universidade federal dos vales do jequitinhonha e...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Química de Minas Gerais
Lívia Mara Fontes Costa Torres
SÍNTESE DE NANOESTRUTURAS DE ALUMINA CONTENDO O PEPTÍDEO
ANTIMICROBIANO BP100 PARA APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Diamantina
2018
Lívia Mara Fontes Costa Torres
SÍNTESE DE NANOESTRUTURAS DE ALUMINA CONTENDO O PEPTÍDEO
ANTIMICROBIANO BP100 PARA APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
Multicêntrico em Química de Minas Gerais da
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e
Mucuri como requisito parcial para obtenção do
título de Doutora em Química.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Moreira Verly
Coorientador: Dr. Marcelo Porto Bemquerer
Diamantina
2018
Aos meus pais,
Simone e Antônio,
que sempre priorizaram minha educação.
AGRADECIMENTOS
A Deus agradeço pela perfeição da criação em toda sua grandeza e em todos seus detalhes,
por nos ter permitido a curiosidade e por deixar aqui todas as respostas, permitindo a
insistência na busca e a alegria da conquista. Obrigada Senhor, por preencher minha mente e
meus instintos com Sua luz, me concedendo saúde, abençoando meu dia-a-dia, me guiando
pelas minhas escolhas e permitindo a conclusão de mais essa jornada, sem Ti nada seria
possível. Agradeço por ter colocado em meu caminho todas as pessoas que tanto contribuíram
para a conclusão desse trabalho, algumas acrescentaram muito conhecimento e sabedoria
outras preencheram todo vazio com alegria, carinho e amor. E todas foram essenciais para que
eu chegasse até aqui.
Aos meus pais agradeço por tanto incentivo à minha educação, eu jamais chegaria aqui sem a
base que vocês me proporcionaram. Vocês foram pilares para as minhas conquistas
acadêmicas e pessoais.
Aos meus irmãos, Thales e Maurício, agradeço pelo companheirismo, pela amizade e pelo
amor incondicional. Por acreditarem e confiarem tanto na minha capacidade. Espero ser
exemplo e não decepcioná-los.
Aos meus sobrinhos, Bia, Laurinha, Yasmin e Arthur, peço desculpas por tantos momentos
ausente e agradeço por fazerem a minha vida muito mais bonita!
Ao meu marido, professor e pesquisador, Wallans, agradeço por ser completamente
apaixonado pela pesquisa, por ser exemplo de dedicação e esforço e por todos os
ensinamentos. Adoro nossas conversas regadas a cerveja e muita química! Obrigada por
aceitar entrar e permanecer na minha vida, minha vida! Você contribuiu muito para a
conclusão desse trabalho.
Estendo a paixão pela pesquisa também ao meu orientador, o amor àquilo que se faz é o maior
incentivador que um aluno poderia ter. Isso nos faz querer ir mais longe, nos instiga a busca, o
interesse e a persistência. Obrigada pelo entusiasmo com o trabalho, isso é contagiante!
Agradeço também pelos ensinamentos, pela dedicação e empenho, se hoje cheguei até aqui
foi porque encontrei apoio e encorajamento no decorrer de todos esses quatro anos.
Ao meu coorientador Marcelo Bemquerer agradeço por toda dedicação e interesse no
trabalho, pelas várias análises de espectrometria de massa e por todos os ensinamentos. À
Magali agradeço pela disposição em ir de Brasília a BH só para me auxiliar na MET e por
toda ajuda sempre oferecida. Deixo aqui um agradecimento muito especial a vocês.
Aos amigos que o LASEB me trouxe, agradeço pelos momentos de alegria e por toda ajuda
no decorrer desse trabalho. Somos uma equipe e trabalhando dessa forma garantimos não
apenas o sucesso coletivo, mas também o individual. A alegria de todos com a conquista de
cada um fazem do LASEB um lugar muito agradável de trabalhar. Espero que esse grupo
continue assim.
Quero agradeço especialmente à Natália, aluna de iniciação científica, que sintetizou muitas
nanopartículas de alumina para mim!
Com um carinho muito grande, agradeço à Mainara, por toda dedicação e esforço, só nós duas
sabemos o quanto foi difícil, estressante, cansativo física e mentalmente. Não foi nada fácil,
mas valeu a pena. Obrigada também pela companhia e pela amizade. Juntas conseguimos
chegar muito mais longe!
Também quero agradecer ao Lúcio, à Isabela, ao Kelton, à Carol e à Nara, com certeza vocês
tornaram essa difícil jornada muito mais feliz.
A todos os amigos do ICT, em especial aos técnicos de química Dilton, Breno e Thiaguinho,
que sempre se dispuseram em me ajudar, em todas e muitas vezes que precisei, muito
obrigada, o apoio de vocês foi fundamental!
Também não poderia deixar de agradecer à Keyla e ao Tiago Guedes, que se dispuseram a me
ajudar com a calcinação das amostras de nanopartículas.
Ilvinha, muito obrigada pela ajuda com a microscopia óptica, jamais conseguiria focalizar
tantas lâminas!
Ao Felipe, Saulo e João, agradeço pela ajuda com os “ajustes técnicos” que alguns aparatos
utilizados nesse trabalho foram submetidos.
Ao técnico Teles, agradeço pelas análises de Raios-x e MEV, e também aos professores
Márcio e Manuel pelos ensinamentos imprescindíveis na interpretação dos difratogramas e
compreensão dessa técnica. Ao professor João Paulo agradeço pela grande contribuição com
as análises de termogravimetria e MET.
À técnica Kelly, agradeço por liofilizar minhas amostras dezenas de vezes, e pela paciência,
pela disponibilidade e ótimo humor nos ensaios microbiológicos, mesmo quando a leitura
precisava ser feita à 1h da madrugada! Também à professora Helen, agradeço por
disponibilizar seu laboratório e materiais para a execução destes ensaios.
À técnica Vanessa, agradeço pela disponibilidade do UV, foram aproximadamente 12345678
leituras! Ao técnico Abraão, agradeço pelas inúmeras tentativas de quantificação pela técnica
de análise elementar, não deu certo, mas aprendi bastante!
À professora Mariana, agradeço por disponibilizar seu laboratório e equipamentos para
execução das análises de dicroísmo circular e espectrometria de massa. Ao professor
Guilherme e à Flavinha, agradeço pela colaboração nos primeiros ensaios de citotoxicidade.
Agradeço também ao professor Victor, presença diária no laboratório, as conversas do dia-a-
dia esclareceram muitas dúvidas, obrigada pela enorme disponibilidade em ajudar!
À Talita, agradeço por todas as contribuições, principalmente no fechamento dos nossos
artigos!
Pelos momentos de alegria e pela amizade, quero agradecer aos amigos-irmãos que a vida me
deu, Maraísa e Eduardo! Vocês são muito especiais para mim!
Não se chega a lugar algum sozinho e sei que, dessa vez, alcancei grandes distâncias. Muito
obrigada, todos vocês!
“A parte que ignoramos é muito maior que tudo quanto sabemos.”
Platão
RESUMO
Nanopartículas de alumina contendo peptídeos antimicrobianos podem ser uma estratégia
promissora para modelar dispositivos nanoestruturados para uso em implantes e próteses, com
interesse de substituição óssea, uma vez que a contaminação por patógenos pode ser reduzida.
Neste trabalho, é apresentada a síntese de nanobioestruturas de alumina em morfologia
fibrosa, bem como a sua funcionalização com o peptídeo BP100 através de três diferentes
estratégias de síntese: (i) via formação de uma ligação amídica entre o grupo amino de
nanopartículas funcionalizadas e a cadeia lateral do resíduo de ácido glutâmico do peptídeo;
(ii) através de ligação de dissulfeto entre nanopartículas funcionalizadas com o grupo tiol e
cadeia lateral de resíduos de cisteína do peptídeo e (iii) por meio da reação de cicloadição 1,3-
dipolar entre as nanopartículas funcionalizadas com o grupo azido e a cadeia lateral de
propargilglicina do resíduo de aminoácido do peptídeo. Das três rotas de síntese
desenvolvidas neste trabalho, verificou-se que o maior grau de substituição foi alcançado nas
nanopartículas formadas a partir da reação de cicloadição catalisada por cobre (I). O trabalho
apresenta ainda ampla caracterização estrutural e fisco-química das nanopartículas
funcionalizadas empregando-se técnicas como difração de raios-x, microscopia eletrônica de
transmissão, espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier,
ressonância magnética nuclear e outras técnicas físico-químicas. Os dados de atividade
antimicrobiana das nanobioestruturas obtidas mostram que as nanopartículas de alumina são
ativas apenas após a funcionalização com o peptídeo BP100. Além disso, os estudos
conformacionais por dicroísmo circular e de interação por ressonância plasmônica de
superfície revelaram que as cadeias peptídicas mesmo ligadas covalentemente às
nanopartículas de alumina conseguem estabelecer uma interação peptídeo-membrana, a partir
da qual perturbam a estrutura da membrana microbiana exercendo assim seus mecanismos de
ação.
Palavras-chave: Nanobioestrutura. Nanopartícula. Alumina.Peptídeo antimicrobiano. BP100.
ABSTRACT
Alumina nanoparticles containing antimicrobial peptides represent a promising strategy for
the development of bioactive nanostructured devices for use in orthopedic and orthodontic
implants, since pathogen contamination can be reduced. In this work, the synthesis of alumina
nanobioestructures with fibrous morphology, as well as their functionalization with the BP100
peptide through three different synthesis strategies are presented: (i) via an amide bond
formation between the amino group of functionalized nanoparticles and the side chain of the
glutamic acid residue; (ii) by disulfide bonding between thiol groups of functionalized
nanoparticles and the side chains of cysteine residues and (iii) through 1,3-dipolar
cycloaddition reaction between azide group of nanoparticles functionalized and the side chain
of propargylglycine amino acid residue. From the three synthetic routes developed in this
work it was verified that the highest substitution degree was achieved in the nanoparticles
formed from the copper(I)-catalyzed reaction. This work also presents an extensive set of
structural and physic-chemical characterization of the functionalized nanoparticles by using
techniques such as x-ray diffraction, transmission electron microscopy, Fourier transform
infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance and other physico-chemical techniques.
The antimicrobial activity assays for the nanobiostructures and alumina nanoparticles show
significant activity only after functionalization with the BP100 peptide. In addition,
interaction and conformational studies carried out by surface plasmon resonance and circular
dichroism, respectively, revealed that peptide chains are able to establish interaction with
phospholipidic bilayer in a helical conformation even covalently bound to alumina
nanoparticles, from which result in microbial membrane disruption, exerting their
mechanisms of action.
Key-words: Nanobiostructured. Nanoparticle. Alumina. Antimicrobial peptide. BP100
.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática das principais propostas de mecanismo de ação de
peptídeos antimicrobianos: modelo de formação do barril (A), modelo de formação do poro
toroidal (B), modelo carpete (C) e modelo detergente (D).......................................................42
Figura 2 – Estrutura secundária de peptídeos antimicrobianos: α-hélice (A) e β-folha
(B).............................................................................................................................................45
Figura 3 – Ângulos de rotação ϕ e ψ presentes em estruturas peptídicas (A). Espectros de
dicroísmo circular característicos de peptídeos não estruturados (espectro em vermelho), de
peptídeos estruturados em α-hélice (espectro em amarelo) e em β-folha (espectro em azul)
(B).............................................................................................................................................46
Figura 4 – Projeção helicoidal da sequência peptídica primária do BP100..............................47
Figura 5 – Mecanismo de ação do peptídeo antimicrobiano BP100 proposto por Manzini et al.
(2014)........................................................................................................................................48
Figura 6 – Esquema de estratégias para o desenvolvimento de materiais bioativos: superfície
de materiais contendo os ativos antimicrobianos adsorvidos a superfície (A) e superfície de
materiais ligados covalentemente aos agentes antimicrobianos (B).........................................53
Figura 7 – Estratégias para a imobilização de PAM na superfície de materiais.......................58
Figura 8 – Esquema demonstrativo da ligação covalente entre nanopartículas de alumina e as
cadeias peptídicas dos derivados EAAA-BP100 (A), CAAA-BP100 (B) e [Pra]GAAA-BP100
(C).............................................................................................................................................60
Figura 9 – Resina Rink®
amida.................................................................................................61
Figura 10 – Esquema das etapas de desproteção, acoplamento e clivagem realizadas na SPFS
empregando-se a estratégia Fmoc.............................................................................................64
Figura 11 – Esquemas demonstrativos de parte da estrutura química dos peptídeos
[Pra]GAAA-BP100 (A) e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (B) e da nanobioestrutura NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100 (C)..................................................................................................................67
Figura 12 – Etapas sequenciais das três estratégias para obtenção das nanobioestruturas do
BP100........................................................................................................................................69
Figura 13 – Aparato para realização da reação entre nitrato de alumínio e carbonato de sódio
(A) e esquema demonstrativo das reações envolvidas na obtenção das nanopartículas de
alumina (B)...............................................................................................................................70
Figura 14 – Mecanismo de remoção do grupo protetor Fmoc utilizando solução de PIPE em
DMF com posterior formação do aduto dibenzofulveno-piperidina........................................75
Figura 15 – Etapas sequenciais do processo de obtenção de LUV...........................................85
Figura 16 – Mecanismo de reação para remoção do grupo Fmoc............................................90
Figura 17 – Mecanismo de ativação da carboxila da porção C-terminal seguida da formação
de uma ligação peptídica...........................................................................................................91
Figura 18 – Perfil cromatográfico analítico de amostra bruta dos peptídeos BP100 (A),
EAAA-BP100 (B), CAAA-BP100 (C) e [Pra]GAAA-BP100 (D)...........................................95
Figura 19 – Espectro de massa MS dos peptídeos BP100 (A), EAAA-BP100 (B), CAAA-
BP100 (C) e [Pra]GAAA-BP100 (D).......................................................................................97
Figura 20 – Possíveis regiões de clivagem da cadeia peptídica gerando os íons: a, b, c, x, y e
z.................................................................................................................................................98
Figura 21 – Interpretação dos espectros de massa MS/MS dos peptídeos BP100 (A), EAAA-
BP100 (B), CAAA-BP100 (C) e [Pra]AAA-BP100 (D). Íons da série b estão apresentados em
azul escuro e íons da série y em vermelho. Íons em azul claro não foram observados no
espectro, mas são característicos da molécula analisada. Os imônios estão indicados por
setas...........................................................................................................................................99
Figura 22 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-EAAA-BP100.................101
Figura 23 – Esquema demonstrativo da reação entre as hidroxilas imobilizadas em NP-OH e o
Si presente no APTES para a introdução de grupos contendo terminações amino na superfície
do óxido de alumínio...............................................................................................................103
Figura 24 – Espectros de ressonância magnética nuclear (13
C) em fase sólida de NP, NP-OH e
NP-NH2...................................................................................................................................103
Figura 25 – Difratograma de raios-x de nanopartículas de alumina. Em (A) planos cristalinos
e padrão de refinamento Rietveld de nanopartículas (NP) de -Al2O3. Em (B) difratograma de
raios-x de NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100..........................................................104
Figura 26 – Célula unitária de arranjo cúbico (duplicada no desenho) de -Al2O3................105
Figura 27 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura de nanopartículas de Al2O3.
Agregados de nanopartículas evidenciados por círculos brancos, aumento de 2000 vezes (A).
Presença de agregado central e estruturas menores no entorno, aumento de 10000 vezes
(B)...........................................................................................................................................106
Figura 28 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de NP (A e C) e NP-EAAA-
BP100 (B e D).........................................................................................................................107
Figura 29 – Espectro de infravermelho de nanopartículas e do peptídeo EAAA-BP100. À
esquerda, o espectro de NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100. À direita, comparação
entre os espectros de EAAA-BP100 e NP-EAAA-BP100......................................................108
Figura 30 – Curvas termogravimétricas de porcentagem de perda de massa (A) e da primeira
derivada da perda de massa (B) para as nanopartículas NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-
BP100......................................................................................................................................109
Figura 31 – Valores de potencial zeta para NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 em
tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Em (A) acompanhamento da variação do potencial zeta ao
longo de 60 min. Em (B) média dos valores obtidos e os respectivos
desvios.....................................................................................................................................110
Figura 32 – Espectros de dicroísmo circular dos peptídeos BP100 (A) e EAAA-BP100 (B) e
das nanopartículas NP, NP-NH2 (ambas em LUV POPC:POPG (3:1) 1 mM) e NP-EAAA-
BP100 (C) em tampão Tris-HCl, pH 8,5, e na presença de LUV POPC:POPG
(3:1).........................................................................................................................................116
Figura 33 – Intensidade da fluorescência de carboxifluoresceína ao longo do tempo devido a
adição de NP, EAAA-BP100 e NP-EAAA-BP100 em LUV de POPC:POPG (3:1) contendo
CF............................................................................................................................................117
Figura 34 – Esquema demonstrativo da interação das cadeias de peptídeo imobilizadas na
superfície de nanopartículas de formato alongado (A) e formato esférico (B) com a bicamada
fosfolipídica evidenciando o maior número de peptídeos em contato simultâneo quando
imobilizados em partículas alongadas.....................................................................................118
Figura 35 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-CAAA-BP100 (rota
2).............................................................................................................................................120
Figura 36 – Demonstração de possíveis ligações de dissulfeto (indicadas pelas setas): entre
derivados de cisteína em uma mesma nanopartícula (A), entre derivados de cisteína
imobilizados em nanopartículas distintas (B) e entre duas cadeias peptídicas de CAAA-BP100
(C)...........................................................................................................................................121
Figura 37 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
(rota 3)...................................................................................................................................123
Figura 38 – Mecanismo de reação proposto para a reação de cicloadição 1,3-dipolar entre o
alcino terminal da propargilglicina e azida imobilizada em nanopartículas de Al2O3 com base
no trabalho de Worrell, Malik e Fokin (2013)........................................................................124
Figura 39 – Perfil cromatográfico analítico de amostra bruta dos peptídeos [Pra]GAAA-
BP100 (A) e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (B)...............................................................................125
Figura 40 – Espectro de massa MS do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100..............................126
Figura 41 – Interpretação do espectro de massa MS/MS do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100.
Íons da série b estão apresentados em azul e íons da série y em vermelho. Íons em azul claro
não foram observados no espectro, mas são característicos da molécula analisada. Os imônios
estão indicados por setas.........................................................................................................126
Figura 42 – Difratograma de raios-x de nanopartículas de alumina características de cada
etapa de funcionalização das rotas de síntese 2 e 3.................................................................127
Figura 43 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de NP (A, B e C), NP-CAAA-
BP100 (D e E) e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (F e G)............................................................128
Figura 44 – Espectro de infravermelho de peptídeos e nanopartículas característicos das
estapas de funcionalização das rotas de síntese 2 e 3.............................................................130
Figura 45 – Espectros de ressonância magnética nuclear (13
C) em fase sólida das
nanopartículas de alumina em cada uma das etapas de funcionalização até obtenção de NP-
CAAA-BP100 (rota 2) e de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3)........................................132
Figura 46 – Curvas termogravimétricas de porcentagem de perda de massa (A e C) e da
primeira derivada da perda de massa (B e D). Estão apresentadas as curvas para as
nanopartículas de alumina em cada uma das etapas de funcionalização da rota 2 (A e B) e da
rota 3 (C e D).........................................................................................................................134
Figura 47 – Potencial zeta de nanopartículas de alumina em tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
Acompanhamento da variação do potencial zeta ao longo de 60 min das nanopartículas
provenientes da rota 2 (A) e da rota 3 (B). Em (C) média dos valores de potencial zeta obtidos
e os respectivos desvios para as nanopartículas das rotas de síntese 2 e
3...............................................................................................................................................136
Figura 48 – Espectros de dicroísmo circular dos peptídeos CAAA-BP100 (A) e [Trz-β-
A1]AAA-BP100 (B) e das nanopartículas em cada etapa de funcionalização da rota 2 (C) e da
rota 3 (D) em tampão Tris-HCl, pH 8,5, e na presença de LUVs POPC:POPG (3:1) (1 mM
para as nanopartículas)............................................................................................................142
Figura 49 – Sensogramas de interações com bicamada lipídica de NP, suas formas derivadas e
peptídeos livres medidas por SPR. Curvas obtidas para as espécies envolvidas nas etapas de
funcionalização da rota 2 (A) e da rota 3 (B). C e D mostram curvas obtidas em diversas
concentrações de peptídeo para NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100,
respectivamente. Em (E) estão apresentadas as curvas para determinação dos valores de
Ka.............................................................................................................................................144
Figura 50 – Em (A) espectro de UV evidenciando pico de absorção do aduto dibenzofulveno-
piperidina em 301 nm. Em (B) curva analítica obtida com o aduto dibenzofulveno-piperidina
(produto de desproteção da resina Rink®
amida 0,79 mnmol.g-1
) em PIPE/DMF 1:20
(v:v).........................................................................................................................................174
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Protocolo para solvatação da resina.......................................................................61
Quadro 2 – Protocolo de desproteção: para remoção do grupo protetor de terminação amino,
Fmoc..........................................................................................................................................62
Quadro 3 – Protocolo para acoplamento de derivado de aminoácido.......................................62
Quadro 4 – Protocolo de lavagem para remoção de resíduos e excesso de reagentes..............63
Quadro 5 – Protocolo para realização do teste de Kaiser..........................................................63
Quadro 6 – Protocolo para realização do procedimento de clivagem.......................................66
Quadro 7 – Protocolo para remoção do grupo protetor Fmoc e recolhimento do produto
gerado........................................................................................................................................77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Estatística da atividade biológica de peptídeos do banco de dados de peptídeos
antimicrobianos.........................................................................................................................40
Tabela 2 – Biomateriais baseados em peptídeos antimicrobianos............................................54
Tabela 3 – Sequência de aminoácidos da estrutura primária dos peptídeos BP100, EAAA-
BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100 sintetizados.......................................................59
Tabela 4 – Derivados de aminoácidos utilizados na síntese dos peptídeos BP100
(MM:1420,872 g.mol-1
), EAAA-BP100 (MM: 1763,224 g.mol-1
), CAAA-BP100 (MM:
1737,251 g.mol-1
) e [Pra]GAAA-BP100 (1729,16 g.mol-1
).....................................................61
Tabela 5 – Solução empregada na etapa de clivagem para obtenção dos peptídeos
sintéticos....................................................................................................................................65
Tabela 6 – Grupos protetores de cadeias laterais reativas dos derivados de aminoácido
empregados na síntese dos peptídeos BP100 e análogos, e seus respectivos tempos mínimos
de reação de clivagem...............................................................................................................65
Tabela 7 – Concentrações de peptídeo e/ou nanopartícula presentes em cada amostra utilizada
no ensaio de atividade antibacteriana........................................................................................82
Tabela 8 – Concentrações de peptídeo e/ou nanopartícula presentes em cada amostra utilizada
no ensaio de atividade antifúngica............................................................................................83
Tabela 9 – Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo BP100....................................92
Tabela 10 – Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo EAAA-BP100......................92
Tabela 11 – Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo CAAA-BP100.....................93
Tabela 12 – Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo [Pra]GAAA-BP100............ 94
Tabela 13 – Valores de MIC obtidos para os peptídeos BP100 e EAAA-BP100 e para as
nanobioestruturas NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 contra cepas de bactérias (E.
coli, S. typhimurium e S. aureus) e leveduras (C. krusei e C. parapsilosis).......................113
Tabela 14 – Valores de MIC obtidos sobre cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e S.
aureus) para os peptídeos BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 e para as
nanopartículas em cada etapa de funcionalização até a obtenção da NP-CAAA-BP100 e NP-
[Trz-β-A1]AAA-BP100...........................................................................................................138
Tabela 15 – Valores de MIC obtidos sobre leveduras (C. kruseie C. parapsilosis) para os
peptídeos BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 e para as nanopartículas em cada
etapa de funcionalização até a obtenção da NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-
BP100......................................................................................................................................139
Tabela 16 – Grau de imobilização e valores de MIC obtidos para as nanoestruturas NP-
EAAA-BP100, NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 contra cepas de bactérias (E.
coli, S. typhimurium e S. aureus) e leveduras (C. krusei e C. parapsilosis)...........................147
Tabela 17 – Estrutura química dos 20 aminoácidos essenciais..............................................169
Tabela 18 – Íons fragmento das séries b e y do peptídeo BP100 – Massa monoisotópica:
1419,959..................................................................................................................................171
Tabela 19 – Íons fragmento das séries b e y do peptídeo EAAA-BP100 – Massa
monoisotópica: 1762,113........................................................................................................171
Tabela 20 – Íons fragmento das séries b e y do peptídeo CAAA-BP100 – Massa
monoisotópica: 1736,079........................................................................................................171
Tabela 21 – Íons fragmento das séries b e y do peptídeo do peptídeo [Pra]GAAA-BP100 –
Massa monoisotópica: 1729,114.............................................................................................172
Tabela 22 – Íons fragmento das séries b e y do peptídeo do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 –
Massa monoisotópica: 1771,124.............................................................................................172
Tabela 23 – Concentrações das alíquotas obtidas pela desproteção da resina Rink®
amida 0,79
mmol.g-1
utilizadas na elaboração da curva analítica e os respectivos valores de absorbância
obtidos pela leitura em UV a 301 nm.....................................................................................174
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
A absorbância
ACN acetonitrila
APD banco de dados de peptídeos antimicrobianos, do inglês antimicrobial
peptide database
APTES 3-aminopropiltrietoxisilano
Boc t-butoxicarbonil
C concentração
CD dicroísmo circular, do inglês circular dichroism
CF 5,6-carboxifluoresceína
CLAE cromatografia líquida de alta eficiência
CPTES 3-cloropropiltrietoxisilano
DCM diclorometano
DIC N,N’-diisopropilcarbodiimida
DLS espalhamento de luz dinâmico, do inglês dynamics light scattering
DMF N,N-dimetilformamida
DRX difração de raios-x
EDAC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EDT 1,2-etanoditiol
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético, do inglês ethylenediamine
tetraacetic acid
EM espectrometria de massa
Equiv. equivalente
ESI ionização por eletro-spray, do inglês electron spray ionization
Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila
FTIR espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier, do
inglês Fourier transform infrared spectrometry
HA hidroxiapatita
HOBt 1-hidroxibenzotriazola
IPA álcool isopropílico
LPS lipopolissacarídeo
LUV vesículas grandes unilamelares, do inglês large unilamellar vesicles
MALDI dessorção/ionização de matriz assistida por laser, do inglês matrix
assisted laser dessorption/ionization
MET microscopia eletrônica de transmissão
MIC concentração inibitória mínima, do inglês minimal inhibitory
concentration
MOPS ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico, do inglês 3-(N-
morpholino)propanesulfonic acid
MS espectrometria de massa, do inglês mass espectrometry
MTT brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio
NP nanopartículas de alumina calcinadas
NP-CAAA-BP100 nanopartículas de alumina contendo o peptídeo CAAA-BP100
imobilizado em sua superfície
NP-Cl nanopartículas de alumina contendo átomos de Cloro imobilizados
NP-Cys nanopartículas de alumina contendo resíduo de cisteína imobilizado
NP-EAAA-BP100 nanopartículas de alumina contendo o peptídeo EAAA-BP100
imobilizado em sua superfície
NP-NH2 nanopartículas de alumina aminadas
NP-N3 nanopartículas de alumina contendo azidas terminais
NP-OH nanopartículas de alumina hidroxiladas
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
OtBu t-butoxi
PAM peptídeos antimicrobianos
PIPE 4-metilpiperidina
POPC 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina
POPG 1-palmitoil-2-oleil-fosfatidilglicerol
PC fosfatidilcolina
PE fosfatidiletanolamina
PS fosfatidilserina
RMN ressonância magnética nuclear
SPFS síntese de peptídeos em fase sólida
SPR ressonância plasmônica de superfície, do inglês surface plasmon
resonance
tBu t-butil
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
TIS tri-isopropilsilano
ToF tempo de voo, do inglês time of flight
tR tempo de retenção
Trt tritil
UFC unidade formadora de colônia
UV espectroscopia da região do ultra violeta
m/z razão entre a massa e a carga
λ comprimento de onda
ζ potencial zeta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................35
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................39
2.1 Peptídeos antimicrobianos...............................................................................................39
2.1.1 Mecanismo de ação antibacteriano de peptídeos antimicrobianos...............................41
2.1.2 Estudos do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos.....................................43
2.1.3 Resistência microbiana a peptídeos bioativos................................................................49
2.2 Biomateriais com propriedades antimicrobianas..........................................................50
2.2.1 Biomateriais baseados em peptídeos antimicrobianos...................................................53
2.3 Materiais derivados de alumina.......................................................................................55
2.4 Estratégias para a associação de PAM na superfície de materiais...............................57
3 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................59
3.1 Síntese dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-
BP100........................................................................................................................................59
3.1.1 Obtenção do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP10..................................................................66
3.2 Purificação e quantificação dos peptídeos sintéticos.....................................................67
3.3 Espectrometria de massa para caracterização dos peptídeos.......................................68
3.4 Síntese e funcionalização de nanopartículas de alumina...............................................70
3.4.1 Obtenção de nanopartículas de alumina (NP) – Etapa 1..............................................70
3.4.2 Hidroxilação das nanopartículas de alumina (NP NP-OH) – Etapa 2...................71
3.4.3 Ligação dos peptídeos sintéticos às nanopartículas de alumina...................................71
3.4.3.1 Rota 1 – Obtenção das nanobioestruturas NP- EAAA-BP100.....................................72
3.4.3.2 Rota 2 - Obtenção das nanobioestruturas NP -CAAA-BP100......................................73
3.4.3.3 Rota 3 - Obtenção das nanobioestruturas NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100........................74
3.5 Determinação do grau de funcionalização das nanopartículas de alumina................75
3.5.1 Confirmação do grau de substituição da resina Rink®
amida 0,79 mmol.g-1
e
confecção da curva analítica...................................................................................................76
3.5.2 Determinação do grau de funcionalização das nanopartíiculas de alumina com
derivados de aminoácido ou de peptídeos...............................................................................77
3.6 Caracterização das nanoestruturas.................................................................................78
3.6.1 Difração de raios-x..........................................................................................................78
3.6.2 Microscopia eletrônica de varredura...........................................................................78
3.6.3 Microscopia eletrônica de transmissão........................................................................79
3.6.4 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier.................................................................................................................................79
3.6.5 Ressonância magnética nuclear de 13
C em fase sólida..................................................79
3.6.6 Análise térmica................................................................................................................80
3.6.7 Medidas de potencial zeta...............................................................................................80
3.7 Ensaios de atividade antimicrobiana...............................................................................80
3.7.1 Ensaio antibacteriano.....................................................................................................81
3.7.2 Ensaio antifúngico..........................................................................................................82
3.8 Estudos biofísicos..............................................................................................................84
3.8.1 Obtenção de vesículas lipídicas unilamelares................................................................84
3.8.2 Medidas de extravasamento de carboxifluoresceína.....................................................85
3.8.3 Dicroísmo circular..........................................................................................................86
3.8.4 Ressonância plasmônica de superfície...........................................................................86
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................89
4.1 Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Pra]GAAA-BP100...................................................................................................89
4.1.1 Síntese dos peptídeos em fase sólida...............................................................................89
4.1.2 Purificação dos peptídeos sintetizados...........................................................................94
4.1.3 Caracterização por espectrometria de massa.................................................................96
4.2 Funcionalização de nanofibras de alumina com o peptídeo EAAA-BP100: Síntese,
caracterização e ensaios biológicos......................................................................................100
4.2.1 Obtenção da nanobioestrutura NP-EAAA-BP100......................................................102
4.2.2 Caracterização das nanoestruturas..............................................................................104
4.2.2.1 Difração de raios-x.....................................................................................................104
4.2.2.2 Microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de
transmissão.............................................................................................................................106
4.2.2.3 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier...............................................................................................................................107
4.2.2.4 Análise térmica...........................................................................................................109
4.2.2.5 Potencial zeta..............................................................................................................110
4.2.3 Determinação do grau de funcionalização..................................................................111
4.2.4 Ensaio de atividades antibacteriana e antifúngica......................................................112
4.2.5 Estudos biofísicos: ensaios de dicroísmo circular e de extravasamento de
carboxifluoresceína ...............................................................................................................115
4.3 Nanobioestrutura de alumina acoplada ao peptídeo antimicrobiano BP100 através
de formação de ligação de dissulfeto e anel triazólico dissubstituído...............................119
4.3.1 Obtenção da nanobioestrutura NP-CAAA-BP100 (rota 2) .......................................119
4.3.2 Obtenção da nanobioestrutura NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3)..........................122
4.3.2.1 Síntese, purificação e caracterização do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100................124
4.3.3 Caracterização das nanoestruturas..............................................................................126
4.3.3.1 Difração de raios-x.....................................................................................................126
4.3.3.2 Microscopia eletrônica de transmissão......................................................................127
4.3.3.3 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier...............................................................................................................................129
4.3.3.4 Ressonância magnética nuclear de 13
C em fase sólida ..............................................131
4.3.3.5 Análise térmica...........................................................................................................133
4.3.3.6 Potencial zeta..............................................................................................................135
4.3.4 Ensaios de atividades antibacteriana e antifúngica....................................................137
4.3.4.1 Ensaio de atividade antibacteriana............................................................................137
4.3.4.2 Ensaio de atividade antifúngica..................................................................................139
4.3.5 Estudos biofísicos de interação com meios biomiméticos...........................................140
4.3.5.1 Espectroscopia de dicroísmo circular........................................................................141
4.3.5.2 Ressonância plasmônica de superfície.......................................................................143
5 CONCLUSÕES..................................................................................................................147
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................149
ANEXO I................................................................................................................................167
ANEXO II..............................................................................................................................169
ANEXO III.............................................................................................................................171
ANEXO IV.............................................................................................................................173
35
1 INTRODUÇÃO
A incansável busca por substâncias químicas capazes de combater diferentes
microrganismos causadores de doenças infecciosas conduz há décadas a sociedade científica
na descoberta e no desenvolvimento de diferentes agentes biológicos. No entanto, há um
crescente desenvolvimento de resistência microbiana aos antibióticos convencionais, o que
reduz cada vez mais as opções no tratamento contra patógenos e torna ainda mais incessante e
necessária a busca de novos agentes antimicrobianos (HANCOCK, 2014). Nesse contexto, os
peptídeos antimicrobianos (PAM) surgem como uma alternativa promissora aos tratamentos
convencionais, principalmente em casos de desenvolvimento de resistência microbiana, uma
vez que não atuam apenas sobre um alvo específico, mas sobre toda a extensão da membrana
celular de microrganismos e, em alguns casos, sobre diferentes estruturas intracelulares
(PARK; PARK; HAHM, 2011).
Atualmente, 2980 peptídeos, de origem natural ou sintéticos, que apresentam
atividade antimicrobiana, já foram descritos (WANG; LI; WANG, 2016). Diante desse
enorme potencial microbicida, outras aplicações podem ser vislumbradas para estas
moléculas, principalmente em formulações farmacêuticas para uso terapêutico contra
organismos patogênicos. Contudo, recentemente tem aumentado muito o interesse do
emprego de PAM conjugados a materiais de diversas naturezas. Muitos estudos têm sido
direcionados para o desenvolvimento de materiais com propriedades antimicrobianas que
possam ser utilizados em implantes ortopédicos e dentários, cateteres, válvulas cardíacas e
diversos outros dispositivos médico-hospitalares (HOLMBERG et al., 2013;
KAZEMZADEH-NARBAT et al., 2013; GOMES et al., 2015; BUCKHOLTZ et al., 2016).
Dentre estes materiais, a alumina tem se mostrado compatível para a confecção de
dispositivos para reparação de tecido ósseo. A elevada dureza, baixo coeficiente de atrito e
resistência à corrosão da alumina propiciam pouco desgaste das superfícies articuladas em
aplicações ortopédicas (CORDINGLEY et al., 2003; SEQUEIRA et al., 2017). Além disso,
estudos recentes relatam que o crescimento de osteoblastos em sua superfície é altamente
favorecido (TAXIS et al., 2016; MUSSANO et al., 2018). Não obstante, ainda são
emergentes as pesquisas que associam a alumina à peptídeos com intuito de reparação óssea
(SWAN; POPAT; DESAI, 2005).
36
Neste sentido, o presente trabalho tem como principal objetivo a obtenção de
nanobiomateriais híbridos, com atividade antimicrobiana, compostos por alumina e peptídeos
bioativos derivados do BP100 para aplicações futuras em dispositivos medicinais de
reestabelecimento ósseo, unindo assim o potencial mecânico e bioinerte da alumina e o
potencial antibacteriano do peptídeo BP100. O peptídeo BP100, escolhido para estudo neste
trabalho, é composto por 11 resíduos de aminoácidos, possui amplo espectro de ação contra
bactérias Gram-negativas (E. amylovora, X. vesicatoria, P. syringae, E. coli), baixa toxicidade
a células humanas e pouca susceptibilidade a degradação por proteases (TORCATO et al.,
2013; MANZINI et al., 2014; SCHREIER et al., 2014). Esse peptídeo foi desenvolvido por
química combinatória a partir de um híbrido da Cecropina A (resíduos 2-7) e Melitina
(resíduos 8-11) (BADOSA et al., 2007). A Melitina, encontrada no veneno da abelha, é
constituída por uma sequência peptídica formada por 26 resíduos de aminoácidos
(TERWILLIGER; EISENBERG, 1982) e a Cecropina A, um peptídeo formado por 37
resíduos de aminoácidos, é encontrada na hemolinfa da mariposa Hyalophora cecropia, e
apresenta elevada atividade contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (FERRE et al.,
2006; FERRE et al., 2009).
Para a obtenção das nanoestruturas de alumina, o trabalho baseia-se em um
método previamente descrito na literatura, com algumas adaptações, através do qual foi
possível obter nanoestruturas de alumina hidroxiladas superficialmente (SWAN; POPAT;
DESAI, 2005; POTDAR et al., 2007). Em seguida, foram realizadas etapas de
funcionalização orgânica para desenvolvimento de três estratégias diferentes para ligação
covalente da cadeia peptídica do BP100 às nanopartículas: (i) formação de uma ligação
amídica entre grupos amino presentes na superfície do material inorgânico e carboxilas
disponíveis na cadeia peptídica, (ii) formação de uma ligação de dissulfeto entre tióis
presentes na superfície da nanopartícula e adicionados à cadeia peptídica pela introdução de
um resíduo de cisteína, e (iii) através de uma reação de cicloadição entre azidas imobilizadas
sobre as nanopartículas de alumina e grupos alcino presentes na cadeia lateral de um resíduo
de aminoácido (propargilglicina) intencionalmente adicionado à sequência primária do
BP100. O trabalho apresenta também ampla caracterização estrutural e físico-química das
nanobioestruturas em todas as suas etapas de funcionalização, além de ensaios de atividade
antibacteriana e antifúngica dos materiais obtidos.
37
Os resultados deste trabalho estão divididos em três partes. Na primeira parte
(item 4.1) estão relacionados os resultados da síntese, purificação e caracterização do peptídeo
antimicrobiano BP100 e dos derivados EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100,
os quais foram utilizados para ligação com as nanopartículas de alumina, respectivamente de
acordo com as estratégias i, ii e iii mencionadas acima. Em seguida, na segunda parte (item
4.2) estão descritos os resultados da síntese, caracterização e estudos biológicos das
nanopartículas de alumina funcionalizadas com o derivado EAAA-BP100, esses resultados
foram utilizados na redação do primeiro artigo científico proveniente do presente trabalho
(TORRES et al., 2018). Finalmente, na terceira parte (item 4.3) são apresentados os
resultados da síntese, caracterização e dos ensaios antimicrobianos conduzidos com as
nanopartículas de alumina funcionalizadas com os derivados CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-
BP100. Estes resultados estão descritos no segundo artigo submetido proveniente deste
trabalho.
38
39
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Peptídeos antimicrobianos
O crescente desenvolvimento de resistência microbiana aos antibióticos
convencionais tem reduzido cada vez mais as alternativas aos tratamentos atualmente
disponíveis (HANCOCK, 2014). Assim, os peptídeos antimicrobianos surgem como uma
nova classe de agentes antibióticos promissores para a substituição de fármacos comumente
empregados para tratamentos de infecções bacterianas e fúngicas, principalmente em casos de
resistência microbiana adquirida por microrganismos (JENSSEN; HAMILL; HANCOCK,
2006; KANG et al., 2014; DA COSTA et al., 2015).
Os PAM são moléculas biologicamente ativas que podem ser encontradas em
praticamente todas as formas de vida – bactérias, anfíbios, plantas, insetos, mamíferos, seres
humanos, entre outros (ZASLOFF, 2002; BOMAN, 2003; SÁNCHEZ; VÁZQUEZ, 2017). A
ampla distribuição de biodiversidade dessas moléculas sugere que elas desempenharam um
papel fundamental no processo evolutivo de todas essas espécies, pois atuam como parte do
sistema inato de defesa imunológica desses organismos, exercendo atividades diversas
(antibacteriana, antifúngica, antiviral, entre outras) e, consequentemente, protegendo o
hospedeiro de microrganismos patogênicos (DA COSTA et al., 2015).
O primeiro peptídeo antimicrobiano foi detectado por Renè Dubos, em células
procariotas, a partir de uma cultura da bactéria Bacillus brevis. Neste trabalho, verificou-se
que tal substância, então denominada gramicidina, apresentava atividade contra uma gama de
bactérias Gram-positivas (DUBOS; HOTCHKISS, 1941; HOTCHKISS; DUBOS, 1941).
Estudos posteriores revelaram que a gramicidina era, na verdade, composta por uma mistura
de seis PAM capazes de tratar feridas infectadas na pele de cobaias, indicando assim seu
potencial terapêutico para utilização clínica (SARGES; WITKOP, 1965a, 1965b, 1965c). A
gramicidina foi o primeiro antibiótico a base de PAM comercialmente fabricado, e atualmente
continua sendo utilizada em formulações farmacêuticas. No reino vegetal, Balls et al. (1942)
isolaram o primeiro PAM do trigo, denominado purotionina, responsável pela atividade
antimicrobiana contra algumas bactérias patogênicas e leveduras, como Pseudomonas
solanacearum e Xanthomonas campestres (DE CALEYA et al., 1972; HERNANDEZ-
LUCAS; CARBONERO; GARCIA-OLMEDO, 1978). Com o surgimento de patógenos
40
microbianos multirresistentes (GRUNDMANN et al., 2006; ARIAS; MURRAY, 2015),
intensificou-se o interesse nas moléculas de defesa naturais e muitos peptídeos passaram a ser
isolados de diferentes espécies. Em 1962, o que alguns consideram ser a primeira descrição de
um PAM de origem animal, o peptídeo bombinina foi isolado do sapo Bombina variegata
(CSORDAS; MICHL, 1969; SIMMACO et al., 1991). Dentre os PAM oriundos de insetos,
em 1981 duas moléculas foram identificadas na hemolinfa da mariposa da seda, Hyalophora
cecropia, denominadas cecropinas A e B (STEINER, 1982). Atualmente, na base de dados de
peptídeos antimicrobianos (APD, http://aps.unmc.edu/AP/), estão cadastrados 2764 peptídeos
antimicrobianos, dentre estes, 276 PAM foram isolados de bactérias, 335 de plantas e 2075 de
animais, exercendo atividades antibacteriana, antifúngica, antiviral, entre outras, conforme
apresentado na Tabela 1.
Além do amplo espectro de atividade, os PAM apresentam, em grande parte,
baixa toxicidade às células humanas e elevada eficiência contra microrganismos em
concentrações relativamente baixas (ALVES; PEREIRA, 2014). Sendo assim, o estudo para a
utilização desses peptídeos como agentes antibióticos é uma proposta promissora para o
desenvolvimento de novos fármacos, conservantes de alimentos e antissépticos em
cosméticos, por exemplo.
Tabela 1 – Estatística da atividade biológica de peptídeos do banco de dados de peptídeos antimicrobianos
Atividade Biológica Número de peptídeos Porcentagem (%)
Antibacteriana 2502 83,95
Antiviral 182 6,1
Antifúngica 1062 35,63
Antiprotista 4 0,13
Antibiofilme 32 1,07
Antiparasitária 103 3,45
Inseticida 33 1,1
Espermicida 13 0,43
Anti-HIV 109 3,65
Antitumoral 213 7,14
Quimiotática 58 1,94
Cicatrizante de feridas 19 0,63
Antioxidante 22 0,73
Inibidora de enzimas/proteases 26 0,87
Fonte: Banco de dados de peptídeos antimicrobianos (APD3, http://aps.unmc.edu/AP/). Acesso em 21/05/2018.
41
2.1.1 Mecanismo de ação antibacteriano de peptídeos antimicrobianos
Os PAM exercem seu mecanismo de ação de forma diferente dos antibióticos
clássicos, que atuam sobre alvos específicos, cujos mecanismos de ação baseiam-se, por
exemplo, em inibições enzimáticas (β-lactâmicos), no bloqueio da síntese de RNA
(rifampicina) e da replicação do DNA (fluoroquinolonas) e na interrupção da síntese proteica
bacteriana (macrolídeos, tetraciclinas) (GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010;
BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).
De forma geral, os PAM exercem seu mecanismo de ação através da interação
com a membrana das células bacterianas, sem um alvo específico (CHOU et al., 2010).
Inicialmente, há a atração eletrostática entre as cadeias laterais catiônicas de resíduos de
aminoácidos presentes na estrutura primária do peptídeo e os grupos fosfato, de caráter
aniônico, presentes na superfície da membrana fosfolipídica de microrganismos. Nesta
primeira etapa, os peptídeos, ainda em solução aquosa, não apresentam uma conformação
definida (BECHINGER; LOHNER, 2006). Em seguida, após a interação com a superfície da
membrana, ocorrem mudanças conformacionais da cadeia peptídica passando a adquirir uma
estrutura secundária estável (em geral α-hélice ou β-folha) que permite que a porção
hidrofóbica do PAM interaja com a região mais interna e também hidrofóbica da bicamada
fosfolipídica das células bacterianas, resultando na perturbação da membrana e,
consequentemente, na morte celular (SANI; SEPAROVIC, 2016). Muitos modelos já foram
propostos na literatura para o mecanismo de ação de PAM, sendo os mais comuns o modelo
de barril (barrel-stave model), modelo de poro toroidal (toroidal pore model), modelo carpete
(carpet-like model) e o modelo detergente (detergent-like model) (JENSSEN; HAMILL;
HANCOCK, 2006). Mas é importante ressaltar que existem PAM que, além de perturbarem e
permearem a membrana bacteriana, também exercem seu mecanismo de ação atuando em
receptores intracelulares. Estes peptídeos atravessam a membrana celular sem rompê-la e
atuam em alvos que resultam na alteração de processos celulares fundamentais (TEIXEIRA;
FEIO; BASTOS, 2012), de maneira que a morte celular ocorre devido a mecanismos
secundários, mas que também podem acarretar na ruptura da membrana (EPAND; VOGEL,
1999; LOHNER, 2017).
42
Figura 1 – Representação esquemática das principais propostas de mecanismo de ação de peptídeos
antimicrobianos: modelo carpete (A), modelo de formação do barril (B), modelo detergente (C) e modelo
de formação do poro toroidal (D).
Fonte: Bahar e Ren (2013).
De acordo com o modelo carpete, ocorre a interação paralela dos peptídeos com a
membrana fosfolipídica formando um agregado de moléculas que cobre esta superfície como
um carpete (FIG. 1A). Em uma segunda etapa, após a interação catiônica do peptídeo com os
grupos fosfato dos fosfolipídeos, o peptídeo direciona sua região hidrofóbica para o interior
da bicamada, o que perturba a estrutura fosfolipídica implicando em uma tensão superficial
que também resulta no rompimento da membrana celular (CARNICELLI et al., 2013).
No modelo de formação do barril os peptídeos interagem lateralmente entre si
ocasionando a formação de poros transmembranares por agregados de peptídeos dispostos
perpendicularmente a membrana fosfolipídica, como as aduelas de um barril (FIG. 1B).
Inicialmente, os monômeros do peptídeo, dispostos paralelamente sobre a superfície aniônica
da bicamada lipídica, agregam-se ao atingir concentração suficiente de moléculas nesta
superfície. Em seguida, ocorre a inserção perpendicular dos agregados de peptídeos na
membrana formando um poro, no qual a porção hidrofóbica das cadeias peptídicas interage
43
com a região apolar da membrana, enquanto a porção hidrofílica fica exposta no interior do
poro, permitindo o fluxo de conteúdo entre os meios intra e extracelulares (YANG et al.,
2001; TEIXEIRA; FEIO; BASTOS, 2012).
O modelo detergente representa um mecanismo geral para moléculas anfipáticas e
descreve a ação detergente dos peptídeos, de forma inespecífica, sobre a membrana
fosfolipídica, resultando na perda de sua integridade pela formação de micelas (FIG. 1C).
Neste modelo, ao atingir a concentração crítica de moléculas de peptídeo, de forma similiar
aos detergentes, elas interagem entre si e originam estruturas micelares. Estas estruturas de
peptídeos agregados, ao interagir com a membrana celular, podem envolver moléculas de
fosfolipídeos que leva à formação de poros na bicamada lipídica (LEGRAND et al., 2011).
No modelo de formação do poro toroidal não há interação peptídeo-peptídeo. As
moléculas atuam de forma colaborativa na formação de uma curvatura na bicamada
fosfolipídica de maneira a originar uma toróide (FIG. 1D). Como descrito no modelo de
formação de barril, para a formação do poro toroidal também é necessário atingir um limiar
na concentração de cadeias peptídicas orientadas paralelamente na superfície da membrana
celular. Em seguida, as moléculas de peptídeo penetram a bicamada e se orientam
perpendicularmente à superfície da membrana. Neste modelo, o poro é formado por
peptídeos e lipídeos intercalados, de maneira que o poro é revestido pela própria membrana
celular (BECHINGER; LOHNER, 2006; MIHAJLOVIC; LAZARIDIS, 2010).
Estas são apenas algumas das diversas propostas sobre o mecanismo de ação de
peptídeos antimicrobianos, muitas outras já foram desenvolvidas e estão descritas na literatura
(LI et al., 2012). No entanto, para muitos PAM ainda não há um mecanismo de ação
determinado e acredita-se que cada peptídeo possa exercer sua atividade de forma distinta
(BECHINGER; GORR, 2017). Por esse motivo, essas moléculas tornam-se menos propensas
a induzir o desenvolvimento de resistência por parte dos microrganismos (SHAI, 2002;
BOWDISH; DAVIDSON; HANCOC, 2005; HANCOCK; SAHL, 2006).
2.1.2 Estudos do mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos
As propriedades físico-químicas e estruturais apresentadas pelos peptídeos
antimicrobianos são altamente influenciadas por características como carga, hidrofobicidade e
momento hidrofóbico, e estão relacionadas diretamente à atividade antimicrobiana exercida
44
pelo PAM (SCHMIDTCHEN; PASUPULETI; MALMSTEN, 2014). Dessa forma,
modificações na sequência primária da cadeia peptídica de um dado peptídeo podem
ocasionar alterações nas características citadas anteriormente com subsequente efeito no
mecanismo de ação e potencial biológico do peptídeo (BISHT et al., 2007; JUNIOR et al.,
2017; THERY et al., 2018). Neste sentido, para elucidar e compreender o mecanismo de ação
dos peptídeos sobre membranas biológicas alguns estudos podem ser conduzidos. Métodos de
análise como a espectroscopia de dicroísmo circular (CD) e o extravasamento de
carboxifluoresceína (CF) são amplamente empregados para investigação de características
conformacionais de peptídeos e avaliação da capacidade lítica de peptídeos, repectivamente.
Esses experimentos são rotineiramente realizados na presença de modelos miméticos de
membrana e os resultados podem indicar o modo de interação peptídeo-membrana
(AVITABILE; D’ANDREA; RAMANELLI, 2014; GUSMÃO et al., 2017).
As vesículas lipídicas unilamelares (LUV) são modelos miméticos de membranas
celulares muito utilizados para avaliar a interação e estruturação de peptídeos
antimicrobianos. Diversos trabalhos já relatados na literatura descrevem a utilização de LUV
como meios biomiméticos para estudos de mecanismos de ação de PAM (RESENDE et al.,
2009; WANG et al., 2016; VERLY et al., 2017). Esta estratégia torna-se muito interessante,
pois as membranas celulares são constituídas, na sua maior parte, de lipídeos (glicerolipídeos,
esfingolipídeos e esteróis), proteínas de membrana e carboidratos (SEZGIN et al., 2017).
Dentre os glicerolipídeos destacam-se os fosfolipídeos, que consistem em moléculas de
natureza anfipática, constituintes da bicamada lipídica que envolve o conteúdo intracelular.
Nas LUV, assim como nas membranas celulares, os grupos apolares dos fosfolipídeos se
orientam para o interior hidrofóbico da bicamada e a região polar é orientada para a face
aquosa externa (DELEU et al., 2014; ZHAO et al., 2014).
Em células eucarióticas, os principais lipídeos que compõem a membrana são a
fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) e ácido fosfatídico
(SAHU; LYNN, 1977), os quais conferem uma característica zwitteriônica para a bicamada
fosfolipídica. Por outro lado, as membranas bacterianas apresentam quantidade
significativamente maior de lipídeos carregados negativamente, como o fosfatidilglicerol
(PG) e a cardiolipina (EPAND; SAVAGE; EPAND, 2007; EPAND; EPAND, 2010). Neste
sentido, é comum a preparação de meios vesiculares compostos por PC e PG como meios
45
biomiméticos de membranas bacterianas (GUSMÃO et al., 2017; JUNIOR et al., 2017). As
estruturas químicas dos fosfolipídeos citados estão apresentadas no Anexo I.
Ao interagir com as membranas biológicas, ou com meios que as mimetizam, os
peptídeos antimicrobianos podem apresentar estrutura secundária anfipática, caracterizada
pela orientação para a mesma face (em direção à região hidrofóbica da membrana) dos
resíduos de aminoácido hidrofóbicos da cadeia peptídica, o que favorece maior interação com
a bicamada lipídica dos microrganismos (JENSSEN; HAMILL; HANCOCK, 2006). Por essa
razão, a presença de estruturas secundárias pode estar diretamente relacionada à atividade
biológica apresentada pelo peptídeo (MANZINI et al., 2014).
Os PAM que apresentam estrutura secundária em α-hélice e β-folha (FIG. 2) são
os mais comuns (HUANG; HUANG; CHEN, 2010). A conformação em α-hélice, como
representada na Figura 2A para o peptídeo antmicrobiano DD k (VERLY et al., 2009),
consiste em uma estrutura helicoidal estabilizada pela formação de ligações de hidrogênio
intramoleculares. Já a conformação em β-folha é originada pela presença de dois segmentos
de fitas β, em geral aproximadas devido a presença de ligações de dissulfeto ou conformações
-turn e estabilizadas por ligações de hidrogênio entre os segmentos (POWERS; HANCOCK,
2003; SUDHEENDRA et al., 2015). A Figura 2B mostra a estrutura terciária do peptídeo
antimicrobiano lactoferricina B na qual é possível observar uma conformação em -folha
(HWANG et al., 1998). Alguns peptídeos podem apresentar estruturas terciárias nas quais
ambas estruturas secundárias podem ser formadas, como por exemplo os peptídeos MsDef4 e
α1-purotionina (RAUTENBACH; TROSKIE; VOSLOO, 2016).
Figura 2 – Estrutura secundária de peptídeos antimicrobianos: α-hélice (A) e β-folha (B).
Fonte: Protein Data Bank - DD k (DOI: 10.2210/pdb2JX6/pdb) (A) e Lactoferricina B
(DOI: 10.2210/pdb1LFC/pdb) (B). Disponível em: <http://www.rcsb.org>. Acesso em: 15/01/2018).
46
A espectroscopia de dicroísmo circular, método utilizado para investigar
estruturas secundárias e preferências conformacionais de peptídeos em meios biomiméticos,
baseia-se na diferença de absorbância entre as duas componentes circulares da luz linearmente
polarizada (que pode ser descrita como o somatório de duas componentes circularmente
polarizadas de mesma magnitude, porém girando em sentidos contrários) originada pelos
grupos cromóforos da cadeia peptídica, (KELLY; JESS; PRICE, 2005).
Na cadeia peptídica, o grupo amido formador da ligação peptídica é o principal
grupo cromóforo presente na molécula. As absorções energéticas desse grupo se devem a
transições eletrônicas nos orbitais componentes das ligações peptídicas, cujas intensidades
dependem dos ângulos de rotação ϕ e ψ (FIG.3A). Por sua vez, esses ângulos dependem da
conformação que a cadeia peptídica adquire ao interagir com outras espécies (solventes e
meios biomiméticos, por exemplo). Os ângulos ϕ e ψ definem as condições de coplanaridade
dos orbitais envolvidos na ligação peptídica, sendo característicos para cada tipo de estrutura
secundária (BÜRCK et al., 2016). Em decorrência disso, as bandas observadas no espectro de
dicroísmo circular, em função do comprimento de onda, podem ser atribuídas a cada um dos
tipos de estrutura secundária apresentada pelo peptídeo (FIG.3B).
Figura 3 – Ângulos de rotação ϕ e ψ presentes em estruturas de peptídeos (A). Espectros de dicroísmo
circular característicos de peptídeos não estruturados (espectro em vermelho), de peptídeos estruturados
em α-hélice (espectro em amarelo) e em β-folha (espectro em azul) (B).
Fonte: Imagem extraída e adaptada do sítio <http://www.proteinchemist.com/cd/cdspec.html>. Acesso em:
11/10/2017.
O mecanismo de ação proposto para o peptídeo BP100 foi determinado por
estudos conformacionais e de interação peptídeo-membrana envolvendo técnicas biofísicas
como dicroísmo circular, ressonância magnética nuclear (RMN), extravasamento de
47
carboxifluoresceína, medidas de potencial zeta e do volume hidrodinâmico por espalhamento
de luz dinâmico (DLS), entre outros (FERRE et al., 2009; MANZINI et al., 2014;
WADHWANI et al., 2014). Manzini et al. (2014) estudaram por CD a capacidade de
estruturação do BP100 em LUV aniônicas de PC:PG como meio biomimético. Os autores
obtiveram dados conformacionais que revelaram que em solução aquosa o peptídeo não
apresenta conformação definida, enquanto que uma conformação típica em α-hélice foi
observada na presença das vesículas. No entanto, os autores não identificaram conformações
α-helicoidais em vesículas zwiteriônicas de PC. Através desse estudo verificou-se a
importância da atração eletrostática na interação peptídeo-membrana para o mecanismo de
ação do BP100 (FERRE et al., 2009; MANZINI et al., 2014), sendo este peptídeo seletivo
para vesículas carregadas negativamente.
A partir de estudos por RMN, determinaram-se estruturas tridimensionais, ao
interagir com meios biomiméticos, mostrando que o BP100 adota uma conformação
helicoidal anfipática, com a disposição das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos do
BP100 conforme mostrado na projeção helicoidal da Figura 4 (MANZINI et al., 2014;
WADHWANI et al., 2014). A face polar da hélice é constituída por 5 resíduos de lisina,
carregados positivamente em pH fisiológico, o que permite a atração eletrostática com as
cargas negativas dos fosfolipídeos constituintes da membrana bacteriana (MANZINI et al.,
2014). A face oposta, apolar, é composta por resíduos de aminoácido hidrofóbicos, cujas
cadeias laterais são capazes de se inserirem paralelamente na interface apolar da bicamada
lipídica em uma segunda etapa do mecanismo de ação, perturbando a integridade da
membrana (FERRE et al., 2009).
Figura 4 – Projeção helicoidal da sequência peptídica primária do BP100.
48
Fonte: Adaptado de Wadhwani et al. (2014).
Sabe-se que o mecanismo de ação de peptídeos antimicrobianos depende da razão
peptídeo:lipídeo e a desintegração da membrana geralmente ocorre quando é atingida uma
concentração crítica de moléculas de peptídeos na superfície da membrana lipídica. Manzini
et al. (2014) verificaram por DLS que a lise de vesículas causadas por BP100 pode ocorrer em
razões peptídeo:lipídeo distintas, porém também através de mecanismos diferentes (FIG. 5).
O mecanismo de ação proposto não envolve a formação de poros transmembrana, uma vez
que o BP100 é composto por poucos resíduos de aminoácido, não sendo longo suficiente para
atuar de tal maneira (WADHWANI et al., 2014.). Os autores sugerem que o peptídeo atua
sobre células bacterianas através do mecanismo proposto no modelo carpete ou pela formação
de micelas, conforme proposta baseada no modelo detergente.
Figura 5 – Mecanismo de ação do peptídeo antimicrobiano BP100 proposto por Manzini et al. (2014).
Fonte: Adaptado de Manzini et al. (2014).
Muitos peptídeos antibacterianos podem ser também ativos contra fungos, como
os peptídeos Bombinina H4, Dermaseptina-B2, Magainina 2 (APD3,
http://aps.unmc.edu/AP/). Os agentes terapêuticos fungicidas atualmente disponíveis no
mercado apresentam alvos de ação limitados, na maioria atuando na biosíntese do ergosterol,
49
presente na membrana dos fungos ou diretamente na síntese de sua parede celular (ARNOLD
et al., 2010). No entanto, os PAM geralmente atuam sobre toda extensão da membrana
fosfolipídica ou sobre alvos intracelulares de células de fungos, precisando, para isso,
atravessar a parede celuar desses microrganismos. Porém, já foi constatado que alguns
peptídeos atuam diretamente sobre moléculas constituintes da parede celular causando o
enfraquecimento ou desorganização dessa estrutura, que eventualmente acarreta na morte
celular (VAN DER WEERDEN; HANCOCK; ANDERSON, 2010).
Além disso, assim como a membrana de células bacterianas, a membrana celular
de fungos apresenta maior carga negativa que a de mamíferos (RAUTENBACH;
TROSKIED; VOSLOO, 2016), e dessa forma, esses microrganismos também são alvos de
peptídeos catiônicos, como o BP100.
2.1.3 Resistência microbiana a peptídeos bioativos
Mesmo apresentando amplo espectro de atividade biológica e baixa toxicidade,
alguns casos de resistência microbiana aos PAM já tem sido relatados na literatura (GUNN,
2008; ERNST; PESCHEL, 2011; SAAR-DOVER et al., 2012). O desenvolvimento de
resistência por parte dos microrganismos está diretamente relacionado ao mecanismo de ação
dos peptídeos antimicrobianos (ANDRÄ et al., 2011).
Os microrganismos podem desenvolver diversas estratégias de resistência e, no
caso dos PAM, os mecanismos mais comuns de desenvolvimento de resistência envolvem o
remodelamento da superfície bacteriana com alteração da superfície celular (carga, densidade
da membrana), dificultando a interação do peptídeo com a membrana (GUILHELMELLI et
al., 2013). Um exemplo é a redução da carga líquida negativa na superfície de células
bacterianas, que dificulta a atração eletrostática com a face positiva dos peptídeos (ANDRÄ et
al., 2011). Neste trabalho Andrä et al. (2011) verificaram que há alteração na síntese do
fosfotidilglicerol, componente estrutural de membrana lipídica de S. aureus, de forma que um
resíduo de lisina é transferido ao fosfolipídeo, conferindo assim uma redução da carga
negativa da membrana lipídica dessa bactéria.
Outra estratégia desenvolvida por microrganismos é o aumento da densidade da
parede/membrana celular (SAAR-DOVER et al., 2012) ou a formação de cápsula de
polissacarídeos aniônica, que reduz a ação de peptídeos antimicrobianos (LLOBET; TOMAS;
50
BENGOECHEA, 2008). Llobet, Tomas e Bengoechea (2008) analisaram cápsulas de
polissacarídeos aniônicas isoladas de Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e
Pseudomonas aeruginosa e descobriram uma nova estratégia de resistência microbiana
baseada na neutralização da atividade de peptídeos em decorrência do caráter aniônico das
cápsulas de polissacarídeos que se ligam eletrostaticamente aos peptídeos impedindo que
atuem sobre a membrana bacteriana.
Além disso, patógenos resistentes também podem produzir proteases que clivam a
cadeia peptídica, destruindo sua estrutura primária (JOHANSSON et al., 2008), reduzindo a
atividade biológica ou mesmo impedindo, que o peptídeo alcance a membrana bacteriana. No
trabalho de Johansson et al. (2008) foi constatado que uma protease de cisteína sintetizada por
estreptococos é capaz de inibir a catelicidina LL-37 humana in vitro. A catelicidina LL-37 é
um peptídeo antimicrobiano constituinte do sistema de defesa imunológica inata do
organismo humano e o protege contra algumas infecções de tecidos moles, como a fascite
necrosante, que são causadas por estreptococos. No entanto, a presença de resistência
bacteriana permite que a infecção progrida rapidamente ameaçando a vida do paciente.
Contudo, o desenvolvimento de resistência aos PAM é evidentemente menor que
aos antibióticos convencionais (PESCHEL; SAHL, 2006), devido ao modo de ação
inespecífico das moléculas peptídicas e por, possivelmente, exercerem de forma simultânea
diferentes modos de ação que resultam na morte celular. Neste contexto, a utilização destas
moléculas como agentes antibióticos continua sendo vantajosa frente às convencionalmente
empregadas. Diante disso, o uso de PAM associados a materiais de origem inorgânica tem
despertado atenção da sociedade científica nos últimos anos para o desenvolvimento de
biomaterias com atividade antimicrobiana (GABRIEL et al., 2006; BLIN et al., 2011).
2.2 Biomateriais com propriedades antimicrobianas
Muitos trabalhos já relatados na literatura empregam agentes antibióticos em
materiais biotecnológicos que são utilizados em implantes ortopédicos e odontológicos e em
dispositivos médico-hospitalares de fácil contaminação (NOROWSKI; BUMGARDNER,
2008; SHIRAI et al., 2011; STELZIG et al., 2011; XIE et al., 2014; BAZAKA et al., 2015).
A utilização de agentes antimicrobianos em materiais de implantes e próteses tem
sido realizada com o intuito de evitar a ocorrência de infecções em sítios cirúrgicos, pois a
51
contaminação microbiana pode ocasionar a falência do implante e a necessidade de novo
procedimento operatório (ZHOU et al., 2015; CHEN et al., 2016; BRAEM et al., 2017). A
contaminação de materiais de uso cirúrgico, geralmente ocorre pela presença de
microrganismos na sala de operação ou normalmente encontrados em tecido epitelial (DAVIS
et al., 1999; YU et al., 2017). Uma vez que são implantados, a superfície desses dispositivos
torna-se um local propício para a adesão de células microbianas, que também podem ser
oriundas de fluídos biológicos que entram em contato com alguns destes dispositivos, como
saliva e urina, por exemplo (FRANCOLINI; DONELLI, 2010). Por sua vez, infecções
decorrentes de implantes médico-hospitalares têm se mostrado difíceis de tratar devido à
formação de biofilmes na superfície desses materiais. Biofilmes são constituídos por um
grupo complexo de células microbianas aderidas à superfície do material e entre si GODOY-
GALLARDO et al., 2014). As bactérias, em biofilmes, encontram-se envoltas por matrizes
poliméricas, produzidas por elas mesmas, que favorecem sua sobrevida em determinado meio
(HARDING; REYNOLDS, 2014; MISHRA et al., 2017). Os patógenos mais comuns
associados a infecções hospitalares e formação de biofilmes incluem diversas espécies de
Candida, bactérias Gram-positivas como Staphylococcus aureus, Staphylococus epidermidis,
Enterococcus faecalis e Streptococcus viridans e bactérias Gram-negativas como Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa (ALVES;
PEREIRA, 2014).
Bactérias Gram-negativas apresentam, como um dos principais componentes de
sua membrana externa, a endotoxina denominada lipopolissacarídeo (LPS). Essa endotoxina
estimula funções de macrófagos como resposta imunológica do hospedeiro infectado
(BJORKBACKA et al., 2004), os quais constituem a primeira linha de defesa contra
microrganismos como bactérias e vírus (INGHAM; FISHER, 2005). Assim sendo, se há a
ativação exarcebada de macrófagos na interface do implante ortopédico ou dentário, uma série
de eventos imunológicos ocorrem para proteger o hospedeiro contra o organismo invasor e
que, consequentemente, podem alterar a biocompatibilidade do material de implante. Dentre
estes eventos estão a produção de fibroblastos (células que contribuem para a encapsulação
fibrosa do implante e para a formação de calos) e de diversas substâncias que causam
osteólise (reabsorção ósea). Estes eventos reduzem a proliferação de osteoblastos (células que
permitem a formação do tecido ósseo), de forma a acarrretar na falência do implante
(WEBSTER; SIEGEL; BIZIOS, 1999; GUTWEIN; WEBSTER, 2002; INGHAM; FISHER,
52
2005). Por sua vez, a adesão de células bacterianas à superfície do implante depende tanto da
composição química do material como da morfologia da superfície do dispositivo
(VEERACHAMY et al., 2014). Assim, diversas estratégias têm sido reportadas com o intuito
de criar uma superfície antimicrobiana no dispositivo implantado; por exemplo, o
desenvolvimento de (i) superfícies que evitam a adesão celular, (ii) superfícies previamente
colonizadas com microrganismos não patogênicos e (iii) superfícies associadas a substâncias
antibióticas (COSTA et al., 2011).
Superfícies que evitam a adesão celular atuam pela redução de forças atrativas
entre a superfície bacteriana e o material; por exemplo, superfícies carregadas negativamente
ou altamente hidrofóbicas (HARDING; REYNOLDS, 2014). Contudo, inevitavelmente,
microrganismos irão aderir em alguma extensão à superfície destes materiais (ALVES;
PEREIRA, 2014). Por isso, superfícies associadas a substâncias antibióticas são mais
vantajosas e disponibilizam o agente antimicrobiano diretamente no sítio cirúrgico,
eliminando a presença de possíveis patógenos nestes locais. No entanto, a eficácia do material
superficialmente modificado com substâncias antibióticas depende do espectro de ação desse
agente e da capacidade dos patógenos desenvolverem resistência a este fármaco. Sendo assim,
a utilização de peptídeos antimicrobianos associados a estes materiais é uma opção
interessante para o desenvolvimento de materiais biocompatíveis (COSTA et al., 2011).
As superfícies associadas a substâncias antibióticas ou a ativos antimicrobianos
podem ser desenvolvidas visando a diferentes estratégias para eliminação dos patógenos. Uma
dessas estratégias envolve o uso de biomateriais que exercem efeito microbicida fora da
superfície, ou seja, materiais que liberam o ativo microbicida de sua superfície para o meio
(FIG. 6A). Uma outra estratégia está relacionada a biomateriais nos quais a atividade
microbicida ocorre diretamente em sua superfície, neste caso o agente antimicrobiano
permanecerá imobilizado na superfície do material (FIG. 6B) (SUPPAKUL et al., 2003). Uma
desvantagem dos biomateriais que liberam o ativo biológico da superfície é o curto tempo de
permanência do efeito antimicrobiano. Já os biomateriais obtidos com a imobilização
covalente do ativo apresentam maior duração da atividade antimicrobiana (ALVES;
PEREIRA, 2014).
Embora seja evidente o potencial, a utilização dos peptídeos antimicrobianos em
associação a biomateriais ainda é emergente (COSTA et al., 2011; ALVES; PEREIRA, 2014;
ZHOU et al., 2015; CHEN et al., 2016; YU et al., 2017)
53
Figura 6 – Esquema de estratégias para o desenvolvimento de materiais bioativos: superfície de materiais
contendo os ativos antimicrobianos adsorvidos a superfície (A) e superfície de materiais ligados
covalentemente aos agentes antimicrobianos (B).
2.2.1 Biomateriais baseados em peptídeos antimicrobianos
Alguns trabalhos têm demonstrado que a associação de peptídeos antimicrobianos
em biomateriais conserva ou pode até mesmo elevar as propriedades biológicas dos PAM
(CAMPOCCIA; MONTANARO; ARCIOLA, 2013; HASAN; CRAWFORD; LVANOVA,
2013).
Dispositivos médicos incorporados com peptídeos antimicrobianos têm sido
desenvolvidos para a minimização da ocorrência de infecções em pacientes, como cateteres,
válvulas e implantes ósseos (YU et al., 2015; YAZICI et al., 2016). A Tabela 2 apresenta uma
variedade de materiais utilizados para a imobilização de peptídeos.
Gomes et al. (2015) demonstraram que a funcionalização de gazes de algodão
com peptídeos antimicrobianos, dentre eles a magainina 1 e a dermaseptina, reduz
consideravelmente o crescimento de Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumonia. Por sua
vez, Willcox et al. (2008) testaram o peptídeo sintético melimina (combinação de porções dos
peptídeos antimicrobianos melitina e protamina) para incorporação em lentes de contato, e
observaram elevada redução da viabilidade celular de P. aeruginosa e S. aureus. Além disso,
trabalhos que visam a incorporação de moléculas peptídicas em embalagens de alimentos,
como filmes de polietileno ou celulose também já foram descritos na literatura (NITHYA;
MURTHY; HALAMI, 2013).
54
Tabela 2 – Biomateriais baseados em peptídeos antimicrobianos
Material Peptídeo Aplicação Microrganismos
analisados Referência
Nanocompósito de
amido-haloisita
Nisina e
Pediocina Embalagens
Listeria monocytogenes
e Clostridium
perfringens
(MEIRA et al.,
2017)
Óxido de cálcio
alumínio (CaAlO) e
hidroxiapatita (HA)
Inverso-
CysHHC10
Implante ósseo
artificial Escherichia coli
(BUCKHOLTZ et
al., 2016)
Gazes de algodão
β-Defensina-1,
Dermaseptina,
Cys-LC-LL - 37
e Magainina 1
Material de uso
médico
Staphylococcus aureus e
Klebsiella pneumonia
(GOMES et al.,
2015)
Lã Cecropina-B e
[Ala5]-Tritrp7
Áreas de
geriatria ou
pediatria (peles
sensíveis)
Staphylococcus aureus e
Klebsiella pneumonia
(MOURO;
GOUVEIA, 2016)
Lentes de contato
(Etafilcon A) Melimina
Lentes de
contato
Pseudomonas
aeruginosa e
Staphylococcus aureus
(WILLCOX et al.,
2008)
Aço inoxidável Magainina I e
Nisina
Diversas. Ex:
Indústrias
(alimentos)
Listeria ivanovii (HÉQUET et al.,
2011)
Ouro Magainina I -
Listeria ivanovii,
Enterococcus faecalis e
Staphylococcus aureus
(HUMBLOT et
al., 2009)
Titânio HH-36 Implantes
ortopédicos
Pseudomonas
aeruginosa e
Staphylococcus aureus
(KAZEMZADEH-
NARBAT et al.,
2013)
Titânio GL13K Implantes
dentários
Porphyromonas
gingivalis
(HOLMBERG et
al., 2013)
Em um trabalho visando à incorporação de peptídeos em materiais para implantes
a base de titânio, Braem et al. (2017) utilizaram o método de deposição eletroforética por
corrente alternada para imobilizar o lipopeptídeo antifúngico caspofungina sobre a superfície
de titânio. Os autores observaram que o material revestido apresentou atividade antifúngica
contra C. albicans. Também estudando implantes de titânio, Godoy-Gallardo et al. (2014)
55
realizaram revestimento antimicrobiano sobre a superfície de titânio, para aplicações em
implantes dentários, e avaliaram a atividade antibacteriana do peptídeo derivado da
lactoferrina humana hLf1-11. Os autores verificaram redução da adesão celular e da formação
de biofilmes de Streptococcus sanguinis e Lactobacillus salivarius nessas superfícies
funcionalizadas. Já no trabalho publicado em 2016, Buckholtz et al. (2016) desenvolveram
um biomaterial compósito a base de óxido de cálcio alumínio (CaAlO) e hidroxiapatita (HA)
para implantes ósseos e ligaram covalentemente o peptídeo antimicrobiano Inverso-
CysHHC10 em sua superfície; os autores verificaram a redução da proliferação de E. coli no
biomaterial criado.
Além desses, diversos outros trabalhos têm apontado para a utilização de
peptídeos antimicrobianos em implantes de titânio para fins ortopédicos e dentários (MA et
al., 2011; HOLMBERG et al., 2013; KAZEMZADEH-NARBAT et al., 2013). Contudo,
poucos analisaram a viabilidade de incorporação dessas moléculas sobre a superfície da
alumina (ATHARI et al., 2016), principalmente no desenvolvimento de biomateriais para
emprego em implantes e próteses para reconstituição óssea (SWAN; POPAT; DESAI, 2005).
2.3 Materiais derivados de alumina
A alumina é caracterizada como uma cerâmica bio-inerte, com boas propriedades
mecânicas, tais como elevada dureza e excelente resistência à corrosão e ao desgaste físico
(SEDEL; RAOULD, 2007; SAVADEKAR; KADAM; MHASKE, 2015). Devido às
características apresentadas, este material tem sido empregado na elaboração de biosensores
(KUMERIA; SANTOS; LOSIC, 2014) e dispositivos de liberação de fármacos (DEBRASSI
et al., 2014), mas principalmente, para a confecção de implantes dentários e próteses ósseas
(YOUN et al., 2011; OGIHARA et al., 2012). Pode-se encontrar no banco de dados de
patentes mundial (worldwide.espacenet.com) algumas relacionadas à utilização da alumina
em materiais para reintegração óssea (WEBSTER; SIEGEL; BIZIOS, 2001; WEBSTER;
TEPPER, 2003; NIU et al., 2008). No entanto, até o momento não foram encontrados
depósitos que relacionam a utilização de alumina associada a peptídeos. Em bancos de dados
de artigos científicos já podem ser encontrados alguns trabalhos que associam a alumina com
peptídeos bioativos (SWAN; POPAT; DESAI, 2005; YOUN et al., 2011; TANG et al., 2012),
porém este ainda é um campo pouco explorado. A alumina torna-se um material ainda mais
56
promissor uma vez que o óxido de alumínio tem se mostrado um material inorgânico
quimicamente muito versátil, pois permite a funcionalização de sua superfície com diversos
grupos orgânicos, sendo adequado para a ligação de moléculas bioativas (INGHAM; TER
MAAT; DE VOS, 2012; SAPSFORD et al., 2013; DEBRASSI et al., 2014; BRAGAZZI et
al., 2015).
Youn et al. (2011) fabricaram e testaram um implante tridimensional poroso de
Al2O3, cujos experimentos conduzidos in vitro com células de osteoblastos e osteoclastos,
revelaram aumento da proliferação celular sobre o implante confeccionado. Já para a
execução do experimento in vivo, os implantes foram inseridos no tecido subcutâneo de ratos
e, após 4 e 6 semanas, os autores observaram a adesão de fibroblastos sobre a superfície do
implante e o surgimento de vasos sanguíneos no interior dos poros, respectivamente. Dessa
forma, os autores constataram neste trabalho que o material confeccionado, baseado em
alumina é promissor para uso em aplicações de aditivos em implantes ou até mesmo para a
substituição óssea. Apesar da alumina apresentar excelente resistência ao desgaste e boa
biocompatibilidade, sua baixa tenacidade e resistência à flexão reduzem seu emprego em
alguns implantes. Tais propriedades podem ser melhoradas através da confecção de
compósitos de alumina contendo partículas de zircônia como segunda fase. No trabalho de
Tang et al. (2012) foram avaliadas propriedades mecânicas de compósitos de alumina com
zircônia (0-30% v:v) para implantes dentários. Os autores verificaram aumento da resistência
e tenacidade à fratura com o aumento da quantidade de zircônia no compósito, portanto, a
adição de um segundo material à matriz principal é viável na busca de melhores propriedades
de desempenho.
Dentre trabalhos que associam a alumina a peptídeos biotivos podem-se citar os
trabalho de Athari et al. (2016) e de Swan, Popat e Desai (2005). Athari et al. (2016)
utilizaram nanopartículas de α-alumina conjugadas ao peptídeo intestinal vasoativo no
tratamento de asma. O peptídeo, composto por 28 resíduos de aminoácido (MM: 3326 Da),
isolado do sistema gastrointestinal, atua fortemente sobre as células do músculo liso das vias
aéreas, proporcionando uma broncodilatação duradoura. Os autores empregaram o peptídeo
associado à nanopartículas de α-alumina com o intuito de reduzir a degradação enzimática do
peptídeo no trato respiratório, e verificaram um maior efeito farmacológico utilizando o
peptídeo conjugado em comparação ao emprego do peptídeo livre. Em outro trabalho, o
peptídeo adesivo celular RGDC foi imobilizado covalentemente sobre nanoestruturas fibrosas
57
(scafolds) de alumina, nas quais foi possível verificar aumento da adesão de osteoblastos em
comparação às membranas nanoporosas de alumina não funcionalizadas (SWAN; POPAT;
DESAI, 2005). Além disso, partículas de alumina em escala nanométrica favorecem a
proliferação de osteoblastos e condrócitos, quando comparado a partículas micrométricas
(KHANG et al., 2009). Todos esses resultados sugerem que nanopartículas de alumina são
um interessante carreador para peptídeos que atuam sobre membranas celulares. Dessa forma,
o presente trabalho baseou-se nessas evidências científicas para a produção de um novo
biomaterial baseado em nanopartículas de alumina e no peptídeo antimicrobiano BP100
ligados covalentemente com o objetivo de conferir atividade antimicrobiana às
nanopartículas, e assim, possibilitar seu emprego em materiais de implantes ortopédicos e
dentários, minimizando a ocorrência de infecções nos sítios cirúrgicos que reduzem a vida útil
ou mesmo resultam na rejeição do implante.
2.4 Estratégias para a associação de PAM na superfície de materiais
Os métodos para a incorporação de peptídeos antimicrobianos como agentes
biológicos ativos na superfície de materiais são baseados em estratégias de imobilização física
ou química. Dentre os métodos físicos, destaca-se a técnica camada-por-camada (LbL, do
inglês layer-by-layer), que envolve a adsorção de camadas alternadas de cátions e ânions
sobre a superfície do material sólido. Neste caso, os PAM se encontram adsorvidos nestas
diversas camadas (DORNER et al., 2016), diferentemente da imobilização química, na qual
os PAM reagem com a superfície do material formando uma ligação covalente entre a cadeia
peptídica e o material sólido. Entretanto, alguns materiais precisam ser modificados para que
grupos funcionais sejam introduzidos em sua superfície e possam se ligar covalentemente aos
PAM (ALVES; PEREIRA, 2014).
A imobilização química de peptídeos pode ser conduzida por diferentes
estratégias (COSTA et al., 2011) conforme esquematizado na Figura 7: (i) formação de
ligações amídicas entre grupos amino presentes na superfície do material e carboxilas
disponíveis na cadeia peptídica (ou vice-versa, carboxilas imobilizadas superficialmente ao
material e terminações amino do peptídeo) (FIG. 7A) (BAGHERI; BEYERMANN; DATHE,
2009) (ii) adicionando-se à cadeia peptídica alguma estrutura química através da qual pode ser
formada a ligação com a superfície do material, por exemplo pela incorporação de uma
58
cisteína à cadeia peptídica, que permite a formação de ligações do grupo tiol à epóxidos (FIG.
7B), à grupos maleimida (FIG. 7C) ou mesmo à tióis previamente imobilizados no material
(FIG. 7D) (GLINEL et al., 2009) ou ainda (iii) pela realização de reações de cicloadição
(reação click), uma abordagem recentemente proposta que utiliza a adição de uma azida ou
um doador de alcino à cadeia peptídica, de forma que a ligação à superfície ocorra,
respectivamente, através de grupos alcino (FIG. 7E) ou azidas imobilizados (FIG. 7F)
(HUDALLA; MURPHY, 2010).
Figura 7 – Estratégias para a imobilização de PAM na superfície de materiais.
Fonte: Adaptado de Costa et al. (2011).
59
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Síntese dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100
Utilizou-se o método manual de síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS)
empregando-se a estratégia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) (CHAN; WHITE, 2000) para
obtenção do peptídeo antimicrobiano BP100 e dos análogos EAAA-BP100, CAAA-BP100 e
[Pra]GAAA-BP100 (TAB. 3).
Tabela 3 - Sequência de aminoácidos da estrutura primária dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Pra]GAAA-BP100 sintetizados
Peptídeo Sequência de aminoácidos
BP100 KKLFKKILKYL-NH2
EAAA-BP100 EAAAKKLFKKILKYL-NH2
CAAA-BP100 CAAAKKLFKKILKYL-NH2
[Pra]GAAA-BP100 [Pra]GAAAKKLFKKILKYL-NH2
NH2 – representa região carboxi terminal amidada.
Pode-se observar na Tabela 3 a presença de quatro resíduos de aminoácidos
adicionados à porção amino terminal das cadeias peptídicas dos análogos do BP100 (a
metodologia empregada para a imobilização dos peptídeos sobre as nanopartículas será
detalhada no decorrer deste capítulo), os resíduos de alanina (Ala-2, Ala-3 e Ala-4) foram
adicionados para criar um espaçamento entre a estrutura primária do BP100
(KKLFKKILKYL-NH2) e a superfície da nanoestrutura, possibilitando assim que toda a cadeia
peptídica do BP100 possa interagir com a membrana fosfolipídica e manter sua atividade
antimicrobiana. Esses peptídeos, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100, foram
covalentemente ligados à superfície funcionalizada de nanopartículas de alumina através da
cadeia lateral do primeiro resíduo de aminoácido (Glu-1, Cys-1 e [Pra]G-1, respectivamente)
(FIG.8).
Os derivados de aminoácido empregados na síntese dos peptídeos estão descritos
na Tabela 4 e foram todos adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). A estrutura
química dos 20 aminoácidos essenciais pode ser verificada no Anexo II.
60
Figura 8- Esquema demonstrativo da ligação covalente entre nanopartículas de alumina e as cadeias
peptídicas dos derivados EAAA-BP100 (A), CAAA-BP100 (B) e [Pra]GAAA-BP100 (C).
Todos os reagentes sólidos utilizados foram pesados em balança analítica da
marca Shimadzu, modelo ATX224 (Kyoto, Japão) e a agitação mecânica realizada em várias
etapas da síntese foi efetuada em aparelho Vortex Mixer da Analítica (São Paulo, Brasil)
adaptado com suporte para seringas.
Para a síntese de todos os peptídeos foi utilizada como suporte sólido a resina
Rink®
amida adquirida da Iris Biotech (Marktredwitz, Alemanha) com grau de substituição
0,79 mmol.g-1
(FIG. 9).
61
Tabela 4 - Derivados de aminoácidos utilizados na síntese dos peptídeos BP100 (MM:1420,872 g.mol-1
),
EAAA-BP100 (MM: 1763,224 g.mol-1
), CAAA-BP100 (MM: 1737,251 g.mol-1
) e [Pra]GAAA-BP100
(1729,16 g.mol-1
)
Aminoácido Símbolo Derivado de Aminoácido Massa Molar do derivado de
aminoácido (g.mol-1
)
Ácido Glutâmico E Fmoc-Glu(OtBu)-OH 425,5
Alanina A Fmoc-Ala-OH 311,3
Cisteína C Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7
Isoleucina I Fmoc-Ile-OH 353,4
Leucina L Fmoc-Leu-OH 353,4
Lisina K Fmoc-Lys(Boc)-OH 468,5
Propargilglicina [Pra]G Fmoc-propargil-Gly-OH 335,3
Tirosina Y Fmoc-Tyr(tBu)-OH 459,5
Figura 9 - Resina Rink®
amida.
Fonte: Chan e White (2000).
As sínteses foram planejadas para obtenção de 300 mg de cada um dos peptídeos -
BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100. Empregou-se uma seringa de
polipropileno (5 mL) adaptada com filtro poroso de poliuretano para filtração e remoção dos
reagentes em solução, garantindo a retenção dos grânulos de resina.
Com a resina no interior da seringa, iniciou-se o procedimento para realização da
síntese. Primeiramente, foi realizada a solvatação da resina, utilizando diclorometano (DCM)
obtido da Proquímios (Rio de Janeiro, Brasil), como descrito no Quadro 1 abaixo.
Quadro 1 - Protocolo para solvatação da resina.
1. Adicionar 2,5 mL de DCM na seringa, por sucção, e manter o sistema em agitação por 15 minutos.
2. Remover o DCM por filtração.
3. Repetir as etapas 1 e 2.
62
Após a solvatação dos grânulos da resina, esta foi desprotegida para remoção dos
grupos protetores Fmoc ligados covalentemente às terminações amino da resina (QUADRO
2). Nesse processo utilizou-se solução de 4-metilpiperidina (PIPE) (Sigma-Aldrich - St.
Louis, MO, USA) em N,N’-dimetilformamida (DMF) (Vetec Química Fina - Rio de Janeiro,
Brasil) 1:4 (v:v).
Quadro 2 - Protocolo de desproteção: para remoção do grupo protetor de terminação amino, Fmoc.
1. Adicionar à seringa de reação 2,5 mL de solução de PIPE/DMF 1:4 (v:v).
2. Manter o sistema em agitação por 15 minutos.
3. Remover os reagentes da seringa por filtração.
4. Repetir as etapas 1, 2 e 3.
5. Realizar o protocolo de lavagem (descrito no Quadro 4).
6. Fazer o acompanhamento da desproteção com o teste de Kaiser e observar a coloração dos grânulos
(procedimento descrito no Quadro 5).
Após a desproteção, procedeu-se à realização da etapa de acoplamento do
derivado de aminoácido adequado. Para isso seguiu-se o procedimento descrito no quadro
abaixo (QUADRO 3). Nessa etapa foram empregados como agentes ativadores do grupo
carboxila N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), ambos
adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Quadro 3 - Protocolo para acoplamento de derivado de aminoácido.
1. Pesar as quantidades de aminoácido e HOBt e adicioná-los a um tubo Falcon de 50 mL.
2. Adicionar ao tubo Falcon 1,5 mL de DMF destilada e 1,5 mL de DCM, e agitar até a total solubilização.
3. Adicionar a quantidade calculada de DIC no tubo Falcon e homogeneizar.
4. Transferir a solução para um béquer de 25 mL.
5. Succionar a solução com a seringa de reação e manter o sistema em agitação por 2 horas.
6. Após agitação, descartar o resíduo de reagentes por filtração.
7. Realizar o protocolo de lavagem.
8. Realizar o teste de Kaiser e observar a coloração dos grânulos.
Após cada etapa de desproteção e acoplamento, realizou-se o processo de lavagem
descrito a seguir (QUADRO 4), seja para eliminar qualquer resíduo da solução de PIPE ou
para remover o excesso de derivado de aminoácido utilizado que ainda permaneça no interior
63
na seringa de reação. As etapas de lavagem foram realizadas com DMF, álcool isopropílico
(IPA) obtido da Vetec Química Fina (Rio de Janeiro, Brasil) e DCM.
Para verificar a eficiência de cada uma das etapas de desproteção e acoplamento,
realizou-se o teste de Kaiser como descrito no Quadro 5. O teste de Kaiser emprega as
seguintes soluções: piridina a 2% (v:v) em solução aquosa de KCN a 1 mmol.L-1
, fenol a 80%
(m:v) em etanol e ninhidrina a 5% (m:v) em piridina, na proporção de 1:2:1 (v:v:v)
sequencialmente (TROLL; CANNAN, 1953). Os reagentes, piridina, KCN, fenol e
ninhidrina, foram adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha), Lafan Química Fina (São
Paulo, Brasil) e Vetec Química Fina (Rio de Janeiro, Brasil), respectivamente.
Quadro 4 - Protocolo de lavagem para remoção de resíduos e excesso de reagentes.
1. Adicionar 2 mL de DMF na seringa de reação e manter em agitação por 1 minuto.
2. Remover o DMF por filtração.
3. Adicionar 2 mL de IPA na seringa de reação e manter em agitação por 1 minuto.
4. Remover o IPA por filtração.
5. Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 duas vezes.
6. Adicionar 2 mL de DCM na seringa de reação e manter em agitação por 1 minuto.
7. Remover o DCM por filtração.
A coloração dos grânulos de resina (resultado positivo) é indicativo da presença
de grupos amino livres, ou seja, demonstra que a remoção dos grupos Fmoc foi
adequadamente efetuada. Por outro lado, a ausência de coloração (resultado negativo)
demonstra que os grupamentos amino encontram-se ligados ao grupo protetor Fmoc, logo o
acoplamento ocorreu de maneira eficiente.
Quadro 5 - Protocolo para realização do teste de Kaiser.
1. Retirar aproximadamente 5 grânulos de resina da seringa de reação e colocá-los em um tubo de ensaio.
2. Adicionar ao tubo de ensaio:
- Uma gota da solução de cianeto.
- Duas gotas da solução de fenol.
- Uma gota da solução de ninidrina.
3. Manter o tubo de ensaio em aquecedor de tubos por 5 minutos a 90°C.
4. Colocar o tubo de ensaio contra a luz e observar com lupa a coloração dos grânulos.
64
As etapas sequenciais do processo de síntese “desproteção - lavagem - teste de
Kaiser - acoplamento - lavagem - teste de Kaiser - desproteção” foram executadas até que
toda a sequência peptídica almejada fosse obtida. A Figura 10 mostra uma representação
esquemática desse processo.
Figura 10 - Esquema das etapas de desproteção, acoplamento e clivagem realizadas na SPFS empregando-
se a estratégia Fmoc
.Fonte: Adaptado de Chan e White (2000).
Por fim, para remoção simultânea do peptídeo do suporte sólido e dos grupos
protetores das cadeias laterais, realizou-se a etapa de clivagem após a desproteção do último
resíduo de aminoácido da sequência peptídica. Os reagentes utilizados na composição da
solução de clivagem foram definidos de acordo com os grupos protetores presentes na
sequência peptídica sintetizada (TAB. 5).
65
Tabela 5 – Solução empregada na etapa de clivagem para obtenção dos peptídeos sintéticos
BP100, EAAA-BP100, [Pra]GAAA-BP100
e [Trz-β-A1]AAA-BP100
CAAA-BP100
95,0% TFA
2,5% H2O
2,5% TIS
94,0% TFA
2,5% H2O
2,5% EDT
1,0% TIS
Tabela 6 - Grupos protetores de cadeias laterais reativas dos derivados de aminoácido empregados na
síntese dos peptídeos BP100 e análogos, e seus respectivos tempos mínimos de reação de clivagem
Derivado de aminoácido Cadeia lateral reativa Grupo protetor Tempo de reação
(min)
Ácido Glutâmico
O
OH
O
O
t-butoxila (OtBu)
30
Cisteína SH
S
Tritila (Trt)
30
Lisina NH2
O
ONH
t-butoxicarbonila (Boc)
30
Tirosina OH O
t-butila (tBu)
30
Fonte: Adaptado de Chan e White (2000).
Para os peptídeos BP100, EAAA-BP100, [Pra]GAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-
BP100 utilizou-se a solução de clivagem composta por 95,0% de ácido trifluoroacético (TFA)
(Sigma-Aldrich - St. Louis, MO, USA), 2,5% H2O ultra-pura e 2,5% tri-isopropilsilano (TIS)
(Iris Biotech, Marktredwitz, Alemanha). Já para o peptídeo CAAA-BP100 sintetizado foi
66
empregada a solução de clivagem contendo 95,0% de TFA, 2,5% H2O ultra-pura , 1,0% de
TIS e 2,5% de 1,2-etanoditiol (EDT) (Merck - Darmstadt, Alemanha). Os tempos reacionais
mínimos necessários para remoção dos grupos protetores de cadeias laterais presentes nos
aminoácidos empregados podem ser observados na Tabela 6. Contudo, com a finalidade de
garantir elevada eficiência na clivagem dos peptídeos, a reação foi realizada com agitação
mecânica durante 1 hora para todos os peptídeos sintetizados.
O procedimento para realização da clivagem foi realizado conforme sua descrição
apresentada no Quadro 6.
Quadro 6 - Protocolo para realização do procedimento de clivagem.
1. Adicionar à seringa de reação a solução de clivagem definida.
2. Submeter o sistema à agitação mecânica pelo tempo determinado.
3. Remover a solução de clivagem por filtração transferindo-a para um tubo Falcon de 15 mL.
4. Lavar a resina com adição de 500 µL de TFA na seringa de reação. Remover este reagente por filtração.
transferindo-o para o mesmo tubo Falcon.
5. Remover o TFA do filtrado por aplicação de nitrogênio gasoso até a obtenção de um sistema levemente
viscoso.
6. Adicionar 5 mL de éter diisopropílico (Vetec Química Fina - Rio de Janeiro, Brasil), previamente resfriado,
para precipitação do peptídeo.
7. Submeter o sistema a centrifugação a 3200 rpm por 5 minutos.
8. Remover o sobrenadante.
9. Repetir as etapas 6, 7 e 8 mais 3 vezes.
10. Secar o peptídeo por aplicação de nitrogênio gasoso.
11. Solubilizar o peptídeo em água ultra-pura.
12. Liofilizar a solução para obtenção do peptídeo bruto completamente seco.
3.1.1 Obtenção do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100
O peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 foi obtido pela modificação na porção N-
terminal do peptídeo [Pra]GAAA-BP100 (FIG. 11A) através de uma reação de cicloadição
1,3-dipolar. O peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 (FIG. 11B) foi sintetizado para possibilitar a
comparação de resultados obtidos para a nanobioestrutura NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (FIG.
11C), pois ao realizar o acoplamento do derivado [Pra]GAAA-BP100 à nanopartícula
funcionalizada (NP-N3) é formado um anel triazólico unindo as duas estruturas.
67
Figura 11 – Esquemas demonstrativos de parte da estrutura química dos peptídeos [Pra]GAAA-BP100
(A) e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (B) e da nanobioestrutura NP-[Trz-β-A
1]AAA-BP100 (C).
A reação de cicloadição 1,3-dipolar foi conduzida à temperatura ambiente em
seringa de polipropileno, anteriormente à etapa de clivagem do [Pra]GAAA-BP100. Foram
utilizados 10,9 mg de sulfato de cobre II (CuSO4.5H2O) (0,5 equiv.), 10,3 mg de ascorbato de
sódio (0,6 equiv.) e 10,4 mg de azida de sódio (1,8 equiv.). Cada um dos reagentes foi
solubilizado previamente em 250 μL de água ultra-pura e em seguida succionados para o
interior da seringa de reação onde se encontrava o [Pra]GAAA-BP100 ainda acoplado aos
grânulos de resina. A reação ocorreu por 72h em mesa agitadora. Ao final da reação foram
realizadas 8 etapas de lavagem com solução de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA)
10% (m:v), seguida de 2 etapas de lavagem intercaladas com IPA e DMF e, por fim, 1
lavagem com DCM. Em seguida o peptídeo obtido foi clivado, conforme protocolo descrito
no Quadro 6.
3.2 Purificação e quantificação dos peptídeos sintéticos
A purificação dos peptídeos foi conduzida por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) em cromatógrafo líquido Varian® modelo Pro Star 315 (Walnut Creek,
Estados Unidos) com detector na região do UV-Vis modelo Pro Star 335 e válvula de injeção
marca Rheodyne, do Departamento de Química da UFVJM. Foram utilizadas as colunas
cromatográficas de fase reversa analítica Vydac® C18 (250 x 4,6 mm) e a semi-preparativa
Waters mBondapackTM
C18 10 mm 125 Ǻ (7,8 x 300 mm). As análises foram conduzidas
utilizando gradientes de dois eluentes: água ultra-pura acidulada com 0,1% de TFA, como
fase A, e acetonitrila (ACN) contendo 0,08% de TFA, como fase B. Esses reagentes, TFA e
ACN grau UV/HPLC, foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) e da Panreac
(Barcelona, Espanha), respectivamente, e a água ultra-purificada utilizada foi obtida em
aparelho da marca Simplicity UV Ultrapure (Type 1) Water (Berlim, Alemanha).
68
A detecção foi feita por espectroscopia na região do ultravioleta (UV), sendo
utilizado máx 215 nm. A escala analítica (injeção de 100 µL de amostra bruta do peptídeo na
concentração de 1 mg.mL-1
, sob fluxo de 0,8 mL.min-1
e rampa de eluição com aumento de
1,67% de ACN/min realizada durante 60 min) foi utilizada para definir as condições de
realização da purificação em escala semi-preparativa (injeção de 1 mL de amostra bruta na
concentração de 2 mg.mL-1
, sob fluxo de 2 mL.min-1
). A coleta das frações foi realizada
manualmente.
Os reagentes (ACN e TFA) presentes nas frações coletadas durante a purificação
dos peptídeos foram removidos em um evaporador rotativo a vácuo Fisatom modelo 801 com
banho de aquecimento modelo 550 (São Paulo, Brasil), utilizando bomba de vácuo Prismatec
modelo 121 (São Paulo, Brasil). Em seguida, a água remanescente nas amostras foi removida
por liofilização, utilizando o liofilizador LS3000, Terroni (São Paulo, Brasil) do
Departamento de Farmácia da UFVJM.
A concentração de todas as amostras de peptídeo foi padronizada em solução de
acordo com um método previamente descrito na literatura (MURPHY; KIES, 1960). Para essa
determinação, mediu-se a absorbância das amostras em 205, 215 e 225 nm:
(A215 – A225).144 = k
(A205).31 = T
(k + T)/2 = C
onde A é a absorbância da solução da amostra em 205, 215 e 225 nm e C é a concentração da
amostra (mg.L-1
).
3.3 Espectrometria de massa para caracterização dos peptídeos
As análises por espectrometria de massa foram feitas em colaboração com a
EMBRAPA – Recursos Genéticos (Brasília, DF) e com o Instituto de Ciências Biológicas –
ICB/UFMG. Os peptídeos sintetizados - BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100, [Pra]GAAA-
BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 - foram analisados em espectrômetro MALDI-ToF/ToF,
modo MS e MS/MS, em instrumentos AutoFlex III e Ultraflex III da Bruker Daltonics®
equipado com Laser Smart beamTM
em modo positivo. Alíquotas dos peptídeos foram
misturadas a uma solução supersaturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico - 1:1 (v:v)
diretamente em placas MTP AnchorChip 400/384 e 800/384 (Bruker Daltonics). Para a
69
determinação da massa monoisotópica na faixa de 800 a 5000 Da foi utilizado o modo
refletido com calibração externa, empregando-se o padrão de calibração de peptídeos indicado
pelo fabricante (Peptide Calibration Standard, Bruker Daltonics). Também foi realizada a
fragmentação dos íons precursores utilizando o modo MS/MS (espectrometria de massa
sequencial). Para visualização dos espectros foi utilizado o software PepSeq e a interpretação
da estrutura primária dos peptídeos foi realizada manualmente.
Figura 12- Etapas sequenciais das três estratégias para obtenção das nanobioestruturas do BP100.
70
3.4 Síntese e funcionalização de nanopartículas de alumina
Todas as etapas das estratégias de síntese e funcionalização para obtenção das
nanopartículas de alumina contendo o peptídeo antimicrobiano BP100 estão descritas na
Figura 12 e detalhadas a seguir. As etapas 1 e 2 foram iguais para todas as três rotas de
síntese. A etapa 3 é comum para as rotas 1 e 2.
3.4.1 Obtenção de nanopartículas de alumina (NP) – Etapa 1
O método para obtenção das nanopartículas de alumina (etapa 1) foi baseado em
um experimento previamente descrito na literatura (POTDAR et al., 2007). Utilizando um
balão de fundo redondo tritubulado, no qual foram acoplados um condensador (sistema de
refluxo) e dois funis de separação (FIG. 13), foi realizada a reação entre nitrato de alumínio
(150 mL, 0,10 M) e carbonato de sódio (150 mL, 0,19 M), ambos adquiridos da Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Figura 13 - Aparato para realização da reação entre nitrato de alumínio e carbonato de sódio (A) e
esquema demonstrativo das reações envolvidas na obtenção das nanopartículas de alumina (B).
As soluções de nitrato de alumínio e carbonato de sódio foram transferidas,
separadamente, para cada um dos funis de separação e a reação ocorreu pela adição
simultânea (gota a gota) das soluções de Al(NO3)3 e Na2CO3 ao balão de fundo redondo
71
tritubulado contendo 100 mL de água ultra-pura, sob agitação magnética e temperatura de 70
°C. Após, aproximadamente 3,5 h de reação, o sólido gelatinoso formado de AlOOH foi
separado por centrifugação (4500 rpm, 5 minutos) (centrífuga Spinlab, modelo SL-16RAV-
4000, São Paulo, Brasil) e submetido a sucessivas lavagens com água (1 x 10 mL), etanol (1 x
10 mL) e acetona (1 x 10 mL), nesta ordem. Após secagem à temperatura ambiente o
material foi calcinado em mufla de dimensões 30x15x15 (Fornos Magnu’s, Belo Horizonte,
MG, Brasil) com controlador de temperatura (N1040, Novus, Porto Alegre, RS, Brasil) a
550°C por 5 horas para remoção completa da água e obtenção das nanopartículas de Al2O3
(NP). As reações envolvidas na síntese do óxido de alumínio estão descritas na Figura 13B.
3.4.2 Hidroxilação das nanopartículas de alumina (NP NP-OH) – Etapa 2
A etapa de hidroxilação superficial das nanopartículas de alumina (etapa 2)
ocorreu com adição de 500 mg de NP em um balão de fundo redondo. As NP foram dispersas
em 50 mL de peróxido de hidrogênio a 30% (v:v) (Sigma-Aldrich - St. Louis, MO, USA) e
mantidas sob refluxo (100 °C) por 15 minutos utilizando manta aquecedora (Thelga, modelo
TMA250) e um condensador de bolas para obtenção das nanopartículas de alumina
hidroxiladas (NP-OH). Após resfriar à temperatura ambiente o material obtido foi
centrifugado (4500 rpm, 5 minutos) e submetido a sucessivas lavagens com água (3 x 10 mL)
e etanol (3 x 10 mL).
3.4.3 Ligação dos peptídeos sintéticos às nanopartículas de alumina
Para obtenção das nanoestruturas de alumina covalentemente ligadas à cadeia
peptídica do BP100 foram realizadas três estratégias diferentes que partem de modificações
estruturais das nanopartículas hidroxiladas. As etapas específicas das diferentes rotas
sintéticas estão destacadas na Figura 12 e serão descritas separadamente a seguir.
72
3.4.3.1 Rota 1 – Obtenção das nanobioestruturas NP- EAAA-BP100
NP-OH NP-NH2 – Etapa 3
A funcionalização das NP-OH com grupos amino (NP-NH2 - etapa 3) foi realizada
para obtenção das nanobioestruturas contendo os análogos EAAA-BP100 (rota 1) e CAAA-
BP100 (rota 2). As nanopartículas hidroxiladas foram submetidas a reação com 3-
aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Merck – Hohenbrunn, Alemanha) para formação das
nanopartículas com terminações amino livres (NP-NH2) (SWAN; POPAT; DESAI, 2005).
Em um balão de fundo redondo, 450 mg de NP-OH foram dispersas em solução de APTES /
tolueno (Isofar – RJ, Brasil) a 1:15 (v:v). A reação ocorreu em sistema de refluxo (110 °C)
por 120 minutos. O material obtido foi centrifugado (4500 rpm, 5 minutos) e lavado duas
vezes com cada um dos seguintes solventes - tolueno, IPA, DMF, etanol e água - adicionando
10 mL de solvente em cada etapa de lavagem.
NP-NH2 NP-EAAA-BP100 – Etapas 1.4 e 1.5
A obtenção das nanopartículas de alumina contendo o peptídeo EAAA-BP100
(NP-EAAA-BP100) ocorreu através da reação do peptídeo EAAA-BP100 com as NP-NH2 a
45 °C, sob agitação magnética, em um béquer de 25 mL contendo 3 mL de água ultra-pura
(etapa 1.4). Foram solubilizados 31,7 mg do peptídeo EAAA-BP100 protegido com Fmoc na
região N-terminal (2 equiv.), 45 mg de nanopartículas aminadas (1 equiv.) e, como ativadores,
3,5 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) (Merck – Darmstadt,
Alemanha) (2 equiv.) e 2,8 mg de HOBt (2 equiv.). Após 180 minutos de reação, a suspensão
final foi transferida para um tubo Falcon de 15 mL e submetida à centrifugação (4500 rpm, 5
minutos) para remoção do sobrenadante. As nanopartículas obtidas (NP-EAAA-BP100)
foram lavadas com água (2 x 5 mL) e etanol (2 x 5 mL). Em seguida, foi realizada a remoção
e quantificação do grupo Fmoc (ainda presente no resíduo Glu-1) pela adição de 2 mL de
PIPE:DMF 1:4 (v:v) (etapa 1.5). A reação ocorreu por 60 minutos. Finalmente, o material foi
centrifugado e lavado com DMF (1 x 5 mL), água (2 x 5 mL) e etanol (2 x 5 mL),
sequencialmente.
73
3.4.3.2 Rota 2 - Obtenção das nanobioestruturas NP -CAAA-BP100
NP-NH2 NP-Cys – Etapas 2.4, 2.5 e 2.6
Para realizar o acoplamento do derivado de cisteína (Fmoc-Cys(Trt)-OH) às
terminações amino presentes nas NP-NH2 foi utilizada uma suspensão contendo 50 mg de
NP-NH2, 29,6 mg de cisteína (5 equiv.), 7,7 mg de HOBt (5 equiv.) e 8 μL de DIC (5 equiv.)
em 3 mL de DMF (etapa 2.4). A reação ocorreu sob agitação por 3 horas. Ao final da reação
o sobrenadante foi descartado após centrifugação (4500 rpm, 5 minutos) e as nanoestruturas
foram lavadas 3 vezes para remoção de resíduos de reagentes e aminoácidos não acoplados. A
lavagem foi conduzida em três etapas, a primeira com DMF, em seguida com IPA e por fim
com etanol, adicionando-se 3 mL de solvente em cada lavagem. Em seguida, foi necessário
submeter as nanoestruturas a um processo de clivagem, previamente descrito no Quadro 6,
para remoção do Trt, grupo protetor de cadeia lateral da cisteína (etapa 2.5). A reação de
clivagem ocorreu por 1 hora, sob agitação, utilizando 1 mL de solução contendo 94,0% TFA,
2,5% H2O, 2,5% EDT e 1,0% TIS. Ao final deste procedimento, as nanoestruturas foram
secas em N2 gasoso.
As nanopartículas foram então submetidas ao processo de desproteção para
remoção e quantificação dos grupamentos Fmoc (procedimento descrito no item 3.5)
presentes nos derivados de cisteína imobilizados (etapa 2.6).
NP-CysNP-CAAA-BP100 – Etapas 2.7 e 2.8
Por fim, procedeu-se o acoplamento do peptídeo através da reação do CAAA-
BP100 com as NP-Cys a 35 °C, sob agitação magnética, em um béquer de 25 mL contendo 5
mL de solução tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,5 (etapa 2.7). Nesta solução foram
solubilizados 15,6 mg do peptídeo CAAA-BP100 protegido com Fmoc na região N-terminal
(1 equiv.) e adicionados 45 mg de NP-Cys. A reação ocorreu por 48 horas. Em seguida as
nanoestruturas foram centrifugadas (4500 rpm, 5 min) e lavadas com adição de 3 mL de água
ultra-pura. Nova solução tampão contendo o peptídeo foi preparada e procedeu-se o
reacoplamento das nanoestruturas por mais 48 horas de reação nas mesmas condições
descritas anteriormente. Ao final do processo, as nanoestruturas obtidas foram novamente
74
centrifugadas e submetidas a etapas de lavagem com água ultra-pura (2 x 5 mL) e etanol (2 x
5 mL). Em seguida, para remoção e quantificação dos grupamentos Fmoc, as nanopartículas
foram desprotegidas utilizando PIPE/DMF 1:4 (v:v) (etapa 2.8).
3.4.3.3 Rota 3 - Obtenção das nanobioestruturas NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
A rota 3 foi desenvolvida para o acoplamento do análogo [Pra]GAAA-BP100 às
nanopartículas de alumina através de reação de cicloadição 1,3-dipolar.
A funcionalização das nanopartículas na rota 3 ocorreu em três etapas: (i) as
nanopartículas hidroxiladas foram, inicialmente, submetidas a reação com 3-
cloropropiltrietoxisilano (CPTES) (Merck – Hohenbrunn, Alemanha) para obtenção das
nanopartículas com átomos de cloro terminais (etapa 3.3), (ii) logo em seguida, foram
introduzidos grupos N3 (azido) em substituição aos átomos de cloro previamente ligados
(etapa 3.4) e, (iii) por fim, realizou-se o acoplamento do peptídeo [Pra]GAAA-BP100 às
nanoestruturas (etapa 3.5).
NP-OH NP-Cl – Etapa 3.3
A primeira etapa foi realizada em um sistema de refluxo contendo 450 mg de NP-
OH dispersos em solução de CPTES / tolueno (Isofar – RJ, Brasil) a 1:15 (v:v) para formação
das nanopartículas contendo os átomos de cloro terminais (NP-Cl). A reação ocorreu sob
temperatura de refluxo (110 °C) por 120 minutos. O material obtido foi centrifugado (4500
rpm, 5 minutos) e lavado duas vezes com tolueno e hexano, adicionando 10 mL de solvente
em cada lavagem.
NP-Cl NP-N3 – Etapa 3.4
Na segunda etapa, para introdução de grupamentos N3 em substituição aos átomos
de cloro, 400 mg de NP-Cl foram dispersos em solução de tetrahidrofurano (THF)/H2O 1:2
(v:v) contendo 58,5 mg de NaN3 (10 equiv.). A reação ocorreu a 45 ºC, sob agitação
magnética, por 120 minutos. Ao final, as nanopartículas foram centrifugadas (4500 rpm, 5
minutos) e lavadas 2 vezes com 10 mL de água e etanol, sequencialmente.
75
NP-Cl NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 – Etapas 3.5 e 3.6
Por fim, a reação de cicloadição, empregada para ligar covalentemente o derivado
peptídico às nanoestruturas (etapa 3.5), foi realizada utilizando 45 mg de NP-N3, 20,2 mg de
[Pra]GAAA-BP100 (1,3 equiv.), 1, 1 mg de CuSO4 (0,5 equiv.) e 1,1 mg de ascorbato de
sódio (0,6 equiv.). Os reagentes foram solubilizados em 250 μL de água e o volume final de
reação foi ajustado para 3 mL. A reação ocorreu por 72 h em mesa agitadora. Ao final, as
nanopartículas obtidas foram centrifugadas e submetidas a etapas sequenciais de lavagem com
solução de EDTA 10% (m:v) (4 x 5 mL), água (2 x 10 mL) e etanol (2 x 10 mL). Em seguida
os grupos Fmoc foram removidos (etapa 3.6) e quantificados.
3.5 Determinação do grau de funcionalização das nanopartículas de alumina
A quantificação do grau de funcionalização das nanopartículas de alumina foi
alcançada por UV através da análise espectroscópica do aduto dibenzofulveno-piperidina
formado após realização da etapa de remoção dos grupos Fmoc presentes nos resíduos de
aminoácidos empregados na síntese dos peptídeos (FIG. 14). Dessa forma, para possibilitar a
quantificação do grau de funcionalização das nanopartículas foram acoplados os derivados de
Figura 14 – Mecanismo de remoção do grupo protetor Fmoc utilizando solução de PIPE em DMF com
posterior formação do aduto dibenzofulveno-piperidina.
Fonte: Adaptado de Eissler et al. (2017)
76
peptídeo contendo o grupo Fmoc. A detecção de absorbância em máx 301 nm caracteriza a
presença de moléculas do aduto e representa a imobilização de moléculas do referido peptídeo
na superfície da nanopartícula. Para a determinação do grau de funcionalização das NP-
EAAA-BP100 foram realizados acoplamentos de Fmoc-EAAA-BP100 às nanopartículas de
NP-NH2. A determinação do grau de funcionalização das NP-CAAABP100 foi alcançada pela
ligação de dissulfeto de Fmoc-CAAA-BP100 às nanopartículas de NP-Cys. E para
determinação do grau de funcionalização das NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 foi realizada a
reação de cicloadição utilizando Fmoc-[Pra]GAAA-BP100 e as nanopartículas de NP-N3.
3.5.1 Confirmação do grau de substituição da resina Rink®
amida 0,79 mmol.g-1
e
confecção da curva analítica
Baseando-se no artigo de Eissler et al. (2017), cujos autores determinaram por
UV, no comprimento de onda de 301 nm, o coeficiente de absortividade molar (ε301 nm) para o
aduto dibenzofulveno-piperidina, realizou-se uma análise espectroscópica para confirmação
do grau de substituição da resina Rink®
amida (0,79 mmol.g-1
) indicado pelo fabricante, com
o intuito de utilizar o produto de desproteção dessa resina na elaboração da curva analítica a
ser empregada na determinação do grau de substituição das nanobioestruturas contendo
peptídeo ou aminoácido acoplado. A resina Rink®
amida possui terminações amino ligadas ao
grupo protetor Fmoc que produz o aduto dibenzofulveno-piperidina em reação de desproteção
com PIPE/DMF 1:5 (v:v) (FIG. 14).
O experimento foi realizado utilizando 10,7 mg de resina. Em um tubo Falcon de
15 mL foi adicionada a massa de resina pesada e 5 mL de PIPE/DMF 1:5 (v:v). O sistema foi
mantido em agitação mecânica por 60 minutos. Ao final da reação de desproteção os grânulos
de resina foram removidos por filtração e o sobrenadante da reação recolhido em balão
volumétrico de 10 mL cujo volume foi ajustado com adição de PIPE/DMF 1:5 (v:v). Para
leitura a λmáx 301 nm no espectrofotômetro de UV utilizou-se como branco solução de
PIPE/DMF 1:5 (v:v) e cubeta de 1 cm de caminho óptico, além disso, é importante ressaltar
que foi necessário diluir a amostra 1:10 na mesma solução. Utilizando os dados experimentais
citados, o valor de absorbância obtido e o coeficiente de absortividade molar determinado por
Eissler et al. (2017), calculou-se o grau de substituição da resina através da equação:
77
SFmoc (mmol.g-1
) = [(E301 nm . V . D) / (I . ε301 nm . mresina)] . 106
Onde:
SFmoc - grau de substituição com Fmoc em mmol.g-1
de resina
E301 nm - absorbância da solução da amostra a 301 nm
106
- fator para conversão de mol para mmol e mg-1
para g-1
V - volume da amostra em L
I - comprimento do caminho óptico da célula em cm (1 cm)
D - fator de diluição
ε301 nm - coeficiente de absortividade molar 301 nm (8021 L.mol-1
cm-1
)
mresina - massa de resina (mg)
3.5.2 Determinação do grau de funcionalização das nanopartíiculas de alumina com
derivados de aminoácido ou de peptídeos
Finalizadas as reações para ligação dos derivados do peptídeo BP100 sobre as
nanopartículas, as nanoestruturas foram secas e pesadas. Em seguida procedeu-se à remoção e
recolhimento dos grupos Fmoc das cadeias de peptídeo imobilizadas.
A remoção dos grupamentos Fmoc foi feita pela adição de 2 mL de PIPE/DMF
1:4 (v:v) em um tubo Falcon contendo as nanopartículas funcionalizadas. A reação de
desproteção ocorreu por 60 minutos em mesa agitadora. Posteriormente, as nanopartículas
foram submetidas a etapas sequenciais de centrifugação e lavagem para recolhimento, em
balão volumétrico de 5 mL, de todo o sobrenadante que continha o aduto dibenzofulveno-
piperidina (conforme protocolo descrito no Quadro 7).
Quadro 7 - Protocolo para remoção do grupo protetor Fmoc e recolhimento do produto gerado.
1. Finalizada a reação de desproteção, o tubo Falcon contendo as nanoestruturas foi submetido a centrifugação
por 5 minutos, 4500 rpm.
2. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e acondicionamento em balão volumétrico de 5 mL.
3. Adicionou-se ao tubo Falcon, 1 mL de DMF para lavagem das nanoestruturas.
4. O sistema foi mantido em agitação por 1 minuto e em seguida foi submetido a centrifugação por 5 minutos,
4500 rpm.
5. O sobrenadante foi recolhido e acondicionado no mesmo balão volumétrico citado anteriormente.
6. As etapas 3, 4 e 5 foram repetidas mais uma vez.
78
Por fim, o volume do balão foi ajustado para 5 mL com a adição de DMF,
resultando em uma concentração de PIPE/DMF 1:10 (v:v). Dessa forma, para quantificação
do produto por espectroscopia na região do ultravioleta (UV) a curva analítica foi
confeccionada utilizando como solvente PIPE/DMF 1:10 (v:v), além disso empregou-se esta
mesma solução como branco e a leitura foi realizada em λmáx 301 nm.
O mesmo procedimento foi utilizado para quantificar moléculas de aminoácido
imobilizadas. Foi realizada a imobilização de um derivado de cisteína para obtenção de NP-
Cys-Fmoc (item 3.4.3.2 - NP-NH2 NP-Cys-Fmoc) e de um derivado de glicina (NP-NH2
NP-Gly-Fmoc) com o intuito de verificar a diferença no grau de funcionalização utilizando
apenas um derivado de aminoácido e uma cadeia de peptídeo.
3.6 Caracterização das nanoestruturas
Para a caracterização das nanopartículas de alumina contendo peptídeo e de cada
um dos produtos das etapas de funcionalização, realizou-se a análise dos materiais
sintetizados através das técnicas descritas a seguir.
3.6.1 Difração de raios-x
A estrutura cristalina de nanopartículas de alumina (Al2O3) foi analisada pela
técnica de DRX. Os dados foram obtidos em um difratômetro DRX6000, Shimadzu,
disponível no Departamento de Química da UFVJM. Empregou-se radiação Cu K
( = 1.540560 Å), operando a 200 mA e 40 kV. Silício foi utilizado como padrão
externo. O refinamento estrutural Rietveld dos dados de DRX foi efetuado com o
programa FullProf_Suite 2015.
3.6.2 Microscopia eletrônica de varredura
A avaliação morfológica das nanopartículas de alumina foi realizada utilizando o
microscópio eletrônico de varredura, da marca TESCAN, modelo VEGA-LMH (Kohoutovice
República Tcheca), disponível no bloco LABVALE do Departamento de Química da
UFVJM. As micrografias foram feitas a partir da deposição das nanoestruturas em suporte
79
metálico. As nanopartículas foram previamente dispersas em etanol seguida de evaporação
deste solvente à temperatura ambiente.
3.6.3 Microscopia eletrônica de transmissão
A análise estrutural das nanopartículas antes e após imobilização do peptídeo, foi
realizada em microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2-20 - SuperTwin FEI - 200 kV,
no Centro de Microscopia da UFMG. As amostras foram dispersas em etanol utilizando
banho de ultrassom e, em seguida, uma pequena gota de cada amostra foi colocada sobre a
grade (Holey Carbon) e secas a temperatura ambiente.
3.6.4 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier
Para caracterização das etapas de funcionalização das nanopartículas de alumina e
ligação dos derivados peptídicos foram obtidos espectros de absorção na região do
infravermelho, de 4000 a 400 cm-1
, com resolução 8 cm-1
e 32 acumulações, utilizando o
espectofotômetro FT-IR Varian, modelo 640-IR, equipado com modo de reflectância total
atenuada (ATR, Pike Technologies, modelo GladiATR), disponível no Departamento de
Química da UFVJM.
3.6.5 Ressonância magnética nuclear de 13
C em fase sólida
Os experimentos de RMN em fase sólida foram realizados utilizando um
espectrômetro Bruker Avance III 500 (11.75 T) com a sonda CP/MAS de 4 mm. Os espectros
unidimensionais (1D) de 13
C foram realizados para peptídeos livres, nanopartículas
funcionalizadas e ligadas aos peptídeos. Para a calibração dos espectros, amostra padrão de
adamantano enriquecida com o isótopo 13
C foi usada como referência externa. Cada amostra
foi empacotada no rotor de óxido de zircônio e rotacionada a uma velocidade de 5 kHz no
ângulo mágico (54,7 °). Todos os espectros foram coletados com 1,0 s de atraso de relaxação
(d1), tempo de aquisição (AQ) de 0,027 s, 2K de pontos de aquisição (TD) e com janela
espectral de 37593,984 Hz usando polarização cruzada com supressão total da banda lateral -
80
cptoss em 306 K (DIXON et al, 1982). Os dados de RMN foram adquiridos e processados
usando o software Bruker TopSpin (versão 3.1).
3.6.6 Análise térmica
A perda de massa das amostras de nanopartículas de alumina foi analisada, em
colaboração com o departamento de Química da UFMG, utilizando um termoanalisador DTG
60H (Shimadzu, Kyoto, Japan). As análises foram desenvolvidas em atmosfera inerte de N2,
sob um fluxo de 50 mL.min-1
, utilizando porta-amostra de alumina. O aquecimento foi
realizado a partir 30 °C até atingir 600 °C, utilizando taxa de aquecimento de 10 °C.min-1
.
3.6.7 Medidas de potencial zeta
As análises de potencial zeta foram conduzidas a 25 °C em um analisador de
partículas Zetasizer Nano ZS® da Malvern Instrument Ltd (Worcestershire, UK), disponível
no Departamento de Farmácia da UFVJM, utilizando cubeta de polietileno (DTS1061) de 700
µL. As amostras de nanopartículas de alumina foram submetidas ao espalhamento de luz
monocromática (10 mW Ne laser, λ 632,4 nm) e a intensidade de luz espalhada foi medida em
um ângulo de espalhamento de 90°. A determinação do potencial zeta (ζ) foi realizada com as
amostras (0.2 mg.mL-1
) dispersas em tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, contendo 100 mM de
NaCl.
3.7 Ensaios de atividade antimicrobiana
Os ensaios de atividades antibacteriana e antifúngica das nanopartículas de alumina
(NP, NP-OH, NP-NH2, NP-Cys, NP-Cl, NP-N3, NP-EAAA-BP100, NP-CAAA-BP100 e NP-
[Trz-β-A1]AAA-BP100) e dos peptídeos (BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-
A1]AAA-BP100) foram realizados em colaboração com o Laboratório de Doenças
Parasitárias, Departamento de Farmácia, UFVJM.
81
3.7.1 Ensaio antibacteriano
Foram utilizadas cepas de Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella
typhimurium (ATCC 14028) e Staphylococcus aureus (ATCC 29313) da American Type
Culture Collection (Manassas, VA, USA). Utilizou-se como referência a metodologia dos
testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para bactéria de crescimento
aeróbico (ANVISA, 2003; NCCLS, 2012) e o ensaio colorimétrico de viabilidade celular
(QUEIROZ et al., 2011).
Os microrganismos foram cultivados a 37°C em placa de ágar contendo meio BHI
(Brain Heart Infusion) da HiMedia Laboratories (Mumbai, India) durante 12 horas. As
colônias isoladas foram selecionadas e transferidas para o meio líquido de cultura Mueller-
Hinton da Kasvi (Curitiba, Brasil), cuja concentração foi ajustada utilizando o
espectrofotômetro Bel Photonics S-2000 UV (São Paulo, Brasil) para leitura de absorbância
em λmáx 625 nm de modo a obter uma turbidez óptica comparável a solução padrão McFarland
de 0,5, resultando em uma suspensão composta por aproximadamente 5 x 105 UFC.mL
-1
(unidades formadoras de colônia.mL-1
). Essa solução foi diluída (1:10) e alíquotas de 50 µL
do inóculo foram transferidas para cada poço da placa de 96 poços com fundo chato e estéril
Sarstedt (Nümbrecht, Alemanha) usada no ensaio. O Cloranfenicol (MM: 323,132 g.mol-1
)
(antibiótico convencional) obtido da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) foi utilizado como
padrão para controle de morte celular (controle positivo) na concentração de 30 µg.mL-1
(92,8
µmol.L-1
) e o controle negativo foi feito com adição de 50 µL do inóculo e 50 µL de meio de
cultura estéril. As concentrações das amostras empregadas no ensaio de atividade
antibacteriana estão detalhadas na Tabela 7. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Os experimentos foram realizados em cultura estacionária a 37°C e após 20 horas
de incubação, foram adicionados em cada poço 30 μL de solução de resazurina 0,01%
(Sigma-Aldrich, Sto Lous, MO, USA), a incubação permaneceu por mais 4 horas na ausência
de luz para o desenvolvimento de coloração. A alteração de azul para rosa indica redução da
resazurina por microrganismos vivos. A concentração inibitória mínica (MIC) foi definida
como a menor concentração de amostra que inibiu completamente o crescimento de
microrganismos (não há alteração da cor).
82
Tabela 7 - Concentrações de peptídeo e/ou nanopartícula presentes em cada amostra utilizada no ensaio
de atividade antibacteriana.
[Peptídeo]
(µmol.L-1
)
[Peptídeo] / [Nanopartícula]
(µmol.L-1
/ g.L-1
)
[Nanopartícula]
(g.L-1
)
BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Trz-β-A1]AAA-
BP100
NP-EAAA-
BP100
NP-CAAA-
BP100
NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100
NP, NP-OH, NP-NH2, NP-
Cys, NP-Cl e NP-N3
2,5 2,5 / 0,03 2,5 / 0,09 2,5 / 0,03 0,13
5 5 / 0,06 5 / 0,18 5 / 0,07 0,25
10 10 / 0,13 10 / 0,35 10 / 0,13 0,50
20 20 / 0,26 20 / 0,70 20 / 0,26 1,00
40 40 / 0,51 40 / 1,40 40 / 0,53 2,00
80 80 / 1,03 80 / 2,80 80 / 1,05 4,00
160 160 / 2,05 160 / 5,60 160 / 2,10 8,00
Para remoção das nanopartículas de alumina, as placas de 96 poços foram
centrifugadas utilizando centrífuga de placas Thermo Fisher Scientific Megafuge 16R,
Alemanha, durante 15 minutos a 2000 rpm, e o sobrenadante transferido para uma nova placa,
na qual foi realizada a leitura de absorbância das soluções contidas nos poços. As medidas
espectrofotométricas foram efetuadas em λmáx 595 nm, utilizando uma Multileitora
Spectramax Paradigm Molecular Devices, LLC (Sunnyvale, CA, USA).
3.7.2 Ensaio antifúngico
Foram empregadas as leveduras Candida krusei (ATCC 34135) e Candida
parapsilosis (ATCC 22019) neste ensaio. A metodologia empregada no ensaio antifúngico foi
semelhante ao procedimento descrito para o ensaio antibacteriano, de acordo com o método
de referência para testes de diluição em caldo para determinação da sensibilidade de leveduras
à terapia antifúngica (ANVISA, 2002 e NCCLS, 2002) e o ensaio colorimétrico de viabilidade
celular (MOSMANN, 1983).
Os microrganismos foram cultivados por 24 h, em placa de ágar contendo meio
Sabouraud dextrosado da Prodimol Biotecnologia (Belo Horizonte, MG, Brasil). Para o
preparo do inóculo, as colônias isoladas foram transferidas para o meio líquido de cultura
RPMI-1640 contendo MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico) 0,165 mol.L-1
, pH 7,0,
83
ambos adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), cuja concentração foi ajustada
utilizando espectrofotômetro para leitura de absorbância entre 0,25-0,30 em λmáx 530 nm de
modo a obter uma suspensão de leveduras composta por, aproximadamente, 1-5 x 106
UFC.mL-1
. A suspensão resultante foi submetida à duas diluições subsequentes (1:20 e 1:50)
utilizando o próprio meio RPMI/MOPS fornecendo uma concentração de 0,5 – 2,5 x 103
UFC.mL-1
. A Anfotericina B (MM: 924,08 g.mol-1
) (antibiótico convencional) obtido da
Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) foi utilizado como padrão para controle de morte
celular na concentração de 200 µg.mL-1
(216,4 µM) e o controle positivo foi feito com adição
de 50 µL do inóculo e 50 µL de meio de cultura estéril.
A adição de MTT foi realizada após 44 horas de incubação em estufa a 35°C,
adicionou-se 10 µL da solução de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-
tetrazólio) da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) a 4% em cada poço da placa. Em seguida,
procedeu-se à incubação por mais 4 horas sob proteção da luz e os cristais de formazan, de
cor azul, foram solubilizados pela adição, em cada poço, de 100 µL da solução de laurel
sulfato de sódio em água e etanol 5:20:30 (m:v:v) e as medidas espectrofotométricas foram
efetuadas em λmáx 595 nm em leitor de microplaca (Molecular Devices, modelo SPECTRA
MAX, Sunnyvale, CA, USA). As concentrações das amostras analisadas de NP, EAAA-
BP100 e NP-EAAA-BP100 empregadas nos ensaios de atividade fungicida estão detalhadas
na Tabela 8. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Tabela 8 - Concentrações de peptídeo e/ou nanopartícula presentes em cada amostra utilizada no ensaio
de atividade antifúngica
[Peptídeo]
(µmol.L-1
)
[Nanobioestruturas]
(µmol.L-1
/ g.L-1
)
[Nanopartícula]
(g.L-1
)
BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Trz-β-A1]AAA-
BP100
NP-EAAA-
BP100
NP-CAAA-
BP100
NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100
NP, NP-OH, NP-NH2, NP-
Cys, NP-Cl e NP-N3
5 5 / 0,06 5 / 0,18 5 / 0,07 0,25
10 10 / 0,13 10 / 0,35 10 / 0,13 0,50
20 20 / 0,26 20 / 0,70 20 / 0,26 1,00
40 40 / 0,51 40 / 1,40 40 / 0,53 2,00
80 80 / 1,03 80 / 2,80 80 / 1,05 4,00
160 160 / 2,05 160 / 5,60 160 / 2,10 8,00
320 320 / 4,10 320 / 11,20 320 / 4,20 16,00
84
3.8 Estudos biofísicos
3.8.1 Obtenção de vesículas lipídicas unilamelares
Para a realização dos experimentos de extravasamento de carboxifluoresceína,
dicroísmo circular e ressonância plasmônica de superfície foram empregadas LUV como meio
biomimético de membrana. As etapas de preparação das LUV estão esquematizadas na Figura
15 e foram realizadas de acordo com a metodologia previamente descrita na literatura
(KIRBY; GREGORIADIS, 1984). Inicialmente, os fosfolipídeos POPC e POPG, na
proporção 3:1 (mol/mol), foram solubilizados em 1 mL de clorofórmio para obtenção de uma
solução a 5 mM. A solução foi transferida para um tubo de ensaio e, utilizando um
evaporador rotativo, o clorofórmio foi removido para formação de um filme lipídico sobre a
parede interna do tubo de ensaio. Em seguida, o filme lipídico foi hidratado pela adição de 1
mL de solução tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,5) contendo 5(6)-carboxifluoresceína (Sigma-
Aldrich - St. Louis, MO, USA) a 5 mM, o que resultou na formação de vesículas
fosfolipídicas multilamelares contendo carboxifluoresceína. Vale ressaltar que o filme lipídico
utilizado no preparo das LUV empregadas no ensaio de CD foi hidratado com 1 mL de
solução tampão Tris-HCl 20 mM (pH 8,5) contendo NaCl 100 mM e sem 5(6)-
carboxifluoresceína.
A solução de LUV foi submetida a 8 ciclos sucessivos de congelamento em
nitrogênio líquido (-196ºC), descongelamento em banho-maria (40°C) e banho de ultrassom
por 2 minutos, resultando na formação de vesículas fosfolipídicas unilamelares de tamanhos
variáveis. Finalmente, para obtenção das LUV a solução de vesículas foi submetida a
processo de extrusão utilizando-se um sistema de micro extrusão da Avanti® Polar Lipids Inc
(Alabaster, AL) adaptado com membranas de policarbonato de 100 nm.
A CF livre em solução (não encapsulada em LUV) foi removida por separação em
coluna cromatográfica Sephadex-G25 (1,2 cm x 10 cm). Para o preparo da coluna, 500 mg de
Sephadex-G25 foram dispersos em 6 mL de tampão Tris-HCl 10 mM contendo NaCl 200
mM, pH 8,5. Essa suspensão foi mantida em agitação por 24 horas. Preencheu-se 2/5 de uma
seringa de polipropileno de 5 mL com a suspensão de Sephadex-G25, em seguida passou-se 1
mL da suspensão contendo as LUV por essa coluna. As LUV foram recolhidas e o teor total
85
de fosfolípidos das LUV eluídas foi determinado por um método colorimétrico descrito na
literatura (STEWART, 1980).
Figura 15 – Etapas sequenciais do processo de obtenção de LUV.
3.8.2 Medidas de extravasamento de carboxifluoresceína
Alíquotas de LUV contendo CF (150 µL) foram adicionadas a microplacas de
poliestireno (dimensões 128 x 86 x 14,5 mm) de 96 poços (Greiner Bio-one – São Paulo,
Brasil) para medidas de emissão de fluorescência em meios contendo amostras de EAAA-
BP100, NP e NP-EAAABP100. O aumento da fluorescência de CF em função do tempo a
25°C foi continuamente registrado em um espectrofotômetro de fluorescência Spectra Max®
Paradigm (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, US), disponível no Departamento de
Farmácia da UFVJM. Foram utilizados λex 490 nm e λem 512 nm. A fluorescência de CF total
(extravasamento máximo) foi determinada por um experimento similar utilizando 100 µL de
Triton-X 100 a 1:10 (v:v). A porcentagem de extravasamento de CF (% CF) foi determinada
como descrito previamente na literatura (ALVAREZ et al., 2003 VERLY et al., 2008).
86
3.8.3 Dicroísmo circular
Os espectros de dicroísmo circular foram registrados utilizando-se um
espectropolarímetro JASCO®
J-815 acoplado a um sistema de controle de temperatura Peltier
Jasco® modelo PTC-423L. Os espectros foram obtidos a 25 °C, na faixa λ de 190 a 260 nm,
utilizando-se uma cubeta de quartzo com 1 mm de caminho óptico, em oito varreduras
consecutivas por amostra. Foi empregada a velocidade de varredura de 100 nm.min-1
e tempo
de resposta de 4 s. A largura de banda foi de 1 nm e a leitura de elipticidade realizada a cada
0,2 nm. As preferências conformacionais dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (100 µM) foram investigadas em solução tampão 20 mM
Tris-HCl (pH 8,5) contendo NaCl 100 mM e em diferentes concentrações de LUV
POPC:POPG (3:1) (125 µM, 250 µM, 500 µM e 1 mM). As amostras de nanopartículas - NP,
NP-NH2, NP-Cys, NP-Cl, NP-N3, NP-EAAA-BP100, NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100 – também foram analisadas em LUV (0,5 mM e 1 mM) e no mesmo tampão.
3.8.4 Ressonância plasmônica de superfície
As medidas de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) foram realizadas em
comprimento de onda de 670 nm, a 25 ºC e fluxo de 50 mL.min-1
, utilizando equipamento
Multi-Paramétrico de Ressonância Plasmônica de Superfície (MP-SPR) SPRNavi® 200
(BioNavis®, Finlândia). Os experimentos foram realizadas utilizando um chip sensor de SiO2
(SPR102-SiO2) que foi lavado in situ, no canal de fluxo, anteriormente a cada análise por 5
minutos com injeções sequenciais de Hellmanex III a 5%, álcool isopropico e água ultra-pura.
Após cada lavagem, a condição do chip sensor foi confirmada pelo modo de
varredura em água. Para cada medida, o chip sensor foi inicialmente submetido ao tampão
utilizado nas análises (Tris-HCl 20 mM, pH 8,5) e depois a uma solução de POPC: POPG (3:
1) durante aproximadamente 10-15 min até que uma linha de base estável fosse alcançada. Os
experimentos consistiram de injeções de 50 μL de nanopartículas funcionalizadas ou dos
peptídeos livres suspensos na mesma solução tampão.
Para a determinação da constante de associação (Ka) foram analisadas as
nanopartículas que se ligam covalentemente aos peptídeos injetando solução de diferentes
concentrações de NP-CAAA-BP100 e NP- [Trz-β-A1] AAA-BP100 (2-32 μmol.L
-1 de
87
peptídeo). A constante de associação (Ka) das interações peptídeo-membrana foi calculada
com a intensidade do sinal de RU registrada em 13 min para NP-CAAA-BP100 e 10 min para
NP- [Trz-β-A1]AAA-BP100 usando o software TraceDrawer
® v.1.6 (Ridgeview Instruments
AB, Vänge, Suécia).
88
89
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-
BP100 e [Pra]GAAA-BP100
Nesta sessão serão apresentados os resultados da obtenção do peptídeo BP100 e
dos derivados EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100, que foram usados para a
síntese das nanobiestruturas contendo peptídeo produzidas neste trabalho. Cada um destes
derivados foi covalentemente ligado às nanopartículas de alumina por diferentes estratégias de
síntese.
Sabe-se que o peptídeo antimicrobiano BP100 exerce seu mecanismo de ação
através da interação da cadeia peptídica em uma conformação helicoidal com a superfície da
membrana fosfolipídica do microrganismo (TORCATO et al., 2013; MANZINI et al., 2014).
Neste sentido, os resíduos adicionais de alanina presentes nos peptídeos EAAA-BP100,
CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100 foram introduzidos com o intuito de fornecer um
espaçamento adequado entre a superfície da alumina e a estrutura peptídica, possibilitando
assim que toda cadeia do BP100 fique disponível para interagir com a membrana de
microrganismos e manter sua atividade antimicrobiana. Dessa forma, pretende-se evitar
qualquer prejuízo ou alteração significativa na interação das cadeias peptídicas das
nanobioestruturas com as células patogênicas, mantendo a atividade biológica dos PAM
comparável ao peptídeo em sua forma livre (não imobilizada) (COSTA et al., 2011; ALVES;
PEREIRA, 2014). Já os resíduos de ácido glutâmico, cisteína e propargilglicina, presentes nos
derivados sintéticos EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-BP100, respectivamente,
foram adicionados pois, através da cadeia lateral destes resíduos, foi realizada a ligação à
superfície da alumina previamente funcionalizada.
4.1.1 Síntese dos peptídeos em fase sólida
Conforme descrito na metodologia, a síntese dos peptídeos ocorreu através da
realização de etapas sequenciais de desproteção e acoplamento de derivados de aminoácidos,
seguindo o protocolo de síntese de peptídeo em fase sólida. A estratégia Fmoc, utilizada neste
trabalho, emprega derivados de aminoácidos ligados covalentemente em sua porção N-
90
terminal ao grupo protetor Fmoc, para evitar reações secundárias durante as etapas de
acoplamento dos resíduos de aminoácido. Assim como os derivados de aminoácidos, o
suporte polimérico empregado na síntese (resina Rink® amida), responsável pela fixação do
primeiro resíduo de aminoácido, também é protegido com grupamento Fmoc no grupo amino.
Portanto, a primeira etapa consiste na desproteção do grupo Fmoc da resina, promovida em
meio básico conforme demonstrado no mecanismo da Figura 16. Inicialmente, o hidrogênio
ácido do grupo Fmoc é removido pela base orgânica 4-metilpiperidina via mecanismo de
eliminação β, resultando na desproteção da região N-terminal do resíduo de aminoácido.
Figura 16 - Mecanismo de reação para remoção do grupo Fmoc.
Fonte: Adaptado de Pires, Bemquerer e Nascimento (2014).
Em seguida, é realizada a ativação do primeiro derivado de aminoácido
empregando-se DIC e HOBt, os quais favorecem o ataque nucleofílico do grupo amino livre
da resina ao carbono carbonílico do derivado de aminoácido (FIG.17). A partir desta etapa, as
sínteses consistiram em repetitivas etapas de desproteção do grupo Fmoc do derivado de
91
aminoácido acoplado e ativação de um novo derivado para formação das ligações peptídicas
e, consequente, obtenção da sequência primária desejada. A eficiência de todas as etapas de
acoplamento e desproteção dos derivados de aminoácidos foram avaliadas através da
realização do teste de Kaiser.
Figura 17 - Mecanismo de ativação da carboxila da porção C-terminal seguida da formação de uma
ligação peptídica.
Fonte: Adaptado de Pires, Bemquerer e Nascimento (2014).
Nas Tabelas 9 e 10 é possível observar os dados do acompanhamento das sínteses
do BP100 e do EAAA-BP100, nas quais estão descritos os resultados de todos os testes de
Kaiser realizados. O sinal positivo (+) representa a presença de grupos amino livres, ou seja,
não há grupo protetor Fmoc ligado à porção N-terminal do derivado de aminoácido
adicionado. O sinal negativo (-) indica a presença de grupos amino protegidos, neste caso, o a
92
porção N-terminal do resíduo de aminoácido se encontra covalentemente ligado ao grupo
Fmoc. Observa-se pelos dados apresentados nas tabelas que a síntese dos peptídeos ocorreu
de forma eficaz, não havendo problemas em nenhuma das etapas de acoplamento e
desproteção.
Tabela 9 - Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo BP100
Ordem de
acoplamento Derivado de Aminoácido Excesso
Tempo de
reação (h)
Resultado do Teste de Kaiser
Acoplamento Desproteção
1º Fmoc-Leu-OH 4 3 - +
2º Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3 2 - +
3º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
4º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
5º Fmoc-Ile-OH 3 2 - +
6º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
7º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
8º Fmoc-Phe-OH 3 2 - +
9º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
10º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
11º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
Tabela 10 - Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo EAAA-BP100
Ordem de
acoplamento Derivado de Aminoácido Excesso
Tempo de
reação (h)
Resultado do Teste de Kaiser
Acoplamento Desproteção
1º Fmoc-Leu-OH 4 3 - +
2º Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3 2 - +
3º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
4º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
5º Fmoc-Ile-OH 3 2 - +
6º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
7º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
8º Fmoc-Phe-OH 3 2 - +
9º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
10º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
11º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
12º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
13º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
14º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
15º Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3 2 - +
93
Os dados do acompanhamento da síntese dos peptídeos CAAA-BP100 e
[Pra]GAAA-BP100 estão apresentados nas Tabelas 11 e 12. Na síntese do CAAA-BP100
(TAB. 11) foi identificada a presença de grupos amino livres após 2 h de reação para adição
do derivado de cisteína (Fmoc-Cys(Trt)-OH) no 15º acoplamento. Dessa forma, foi necessário
repetir todo o procedimento para acoplamento do derivado de Fmoc-Cys(Trt)-OH. Por outro
lado, na síntese de [Pra]GAAA-BP100 (TAB. 12) não houve a necessidade de reacoplamentos
ou repetição de quaisquer etapas de desproteção.
Alguns dos derivados de aminoácidos empregados na síntese dos peptídeos
apresentam grupos protetores de cadeias laterais reativas - tritil (Trt), t-butoxi (OtBu), t-
butoxicarbonil (Boc), t-butil (tBu) - os quais foram removidos apenas ao final da síntese,
prevenindo assim a ocorrência de reações secundárias indesejáveis (CHAN; WHITE, 2000).
Estes grupamentos foram removidos exclusivamente em meio ácido, durante a etapa de
clivagem, na qual ocorreu também a separação da cadeia peptídica do suporte sólido.
Tabela 11 - Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo CAAA-BP100
Ordem de
acoplamento Derivado de Aminoácido Excesso
Tempo de
reação (h)
Resultado do Teste de Kaiser
Acoplamento Desproteção
1º Fmoc-Leu-OH 4 3 - +
2º Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3 2 - +
3º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
4º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
5º Fmoc-Ile-OH 3 2 - +
6º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
7º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
8º Fmoc-Phe-OH 3 2 - +
9º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
10º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
11º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
12º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
13º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
14º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
15º Fmoc-Cys(Trt)-OH 3 2 +
*15º Fmoc-Cys(Trt)-OH 4 3 - +
*Reacoplamento
94
Tabela 12 - Dados do acompanhamento da síntese do peptídeo [Pra]GAAA-BP100
Ordem de
acoplamento Derivado de Aminoácido Excesso
Tempo de
reação (h)
Resultado do Teste de Kaiser
Acoplamento Desproteção
1º Fmoc-Leu-OH 4 3 - +
2º Fmoc-Tyr(tBu)-OH 3 2 - +
3º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
4º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
5º Fmoc-Ile-OH 3 2 - +
6º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
7º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
8º Fmoc-Phe-OH 3 2 - +
9º Fmoc-Leu-OH 3 2 - +
10º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
11º Fmoc-Lys(Boc)-OH 3 2 - +
12º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
13º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
14º Fmoc-Ala-OH 3 2 - +
15º Fmoc-propargil-Gly-OH 3 2 - +
4.1.2 Purificação dos peptídeos sintetizados
Finalizada a síntese, e imediatamente após a etapa de clivagem, as amostras brutas
dos peptídeos foram submetidas a análise por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), cujos perfis cromatográficos estão apresentados na Figura 18. Em cada um dos
cromatogramas é possível observar a presença de um pico proeminente com tempo de
retenção de 29,05 min, 33,19 min, 34,57 min e 34,24 min, referente aos peptídeos BP100
(FIG. 18A), EAAA-BP100 (FIG. 18B), CAAA-BP100 (FIG. 18C) e [Pra]GAAA-BP100
(FIG. 18D), respectivamente, indicando elevada eficiência das sínteses.
95
Figura 18 - Perfil cromatográfico analítico de amostra bruta dos peptídeos BP100 (A), EAAA-BP100 (B),
CAAA-BP100 (C) e [Pra]GAAA-BP100 (D).
Os tempos de retenção (tR) de cada um dos peptídeos estão diretamente
relacionados com a polaridade da molécula sintetizada (Qi et al., 2010). Sabendo que a coluna
cromatográfica empregada apresenta fase estacionária apolar, diversas considerações podem
ser pontuadas. O BP100 (FIG. 18A) foi o peptídeo com menor tempo de retenção, pois
apresenta menor número de resíduos de aminoácido (11 resíduos) em sua sequência primária.
Já os outros peptídeos sintetizados possuem maior cadeia peptídica que o BP100, todos
dispõem de 15 resíduos de aminoácidos e diferem entre si apenas no primeiro resíduo da
sequência de aminoácidos que compõe sua estrutura primária. O ácido glutâmico, primeiro
resíduo de aminoácido do EAAA-BP100 (FIG. 18B), apresenta cadeia lateral carregada e
polar, por isso o menor tR dentre os derivados. Já os peptídeos [Pra]GAAA-BP100 (FIG. 18D)
e CAAA-BP100 (FIG. 18C) apresentaram maiores tempos de retenção, os resíduos
propargilglicina e cisteína, respectivamente presente nesses derivados, possuem cadeia lateral
de baixa polaridade.
96
4.1.3 Caracterização por espectrometria de massa
A caracterização química das amostras de peptídeos sintéticos foi realizada por
espectrometria de massa, permitindo a confirmação da obtenção das moléculas almejadas. A
Figura 19 apresenta os espectros de massa MS dos peptídeos BP100 (FIG. 19A), EAAA-
BP100 (FIG. 19B), CAAA-BP100 (FIG. 19C) e [Pra]AAA-BP100 (FIG. 19D), nos quais é
possível verificar a presença do pico do íon molecular de razão m/z característica de cada um
dos peptídeos analisados, 1420,99, 1763,07, 1737,07 e 1730,10, respectivamente. Todos as
massas monoisotópicas encontradas nos espectros apresentaram valores muito próximos das
massas teóricas dos respectivos peptídeos também destacadas na Figura 19.
Os íons [M+H]+ de m/z 1420,99, 1763,07, 1737,07 e 1730,10 foram ainda
submetidos à espectrometria de massa MS/MS para caracterização da sequência primária de
cada estrutura peptídica sintetizada. Considerando toda a estrutura química da cadeia
peptídica sabe-se que as ligações peptídicas (ligações amídicas) são mais facilmente
rompidas, dessa forma, os fragmentos oriundos da fragmentação dessas ligações são mais
frequentes no espectro MS/MS. Íons fragmentos que mantém a região N-terminal intacta
pertencem à série b e íons que mantém a região C-terminal intacta pertencem à série y, sendo
os íons do par de fragmentos b/y comlementares entre si. Embora menos intensos, outros íons
podem ser observados no espectro MS/MS, como por exemplo aqueles decorrentes da quebra
de ligações do carbono dos resíduos da cadeia peptídica, gerando as séries de íons a, c, x e z
(FIG. 20). Além desses, pode ocorrer ainda a quebra simultânea das regiões amino e carboxi
terminais de um mesmo aminoácido induzindo a formação de íons imônio (CANTÚ et al.,
2008).
97
Figura 19– Espectro de massa MS dos peptídeos BP100 (A e B), EAAA-BP100 (C e D), CAAA-BP100 (E e
F) e [Pra]GAAA-BP100 (G e H).
98
Figura 20 – Possíveis regiões de clivagem da cadeia peptídica gerando os íons: a, b, c, x, y e z.
Os espectros de massa MS/MS obtidos pela fragmentação das moléculas de
peptídeo BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100 e [Pra]AAA-BP100 estão apresentados na
Figura 21. No Anexo III estão apresentados todos os íons fragmento, teóricos e observados,
para as séries b e y do sequenciamento dos peptídeos BP100, EAAA-BP100 e [Pra]AAA-
BP100.
Em todos os espectros MS/MS dos peptídeos sintetizados foi possível identificar
alguns íons imônio característicos das moléculas sintetizadas. Os íons imônio provenientes
dos resíduos de aminoácido fenilalanina (m/z 120), isoleucina/leucina (m/z 86) e lisina (m/z
101), além do íon fragmento de m/z 84 que está relacionado ao imônio da lisina com perda do
grupo amino proveniente da cadeia lateral deste aminoácido, foram observados em todos os
espectros. O imônio característico de resíduos de alanina (m/z 44) não foi detectado apenas no
espectro do BP100.
Em todos os espectros obtidos nota-se que os sinais dos íons provenientes da série
b foram visualmente mais intensos do que os sinais devido aos íons da série y, sendo de
extrema importância na interpretação e elucidação das estruturas peptídicas primárias. Além
disso, como a variação das estruturas primárias das moléculas sintetizadas ocorreu apenas na
região amino-terminal, os espectros mostraram o mesmo conjunto de íons da série y diferindo
apenas nos íons fragmento y12, y13 e y14 (que praticamente não foram evidenciados nos
espectros), além do íon molecular.
99
Figura 21– Interpretação dos espectros de massa MS/MS dos peptídeos BP100 (A), EAAA-BP100 (B),
CAAA-BP100 (C) e [Pra]AAA-BP100 (D). Íons da série b estão apresentados em azul escuro e íons da
série y em vermelho. Íons em azul claro não foram observados no espectro, mas são característicos da
molécula analisada. Os imônios estão indicados por setas.
100
No espectro do BP100 (FIG. 21A) os íons b7 (m/z 886,81), b8 (m/z 999,84), b9
(m/z 1127,90) e b10 (m/z 1290,81), apareceram com elevada intensidade e permitiram fácil
identificação para a confirmação da estrutura primária do peptídeo. No espectro do EAAA-
BP100 (FIG. 21B) a presença do íon de m/z 101,1 em maior intensidade do que observado no
espectro de BP100 (FIG. 21A) pode ser decorrente do imônio do resíduo adicional de ácido
glutâmico, que geralmente ocorre próximo a m/z 102 assim como os íons imônios derivados
de resíduos de lisina. Neste espcetro também foi possível identificar todos os íons
pertencentes a série b referentes a molécula sintetizada, sendo os de maiores intensidades os
íons b11 (m/z 1228,8), b12 (m/z 1341,9) e b13 (m/z 1470,0). Por outro lado, no espectro
MS/MS do CAAA-BP100 (Figura 21C), os íons fragmento mais intensos foram b11 (m/z
1202,7), b12 (m/z 1315,8) e b7 (m/z 686,4), condizentes com a adição da massa relativa a um
resíduo de cisteína (m/z 104,2 – calculada para b1) nas razões m/z apresentadas. Além disso,
o imônio da cisteína (m/z 74) foi prontamente observado no espectro. Por fim, no espectro do
[Pra]GAAA-BP100 (FIG. 21D) todos os íons da série b apresentaram intensidade elevada,
possibilitando a caracterização completa da sequência de aminoácidos somente por esta série.
Embora o íon relativo ao fragmento b1 (m/z 95,9) não tenha sido observado, os íons devido
aos fragmentos b2 a b14 consideram a massa relativa ao resíduo de propargilglicina ([Pra]-
Gly-1), na razão m/z detectada.
4.2 Funcionalização de nanofibras de alumina com o peptídeo EAAA-BP100: Síntese,
caracterização e ensaios biológicos
Nesta sessão serão apresentados os resultados da caracterização e ensaios
antimicrobianos das nanoestruturas de alumina contendo o peptídeo EAAA-BP100 (NP-
EAAA-BP100) e de cada produto formado nas etapas intermediárias de funcionalização até a
obtenção do peptídeo covalentemente ligado. A Figura 22 apresenta um esquema da síntese
de NP-EAAA-BP100 (rota 1 da Figura 12, pág. 70) com todas as etapas para a obtenção da
nanobioestrutura.
101
Figura 22 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-EAAA-BP100.
102
4.2.1 Obtenção da nanobioestrutura NP-EAAA-BP100
As nanopartículas de alumina foram inicialmente obtidas através da reação entre
nitrato de alumínio e carbonato de sódio (FIG.22 - Etapa 1), cuja metodologia foi baseada no
trabalho de Potdar et al. (2007). A reação inicial consiste na hidrólise do carbonato de sódio
(Reação 1) que origina íons OH-, os quais reagem com os cátions Al
3+ dispersos em solução
aquosa de nitrato de alumínio, resultando na formação de hidróxido de alumínio (Al(OH)3)
(Reação 2). Por sua vez, o Al(OH)3 passa por uma processo de desidratação, formando um
sólido gelatinoso característico da alumina monohidratada (AlOOH), também denominada
boehmita (Reação 3) (POTDAR, et al. 2007). Após a calcinação da alumina monohidratada
forma-se finalmente o óxido inorgânico Al2O3 (Reação 4).
Na2CO3 + H2O 2NaOH + CO2 (1)
Al(NO3)3 + 3NaOH Al(OH)₃ + 3NaNO₃ (2)
Al(OH)₃ AlOOH + H2O (3)
2AlOOH Al2O3 + H2O (4)
Em seguida, as nanoestruturas de Al2O3 (NP) foram funcionalizadas para
possibilitar a ligação covalente entre o óxido inorgânico e a molécula orgânica do peptídeo
(SWAN; POPAT; DESAI, 2005). Embora nanoestruturas de óxido de alumínio possam
apresentar sua superfície hidroxilada espontaneamente devido à exposição ao ar (PUJARI et
al., 2014), neste trabalho as nanoestruturas de Al2O3 foram submetidas a reação com peróxido
de hidrogênio a 30% (v:v) para garantir elevada eficiência de hidroxilação na superfície do
material (etapa 2). As nanopartículas obtidas nesta etapa foram nomeadas como NP-OH.
Posteriormente, as NP-OH foram submetidas a reação com moléculas de APTES para
introdução de grupos amino livres (etapa 3) formando as nanopartículas denominadas de NP-
NH2. Essa reação foi realizada na presença de tolueno anidro para impedir a ocorrência de
polimerização do APTES em detrimento da sua ligação com a superfície hidroxilada do
material. A ligação do grupo APTES na superfície da nanopartícula ocorre através do átomo
de Si liberando o grupo etóxi no meio, permitindo assim diferentes formas de ligação com as
NP-OH conforme esquema apresentado na Figura 23.
103
Figura 23 – Esquema demonstrativo da reação entre as hidroxilas imobilizadas em NP-OH e o Si presente
no APTES para a introdução de grupos contendo terminações amino na superfície do óxido de alumínio.
No entato, a caracterização dessas estruturas por ressonância magnética nuclear
em fase sólida mostra apenas sinais intensos de 13
C em 11,0, 22,5, e 42,8 ppm após a
funcionalização com APTES (NP-NH2) (FIG. 24 – espectro em azul). Estes sinais foram
atribuídos aos carbonos ligados ao silício Cα, Cβ e Cγ, respectivamente, não sendo observado
deslocamentos químicos de 13
C relativos aos carbonos de grupo etóxi do APTES. Dessa
forma, propõem-se a estrutura apresentada na Figura 23C como característica para a
nanoestrutura obtida após funcionalização com APTES, sendo mínima ou inexistente a
presença de grupos etoxi no derivado silano (FIG. 23A e B). Além disso, é importante
observar que, como esperado, não foram visualizados sinais de 13
C para NP e NP-OH
(espectros em preto e em vermelho, respectivamente) (FIG. 24).
Figura 24 – Espectros de ressonância magnética nuclear (13
C) em fase sólida de NP, NP-OH e NP-NH2.
104
Finalmente, foi realizada a etapa de ligação do peptídeo EAAA-BP100 às NP-
NH2, que ocorreu pela formação de uma ligação amídica entre o grupo carboxila livre da
cadeia lateral do resíduo de ácido glutâmico (Glu-1) do peptídeo e a terminação amino
presente em NP-NH2. A reação foi conduzida pelo emprego dos ativadores HOBt e EDAC.
4.2.2 Caracterização das nanoestruturas
4.2.2.1 Difração de raios-x
A estrutura cristalina das nanopartículas de alumina NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-
EAAA-BP100, cuja definição está associada a repetição de grupos de átomos ou moléculas
arranjados espacialmente, foi analisada por difração de raios-x (FIG. 25).
Figura 25 – Difratograma de raios-x de nanopartículas de alumina. Em (A) planos cristalinos e padrão de
refinamento Rietveld de nanopartículas (NP) de -Al2O3. Em (B) difratograma de raios-X de NP, NP-OH,
NP-NH2 e NP-EAAA-BP100.
Os difratogramas de todas as nanopartículas, funcionalizadas ou não, mostraram
alargamento dos picos, o que é característico de amostras amorfas (AL-KHAWAJA; AL-
FATLAWI, 2016). Contudo, o subsequente refinamento Rietveld dos dados de DRX forneceu
os parâmetros estruturais para o Al2O3 que foram indexados como referentes a uma estrutura
predominantemente cúbica (grupo espaçador Fd3m) -Al2O3 de parâmetros de rede a = b = c
= 7,824 Å, α = β = γ = 90° (FIG. 25A). A estrutura cúbica definida de acordo com os planos
cristalinos observados representa a simetria da célula unitária e é a menor estrutura
105
representativa de um cristal. Para as nanopartículas obtidas nestas etapas o arranjo cúbico de
-Al2O3 de uma célula unitária pode ser representado de acordo com a estrutura apresentada
na Figura 26.
Figura 26 – Célula unitária de arranjo cúbico (duplicada no desenho) de -Al2O3.
Fonte: Yazdanmehr et al. (2012).
A comparação entre os difratogramas das nanopartículas após as subsequentes
funcionalizações (FIG. 25B) não revelou diferença significativa do perfil de bandas obtido
para NP, o que demonstra que as etapas de funcionalização não alteraram o arranjo espacial
dos elementos inorgânicos constituintes do material.
De acordo com o trabalho de Zhang et al. (2016), a temperatura de calcinação
empregada (500 °C) favorece a obtenção de -Al2O3, estrutura do óxido de alumínio que
apresenta regiões amorfas, característica esta de um material com elevada área superficial. Os
autores relatam que o aumento da temperatura de calcinação reduz o volume de poros e tende
a formação de α-alumina, estrutura cristalina do óxido de alumínio com menor área de
superfície. Neste sentido, a temperatura de calcinação utilizada neste trabalho foi conveniente
com o objetivo de obter um material com elevada área superficial, além da maior porosidade
como já relatado para estruturas de -Al2O3 (LIU et al., 2015), que podem proporcionar maior
grau de funcionalização das nanopartículas.
106
4.2.2.2 Microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão
Através das imagens das estruturas obtidas por MEV não foi possível concluir
sobre a morfologia e tamanho apresentados pelas partículas (FIG. 27), pois foram visualizadas
somente estruturas de formatos indefinidos e de tamanhos variados; possivelmente tratam-se
de diferentes agregados de nanopartículas. Estes agregados, destacados por círculos brancos
na Figura 27A, apresentaram dimensões que variam em ampla faixa de 4 a 15 μm. Assim
sendo, a partir desta técnica de microscopia não foi possível concluir sobre as dimensões e
morfologia das estruturas, mesmo em imagem ampliada como apresentada na Figura 27B.
Figura 27 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura de nanopartículas de Al2O3. Agregados de
nanopartículas evidenciados por círculos brancos, aumento de 2000 vezes (A). Presença de agregado
central e estruturas menores no entorno, aumento de 10000 vezes (B).
Por outro lado, as imagens obtidas por MET mostram claramente nanoestruturas
morfologicamente similares para NP e NP-EAAA-BP100 (FIG. 28), embora revelam também
a presença de uma mistura de tamanhos de partículas. A maioria das partículas apresentaram-
se organizadas na forma de nanofilamentos, em contraste com diversas formulações de
partículas de alumina que mostram a obtenção de estruturas esféricas (PARIDA; PRADHAN;
SAHU, 2009; SADIQ et al., 2009; CUNHA; ROMAO; MACEDO, 2014; KATHIRVEL et
al., 2014). Observando-se as imagens em menor escala (FIG. 28C e D), verifica-se elevada
similaridade entre os nanofilamentos de NP e NP-EAAA-BP100, os quais apresentaram
diâmetros na faixa de 2-4 nm. Entretanto, enquanto o comprimento dos nanofilamentos de NP
pode ser mensurado na faixa de 25-35 nm, não foi possível determinar o comprimento médio
107
dos filamentos de NP-EAAA-BP100. A imagem dessas nanoestruturas (FIG. 28B e D)
mostrou maior interligação entre os nanofilamentos, possivelmente devido à agregação de
cadeias peptídicas de EAAA-BP100 ligadas à superfície inorgânica, não possibilitando a
visualização de suas extremidades. Embora em suspensão (tampão Tris-HCl pH 8,5) a
presença da cadeia de peptídeo aumente a estabilidade das nanopartículas deixando-as mais
dispersas, devido às cargas positivas nos resíduos de Lys que resulta em repulsão entre as
nanobioestruturas, como as análises por MET foram conduzidas na ausência de água ou
solventes orgânicos, a formação de agregados de cadeias peptídicas torna-se mais propícia
para as NP-EAAA-BP100 nessas condições (FIG. 28B e D) (DONG et al., 2010).
Figura 28 - Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de NP (A e C) e NP-EAAA-BP100 (B e D).
4.2.2.3 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier
Com o intuito de caracterizar estruturalmente os materiais sintetizados, todas as
nanopartículas (NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100) e o peptídeo EAAA-BP100 foram
analisados por espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho utilizando o
modo de reflectância total atenuada (ATR-FTIR). Os resultados da caracterização por FTIR
108
revelam a presença de vibrações características dos diferentes grupos funcionais presentes em
cada nanopartícula (FIG. 29). No espectro de NP é possível observar a presença de uma banda
de vibração em 800-1110 cm-1
e outra em 2500-2000 cm-1
, ambas correspondentes a
vibrações de ligações Al-O-Al, enquanto que a banda de absorção em 1110 cm-1
foi atribuída
a vibrações angulares de grupos Al-O-Si (AKRAM et al., 2015). Este perfil está presente em
todos os espectros de nanopartículas de alumina, funcionalizadas ou não, enquanto o mesmo
só não foi observado para o peptídeo livre (EAAA-BP100).
Figura 29 – Espectro de infravermelho de nanopartículas e do peptídeo EAAA-BP100. À esquerda, o
espectro de NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100. À direita, comparação entre os espectros de EAAA-
BP100 e NP-EAAA-BP100.
A banda larga entre 3690-3000 cm-1
, observada no espectro de NP-OH é atribuída
a vibrações de deformação axial de O-H, cujo alargamento da banda se dá, em grande parte,
devido a ligações de hidrogênio (GUPTA; AGARWAL; SALEH, 2011). No espectro de NP-
NH2 observa-se uma banda típica de aminas primárias próxima a 3130-3100 cm-1
(vibração de
deformação axial de N-H). Diferenças importantes são observadas no espectro de NP-EAAA-
BP100. As vibrações características do esqueleto principal e de cadeias laterais da sequência
peptídica foram nítidas e comparáveis àquelas observadas para o peptídeo livre, destacando-
se: em 1650 cm-1
(vibração de deformação axial de carbonila C=O), em 1535 cm-1
(vibração
de deformação angular simétrica no plano de N-H), entre 1200-1120 cm-1
(vibração de
deformação axial de C-N de aminas alifáticas, resíduos de Lys-5, Lys-6, Lys-9, Lys-10 e Lys-
109
13) e próximas a 3300 cm-1
(vibrações de deformação axial de N-H e C-H) (ZHANG et al.,
1992a, 1992b; MARTINEZ; MILHAUSER, 1995).
4.2.2.4 Análise térmica
Além da caracterização, as análises térmicas foram propostas neste trabalho para
avaliação da estabilidade térmica das nanoestruturas formadas. A Figura 30 apresenta as
curvas termogravimétricas obtidas para as amostras de NP antes e após a funcionalização com
grupos funcionais -OH, -NH2 (NP-OH e NP-NH2) e após a imobilização do peptídeo EAAA-
BP100. As nanopartículas de Al2O3 apresentaram perdas típicas de massa observadas para
estes materiais (GUPTA; RAMAMURTHY; MADRAS, 2011; ZHU et al., 2011) na faixa de
temperatura de 200 a 400 ºC, associadas às perdas de massa devido à eliminação de água e
dióxido de carbono fisicamente adsorvidos (GUPTA; RAMAMURTHY; MADRAS, 2011).
Acima de 400ºC, os grupos hidroxilas superficiais começam a sofrer reações de condensação
levando à desidratação das nanopartículas. Por outro lado, após a funcionalização é evidente
uma perda de massa para as partículas de NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 com início em 266ºC
e máximo centrado em 388 ºC (FIG. 30B), refletindo um comportamento característico da
decomposição térmica de estruturas orgânicas. Neste caso, associadas à perda de grupos
aminopropil (oriundos da reação com APTES) da superfície das nanopartículas NP-NH2 e a
presença da cadeia peptídica em NP-EAAA-BP100 (ZHOU et al., 1999; RAMESH et al.,
2015). Dessa forma, essas nanopartículas podem ser impregnadas em materiais cuja
formulação não ultrapasse temperaturas em torno de 150 ºC, abaixo da qual não há
decomposição térmica da estrutura orgânica dos peptídeos.
Figura 30 - Curvas termogravimétricas de porcentagem de perda de massa (A) e da primeira derivada da
perda de massa (B) para as nanopartículas NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100.
110
4.2.2.5 Potencial zeta
A caracterização das funcionalizações e a estabilidade de suspensão das
nanopartículas derivatizadas foram avaliadas por medidas de potential zeta (ζ), cujos
resultados estão apresentados na Figura 31. Para isso, as nanopartículas NP, NP-OH, NP-
NH2 e NP-EAAA-BP100 foram dispersas em tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,5) contendo 100
mM de NaCl e as medidas de potencial zeta das amostras foram realizadas a cada 10 minutos
durante 60 minutos (FIG. 31A). Não foram observadas variações significativas no valor
medido ao longo do tempo, portanto, o valor de referência para comparação entre as
diferentes nanopartículas foi baseado na média de todos valores medidos para cada
nanoestrutura.
Figura 31 – Valores de potencial zeta para NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 em tampão Tris-HCl
10 mM, pH 8,5. Em (A) acompanhamento da variação do potencial zeta ao longo de 60 min. Em (B) média
dos valores obtidos e os respectivos desvios.
Não foram observadas alterações altamente significativas no valor de potencial ζ
médio comparando NP (-0,76 mV) e NP-OH (-0,54 mV), pois a introdução de grupos -OH na
superfície dos óxidos metálicos ocorre espontaneamente quando o material está exposto a
umidade. Consequentemente, uma mínima diferença é esperada para as nanoestruturas em
meio aquoso (PUJARI et al., 2014). O potencial ζ também pode ser utilizado como medida da
estabilidade de amostras, uma vez que partículas com valores próximos a ±30 mV
normalmente são mais estáveis que aquelas que apresentam menores valores absolutos
(DOMINGUES et al., 2008; DOMINGUES; CASTANHO; SANTOS, 2009), como no caso
de NP e NP-OH. Além disso, para essas nanopartículas a agregação/floculação e decantação
foi visualmente mais evidente quando comparada a NP-NH2 e a NP-EAAA-BP100, indicando
111
menor estabilidade das suspensões. Contudo, houve grande diferença no valor de potencial ζ
determinado para NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 quando comparados com NP e NP-OH. Neste
caso, a presença de grupos amino tanto em NP-NH2 quanto em NP-EAAA-BP100 resultou no
aumento do valor absoluto de potencial ζ de NP-NH2 para +30,54 mV e de NP-EAAA-BP100
para +16,57 mV. Como esperado, a presença de grupos amino livres protonados em NP-NH2
e a presença de resíduos de Lys carregados positivamente (+5) na cadeia peptídica de EAAA-
BP100 aumentam a carga superficial dessas partículas (LEE; JEONG; PARK, 2002),
resultando na repulsão eletrostática entre elas. Consequentemente, observa-se a maior
estabilidade desses sistemas quando comparados aos sistemas de NP e NP-OH em solução
tampão Tris-HCl 10 mM (pH 8,5).
4.2.3 Determinação do grau de funcionalização
O grau de funcionalização da nanopartícula contendo peptídeo foi determinado
para avaliação da eficiência da metodologia proposta, além de possibilitar a obtenção de
valores de concentração mínima inibitória das nanopartículas para efeito de comparação com
os valores obtidos para o peptídeo BP100 e o derivado EAAA-BP100 frente a células de
bactérias e fungos.
Primeiramente, utilizando o coeficiente de absortividade molar para o aduto
dibenzofulveno-piperidina (301 nm), formado como sub-produto de desproteção da resina
Rink® amida 0,79 mmol.g
-1, foi obtida a curva analítica para determinação do grau de
funcionalização das nanopartículas de alumina com a imobilização de único derivado de
aminoácido e com peptídeo EAAA-BP100. A curva analítica apresentou faixa linear de
0,0027 mmol.L-1
a 0,1275 mmol.L-1
e R = 0,99. Todos os cálculos e detalhes deste
experimento estão descritos no Anexo IV.
Empregando-se esta curva, o grau de imobilização de resíduos de glicina na
superfície das NP-NH2 foi determinado pela quantificação do produto de desproteção das NP-
Gly-Fmoc. A imobilização do derivado Fmoc-Gly-OH na superfície de NP-NH2 foi realizada
apenas para efeito de comparação entre o grau de funcionalização obtido ligando-se um único
resíduo de aminoácido com o grau de funcionalização de NP-EAAA-BP100. As três amostras
de NP-Gly-Fmoc (5,3 mg, 5,6 mg e 6,7 mg) utilizadas neste ensaio forneceram grau de
imobilização médio de 0,2021 mmol.g-1
. Já a quantificação por UV do produto de desproteção
112
dos grupos Fmoc provenientes do primeiro resíduo de aminoácido (Glu-1) da sequência
peptídica do EAAA-BP100 imobilizado em NP-NH2 forneceu valor de grau de imobilização
médio de 0,0455 mmol.g-1
, muito inferior quando comparado ao grau de substituição das NP-
NH2 contendo Fmoc-Gly. Este resultado pode estar associado aos impedimentos estéricos
decorrentes das cadeias laterais de resíduos adjacentes ao resíduo de Glu-1 somado à presença
do grupo Fmoc durante a reação para a ligação do peptídeo à nanopartícula. Além disso, a
elevada dinâmica conformacional da cadeia peptídica de EAAA-BP100, verificada pelos
resultados da análise de CD que revelaram uma ausência de conformação preferencial do
peptídeo em meio aquoso (FIG. 32B – espectro em preto, pág. 116), dificulta a aproximação
adequada dos grupos carboxila ativados das cadeias laterais do resíduo de Glu-1 aos grupos
amino da NP-NH2. Ademais, os grupos NH2 presentes nos resíduos de lisina (Lys-5, Lys-6,
Lys-9, Lys-10 e Lys-13) da cadeia peptídica do EAAA-BP100 competem com o grupo amino
da NP-NH2. Dessa forma, ligações entre cadeias peptídicas podem ocorrer em detrimento do
acoplamento do peptídeo à nanopartícula, resultando em menor número de moléculas
peptídicas disponíveis para ligação às nanopartículas. O baixo grau de imobilização do
EAAA-BP100 justifica a visualização por MET de um padrão de formação de nanoestruturas
morfologicamente semelhantes para as partículas NP e NP-EAAA-BP100 (FIG. 28, pág.
107).
4.2.4 Ensaio de atividades antibacteriana e antifúngica
A atividade antimicrobiana de NP, NP-OH, NP-NH2, NP-EAAA-BP100, BP100 e
EAAA-BP100 foi avaliada sobre cepas das bactérias Gram-negativas E. coli e S.
typhimurium, Gram-positiva S. aureus e sobre as leveduras C. krusei e C. parapsilosis. Os
valores de concentração inibitória mínima (MIC) foram determinados para as amostras que
apresentaram atividade antimicrobiana dentro da faixa de concentração empregada nos
ensaios e os resultados estão apresentados na Tabela 13.
As nanopartículas não funcionalizadas (NP) e NP-OH não apresentaram
capacidade de inibição do crescimento celular no meio testado. Entretanto, a presença do
peptídeo EAAA-BP100 ligado covalentemente à nanoestrutura determinou uma atividade
antibacteriana mesmo em concentrações baixas contra S. aureus (0,26 g.L-1
/ 20 μmol.L-1
), E.
coli (0,13 g.L-1
/ 10 μmol.L-1
) e S. typhimurium (0,26 g.L-1
/ 20 M μmol.L-1
). Ansari et al.
113
(2013) verificaram inibição de crescimento bacteriano em um ensaio conduzido com
nanopartículas de Al2O3 (MIC: 1,6 - 3,2 g.L-1
). Contudo, no presente estudo, entre todas as
amostras contendo nanopartículas, somente NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 apresentaram
atividade antibacteriana. Um importante ponto que deve ser considerado no trabalho de
Ansari et al. (2013) é o formato e o tamanho das nanopartículas testadas. Em seus ensaios
antimicrobianos os autores empregaram nanopartículas esféricas com tamanho de partículas
variado (20 – 100 nm) diferentemente das nanofibras de aproximadamente 25-35 nm de
comprimento desenvolvidas neste trabalho, cuja morfologia foi comprovada por MET (FIG.
28C, pág. 107). Dessa forma, a morfologia do material pode influenciar significativamente na
atividade biológica manifestada. Em contraste com o trabalho de Ansari et al. (2013), Shi et
al. (2016) observaram inatividade de óxidos orgânicos sobre cepas bacterianas. Estes autores
sintetizaram o óxido de grafeno modificado com o peptídeo KRWWKWWRR, que inibiu o
crescimento de cepas de E. coli e S. aureus, no entanto o material isolado foi inativo sobre as
mesmas bactérias. Dessa forma, conclui-se que o óxido de alumínio não seja responsável pela
atividade antibacteriana nas concentrações analisadas, mas sim a presença da cadeia peptídica
em NP-EAAA-BP100.
Tabela 13 - Valores de MIC obtidos para os peptídeos BP100 e EAAA-BP100 e para as nanobioestruturas
NP, NP-OH, NP-NH2 e NP-EAAA-BP100 contra cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e S. aureus) e
leveduras (C. krusei e C. parapsilosis)
MIC (g.L-1
/μmol.L-1
)
Amostra Ensaio antibacteriano Ensaio antifúngico
S. aureus E. coli S. typhimurium C. Krusei C. parapsilosis
NP n.a. n.a. n.a. n.a. 16a
NP-OH n.a. n.a. n.a. 16a 16
a
NP-NH2 8a 8
a n.a. 8
a 2
a
NP-EAAABP100 0,26a/20
b 0,13
a/10
b 0,26
a/20
b n.a. 1,03
a/80
b
EAAA-BP100 20b 20
b 10
b 40
b 10
b
BP100 20b 10
b 20
b 40
b 10
b
n.a.: não apresentou atividade biológica nas concentrações testadas.
a: Concentração em g.L
-1
b: Concentração em μmol.L
-1
Importante destacar a atividade antibacteriana observada para NP-NH2 contra
cepas de S. aureus e E. coli, embora os valores de MIC de 8 g.L-1
ainda sejam muito acima
114
daqueles observados para NP-EAAABP100. Neste caso, acredita-se que as terminações
amino em NP-NH2 possam estar protonadas, conferindo carga superficial positiva à essas
nanoestruturas, como verificado na análise do potencial zeta de NP-NH2 (+30,54 mV) (FIG.
31B, pág. 110), e permitindo uma afinidade maior que as NP e NP-OH com as células
bacterianas de característica aniônica.
A atividade antibacteriana apresentada pelos peptídeos livres (BP100 e EAAA-
BP100) e imobilizado (NP-EAAA-BP100) foi semelhante. Assim sendo, a insersão do
fragmento EAAA na sequência do BP100 não altera de forma significativa o potencial
antibacteriano em relação ao BP100, bem como deixa a cadeia peptídica de BP100 disponível
para a interação com a membrana bacteriana.
Por outro lado, os dados experimentais obtidos para os ensaios antifúngicos
revelaram mesma antividade antifúngica dos peptídeos livres BP100 e EAAA-BP100 contra
as cepas de C. krusei (40 μmol.L-1
) e C. parapsilosis (10 μmol.L-1
), enquanto que NP-EAAA-
BP100 não foi ativa contra C. krusei, mas apresentou atividade contra C. parapsilosis (0,26
g.L-1
/ 80 μmol.L-1
). Também foi verificado que as nanopartículas funcionalizadas NP-OH e
NP-NH2 foram capazes de inibir o crescimento das leveduras testadas. A atividade de NP-OH
ocorreu apenas em concentração elevada (16 g.L-1
), já NP-NH2 apresentou atividade sobre C.
parapsilosis em baixa concentração (2 g.L-1
). Contudo, a atividade de NP-EAAA-BP100
(1,03 g.L-1
/ 80 M μmol.L-1
) contra a mesma cepa foi ainda maior que a verificada para NP-
NH2 em relação a concentração de nanopartículas empregada. Contra C. krusei, NP-NH2
apresentou MIC apenas em concentrações elevadas (8 g.L-1
), o que configura a baixa
atividade antifúngica das nanoestruturas não associadas ao peptídeo.
A atividade antifúngica de nanopartículas de óxido de alumínio já foi verificada
em outros trabalhos (JALAL et al., 2016; SHENASHEN et al., 2017). No entanto, a presença
da nanoestrutura carregada positivamente (NP-EAAA-BP100), devido aos resíduos de Lys,
pode favorecer a atração entre a nanoestrutura inorgânica e as células fúngicas, pois estes
microrganismos também possuem quantidade maior de fosfolipídeos aniônicos quando
comparado à células humanas (RAUTENBACH; TROSKIED; VOSLOO, 2016).
Sabendo que o peptídeo antimicrobiano BP100 interage com membranas
fosfolipídicas apresentando estrutura secundária em α-hélice (MANZINI et al., 2014), estudos
biofísicos foram realizados neste trabalho com o intuito de esclarecer e comprovar que a ação
da nanobioestrutura ligada covalentemente ao BP100 (NP-EAAA-BP100) contra cepas de
115
microrganismos se deve à presença da cadeia peptídica e não devido ao óxido de alumínio ou
as funcionalizações nele desenvolvidas.
4.2.5 Estudos biofísicos: ensaios de dicroísmo circular e de extravasamento de
carboxifluoresceína
Neste trabalho, com o intuito de mimetizar membranas bacterianas foram
utilizados os fosfolipídeos 1-palmitoil-2-oleilfosfatidilcolina (POPC) e 1-palmitoil-2-oleil-
fosfatidilglicerol (POPG) para a preparação das vesículas lipídicas unilamelares de
características aniônicas, (EPAND; SAVAGE; EPAND, 2007; EPAND; EPAND, 2010)
Nesse sentido, foram realizados estudos conformacionais por dicroísmo circular de NP, NP-
NH2, NP-EAAA-BP100 e dos peptídeos BP100 e EAAA-BP100 para verificar o
comportamento conformacional dessas espécies na presença de LUV de POPC:POPG (3:1)
em tampão Tris-HCl a 10 mM, pH 8,5. Essa técnica possibilita analisar a estrutura secundária
adquirida por cadeias peptídicas em ambientes variados.
Através dos estudos por espectroscopia de CD realizados (FIG. 32) verificou-se
que tanto o peptídeo BP100 (FIG. 32A) quanto o derivado EAAA-BP100 (FIG. 32B) não
apresentam uma conformação definida em meio aquoso (FIG. 32 – espectros em preto).
Contudo, na presença de vesículas de POPC:POPG (3:1) ambos peptídeos adquirem
conformação helicoidal (FIG. 32A – espectros em verde e rosa para o BP100 e FIG. 32B –
espectros em verde, vermelho, azul e rosa para o EAAA-BP100). A adição de LUV resulta no
surgimento de um máximo λmáx 190 nm e em mínimos intensos em λmáx 208 e 222 nm,
indicando que aos peptídeos adotam conformação α-hélice nesse meio. Este comportamento
já era esperado para o BP100 (MANZINI et al., 2014), e através deste ensaio verificou-se que
a presença de estrutura secundária em α-hélice é mantida após a inserção da sequência de
resíduos EAAA na porção N-terminal deste peptídeo. Observa-se ainda que o peptídeo
EAAA-BP100 adquire conformação helicoidal mesmo em concentração de 0,125 mM de
LUV, enquanto o BP100 somente a partir de 0,5 mM de LUV. Esta maior capacidade de
formação de hélice pode ser em decorrência do aumento da cadeia peptídica que favorece a
interação com a superfície das LUV.
Da mesma forma, a interação peptídeo-membrana também ocorre em NP-EAAA-
BP100 e foi confirmada por estudos de CD realizados com essas nanopartículas. Na Figura
116
32C pode ser visualizado um perfil da curva característica de conformação em α-hélice para
NP-EAAA-BP100 quando em contato com LUV (espectros em vermelho e em preto). Já os
espectros de dicroísmo circular para NP-EAAA-BP100 em tampão e para NP e NP-NH2 (FIG.
32 – espectros em rosa, verde e azul, respectivamente) não apresentaram valores
característicos para conformações helicoidais.
Figura 32 – Espectros de dicroísmo circular dos peptídeos BP100 (A) e EAAA-BP100 (B) e das
nanopartículas NP, NP-NH2 (ambas em LUV POPC:POPG (3:1) 1 mM) e NP-EAAA-BP100 (C) em
tampão Tris-HCl, pH 8,5, e na presença de LUV POPC:POPG (3:1).
Para o estudo de extravasamento de CF foram utilizadas LUV de POPC:POPG
(3:1) em tampão Tris-HCl a 10 mM, contendo 5 mM de CF encapsulada, para avaliar a
capacidade lítica do peptídeo EAAA-BP100, da nanopartícula de Al2O3 (NP) e da
nanoestrutura NP-EAAA-BP100. Foram realizadas medidas de intensidade de fluorescência
de CF em max de 512 nm em função do tempo (Figura 33) após seu extravasamento das
117
LUV. O extravasamento de CF na presença de NP foi negligenciável durante o todo o
experimento. Entretanto, a adição de EAAA-BP100 e NP-EAAA-BP100 às LUV resultou no
aumento da fluorescência de CF devido ao seu extravasamento. Diante desses resultados,
conclui-se que, embora as NP não afetem as estruturas das LUV de POPC:POPG, quando
funcionalizadas com o peptídeo EAAA-BP100 há elevação da capacidade lítica, sugerindo
que a presença do peptídeo leva à ruptura da bicamada fosfolipídica.
Figura 33 - Intensidade da fluorescência de carboxifluoresceína ao longo do tempo devido a adição de NP,
EAAA-BP100 e NP-EAAA-BP100 em LUV de POPC:POPG (3:1) contendo CF.
Estes resultados estão de acordo com os obtidos através da técnica de dicroísmo
circular, pois os espectros para NP-EAAA-BP100 em tampão e para NP e NP-NH2 não
mostraram conformação α-helicoidal, de forma a evidenciar que o extravasamento de CF
observado mediante adição de NP-EAAA-BP100 é causado pela presença do peptídeo nas
nanoestruturas de alumina e não devido ao óxido de alumínio (TURCHENIUK et al., 2015;
RAILEAN-PLUGARU et al., 2016). A inabilidade de NP promover extravasamento de CF de
LUV aliada à capacidade de perturbação das vesículas pela nanobioestrutura NP-EAAA-
BP100 indicam que o peptídeo, mesmo covalentemente ligado à nanopartícula, é capaz de
interagir com vesículas fosfolipídicas. Dessa forma, as cadeias peptídicas de EAAA-BP100
mesmo imobilizadas na superfície de NP-EAAA-BP100 ficam disponíveis para interagir com
a superfície da bicamada lipídica, adotando uma conformação helicoidal ativa capaz de
perturbar sua integridade. Consequentemente, pode haver a formação de poros na membrana
118
bacteriana, como indicado pela liberação de CF nas LUV de POPC:POPG, resultando na lise
celular, explicando em grande parte a atividade antibacteriana apresentada pela
nanobioestrutura de alumina contendo peptídeo.
A observação de atividades antibacteriana e antifúngica indica que a metodologia
proposta é adequada para funcionalizar nanopartículas mantendo a atividade biológica do
peptídeo BP100. Além disso, a morfologia alongada verificada para as nanopartículas
sintetizadas permite que ocorra uma interação mais eficiente entre as cadeias peptídicas
imobilizadas e a superfície de células microbianas, pois devido à este formato, maior número
de moléculas peptídicas podem interagir simultaneamente com a membrana lipídica de
microrganismos patogênicos em comparação a estruturas esféricas (FIG. 34). A vantagem do
material em nanofibras aliada à atividade antimicrobiana de peptídeos pode ser usada com o
objetivo de aumentar a biodisponibilidade local desses compostos.
Figura 34 – Esquema demonstrativo da interação das cadeias de peptídeo imobilizadas na superfície de
nanopartículas de formato alongado (A) e formato esférico (B) com a bicamada fosfolipídica evidenciando
o maior número de peptídeos em contato simultâneo quando imobilizados em partículas alongadas.
119
4.3 Nanobioestrutura de alumina acoplada ao peptídeo antimicrobiano BP100 através
de formação de ligação de dissulfeto e anel triazólico dissubstituído
Nesta sessão serão apresentadas duas novas propostas de rotas sintéticas (rotas 2 e
3 da Figura 12, pág. 70) para a imobilização do peptídeo BP100 sobre a superfície de
nanopartículas de alumina visando o ganho do grau de funcionalização em relação às NP-
EAAABP100 e, consequentemente o aumento no potencial antimicrobiano das novas
nanopartículas produzidas. Neste sentido, serão discutidos a seguir os resultados obtidos pela
funcionalização de nanopartículas de alumina com os peptídeos CAAA-BP100 e [Pra]GAAA-
BP100 através de formação de ligação de dissulfeto (FIG. 12 - rota 2) e de estrutura de anel
triazólico dissubstituído (FIG. 12 - rota 3), respectivamente.
4.3.1 Obtenção da nanobioestrutura NP-CAAA-BP100 (rota 2)
A Figura 35 mostra todas as etapas de funcionalização para a obtenção da
nanobioestrutura NP-CAAA-BP100 (rota 2). A síntese das nanopartículas de alumina foi
realizada através da mesma metodologia empregada na segunda parte (item 4.2) deste
trabalho, assim como a etapa de hidroxilação pela reação com peróxido de hidrogênio (Etapa
2).
Para a obtenção das nanobioestruturas NP-CAAA-BP100 também foi realizada a
aminação com APTES (etapa 3), seguida do acoplamento do derivado de aminoácido Fmoc-
Cys(Trt)-OH (etapa 2.4 – formação de NP-Cys) via ligação amídica entre o grupo amino da
NP-NH2 e o grupo carboxila do derivado de aminoácido. Nesta etapa, a ligação do derivado
de cisteína foi realizada com o intuito de se obter grupos tióis na superfície da nanopartícula
de alumina. No entanto, o derivado de aminoácido empregado (Fmoc-Cys(Trt)-OH) possui a
cadeia lateral do tiol protegida com o grupo tritila (Trt). Para remoção desse grupo, após
ligação do aminoácido às nanopartículas aminadas, as nanoestruturas obtidas foram
submetidas ao processo de clivagem (etapa 2.5). Após removido o grupo protetor Trt em
meio ácido, as nanoestruturas contendo o derivado de cistéina foram submetidas ao processo
de remoção do grupo Fmoc (etapa 2.6) para quantificação do grau de funcionalização das
nanoestruturas com e derivado de cisteína (experimento similar ao realizado na parte II deste
trabalho com o derivado de glicina). O grau de funcionalização das nanoestruturas NP-Cys foi
120
Figura 35 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-CAAA-BP100 (rota 2).
121
determinado com um valor médio de 0,2140 mmol.g-1
. Finalmente, a ligação do peptídeo
CAAA-BP100 com a nanopartícula (etapa 2.7 – formação de NP-CAAA-BP100) através de
ligação de dissulfeto entre o resíduo de cisteína de CAAABP100 e o grupo tiol da NP-Cys.
O peptídeo CAAA-BP100 foi imobilizado sobre a superfície das NP-Cys sem a
remoção prévia do grupo protetor Fmoc do primeiro resíduo de aminoácido da cadeia
peptídica (Cys-1). Assim sendo, as NP-CAAA-BP100 também foram submetidas ao processo
de desproteção para remoção desse grupamento (etapa 2.8), e o grau de funcionalização
dessas nanopartículas apresentou valor médio de 0,0160 mmol.g-1
. Comparando com o grau
de funcionalização das NP-Cys (0,2140 mmol.g-1
), o grau de imobilização do peptídeo
CAAA-BP100 foi significativamente menor. Este resultado pode estar associado a ocorrência
de ligações de dissulfeto entre os grupos tióis próximos na superfície da NP-Cys, ou seja,
entre resíduos de cisteína imobilizados em uma mesma nanopartícula (FIG. 36A) ou mesmo
entre derivados imobilizados em nanopartículas distintas (FIG. 36B). Consequentemente, há
uma redução no número de sítios disponíveis para ligação ao peptídeo. Além disso, é possível
que durante a reação de acoplamento entre CAAA-BP100 e NP-Cys moléculas de peptídeo se
associem por ligação de dissulfeto formando o dímero do CAAA-BP100 (FIG. 36C) (VERLY
et al., 2017), diminuindo assim o número de cadeias peptídicas disponíveis para se ligar às
NP-Cys.
Figura 36 – Demonstração de possíveis ligações de dissulfeto (indicadas pelas setas): entre derivados de
cisteína em uma mesma nanopartícula (A), entre derivados de cisteína imobilizados em nanopartículas
distintas (B) e entre duas cadeias peptídicas de CAAA-BP100 (C).
122
4.3.2 Obtenção da nanobioestrutura NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3)
A Figura 37 apresenta todas as etapas de funcionalização apenas para a rota 3
planejada para a síntese de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100. Para a síntese das nanobioestruturas
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 também foram repetidas as mesmas etapas 1 e 2 para a obtenção
de NP e NP-OH, respectivamente. Contudo, para a introdução da cadeia carbônica contendo
átomo de cloro nas nanopartículas (NP-Cl), foi empregado o reagente CPTES (etapa 3.3). Em
seguida, foi feita a substituição do cloro por grupos azida para obtenção das NP-N3 (etapa
3.4). Posteriormente, a ligação ao peptídeo [Pra]GAAA-BP100 através de reação de
cicloadição 1,3-dipolar (etapa 3.5 ) resultou na formação de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100.
Esta etapa foi conduzida pela reação de cicloadição 1,3-dipolar entre um alcino
terminal (presente na cadeia lateral da propargilglicina – resíduo de aminoácido inserido na
porção N-terminal da cadeia peptídica de [Pra]GAAA-BP100) e o grupo azida presente das
nanopartículas NP-N3. No mecanismo proposto para essa reação (WORRELL; MALIK;
FOKIN, 2013; TAHER et al., 2015) o cobre atua como catalisador formando uma ligação
temporária com o grupo alcino (FIG. 38).
A quantificação do peptídeo imobilizados nas nanopartículas de alumina foi
realizada como descrito no item 3.5.2. E o valor obtido do grau de funcionalização foi de
0,0705 mmol.g-1
, utlizando a reação de cicloadiação para ligação do peptídeo à nanopartícula
NP-N3.
123
Figura 37 – Rota sintética para obtenção da nanobioestrutura NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3).
124
Figura 38 – Mecanismo de reação proposto para a reação de cicloadição 1,3-dipolar entre o alcino
terminal da propargilglicina e azida imobilizada em nanopartículas de Al2O3 com base no trabalho de
Worrell, Malik e Fokin (2013).
4.3.2.1 Síntese, purificação e caracterização do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100
O peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 foi sintetizado para efeito de comparação dos
dados biológicos e biofísicos obtidos para NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100, uma vez que após
realização da imobilização do peptídeo [Pra]GAAA-BP100 sobre a nanopartícula, é formado
um anel triazólico na porção N-terminal dessa molécula unindo-a à nanopartícula. Neste
sentido, este item apresenta os resultados da síntese e caracterização do peptídeo [Trz-β-
A1]AAA-BP100.
A síntese do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 foi realizada a partir da reação do
peptídeo [Pra]GAAA-BP100 (ainda imobilizado na resina Rink®
amida) com sulfato de cobre
II, ascorbato de sódio e azida de sódio (item 3.1.1, pág. 67). O perfil cromatográfico do
produto obtido está apresentado na Figura 39B. A redução no tempo de retenção apresentado
pela amostra do peptídeo modificado ocorreu devido à presença do anel triazólico, pois esta
estrutura aumenta a polaridade do peptídeo. Além disso, observa-se que houve elevado grau
125
de conversão do [Pra]GAAA-BP100 em [Trz-β-A1]AAA-BP100, pois praticamente não foi
observado pico referente ao peptídeo propargilado no cromatograma da Figura 39B. A
caracterização da estrutura química de [Trz-β-A1]AAA-BP100 foi realizada por
espectrometria de massa MS e MS/MS.
Figura 39 - Perfil cromatográfico analítico de amostra bruta dos peptídeos [Pra]GAAA-BP100 (A) e [Trz-
β-A1]AAA-BP100 (B).
Pela espectrometria de massa observou-se a presença do íon molecular de razão
m/z 1772,01 característico do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 protonado (FIG. 40), cuja
massa teórica calculada para o mesmo peptídeo é de 1771,124 Da.
Por espectrometria MS/MS foi possível verificar a presença de íons fragmento
característicos da sequência primária do peptídeo contendo o anel triazol. No espectro de
massa MS/MS do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 (FIG. 41) pode-se observar a presença de
íons imônio de aminoácidos constituintes da cadeia peptídica almejada (indicados por setas no
espectro). Além disso, a grande maioria dos íons da série b está presente em intensidade
elevada no espectro, permitindo a identificação de toda sequência primária. A fragmentação
que resulta na série b ocorre mantendo-se a região N-terminal da cadeia peptídica intacta,
dessa forma a estrutura do anel triazólico é considerada em todos os íons fragmento dessa
série. No Anexo III estão apresentados todos os íons fragmento, teóricos e observados, para as
séries b e y desse sequenciamento.
126
Figura 40 – Espectro de massa MS do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100.
Figura 41 – Interpretação do espectro de massa MS/MS do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100. Íons da série
b estão apresentados em azul e íons da série y em vermelho. Íons em azul claro não foram observados no
espectro, mas são característicos da molécula analisada. Os imônios estão indicados por setas.
4.3.3 Caracterização das nanoestruturas
4.3.3.1 Difração de raios-x
A Figura 42 apresenta os difratogramas obtidos para cada uma das nanopartículas
formadas nas etapas de funcionalização para a obtenção de NP-CAAA-BP100 (rota 2) e de
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3).
127
Figura 42 - Difratograma de raios-x de nanopartículas de alumina características de cada etapa de
funcionalização das rotas de síntese 2 e 3.
A introdução de grupamentos orgânicos através das etapas de funcionalização e
imobilização dos peptídeos sobre as nanopartículas de alumina não acarretou em alteração da
estrutura cristalina das nanoestruturas, indexada como estrutura cúbica de γ-Al2O3 de acordo
com a discussão apresentada anteriormente, na segunda parte dos resultados (item 4.2.2.1,
pág. 104). No entanto, é possível observar o surgimento de diversos picos de difração na
estrutura de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 que decorrem da presença de átomos de cobre ainda
associados à estrutura molecular do peptídeo. No trabalho de Taher et al. (2015) os autores
sintetizaram um compósito polimérico contendo Cu(I) para realizar a catálise de reações de
cicloadição 1,3-dipolar entre alcinos terminais e azidas para a obtenção de compostos 1,2,3-
triazólicos. O material sintetizado apresentou difratograma com picos cristalinos muito
semelhantes aos obtidos no espectro de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 na região de 10º - 40º
(2θ), e os autores associaram o cobre presente no material a Cu(I) e Cu(II). Nesse sentido,
devido a semelhança entre os perfis cristalinos, é possível que átomos de Cu(I) e Cu(II)
estejam ainda associados a cadeia do peptídeo imobilizado e sejam responsáveis pelo
surgimento dos diferentes picos no difratograma de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100.
4.3.3.2 Microscopia eletrônica de transmissão
Na Figura 43 estão apresentadas imagens de MET de nanopartículas de alumina
sem funcionalização (FIG. 43A, B e C) e ligadas ao BP100 - NP-CAAA-BP100 (FIG. 43D e
128
E) e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (FIG. 43F e G). As análises das imagens mostram
novamente nanofilamentos morfologicamente semelhante às estruturas obtidas na segunda
parte deste trabalho (FIG. 28, pág. 107), comprovando que a metodologia de síntese proposta
para obtenção das nanoestruturas inorgânicas é reprodutível.
Figura 43 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de NP (A, B e C), NP-CAAA-BP100 (D e E)
e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (F e G).
Também pode ser observado que a funcionalização com o peptídeo BP100 não
alterou a morfologia fibrosa das nanoestruturas de alumina. As imagens de NP-CAAA-BP100
e de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 apresentam forma e tamanho similares às verificadas para
129
NP. No entanto, a análise microscópica de várias regiões das amostras, aponta que tanto NP-
CAAA-BP100 quanto NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 apresentam maior formação de
aglomerados de nanopartículas do que as NP não funcionalizadas, isso se deve à agregação
das cadeias peptídicas imobilizadas na superfície da alumina. Por outro lado, a presença de
planos cristalinos típicos da estrutura da alumina foi também observada nestas amostras.
Distâncias interplanares de 0,20, 0,24 e 0,42 nm foram identificadas nas amostras e estão
relacionadas aos planos cristalinos 311, 400 e 440 de γ-Al2O3 (CAI et al., 2015). Esses
resultados, embora mostrem nanoestruturas com morfologia um pouco variáveis, confirmam
que são materiais estruturados predominantemente em nanofilamentos com estrutura cristalina
característica de γ-Al2O3.
4.3.3.3 Espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho com transformada
de Fourier
A caracterização estrutural das etapas de síntese descritas nas rotas 2 e 3 foi
verificada através de espectroscopia de absorção molecular na região do infravermelho. Na
Figura 44 é possível observar os espectros de peptídeos e das nanopartículas para os produtos
de cada etapa de funcionalização até a obtenção das nanobiestruturas NP-CAAA-BP100 (rota
2) e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3).
Os espectros de nanopartículas de alumina apresentam o mesmo padrão de bandas
de vibração de Al2O3 observado na segunda parte (item 4.2) dos resultados deste trabalho.
Assim como as vibrações características de ligação de hidrogênio visualizadas no espectro de
NP-OH.
Na rota 2 a etapa de funcionalização subsequente à hidroxilação é a introdução de
grupos orgânicos com terminação NH2 (NP-NH2). No espectro dessa nanoestrutura observa-se
uma banda próxima a 3130-3100 cm-1
característica de vibração de deformação axial de N-H,
originada pela imobilização do grupo orgânico contendo amina primária. Após a imobilização
do derivado de cisteína, verifica-se grande semelhança entre os espectros de NP-Cys e NP-
CAAA-BP100 em relação ao perfil de bandas de absorção, cujas vibrações são características
do esqueleto principal de resíduos de aminoácidos e de ligação peptídica, pois mesmo no
espectro de NP-Cys a introdução do resíduo de cisteína foi realizada através de ligação
amídica formada entre o grupo NH2 presente na nanopartícula e a carboxila presente na
130
porção C-terminal do resíduo de cisteína. Dessa forma, em ambos os espectros são
identificadas as vibrações de deformação axial de carbonila C=O (em 1650 cm-1
), de
deformação angular simétrica no plano de N-H (entre 1200-1120 cm-1
) e de deformação axial
de N-H e C-H (próximas a 3300 cm-1
). Essas vibrações também são prontamente identificadas
no espectro do peptídeo CAAA-BP100 não imobilizado, confirmando sua presença nas
nanopartículas funcionalizadas com peptídeo (NP-CAAA-BP100).
Figura 44 – Espectro de infravermelho de peptídeos e nanopartículas característicos das estapas de
funcionalização das rotas de síntese 2 e 3.
Na rota sintética 3, a funcionalização subsequente a obtenção de nanopartículas
hidroxiladas acarreta na obtenção de NP-Cl. No espectro de NP-Cl não é observada a banda
de hidroxila, confirmando a substituição das hidroxilas de NP-OH por grupos cloropropilsilil
em NP-Cl. Além disso, também pode-se observar banda característica de dobramento CH2-Cl
em 1300-1230 cm-1
, o que fornece evidências da presença do átomo de Cl na porção final da
cadeia carbônica imobilizada. Observando os espectros de NP-N3 e NP-[Trz-β-A1]AAA-
BP100, verifica-se que há diferenças no perfil de bandas apresentado por cada um, indícios de
131
que as reações propostas para introdução de grupamentos e funcionalização das
nanopartículas transcorreram de maneira a resultar nessas modificações. No espectro de NP-
N3 a banda de estiramento C-N ocorre na faixa de 1350-1000 cm-1
se sobrepondo ao
dobramento CH2-Cl (1300-1230 cm-1
), no entanto é possível verificar que há intensificação da
banda de hidroxila no espectro de NP-N3. Ao contrário do átomo de Cl presente em NP-Cl
(etapa anterior à introdução de azida) a presença do nitrogênio na superfície da alumina
favorece a formação de ligações de hidrogênio. Comparando os espectros da nanobioestrutura
contendo o peptídeo (NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100) e o espectro do derivado peptídico livre
[Trz-β-A1]AAA-BP100 também são observadas grandes semelhanças de bandas, sendo essas
oriundas de vibrações entre átomos componentes de grupos funcionais característicos de
moléculas peptídicas.
4.3.3.4 Ressonância magnética nuclear de 13
C em fase sólida
A caracterização estrutural também das estruturas químicas das nanobioestruturas
também foi conduzidas por ressonância magnética nuclear, e neste caso, os espectros de RMN
de 13
C em fase sólida de peptídeos livres, nanopartículas funcionalizadas e contendo peptídeos
comprovaram a ligação covalente dos peptídeos às nanoestruturas de alumina (FIG. 45).
Como esperado, nenhum sinal de ressonância de 13
C foi observado para as nanopartículas
inorgânicas NP e NP-OH. No entanto, as demais nanopartículas funcionalizadas e ligadas ao
BP100 mostraram sinais de ressonância de 13
C característicos.
Para obtenção da nanobioestrutura formada por ligação de dissulfeto (rota 2), a
nanopartícula funcionalizada com APTES (NP-NH2) apresentaram sinais intensos em 11, 22,5
e 42,8, ppm que são atribuídos aos carbonos ligados ao silício Cα, Cβ e Cγ, respectivamente.
Após a ligação do resíduo de cisteína (NP-Cys), os deslocamentos químicos de 13
C a 57, 30,9
e 164,2 ppm foram atribuídos aos carbonos Cα, Cβ e ao carbono carbonílico da carboxiamida,
respectivamente, presentes na estrutura do resíduo de aminoácido. Esses valores estão de
acordo com os padrões de deslocamentos químicos observados para a cisteína no Banco de
Dados de Ressonância Magnética Biológica (Disponível em:
<www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statful.htm>). Valores similares de deslocamentos químicos de
13C da cadeia lateral, Cα e carboxiamida para os espectros do peptídeo CAAA-BP100 livre e
ligado às nanopartículas (NP-CAAA-BP100) também puderam ser identificados na Figura 45.
132
Figura 45 – Espectros de ressonância magnética nuclear (13
C) em fase sólida das nanopartículas de
alumina em cada uma das etapas de funcionalização até obtenção de NP-CAAA-BP100 (rota 2) e de NP-
[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3).
Contudo, um sinal intenso de deslocamento químico de 13
C da cistina foi prontamente
observado a 38 ppm (NP-CAAA-BP100), enquanto que o mesmo não foi observado no
espectro do peptídeo CAAA-BP100 livre. Este resultado revela que a maior parte do grupo
tiol presente nos resíduos de cisteína foi oxidada, resultando na ligação de dissulfeto entre o
133
grupo tiol de NP-Cys e o resíduo de cisteína da cadeia peptídica de CAAA-BP100. Estes
valores estão de acordo com estudos prévios com peptídeos diméricos que mostram que os
deslocamentos químicos de Cβ de resíduos de cisteína e cistina são altamente sensíveis ao
estado de oxidação do enxofre (SHARMA; RAJARATHNAM, 2000; MARTIN et al., 2010).
Para obtenção de NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 (rota 3), a nanopartícula oriunda da
etapa de funcionalização da nanoestrutura de alumina com CPTES mostrou deslocamentos
químicos de 13
C 11,5, 27,3 e 46,2 ppm atribuídos aos carbonos de silano Cα, Cβ e Cγ
presentes em NP-Cl. No espectro de NP-N3, enquanto os deslocamentos químicos de 13
C dos
carbonos ligados ao silício Cα e Cβ não apresentaram mudança significativa (11,6 ppm e 27,4
ppm, respectivamente). A substituição do átomo de cloro pelo grupo azida determinou um
aumento de 46,2 ppm (em NP-Cl) para 49,1 ppm (em NP-N3) no deslocamento químico de
13C do Cγ. O espectro da nanopartícula de alumina ligada ao BP100 por um anel triazólico
dissubstituído (NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100) apresenta muitos sinais devido aos sistemas de
spin de aminoácidos característicos da cadeia do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100. Vale
ressaltar a presença de dois sinais de 13
C em torno de 117 ppm e 130 ppm observados nos
espectros de [Trz-β-A1]AAA-BP100 e de NP-[Trz-β-A
1]AAA-BP100. Essas correlações estão
de acordo com as ressonâncias de carbono do triazol (SUN; XU; ZHANG, 1998) e confirmam
o sucesso da reação de cicloadição entre o peptídeo propargilado ([Pra]GAAA-BP100) e a
nanopartícula contendo azida (NP-N3).
4.3.3.5 Análise térmica
Na Figura 46 estão apresentadas as curvas termogravimétricas obtidas para as
amostras de nanopartículas não funcionalizadas (NP) e após as etapas de funcionalização das
rotas 2 e 3 para a obtenção de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100,
respectivamente. As análises foram realizadas com o intuito de evidenciar a presença de
diferentes grupos orgânicos provenientes das subsequentes etapas de funcionalização. Uma
evidência da ocorrência de funcionalização das nanoestruturas inorgânicas é a diferença nos
valores de massa das amostras ao final do tempo de experimento, uma vez que, quanto maior
a estrutura ligada às nanopartículas, menor é a porcentagem de massa final observada. Em
600 ºC verifica-se que as amostras de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
apresentam, respectivamente, cerca de 80 % e 60 % do seu valor de massa inicial. A menor
134
porcentagem de massa final verificada para NP-Cys (aproximadamente 77%) se deve à
grande perda de massa inicial para essa amostra (até 150 ºC), que é decorrente da eliminação
de água adsorvida. Além disso, a porcentagem de perda de massa acentuada para NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100 quando comparada à perda apresentada por NP-CAAA-BP100 confirma o
maior grau de imobilização de peptídeos observado para essa nanoestrutura (0,0705 mmol.g-1
e 0,0160 mmol.g-1
, respectivamente).
Figura 46 - Curvas termogravimétricas de porcentagem de perda de massa (A e C) e da primeira derivada
da perda de massa (B e D). Estão apresentadas as curvas para as nanopartículas de alumina em cada uma
das etapas de funcionalização da rota 2 (A e B) e da rota 3 (C e D).
À exceção de NP e NP-OH, as demais curvas termograviméticas mostram
diversos eventos térmicos, mais evidentes nas curvas de primeira derivada, que estão
associados à eliminação dos grupos orgânicos imobilizados (JOHNS; MCELHILL; SMITH,
135
1962). Principalmente nas curvas de NP-Cys, NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-
BP100 observa-se nitidamente que há grande número de eventos térmicos, o que pode ser
justificado pela maior diversidade de grupos funcionais presente nessas estruturas, como
observado nas análises de FTIR (FIG. 44, pág. 130), nas quais foram evidenciadas vibrações
características de grupos funcionais presentes em aminoácidos e moléculas peptídicas. Esses
resultados corroboram para a caracterização de todas as etapas de funcionalização das
nanopartículas de alumina e, novamente, mostram que as nanobioestruturas contendo
peptídeo apresentam estabilidade térmica a temperaturas inferiores a 150 ºC, sendo passíveis
de aplicação em formulação diversas cuja a temperatura de produção e modelagem não
ultrapassem este limite.
4.3.3.6 Potencial zeta
Os experimentos de determinação do potencial zeta para todas as nanopartículas
foram realizados a fim de avaliar as alterações químicas na superfície como resultado das
etapas de funcionalização para ambas as rotas sintéticas. A Figura 47 apresenta as medidas de
potencial zeta obtidas para nanopartículas de alumina e as estruturas derivadas, relacionadas
às rotas 2 e 3, suspensas em solução tampão Tris-HCl (pH 8,5). As medidas foram realizadas
a cada 10 minutos durante 60 minutos. Não foram observadas variações significativas no
valor medido ao longo do tempo para a mesma nanoestrutura. Mas foi possível observar
diferença no valor de potencial ζ determinado para diferentes nanopartículas.
Os valores médios de potencial ζ para as nanopartículas provenientes das
subsequentes funcionalizações da rota 2 podem ser observado no lado esquerdo da Figura
47C. Da mesma forma como observado para as noapartículas sintetizadas na parte II, os
valores de potencial ζ para NP e NP-OH foram próximos de zero. Por outro lado, as formas
derivadas obtidas durante as etapas da rota 2 proporcionaram um grande aumento nos valores
do potencial zeta. A presença do grupo aminopropil na NP-NH2 e as terminações α-amino na
NP-Cys aumentaram os valores do potencial para +30,5 e +23,0, respectivamente.
Similarmente, um aumento no valor de potencial ζ em comparação com NP-OH é alcançado
para NP-CAAA-BP100 (+17,2), como uma consequência dos cinco resíduos de Lys presentes
na cadeia peptídica.
136
Figura 47 - Potencial zeta de nanopartículas de alumina em tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,5.
Acompanhamento da variação do potencial zeta ao longo de 60 min das nanopartículas provenientes da
rota 2 (A) e da rota 3 (B). Em (C) média dos valores de potencial zeta obtidos e os respectivos desvios para
as nanopartículas das rotas de síntese 2 e 3.
Os valores médios de potencial ζ para as nanopartículas da rota 3 podem ser
visualizados no lado direto da Figura 47C. As nanopartículas provenientes das
funcionalizações subsequentes na também mostraram grandes mudanças nos valores de
137
potencial ζ quando comparadas a NP e a NP-OH. Contudo, as derivatizações que resultaram
na imobilização de grupos cloropropil (NP-Cl) e azidopropil (NP-N3) levaram os potenciais ζ
a valores negativos (-13,8 e -16,4, respectivamente) das nanopartículas. No entanto, a
imobilização da cadeia peptídica após reação de cicloadição resultou em um aumento do valor
de potencial para NP-[Trz-β-A1]]AAA-BP100 (Δζ de 13,1 mV), em comparação com o valor
obtido para NP-N3, novamente devido à presença de resíduos de lisina carregados
positivamente.
4.3.4 Ensaios de atividades antibacteriana e antifúngica
Após a caracterização das nanobioestruturas sintetizadas foram realizados ensaios
de atividade antimicrobiana de NP, NP-OH, NP-NH2, NP-Cys, NP-Cl, NP-N3, NP-CAAA-
BP100, NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 e dos peptídeos BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-
A1]AAA-BP100 foi avaliada contra cepas das bactérias Gram-negativas E. coli e S.
typhimurium, Gram-positiva S. aureus e contra as leveduras C. krusei e C. parapsilosis.
4.3.4.1 Ensaio de atividade antibacteriana
Os valores de concentração inibitória mínima (MIC) determinados no ensaio de
atividade antibacteriana estão apresentados na Tabela 14 e serão discutidos a seguir.
Não houve divergência significativa entre a atividade bacteriana dos peptídeos
livres (BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100) sobre as cepas testadas. Os peptídeos
apresentaram atividade antibacteriana semelhante e com baixos valores de MIC. Portanto, as
alterações realizadas na porção N-terminal da cadeia peptídica originando os derivados
CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 não afetam a atividade bacteriana dessas moléculas
em relação ao peptídeo BP100 original.
Em relação à atividade antibacteriana das nanopartículas, verificou-se que NP,
NP-OH, NP-Cl e NP-N3 não apresentaram atividade nas concetrações testadas, enquanto que
NP-NH2 e NP-Cys foram ativas sobre S. aureus e E. coli, embora em elevadas concentrações.
Neste caso, as terminações amino presentes tanto em NP-NH2 quanto em NP-Cys podem se
apresentar protonadas, como apontado pelos valores de potenciais zeta (+30,54 e +23,02,
respectivamente) determinados para estas nanoestruturas (FIG. 47, pág. 136), e dessa forma,
138
contribuir para a atração eletrostática entre a nanopartícula e a membrana fosfolipídica
aniônica das células bacterianas (OMARDIEN; BRUL; ZAAT, 2016). É importante ressaltar que
o mecanismo necessário para ocasionar a morte celular não depende apenas de atração
eletrostática, pode-se observar que nenhuma das nanoestruturas, mesmo as carregadas
positivamente, apresentaram atividade sobre S. typhimurium.
Tabela 14 - Valores de MIC obtidos sobre cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e S. aureus) para os
peptídeos BP100, CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 e para as nanopartículas em cada etapa de
funcionalização até a obtenção da NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
Amostra MIC (g.L
-1/mol.L-
1)
S. aureus E. coli S. typhimurium
NP n.a. n.a. n.a.
NP-OH n.a. n.a. n.a.
NP-NH2 8a 8
a n.a.
NP-Cys 8a 4
a n.a.
NP-Cl n.a. n.a. n.a.
NP-N3 n.a. n.a. n.a.
NP-CAAABP100 5,6a/160
b 2,8
a/80
b 5,6
a/160
b
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 1,05
a/80
b 1,05
a/8
b n.a.
BP100 20b 10
b 20
b
CAAA-BP100 20b 40
b 20
b
[Trz-β-A1]AAA-BP100 20
b 20
b 20
b
n.a.: não apresentou atividade biológica nas concentrações testadas.
a: Concentração em g.L
-1
b: Concentração em μmol.L
-1
As nanobioestruturas contendo peptídeo imobilizado NP-CAAA-BP100 e NP-
[Trz-β-A1]AAA-BP100 também apresentaram atividade antibacteriana. Ambas
nanobioestruturas de peptídeo mostraram atividade contra E. coli e S. aureus em
concentrações de nanopartículas menores que as apresentadas por NP-NH2 e NP-Cys. Além
disso, NP-CAAA-BP100 foi ativa inclusive sobre S. typhimurium na concentração de 5,6 g.L-
1/160 μmol.L
-1.
139
4.3.4.2 Ensaio de atividade antifúngica
Os valores de MIC determinados no ensaio de atividade antifúngica estão
apresentados na Tabela 15 e serão discutidos a seguir.
Tabela 15 - Valores de MIC obtidos sobre leveduras (C. krusei e C. parapsilosis) para os peptídeos BP100,
CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 e para as nanopartículas em cada etapa de funcionalização até a
obtenção da NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100
Amostra MIC (g.L
-1/mol.L-
1)
C. Krusei C. parapsilosis
NP n.a. 16a
NP-OH 16a 16
a
NP-NH2 8a 2
a
NP-Cys 2a 0,25
a
NP-Cl 8a 1
a
NP-N3 16a 16
a
NP-CAAABP100 n.a. 11,2a/320
b
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 0,26
a/20
b 0,07
a/5
b
BP100 40b 10
b
CAAA-BP100 40b 10
b
[Trz-β-A1]AAA-BP100 20
b 5
b
n.a.: não apresentou atividade biológica nas concentrações testadas.
a: Concentração em g.L
-1
b: Concentração em μmol.L
-1
Os peptídeos BP100 e CAAA-BP100 apresentaram mesmo valor de MIC sobre as
cepas de C. krusei e C. parapsilosis (40 μmol.L-1
e 10 μmol.L-1
, respectivamente). No
entanto, a presença do anel triazólico em [Trz-β-A1]AAA-BP100 intensificou a atividade
antifúngica dessa molécula, que mostrou menores valores de MIC sobre as mesmas cepas (20
μmol.L-1
e 5 μmol.L-1
, respectivamente). A atividade antifúngica relacionada à presença do
anel triazólico já é extensamente relatada na literatura (ZHOU; WANG, 2012; ZHANG et al.,
2014; DHEER; SINGH; SHANKAR, 2017) inclusive em associação a peptídeos
antimicrobianos (FERREIRA et al., 2015; JUNIOR et al., 2017). Muitos estudos apontam
para a capacidade da inibição da biossíntese do ergosterol, componente da membrana celular
140
de fungos, causada pelos derivados triazólicos (RAUTENBACH; TROSKIE; VOSLOO,
2016).
Em alguma extensão todas as nanoestruturas de alumina sintetizadas apresentaram
atividade antifúngica. Jalal et al. (2016) e Shenashen et al. (2016) também sintetizaram e
verificaram atividade antifúngica em nanopartículas de alumina. As nanopartículas obtidas no
trabalho de Jalal et al. (2016) apresentaram diâmetro de aproximadamente 50 nm e foram
ativas sobre diversas espécies de Candida. Por microscopia eletrônica de transmissão de alta
resolução os autores verificaram que ocorre ancoramento das nanopartículas na superfície
celular e subsequente internalização de nanoestruturas menores nas células de leveduras,
acarretando em alterações morfológicas com ruptura de parede e membrana celulares e,
consequentemente, em morte celular.
No presente trabalho foi possível verificar que tanto as nanopartículas carregadas
positivamente (NP-NH2 e NP-Cys) quanto NP-Cl mostraram atividade sobre as espécies de
Candida testadas. Nitidamente a atividade de NP-Cys sobre as leveduras foi significativa
maior com valores de MIC obtidos sobre C. krusei e C. parapsilosis de 2 g.L-1
e 0,25 g.L-1
,
respectivamente.
Assim como verificado contra cepas bacterianas, a atividade antifúngica de NP-
CAAA-BP100 foi significativamente menor em comparação ao peptídeo CAAA-BP100 livre.
Porém, para a nanoestrutura ligada ao peptídeo através do anel triazólico (NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100) o valor de MIC contra as leveduras C. krusei (0,26 g.L
-1/20 μmol.L
-1) e C.
parapsilosis (0,07 g.L-1
/ 5 μmol.L-1
) foi menor do que o valor apresentado pelas
nanoestruturas intermediárias de ambas as rotas, NP, NP-OH, NP-NH2, NP-Cys, NP-Cl e NP-
N3 e o próprio peptídeo BP100. Neste senido, a presença do anel triazólico mesmo atuando
como ligante da porção inorgânica e peptídica em NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 também tem
papel fundamental na atividade antifúngica da nanobioestrutura.
4.3.5 Estudos biofísicos de interação com meios biomiméticos
Os estudos de CD e SPR foram realizados com o intuito de analisar o
comportamento estrutural e de interação dos peptídeos CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-
BP100 e das nanobioestruturas das rotas de síntese 2 e 3 na presença de LUV de POPC:POPG
(3:1) em tampão Tris-HCl a 10 mM, pH 8,5.
141
4.3.5.1 Espectroscopia de dicroísmo circular
Através da espectroscopia de dicroísmo circular as preferências conformacionais
dos peptídeos, nanopartículas funcionalizadas e ligadas aos derivados peptídicos do BP100
foram investigadas em solução tampão e na presença de vesículas fosfolipídicas como meio
mimético de membrana. Foram coletados espectros de CD dos peptídeos livres CAAA-BP100
e [Trz-β-A1]AAA-BP100 para verificar se há alterações na conformação desses derivados ao
interagir com as membranas fosfolipídicas de POPC:POPG, em comparação com os
resultados de CD obtidos para o BP100 (item 4.2.5, pág. 115). Os espectros de CD dos
peptídeos CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 em solução tampão Tris-HCl pH 8,5 (FIG.
48A e C – espectros em preto, respectivamente) mostram uma banda negativa a cerca de 200
nm, que é típica de peptídeos em conformação desenovelada (SIANO et al., 2014). Na
presença de LUV POPC:POPG (3:1) os espectros de CD (FIG. 48A e C) revelaram que
ambos peptídeos adotam estrutura em α-hélice, caracterizado por um máximo em 193 nm e
dois mínimos em 208 nm e 222 nm. Aumentando-se a concentração de LUV, os espectros de
ambos os peptídeos revelam maiores intensidades nos sinais característicos de conformação
helicoidal. Mesmo na concentração de 125 mM de LUV POPC:POPG um perfil helicoidal
muito bem definido é reconhecido nos espectros dos peptídeos, uma vez que dois mínimos
são observados a 222 nm e 208 nm e um ponto máximo é observado a 193 nm. Curiosamente,
uma saturação na helicidade é alcançada mais rapidamente para proporções menores de LUV
POPC:POPG nas soluções que contêm o CAAA-BP100 quando comparado aos peptídeos
triazol. Contudo, as modificações realizadas na porção N-terminal de ambas cadeias
peptídicas (CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100) não causaram alteração significativa na
carga líquida positiva e tampouco gerado uma estrutura suficientemente longa para
possibilitar a formação de poros transmembrana modificando o mecanismo de ação do
BP100, uma vez que o perfil de estrutura secundária adotado pelos novos peptídeos é muito
semelhante ao apresentado pelo peptídeo antimicrobiano BP100, como pode ser visto na
segunda parte desse trabalho (FIG. 32A, pág. 116) e nos estudos apresentados por Manzini et
al. (2014).
Como esperado, devido à ausência de cadeias peptídicas, NP e todas as
nanopartículas funcionalizadas tanto para a rota 2 quanto para a rota 3 (NP-NH2, NP-Cys, NP-
Cl e NP-N3) não apresentaram quaisquer preferências conformacionais (FIG. 51B e 51D). Da
142
mesma forma, os espectros de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 em soluções
tampão Tris-HCl (FIG. 48B e D - espectros em azul claro em azul escuro - respectivamente)
revelam que a cadeia peptídica mostra uma conformação não definida, principalmente devido
à presença de uma banda positiva intensa próximo a 205 nm. Por outro lado, é observado um
aumento significativo na estabilidade estrutural para as moléculas peptídicas ligadas às
nanopartículas na presença de vesículas de fosfolipídeos, novamente caracterizando a
formação de conformações helicoidais das cadeias peptídicas (FIG. 48B e D - espectros em
rosa). Estes resultados demonstram que a presença dos resíduos Ala-2, Ala-3 e Ala-4
fornecem um espaçamento adequado entre a superfície da nanopartícula e a cadeia peptídica
de BP100 permitindo que esta interaja efetivamente com as membranas fosfolipídicas
conservando a conformação em α-hélice (COSTA et al., 2011).
Figura 48 - Espectros de dicroísmo circular dos peptídeos CAAA-BP100 (A) e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (B) e
das nanopartículas em cada etapa de funcionalização da rota 2 (C) e da rota 3 (D) em tampão Tris-HCl,
pH 8,5, e na presença de LUVs POPC:POPG (3:1) (1 mM para as nanopartículas).
143
Dessa forma, a espectroscopia de CD mostrou que ambos os peptídeos adotam
conformações -helice em ambientes de membrana, mesmo quando ligados às nanoestruturas.
Portanto, as interações peptídeo-membrana desempenham um papel crucial na estabilidade da
conformação -helicoidal ativa de todas as espécies. Isto foi observado anteriormente para
nanopartículas contendo o peptídeo EAAA-BP100 (FIG. 32C – espectros em vermelho e em
preto, pág. 120) ligado pela cadeia lateral do ácido glutâmico (TORRES et al., 2018). Diante
disso, podemos afirmar que os novos modelos de ligação não prejudicam a interação
peptídeo-membrana, como visto pelos resultados da atividade antimicrobiana, que se manteve
presente mesmo com a imobilização dos novos derivados em nanopartículas de alumina.
4.3.5.2 Ressonância plasmônica de superfície
A SPR foi utilizada a fim de investigar as interações peptídeo-membrana em
experimentos que avaliaram a afinidade dos peptídeos livres (CAAA-BP100 e [Trz-β-
A1]AAA-BP100) e de todas as nanopartículas envolvidas nas rotas 2 e 3 com LUV de
POPC:POPG (3:1). Os sensogramas da interação de todas as espécies citadas com as
bicamadas lipídicas de POPC:POPG são mostrados na Figura 49. Após a injeção de LUV de
POPC:POPG sobre o chip de SiO2 há a formação da bicamada fosfolipídica (HAN et al.,
2008) que é caracterizada pelo aumento do sinal de ressonância em 5 min até sua
estabilização em 20 min. Observa-se que as curvas para as nanopartículas sem peptídeo ligado
(NP, NP-NH2, NP-Cys, NP-Cl e NP-N3) apresentam baixo grau de interação, uma vez que a
intensidade do sinal da RU retorna a valores muito próximos aos observados para a bicamada
lipídica em tempos acima de 45 min (HALL; MOZSOLITS; AGUILAR, 2003). No entanto, a
intensidade do sinal da RU atingida para NP-NH2 e NP-Cys é relativamente maior do que as
intensidades observadas para NP, NP-Cl e NP-N3. Este resultado pode estar associado a maior
atração eletrostática com as membranas fosfolipídicas aniônicas das nanoestruturas de NP-
NH2 e NP-Cys, cujos valores de potencial zeta foram pronunciadamente positivos (+30,54 e
+23,02, respectivamente), enquanto para as demais (NP, NP-Cl e NP-N3) estes valores foram
negativos ou próximo a zero (-0,76, -13,78 e -16,44, respectivamente). Além disso, a maior
interação de NP-NH2 e NP-Cys com LUV de POPC:POPG confirmada pelo SPR está de
acordo com a atividade antibacteriana observada para essas estruturas, não verificada para as
NP, NP-Cl e NP-N3.
144
Figura 49 - Sensogramas de interações com bicamada lipídica de NP, suas formas derivadas e peptídeos
livres medidas por SPR. Curvas obtidas para as espécies envolvidas nas etapas de funcionalização da rota
2 (A) e da rota 3 (B). C e D mostram curvas obtidas em diversas concentrações de peptídeo para NP-
CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100, respectivamente. Em (E) estão apresentadas as curvas para
determinação dos valores de Ka.
Por outro lado, os sensogramas de nanopartículas contendo peptídeo exibem
intensidade de sinal de RU elevada mesmo após o final da injeção da amostra (~45 min). Os
sensogramas dos peptídeos CAAA-BP100 e [Trz-β-A1]AAA-BP100 (FIG. 49A e B - curvas
em rosa) também foram obtidos para comparar a interação peptídeo-membrana da cadeia livre
e ligada às nanoestruturas de alumina. As curvas de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-
BP100 revelaram intensidade do sinal de RU um pouco menor em relação aos peptídeos não
imobilizados, contudo com valores muito superiores aos apresentados pelas NPs sem
145
peptídeo. Este resultado concorda com os valores de MIC obtidos nos ensaios antibacterianos
(TAB. 14, pág. 138) para as nanoestruturas NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 e
os respectivos peptídeos livres, pois foram determinados menores valores de MIC para os
peptídeos livres em comparação com as nanobioestruturas peptídicas.
Diante desses resultados, pode-se afirmar que mesmo ligadas às nanopartículas, as
cadeias peptídicas de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 estão disponíveis para
a interação com a superfície da bicamada fosfolipídica de POPC:POPG. Assim sendo, as
constantes de associação (Ka) das nanoestruturas contendo peptídeo foram obtidas com o
objetivo de avaliar a interação peptídeo-membrana de NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100 com POPC:POPG (FIG. 49E). Os sensogramas registrados em diferentes
concentrações das nanobiestruturas peptídicas (FIG. 49C e D) confirmam as interações
peptídeo-membrana uma vez que a intensidade do sinal da UR aumenta em função da
concentração do peptídeo (PAPO; SHAI, 2003). Os sensogramas da ligação entre NP-CAAA-
BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 com as bicamadas lipídicas negativas são semelhantes
entre si. Estes resultados são fortemente apoiados pelos experimentos de CD, uma vez que o
perfil helicoidal observado para esses peptídeos derivados do BP100 também foi semelhante.
Os valores de Ka obtidos para NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 foram muito
próximos (6200±250 e 6900±180, respectivamente) e demonstram uma intensidade moderada
da interação dos peptídeos com bicamada fosfolipídica, comparável com outros PAM já
desritos na literatura e cujos mecanismo de ação basem-se na perturbação da membrana
bacteriana (KAMIMORI et al., 2005; LOMBARDI et al., 2017).
146
147
5 CONCLUSÕES
O trabalho apresenta três diferentes estratégias de síntese para obtenção de
nanobioestruturas de alumina contendo o peptídeo antimicrobiano BP100. As metodologias
empregadas para realizar a ligação entre o peptídeo e a superfície da nanopartícula foram
investigadas e caracterizadas, mostrando-se adequadas para obtenção de uma ligação
covalente entre o óxido e a estrutura orgânica. Embora todas as estratégias de funcionalização
tenham sido eficientes para obtenção dos nanobiomateriais, a reação de cicloadição catalisada
por cobre (I) resultou no maior grau de funcionalização de peptídeo (TAB. 16).
Os aspectos físico-químicos e morfológicos dos materiais obtidos foram
caracterizados por diferentes técnicas analíticas. As nanopartículas de alumina não
funcionalizadas e após imobilização do peptídeo apresentaram estruturas de nanofilamentos
muito semelhantes. No entanto, verificou-se que as propriedades físico-químicas e biológicas
foram significativamente alteradas.
Tabela 16 - Grau de imobilização e valores de MIC obtidos para as nanoestruturas NP-EAAA-BP100,
NP-CAAA-BP100 e NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100 contra cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e S.
aureus) e leveduras (C. krusei e C. parapsilosis)
MIC (g.L-1
/μmol.L-1
)
Amostra Grau de imobilização
(mmol.g-1
)
Ensaio antibacteriano Ensaio antifúngico
S.
aureus
E.
coli
S.
typhimurium
C.
Krusei
C.
parapsilosis
NP-EAAA-
BP100 0,0455 ± 0,0324 0,26
a/20
b 0,13
a/10
b 0,26
a/20
b n.a. 1,03
a/80
b
NP-CAAA-
BP100 0,0160 ± 0,0106 5,6
a/160
b 2,8
a/80
b 5,6
a/160
b n.a. 11,2
a/320
b
NP-[Trz-β-
A1]AAA-BP100
0,0705 ± 0,0198 1,05a/80
b 1,05
a/80
b n.a. 0,26
a/20
b 0,07
a/5
b
n.a.: não apresentou atividade biológica nas concentrações testadas.
a: Concentração em g.L
-1
b: Concentração em μmol.L
-1
As nanopartículas de alumina contendo os peptídeos apresentaram maior
atividade antimicrobiana quando comparadas às nanopartículas de alumina pura. Dentre as
três nanobioestruturas sintetizadas NP-EAAA-BP100 foi a que apresentou melhor atividade
148
sobre as cepas bacterianas testadas. A nanobioestrutura com melhor potencial antifúngico foi
NP-[Trz-β-A1]AAA-BP100, o que pode estar relacionado a presença do anel triazólico,
reconhecidamente como um agente inibidor da biossíntese do ergosterol responsável pela
estabilidade da membrana de fungos. Essa nanobioestrutura também mostrou potencial
antimicrobiano
As metodologias sintéticas aqui propostas abrem novas possibilidades para o
desenvolvimento de diferentes nanobiomateriais, que podem ser obtidos através da ligação de
outros peptídeos a diferentes estruturas de alumina. Espera-se que investigações adicionais
possam levar a materiais com um potencial biológico ainda mais amplo. Um ponto importante
a ser abordado é a aplicação desses nanomateriais associados a suportes poliméricos para uso
em implantes ortopédicos ou ortodônticos, a fim de aumentar a regeneração óssea e, ao
mesmo tempo, prevenir a rejeição causada em consequência de infeções microbianas.
149
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKRAM, S.; GAO, G. Q.; LIU, Y.; ZHU, J.; WU, G. N.; ZHOU, K. Degradation
mechanism of Al2O3 nano filled polyimide film due to surface discharge under square impulse
voltage. Ieee Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation, 22(6): 3341-3349.
2015.
AL-KHAWAJA, E.; AL-FATLAWI, A. H.n. Preparation of Nano Activated γ-Alumina with
Surfactant and Surface Characterization. Journal of Babylon University, 3(24). 2016.
ALVAREZ, C.; CASALLANOVO, F.; SHIDA, C. S.; NOGUEIRA, L. V.; MARTINEZ, D.;
TEJUCA, M.; PAZOS, I. F.; LANIO, M. E.; MENESTRINA, G.; LISSI E.; SCHREIER, S.
Binding of sea anemone pore-forming toxins sticholysins I and II to interfaces - Modulation
of conformation and activity, and lipid-protein interaction. Chemistry and Physics of Lipids,
122(1-2): 97-105. 2003.
ALVES, D.; PEREIRA, M. O. Mini-review: Antimicrobial peptides and enzymes as
promising candidates to functionalize biomaterial surfaces. Biofouling, 30(4): 483-499. 2014.
ANDRÄ, J.; GOLDMANN, T.; ERNST, C. M.; PESCHEL, A.; GUTSMANN, T. Multiple
peptide resistance factor (MprF)-mediated resistance of Staphylococcus aureus against
antimicrobial peptides coincides with a modulated peptide interaction with artificial
membranes comprising lysyl-phosphatidylglycerol. Journal of Biological Chemistry,
286(21): 18692-18700. 2011.
ANSARI, M. A.; KHAN, H. M.; KHAN, A. A.; CAMEOTRA, S. S.; SAQUIB, Q.;
MUSARRAT, J. Interaction of Al2O3 nanoparticles with Escherichia coli and their cell
envelope biomolecules. Journal of applied microbiology 116(4): 772-783. 2013.
ANVISA. Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da
Sensibilidade a Terapia Antifúngica das Leveduras; Norma Aprovada - Segunda Edição,
M27-A2. 2002.
ANVISA. Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição
para Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada - Sexta Edição, M7-A6. 2003.
ARIAS, C. A.; MURRAY, B. E. A new antibiotic and the evolution of resistance. New
England Journal of Medicine, 372(12): 1168-1170. 2015.
ARNOLD, T. M.; DOTSON, E.; SAROSI, G. A.; HAGE, C. A. Traditional and emerging
antifungal therapies. Proceedings of the American Thoracic Society, 7(3): 222-228. 2010.
ATHARI, S. S.; POURPAK, Z.; FOLKERTS, G.; GARSSEN, J.; MOIN, M.; ADCOCK, I.
M.; MOVASSAGHI, M.; ARDESTANI, M. S.; MOAZZENI, S. M.; MORTAZ, E.
Conjugated Alpha-Alumina nanoparticle with vasoactive intestinal peptide as a Nano-drug in
treatment of allergic asthma in mice. European Journal of Pharmacology, 791: 811-820.
2016.
150
AVITABILE, C.; D'ANDREA, L. D.; ROMANELLI, A. Circular dichroism studies on the
interactions of antimicrobial peptides with bacterial cells. Scientific reports, 4: 4293, 2014.
BADOSA, E.; FERRE, R.; PLANAS, M.; FELIU, L.; BESALU, E.; CABREFIGA, J.;
BARDAJI, E.; MONTESINOS, E. A library of linear undecapeptides with bactericidal
activity against phytopathogenic bacteria. Peptides, 28(12): 2276-2285. 2007.
BAGHERI, M.; BEYERMANN, M.; DATHE, M. Immobilization reduces the activity of
surface-bound cationic antimicrobial peptides with no influence upon the activity
spectrum. Antimicrobial agents and chemotherapy, 53(3): 1132-1141. 2009.
BAHAR, A. A.; REN, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals, 6(12): 1543-1575, 2013.
BAZAKA, K.; JACOB, M. V., CHRZANOWSKI, W.; OSTRIKOV, K. Anti-bacterial
surfaces: natural agents, mechanisms of action, and plasma surface modification. Rsc
Advances, 5(60): 48739-48759. 2015.
BECHINGER, B.; GORR, S. U. Antimicrobial peptides: mechanisms of action and
resistance. Journal of dental research, 96(3): 254-260. 2017.
BECHINGER, B.; LOHNER, K.. Detergent-like actions of linear amphipathic cationic
antimicrobial peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1758(9):
1529-1539. 2006.
BISHT, G. S.; RAWAT, D. S.; KUMAR, A.; KUMAR, R.; PASHA, S. Antimicrobial activity
of rationally designed amino terminal modified peptides. Bioorganic & medicinal chemistry
letters, 17(15): 4343-4346. 2007.
BJORKBACKA, H.; FITZGERALD, K. A.; HUET, F.; LI, X.; GREGORY, J. A.; LEE, M.
A., ORDIJA, C. M.; DOWLEY, N. E.; GOLENBOCK, D. T.; FREEMAN, M. W. The
induction of macrophage gene expression by LPS predominantly utilizes Myd88-independent
signaling cascades. Physiological Genomics, 19(3): 319-330. 2004.
BLIN, T.; PUROHIT, V.; LEPRINCE, J.; JOUENNE, T.; GLINEL, K. Bactericidal
microparticles decorated by an antimicrobial peptide for the easy disinfection of sensitive
aqueous solutions. Biomacromolecules, 12(4): 1259-1264. 2011.
BOMAN, H. G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. Journal of
Internal Medicine, 254(3): 197-215. 2003.
BOWDISH, D. M.; DAVIDSON, D. J.; HANCOC, R. A re-evaluation of the role of host
defence peptides in mammalian immunity. Current Protein and Peptide Science, 6(1): 35-
51. 2005.
BRAEM, A.; DE BRUCKER, K.; DELATTIN, N.; KILLIAN, M. S.; ROEFFAERS, M. B.;
YOSHIOKA, T.; HAYAKAWA, S.; SCHMUKI, P.; CAMMUE, B. P.A.; VIRTANEN, S.;
THEVISSEN, K.; NEIRINCK, B. Alternating current electrophoretic deposition for the
151
immobilization of antimicrobial agents on titanium implant surfaces. ACS applied materials
& interfaces, 9(10): 8533-8546. 2017.
BRAGAZZI, N. L.; GASPARINI, R.; AMICIZIA, D.; PANATTO, D.; LAROSA, C. Porous
alumina as a promising biomaterial for public health. Advances in Protein Chemistry and
Structural Biology, R. Donev. San Diego, Elsevier Academic Press Inc., 101: 213-229.
2015.
BRUNTON, L. L.; CHABNER, B. A.; KNOLLMANN, B. C. As Bases Farmacológicas da
Terapêutica de Goodman & Gilman-11. Editora McGraw-Hill. 2006.
BUCKHOLTZ, G. A.; REGER, N. A.; ANDERTON, W. D.; SCHIMOLER, P. J.;
ROUDEBUSH, S. L.; MENG, W. S.; MILLER, M. C.; GAWALT, E. S. Reducing
Escherichia coli growth on a composite biomaterial by a surface immobilized antimicrobial
peptide. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications, 65:
126-134. 2016.
BÜRCK, J.; WADHWANI, P.; FANGHÄNEL, S.; ULRICH, A. S. Oriented circular
dichroism: a method to characterize membrane-active peptides in oriented lipid
bilayers. Accounts of chemical research, 49(2): 184-192. 2016.
CAI, Y.; HUANG, H.; WANG, L.; ZHANG, X.; YUAN, Y.; LI, R.; WAN, H.; Guan, G.
Facile synthesis of pure phase γ-AlOOH and γ-Al 2 O 3 nanofibers in a recoverable ionic
liquid via a low temperature route. RSC Advances, 5(127): 104884-104890. 2015.
CAMPOCCIA, D.; MONTANARO, L.; ARCIOLA, C. R. A review of the biomaterials
technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials, 34(34): 8533-8554. 2013.
CANTÚ, M. D.; CARRILHO, E.; WULFF, N. A.; PALMA, M. S. Seqüenciamento de
peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático. Química nova, 669-675. 2008.
CARNICELLI, V.; LIZZI, A. R.; PONZI, A.; AMICOSANTE, G.; BOZZI, A.; DI GIULIO,
A. Interaction between antimicrobial peptides (AMPs) and their primary target, the
biomembranes. Microbial Pathogens and Strategies for Combating Them: Science,
Technology and Education, 2: 1123-1134. 2013.
CHAN, W. C.; WHITE, P. D. Fmoc solid phase peptide synthesis. Oxford University Press.
2000.
CHEN, R.; WILLCOX, M. D.; HO, K. K. K.; SMYTH, D.; KUMAR, N. Antimicrobial
peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent
subcutaneous infection models. Biomaterials, 85: 142-151. 2016.
CHOU, H. T.; WEN, H. W.; KUO, T. Y.; LIN, C. C.; CHENn, W. J. Interaction of cationic
antimicrobial peptides with phospholipid vesicles and their antibacterial
activity. Peptides, 31(10): 1811-1820. 2010.
152
CORDINGLEY, R.; KOHAN, L.; BEN-NISSAN, B.; PEZZOTTI, G. Alumina as an
orthopaedic biomaterial: characteristics, properties, performance and applications. Journal of
the Australasian Ceramic Society, 39(1): 20-28. 2003.
COSTA, F.; CARVALHO, I. F.; MONTELARO, R. C.; GOMES, P.; MARTINS, M. C. L.
Covalent immobilization of antimicrobial peptides (AMPs) onto biomaterial surfaces. Acta
Biomaterialia, 7(4): 1431-1440. 2011.
CSORDAS, A.; MICHL, H. Primary structure of two oligopeptides of the toxin of Bombina
variegata L. Toxicon, 7(2): 103-108. 1969.
CUNHA, G. D.; ROMAO, L. P. C.; MACEDO, Z. S. Production of alpha-alumina
nanoparticles using aquatic humic substances. Powder Technology, 254: 344-351. 2014.
DA COSTA, J. P.; COVA, M.; FERREIRA, R.; VITORINO, R. Antimicrobial peptides: an
alternative for innovative medicines? Applied Microbiology and Biotechnology 99(5):
2023-2040. 2015.
DAVIS, N.; CURRY, A.; GAMBHIR, A. K.; PANIGRAHI, H.; WALKER, C. R. C.;
WILKINS, E. G. L.; WORSLEY, M. A.; KAY, P. R. Intraoperative bacterial contamination
in operations for joint replacement. J Bone Joint Surg Br, 81(5): 886-889. 1999.
DE CALEYA, R. F.; GONZALEZ-PASCUAL, B.; GARCÍA-OLMEDO, F.; CARBONERO,
P. Susceptibility of phytopathogenic bacteria to wheat purothionins in vitro. Applied
microbiology, 23(5): 998-1000. 1972.
DEBRASSI, A.; RIBBERA, A.; DE VOS, W. M.; WENNEKES, T.; ZUILHOF, H. Stability
of (bio)functionalized porous aluminum oxide. Langmuir, 30(5): 1311-1320. 2014.
DELEU, M.; CROWET, J. M.; NASIR, M. N.; LINS, L. Complementary biophysical tools to
investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma
membrane: a review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1838(12):
3171-3190. 2014.
DHEER, D.; SINGH, V.; SHANKAR, R.. Medicinal attributes of 1, 2, 3-triazoles: Current
developments. Bioorganic chemistry, 71: 30-54, 2017.
DIXON, W. T.; SCHAEFER, J.; SEFCIK, M. D.; STEJSKAL, E. O.; MCKAY, R. Total
suppression of sidebands in CPMAS C-13 NMR. Journal of Magnetic Resonance
(1969), 49(2): 341-345. 1982.
DOMINGUES, M. M.; CASTANHO, M.; SANTOS, N. C. rBPI(21) promotes
lipopolysaccharide aggregation and exerts its antimicrobial effects by (hemi)fusion of PG-
containing membranes. Plos One, 4(12). 2009.
153
DOMINGUES, M. M.; SANTIAGO, P. S.; CASTANHO, M.; SANTOS, N. C. What can
light scattering spectroscopy do for membrane-active peptide studies. Journal of Peptide
Science, 14(4): 394-400. 2008.
DONG, A.; ZHANG, Q.; WANG, T.; WANG, W. W.; LIU, F. Q.; GAO, G. Immobilization
of cyclic N-halamine on polystyrene-functionalized silica nanoparticles: synthesis,
characterization, and biocidal activity. Journal of Physical Chemistry C, 114(41): 17298-
17303. 2010.
DORNER, F.; MALEK-LUZ, A.; SAAR, J. S.; BONAUS, S.; AL-AHMAD, A.;
LIENKAMP, K. Synthetic Mimics of Antimicrobial Peptides (SMAMPs) in Layer-by-Layer
Architectures: Possibilities and Limitations. Macromolecular Chemistry and Physics,
217(19): 2154-2164. 2016.
DUBOS, R. J.; HOTCHKISS, R. D. The production of bactericidal substances by aerobic
sporulating bacilli. The Journal of experimental medicine, 73(5): 629. 1941.
EISSLER, S.; KLEY, M.; BÄCHLE, D.; LOIDL, G.; MEIER, T.; SAMSON, D. Substitution
determination of Fmoc‐substituted resins at different wavelengths. Journal of Peptide
Science, 23(10): 757-762. 2017.
EPAND, R. F.; SAVAGE, P. B.; EPAND, R. M. Bacterial lipid composition and the
antimicrobial efficacy of cationic steroid compounds (Ceragenins). Biochimica et Biophysica
Acta (BBA)-Biomembranes, 1768(10): 2500-2509. 2007.
EPAND, R. M.; EPAND, R. F. Bacterial membrane lipids in the action of antimicrobial
agents. Journal of Peptide Science, 17(5): 298-305. 2010.
EPAND, R. M.; VOGEL, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of
action. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, 1462(1–2): 11-28. 1999.
ERNST, C. M.; PESCHEL, A. Broad‐spectrum antimicrobial peptide resistance by MprF‐mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Molecular microbiology, 80(2):
290-299. 2011.
FERREIRA, S. Z.; CARNEIRO, H. C.; LARA, H. A.; ALVES, R. B.; RESENDE, J. M.;
OLIVEIRA, H. M.; SILVA, L. M.; SANTOS, D. A; FREITAS, R. P. Synthesis of a new
peptide–coumarin conjugate: a potential agent against cryptococcosis. ACS medicinal
chemistry letters, 6(3): 271-275. 2015.
FERRE, R.; BADOSA, E.; FELIU, L.; PLANAS, M.; MONTESINOS, E.; BARDAJI, E.
Inhibition of plant-pathogenic bacteria by short synthetic cecropin a-melittin hybrid peptides.
Applied and Environmental Microbiology, 72(5): 3302-3308. 2006.
FERRE, R.; MELO, M. N.; CORREIA, A. D.; FELIU, L.; BARDAJI, E.; PLANAS, M.;
CASTANHO, M. Synergistic effects of the membrane actions of Cecropin-Melittin
antimicrobial hybrid peptide BP100. Biophysical Journal, 96(5): 1815-1827. 2009.
154
FRANCOLINI, I.; DONELLI, G. Prevention and control of biofilm-based medical-device-
related infections. FEMS Immunology & Medical Microbiology 59(3): 227-238. 2010.
GABRIEL, M.; NAZMI, K.; VEERMAN, E. C.; NIEUW, A. V. A; ZENTNER, A.
Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate
chemistry, 17(2): 548-550. 2006.
GLINEL, K.; JONAS, A. M.; JOUENNE, T.; LEPRINCE, J.; GALAS, L.; HUCK, W. T.
Antibacterial and antifouling polymer brushes incorporating antimicrobial peptide.
Bioconjugate chemistry, 20(1): 71-77. 2009.
GODOY-GALLARDO, M.; MAS-MORUNO, C.; FERNÁNDEZ-CALDERÓN, M. C.;
PÉREZ-GIRALDO, C.; MANERO, J. M.; ALBERICIO, F., GIL, F.; RODRÍGUEZ, D.
Covalent immobilization of hLf1-11 peptide on a titanium surface reduces bacterial adhesion
and biofilm formation. Acta biomaterialia, 10(8): 3522-3534. 2014.
GOMES, A. P.; MANO, J. F.; QUEIROZ, J. A.; GOUVEIA, I. C. Incorporation of
antimicrobial peptides on functionalized cotton gauzes for medical applications.
Carbohydrate Polymers, 127: 451-461. 2015.
GRUNDMANN, H.; AIRES-DE-SOUSA, M.; BOYCE, J.; TIEMERSMA, E. Emergence and
resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet,
368: 874–85. 2006.
GUILHELMELLI, F.; VILELA, N.; ALBUQUERQUE, P.; DERENGOWSKI, L. D. S.;
SILVA-PEREIRA, I.; KYAW, C. M. Antibiotic development challenges: the various
mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. 2013.
GUIMARÃES, D. O.; MOMESSO, L. S.; PUPO, M. T. Antibióticos: importância terapêutica
e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Química Nova, 33(3):
667-679. 2010.
GUNN, J. S. The Salmonella PmrAB regulon: lipopolysaccharide modifications,
antimicrobial peptide resistance and more. Trends in microbiology, 16(6): 284-290. 2008.
GUPTA, S.; RAMAMURTHY, P. C.; MADRAS, G. Synthesis and characterization of
flexible epoxy nanocomposites reinforced with amine functionalized alumina nanoparticles: a
potential encapsulant for organic devices. Polymer Chemistry, 2(1): 221-228. 2011.
GUPTA, V. K.; AGARWAL, S.; SALEH, T. A. Synthesis and characterization of alumina-
coated carbon nanotubes and their application for lead removal. Journal of hazardous
materials, 185(1): 17-23. 2011.
GUSMÃO, K. A.; DOS SANTOS, D. M.; SANTOS, V. M.; CORTÉS, M. E.; REIS, P. V.;
SANTOS, V. L.; PILÓ-VELOSO, D.; VERLY, R. M.; LIMA, M. E.; RESENDE, J. M.
Ocellatin peptides from the skin secretion of the South American frog Leptodactylus
labyrinthicus (Leptodactylidae): characterization, antimicrobial activities and membrane
155
interactions. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical
Diseases, 23(1): 4. 2017.
GUTWEIN, L. G.; WEBSTER, T. J. Osteoblast and chrondrocyte proliferation in the
presence of alumina and titania nanoparticles. Journal of Nanoparticle Research, 4(3): 231-
238. 2002.
HALL, K.; MOZSOLITS, H.; AGUILAR, M. I. Surface plasmon resonance analysis of
antimicrobial peptide–membrane interactions: affinity & mechanism of action. Letters in
Peptide Science, 10(5-6): 475-485, 2003.
HAN, J. H.; TAYLOR, J. D.; PHILLIPS, K. S.; WANG, X.; FENG, P.; CHENG, Q.
Characterizing stability properties of supported bilayer membranes on nanoglassified
substrates using surface plasmon resonance. Langmuir, 24(15): 8127-8133. 2008.
HANCOCK, R. E. W. Collateral damage. Nature Biotechnology 32(1): 66-68. 2014.
HANCOCK, R. E.; SAHL, H.-G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-
infective therapeutic strategies. Nature biotechnology, 24(12): 1551-1557. 2006.
HARDING, J. L.; REYNOLDS, M. M. Combating medical device fouling. Trends in
biotechnology, 32(3): 140-146. 2014.
HASAN, J.; CRAWFORD, R. J.; LVANOVA, E. P. Antibacterial surfaces: the quest for a
new generation of biomaterials. Trends in Biotechnology, 31(5): 31-40. 2013.
HÉQUET, A.; HUMBLOT, V.; BERJEAUD, J.-M.; PRADIER, C.-M. Optimized grafting of
antimicrobial peptides on stainless steel surface and biofilm resistance tests. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, 84(2): 301-309. 2011.
HERNANDEZ-LUCAS, C.; CARBONERO, P.; GARCIA-OLMEDO, F. Identification and
purification of a purothionin homolog from rye (Secale cereale L.). Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 26(4): 794-796. 1978.
HOLMBERG, K. V.; ABDOLHOSSEINI, M.; LI, Y.; CHEN, X.; GORR, S.-U.; APARICIO,
C. Bio-inspired stable antimicrobial peptide coatings for dental applications. Acta
biomaterialia, 9(9): 8224-8231. 2013.
HOTCHKISS, R. D.; DUBOS, R. J. The isolation of bactericidal substances from cultures of
Bacillus brevis. Journal of Biological Chemistry, 141(1): 155-162. 1941.
HUANG, Yibing; HUANG, Jinfeng; CHEN, Yuxin. Alpha-helical cationic antimicrobial
peptides: relationships of structure and function. Protein & cell, 1( 2) 143-152, 2010.
HUDALLA, G. A.; MURPHY, W. L. Immobilization of peptides with distinct biological
activities onto stem cell culture substrates using orthogonal chemistries. Langmuir, 26(9):
6449-6456. 2010.
156
HUMBLOT, V.; YALA, J.-F.; THEBAULT, P.; BOUKERMA, K.; HÉQUET, A.;
BERJEAUD, J.-M.; PRADIER, C.-M. The antibacterial activity of Magainin I immobilized
onto mixed thiols Self-Assembled Monolayers. Biomaterials, 30(21): 3503-3512. 2009.
HWANG, P. M.; ZHOU, N.; SHAN, X.; ARROWSMITH, C. H.; VOGEL, H. J. Three-
dimensional solution structure of lactoferricin B, an antimicrobial peptide derived from
bovine lactoferrin. Biochemistry, 37(12), 4288-4298. 1998.
INGHAM, C. J.; TER MAAT, J.; DE VOS, W. M. Where bio meets nano: The many uses for
nanoporous aluminum oxide in biotechnology. Biotechnology Advances, 30(5): 1089-1099.
2012.
INGHAM, E.; FISHER, J. The role of macrophages in osteolysis of total joint
replacement. Biomaterials, 26(11): 1271-1286. 2005.
JALAL, M.; ANSARI, M. A.; SHUKLA, A. K.; ALI, S. G.; KHAN, H. M., PAL, R.; ALAM,
J.; CAMEOTRA, S. S. Green synthesis and antifungal activity of Al 2 O 3 NPs against
fluconazole-resistant Candida spp isolated from a tertiary care hospital. RSC
Advances, 6(109): 107577-107590. 2016.
JENSSEN, H.; HAMILL, P.; HANCOCK, R. E. W. Peptide antimicrobial agents. Clinical
Microbiology Reviews, 19(3): 491-+. 2006.
JOHANSSON, L.; THULIN, P.; SENDI, P.; HERTZÉN, E.; LINDER, A.; ÅKESSON, P.;
LOW, D. E.; AGERBERTH, B.; NORRBY-TEGLUND, A. Cathelicidin LL-37 in severe
Streptococcus pyogenes soft tissue infections in humans. Infection and immunity, 76(8):
3399-3404. 2008.
JOHNS, I. B.; MCELHILL, E. A.; SMITH, J. O. Thermal Stability of Some Organic
Compounds. Journal of Chemical and Engineering Data, 7(2): 277-281. 1962.
JUNIOR, E. F.; GUIMARÃES, C. F.; FRANCO, L. L.; ALVES, R. J.; KATO, K. C.;
MARTINS, H. R.; FILHO, J. D. S.; BEMQUERER, M. P.; MUNHOZ, V. H.; RESENDE, J.
M.; VERLY, R. M. Glycotriazole-peptides derived from the peptide HSP1: synergistic effect
of triazole and saccharide rings on the antifungal activity. Amino acids, 49(8): 1389-1400.
2017.
KAMIMORI, H.; HALL, K.; CRAIK, D. J.; AGUILAR, M. I. Studies on the membrane
interactions of the cyclotides kalata B1 and kalata B6 on model membrane systems by surface
plasmon resonance. Analytical biochemistry, 337(1): 149-153. 2005.
KANG, S. J.; PARK, S. J.; MISHIG-OCHIR, T.; LEE, B. J. Antimicrobial peptides:
therapeutic potentials. Expert Review of Anti-Infective Therapy, 12(12): 1477-1486. 2014.
KATHIRVEL, P.; CHANDRASEKARAN, J.; MANOHARAN, D.; KUMAR, S. Preparation
and characterization of alpha alumina nanoparticles by in-flight oxidation of flame synthesis.
Journal of Alloys and Compounds, 590: 341-345. 2014.
157
KAZEMZADEH-NARBAT, M.; LAI, B. F.; DING, C.; KIZHAKKEDATHU, J. N.;
HANCOCK, R. E.; WANG, R. Multilayered coating on titanium for controlled release of
antimicrobial peptides for the prevention of implant-associated infections. Biomaterials,
34(24): 5969-5977. 2013.
KELLY, M.; JESS, T. J.; PRICE, N. C. How to study proteins by circular
dichroism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1751(2): 119-
139. 2005.
KHANG, D.; LIU-SNYDER, P.; PARETA, R.; LU, J.; WEBSTER, T. J. Reduced responses
of macrophages on nanometer surface features of altered alumina crystalline phases. Acta
biomaterialia, 5(5): 1425-1432. 2009.
KIRBY, C.; GREGORIADIS, G. Dehydration-rehydration vesicles - a simple method for
high-yield drug entrapment in liposomes. Bio-Technology, 2(11): 979-984. 1984.
KUMERIA, T.; SANTOS, A.; LOSIC, D. Nanoporous anodic alumina platforms: engineered
surface chemistry and structure for optical sensing applications. Sensors, 14(7): 11878-
11918. 2014.
LEE, H.; JEONG, J. H.; PARK, T. G. PEG grafted polylysine with fusogenic peptide for gene
delivery: high transfection efficiency with low cytotoxicity. Journal of Controlled Release,
79(1): 283-291. 2002.
LEGRAND, B.; LAURENCIN, M.; SARKIS, J.; DUVAL, E.; MOURET, L.; HUBERT, J.
F., COLLEN, M.; VIÉ, V.; ZATYLNY-GAUDIN, C.; HENRY, J.; BAUDY-FLOC’H, M.;
BONDON, A. Structure and mechanism of action of a de novo antimicrobial detergent-like
peptide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1808(1): 106-116. 2011.
LI, Y.; XIANG, Q.; ZHANG, Q.; HUANG, Y.; SU, Z. Overview on the recent study of
antimicrobial peptides: origins, functions, relative mechanisms and
application. Peptides, 37(2): 207-215. 2012.
LIU, S.; CHEN, C., LIU, Q.; ZHUO, Y.; YUAN, D.; DAI, Z.; BAO, J. Two-dimensional
porous γ-AlOOH and γ-Al 2 O 3 nanosheets: hydrothermal synthesis, formation mechanism
and catalytic performance. RSC Advances, 5(88): 71728-71734. 2015.
LLOBET, E.; TOMAS, J. M.; BENGOECHEA, J. A. Capsule polysaccharide is a bacterial
decoy for antimicrobial peptides. Microbiology, 154(12): 3877-3886. 2008.
LOHNER, K.. Membrane-active antimicrobial peptides as template structures for novel
antibiotic agents. Current topics in medicinal chemistry, 17(5): 508-519, 2017.
LOMBARDI, L.; STELLATO, M. I.; OLIVA, R.; FALANGA, A.; GALDIERO, M.;
PETRACCONE, L.; D’ERRICO, G.; SANTIS, A.;GALDIERO, S.; DEL VECCHIO, P.
Antimicrobial peptides at work: interaction of myxinidin and its mutant WMR with lipid
bilayers mimicking the P. aeruginosa and E. coli membranes. Scientific Reports, 7, 44425.
2017.
158
MA, M.; KAZEMZADEH‐NARBAT, M.; HUI, Y.; LU, S.; DING, C.; CHEN, D. D.,
HANCOCK, R. E. W.; WANG, R. Local delivery of antimicrobial peptides using self‐organized TiO2 nanotube arrays for peri‐implant infections. Journal of Biomedical
Materials Research Part A, 100(2): 278-285. 2012.
MANZINI, M. C.; PEREZ, K. R.; RISKE, K. A.; BOZELLI, J. C.; SANTOS, T. L.; DA
SILVA, M. A.; SARAIVA, G. K. V.; POLITI, M. J.; VALENTE, A. P.; ALMEIDA, F. C. L.;
CHAIMOVICH, H.; RODRIGUES, M. A.; BEMQUERER, M. P.; SCHREIER, S.;
CUCCOVIA, I. M. Peptide:lipid ratio and membrane surface charge determine the
mechanism of action of the antimicrobial peptide BP100. Conformational and functional
studies. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1838(7): 1985-1999. 2014.
MARTINEZ, G.; MILLHAUSER, G. FTIR spectroscopy of alanine-based peptides:
assignment of the amide modes for random coil and helix. Journal of structural biology,
114(1): 23-27. 1995.
MARTIN, O. A.; VILLEGAS, M. E.; VILA, J. A.; SCHERAGA, H. A. Analysis of 13
Cα and 13
Cβ chemical shifts of cysteine and cysteine residues in proteins: a quantum chemical
approach. Journal of biomolecular NMR, 46(3): 217-225. 2010.
MA, M.; KAZEMZADEH-NARBAT, M.; HUI, Y.; LU, S.; DING, C.; CHEN, D. D. Y.,
HANCOCK, R> E. W.; WANG, R. Local delivery of antimicrobial peptides using self‐organized TiO2 nanotube arrays for peri‐implant infections. Journal of Biomedical
Materials Research Part A, 100(2): 278-285. 2012.
MEIRA, S. M. M.; ZEHETMEYER, G.; WERNER, J. O.; BRANDELLI, A. A novel active
packaging material based on starch-halloysite nanocomposites incorporating antimicrobial
peptides. Food Hydrocolloids, 63: 561-570. 2017.
MIHAJLOVIC, M.; LAZARIDIS, T. Antimicrobial peptides in toroidal and cylindrical
pores. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1798(8): 1485-1493. 2010.
MISHRA, B.; LUSHNIKOVA, T.; GOLLA, R. M.; WANG, X.; WANG, G. Design and
surface immobilization of short anti-biofilm peptides. Acta biomaterialia, 49: 316-328. 2017.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival - application to
proliferation and cyto-toxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65(1-2): 55-63.
1983.
MOURO, C.; GOUVEIA, I. C. Antimicrobial functionalization of wool: assessment of the
effect of Cecropin-B and [Ala5]-Tritrp7 antimicrobial peptides. The Journal of The Textile
Institute, 107(12): 1575-1583. 2016.
MURPHY, J. B.; KIES, M. W. Note on spectrophotometric determination of proteins in dilute
solutions. Biochimica Et Biophysica Acta, 45(2): 382-384. 1960.
MUSSANO, F.; GENOVA, T.; SERRA, F. G.; CAROSSA, M.; MUNARON, L.;
CAROSSA, S. Nano-Pore Size of Alumina Affects Osteoblastic Response. International
journal of molecular sciences, 19(2): 528. 2018.
159
NCCLS. Manual Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution
Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard -
Ninth Edition. CLSI document M07-A9. 2012.
NCCLS. Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da
Sensibilidade a Terapia Antifúngica das Leveduras. Norma Aprovada - Segunda Edição.
NCCLS document M27-A2 [ISBN 1-56238-469-4], 22(15). 2002.
NITHYA, V.; MURTHY, P. S. K.; HALAMI, P. M. Development and application of active
films for food packaging using antibacterial peptide of Bacillus licheniformis Me1. Journal
of Applied Microbiology, 115(2): 475-483. 2013.
NIU, C.; DANIELS, R. H.; DUBROW, R. S.; GOLDMAN, J. L. US 20080073505A1, 27
Mar. 2008.
NOROWSKI, P. A.; BUMGARDNER, J. D. Biomaterial and antibiotic strategies for peri‐implantitis: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied
Biomaterials, 88(2): 530-543. 2009.
OGIHARA, N.; USUI, Y.; AOKI, K.; SHIMIZU, M.; NARITA, N.; HARA, K.;
NAKAMURA, K.; ISHIGAKI, N.; TAKANASHI, S.; OKAMOTO, M. Biocompatibility and
bone tissue compatibility of alumina ceramics reinforced with carbon nanotubes.
Nanomedicine, 7(7): 981-993. 2012
OMARDIEN, S.; BRUL, S.; ZAAT, S. A. J. Antimicrobial activity of cationic antimicrobial
peptides against gram-positives: current progress made in understanding the mode of action
and the response of bacteria. Frontiers in cell and developmental biology, 4: 111. 2016.
PAPO, N.; SHAI, Y.. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon
resonance: differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic
peptides. Biochemistry, 42(2): 458-466. 2003.
PARIDA, K. M.; PRADHAN, A. C.; DAS, J.; SAHU, N. Synthesis and characterization of
nano-sized porous gamma-alumina by control precipitation method. Materials Chemistry
and Physics 113(1): 244-248. 2009.
PARK, S. C.; PARK, Y.; HAHM, K. S. The role of antimicrobial peptides in preventing
multidrug-resistant bacterial infections and biofilm formation. International journal of
molecular sciences, 12(9): 5971-5992. 2011.
PESCHEL, A.; SAHL, H.-G. The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and
microbial resistance. Nature Reviews Microbiology, 4(7): 529-536. 2006.
PIRES, D. A. T.; BEMQUERER, M. P.; DO NASCIMENTO, C. J. Some mechanistic aspects
on Fmoc solid phase peptide synthesis. International Journal of Peptide Research and
Therapeutics, 20(1): 53-69. 2014.
160
POTDAR, H. S.; JUN, K. W.; BAE, J. W.; KIM, S. M.; LEE, Y. J. Synthesis of nano-sized
porous gamma-alumina powder via a precipitation/digestion route. Applied Catalysis a-
General, 321(2): 109-116. 2007.
POWERS, J. P. S.; HANCOCK, R. E. W. The relationship between peptide structure and
antibacterial activity. Peptides, 24(11): 1681-1691. 2003.
PUJARI, S. P.; SCHERES, L.; MARCELIS, A. T. M.; ZUILHOF, H. Covalent surface
modification of oxide surfaces. Angewandte Chemie-International Edition, 53(25): 6322-
6356. 2014.
QI, X.; ZHOU, C.; LI, P.; XU, W.; CAO, Y.; LING, H.; CHEN, W. N.; LI, C. M.; XU, R.;
LAMRANI, M.; MU, Y.; LEONG, S. S. J.; CHANG, M. W.; CHAN-PARK, M. B. Novel
short antibacterial and antifungal peptides with low cytotoxicity: efficacy and action
mechanisms. Biochemical and biophysical research communications, 398(3): 594-600.
2010.
QUEIROZ, G.M.; SOUZA, M. M.; CARVALHO, T. C.; CASEMIRO, L. A.; CUNHA, W.
R.; MARTINS, C. H. G. Absence of the antibacterial activity of the crude extracts and
compounds isolated from M. rubiginosa against extended-spectrum β-lactamase producing
enterobacteria. Journal of Pharmaceutical Negative Results, 2(1): 1-7. 2011.
RAILEAN-PLUGARU, V.; POMASTOWSKI, P.; WYPIJ, M.; SZULTKA-MLYNSKA, M.;
RAFINSKA, K.; GOLINSKA, P.; DAHM, H.; BUSZEWSKI, B. Study of silver
nanoparticles synthesized by acidophilic strain of Actinobacteria isolated from the of Picea
sitchensis forest soil. Journal of Applied Microbiology, 120(5): 1250-1263. 2016.
RAMESH, S.; SIVASAMY, A.; RHEE, K.; PARK, S.; HUI, D. Preparation and
characterization of maleimide–polystyrene/SiO 2–Al 2 O 3 hybrid nanocomposites by an in
situ sol–gel process and its antimicrobial activity. Composites Part B: Engineering, 75: 167-
175. 2015.
RAUTENBACH, M.; TROSKIE, A. M.; VOSLOO, J. A. Antifungal peptides: To be or not to
be membrane active. Biochimie, 130: 132-145. 2016.
RESENDE, J. M.; MORAES, C. M.: MUNHOZ, V. H.; AISENBREY, C; VERLY, R. M.;
BERTANI, P.; CESAR, A.; PILÓ-VELOSO, D.; Bechinger, B. Membrane structure and
conformational changes of the antibiotic heterodimeric peptide distinctin by solid-state NMR
spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(39): 16639-16644.
2009.
SAAR-DOVER, R.; BITLER, A.; NEZER, R.; SHMUEL-GALIA, L.; FIRON, A.;
SHIMONI, E.; TRIEU-CUOT, P.; SHAI, Y. D-alanylation of lipoteichoic acids confers
resistance to cationic peptides in group B streptococcus by increasing the cell wall density.
PLoS Pathog, 8(9): e1002891. 2012.
161
SADIQ, I. M.; CHOWDHURY, B.; CHANDRASEKARAN, N. Antimicrobial sensitivity of
Escherichia coli to alumina nanoparticles. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and
Medicine, 5(3): 282-286. 2009.
SAHU, S.; LYNN, W. S. Lipid composition of human alveolar macrophages. Inflammation,
2(2): 83-91. 1977.
SÁNCHEZ, A.; VÁZQUEZ, A.. Bioactive peptides: A review. Food Quality and Safety,
1(1): 29-46. 2017.
SANI, M. A.; SEPAROVIC, F.. How membrane-active peptides get into lipid
membranes. Accounts of chemical research, 49(6): 1130-1138. 2016.
SAPSFORD, K. E.; ALGAR, W. R.; BERTI, L.; GEMMILL, K. B.; CASEY, B. J.; OH, E.;
STEWART, M. H.; MEDINTZ, I. L. Functionalizing nanoparticles with biological molecules:
developing chemistries that facilitate nanotechnology. Chemical Reviews, 113(3): 1904-
2074. 2013.
SARGES, R.; WITKOP, B. Gramicidin .7. Structure of valine- and isoleucine-gramicidin B.
Journal of the American Chemical Society, 87(9): 2027-. 1965a.
SARGES, R.; WITKOP, B. Gramicidin .8. Structure of valine- and isoleucine-gramicidin C.
Biochemistry, 4(11): 2491-. 1965b.
SARGES, R.; WITKOP, B. Gramicidin A .V. Structure of valine- and isoleucine-gramicidin
A. Journal of the American Chemical Society, 87(9): 2011-. 1965c.
SAVADEKAR, N. R.; KADAM, P. G.; MHASKE, S. T. Studies on the effect of nano-
alumina on the performance properties of poly (butylene adipate-co-terephthalate) composite
films. Journal of Thermoplastic Composite Materials, 28(11): 1522-1536. 2015.
SCHMIDTCHEN, A.; PASUPULETI, M.; MALMSTEN, M. Effect of hydrophobic
modifications in antimicrobial peptides. Advances in colloid and interface science, 205:
265-274. 2014.
SCHREIER, S.; MANZINI, M. C.; PEREZ, K. R.; RISKE, K. A.; BOZELLI, J. C.; POLITI,
M. J.; VALENTE, A. P.; ALMEIDA, F. C.; CHAIMOVICH, H.; RODRIGUES, M. A.;
BEMQUERER, M. P.; CUCCOVIA, I. M. Peptide:lipid ratio and membrane surface charge
modulate the mechanism of action of the antimicrobial peptide BP100. Biophysical Journal,
106(2): 441A-441A. 2014.
SEDEL, L.; RAOULD, A. Engineering aspect of alumina on alumina hip prosthesis.
Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering
in Medicine, 221(1): 21-27. 2007.
SEQUEIRA, S.; FERNANDES, M. H.; NEVES N.; ALMEIDA, M. M. Development and
characterization of zirconia–alumina composites for orthopedic implants. Ceramics
International, 43(1): 693-703. 2017.
162
SEZGIN, E.; LEVENTAL, I.; MAYOR, S.; EGGELING, C. The mystery of membrane
organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular
Cell Biology, 18(6): 361. 2017.
SHAI, Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Peptide Science, 66(4):
236-248. 2002.
SHARMA, D.; RAJARATHNAM, K. 13
C NMR chemical shifts can predict disulfide bond
formation. Journal of biomolecular NMR, 18(2): 165-171. 2000.
SHENASHEN, M.; DERBALAH, A.; HAMZA, A.; MOHAMED, A.; EL SAFTY, S.
Antifungal activity of fabricated mesoporous alumina nanoparticles against root rot disease of
tomato caused by Fusarium oxysporium. Pest management science, 73(6): 1121-1126. 2017.
SHI, L.; WANG, L.; CHEN, J.; CHEN, J.; REN, L.; SHI, X.; WANG, Y. Applied Materials
Today 5: 111-117. 2016.
SHIRAI, T.; SHIMIZU, T.; OHTANI, K.; ZEN, Y.; TAKAYA, M.; TSUCHIYA, H.
Antibacterial iodine-supported titanium implants. Acta Biomaterialia, 7(4): 1928-1933.
2011.
SIANO, A.; HÚMPOLA, M. V.; DE OLIVEIRA, E.; ALBERICIO, F.; SIMONETTA, A. C.;
LAJMANOVICH, R.; TONARELLI, G. G. Antimicrobial peptides from skin secretions of
Hypsiboas pulchellus (Anura: Hylidae). Journal of natural products, 77(4): 831-841. 2014.
SIMMACO, M.; BARRA, D.; CHIARINI, F.; NOVIELLO, L.; MELCHIORRI, P.; KREIL,
G.; RICHTER, K. A family of bombinin‐related peptides from the skin of Bombina variegata. European Journal of Biochemistry, 199(1): 217-222. 1991.
STEINER, H. Secondary structure of the cecropins: antibacterial peptides from the moth
Hyalophora cecropia. FEBS letters, 137(2): 283-287. 1982.
STELZIG, S. H.; MENNEKING, C.; HOFFMANN, M. S.; EISELE, K.; BARCIKOWSKI,
S.; KLAPPER, M.; MÜLLEN, K. Compatibilization of laser generated antibacterial Ag-and
Cu-nanoparticles for perfluorinated implant materials. European Polymer Journal, 47(4):
662-667. 2011.
STEWART, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium
ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry, 104(1): 10-14. 1980.
SUDHEENDRA, U. S.; DHOPLE, V.; DATTA, A.; KAR, R. K.; SHELBURNE, C. E.;
BHUNIA, A.; RAMAMOORTHY, A. Membrane disruptive antimicrobial activities of human
β-defensin-3 analogs. European journal of medicinal chemistry, 91: 91-99. 2015.
SUN, X.; XU, P.; ZHANG, Z. 1H and
13C NMR spectroscopy of substituted 1, 2, 3‐
triazoles. Magnetic resonance in chemistry, 36(6): 459-460. 1998.
163
SUPPAKUL, P.; MILTZ, J.; SONNEVELD, K.; BIGGER, S. W. Active packaging
technologies with an emphasis on antimicrobial packaging and its applications. Journal of
food science, 68(2): 408-420. 2003.
SWAN, E. E. L.; POPAT, K. C.; DESAI, T. A. Peptide-immobilized nanoporous alumina
membranes for enhanced osteoblast adhesion. Biomaterials 26(14): 1969-1976. 2005.
TAHER, A.; NANDI, D.; ISLAM, R. U.; CHOUDHARY, M.; MALLICK, k. Microw ave
assisted azide–alkyne cycloaddition reaction using polymer supported Cu (I) as a catalytic
species: a solventless approach. RSC Advances, 5(59): 47275-47283, 2015.
TANG, D.; LIM, H.-B.; LEE, K.-J.; LEE, C.-H.; CHO, W.-S. Evaluation of mechanical
reliability of zirconia-toughened alumina composites for dental implants. Ceramics
International, 38(3): 2429-2436. 2012.
TAXIS, J.; MOEST, T.; PEDIMONTE, B. J.; SCHLEGEL, K. A.; NEUKAM, F. W.; VON
WILMOWSKY, C. Nanoporous Anodic Alumina Surfaces Affect Fibro‐and Osteoblasts in Opposite Ways. Advanced Engineering Materials, 18(2): 333-340. 2016.
TEIXEIRA, V.; FEIO, M. J.; BASTOS, M. Role of lipids in the interaction of antimicrobial
peptides with membranes. Progress in lipid research, 51(2): 149-177, 2012.
TERWILLIGER, T. C.; EISENBERG, D. The structure of melittin. I. Structure determination
and partial refinement. Journal of Biological Chemistry, 257(11): 6010-6015. 1982.
THERY, T.; O'CALLAGHAN, Y.; O'BRIEN, N.; ARENDT, E. K. Optimisation of the
antifungal potency of the amidated peptide H-Orn-Orn-Trp-Trp-NH2 against food
contaminants. International journal of food microbiology, 265: 40-48. 2018.
TORCATO, I. M.; HUANG, Y. H.; FRANQUELIM, H. G.; GASPAR, D.; CRAIK, D. J.;
CASTANHO, M.; S. T. Design and characterization of novel antimicrobial peptides, R-
BP100 and RW-BP100, with activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria.
Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1828(3): 944-955. 2013.
TORRES, L. M. F. C.; BRAGA, N. A.; GOMES, I. P.; ALMEIDA, M. T.; SANTOS, T. L.;
DE MESQUITA, J. P., DA SILVA, L. M.; MARTINS, H. R.; KATO, K. C.; DOS SANTOS,
W. T. P.; RESENDE, J. M; PEREIRA, M. C.; BEMQUERER, M. P.; RODRIGUES, M. A.;
VERLY, R. M. Nanobiostructure of Fibrous-Like Alumina Functionalized with an Analog of
the BP100 Peptide: Synthesis, Characterization and Biological Applications. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, 163: 275-283. 2018.
TROLL, W.; CANNAN, R. K. A modified photometric ninhydrin method for the analysis of
amino and imino acids. Journal of Biological Chemistry, 200(2): 803-811. 1953.
TURCHENIUK, V., V. RAKS, R. ISSA, I. R. COOPER, P. J. CRAGG, R. JIJIE, N.
DUMITRASCU, L. I. MIKHALOVSKA, A. BARRAS, V. ZAITSEV, R. BOUKHERROUB
AND S. SZUNERITS. Antimicrobial activity of menthol modified nanodiamond particles.
Diamond and Related Materials, 57: 2-8. 2015.
164
VAN DER WEERDEN, N. L.; HANCOCK, R. E. W.; ANDERSON, M. A. Permeabilization
of fungal hyphae by the plant defensin NaD1 occurs through a cell wall-dependent
process. Journal of Biological Chemistry, 285(48): 37513-37520. 2010.
VEERACHAMY, S.; YARLAGADDA, T.; MANIVASAGAM, G.; YARLAGADDA, P. K.
Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: a review. Proceedings of the
Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine, 228(10): 1083-1099. 2014.
VERLY, R. M.; DE MORAES, C. M.; RESENDE, J. M.; AISENBREY, C.; BEMQUERER,
M. P.; PILÓ-VELOSO, D.; VALENTE, A. P.; ALMEIDA, F. C.; BECHINGER, B. Structure
and membrane interactions of the antibiotic peptide dermadistinctin K by multidimensional
solution and oriented 15 N and 31 P solid-state NMR spectroscopy. Biophysical journal,
96(6): 2194-2203. 2009.
VERLY, R. M.; RESENDE, J. M.; JUNIOR, E. F.; DE MAGALHÃES, M. T.;
GUIMARÃES, C. F.; MUNHOZ, V. H.; BEMQUERER, M. P.; ALMEIDA, F. C. L.;
SANTORO, M. M.; PILÓ-VELOSO, D.; Bechinger, B. Structure and membrane interactions
of the homodimeric antibiotic peptide homotarsinin. Scientific reports, 7: 40854. 2017.
VERLY, R. M.; RODRIGUES, M. A.; DAGHASTANLI, K. R. P.; DENADAI, A. M. L.;
CUCCOVIA, I. M.; BLOCH, C.; FREZARD, F.; SANTORO, M. M.; PILO-VELOSO, D.;
BEMQUERER, M. P. Effect of cholesterol on the interaction of the amphibian antimicrobial
peptide DD K with liposomes. Peptides, 29(1): 15-24. 2008.
WADHWANI, P.; STRANDBERG, E.; VAN DEN BERG, J.; MINK, C.; BÜRCK, J.;
CIRIELLO, R. A.; ULRICH, A. S. Dynamical structure of the short multifunctional peptide
BP100 in membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1838(3):
940-949. 2014.
WANG, G. S.; LI, X.; WANG, Z. APD3: the antimicrobial peptide database as a tool for
research and education. Nucleic Acids Research, 44(D1): D1087-D1093. 2016.
WEBSTER, T. J.; SIEGEL, R. W.; BIZIOS, R. Nanostructured ceramics and composite
materials for orthopaedic-dental implants. US 6270347B1, 7 Ago. 2001.
WEBSTER, T. J.; TEPPER, F. Osteointegration device and method. US 20030059742A1, 27
Mar. 2003.
WEBSTER, Thomas J.; SIEGEL, Richard W.; BIZIOS, Rena. Osteoblast adhesion on
nanophase ceramics. Biomaterials, v. 20, n. 13, p. 1221-1227, 1999.
WILLCOX, M. D. P.; HUME, E. B. H.; ALIWARGA, Y.; KUMAR, N.; COLE, N. A novel
cationic-peptide coating for the prevention of microbial colonization on contact lenses.
Journal of Applied Microbiology, 105(6): 1817-1825. 2008.
165
WORRELL, B. T.; MALIK, J. A.; FOKIN, V. V. Direct evidence of a dinuclear copper
intermediate in Cu (I)-catalyzed azide-alkyne cycloadditions. Science: 1229506, 2013.
XIE, C. M.; LU, X.; WANG, K. F.; MENG, F. Z.; JIANG, O.; ZHANG, H. P.; ZHI, W.;
FANG, L. M. Silver nanoparticles and growth factors incorporated hydroxyapatite coatings
on metallic implant surfaces for enhancement of osteoinductivity and antibacterial
properties. ACS applied materials & interfaces, 6(11): 8580-8589. 2014.
YANG, L.; HARROUN, T. A.; WEISS, T. M.; DING, L.; HUANG, H. W. Barrel-stave
model or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophysical journal, 81(3): 1475-
1485. 2001.
YAZDANMEHR, M.; ASADABADI, S. J.; NOURMOHAMMADI, A.; GHASEMZADEH,
M.; REZVANIAN, M. Electronic structure and bandgap of γ-Al 2 O 3 compound using mBJ
exchange potential. Nanoscale research letters, 7(1): 488. 2012.
YAZICI, H.; O’NEILL, M. B.; KACAR, T.; WILSON, B. R.; OREN, E. E.; SARIKAYA,
M.; TAMERLER, C. Engineered chimeric peptides as antimicrobial surface coating agents
toward infection-free implants. ACS applied materials & interfaces, 8(8): 5070-5081. 2016.
YOUN, H.-S.; JYOTI, M. A.; KWAK, K.-A.; SEO, H.-S.; LEE, B.-T.; SONG, H.-Y.
Enhanced osteoconduction and angiogenesis of a three dimensional continuously porous
Al2O3 implant. Materials Science and Engineering: C, 31(7): 1458-1465. 2011.
YU, K.; LO, J. C. Y.; MEI, Y.; HANEY, E. F.; SIREN, E.; KALATHOTTUKAREN, M. T.;
HANCOCK, R. E. W.; LANGE, D.; KIZHAKKEDATHU, J. N. Toward infection-resistant
surfaces: achieving high antimicrobial peptide potency by modulating the functionality of
polymer brush and peptide. Acs Applied Materials & Interfaces, 7(51): 28591-28605. 2015.
YU, K.; LO, J. C.; YAN, M.; YANG, X.; BROOKS, D. E.; HANCOCK, R. E.; LANGE, D.;
KIZHAKKEDATHU, J. N. Anti-adhesive antimicrobial peptide coating prevents catheter
associated infection in a mouse urinary infection model. Biomaterials, 116: 69-81. 2017.
ZASLOFF, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, 415(6870): 389-
395. 2002.
ZHANG, L.; WU, Y.; ZHANG, L.; WANG, Y.; LI, M. Synthesis and characterization of
mesoporous alumina with high specific area via coprecipitation method. Vacuum, 133:1-6.
2016.
ZHANG, H. Z.; WEI, J. J.; KUMAR, K. V.; RASHEED, S.; ZHOU, C. H. Synthesis and
biological evaluation of novel d-glucose-derived 1, 2, 3-triazoles as potential antibacterial and
antifungal agents. Medicinal Chemistry Research, 24(1): 182-196. 2015.
ZHANG, Y. P.; LEWIS, R. N.; HODGES, R. S.; MCELHANEY, R. N. FTIR spectroscopic
studies of the conformation and amide hydrogen exchange of a peptide model of the
hydrophobic transmembrane. alpha.-helixes of membrane proteins. Biochemistry, 31(46):
11572-11578. 1992a.
166
ZHANG, Y. P.; LEWIS, R. N.; HODGES, R. S.; MCELHANEY, R. N. Interaction of a
peptide model of a hydrophobic transmembrane. alpha.-helical segment of a membrane
protein with phosphatidylcholine bilayers: Differential scanning calorimetric and FTIR
spectroscopic studies. Biochemistry, 31(46): 11579-11588. 1992b.
ZHAO, J.; ZHAO, X.; JIANG, Z.; LI, Z.: FAN, X.; ZHU, J.; WU, H.; SU, Y.; YANG, D.;
PAN, F.; SHI, J. Biomimetic and bioinspired membranes: preparation and
application. Progress in Polymer Science, 39(9): 1668-1720. 2014.
ZHOU, H. C.; WANG, Y. Recent researches in triazole compounds as medicinal
drugs. Current medicinal chemistry, 19(2): 239-280. 2012.
ZHOU, L.; LAI, Y.; HUANG, W.; HUANG, S.; XU, Z.; CHEN, J.; WU, D.
Biofunctionalization of microgroove titanium surfaces with an antimicrobial peptide to
enhance their bactericidal activity and cytocompatibility. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, 128: 552-560. 2015.
ZHOU, W.; DONG, J. H.; QIU, K. Y.; WEI, Y. Effect of 3‐aminopropyltriethoxysilane on
properties of poly (butyl acrylate‐co‐maleic anhydride)/silica hybrid materials. Journal of
applied polymer science, 73(3): 419-424. 1999.
ZHU, J. H.; WEI, S. Y.; ZHANG, L.; MAO, Y. B.; RYU, J. E.; HALDOLAARACHCHIGE,
N.; YOUNG, D. P.; GUO, Z. H. Electrical and dielectric properties of polyaniline-Al2O3
nanocomposites derived from various Al2O3 nanostructures. Journal of Materials
Chemistry, 21(11): 3952-3959. 2011.
167
ANEXO I
Estrutura química de alguns fosfolipídeos
168
169
ANEXO II
Tabela 17 - Estrutura química dos 20 aminoácidos essenciais
Aminoácido
Abreviatura
(Símbolo)
Estrutura química
Aminoácido
Abreviatura
(Símbolo)
Estrutura química
Alanina
Ala
(A)
O
NH3
+
CH3 O
-
Arginina
Arg
(R)
NH
O
NH
NH2
NH3
+O
-
Asparagina Asn
(N)
O
O
NH2
NH3
+O
-
Ácido Aspártico
Asp
(D)
O-OH
NH3
+O
O
Cisteína
Cys
(C)
O
NH3
+SH O
-
Ácido
Glutâmico
Glu
(E)
O O
O-
OH
NH3
+
Valina
Val
(V)
O
NH3
+
CH3
CH3
O-
Glutamina
Gln
(Q)
O
O
NH2
NH3
+O
-
Glicina
Gly
(G)
O
NH3
+
O-
Histidina
His
(H)
O
NH3
+
N
NH
O-
Isoleucina
Ile
(I)
O
NH3
+
CH3
CH3 O
-
Tirosina
Tyr
(Y)
O
NH3
+
OH
O-
Leucina
Leu
(L)
O
NH3
+
CH3
CH3
O-
Lisina
Lys
(K)
O
NH3
+
NH2 O
-
Prolina
Pro
(P)
O
NH
2+
O-
Metionina
Met
(M)
O
NH3
+
SCH
3O
-
170
Serina
Ser
(S)
O
NH3
+OH O
-
Fenilalanina
Phe
(F)
O
NH3
+O
-
Treonina
Thr
(T)
O
NH3
+OH
CH3
O-
Triptofano
Trp
(W)
O
NH3
+
NH
O-
171
ANEXO III
Tabelas de íons fragmento das séries b e y determinados térica e experimentalmente
para os peptídeos BP100, EAAA-BP100, CAAA-BP100, [Pra]GAAA-BP100 e [Trz-β-
A1]AAA-BP100
Tabela 18 - Íons fragmento das séries b e y do peptídeo BP100 – Massa monoisotópica: 1419,959.
Série b Série y
íon Sequência Teórico Observado íon Sequência Teórico Observado b1 K- 129,092 129,16 y1 -L 132,100 n.o. b2 KK- 257,187 257,35 y2 -YL 295,163 n.o.
b3 KKL- 370,271 370,49 y3 -KYL 423,258 422,50
b4 KKLF- 517,339 517,64 y4 -LKYL 536,342 535,64
b5 KKLFK- 645,434 645,72 y5 -ILKYL 649,426 n.o. b6 KKLFKK- 773,529 773,75 y6 -KILKYL 777,521 776,76
b7 KKLFKKI- 886,613 886,81 y7 -KKILKYL 905,616 905,71
b8 KKLFKKIL- 999,697 999,84 y8 -FKKILKYL 1052,685 1052,85
b9 KKLFKKILK- 1127,792 1127,90 y9 -LFKKILKYL 1165,769 1164,87
b10 KKLFKKILKY- 1290,856 1290,81 y10 -KLFKKILKYL 1293,864 1293,15
KKLFKKILKYL 1403,940 1403,67 KKLFKKILKYL 1420,959 1420,98
n.o.: não observado
Tabela 19 - Íons fragmento das séries b e y do peptídeo EAAA-BP100 – Massa monoisotópica: 1762,113.
Série b Série y
íon Sequência Teórico Observado íon Sequência Teórico Observado
b1 E- 130,0393 129,13 y1 -L 132,1 n.o.
b2 EA- 201,0763 200,24 y2 -YL 295,163 n.o. b3 EAA- 272,1133 272,26 y3 -KYL 423,258 422,43
b4 EAAA- 343,1503 343,28 y4 -LKYL 536,342 n.o.
b5 EAAAK- 471,2453 470,45 y5 -ILKYL 649,426 n.o.
b6 EAAAKK- 599,3403 599,55 y6 -KILKYL 777,521 776,84
b7 EAAAKKL- 712,4253 712,68 y7 -KKILKYL 905,616 904,96
b8 EAAAKKLF- 859,4933 859,86 y8 -FKKILKYL 1052,685 1052,05
b9 EAAAKKLFK- 987,5883 987,94 y9 -LFKKILKYL 1165,769 1165,12
b10 EAAAKKLFKK- 1115,683 1116,04 y10 -KLFKKILKYL 1293,864 1293,14
b11 EAAAKKLFKKI- 1228,767 1229,07 y11 -KKLFKKILKYL 1421,959 n.o.
b12 EAAAKKLFKKIL- 1341,851 1342,03 y12 -AKKLFKKILKYL 1492,996 n.o.
b13 EAAAKKLFKKILK- 1469,946 1469,99 y13 -AAKKLFKKILKYL 1564,033 n.o. b14 EAAAKKLFKKILKY- 1633,009 1633,38 y14 -AAAKKLFKKILKYL 1635,07 1634,47
EAAAKKLFKKILKYL 1746,094 n.o. -EAAAKKLFKKILKYL 1763,113 1763,10
n.o.: não observado
Tabela 20 - Íons fragmento das séries b e y do peptídeo CAAA-BP100 – Massa monoisotópica: 1736,079.
Série b Série y
íon Sequência Teórico Observado íon Sequência Teórico Observado b1 C- 104,006 n.o. y1 -L 132,116 n.o.
b2 CA- 175,043 174,92 y2 -YL 295,179 n.o.
b3 CAA- 246,080 245,87 y3 -KYL 423,274 421,95
b4 CAAA- 317,117 316,89 y4 -LKYL 536,358 535,02
b5 CAAAK- 445,212 444,86 y5 -ILKYL 649,442 n.o. b6 CAAAKK- 573,307 572,97 y6 -KILKYL 777,537 776,19
b7 CAAAKKL- 686,391 686,06 y7 -KKILKYL 905,632 904,28
b8 CAAAKKLF- 833,460 833,15 y8 -FKKILKYL 1052,701 1051,29
b9 CAAAKKLFK- 961,555 961,19 y9 -LFKKILKYL 1165,785 1164,29
b10 CAAAKKLFKK- 1089,650 1089,25 y10 -KLFKKILKYL 1293,88 1292,21
b11 CAAAKKLFKKI- 1202,734 1202,23 y11 -KKLFKKILKYL 1421,975 n.o.
b12 CAAAKKLFKKIL- 1315,818 1315,2 y12 -AKKLFKKILKYL 1493,012 1491,21
b13 CAAAKKLFKKILK- 1443,913 1443,06 y13 -AAKKLFKKILKYL 1564,049 n.o. b14 CAAAKKLFKKILKY- 1606,976 1606,45 y14 -AAAKKLFKKILKYL 1635,086 n.o.
CAAAKKLFKKILKYL 1720,060 1720,16 CAAAKKLFKKILKYL 1737,079 1737,23
n.o.: não observado
172
Tabela 21 - Íons fragmento das séries b e y do peptídeo do peptídeo [Pra]GAAA-BP100 – Massa
monoisotópica: 1729,114.
Série b Série y
íon Sequência Teórico Observado íon Sequência Teórico Observado b1 [Pra]G- 97,041 n.o. y1 -L 132,116 n.o.
b2 [Pra]GA- 168,078 168,22 y2 -YL 295,179 n.o. b3 [Pra]GAA- 239,115 239,31 y3 -KYL 423,274 422,43
b4 [Pra]GAAA- 310,152 310,33 y4 -LKYL 536,358 535,53
b5 [Pra]GAAAK- 438,247 437,44 y5 -ILKYL 649,442 650,68
b6 [Pra]GAAAKK- 566,342 566,69 y6 -KILKYL 777,537 776,90
b7 [Pra]GAAAKKL- 679,426 679,83 y7 -KKILKYL 905,632 905,03
b8 [Pra]GAAAKKLF- 826,495 826,92 y8 -FKKILKYL 1052,701 1052,08
b9 [Pra]GAAAKKLFK- 954,590 954,97 y9 -LFKKILKYL 1165,785 1165,13
b10 [Pra]GAAAKKLFKK- 1082,69 1083,14 y10 -KLFKKILKYL 1293,880 1293,15
b11 [Pra]GAAAKKLFKKI- 1195,77 1196,06 y11 -KKLFKKILKYL 1421,975 1420,89
b12 [Pra]GAAAKKLFKKIL- 1308,85 1309,19 y12 -AKKLFKKILKYL 1493,012 n.o.
b13
[Pra]GAAAKKLFKKILK-
1436,94
8 1437,04
y13
-AAKKLFKKILKYL 1564,049 1563,32 b14
[Pra]GAAAKKLFKKILKY-
1600,01
1 1600,25
y14
-AAAKKLFKKILKYL 1635,086 n.o.
[Pra]GAAAKKLFKKILKYL
1713,09
5 1713,13
[Pra]GAAAKKLFKKILKYL 1731,130 1730,21
n.o.: não observado
Tabela 22 - Íons fragmento das séries b e y do peptídeo do peptídeo [Trz-β-A1]AAA-BP100 – Massa
monoisotópica: 1771,124.
Série b Série y
íon Sequência Teórico Observado íon Sequência Teórico Observado b1 [Trz-β-A
1]- 139,051 n.o. y1 -L 132,116 n.o.
b2 [Trz-β-A1]A- 210,088 2010,24 y2 -YL 295,179 n.o.
b3 [Trz-β-A1]AA- 281,125 281,23 y3 -KYL 423,274 422,45
b4 [Trz-β-A1]AAA- 352,162 352,30 y4 -LKYL 536,358 535,56
b5 [Trz-β-A1]AAAK- 480,257 n.o. y5 -ILKYL 649,442 n.o.
b6 [Trz-β-A1]AAAKK- 608,352 608,56 y6 -KILKYL 777,537 776,81
b7 [Trz-β-A1]AAAKKL- 721,436 721,70 y7 -KKILKYL 905,632 906,01
b8 [Trz-β-A1]AAAKKLF- 868,505 868,94 y8 -FKKILKYL 1052,701 n.o.
b9 [Trz-β-A1]AAAKKLFK- 996,600 997,12 y9 -LFKKILKYL 1165,785 1165,96
b10 [Trz-β-A1]AAAKKLFKK- 1124,695 1125,03 y10 -KLFKKILKYL 1293,880 1293,88
b11 [Trz-β-A1]AAAKKLFKKI- 1237,779 1238,04 y11 -KKLFKKILKYL 1421,975 1421,90
b12 [Trz-β-A1]AAAKKLFKKIL- 1350,863 1351,09 y12 -AKKLFKKILKYL 1493,012 1492,73
b13 [Trz-β-A
1]AAAKKLFKKILK- 1478,958 1478,96
y13 -AAKKLFKKILKYL 1564,049
1564,00
b14 [Trz-β-A
1]AAAKKLFKKILKY- 1642,021 1641,94
y14 -AAAKKLFKKILKYL 1635,086
n.o.
[Trz-β-A
1]AAAKKLFKKILKYL 1755,105 1756,21
[Trz-β-A
1]AAAKKLFKKILKYL 1772,124 1772,26
n.o.: não observado
173
ANEXO IV
Espectroscopia por UV para confirmação do grau de substituição da resina Rink®
amida
0,79 mmol.g-1
O coeficiente de absortividade molar para o aduto dibenzofulveno-piperidina, no
comprimento de onda de 301 nm (pico de absorção envidenciado na Figura 50A),
determinado por Eissler et al. (2017) foi de 8021 L.mol-1
cm-1
. A leitura de absorbância, após
diluição 1:10 do sobrenadante recolhido após reação de desproteção da resina, forneceu valor
de 0,6941. Utilizando esses resultados e os demais dados (abaixo relacionados) para a
realização do experimento, calculou-se o grau de substituição da resina através da equação
fornecida no artigo de Eissler et al. (2017):
E301 nm = 0,6941 (absorbância)
V = 10 mL = 0,01 L
D = 10
I = 1 cm
ε301 nm = 8021 L.mol-1
cm-1
Mresina = 10,7 mg
SFmoc (mmol.g-1
) = [(E301 nm . V . D) / (I . ε301 nm . mresina)] . 106
SFmoc (mmol.g-1
) = [(0,6941. 0,01 . 10) / (1 . 8021 . 10,7)] . 106
Sfmoc = 0,8087 mmol.g-1
Diante do resultado obtido (0,8087 mmol.g-1
) concluiu-se que o grau de
funcionalização da resina Rink® amida indicado pelo fornecedor (0,79 mmol.g
-1) é confiável.
Sendo assim, a curva analítica, empregada para determinar o grau de funcionalização das
nanopartículas de alumina com aminoácidos e os derivados peptídicos, pôde ser elaborada
utilizando o produto de desproteção da resina Rink® amida 0,79 mmol.g
-1. Então foram
realizadas diluições da solução obtida pela desproteção da resina polimérica para confecção
da curva (FIG. 50B). A concentração das alíquotas utilizadas na elaboração da curva analítica
e o valor de absorbância obtido pela leitura em 301 nm estão relacionados na Tabela 23. Vale
ressaltar a importância de refazer a curva analítica a cada 30 dias, caso fosse necessário
quantificar nova formulação de nanopartículas.
174
Figura 50 – Em (A) espectro de UV evidenciando pico de absorção do aduto dibenzofulveno-piperidina em
301 nm. Em (B) curva analítica obtida com o aduto dibenzofulveno-piperidina (produto de desproteção da
resina Rink®
amida 0,79 mnmol.g-1
) em PIPE/DMF 1:20 (v:v).
A curva analítica obtida (FIG. 50B) apresentou faixa linear de 0,0027 mM a
0,1275 mM e R = 0,99. Na parte superior direita do gráfico está apresentada a equação da
reta.
Tabela 23 - Concentrações das alíquotas obtidas pela desproteção da resina Rink®
amida 0,79 mmol.g-1
utilizadas na elaboração da curva analítica e os respectivos valores de absorbância obtidos pela leitura em
UV a 301 nm.
Concentração (mM) Absorbância λ 301 nm
0,0027 0,0397
0,0053 0,0569
0,0106 0,0994
0,0213 0,1837
0,0425 0,3579
0,0850 0,6897
0,1275 1,0160