissora da LV no Brasil (LAINSON; WARD;

SHAW, 1977).

Lutzomyia longipalpis é considerado um complexo de espécies (LANZARO et

al., 1993), com grande distribuição geográfica podendo ser encontrado do México até a

Argentina (YOUNG; DUNCAN, 1994). Este inseto tem mostrado bastante plasticidade

ecológica e capacidade de adaptação aos mais diversos ambientes, ocupando

principalmente as regiões periféricas das cidades, onde existe a escassez dos principais

serviços de saneamento e forte presença de animais domésticos, local propício para a

manutenção do seu ciclo de vida. Fatos que o apontam como um dos principais

responsáveis pela urbanização da LV no Brasil (JERONIMO et al., 1994; RANGEL;

VILELA, 2008; XIMENES et al., 2007).

Assim como a generalidade dos dípteros, Lu. longipalpis são insetos

holometábolos que passam por metamorfose completa durante o seu desenvolvimento,

tendo uma fase de ovo, quatros estádios larvais (L1, L2, L3 e L4), uma fase pupal e adulto.

E cada fêmea adulta de flebotomíneo é capaz de realizar uma postura de 28 ovos em

média, podendo pôr até 80 ovos, que são de forma elipsóide, cor clara esbranquiçada,

tendendo a cor castanho escuro horas depois. São depositados em ambiente terrestre onde

existe o acúmulo de matéria orgânica e possuem um tempo médio de eclosão de 8,5 dias

(FERRO et al., 1998; RANGEL; LAINSON, 2003).

12

As larvas são de aspecto vermiforme, com corpo de cor clara e região cefálica

escura, possuem cerdas caudais que são duas no primeiro estádio e quatro nas larvas de

segundo a quarto estádio. Esta fase dura em média de 15 a 20 dias. Durante este período

alimentam-se de matéria orgânica em decomposição inclusive as cascas dos ovos e

adultos mortos até empupar (BRASIL; BRASIL, 2003; LEITE; WILLIAMS, 1997). As

pupas são esbranquiçadas inicialmente tornando-se cada vez mais escuras a medida que

se aproximam da eclosão, que ocorre em 15 dias em média. Possuem o corpo dividido

em cefalotórax e abdome, com movimentos limitados a extensão e flexão do corpo

(BRASIL; BRASIL, 2003; FERRO et al., 1998).

Adultos apresentam dimorfismo sexual com diferenciação dos últimos segmentos

abdominais que compõem as genitálias dos insetos, características altamente importantes

para identificação da espécie. Nas fêmeas as estruturas são pequenas e simples sendo

visualizadas apenas com o auxílio de um microscópio, enquanto que no macho são bem

desenvolvidas com maior complexidade estrutural. As diferenças morfológicas não são

limitadas aos aparatos reprodutivos, mas também está presente no aparelho bucal, onde a

probóscíde nos machos é menor enquanto que nas fêmeas é maior e acompanhado do

cibário, uma estrutura interna a cabeça associada ao hábito hematofágico (BRASIL;

BRASIL, 2003).

Machos e fêmeas necessitam de uma alimentação a base de açucares, geralmente

a frutose e glicose, que são importantes fontes energéticas para sobrevivência e

reprodução. Este recurso é adquirido diretamente em plantas ou fezes de afídeos

(CAMERON et al., 1995). No entanto, as fêmeas também precisam alimentar-se de

sangue para o desenvolvimento ovariano, sendo Lu. longipalpis bastante eclética quanto

a preferência da fonte sanguínea. Alimentam-se de aves, humanos, cães e outros animais

de sangue quente. O hábito hematófago das fêmeas associado ao gosto diversificado por

fontes sanguíneas, atribui a espécie um importante papel como vetor (RANGEL;

LAINSON, 2003).

As medidas de prevenção e controle da LV visam interromper o ciclo da doença

e são direcionadas a três vertentes: aos humanos, a população de cães e ao vetor. À

população humana são atribuídas medidas de proteção individual, como o uso de

repelentes, mosquiteiros de malha fina e telas nas janelas em ambientes onde o vetor é

comumente encontrado (BRASIL, 2014).

Os cães são os reservatórios mais próximos do homem, sendo as medidas de

prevenção de grande importância, para a saúde do cão e do homem (MARESCA et al.,

13

2009). É adotado o uso de proteção individual para cães domésticos através de coleiras

impregnadas com inseticida deltametrina a 4% (FOGLIA MANZILLO et al., 2006), uso

de telas em canis individuais ou coletivos, para impedir a entrada de flebotomíneos e uso

de vacina anti-leishmaniose visceral canina que é liberada pelo Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento, porém sem comprovação da sua total efetividade (BRASIL,

2014). Em relação aos animais errantes, é adotada a captura dos mesmos, principalmente

em áreas urbanas e realizado o exame sorológico para LV. Caso o resultado seja negativo

os cães são destinados a adoção, mas caso seja positivo são encaminhados para eutanásia

(BRASIL, 2014).

As medidas de prevenção direcionadas ao vetor visam eliminar possíveis focos de

reprodução, através do emprego do saneamento ambiental, limpeza de terrenos e abrigos

de animais domésticos além do destino adequado do lixo (BRASIL, 2014). Em centros

urbanos é possível encontrar maior densidade populacional de flebotomíneos em locais

com maior acúmulo de matéria orgânica, como praças arborizadas onde há o acumulo de

folhas em decomposição e locais onde não existe serviços de saneamento básico

(URSINE et al., 2016).

Apesar da existência das medidas de prevenção, as estratégias de controle são as

mais empregadas. Os esforços para controle da LV concentram-se em três pontos: I-

tratamento dos casos humanos; II- eutanásia dos reservatórios domésticos infectados; III-

eliminação do vetor através da aplicação de inseticidas residuais que visam eliminar ou

reduzir a população de flebotomíneos (BRASIL, 2014).

O controle do vetor tem se mostrado a estratégia mais eficiente, pois impede ou

em alguns casos reduz o contato do vetor com a população humana, atenuando o risco de

transmissão da doença (COSTA; PEREIRA; ARAÚJO, 1990; OLIVEIRA; ARAÚJO,

2003). Atualmente no Brasil, o Ministério da Saúde preconiza a utilização dos piretróides

deltametrina e a α-cipermetrina no controle do Lu. longipalpis, esses inseticidas

persistentes são utilizados através da borrifação das casas e anexos (BRASIL, 2014).

Os inseticidas desta classe são neurotóxicos de ação rápida sobre insetos,

causando paralisia e morte imediata (SANTOS; AREAS; REYES, 2007). A toxicidade

dos piretróides aos mamíferos é considerada baixa, no entanto há relatos de morte humana

por intoxicação por piretróides, sendo o contato físico e a inalação as vias de absorção

mais importantes (BRADBERRY et al., 2005). Para outros organismos como abelhas,

peixes e crustáceos, os piretróides são altamente tóxicos, pois estes animais possuem um

14

metabolismo mais baixo e por isso menos capacidade de desintoxicação. (MONTANHA;

PIMPÃO, 2012).

A LV é uma doença de caráter reemergente, portanto a continuidade das ações de

controle é de grande importância para evitar novos surtos da doença. Além disso, o

monitoramento da efetividade dessas medidas contribui para o bom funcionamento do

programa de controle (BARATA et al., 2013; DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO,

2006). O monitoramento da eficácia dos piretróides sobre Lu. longipalpis, já é realizado

a bastante tempo. Um estudo realizado em 1988 na Gruta da Lapinha em Lagoa Santa,

Minas Gerais, avaliou a susceptibilidade do piretróide deltametrina em uma população de

Lu. longipalpis, comprovando a eficiência do inseticida (FALCÃO; PINTO; GONTIJO,

1988). Recentemente outra investigação realizada também na Gruta da Lapinha com a

alfa-α-cipermetrina, novamente demonstrou a susceptibilidade de Lu. longipalpis a este

piretróide em campo (PESSOA et al., 2015).

Não apenas no Brasil foi demostrada o bom funcionamento da deltametrina, na

Bolívia, Le Font et al., (1989) também confirmaram a eficiência do inseticida em um

estudo de campo. Da mesma forma, uma população de laboratório oriunda da Colômbia

não apresentou resistência à alfa-α-cipermetrina (MARCELÓ et al., 2014). Apesar dos

vários relatos de sucesso dos inseticidas piretróides, alguns trabalhos também já

demostraram uma baixa efetividade sobre algumas populações de Lu. longipalpis.

Uma comparação entre populações de Lu. longipalpis de Minas Gerais

procedentes da Gruta da Lapinha e da cidade de Montes Claros, revelou que os

flebotomíneos de Montes Claros são menos susceptíveis aos piretróides deltametrina e

permetrina, com taxas de sobrevivências maiores que 30% em relação a outra população,

demonstrando um caso de susceptibilidade reduzida (ALEXANDER et al., 2009).

Resultados semelhantes também foram observados na Venezuela onde populações de Lu.

longipalpis foram avaliados em relação aos piretróides deltametrina, lambdacyhalotrina

e permetrina. Apesar de susceptíveis a deltametrina e lambdacyhalotrina, apresentaram

um baixo nível de resistência à permetrina (MAZZARRI et al., 1997).

O acompanhamento do controle vetorial é um passo importante para a garantia da

sua eficácia a longo prazo (ROSE, 2001), uma vez que através do mecanismo de seleção

natural as populações de insetos tendem a adquirir resistência naturalmente as moléculas

químicas usadas no seu controle (RIDLEY, 2006). Além do fator natural, a

descontinuidade ou realização inadequada das ações podem acelerar esse processo

(BRAGA; VALLE, 2007). A resistência de uma população origina na seleção de

15

indivíduos com características genéticas herdáveis, que lhes conferem tolerância a uma

molécula ou um grupo químico, tornando uma população anteriormente susceptível em

resistente (RIDLEY, 2006).

A resistência adquirida pelos insetos, os danos à saúde humana e a poluição

ambiental, causadas pela aplicação repetida de inseticidas sintéticos persistentes, têm

levado a um aumento no interesse por novos produtos químicos (VIEGAS-JÚNIOR,

2003). O desenvolvimento ou reformulação de moléculas químicas tem se mostrado

bastante caro, o que tem feito crescer o interesse pela pesquisa de inseticidas alternativos

(ALMEIDA; BATISTA-FILHO, 2001). Uma opção bastante promissora é a investigação

da ação de extratos de plantas para a descoberta de moléculas que possam ser usadas no

controle dos vetores, associados as demais práticas de controle da LV (CAVALCANTE;

MOREIRA; VASCONCELOS, 2006; MACIEL et al., 2010a).

As plantas coevoluiram com insetos herbívoros e organismos patogênicos, o que

resultou no desenvolvimento de mecanismos naturais de defesa contra seus inimigos

(RIDLEY, 2006; SIMAS et al., 2004). Esses mecanismos são classificados em três tipos

de resistência, que podem afetar diretamente o comportamento e ou biologia do indivíduo

ou não causar nenhum efeito. São classificadas como: I- antibiose, que é o tipo de

resistência em que a planta provoca um efeito adverso sobre a biologia do inseto; II-

antixenose, chamada também de não-preferência onde o inseto evita a planta para:

alimentação, oviposição ou abrigo; III- tolerância, onde a planta suporta a presença do

inseto sem que haja modificação na biologia e/ou comportamento do mesmo (PAINTER,

1951).

O mecanismo de antibiose destaca-se dos demais por afetar diretamente o inseto

através da produção de metabólitos secundários capazes de causar uma intoxicação aguda

ou crônica (PINTO et al., 2002). Existem diversas classes de metabólitos secundários

produzidos pelas plantas empregados na sua defesa como: alcaloides, terpenos, taninos,

saponinas, quinonas entre outros (MATIAS et al., 2002). A presença destes e outros

compostos químicos nas plantas com ação biológica sobre insetos, aponta um grande

potencial de uso deste recurso no controle de pragas e vetores de doenças (PAVELA,

2004).

Estudos com Lu. longipalpis tem demostrado a ação de bioprodutos de plantas

sobre o inseto adulto e os outros estádios de vida, como o óleo essencial de Azadirachta

indica (nim), com ação ovocida, larvicida e adulticida comprovada sobre o inseto

(MACIEL et al., 2010b). Os bioprodutos possuem formas de processamento e aplicações

16

bastante diversificadas, características que possibilitam o uso de uma mesma planta ou

parte dela de diferentes formas. Como o uso de extratos secos da Azadirachta indica (nim)

e Melia azedarach (nim) incorporados a ração das larvas do vetor, que resultaram na

morte das mesmas e no bloqueio da muda entre os estádios larvais (ANDRADE-

COELHO et al., 2009). Os óleos essenciais de Eucalyptus staigeriana, Eucalyptus

citriodora e Eucalyptus globulus (eucaliptos) também apresentam ação biocida contra

todas as formas de vida do mesmo vetor (MACIEL et al., 2010a). Plantas amazônicas

popularmente conhecidas como timbós, Antonia ovata e Derris amazonica, também

apresentaram efeito inseticida de seus extratos aquosos sobre Lu. longipalpis

(LUITGARDS-MOURA et al., 2002).

A família Burseraceae agrupa diversas plantas conhecidas pela produção de

resinas amplamente empregadas na indústria de cosméticos, produção de verniz e

calafetagem de embarcações de madeira, em rituais religiosos na forma de incenso e na

medicina popular. Possui cerca de 800 espécies distribuídas em 16 gêneros. O gênero

Protium possui espécies com atividade citotóxica, antifúngica, antimicrobiana,

antinflamatória e acaricida, já conhecidas pela ciência (CAMPORESE et al., 2003;

CARRETERO et al., 2008; GONZÁLEZ et al., 1994; JOLAD; WIEDHOPF; COLE,

1977; PONTES et al., 2007a, 2007b).

Protium heptaphyllum é conhecido popularmente como breu-branco, breu-preto,

breu incenso, almecegueira, almecegueira cheirosa, almíscar, entre vários outros nomes

de acordo com a região. É uma espécie perenifólia encontrada nas regiões de florestas e

savanas (cerradão), altamente difundida pelo Brasil e América do Sul, estando presente

das Guianas à Argentina. É bastante conhecida pela resina de cheiro forte, que é exsudada

do caule para defesa da planta, usada na medicina popular, como antinflamatório,

analgésico, expectorante e cicatrizante (DA SILVA et al., 2016; DOMENE; MATTOS;

SALIS, 2010).

Os compostos químicos de P. heptaphyllum variam de acordo com a parte da

planta, e no fruto varia com o estágio de maturação. Os terpenos são a classe de compostos

mais relatada, estando presentes em quase toda a planta. A maioria dos estudos são

realizados com a resina onde são encontradas grande quantidade de monoterpenos e

triterpenos (ALBINO et al., 2017; BANDEIRA et al., 2001; CARVALHO; SOUSA;

CHAVES, 2007; DA SILVA et al., 2016; JÚNIOR; SOUZA; CHAVES, 2005; MAIA et

al., 2000; MOBIN et al., 2017).

17

Nas folhas, são encontrados monoterpenos, sesquiterpenos, flavonoides e

cumarinas (ALMEIDA; CONSERVA; LYRA-LEMOS, 2002; BANDEIRA et al., 2001,

2002; CITÓ; COSTA; LOPES, 2006; PONTES et al., 2007a). Já nos frutos, são

encontrados flavonoides, monoterpenos e catequina (BANDEIRA et al., 2001, 2002;

CITÓ; COSTA; LOPES, 2006; PONTES et al., 2007a). Dentre as partes da planta já

estudadas, a casca é o que se tem menos conhecimento, sendo citado apenas a presença

de cumarina (ALMEIDA; CONSERVA; LYRA-LEMOS, 2002; BANDEIRA et al.,

2002).

Estudos farmacológicos a respeito dos benefícios à saúde humana tem

demonstrado atividades gastroprotetora, antinflamatória, sedativa, ansiolítica,

antidepressiva (ARAGÃO et al., 2006), e no tratamento de Alzheimer através da ação

anticolinasterase (ARAGÃO et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2004; SALLES-TREVISAN

et al., 2003). A ação citotóxica e apoptótica também foi observada em células

carcinogênicas, bem como o efeito vasorrelaxante arterial em estudos com roedores

(LIMA et al., 2014; MOBIN et al., 2017). A ação bioicida também foi demonstrada em

alguns estudos, como a atividade cercaricida das folhas sobre Schistosoma mansoni

(FRISCHKORN; FRISCHKORN; CARRAZZONI, 1978). A atividade larvicida do óleo

essencial da resina sobre Artemia salina e ação fungicida sobre Candida sp., e

Cryptococcus neoformans também foi evidenciada (CITÓ et al., 2003; VIOLANTE et

al., 2012).

Além de suas aplicações a saúde humana, P. heptaphyllum mostra potencial no

controle biológico de pragas agrícolas. O ácaro Tetranychus urticae que causa prejuízos

econômicos em plantações como as de abacaxi, abobrinha, cacau, maçã entre várias

outras culturas, apresentou susceptibilidade ao óleo essencial das folhas e frutos, sendo o

óleo dos frutos mais eficiente quando comparado ao das folhas (PONTES et al., 2007a).

O extrato etanólico das cascas também apresentou efeito acaricida em relação ao

carrapato-do-boi, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, espécie responsável pela

transmissão de endoparasitas e afetar diretamente a produção de leite, couro e carne

(CATTO; BIANCHIN; SAITO, 2009).

O efeito do extrato aquoso das folhas de P. heptaphyllum já foi investigado sobre

Lu. longipalpis, onde foi demonstrada a atividade inseticida sobre insetos adultos

selvagens (SINCURÁ et al., 2017) (Apêndice pag.46). No entanto, a ação de outros

extratos com partes diferentes da planta sobre este vetor, ainda permanece desconhecida.

Tendo conhecimento do problema de saúde pública que é a LV, a biologia do vetor e ação

18

promissora de Protium heptaphyllum sobre o modelo biológico já estudado, estre trabalho

propôs avaliar diferentes extratos desta planta sobre o vetor da LV, contribuindo para o

conhecimento sobre a ação de bioprodutos que possam ser empregados no controle de

Lutzomyia longipalpis e consequentemente da leishmaniose visceral.

19

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

O estudo teve como objetivo investigar o potencial inseticida dos extratos de

folhas e cascas de Protium heptaphyllum sobre Lutzomyia longipalpis, vetor da

Leishmaniose Visceral no Brasil.

2.2 Específicos

Confeccionar extratos hidroalcoólicos das folhas e das cascas de Protium

heptaphyllum.

Confeccionar extratos etanólicos das folhas e das cascas de Protium

heptaphyllum.

Confeccionar extratos ciclo- hexânicos das folhas e das cascas de Protium

heptaphyllum.

Caracterizar as classes de metabólitos secundários presentes nos extratos

hidroalcoólicos, etanólicos e ciclo- hexânicos das folhas e cascas de P. heptaphyllum.

20

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta, identificação e preparo do material vegetal

Para o estudo foram coletadas folhas e cascas de Protium heptaphyllum no

município de Diamantina, Minas Gerais, Brasil (18°22’53” S; 43°32’6” W), que está

situada na porção meridional da Cadeia do Espinhaço. A porção meridional é

caracterizada por vegetação típica do bioma cerrado com formações rupestres e savânicas,

além de áreas com floresta estacional semidecidual, local este onde P. heptaphyllum é

comumente encontrado. Segundo a classificação de Köppen, o clima é mesotérmico, do

tipo Cwb, com estações bem definidas de inverno seco e verão temperado com

precipitação anual de 1300 a 1600 mm (GALVÃO; NIMER, 1965) (Figura 1).

A identificação botânica foi feita com base nos caracteres morfológicos descritos

no trabalho de Domene et al. (2010). Três exsicatas foram confeccionadas e depositadas

no herbário DIAM, registradas com o número DIAM nº 5897. O material coletado foi

submetido à secagem em estufa de circulação e renovação forçada de ar da marca

TECNAL, TE-394/3 a 35 ºC até obter peso constante. Logo após foi triturado em moinho

de facas da marca SOLAB, SL 32, obtendo um pó fino, com granulação uniforme.

Figura 1: Geolocalização dos pontos de coleta da planta Protium heptaphyllum e dos flebotomíneos

Lutzomyia longipalpis na porção meridional da Cadeia do Espinhaço no estado de Minas Gerais, Brasil.

21

3.2 Preparo dos extratos vegetais

Foram preparados três extratos com as folhas e três com as cascas de Protium

heptaphyllum (hidroalcoólico, etanólico e ciclo- hexânico). Para todos os extratos foram

utilizadas 150g da planta pulverizada, mais o solvente e empregada a técnica de

maceração até o esgotamento. Logo após os solventes foram destilados através do

rotaevaporador FISATOM, 801.

Para o extrato hidroalcoólico (HA) foi utilizado uma solução de etanol/água (2:1

v:v) para cada parte da planta. Após a destilação do solvente, este extrato foi liofilizado

em um liofilizador TERRONI, LS 3000D e armazenado em freezer a -30 °C. No preparo

dos extratos etanólicos (ET) e ciclo- hexânicos (CH) foram utilizados álcool etílico

absoluto 99,8% P.A. e ciclehexano 99,0% P.A., respectivamente. Após a destilação os

extratos ficaram em repouso para evaporação natural do restante dos solventes em

secadora com sílica onde permaneceram até o momento do bioensaio.

3.3 Prospecção fitoquímica dos extratos

Os extratos foram analisados pelo método de prospecção fitoquímica de bancada

onde as classes de metabólitos secundários são evidenciadas através de reações

cromogênicas e de precipitações e comparados com um grupo controle (MATTOS,

2009). Para cada teste foi utilizada uma alíquota de aproximadamente 2,0 mg de cada

extrato. Com exceção do teste para cumarinas que foi utilizado placas cromatográficas,

todos os outros testes foram realizados em tubos de ensaios (Figura 2). As classes

investigados foram:

I- Terpenos e/ou esteroides: os extratos foram diluídos em clorofórmio,

misturados em um tubo de ensaio com o reagente de Liebermann-Burchard (2,0 mL de

anidrido acético e duas gotas de ácido sulfúrico concentrado). A presença destes

compostos é evidenciada pelo aparecimento das cores rosa, azul ou verde;

II- Taninos: os extratos foram diluídos em 2,0 mL de água e misturados a uma

solução de cloreto férrico (10%). Neste caso o aparecimento da cor azul sugere a presença

de taninos hidrolisáveis e a verde, de taninos condensados.

III- Flavonoides: os extratos foram diluídos em 2,0 mL de água, e logo após foi

adicionado hidróxido de amônia até atingir pH 11. O aparecimento de coloração amarela

indica a presença de flavonas, flavonóis e xantonas. O desenvolvimento de coloração

22

vermelha púrpura indica a presença de chalconas e auronas. Já a coloração

vermelha/laranja indica a presença de flavonóis na amostra.

IV- Alcaloides: os extratos foram diluídos em 2,0 mL de água e misturados ao

reagente de Dragendorff (5 g de carbonato de bismuto; 25 g de iodeto de potássio; 12 mL

de ácido clorídrico e 100 mL de água destilada). A formação de precipitados floculosos

ao adicionar o reagente indica a presença de alcaloides na amostra.

V- Saponinas: Após a diluição dos extratos em 2,0 mL de água o tubo foi agitado

intensamente por 2 min. A formação de espuma persistente evidencia a presença de

saponinas na amostra.

VI- Cumarinas: para a investigação desta classe, utilizou-se placas

cromatográficas e uma fase eluente composta por 50,0 mL de acetato de etila, 5,5 mL de

ácido acético glacial, 5,5 mL de ácido fórmico e 13,0 mL de água. Neste caso o

aparecimento de coloração azul sob luz ultravioleta (UV), revela a presença desta classe.

Figura 2: Representação das análises fitoquímicas realizadas. A: Observação de triterpenos e/ou esteroides

pela presença da cor verde no extrato ciclo- hexânico de folhas; B: Observação da presença de flavonoides

pela presença de cor amarela no extrato etanólico das folhas; C: Observação de alcaloides pela presença de

precipitados no extrato de folhas hidroalcoólico; D: Placa observada sob UV, na investigação de cumarinas.

3.4 Coleta e identificação de Lutzomyia longipalpis

Os insetos foram coletados na comunidade Aroeira, localizada no município de

Diamantina/MG (18°8'8" S, 43°38'5" W) (Figura 1), utilizando armadilhas luminosas do

tipo HP expostas das 16:00h as 8:00h no interior de um galinheiro (Figura 3). Os

espécimes foram transportados ao Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal

dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) e acondicionados em gaiolas de

contenção de tecido organza. Deste material, foi retirada uma amostra para identificação,

23

que foi realizada segundo a classificação proposta por Young & Duncan (1994). Os

flebotomíneos permaneceram em repouso por 24h até a realização do ensaio, durante este

período foi fornecida água e solução açucarada ad libitum.

Figura 3: A: Armadilha luminosa do tipo HP, utilizada para captura dos flebotomíneos; B: Galinheiro

localizado na comunidade Aroeira, onde foram coletados os exemplares pertencentes a espécie Lutzomyia

longipalpis.

3.5 Bioensaio sobre Lutzomyia longipalpis

O bioensaio foi subdividido em três experimentos, um para os extratos

hidroalcoólicos, um para os extratos etanólicos e outro para os extratos ciclo- hexânicos.

Para cada experimento foram utilizados 990 flebotomíneos adultos selvagens, 495

machos e 495 fêmeas. Com o auxílio de um capturador de Castro, grupos de 30

flebotomíneos (15 machos e 15 fêmeas) foram transferidos para potes translúcidos de

plástico de 250 mL, contendo papel filtro ao fundo, com tampa de tecido organza e

tampão de algodão.

Foram preparadas quatro diluições dos extratos de folhas em uma solução de

Tween 80 a 3%, nas concentrações de 50, 100, 200 e 400 mg/mL e mais quatro dos

extratos de cascas nas mesmas concentrações. Também constituíram o experimento, três

grupos controles: um positivo com α-cipermetrina a de 196 µg/mL (CP), um negativo

com água destilada (CN) e um com Tween 80 a 3% (CT), totalizando oito tratamentos de

extratos vegetais, mais três controles por experimento. Todos os testes foram realizados

em triplicatas.

A B

24

No papel filtro foram aplicados com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 300 µL

dos extratos em cada pote. O mesmo procedimento foi realizado para os grupos controle

(CP, CN e CT). As observações de mortalidade foram realizadas após 1h, 2h, 4h, 16h,

24h, 48h e 72h. Neste momento foi observado o número total acumulado de

flebotomíneos mortos, com distinção entre machos e fêmeas. Durante todo o processo foi

fornecida água e solução açucarada ad libitum (Figura 4).

3.6 Análises estatísticas

Os dados foram transformados pela fórmula (x + 1) ^ 0.5, submetidos à análise de

variância ANOVA e comparados pelo teste de Scott-Knott com nível de significância de

0,05, usando o programa SISVAR 5.6 (FERREIRA, 2014).

Figura 4: A: Capturador de Castro utilizado para transferência dos flebotomíneos da gaiola para os potes

utilizados no teste; B: Pote plástico translucido com papel filtro ao fundo, tampa de tecido organza e

tampão de algodão; C: Aplicação dos extratos e controles no papel filtro.

A B C

25

4. RESULTADOS

4.1 Caracterização fitoquímica

Após a realização dos testes fitoquímicos foi possível observar que os metabólitos

secundários variam em tipo e número de classes de acordo com o solvente utilizado na

extração. Foi possível identificar a classe dos terpenos, esteroides, taninos, flavonoides,

alcaloides e saponinas. Apenas a classe das cumarinas não foi observada em nenhum dos

testes realizados (Tabela 1).

Tabela 1: Classes de metabólitos secundários identificados nos extratos hidroalcoólicos (HA), etanólicos

(ET) e ciclo- hexânicos (CH) das folhas e cascas de Protium heptaphyllum

CLASSES FOLHAS CASCAS

HA ET CH HA ET CH

Triterpenos + Verde + Verde + Verde - + Verde + Verde

Esteroides + Verde + Verde + Verde - + Verde + Verde

Taninos + Verde + Verde - + Verde + Verde -

Flavonoides + Amarelo + Amarelo - +Vermelho/

Laranja

+Vermelho/

Laranja -

Alcaloides + + + + + +

Saponinas + - - + - -

Cumarinas - - - - - - + Presente; - Ausente

No extrato hidroalcoólico das folhas foi observada presença de triterpenos,

esteróides, taninos condensados, flavonoides (flavonas, flavonóis e xantonas), alcaloides

e saponinas. Já no extrato das cascas foi observada a presença de taninos condensados e

flavonoides (flavonóis), alcaloides e saponinas. Quando comparamos o extrato das folhas

com o de cascas, é possível notar que no extrato das folhas existe uma maior variedade

de classes de metabólitos secundários, uma vez que triterpenos e esteroides não estão

presentes no extrato de cascas, os flavonoides também diferem entre as partes sendo que

o extrato de folhas contém flavonas, flavonóis e xantonas, enquanto o extrato de casca

contém apenas flavonóis. Quando comparamos os extratos hidroalcoólicos com os

extratos etanólicos e ciclo- hexânicos foi possível observar que estes foram os únicos com

a presença da classe das saponinas, tanto nas folhas quanto nas cascas (Tabela 1).

No extrato etanólico das folhas foi observada a presença de triterpenos, esteroides,

taninos condensados, flavonoides (flavonas, flavonóis e xantonas) e alcaloides. As

mesmas classes de metabólitos secundários também foram encontradas no extrato das

cascas. Neste caso houve diferença apenas no tipo de flavonoides encontrados, pois foi

26

observada a presença de flavonas, flavonóis e xantonas no extrato de folhas e apenas

flavonóis na no extrato de cascas. Quando comparado aos demais extratos nota-se que os

extratos etanólicos possuem composições semelhantes aos extratos hidroalcoólicos e

maior número de classes químicas que os extratos ciclo- hexânicos (Tabela 1).

No extrato ciclo- hexânico das folhas foi observada a presença de triterpenos,

esteroides e alcaloides. O mesmo também foi observado no extrato das cascas, portanto

não foi observada diferença na composição química dos extratos ciclo- hexânicos de

folhas e cascas. Em relação aos extratos hidroalcoólicos e etanólicos os extratos ciclo-

hexânicos foram os que apresentaram menor número de classes químicas, tanto nas folhas

quanto nas cascas (Tabela 1).

4.2 Bioensaio sobre Lutzomyia longipalpis

Os bioensaios realizados com os extratos hidroalcoólicos, etanólicos e ciclo-

hexânicos apresentaram ao longo do tempo uma evolução semelhante da mortalidade

total de Lu. longipalpis. Nas observações iniciais de uma a quatro horas após a aplicação,

a taxa de mortalidade foi muito baixa e algumas vezes inexistente nos tratamentos

realizados com os extratos de folhas e cascas, assim como nos controles negativo e

Tween. A partir das 14 horas de experimento foi possível observar um aumento na

mortalidade dos flebotomíneos em todos os tratamentos com extratos, ao passo que os

controles negativos e Tween, mantiveram uma baixa taxa de mortalidade. O controle

positivo com α-cipermetrina apresentou o comportamento esperado nos três bioensaios

em relação aos demais tratamentos. Exibiu um pico de atividade inseticida nas

observações iniciais, atingindo uma taxa de mortalidade de 83 a 93% nas quatro primeiras

horas e 100% de mortalidade após 16 horas de experimento (Figura 5).

27

Figura 5: Gráfico da evolução da mortalidade total (Machos + Fêmeas) de Lu. longipalpis nos bioensaios

com extratos, A: hidroalcoólicos, B: etanólicos e C: ciclo- hexânicos.

Os dados do bioensaio com os extratos hidroalcoólicos são apresentados na tabela

2, onde podemos observar que, no tempo de 72 horas, uma ação inseticida

estatisticamente semelhante ao controle positivo sobre machos e fêmeas nos extratos de

folhas nas concentrações de 50, 100 e 200mg/mL e nas concentrações de 400mg/mL de

folhas e 50mg/mL de cascas, apenas para fêmeas. Quando observamos a mortalidade dos

tratamentos com extratos em relação aos controles negativo e Tween, a maioria das

concentrações dos extratos de folhas e cascas apresentaram taxas de mortalidade

superiores, apenas as concentrações de 200 e 400 mg/mL de cascas, apresentaram taxa de

mortalidade igual aos controles para os machos e fêmeas.

Em relação à parte da planta utilizada, as taxas de mortalidade entre folhas e cascas

diferem estatisticamente, o extrato de folhas apresentou maior atividade inseticida do que

o extrato de cascas, sendo as fêmeas mais sensíveis que os machos em ambos os extratos.

A média total de mortalidade dos tratamentos com extratos de folhas foi de 93% dos

flebotomíneos, enquanto que para os extratos de cascas foi de 69%.

28


concentrações dos extratos hidroalcoólicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum

Mortalidade %

1h 2h 4h 16h 24h 48h 72h

Mac

hos Folh

as 50 mg/mL 0.04bD 0.04bD 0.07bD 0.13bD 0.38cC 0.71bB 1.00aA

100 mg/mL 0.04bC 0.04bC 0.04bC 0.20bC 0.56bB 0.84bA 0.96aA

200 mg/mL 0.04bD 0.04bD 0.07bD 0.07bD 0.29cC 0.56cB 0.93aA

400 mg/mL 0.07bD 0.09bD 0.11bD 0.22bC 0.33cC 0.53cB 0.73bA

Cas

cas

50 mg/mL 0.00bC 0.00bC 0.00bC 0.00bC 0.11dC 0.44cB 0.80bA

100 mg/mL 0.04bC 0.07bC 0.07bC 0.09bC 0.24cC 0.42cB 0.80bA

200 mg/mL 0.04bC 0.04bC 0.04bC 0.09bC 0.11dC 0.31dB 0.49cA

400 mg/mL 0.00bB 0.00bB 0.00bB 0.02bB 0.11dB 0.24dA 0.40cA

Fêm

eas Folh

as 50 mg/mL 0.09bE 0.09bE 0.11bE 0.27bD 0.56bC 0.71bB 0.98aA

100 mg/mL 0.07bE 0.11bE 0.11bE 0.29bD 0.44cC 0.76bB 0.98aA

200 mg/mL 0.02bE 0.02bE 0.02bE 0.20bD 0.36cC 0.58cB 0.91aA

400 mg/mL 0.11bD 0.11bD 0.11bD 0.13bD 0.29dC 0.67bB 0.93aA

Cas

cas

50 mg/mL 0.00bD 0.00bD 0.00bD 0.02cD 0.20dC 0.51cB 0.91aA

100 mg/mL 0.04bD 0.04bD 0.04bD 0.04bC 0.27dC 0.56cB 0.84bA

200 mg/mL 0.00bD 0.00bD 0.00bD 0.18bC 0.20dC 0.42dB 0.76bA

400 mg/mL 0.00bC 0.00bC 0.00bC 0.02cC 0.11eC 0.27dB 0.49cA

Controle Água (-) 0.00bB 0.00bB 0.00bB 0.02cB 0.04eB 0.09eB 0.42cA

Controle Tween 80 0.00bC 0.00bC 0.00bC 0.07cC 0.13eC 0.31dB 0.51cA

Controle Α-cipermetrina (+) 0.60aB 0.73aB 0.91aA 1.00aA 1.00aA 1.00aA 1.00aA

CV% machos 37.87

CV% fêmeas 28.52 - Letras minúsculas como expoente, quando diferentes na mesma coluna, indicam diferença significativa.

- Letras maiúsculas como expoente, quando diferentes na mesma linha, indicam diferença significativa.

- P<0,05; teste de Scott-Knott.

- Valores destacados em negrito, não diferem estatisticamente.

Os dados do bioensaio com os extratos ciclo- hexânicos são apresentados na tabela

3 onde podemos observar que, no tempo de 72 horas, uma ação inseticida estatisticamente

semelhante ao controle positivo sobre machos e fêmeas para os extratos de folhas a 400

mg/mL e no extrato de cascas a 50mg/mL apenas para machos. Quando observamos a

mortalidade dos tratamentos com extratos em relação aos controles negativo e Tween,

todas as concentrações de folhas e cascas apresentaram taxas de mortalidade superiores a

estes controles.

Em ralação a parte da planta utilizada, as taxas de mortalidade de flebotomíneos

entre folhas e cascas não diferem estatisticamente. Ao compararmos a mortalidade de

machos e fêmeas é possível notar que os machos foram mais sensíveis ao extrato de cascas

do que as fêmeas, enquanto que no extrato de folhas não houve diferença. As médias de

mortalidade total são bastante próximas, com 81% de mortalidade no extrato de cascas e

77% das folhas.

29


concentrações dos extratos ciclo- hexânicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum

Mortalidade %

1h 2h 4h 16h 24h 48h 72h

Mac

hos Folh

as 50 mg/mL 0.07bC 0.04bC 0.07bC 0.09dC 0.16dC 0.44cB 0.71bA

100 mg/mL 0.09bC 0.04bC 0.09bC 0.13dC 0.16dC 0.40cB 0.78bA

200 mg/mL 0.09bC 0.11bC 0.11bC 0.20cC 0.38bB 0.47cB 0.82bA

400 mg/mL 0.11bD 0.04bD 0.18bD 0.40bC 0.47bC 0.71bB 0.91aA

Cas

cas

50 mg/mL 0.07bD 0.09bD 0.13bD 0.20cC 0.24cC 0.69bB 0.96aA

100 mg/mL 0.13bD 0.16bD 0.18bD 0.27cC 0.29cC 0.58bB 0.84bA

200 mg/mL 0.11bD 0.11bD 0.11bD 0.20cC 0.27cC 0.64bB 0.78bA

400 mg/mL 0.02bD 0.04bD 0.04bD 0.13dC 0.18dC 0.42cB 0.84bA

Fêm

eas Folh

as 50 mg/mL 0.02bC 0.07bC 0.02cC 0.11dC 0.16cC 0.33dB 0.71bA

100 mg/mL 0.09bC 0.16bC 0.11bC 0.11dC 0.22cC 0.44cB 0.67bA

200 mg/mL 0.09bD 0.04bD 0.20bC 0.22cC 0.27cC 0.51cB 0.69bA

400 mg/mL 0.13bC 0.11bC 0.22bC 0.58bB 0.67bB 0.73bB 0.89aA

Cas

cas

50 mg/mL 0.04bC 0.02bC 0.04cC 0.16cC 0.16cC 0.49cB 0.73bA

100 mg/mL 0.07bC 0.07bC 0.07cC 0.07dC 0.18cC 0.36dB 0.71bA

200 mg/mL 0.04bC 0.04bC 0.04cC 0.09dC 0.18cC 0.44cB 0.80bA

400 mg/mL 0.09bD 0.11bD 0.13bD 0.24cC 0.33cC 0.58cB 0.82bA

Controle Água (-) 0.00bA 0.00bA 0.00cA 0.00dA 0.00dA 0.02eA 0.02dA

Controle Tween 80 0.00bB 0.00bB 0.00cB 0.00dB 0.00dB 0.07eB 0.24cA

Controle Α-cipermetrina

(+) 0.78aB 0.78aB 0.93aA 0.98aA 1.00aA 1.00aA 1.00aA

CV% machos 25.03




- Valores destacados em negrito, não diferem estatisticamente.

Os dados do bioensaio com os extratos etanólicos são apresentados na tabela 4,

onde podemos observar que não houve ação semelhante ao controle positivo em nenhum

dos tratamentos com extratos. Quando observamos a taxa de mortalidade em relação ao

controle negativo, todos os tratamentos apresentaram maior taxa de mortalidade. Em

relação ao controle Tween a maioria dos tratamentos com extratos tiveram uma taxa de

mortalidade superior, exceto as concentrações das cascas de 100, 200 e 400 mg/mL que

não diferenciaram para fêmeas e 200 mg/mL para machos.

Em relação à parte da planta utilizada, as taxas de mortalidade entre folhas e cascas

diferem estatisticamente, o extrato das folhas apresentou maior atividade inseticida em

relação ao extrato de cascas. Neste caso não foi observada diferença na mortalidade entre

machos e fêmeas para o extrato de folhas, no entanto os machos foram mais sensíveis que

30

as fêmeas no extrato de cascas. A média total de mortalidade das concentrações do extrato

de folhas foi de 71% dos flebotomíneos, enquanto que para o extrato de cascas foi de

50%.


concentrações dos extratos etanólicos das folhas e cascas de Protium heptaphyllum

Mortalidade %

1h 2h 4h 16h 24h 48h 72h

Mac

hos Folh

as 50 mg/mL 0.00bD 0.00bD 0.00bD 0.13bC 0.24bC 0.49bB 0.78bA

100 mg/mL 0.04bC 0.07bC 0.07bC 0.18bC 0.33bB 0.42bB 0.84bA

200 mg/mL 0.04bC 0.04bC 0.11bC 0.18bC 0.27bB 0.36bB 0.73bA

400 mg/mL 0.02bC 0.04bC 0.07bC 0.11bC 0.16cB 0.24cB 0.53cA

Cas

cas

50 mg/mL 0.00bC 0.04bC 0.04bC 0.09bC 0.16cC 0.33bB 0.60cA

100 mg/mL 0.00bB 0.09bB 0.09bB 0.07bB 0.11cB 0.22cB 0.44cA

200 mg/mL 0.04bB 0.04bB 0.04bB 0.09bB 0.09cB 0.31bA 0.36dA

400 mg/mL 0.02bC 0.02bC 0.02bC 0.04bC 0.07cC 0.24cB 0.53cA

Fêm

eas Folh

as 50 mg/mL 0.04bC 0.04bC 0.04bC 0.11bC 0.20bC 0.42bB 0.82bA

100 mg/mL 0.00bD 0.00bD 0.00bD 0.09cD 0.29bC 0.51bB 0.84bA

200 mg/mL 0.00bD 0.00bD 0.07bD 0.20bC 0.24bC 0.44bB 0.71cA

400 mg/mL 0.00bC 0.02bC 0.02bC 0.04cC 0.13cB 0.16cB 0.40dA

Cas

cas

50 mg/mL 0.13bD 0.13bD 0.13bD 0.13bD 0.29bC 0.42bB 0.67cA

100 mg/mL 0.02bC 0.04bC 0.04bC 0.04cC 0.07cC 0.20cB 0.47dA

200 mg/mL 0.00bC 0.00bC 0.00bC 0.00cC 0.00cC 0.24cB 0.47dA

400 mg/mL 0.02bC 0.09bC 0.11bC 0.18bB 0.20bB 0.38bA 0.47dA

Controle Água (-) 0.00bA 0.00bA 0.00bA 0.02cA 0.02cA 0.02dA 0.11eA

Controle Tween 80 0.00bB 0.02bB 0.02bB 0.02cB 0.04cB 0.09dB 0.31dA

Controle Α-cipermetrina (+) 0.67aB 0.91aA 0.98aA 1.00aA 1.00aA 1.00aA 1.00aA

CV% machos 36.63




31

5. DISCUSSÃO

A leishmaniose visceral é uma doença de caráter reemergente que necessita de

uma continuidade das ações de controle para impedir novos surtos da doença onde antes

já fora controlada (BARATA et al., 2013; DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO,

2006). A eliminação do Lutzomyia longipalpis tem se mostrado como um método

bastante eficiente no combate da LV, uma vez que quebra o ciclo da doença. Para o

controle dos flebotomíneos, atualmente são empregados inseticidas piretróides, que são

compostos neurotóxicos de ação rápida sobre insetos (BRASIL, 2014; SANTOS;

AREAS; REYES, 2007). Apesar de serem poucos, já existem relatos de resistência de Lu.

longipalpis a piretróides como a permetrina e a deltametrina (ALEXANDER et al., 2009;

MAZZARRI et al., 1997). No presente trabalho foram utilizados Lu. longipalpis

selvagens. A rápida atuação da α-cipermetrina observada no estudo indica que a

população selvagem utilizada é susceptível a este piretróide.

Nos últimos anos houve um crescimento no interesse por novas moléculas que

possam ser utilizadas no controle de pragas agrícolas e vetores, sendo as plantas uma boa

fonte de pesquisa, pois já produzem moléculas químicas para sua defesa contra insetos e

patógenos (PAINTER, 1951; TARE; DESHPANDE; SHARMA, 2004; VIEGAS-

JÚNIOR, 2003). A ação biológica de P. heptaphyllum tem sido demonstrada em diversos

trabalhos, no entanto quase todos foram realizados com a resina produzida pela planta, a

qual já é bastante conhecida pela grande quantidade de óleo essencial, composto

majoritariamente por mono e sesquiterpenos (ALBINO et al., 2017; CARVALHO;

SOUSA; CHAVES, 2007; DA SILVA et al., 2016; JÚNIOR; SOUZA; CHAVES, 2005;

MAIA et al., 2000; MOBIN et al., 2017).

Na investigação fitoquímica realizada no presente estudo, encontramos a presença

de triterpenos nos extratos hidroalcoólicos, etanólicos e ciclo- hexânicos das folhas e nos

extratos etanólico e ciclo- hexânico das cascas. Também foram observados flavonoides

nos extratos hidroalcoólicos e etanólicos das folhas e cascas. Citó, Costa e Lopes (2006)

e Pontes et al., (2007) em suas pesquisas com óleos essenciais de P. heptaphyllum,

também demonstraram a presença da classe dos terpenos nas folhas desta planta, mais

especificamente os sesquiterpenos. De forma semelhante, Bandeira et al. (2001, 2002)

analisando os metabólitos secundários presentes no óleo essencial das folhas e também

das cascas de P. heptaphyllum, descreveram a presença da classe dos terpenos e dos

flavonoides nas folhas, onde encontraram monoterpenos, sesquiterpenos e o flavonoide

32

quercetina-3-O-ramnosil. Já na casca observaram a presença da cumarina escopoletina.

A classe das cumarinas apesar de ter sido avaliada, não foi observada em nossos testes

fitoquímicos, possivelmente devido à baixa concentração. A utilização de um método de

análise mais sensível, pode evidenciar a presença desta classe mesmo que em baixas

concentrações.

Além dos compostos já citados, também encontramos a presença de esteroides nos

extratos hidroalcoólicos, etanólicos e ciclo- hexânicos das folhas e nos extratos etanólico

e ciclo- hexânico das cascas. Os taninos foram encontrados nos extratos hidroalcoólicos

e etanólicos das folhas e cascas. A classe dos alcaloides foi identificada em todos os

extratos. E a classe das saponinas foi identificada apenas nos extratos hidroalcoólicos.

A classe dos terpenos, que foi encontrada nos três extratos testados, representa

uma grande quantidade de compostos, e consequentemente possuem muitos mecanismos

possíveis de atuação, gerando diversas ações sobre o comportamento alimentício,

reprodutivo e de desenvolvimento de acordo com o modelo biológico utilizado e seu

estágio de vida (VIEGAS-JÚNIOR, 2003). Podem causar distúrbios fisiológicos, inibindo

ou retardando o desenvolvimento do organismo, pode atuar no sistema nervoso periférico

da antena do inseto, reduzir a capacidade reprodutiva ou causar uma supressão de apetite,

causando a morte direta ou indireta por inanição. (SAITO; LUCHINI, 1998; SALLES;

RECH, 1999; VIEGAS-JÚNIOR, 2003).

Protium heptaphyllum que é conhecido pela grande quantidade de terpenos em

sua composição teve a ação acaricida dos óleos essenciais das folhas e frutos testadas

sobre o acaro Tetranychus urticae, que mostrou-se susceptível as duas frações, sendo

mais susceptível ao óleo essencial dos frutos onde observa-se a predominância de

monoterpenos e no óleo essencial das folhas os sesquiterpenos (PONTES et al., 2007a).

Quando comparamos o desempenho da ação inseticida entre os extratos das folhas e

cascas de P. heptaphyllum sobre Lu. longipalpis, também podemos observar diferenças

na mortalidade e na composição química. Estatisticamente os flebotomíneos foram mais

sensíveis aos extratos das folhas nos testes com extratos hidroalcoólico e etanólico. Neste

caso, os extratos hidroalcoólicos das folhas diferem quimicamente dos extratos das

cascas, pela presença de triterpenos e esteroides. Os extratos hidroalcoólicos e etanólicos

das folhas também diferem dos das cascas, quanto aos flavonoides presentes, que são

flavona, flavonóis e chantonas nas folhas e apenas flavonóis nas cascas.

Assim como neste estudo, ação inseticida das folhas de P. heptaphyllum também

foi verificada sobre Lu. longipalpis por Sincurá et al. (2017), que observaram a ação

33

inseticida do extrato aquoso em duas das quatro concentrações testadas, efeito que foi

associado aos terpenos presentes nesta parte da planta. Em outros trabalhos realizados

com Lu. longipalpis a classe dos terpenos também foi relacionada a atividade inseticida,

como podemos observar em Maciel et al., (2009, 2010a, 2010b) que demonstraram a ação

inseticida de óleos essenciais de Eucalyptus staigeriana, Eucalyptus citriodora,

Eucalyptus globulus (eucaliptos), Lippia sidoides, Coriandrum sativum e da Azadirachta

indica (nim) sobre os três estádios de desenvolvimento de Lu. longipalpis.

As plantas popularmente chamadas de nim são conhecidas por possuírem uma

grande quantidade de terpenos como a azadiractina que tem atividade inseticida

comprovada. Por isso são bastante utilizadas em estudos que avaliam sua atividade

biológica, como por exemplo no trabalho supracitado com o óleo essencial de

Azadirachta indica. Andrade-Coelho et al. (2009) avaliaram a ação de extratos brutos de

frutos e folhas de Azadirachta indica e Melia azedarach misturados a alimentação padrão

das larvas de Lu. longipalpis, causando altas taxas de mortalidade e bloqueio da muda.

A azadiractina isolada também foi testada sobre larvas ainda através da

alimentação, onde também observaram grande número de larvas mortas e bloqueio da

muda (ANDRADE-COELHO et al., 2006). Esses resultados mostram que os terpenos

além de ter efeito larvicida, atuam como inibidores do crescimento de Lu. longipalpis.

Tendo em vista ação inseticida de P. heptaphyllum sobre Lu. longipalpis observada neste

estudo, é interessante uma futura avaliação dos extratos brutos das folhas e cascas de P.

heptaphyllum utilizando esta metodologia.

A classe das saponinas foi identificada nos extratos hidroalcoólicos de P.

heptaphyllum. Estas representam um amplo grupo de moléculas glicosadas, esteroidais

ou triterpênicas, que alteram a permeabilidade da membrana celular, alterando seu

funcionamento ou causando sua destruição (SIMONS et al., 2006). São comumente

encontrados nas plantas e empregados na defesa contra herbívoros e microrganismos,

sendo consideradas ótimos fitoprotetores (SAITO; LUCHINI, 1998). Algumas saponinas

esteroidais, apresentam toxicidade a mamíferos, mas são frequentemente mais tóxicas a

peixes e insetos (PAPADOPOULOU et al., 1999). A ação larvicida das saponinas

também já foi observada sobre larvas de Aedes aegypti (PAULINO et al., 2014).

As plantas amazônicas Antonia ovata e Derris amazonica que são conhecidas

como timbós, são a muito tempo utilizadas por tribos amazônicas na pesca devido sua

ação ictiotóxica (LUITGARDS-MOURA et al., 2002). Estas são plantas que tem sua

composição química já bem estabelecida e a grande quantidade de saponinas e rotenonas

34

é conhecida (LUITGARDS-MOURA et al., 2002). Os extratos aquosos das folhas de

Antonia ovata e raízes de Derris amazonica, foram testados sobre machos e fêmeas de

Lu. longipalpis. Ambas as plantas apresentaram efeitos inseticidas sendo os machos mais

afetados por Antonia ovata e as fêmeas por Derris amazonica. (LUITGARDS-MOURA

et al., 2002). No presente estudo as saponinas foram identificadas apenas no extrato

hidroalcoólico, onde foi observada a maior taxa de mortalidade dentre os três extratos

testados. De forma semelhante aos resultados encontrados para Derris amazonica,

também observamos uma maior susceptibilidade das fêmeas, neste caso para o extrato

hidroalcoólico de folhas e cascas de P. heptaphyllum.

Os taninos, outra classe que foi identificada nos extratos hidroalcoólicos e

etanólicos, são substâncias conhecidas por sua capacidade de precipitar proteínas e pela

capacidade de oxidar no intestino dos insetos, liberando moléculas reativas ao oxigênio

(BARBEHENN; PETER CONSTABEL, 2011). Também atuam na inativação de

enzimas digestivas, dificultando a digestão em mamíferos e também nos insetos, desta

forma reduz o crescimento e dificulta sua sobrevivência e reprodução (CAVALCANTE;

MOREIRA; VASCONCELOS, 2006).

Testes realizados com taninos isolados das cascas da planta Magonia pubescens

tiveram ação inseticida observada sobre larvas de Aedes aegypti (SILVA et al., 2004). Do

mesmo modo, Valotto et al. (2011) também utilizando Magonia pubescens observaram a

ação larvicida de uma fração rica em taninos sobre as larvas de Aedes aegypti. Neste caso

através da dessecação e observação das larvas mortas utilizando metodologia adequada,

foi possível afirmar que o efeito larvicida ocorreu devido a destruição celular do intestino

médio (VALOTTO et al., 2011).

Fernández-Sales et al. (2011) testaram extratos ricos em taninos confeccionados

com as plantas Acacia pennatula, Piscidia piscipula, Leucaena leucocephala e Lysiloma

latisiliquum sobre larvas e adultos do ácaro Rhipicephalus (Boophilus) microplus

(carrapato). Sobre as larvas foi observada atividade acaricida para os extratos das quatro

plantas, já nas formas adultas não houve atividade acaricida, no entanto os extratos

causaram a inibição da eclosão dos ovos (FERNÁNDEZ-SALAS et al., 2011).

Considerando que a via de ação biológica dos taninos sobre insetos é por meio da

sua ingestão e a eficiência biocida dos taninos apenas sobre as larvas do ácaro

Rhipicephalus (Boophilus) microplus e do díptero Aedes aegypti, é possível que a ação

inseticida dos extratos hidroalcoólicos e etanólicos de P. heptaphyllum sobre insetos

adultos de Lu. longipalpis, não estejam associadas a esta classe de compostos. Em outro

35

momento uma investigação com uso desses extratos na ração padrão de larvas de Lu.

longipalpis pode revelar ação semelhante ao encontrado para as larvas de Aedes aegypti.

Entre as várias classes de compostos identificados nos extratos de folhas e cascas

de P. heptaphyllum, os flavonoides são um importante achado. Essas moléculas são

comumente mais tóxicas para peixes e insetos, neste último causam deterrência alimentar,

além de afetar funções locomotoras, causando paralisia e morte (SAITO; LUCHINI,

1998). A ação antienzimas destes compostos também tem sido investigada e observada

sobre outros grupos, como por exemplo a capacidade inibitória da acetilcolinesterase que

foi evidenciada em um estudo para o tratamento do mal de Alzheimer (SALLES-

TREVISAN et al., 2006).

A ação inibitória de enzimas pode ser um importante mecanismo a ser explorado

e empregado no controle de insetos vetores. Wang et al. (2016) já demonstraram que os

flavonoides têm ação inibitória do mecanismo de desintoxicação em insetos,

potencializando a ação de inseticidas através do sinergismo entre as moléculas. A

interrupção da capacidade de desintoxicação é de grande importância, uma vez que este

processo favorece a sobrevivência de indivíduos que entraram em contato com compostos

inseticidas, o que resulta na seleção de indivíduos com características genéticas

tolerantes, e a longo prazo conferem resistências a uma molécula ou um grupo químico

(RIDLEY, 2006).

A classe dos alcaloides foi a única comum a todos os extratos de P. heptaphyllum.

Esses compostos são tóxicos para os insetos mesmo em pequenas quantidades, causando

diretamente a morte do indivíduo, e em alguns casos também atuam como deterrentes da

alimentação (MELLO; SILVA-FILHO, 2002). De forma semelhante aos taninos os

alcaloides têm sua ação sobre o organismo após ser ingerido, um estudo com larvas de

Lymantria díspar, que são herbívoros generalista quanto a sua preferência alimentar,

demostrou a dissuasão alimentar das larvas em relação as folhas onde foram aplicadas

substancias alcaloides (SHIELDS et al., 2008). Em conjunto com outros inseticidas

também pode atuar de forma sinérgica, potencializando toxicidade das moléculas sobre

os insetos, através da inibição do sistema de desintoxicação (FEYEREISEN, 1999).

Estudos com produtos derivados de plantas estão sujeitos a grandes variações, pois

os extratos são compostos por um conjunto de substâncias, que estão sujeitas a variações

quanto ao tipo e concentrações dos constituintes químicos, que são alterados de acordo

com os fatores bióticos e abióticos incidentes sobre a planta, como a ação de predadores

36

e patógenos, intensidade luminosa, disponibilidade de água, nutrientes e tipo de solo onde

ela se encontra (TAYLOR et al., 2001).

Desta forma, a presença destes compostos nas folhas e cascas de P. heptaphyllum

indica sua capacidade inseticida contra Lu. longipalpis. No entanto, maiores estudos

necessitam ser realizados para investigar uma fração mais pura para que possa ser

utilizado de forma efetiva. Além disso é interessante também investigar se há variação

sazonal dos compostos químicos da planta para definir qual a melhor época de colheita

para se obter o resultado desejado.

37

6. CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos, concluímos que:

As folhas e cascas de Protium heptaphyllum possuem um grande potencial

fitoquímico para uso no controle biológico.

A população selvagem de Lutzomyia longipalpis testada neste estudo mostrou ser

sensível à α-cipermetrina.

Os extratos hidroalcoólicos e ciclo- hexânicos de Protium heptaphyllum tiveram ação

inseticida semelhante a α-cipermetrina sobre Lu. longipalpis.

Fêmeas de Lu. longipalpis são mais sensíveis aos extratos hidroalcoólicos de folhas e

cascas de P. heptaphyllum.

Machos de Lu. longipalpis são mais sensíveis aos extratos ciclo- hexânico de casca e

etanólico de cascas.

38

7. REFERÊNCIAS

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46

8. APÊNDICE

Effect of Aqueous Extract of Protium heptaphyllum (Burseraceae) on Lutzomyia

longipalpis (Diptera: Psychodidae), a Proven Vector of Visceral Leishmaniasis in

Brazil

universidade federal dos vales do jequitinhonha e...

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