UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BAacuteSICAS DA SAUacuteDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA CURSO DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS ndash FISIOLOGIA

LAVIacuteNIA ALMEIDA CRUZ

EFEITO DAS PROSTAGLANDINAS CICLOPENTENOcircNICAS SOBRE A EXPRESSAtildeO GEcircNICA DO FATOR NUCLEAR PPAR-γ DO RECEPTOR DE

SCAVENGER CD36 E PROTEIacuteNAS DE APOPTOSE EM MACROacuteFAGOS IMPLICACcedilOtildeES PARA A FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

Porto Alegre

2004

LAVIacuteNIA ALMEIDA CRUZ

EFEITO DAS PROSTAGLANDINAS CICLOPENTENOcircNICAS SOBRE A EXPRESSAtildeO GEcircNICA DO FATOR NUCLEAR PPAR-γ DO RECEPTOR DE

SCAVENGER CD36 E PROTEIacuteNAS DE APOPTOSE EM MACROacuteFAGOS IMPLICACcedilOtildeES PARA A FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

Dissertaccedilatildeo apresentada ao curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia do Instituto de Ciecircncias Baacutesica da Sauacutede da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de mestre

Orientador Dr Paulo Ivo Homem de Bittencourt Juacutenior

Porto Alegre dezembro 2004

DEDICATOacuteRIA

Dedico este trabalho a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a sua realizaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave professora Dra Dulcineacuteia Saes Parra Abdalla do Departamento de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo pela acolhida e pela orientaccedilatildeo indispensaacuteveis para a elaboraccedilatildeo dos experimentos constantes neste trabalho

Ao professor Dr Rui Curi do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo por disponibilizar o laboratoacuterio e recursos diversos para a realizaccedilatildeo dos experimentos de cultura de ceacutelulas e expressatildeo gecircnica

Ao Dr Humberto Matos pelo apoio e inestimaacutevel orientaccedilatildeo para desvendar os misteacuterios do HPLC

Ao proferssor Dr Eacuteder Quintatildeo e a Lilla do Laboratoacuterio de Liacutepides da Universidade de Satildeo Paulo pelo auxiacutelio na separaccedilatildeo de LDL

Agrave professora Dra Regina Guaragna do Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul pelo apoio amizade e orientaccedilatildeo em todos os momentos desde 1998

Aos colegas e amigos do Laboratoacuterio de Fisiologia Celular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul Lino Elza Dai Juacutelia Baby Dedeacute Acircngela B1 Acircngela B2 e Tati pela amizade companheirismo e torcida calorosa

Aos colegas do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo Joelma Elaine Simone Naacutegila Kaacutetia Emerson Edimar e Isabela aleacutem do meu ldquoaluninhordquo Fabriacutecio pela amizade apoio e paciecircncia mesmo nos periacuteodos mais difiacuteceis

Aos colegas do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo Rocirc Thaiacutes e Manuela pela grande ajuda nos experimentos de expressatildeo gecircnica

Ao pessoal da ldquoCicerolacircndiardquo pelo conviacutevio alegre e descontraiacutedo na sauacutede e na doenccedila

Aos amigos Geane Cris Ricki Sara Rose Douglas e Laerte do Departamento de Engenharia Quiacutemica da Universidade de Satildeo Paulo pelo apoio amizade e pelas aulas de modelagem molecular que mostraram perspectivas sempre maiores para o trabalho realizado no laboratoacuterio

Aos familiares pai Inecircs Pri Luacute Suacute tia Vera tio Wilson e Thaiacutes pelo incentivo indispensaacutevel em todos os momentos mesmo agrave distacircncia

Ao Robertinho pelo carinho paciecircncia e compreensatildeo iacutempares que me impediram de desistir de tudo

Aos amigos Thaiacutes Charles Anelise Faacutebio Alessandra Berg bem como ao tio Bruno pessoas cujo incentivo foi fundamental para a conclusatildeo deste trabalho

RESUMO

Considerando que as doenccedilas cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em paiacuteses ocidentais a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e a doenccedilas vasculares perifeacutericas Neste contexto a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL eacute um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares pois eacute reconhecida e internalizada por macroacutefagos ocasionando a sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Diversos fatores participam deste processo de diferenciaccedilatildeo como a expressatildeo de receptores de scavenger CD 36 proporcionando aumento na captaccedilatildeo de LDL oxidada aumento na siacutentese endoacutegena de colesterol e ativaccedilatildeo de fatores nucleares que iniciam a transcriccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas e fatores de crescimento que disparam a aterogecircnese Os fenocircmenos celulares relacionados agrave apoptose tambeacutem satildeo de especial importacircncia tanto no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica como na estabilidade da placa e formaccedilatildeo de trombos As prostaglandinas (PGs) ciclopentenocircnicas (CP-PGs) em particular a PGA2 e a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 satildeo uma classe especial de PGs que em diminutas concentraccedilotildees disparam a expressatildeo das proteiacutenas de choque teacutermico (hsp) que satildeo citoprotetoras Aleacutem disso CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do fator nuclear proacute-inflamatoacuterio NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatoacuterios Embora as PGs das famiacutelias A e J guardem uma seacuterie de caracteriacutesticas em comum a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 eacute o ligante fisioloacutegico do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ enquanto as PGs da famiacutelia A ativam apenas a via citoprotetora das hsp Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressatildeo gecircnica de fatores relacionados agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como proteiacutenas reguladoras do processo de apoptose em ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 Para tal as ceacutelulas foram tratadas com CP-PGs em presenccedila eou ausecircncia de LDL nat e LDL ox o RNA foi extraiacutedo para a realizaccedilatildeo de RT-PCR para PPAR-γ CD 36 HMG-CoA redutase e proteiacutenas de apoptose Caspase 3 p53 e Bcl-xL O tratamento estatiacutestico utilizado foi anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-way) e teste ldquotrdquo de student com resultados expressos como meacutedias + desvios-padratildeo da meacutedia com Plt005 Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20microM-24h) e PGJ2 (15microM-24h) inibiram a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR- γ (64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) nas ceacutelulas U937 em presenccedila de LDL oxidada quando comparado ao controle PGA2 inibiu a expressatildeo de HMG-CoA redutase (33 ) enzima chave da siacutentese de colesterol intracelular e o tratamento com as CP-PGs tambeacutem inibiu a apoptose nas ceacutelulas tratadas em presenccedila de LDL oxidada Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose jaacute que aleacutem de apresentarem efeito antiinflamatoacuterio inibem a expressatildeo do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase O bloqueio da apoptose nas ceacutelulas estudadas pode estar relacionado agrave citoproteccedilatildeo oferecida por estas PGs Embora investigaccedilotildees in vivo deste laboratoacuterio tenham mostrado a eficaacutecia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose estudos adicionais satildeo necessaacuterios para esclarecer-se o efeito antiaterogecircnico das mesmas

Palavras chave prostaglandinas ciclopentenocircnicas aterosclerose LDL apoptose macroacutefagos foam cells

ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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LAVIacuteNIA ALMEIDA CRUZ

EFEITO DAS PROSTAGLANDINAS CICLOPENTENOcircNICAS SOBRE A EXPRESSAtildeO GEcircNICA DO FATOR NUCLEAR PPAR-γ DO RECEPTOR DE

SCAVENGER CD36 E PROTEIacuteNAS DE APOPTOSE EM MACROacuteFAGOS IMPLICACcedilOtildeES PARA A FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

Dissertaccedilatildeo apresentada ao curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas Fisiologia do Instituto de Ciecircncias Baacutesica da Sauacutede da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de mestre

Orientador Dr Paulo Ivo Homem de Bittencourt Juacutenior

Porto Alegre dezembro 2004

DEDICATOacuteRIA

Dedico este trabalho a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a sua realizaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave professora Dra Dulcineacuteia Saes Parra Abdalla do Departamento de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo pela acolhida e pela orientaccedilatildeo indispensaacuteveis para a elaboraccedilatildeo dos experimentos constantes neste trabalho

Ao professor Dr Rui Curi do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo por disponibilizar o laboratoacuterio e recursos diversos para a realizaccedilatildeo dos experimentos de cultura de ceacutelulas e expressatildeo gecircnica

Ao Dr Humberto Matos pelo apoio e inestimaacutevel orientaccedilatildeo para desvendar os misteacuterios do HPLC

Ao proferssor Dr Eacuteder Quintatildeo e a Lilla do Laboratoacuterio de Liacutepides da Universidade de Satildeo Paulo pelo auxiacutelio na separaccedilatildeo de LDL

Agrave professora Dra Regina Guaragna do Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul pelo apoio amizade e orientaccedilatildeo em todos os momentos desde 1998

Aos colegas e amigos do Laboratoacuterio de Fisiologia Celular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul Lino Elza Dai Juacutelia Baby Dedeacute Acircngela B1 Acircngela B2 e Tati pela amizade companheirismo e torcida calorosa

Aos colegas do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo Joelma Elaine Simone Naacutegila Kaacutetia Emerson Edimar e Isabela aleacutem do meu ldquoaluninhordquo Fabriacutecio pela amizade apoio e paciecircncia mesmo nos periacuteodos mais difiacuteceis

Aos colegas do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo Rocirc Thaiacutes e Manuela pela grande ajuda nos experimentos de expressatildeo gecircnica

Ao pessoal da ldquoCicerolacircndiardquo pelo conviacutevio alegre e descontraiacutedo na sauacutede e na doenccedila

Aos amigos Geane Cris Ricki Sara Rose Douglas e Laerte do Departamento de Engenharia Quiacutemica da Universidade de Satildeo Paulo pelo apoio amizade e pelas aulas de modelagem molecular que mostraram perspectivas sempre maiores para o trabalho realizado no laboratoacuterio

Aos familiares pai Inecircs Pri Luacute Suacute tia Vera tio Wilson e Thaiacutes pelo incentivo indispensaacutevel em todos os momentos mesmo agrave distacircncia

Ao Robertinho pelo carinho paciecircncia e compreensatildeo iacutempares que me impediram de desistir de tudo

Aos amigos Thaiacutes Charles Anelise Faacutebio Alessandra Berg bem como ao tio Bruno pessoas cujo incentivo foi fundamental para a conclusatildeo deste trabalho

RESUMO

Considerando que as doenccedilas cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em paiacuteses ocidentais a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e a doenccedilas vasculares perifeacutericas Neste contexto a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL eacute um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares pois eacute reconhecida e internalizada por macroacutefagos ocasionando a sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Diversos fatores participam deste processo de diferenciaccedilatildeo como a expressatildeo de receptores de scavenger CD 36 proporcionando aumento na captaccedilatildeo de LDL oxidada aumento na siacutentese endoacutegena de colesterol e ativaccedilatildeo de fatores nucleares que iniciam a transcriccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas e fatores de crescimento que disparam a aterogecircnese Os fenocircmenos celulares relacionados agrave apoptose tambeacutem satildeo de especial importacircncia tanto no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica como na estabilidade da placa e formaccedilatildeo de trombos As prostaglandinas (PGs) ciclopentenocircnicas (CP-PGs) em particular a PGA2 e a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 satildeo uma classe especial de PGs que em diminutas concentraccedilotildees disparam a expressatildeo das proteiacutenas de choque teacutermico (hsp) que satildeo citoprotetoras Aleacutem disso CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do fator nuclear proacute-inflamatoacuterio NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatoacuterios Embora as PGs das famiacutelias A e J guardem uma seacuterie de caracteriacutesticas em comum a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 eacute o ligante fisioloacutegico do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ enquanto as PGs da famiacutelia A ativam apenas a via citoprotetora das hsp Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressatildeo gecircnica de fatores relacionados agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como proteiacutenas reguladoras do processo de apoptose em ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 Para tal as ceacutelulas foram tratadas com CP-PGs em presenccedila eou ausecircncia de LDL nat e LDL ox o RNA foi extraiacutedo para a realizaccedilatildeo de RT-PCR para PPAR-γ CD 36 HMG-CoA redutase e proteiacutenas de apoptose Caspase 3 p53 e Bcl-xL O tratamento estatiacutestico utilizado foi anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-way) e teste ldquotrdquo de student com resultados expressos como meacutedias + desvios-padratildeo da meacutedia com Plt005 Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20microM-24h) e PGJ2 (15microM-24h) inibiram a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR- γ (64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) nas ceacutelulas U937 em presenccedila de LDL oxidada quando comparado ao controle PGA2 inibiu a expressatildeo de HMG-CoA redutase (33 ) enzima chave da siacutentese de colesterol intracelular e o tratamento com as CP-PGs tambeacutem inibiu a apoptose nas ceacutelulas tratadas em presenccedila de LDL oxidada Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose jaacute que aleacutem de apresentarem efeito antiinflamatoacuterio inibem a expressatildeo do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase O bloqueio da apoptose nas ceacutelulas estudadas pode estar relacionado agrave citoproteccedilatildeo oferecida por estas PGs Embora investigaccedilotildees in vivo deste laboratoacuterio tenham mostrado a eficaacutecia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose estudos adicionais satildeo necessaacuterios para esclarecer-se o efeito antiaterogecircnico das mesmas

Palavras chave prostaglandinas ciclopentenocircnicas aterosclerose LDL apoptose macroacutefagos foam cells

ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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DEDICATOacuteRIA

Dedico este trabalho a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a sua realizaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave professora Dra Dulcineacuteia Saes Parra Abdalla do Departamento de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo pela acolhida e pela orientaccedilatildeo indispensaacuteveis para a elaboraccedilatildeo dos experimentos constantes neste trabalho

Ao professor Dr Rui Curi do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo por disponibilizar o laboratoacuterio e recursos diversos para a realizaccedilatildeo dos experimentos de cultura de ceacutelulas e expressatildeo gecircnica

Ao Dr Humberto Matos pelo apoio e inestimaacutevel orientaccedilatildeo para desvendar os misteacuterios do HPLC

Ao proferssor Dr Eacuteder Quintatildeo e a Lilla do Laboratoacuterio de Liacutepides da Universidade de Satildeo Paulo pelo auxiacutelio na separaccedilatildeo de LDL

Agrave professora Dra Regina Guaragna do Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul pelo apoio amizade e orientaccedilatildeo em todos os momentos desde 1998

Aos colegas e amigos do Laboratoacuterio de Fisiologia Celular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul Lino Elza Dai Juacutelia Baby Dedeacute Acircngela B1 Acircngela B2 e Tati pela amizade companheirismo e torcida calorosa

Aos colegas do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo Joelma Elaine Simone Naacutegila Kaacutetia Emerson Edimar e Isabela aleacutem do meu ldquoaluninhordquo Fabriacutecio pela amizade apoio e paciecircncia mesmo nos periacuteodos mais difiacuteceis

Aos colegas do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo Rocirc Thaiacutes e Manuela pela grande ajuda nos experimentos de expressatildeo gecircnica

Ao pessoal da ldquoCicerolacircndiardquo pelo conviacutevio alegre e descontraiacutedo na sauacutede e na doenccedila

Aos amigos Geane Cris Ricki Sara Rose Douglas e Laerte do Departamento de Engenharia Quiacutemica da Universidade de Satildeo Paulo pelo apoio amizade e pelas aulas de modelagem molecular que mostraram perspectivas sempre maiores para o trabalho realizado no laboratoacuterio

Aos familiares pai Inecircs Pri Luacute Suacute tia Vera tio Wilson e Thaiacutes pelo incentivo indispensaacutevel em todos os momentos mesmo agrave distacircncia

Ao Robertinho pelo carinho paciecircncia e compreensatildeo iacutempares que me impediram de desistir de tudo

Aos amigos Thaiacutes Charles Anelise Faacutebio Alessandra Berg bem como ao tio Bruno pessoas cujo incentivo foi fundamental para a conclusatildeo deste trabalho

RESUMO

Considerando que as doenccedilas cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em paiacuteses ocidentais a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e a doenccedilas vasculares perifeacutericas Neste contexto a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL eacute um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares pois eacute reconhecida e internalizada por macroacutefagos ocasionando a sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Diversos fatores participam deste processo de diferenciaccedilatildeo como a expressatildeo de receptores de scavenger CD 36 proporcionando aumento na captaccedilatildeo de LDL oxidada aumento na siacutentese endoacutegena de colesterol e ativaccedilatildeo de fatores nucleares que iniciam a transcriccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas e fatores de crescimento que disparam a aterogecircnese Os fenocircmenos celulares relacionados agrave apoptose tambeacutem satildeo de especial importacircncia tanto no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica como na estabilidade da placa e formaccedilatildeo de trombos As prostaglandinas (PGs) ciclopentenocircnicas (CP-PGs) em particular a PGA2 e a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 satildeo uma classe especial de PGs que em diminutas concentraccedilotildees disparam a expressatildeo das proteiacutenas de choque teacutermico (hsp) que satildeo citoprotetoras Aleacutem disso CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do fator nuclear proacute-inflamatoacuterio NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatoacuterios Embora as PGs das famiacutelias A e J guardem uma seacuterie de caracteriacutesticas em comum a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 eacute o ligante fisioloacutegico do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ enquanto as PGs da famiacutelia A ativam apenas a via citoprotetora das hsp Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressatildeo gecircnica de fatores relacionados agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como proteiacutenas reguladoras do processo de apoptose em ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 Para tal as ceacutelulas foram tratadas com CP-PGs em presenccedila eou ausecircncia de LDL nat e LDL ox o RNA foi extraiacutedo para a realizaccedilatildeo de RT-PCR para PPAR-γ CD 36 HMG-CoA redutase e proteiacutenas de apoptose Caspase 3 p53 e Bcl-xL O tratamento estatiacutestico utilizado foi anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-way) e teste ldquotrdquo de student com resultados expressos como meacutedias + desvios-padratildeo da meacutedia com Plt005 Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20microM-24h) e PGJ2 (15microM-24h) inibiram a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR- γ (64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) nas ceacutelulas U937 em presenccedila de LDL oxidada quando comparado ao controle PGA2 inibiu a expressatildeo de HMG-CoA redutase (33 ) enzima chave da siacutentese de colesterol intracelular e o tratamento com as CP-PGs tambeacutem inibiu a apoptose nas ceacutelulas tratadas em presenccedila de LDL oxidada Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose jaacute que aleacutem de apresentarem efeito antiinflamatoacuterio inibem a expressatildeo do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase O bloqueio da apoptose nas ceacutelulas estudadas pode estar relacionado agrave citoproteccedilatildeo oferecida por estas PGs Embora investigaccedilotildees in vivo deste laboratoacuterio tenham mostrado a eficaacutecia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose estudos adicionais satildeo necessaacuterios para esclarecer-se o efeito antiaterogecircnico das mesmas

Palavras chave prostaglandinas ciclopentenocircnicas aterosclerose LDL apoptose macroacutefagos foam cells

ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

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tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

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ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

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de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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AGRADECIMENTOS

Agrave professora Dra Dulcineacuteia Saes Parra Abdalla do Departamento de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo pela acolhida e pela orientaccedilatildeo indispensaacuteveis para a elaboraccedilatildeo dos experimentos constantes neste trabalho

Ao professor Dr Rui Curi do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo por disponibilizar o laboratoacuterio e recursos diversos para a realizaccedilatildeo dos experimentos de cultura de ceacutelulas e expressatildeo gecircnica

Ao Dr Humberto Matos pelo apoio e inestimaacutevel orientaccedilatildeo para desvendar os misteacuterios do HPLC

Ao proferssor Dr Eacuteder Quintatildeo e a Lilla do Laboratoacuterio de Liacutepides da Universidade de Satildeo Paulo pelo auxiacutelio na separaccedilatildeo de LDL

Agrave professora Dra Regina Guaragna do Departamento de Bioquiacutemica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul pelo apoio amizade e orientaccedilatildeo em todos os momentos desde 1998

Aos colegas e amigos do Laboratoacuterio de Fisiologia Celular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul Lino Elza Dai Juacutelia Baby Dedeacute Acircngela B1 Acircngela B2 e Tati pela amizade companheirismo e torcida calorosa

Aos colegas do Laboratoacuterio de Bioquiacutemica Cliacutenica da Universidade de Satildeo Paulo Joelma Elaine Simone Naacutegila Kaacutetia Emerson Edimar e Isabela aleacutem do meu ldquoaluninhordquo Fabriacutecio pela amizade apoio e paciecircncia mesmo nos periacuteodos mais difiacuteceis

Aos colegas do Departamento de Fisiologia e Biofiacutesica da Universidade de Satildeo Paulo Rocirc Thaiacutes e Manuela pela grande ajuda nos experimentos de expressatildeo gecircnica

Ao pessoal da ldquoCicerolacircndiardquo pelo conviacutevio alegre e descontraiacutedo na sauacutede e na doenccedila

Aos amigos Geane Cris Ricki Sara Rose Douglas e Laerte do Departamento de Engenharia Quiacutemica da Universidade de Satildeo Paulo pelo apoio amizade e pelas aulas de modelagem molecular que mostraram perspectivas sempre maiores para o trabalho realizado no laboratoacuterio

Aos familiares pai Inecircs Pri Luacute Suacute tia Vera tio Wilson e Thaiacutes pelo incentivo indispensaacutevel em todos os momentos mesmo agrave distacircncia

Ao Robertinho pelo carinho paciecircncia e compreensatildeo iacutempares que me impediram de desistir de tudo

Aos amigos Thaiacutes Charles Anelise Faacutebio Alessandra Berg bem como ao tio Bruno pessoas cujo incentivo foi fundamental para a conclusatildeo deste trabalho

RESUMO

Considerando que as doenccedilas cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em paiacuteses ocidentais a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e a doenccedilas vasculares perifeacutericas Neste contexto a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL eacute um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares pois eacute reconhecida e internalizada por macroacutefagos ocasionando a sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Diversos fatores participam deste processo de diferenciaccedilatildeo como a expressatildeo de receptores de scavenger CD 36 proporcionando aumento na captaccedilatildeo de LDL oxidada aumento na siacutentese endoacutegena de colesterol e ativaccedilatildeo de fatores nucleares que iniciam a transcriccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas e fatores de crescimento que disparam a aterogecircnese Os fenocircmenos celulares relacionados agrave apoptose tambeacutem satildeo de especial importacircncia tanto no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica como na estabilidade da placa e formaccedilatildeo de trombos As prostaglandinas (PGs) ciclopentenocircnicas (CP-PGs) em particular a PGA2 e a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 satildeo uma classe especial de PGs que em diminutas concentraccedilotildees disparam a expressatildeo das proteiacutenas de choque teacutermico (hsp) que satildeo citoprotetoras Aleacutem disso CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do fator nuclear proacute-inflamatoacuterio NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatoacuterios Embora as PGs das famiacutelias A e J guardem uma seacuterie de caracteriacutesticas em comum a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 eacute o ligante fisioloacutegico do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ enquanto as PGs da famiacutelia A ativam apenas a via citoprotetora das hsp Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressatildeo gecircnica de fatores relacionados agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como proteiacutenas reguladoras do processo de apoptose em ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 Para tal as ceacutelulas foram tratadas com CP-PGs em presenccedila eou ausecircncia de LDL nat e LDL ox o RNA foi extraiacutedo para a realizaccedilatildeo de RT-PCR para PPAR-γ CD 36 HMG-CoA redutase e proteiacutenas de apoptose Caspase 3 p53 e Bcl-xL O tratamento estatiacutestico utilizado foi anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-way) e teste ldquotrdquo de student com resultados expressos como meacutedias + desvios-padratildeo da meacutedia com Plt005 Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20microM-24h) e PGJ2 (15microM-24h) inibiram a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR- γ (64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) nas ceacutelulas U937 em presenccedila de LDL oxidada quando comparado ao controle PGA2 inibiu a expressatildeo de HMG-CoA redutase (33 ) enzima chave da siacutentese de colesterol intracelular e o tratamento com as CP-PGs tambeacutem inibiu a apoptose nas ceacutelulas tratadas em presenccedila de LDL oxidada Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose jaacute que aleacutem de apresentarem efeito antiinflamatoacuterio inibem a expressatildeo do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase O bloqueio da apoptose nas ceacutelulas estudadas pode estar relacionado agrave citoproteccedilatildeo oferecida por estas PGs Embora investigaccedilotildees in vivo deste laboratoacuterio tenham mostrado a eficaacutecia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose estudos adicionais satildeo necessaacuterios para esclarecer-se o efeito antiaterogecircnico das mesmas

Palavras chave prostaglandinas ciclopentenocircnicas aterosclerose LDL apoptose macroacutefagos foam cells

ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

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Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

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endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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RESUMO

Considerando que as doenccedilas cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade e morbidade em paiacuteses ocidentais a aterosclerose se destaca pelo fato de predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e a doenccedilas vasculares perifeacutericas Neste contexto a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL eacute um dos fatores de risco para eventos cardiovasculares pois eacute reconhecida e internalizada por macroacutefagos ocasionando a sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Diversos fatores participam deste processo de diferenciaccedilatildeo como a expressatildeo de receptores de scavenger CD 36 proporcionando aumento na captaccedilatildeo de LDL oxidada aumento na siacutentese endoacutegena de colesterol e ativaccedilatildeo de fatores nucleares que iniciam a transcriccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas e fatores de crescimento que disparam a aterogecircnese Os fenocircmenos celulares relacionados agrave apoptose tambeacutem satildeo de especial importacircncia tanto no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica como na estabilidade da placa e formaccedilatildeo de trombos As prostaglandinas (PGs) ciclopentenocircnicas (CP-PGs) em particular a PGA2 e a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 satildeo uma classe especial de PGs que em diminutas concentraccedilotildees disparam a expressatildeo das proteiacutenas de choque teacutermico (hsp) que satildeo citoprotetoras Aleacutem disso CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do fator nuclear proacute-inflamatoacuterio NF-κB tornando-as potentes agentes antiinflamatoacuterios Embora as PGs das famiacutelias A e J guardem uma seacuterie de caracteriacutesticas em comum a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 eacute o ligante fisioloacutegico do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ enquanto as PGs da famiacutelia A ativam apenas a via citoprotetora das hsp Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das CP-PGs sobre a expressatildeo gecircnica de fatores relacionados agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como proteiacutenas reguladoras do processo de apoptose em ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 Para tal as ceacutelulas foram tratadas com CP-PGs em presenccedila eou ausecircncia de LDL nat e LDL ox o RNA foi extraiacutedo para a realizaccedilatildeo de RT-PCR para PPAR-γ CD 36 HMG-CoA redutase e proteiacutenas de apoptose Caspase 3 p53 e Bcl-xL O tratamento estatiacutestico utilizado foi anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-way) e teste ldquotrdquo de student com resultados expressos como meacutedias + desvios-padratildeo da meacutedia com Plt005 Os resultados obtidos demontraram que as CP-PGs PGA2 (20microM-24h) e PGJ2 (15microM-24h) inibiram a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR- γ (64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) nas ceacutelulas U937 em presenccedila de LDL oxidada quando comparado ao controle PGA2 inibiu a expressatildeo de HMG-CoA redutase (33 ) enzima chave da siacutentese de colesterol intracelular e o tratamento com as CP-PGs tambeacutem inibiu a apoptose nas ceacutelulas tratadas em presenccedila de LDL oxidada Os dados sugerem que as CP-PGs apresentam grande potencial para o tratamento da aterosclerose jaacute que aleacutem de apresentarem efeito antiinflamatoacuterio inibem a expressatildeo do fator nuclear proacute-aterogecircnico PPAR-γ do receptor de scavenger CD36 (apenas a 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2) e da enzima HMG-CoA redutase O bloqueio da apoptose nas ceacutelulas estudadas pode estar relacionado agrave citoproteccedilatildeo oferecida por estas PGs Embora investigaccedilotildees in vivo deste laboratoacuterio tenham mostrado a eficaacutecia do tratamento com CP-PGs em camundongos portadores de aterosclerose estudos adicionais satildeo necessaacuterios para esclarecer-se o efeito antiaterogecircnico das mesmas

Palavras chave prostaglandinas ciclopentenocircnicas aterosclerose LDL apoptose macroacutefagos foam cells

ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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ABSTRACT

Inasmuch as cardiovascular diseases are a major cause of mortality and morbidity in western countries atherosclerosis is highlighted for being a main cause of brain strokes and peripheral vascular diseases Low density lipoprotein (LDL) particles are the major carriers of cholesterol towards extrahepatic tissues in the blood The oxidation hypothesis of atherogenesis proposes that LDL must be oxidatively modified to trigger the pathological events of atherosclerosis Apoptosis is another important factor to both development of atherosclerosis lesions and cloth formation Cyclopentenone prostaglandins (CP-PGs) particularly PGA2 and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 are a special class of prostaglandins (PGs) wich in minute amounts trigger the expression of heat shock proteins (hsp) that are in turn cytoprotectors Moreover CP-PGs impair the activation of the pro-inflammatory nuclear factor NF-kappa B which makes CP-PGs potent anti-inflammatory agents Although type A and J PGs present many commom different features between one another 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 is the physiological ligand of the pro-atherogenic nuclear factor PPAR-γ whereas PGs of A-family activate only the cytoprotector hsp pathway Since CP-PGs are anti-inflammatory and atherosclerosis is a typically inflammatory disease of vascular wall this work aimed to investigate CP-PG effects on the expression of some factors related to macrophage-foam cell differentiation as well as apoptosis regulatory proteins in human pro-monocytic leukemia line U937 cells Cells were treated with CP-PGs in the presence or absence of LDL (native or oxidized) and total RNA was extrated to be probed to PPAR-γ CD36 HMG-CoA reductase as well as apoptosis pathway proteins caspase 3 p53 and Bcl-xL by RT-PCR Statistical analysis were performed by one-way ANOVA and Student ldquotrdquo test by using the means + SEM and plt005 Data showed that treatment whith PGA2 (20 microM) and 15-desoacutexi-∆1214-PGJ2 (15-dPGJ2 15 microM) during 24 h inhibited PPAR-γ (by 64 (PGA2) 88 (15-d-PGJ2)) in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls PGA2 also inhibited of HMG-CoA reductase gene expression (by 33 ) Treatment with CP-PGs also inhibits apoptosis in U937 cells in presence of oxidized LDL (20 microgmL) as compared to controls Taken together the results suggest that CP-PGs show a high therapeutical potential for the treatment of atherosclerosis since besides being anti-inflammatory they inhibited the expression of the pro-atherogenic factor PPAR-γ the scavenger receptor CD36 (only 15-dPGJ2) and the key-enzyme of the cholesterogenesis HMG-CoA reductase Impairment of apoptosis in the cells studied may be related to the cytoprotection offered by such PGs Although in vivo studies from this laboratory have demonstrated the efficacy of CP-PG treatment in atherosclerosis-bearing mice additional studies are necessary to clarify anti-atherogenic effects of them

Key-words cyclopentenonic prostaglandins atherosclerosis LDL apoptosis macrophage-foam cells

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

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ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 13 11 ATEROSCLEROSE13 111 ATEROSCLEROSE E LIPOPROTEIacuteNAS PLASMAacuteTICAS19 112 Aterosclerose e apoptose 26 12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas30 2 OBJETIVOS 36 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS37 31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma 37 311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC39 312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL43 314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas47 32 Cultura de ceacutelulas54 321 Grupos experimentais 54 322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR56 323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase) 57 324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)57 33 Tratamento estatiacutestico61 4 RESULTADOS 62 41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells63 411 PPAR-γ 63 412 CD3665 413 HMG-CoA redutase67 42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose70 421 Caspase 371 422 p5372 423 Bcl-xL73 5 DISCUSSAtildeO 77 51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells77 511 PPAR-γ77

512 CD3679 513 HMG-CoA redutase82 52 Proteiacutenas relacionadas agrave apoptose84 521 Caspase 386 522 p5387 523 Bcl-xL88 6 CONCLUSOtildeES90 7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS92

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

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ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (Scientific American Brasil 2004) 17

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas (Hevonoja et al 2000) 20

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (LIMA E S amp ABDALLA D S P 2001) 25

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC41

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a)43

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL 47

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) LDL nativa e oxidada 52

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada53

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos64

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos66

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos68

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos71

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos73

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos75

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)38

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM) 40

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)40

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO) 42

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase42

Quadro 6 ndash PBS 42

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)45

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida 48

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)48

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento) 49

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )49

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo49

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra 49

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)50

Quadro 15 ndash Corante 50

Quadro 16 ndash Descorante Forte50

Quadro 17 ndash Descorante Fraco 50

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia 53

ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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ABREVIATURAS

AGPI Aacutecidos graxos poliinsaturados

CP-PGs Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

HDL High-density lipoprotein

HPLC High-performance liquid chromatography

HSP Heat shock protein

LDL Low-density lipoiprotein

LDLnat LDL nativa

LDLox LDL oxidada

Lp(a) Lipoproteiacutena (a)

LPO Lipoperoxidaccedilatildeo

MDA Malondialdeiacutedo

MPO Mieloperoxidase

12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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12

mRNA RNA mensageiro

NO Oacutexido niacutetrico

PGA2 Prostaglandina A2

PGJ2 Prostaglandina J2

RNA Aacutecido ribonucleacuteico

TBA Thiobarbituric acid

TBARS Thiobarbituric acids reactive substances

TCA Trichloroacetic acid

VLDL Very low-density lipoproteins

13

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

19

ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

20

moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

91

expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aterosclerose

As doenccedilas cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade e morbidade

em paiacuteses ocidentais (American Heart Association 2000) No ano de 1997 atingiram cerca de

16 da populaccedilatildeo norte-americana com idade meacutedia de 65 anos (Keaney et al 2000)

correspondendo em termos percentuais a 30 para homens e 24 para mulheres (American

Heart Association 2000) Dentre estas doenccedilas a aterosclerose se destaca pelo fato de

predispor os pacientes ao infarto do miocaacuterdio a acidentes vasculares cerebrais e doenccedilas

vasculares perifeacutericas

A aterogecircnese caracteriza-se por uma sucessatildeo de desordens nas tuacutenicas iacutentima e

meacutedia das peredes vasculares Tais desordens incluem aumento de permeabilidade do

endoteacutelio infiltraccedilatildeo de monoacutecitos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas adjacentes

agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e acuacutemulo de liacutepides Ca2+ e de componentes de matriz extracelular

(Schmitz et al 1991)

Estudos epidemioloacutegicos tecircm identificado vaacuterios fatores de risco para a aterosclerose

incluindo as hiperlipidemias adquiridas ou familiares (Castelli 1992) o diabetes mellitus

(Fuller et al 1980) a hipertensatildeo (Kannel 1975) o tabagismo (McGill 1988) a obesidade

(Hubbert et al 1983) e os baixos niacuteveis de HDL (Conference of consense of NIH 1994) A

oxidabilidade das lipoproteiacutenas particularmente da LDL assim como a funcionalidade do

14

endoteacutelio tambeacutem veacutem sendo considerados essenciais para a iniciaccedilatildeo e a progressatildeo da

aterosclerose (Boumlger et al 1997 Flavahan 1992)

Apesar da magnitude deste problema de sauacutede puacuteblica pouco se sabe a respeito das

causas da aterosclerose e diversas hipoacuteteses visam explicar seu desenvolvimento A claacutessica

teoria da infiltraccedilatildeo lipiacutedica propotildee que as dislipidemias sobretudo as hipercolesterolemias

sejam um fator decisivo para o desenvolvimento da aterosclerose (Aherns et al 1957

Hegsted et al 1965 Grundy et al 1988) A hipoacutetese da resposta agrave injuacuteria proposta por Ross

amp Glomset (1983) e por Ross (1986) sugere que lesotildees teciduais causadas por estiacutemulos

mecacircnicos substacircncias quiacutemicas toxinas infecccedilotildees virais ou ateacute mecanismos imunoloacutegicos

provocariam modificaccedilotildees primaacuterias no endoteacutelio Tais alteraccedilotildees promoveriam o

recrutamento e ativaccedilatildeo de vaacuterios tipos celulares especiacuteficos que juntos desfecham o quadro

aterogecircnico

Devido a interaccedilotildees celulares com o endoteacutelio jaacute natildeo iacutentegro macroacutefagos plaquetas

neutroacutefilos e linfoacutecitos liberam fatores de crescimento que satildeo quimiotaacuteticos e mitogecircnicos

para as ceacutelulas da musculatura lisa vascular (Schimitz et al 1991) Estas por sua vez migram

da meacutedia para a iacutentima vascular onde perdem o fenoacutetipo contraacutetil diferenciando-se em ceacutelulas

com caracteriacutesticas secretoacuterias que se proliferam produzem fatores de crescimento e liberam

componentes de matriz extracelular que induzem ativaccedilatildeo e lesatildeo celulares (Thyberg et al

1990) Fatores celulares como PAF e PDGF produzidos por macroacutefagos da lesatildeo tecidual

induzem as ceacutelulas endoteliais a produzirem o fator de von Willebrand (Hashemi et al 1993)

recrutam e ativam plaquetas que por sua vez produzem grandes quantidades do eicosanoacuteide

altamente vasoconstritor tromboxana A2 (Buzzard et al 1993)

15

Devido agrave injuacuteria ao endoteacutelio nos estaacutegios iniciais da aterogecircnese as ceacutelulas

endoteliais passam a apresentar maior reciclagem metaboacutelica levando agrave replicaccedilatildeo celular

aumento de permeabilidade para elementos do plasma e ativaccedilatildeo de proteiacutenas do sistema

complemento o que favorece a infiltraccedilatildeo de monoacutecitos (Schimitz et al 1991) Nas camadas

subendoteliais ocorre diferenciaccedilatildeo destes monoacutecitos em macroacutefagos com habilidade de

acumular grandes quantidades de liacutepides as foam cells ou ceacutelulas espumosas que recebem

este nome devido agrave morfologia caracteriacutestica que passam a apresentar Estas ceacutelulas acumulam

grandes quantidades de colesterol e eacutesteres de colesterol que ficam constantemente sendo

submetidos a um ciclo de hidroacutelise e reesterificaccedilatildeo ateacute que o excesso de colesterol possa ser

secretado ou utilizado para a siacutentese de membranas (Brown amp Goldstein 1983 Brown et al

1980 Rosenfeld et al 1991) Entretanto uma das caracteriacutesticas mais importantes destes

macroacutefagos pelas implicaccedilotildees na gecircnese da placa ateromatosa eacute a capacidade das foam cells

de captar e degradar lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) modificadas promovendo sua

oxidaccedilatildeo e gerando produtos com alta capacidade oxidativa e de lesatildeo tecidual (Rosenfeld et

al 1991)

A aterogecircnese eacute portanto um fenocircmeno de relaccedilotildees intercelulares e neste contexto

os macroacutefagos ocupam uma posiccedilatildeo central pois participam de praticamente todas estas

alteraccedilotildees agindo como ceacutelula mediadora para a instalaccedilatildeo da aterosclerose

Sabe-se que monoacutecitosmacroacutefagos em presenccedila de lipoproteiacutenas modificadas

oxidativamente aumentam a expressatildeo de receptores de scavenger (Brown et al 1980) eou

receptores para a fraccedilatildeo Fc das imunoglobulinas (Stanton et al 1992) Este evento permite a

captaccedilatildeo de partiacuteculas ricas em eacutesteres de colesterol atraveacutes de um processo natildeo controlado

por feed-back negativo dando origem as foam cells Ceacutelulas da musculatura lisa vascular

16

apresentam os mesmos receptores de remoccedilatildeo encontrados em macroacutefagos e ceacutelulas

endoteliais satildeo igualmente capazes de internalizar LDL mas por receptores de scavenger

diferentes daqueles encontrados em macroacutefagos foam cells (Bickel amp Freeman 1992)

A progressatildeo das lesotildees ateroscleroacuteticas compreende trecircs estaacutegios lesotildees iniciais

lesotildees em desenvolvimento e lesotildees maduras

As lesotildees iniciais satildeo caracterizadas por deposiccedilatildeo lipiacutedica conhecida como estrias

gordurosas (fatty streaks) Apresentam macroacutefagos foam cells ceacutelulas musculares lisas

linfoacutecitos T lipiacutedeos extracelulares proteoglicanos colaacutegenos e fibras elaacutesticas em menores

quantidades que na placa fibrosa As estrias gordurosas natildeo se projetam em direccedilatildeo agrave luz do

vaso natildeo comprometendo portanto o fluxo sanguumliacuteneo Estas lesotildees surgem em crianccedilas com

menos de um ano de vida e estatildeo presentes em todas as crianccedilas com dez anos de idade

(Frederick et al 1996) podendo ocupar cerca de 13 da arteacuteria por volta dos trinta anos

As lesotildees em desenvolvimento satildeo algumas vezes denominadas placas fibro-

gordurosas e representam um estaacutegio avanccedilado das estrias gordurosas Elas satildeo inicialmente

encontradas em diversas regiotildees das arteacuterias coronarianas na aorta abdominal e nas arteacuterias

caroacutetidas (em torno dos trinta a quarenta anos de idade) Estas placas fibrosas satildeo riacutegidas e

recobertas por uma capa fibromuscular

Finalmente as lesotildees progridem para um estaacutegio mais complicado e avanccedilado

caracterizado por aacutereas fibrosas calcificadas com ulceraccedilatildeo visiacutevel sendo consideradas lesotildees

maduras Estas calcificaccedilotildees contribuem para a perda da complacecircncia do vaso e favorecem a

ruptura da lesatildeo com consequumlente liberaccedilatildeo de trombos na circulaccedilatildeo sistecircmica Assim este

17

tipo de lesatildeo predispotildee agrave trombose e calcificaccedilatildeo levando ao enfraquecimento da musculatura

lisa do vaso e a sua dilataccedilatildeo (aneurisma)

Figura 1 ndash Fotomicrografia de arteacuteria coronariana com placa ateromatosa e formaccedilatildeo de trombo oclusivo (em vermelho) (Scientific American Brasil 2004)

De acordo com a American Heart Association (Stary et al 1995) as lesotildees

ateroscleroacuteticas podem ainda ser classificadas quanto agrave sua organizaccedilatildeo histoloacutegica da

seguinte forma

minus Lesotildees do Tipo I presenccedila de macroacutefagos e de foam cells isolados Aparecem na

primeira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo II satildeo as chamadas estrias gordurosas Apresentam-se como

lesotildees principalmente intracelulares caracterizadas por acuacutemulo lipiacutedico

Tambeacutem se iniciam na primeira deacutecada de vida

18

minus Lesotildees do Tipo III satildeo as chamadas intermediaacuterias pois satildeo semelhantes agraves

lesotildees do Tipo II mas apresentam acuacutemulo de lipiacutedeos extracelulares Comeccedilam

a se formar a partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo IV satildeo os ateromas Tambeacutem se assemelham agraves lesotildees Tipo II

mas agora haacute a presenccedila de um nuacutecleo lipiacutedico extracelular Tambeacutem aparecem a

partir da terceira deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo V satildeo denominadas fibroateromas Estas lesotildees satildeo

caracterizadas pelo nuacutecleo lipiacutedico e por uma camada fibrosa de tecido

conjuntivo ou por vaacuterios nuacutecleos e vaacuterias camadas fibrosas Jaacute haacute calcificaccedilatildeo da

lesatildeo Esta deposiccedilatildeo de material fibroso favorece a precipitaccedilatildeo de caacutelcio com

colesterol e outros lipiacutedeos na placa resultando em rigidez da parede vascular e

perda de distensibilidade que podem evoluir para a ruptura do vaso (GANONG

1997) Sua formaccedilatildeo ocorre a partir da quarta deacutecada de vida

minus Lesotildees do Tipo VI satildeo as lesotildees mais graves que podem ocorrer Apresentam a

superfiacutecie do ateroma defeituosa com hematomas hemorragias e coaacutegulos

Tambeacutem aparecem a partir da quarta deacutecada de vida

Normalmente as lesotildees ateroscleroacuteticas estatildeo localizadas nas bifurcaccedilotildees de arteacuterias

de tamanho meacutedio tais como as de coronaacuterias caroacutetidas arteacuterias vertebrais bem como na

aorta e em arteacuterias que suprem as extremidades baixas como arteacuterias iliacuteacas e femorais

(Munro et al 1988 Stary et al 1995) As lesotildees ateroscleroacuteticas que se localizam nas arteacuterias

coronarianas ou nas bifurcaccedilotildees carotiacutedeas podem liberar trombos que satildeo direcionados ao

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ceacuterebro provocando sintomas cerebrais transitoacuterios Entretanto a oclusatildeo da arteacuteria caroacutetida

interna proximal ou das ramificaccedilotildees cerebrais pode levar agrave obstruccedilatildeo isquemia e necrose de

uma porccedilatildeo de tecido cerebral (Stary et al 1995)

111 Aterosclerose e lipoproteiacutenas plasmaacuteticas

As lipoproteiacutenas do plasma satildeo agregados hidrossoluacuteveis de lipiacutedeos com proteiacutenas

especializadas (apolipoproteiacutenas) cuja funccedilatildeo eacute transportar lipiacutedeos como trigliceacuterides e

eacutesteres de colesterol do fiacutegado e intestino para outros tecidos do corpo para estoque ou

utilizaccedilatildeo como fonte de energia As apolipoproteiacutenas solubilizam e estabilizam os lipiacutedeos

insoluacuteveis das partiacuteculas de lipoproteiacutenas possibilitando este transporte

A LDL humana eacute uma partiacutecula esfeacuterica com limites de densidade entre 1019 e 1063

gmL diacircmetro variaacutevel de 19 a 25 nm e peso molecular de 25 milhotildees de daltons (Steinerovaacute et

al 2001) O nuacutecleo da partiacutecula conteacutem aproximadamente 1600 moleacuteculas de eacutesteres de

colesterol (CE) e 170 moleacuteculas de trigliceacuterides (TG) (Esterbauer et al 1990) A superfiacutecie da

lipoproteiacutena eacute constituiacuteda de uma monocamada que compreende cerca de 700 moleacuteculas de

fosfolipiacutedios e uma uacutenica moleacutecula de apolipoproteiacutena B-100 (apo B) Esta apolipoproteiacutena eacute

glicosilada e conteacutem aproximadamente 4536 aminoaacutecidos correspondendo a um peso molecular

de 550000 KDa Das cerca de 3000 moleacuteculas de aacutecidos graxos presentes na partiacutecula de LDL a

metade eacute composta por aacutecidos graxos poliinsaturados sendo predominantes os aacutecidos linoleacuteico

(182) e araquidocircnico (204) com uma quantidade relativamente pequena de aacutecido

docosahexaenoacuteico (226) (Esterbauer et al 1987) Os antioxidantes associados agrave lipoproteiacutena satildeo

de natureza lipossoluacutevel e o mais abundante eacute o α-tocoferol com aproximadamente 6 a 8

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moleacuteculas por partiacutecula de LDL Outros antioxidantes presentes na LDL incluem o γ-tocoferol

ubiquinol-10 β-caroteno licopeno criptoxantina e α-caroteno No entanto estes antioxidantes

ocorrem em baixas concentraccedilotildees nas partiacuteculas de LDL

Figura 2 ndash Modelo molecular esquemaacutetico de uma partiacutecula de LDL em condiccedilotildees fisioloacutegicas A partiacutecula representada tem um diacircmetro de 2 nm (fundo amarelado) e composiccedilatildeo meacutedia de 20 proteiacutena 20 fosfolipiacutedios 40 eacutesteres de colesterol 10 colesterol natildeo-esterificado e 5 trigliceacuteridesAs moleacuteculas individuais foram desenhadas usando o software Cerius2 (MSI Molecular Simulations Inc) A composiccedilatildeo das cadeias ilustradas acima eacute esfingomielina (SM) (160) fosfatidilcolina (PC) (160182∆912) trigliceacuterides (TG) (160182∆912140) eacutesteres de colesterol (CE) (182∆912) (Hevonoja et al 2000)

As descobertas da modificaccedilatildeo in vivo de LDL e do envolvimento das LDL

modificadas com a aterosclerose vieram da detecccedilatildeo de autoanticorpos contra LDL oxidadas

21

no plasma de humanos com aterosclerose (Palinsky et al 1989) Jaacute foram encontradas vaacuterias

alteraccedilotildees nas LDL plasmaacuteticas e que ocorrem in vivo Contudo a mais significativa destas

alteraccedilotildees eacute a peroxidaccedilatildeo da fraccedilatildeo lipiacutedica destas lipoproteiacutenas e oxidaccedilatildeo de resiacuteduos lisina

das apoproteiacutenas (parte proteacuteica) (Brown amp Goldstein 1983) Outra alteraccedilatildeo verificada e

associada agrave aterogecircnese foi a reduccedilatildeo de ateacute 75 no conteuacutedo de aacutecido siaacutelico em LDL

provenientes de pacientes com doenccedila coronariana oclusiva (Orekhov et al 1992) A

glicosilaccedilatildeo de LDL que ocorre em presenccedila de altas concentraccedilotildees de glicose circulantes no

diabetes induz a adesatildeo de monoacutecitos a ceacutelulas endoteliais apoacutes internalizaccedilatildeo mediada por

receptores (Kim et al 1994 Picard et al 1992)

O motivo pelo qual as LDL nativas satildeo modificadas ainda natildeo estaacute esclarecido

embora se suspeite que altas concentraccedilotildees de colesterol plasmaacutetico levem a uma circulaccedilatildeo

de LDL contendo colesterol por tempo maior ateacute que a lipoproteiacutena seja retirada do plasma o

que aumenta a probabilidade de que as LDL e seus conteuacutedos lipiacutedicos venham a ser oxidados

(Brown amp Goldstein 1990) O aumento da meia-vida das LDL no plasma deve-se agrave

ldquosaturaccedilatildeordquo do sistema de remoccedilatildeo destas partiacuteculas que eacute inibido pelo colesterol intracelular

cujas concentraccedilotildees por sua vez estatildeo elevadas quando o indiviacuteduo apresenta

hipercolesterolemia Eacute possiacutevel tambeacutem que a modificaccedilatildeo das LDL ocorra no local da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Steinberg et al 1989)

A LDL pode ser modificada oxidativamente por ceacutelulas endoteliais ceacutelulas

musculares lisas macroacutefagos plaquetas e outros tipos celulares (Malle amp Sattler 1994) As

partiacuteculas de LDL podem se ligar a proteoglicanos o que facilita a sua oxidaccedilatildeo por espeacutecies

reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio geradas pelas ceacutelulas da parede vascular Estas ceacutelulas

poderiam participar da oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas por diversos mecanismos como a) geraccedilatildeo

22

de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio b) fornecimento de substratos que geram

oxidantes extracelulares c) propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no meio e d) depleccedilatildeo de

antioxidantes da lipoproteiacutena

A mieloperoxidase (MPO) eacute uma enzima encontrada em neutroacutefilos e monoacutecitos que

tem sido detectada nas lesotildees ateroscleroacuteticas Esta enzima amplifica o potencial oxidante do

peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) utilizando-o como co-substrato para gerar compostos

oxidantes difusiacuteveis que podem oxidar nitrar e clorar lipiacutedeos e proteiacutenas da LDL (Podrez et

al 2000) Monoacutecitos-macroacutefagos das lesotildees ateroscleroacuteticas tambeacutem expressam a 15-

lipoxigenase enzima capaz de catalisar a formaccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos nas partiacuteculas de

LDL contribuindo para a formaccedilatildeo da LDL oxidada (Cathart amp Folcik 2000)

Os neutroacutefilos e as ceacutelulas endoteliais constituem uma fonte potencial para a

produccedilatildeo do acircnion radical superoacutexido (O2-) in vivo Os leucoacutecitos e as ceacutelulas endoteliais

conteacutem os complexos enzimaacuteticos da NAD(P)H-oxidase que embora apresentem

caracteriacutesticas distintas entre si geram grandes quantidades de radicais superoacutexido (Jesaitis et

al 1991 Souza et al 2001) A angiotensina II atraveacutes do receptor AT-1 promove

hiperregulaccedilatildeo de vaacuterias subunidades da NAD(P)H-oxidase das ceacutelulas endoteliais

aumentando a produccedilatildeo de radicais superoacutexido (Wolf 2000) A oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

plasmaacuteticas em indiviacuteduos hiperlipidecircmicos poderia tambeacutem ser facilitada pela maior

produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio por leucoacutecitos estimulados (Ludwig et al 1982

Proacutenai et al 1991 Lavy et al 1991 Krause et al 1993) uma vez que leucoacutecitos

mononucleares de pacientes com hiperlipidemia combinada ou hipertrigliceridemia liberam

maiores quantidades de espeacutecies reativas de oxigecircnio quando comparados aos indiviacuteduos

normolipidecircmicos (Hiramatsu amp Arimori 1988)

23

A oxidaccedilatildeo mediada pelo acircnion radical superoacutexido depende da presenccedila de metais de

transiccedilatildeo como cobre e ferro (Heinecke et al 1984) A concentraccedilatildeo destes metais na forma

livre eacute extremamente baixa no plasma pelo fato de estarem complexados agraves suas proteiacutenas

transportadoras que os impedem de participar de ciclos redox em condiccedilotildees fisioloacutegicas

(Halliwel amp Gutteridge 1985) Entretanto o acircnion radical superoacutexido pode liberar tanto o

ferro da ferritina em pH fisioloacutegico (Biemond et al 1986 Bolann amp Ulvik 1987) como o

cobre da superfiacutecie da ceruloplasmina que eacute a principal transportadora deste metal na

circulaccedilatildeo gerando espeacutecies que induzem a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas

(Fox et al 2000)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica ou lipoperoxidaccedilatildeo (LPO) consiste na incorporaccedilatildeo de

oxigecircnio molecular a um aacutecido graxo poliinsaturado (AGPI) para produzir um hidroperoacutexido

lipiacutedico (LOOH) como produto primaacuterio inicial Nos sistemas bioloacutegicos a LPO pode ocorrer

por duas vias principais (i) uma via enzimaacutetica envolvendo as ciclooxigenases e

lipooxigenases na oxigenaccedilatildeo dos AGPI e (ii) a peroxidaccedilatildeo natildeo enzimaacutetica que envolve a

participaccedilatildeo de espeacutecies ativas de oxigecircnio e nitrogecircnio metais de transiccedilatildeo e outros radicais

livres (Al Mehdi et al 1993 Porter et al 1995)

O processo da LPO pode ser dividido em trecircs etapas iniciaccedilatildeo propagaccedilatildeo e

terminaccedilatildeo A fase de iniciaccedilatildeo representa o iniacutecio da peroxidaccedilatildeo em que os AGPI sofrem o

ataque de uma espeacutecie suficientemente reativa capaz de abstrair um aacutetomo de hidrogecircnio de

um grupo metileno (-CH2-) formando um radical de carbono Este radical eacute estabilizado por

um rearranjo molecular para formar um dieno conjugado ou seja duas duplas ligaccedilotildees

intercaladas por uma ligaccedilatildeo simples (Halliwell amp Gutteridge 1999)

24

Em meio aeroacutebio o radical alquila inicialmente formado se combina com o oxigecircnio

formando o radical peroxila o qual pode abstrair um hidrogecircnio aliacutelico de um outro aacutecido

graxo gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa da propagaccedilatildeo A reaccedilatildeo do

radical peroxila com o aacutetomo de hidrogecircnio abstraiacutedo gera um hidroperoacutexido lipiacutedico

(LOOH) Peroacutexidos ciacuteclicos tambeacutem podem ser formados quando o radical peroxila reage

com uma dupla ligaccedilatildeo na mesma cadeia de aacutecido graxo o que tambeacutem pode propagar a LPO

(Halliwell amp Gutteridge 1999)

Iacuteons de metais de transiccedilatildeo como Fe n+ e Cu n+ podem participar do processo

catalisando a formaccedilatildeo de radicais lipiacutedicos alcoxila peroxila e hidroxila a partir dos

hidroperoacutexidos conforme demonstrado nas reaccedilotildees (1) e (2)

(1) LOOH + M n+ rarr LO + HO- + M n+1 reaccedilatildeo 1

(2) LOOH + M n+1 rarr LOO + H+ + M n+ reaccedilatildeo 2

A terceira e uacuteltima etapa da reaccedilatildeo a fase de terminaccedilatildeo daacute-se pela aniquilaccedilatildeo dos

radicais formados originando produtos natildeo radicalares (Gardner 1989 Halliwell amp

Gutteridge 1999) Os radicais peroxila e alcoxila tambeacutem podem sofrer dismutaccedilatildeo ou

clivagem formando aldeiacutedos formar uma ligaccedilatildeo covalente com resiacuteduos de aminoaacutecidos ou

sofrer um rearranjo formando produtos secundaacuterios da LPO (derivados hidroxi- ceto- ceto-

hidroxi- e epoxi-hidroxi-aacutecido graxo) (Lima E S amp Abdalla D S P 2001) conforme figura

3

25

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo (Lima E S amp Abdalla D S P 2001)

Os efeitos da lipoperoxidaccedilatildeo podem ser observados tanto pela mudanccedila no ambiente

lipiacutedico das membranas bioloacutegicas (modificaccedilotildees na fluidez e na seletividade) como tambeacutem

pelas alteraccedilotildees de suas proteiacutenas (receptores e canais iocircnicos) (YU 1994)

As proteiacutenas tambeacutem sofrem reaccedilotildees oxidativas iniciadas pelas espeacutecies ativas de

oxigecircnio que levam a alteraccedilotildees nas suas estruturas e nos seus estados conformacionais

Processos como fragmentaccedilatildeo e agregaccedilatildeo aleacutem da maior susceptibilidade a proteases

ilustram algumas das accedilotildees das espeacutecies ativas de oxigecircnio sobre as proteiacutenas (YU 1994)

26

112 Aterosclerose e apoptose

Diversos grupos de pesquisa tecircm demonstrado a ocorrecircncia de morte celular por

apoptose em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas bem como a presenccedila de fatores apoptoacuteticos nos

locais afetados (Hayakawa et al 1999 Cai et al 1997 Isner et al 1995 Han et al 1995

Kockx et al 1998)

Placas prestes ao rompimento apresentam uma delgada capa fibrosa com algumas

ceacutelulas musculares lisas vasculares e densa infiltraccedilatildeo de macroacutefagos (Davis et al 1996

Libby et al 1996 Libby et al 1995) As ceacutelulas musculares lisas vasculares satildeo importantes

na manutenccedilatildeo da resistecircncia tecircnsil da capa fibrosa pois estas ceacutelulas sintetizam fibras

colaacutegenas dos tipos I e III (Kockx amp Herman 1998) Embora se tenha verificado a ocorrecircncia

de apoptose em placas ateroscleroacuteticas humanas os mecanismos que desencadeiam os

processos apoptoacuteticos bem como sua contribuiccedilatildeo para a baixa densidade de ceacutelulas

musculares lisas vasculares na regiatildeo da placa permanecem desconhecidos

Sabe-se que modificaccedilotildees oxidativas da LDL estatildeo envolvidas na aterogecircnese e a

internalizaccedilatildeo de LDL oxidada (LDLox) por macroacutefagos e ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

leva agrave formaccedilatildeo de foam cells Tambeacutem se tem demonstrado que LDLox apresenta-se

citotoacutexica e capaz de promover apoptose em cultura de ceacutelulas de muacutesculo liso vascular

(Morel et al 1983 Jovinge et al 1997 Bjokerud amp Bjokerud 1996)

As LDL oxidadas satildeo citotoacutexicas para uma grande variedade de ceacutelulas e induzem

apoptose natildeo apenas em ceacutelulas musculares lisas mas tambeacutem em fibroblastos ceacutelulas

27

endoteliais e macroacutefagos in vitro As proteiacutenas proacute-apoptoacuteticas Fas Bax e Caspase 3 satildeo

geralmente encontradas no endoteacutelio e ceacutelulas musculares lisas proacuteximas ao luacutemen do vaso

enquanto Bcl-2 co-localiza-se com macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas de lesotildees

ateroscleroacuteticas (Norata et al 2002)

Diversos trabalhos relatam a presenccedila de macroacutefagos mortos em lesotildees

ateroscleroacuteticas humanas o que influencia a progressatildeo da lesatildeo Moleacuteculas aterogecircnicas e

trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas de macroacutefagos em processo de

morte particularmente morte por apoptose podem contribuir para a aterogecircnese ruptura da

placa e trombose aguda (Yao amp Tabas 2000) Deste modo tanto a ruptura da placa como

trombose aguda estatildeo intimamente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees os

quais contecircm debris de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995 Berberian et al 1990)

As possiacuteveis causas para a morte de macroacutefagos em lesotildees ateroscleroacuteticas incluem a

citotoxidade induzida pelo colesterol (Warner et al 1995 Tabas et al 1996) a privaccedilatildeo de

fatores de crescimento (Chin et al 1999) e a exposiccedilatildeo a lipoproteiacutenas oxidadas e outros

fatores como citokinas inflamatoacuterias e oacutexido niacutetrico (Mitchinson et al 1996 Lopez-Collazo et

al 1998)

O processo apoptoacutetico caracteriza-se morfologicamente por reduccedilatildeo no tamanho das

ceacutelulas condensaccedilatildeo do nuacutecleo e aparecimento de corpos nucleares devido agrave fragmentaccedilatildeo do

DNA Ocorre tambeacutem o surgimento de vesiacuteculas que satildeo rapidamente fagocitadas por

macroacutefagos ou por outras ceacutelulas adjacentes sem desencadear-se uma resposta inflamatoacuteria

(Martim 1993)

28

A regulaccedilatildeo dos mecanismos de apoptose eacute bastante complexa envolvendo fatores

como receptores e enzimas celulares Dentre estas destacam-se as caspases CD95 (APO-

1FAS) citocromo c CD36 inhibitors of apoptosis proteins (IAP) p53 e famiacutelia Bcl2 Esta

uacuteltima possui trecircs subfamiacutelias

1 Bcl2 composta pelos fatores anti-apoptoacuteticos bcl2 bclxL e bclw

2 Bax da qual fazem parte os fatores proacute-apoptoacuteticos bax bak e bok

3 BH3 constitui-se dos fatores proacute-apoptoacuteticos bik blk e bid (Adams amp Cory

1998)

Estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia ou lipoproteiacutenas

oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 primeiramente atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua

rota bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) Elevados niacuteveis de p53 levam a respostas

antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas tanto pela ativaccedilatildeo da expressatildeo de determinados genes

(p21WAF1 e Bax) pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de outros genes (IGF-II e Bcl-2) como tambeacutem

pela interaccedilatildeo direta proteiacutena-proteiacutena como ocorre entre helicases e caspases (Gottlieb amp

Oren 1998 Sheikh amp Fornace 2000)

O papel do p53 na proliferaccedilatildeo de ceacutelulas musculares lisas em lesotildees ateroscleroacuteticas

humanas tem sido um toacutepico particularmente popular na literatura (Tabas et al 2001) Por

outro lado a deficiecircncia de p53 estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo

ateroscleroacutetica (Tabas et al 2001) Desta forma pesquisas que busquem desvendar as

possiacuteveis propriedades proacute-aterogecircnicas de ceacutelulas deficientes em p53 especialmente

29

macroacutefagos associadas agrave investigaccedilatildeo do papel do p53 na captaccedilatildeo e metabolismo de

lipoproteiacutenas aterogecircnicas ou mesmo seu envolvimento na produccedilatildeo e secreccedilatildeo de outras

moleacuteculas proacute-aterogecircnicas pelas ceacutelulas do espaccedilo arterial satildeo de especial interesse (Tabas

2001)

12 Prostaglandinas ciclopentenocircnicas

Prostaglandinas formam um ramo de uma famiacutelia maior de compostos endoacutegenos

conhecida como eicosanoacuteides agrave qual tambeacutem pertencem os tromboxanos e leucotrienos Estes

compostos constituem um grupo variado de aacutecidos graxos de 20 carbonos insaturados e

oxigenados derivados do aacutecido araquidocircnico e outros aacutecidos graxos poliinsaturados e de

estrutura similar (aacutecido di-homo-linolecircnico aacutecido 58111417-eicosapentaenoacuteico e aacutecido

adrecircnico entre outros) Os eicosanoacuteides exercem efeitos profundos sobre praticamente todas

as ceacutelulas e tecidos sendo alvos potenciais nos tratamentos de vaacuterios estados patoloacutegicos

Prostaglandinas como PGA2 PGJ2 e 12-PGJ2 coletivamente chamadas de PGs

ciclopentenocircnicas (CP-PGs) satildeo produzidas in vivo por desidrataccedilatildeo de PGE2 (PGA2) e PGD2

(PGJ2 e 12-PGJ2) catalisada por albumina plasmaacutetica Estas prostaglandinas apresentam

mecanismos de accedilatildeo diferente do de outros eicosanoacuteides Sua produccedilatildeo estaacute relacionada com a

resposta celular ao estresse (atividade citoprotetora) As prostaglandinas ciclopentenocircnicas

apresentam atividade antiproliferativa em funccedilatildeo do grupo cetona insaturado

As CP-PGs satildeo ativamente transportadas ao interior das ceacutelulas atraveacutes de carreador

especiacutefico que reconhece o grupamento ciclopentenocircnico insaturado e localizam-se no

nuacutecleo celular Estas PGs impedem a progressatildeo de ceacutelulas aleacutem da fase G1 do ciclo celular

inibindo a siacutentese de novo de moleacuteculas de DNA polimerases embora sem interferir na

atividade destas enzimas o que resulta na inibiccedilatildeo da siacutentese de DNA pela ceacutelula As CP-PGs

tambeacutem promovem desorganizaccedilatildeo de filamentos de actina do citoesqueleto e inibem a

reciclagem de fosfoinositiacutedeos de membrana Deste modo as CP-PGs podem ser mediadores

31

fisioloacutegicos de mecanismo geral de defesa celular contra agentes estressantes ou de

autocontrole da atividade proliferativa (Choi et al 1992 Thompson 1995)

Com respeito agrave aterosclerose uma das primeiras respostas da parede arterial a

estiacutemulos nocivosaterogecircnicos (como hiperlipidemia e hipertensatildeo arterial) eacute a produccedilatildeo de

autacoacuteides derivados do endoteacutelio como prostaglandinas (PGs) especialmente a prostaciclina

(PGI2) e o oacutexido niacutetrico (NO) (Schmitz et al 1991) Se por um lado estes compostos estatildeo

implicados na defesa e manutenccedilatildeo da quiescecircncia da parede vascular evidecircncias sugerem que

deficiecircncias na produccedilatildeo de PGs e NO estejam envolvidas no estabelecimento da aterosclerose

(Gross amp Wolin 1995 Harrison 1997 Michel amp Feron 1997)

Sabe-se que as PGs do tipo E diminuem o tamanho de enfartos miocaacuterdicos

experimentais em catildees atraveacutes do bloqueio da migraccedilatildeo e ativaccedilatildeo de neutroacutefilos (Simpsos et

al 1998) aleacutem de estimularem a captaccedilatildeo de colesterol por HDL a partir de macroacutefagos

(Bernard et al 1991) Isso leva a uma diminuiccedilatildeo dos conteuacutedos intracelulares de colesterol e

reduccedilatildeo do risco de acuacutemulo de liacutepides Por outro lado macroacutefagos que ocupam papel de

destaque na iniciaccedilatildeo e no desenvolvimento da lesatildeo ateroscleroacutetica satildeo produtores de

grandes quantidades de PGE2 e seu isocircmero a PGD2 (Scott 1982 Urade et al 1989) que

por sua vez podem ser transformadas facilmente no plasma in vivo em PGA2 e ∆12-PGJ2 e

seus derivados (Ohno et al 1986 Narumiya amp Fukushima 1985 Kikawa et al 1984

Fitzpatrick amp Wynalda 1983)

Altos niacuteveis de estresse de cisalhamento interleucina 1 (IL-1β) e fator de necrose

tumoral alfa (TNFα) derivados de macroacutefagos ativadores da proteiacutena quinase C (PKC) bem

como o estresse oxidativo da parede arterial levam agrave ativaccedilatildeo do fator transcripcional NF-κB

32

que dispara a transcriccedilatildeo de uma grande variedade de genes tanto nas ceacutelulas endoteliais

quanto nas ceacutelulas musculares lisas Por sua vez o NF-κB ativado precipita nestas ceacutelulas a

transcriccedilatildeo de fatores de crescimento citocinas moleacuteculas de adesatildeo intercelulares e fatores

de transcriccedilatildeo relacionados ao processo de proliferaccedilatildeo celular (Griendling amp Alexander

1996 Colins et al 1995 Resnik e Gimbrone 1995)

Sabe-se que as CP-PGs satildeo ativadoras da via das HSP (heat shock protein) (Amici et

al 1992 Rossi e Santoro 1995) e que estas levam agrave citoproteccedilatildeo atraveacutes da inibiccedilatildeo dos

mecanismos de ativaccedilatildeo do NF-κB em diversos tipos celulares jaacute estudados incluindo as

ceacutelulas musculares lisas dos vasos (Rossi et al 1997 Wong et al 1997 Kim et al 1997

Nagoshi et al 1998 Feinstein et al 1996) Na verdade as CP-PGs bloqueiam a ativaccedilatildeo do

NF-κB atraveacutes da inibiccedilatildeo da I-κB quinase enzima que precipita a ativaccedilatildeo deste fator nuclear

(Rossi et al 2000)

Tanto a expressatildeo como a ativaccedilatildeo do fator de diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos PPAR-γ

(receptor nuclear ativado por proliferadores de peroxissomas) estatildeo dramaticamente

estimuladas em lesotildees ateroscleroacuteticas humanas (Ricote et al 1998) A ativaccedilatildeo do PPAR-γ

em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger CD36FAT caracteriacutestica de

macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998)

As lipoproteiacutenas de baixa densidade (LDL) oxidadas contecircm altas concentraccedilotildees de

derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-ocatadecadienoacuteico) que

satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nagy et al 1998) Assim a ativaccedilatildeo do PPAR-γ induz a

um ciclo que perpetua a lesatildeo ateroscleroacutetica jaacute que componentes das LDL oxidadas ativam

33

este fator que desencadeia a expressatildeo de receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de

cada vez mais moleacuteculas de LDL oxidadas contendo mais ativadores do PPAR-γ

As CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do

PPAR-γ podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose Jaacute as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 natildeo levam agrave ativaccedilatildeo deste fator nuclear (Formam et al 1995) Ao contraacuterio estudos

sugerem que PGs da famiacutelia da PGA2 sejam citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees

intracelulares de colesterol (Senna et al 1998) CP-PGs desviam o metabolismo lipiacutedico de

macroacutefagos inflamatoacuterios no sentido da produccedilatildeo de fosfoliacutepides o que resulta numa grande

diminuiccedilatildeo no acuacutemulo de colesterol eacutesteres de colesterol e aacutecidos graxos por estas ceacutelulas

Assim as CP-PGs e o NO compartilham a propriedade de induzir citoproteccedilatildeo atraveacutes da

ativaccedilatildeo da via metaboacutelica das HSP pela inibiccedilatildeo do NF-κB inibindo os efeitos citotoacutexicos

decorrentes da ativaccedilatildeo deste fator transcricional

Outro efeito positivo das CP-PGs na aterosclerose diz respeito agrave siacutentese de colesterol

A homeostase intracelular de colesterol eacute sustentada em ceacutelulas de mamiacuteferos por uma

intrincada seacuterie de mecanismos que levam ao preciso balanccedilo entre o imput (siacutentese de novo

de liacutepides a partir do acetil-CoA via HMG-CoA redutase e captaccedilatildeo via lipoproteiacutenas) e o

output (efluxo) de colesterol pelas ceacutelulas (Goldstein amp Brown 1990) A pesar de desbalanccedilos

no metabolismo lipiacutedico em geral serem caracteriacutesticas marcantes do processo de

aterosclerose e a hiperlipidemia estar fortemente associada ao desenvolvimento da doenccedila o

mecanismo pelo qual as ceacutelulas participantes da lesatildeo acumulam lipiacutedios permanece por ser

estudado

34

A lipogecircnese em macroacutefagos eacute um fenocircmeno essencial para a sua funcionalidade

uma vez que estas ceacutelulas apresentam uma altiacutessima taxa de renovaccedilatildeo de membranas (t12 ~30

min) e intensa produccedilatildeo e secreccedilatildeo de mediadores lipiacutedicos (Steiman et al 1983) Entretanto

o efeito de autacoacuteides derivados de ceacutelulas endoteliais sobre a lipogecircnese e exportaccedilatildeo de

lipiacutedios em macroacutefagos permanece por ser investigada e seu estudo poderaacute esclarecer aspectos

criacuteticos do funcionamento de macroacutefagos na aterosclerose Sabe-se que a PGA2 desvia o

metabolismo lipiacutedico de macroacutefagos reduzindo a siacutentese de novo de colesterol trigliceacuterides e

aacutecidos graxos livres (Senna et al 1998)

Uma vez que o acuacutemulo de lipiacutedios por macroacutefagos pode estar relacionado com

disfunccedilotildees na capacidade de regulaccedilatildeo da siacutentese e exportaccedilatildeo destes lipiacutedios a investigaccedilatildeo

do mecanismo de accedilatildeo das CP-PGs sobre tal siacutentese atraveacutes da medida da expressatildeo gecircnica de

enzimas reguladoras do metabolismo lipiacutedico como a HMG-CoA redutase eacute de grande

importacircncia para esclarecer o papel das CP-PGs no processo de resposta agrave injuacuteria Deste

modo os mecanismos pelos quais as prostaglandinas ciclopentenocircnicas podem interferir na

regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo de fatores nucleares como PPAR-γ bem como o modo como estes

compostos podem influenciar no comportamento de macroacutefagos e sua diferenciaccedilatildeo em

macroacutefagos foam cells permanecem obscuros

Conforme jaacute discutido em seccedilotildees anteriores neste trabalho a modificaccedilatildeo oxidativa

das lipoproteiacutenas de baixa densidade no plasma in vivo eacute um evento criacutetico na patogenia da

aterosclerose Durante o desenvolvimento da lesatildeo vascular diversas populaccedilotildees celulares

sofrem alteraccedilotildees fisioloacutegicas que culminam com a formaccedilatildeo da placa de ateroma entre elas

ceacutelulas de muacutesculo liso vascular ceacutelulas endoteliais e principalmente macroacutefagos

35

O papel central dos macroacutefagos no desenvolvimento da placa ateromatosa estaacute

relacionado agrave sua diferenciaccedilatildeo em foam cells caracteriacutesticas deste estado patoloacutegico Os

macroacutefagos satildeo capazes de internalizar lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas via

receptores especiacuteficos como os receptores de scavenger CD36 Estas ceacutelulas tambeacutem tem a

capacidade de acumular eacutesteres de colesterol em gotiacuteculas citoplasmaacuteticas

A captaccedilatildeo de LDL oxidadas eou siacutentese endoacutegena de colesterol pelos macroacutefagos

deficiecircncias no mecanismo de exportaccedilatildeo de liacutepides e a ativaccedilatildeo de fatores nucleares

reguladores da transcriccedilatildeo de genes especiacuteficos interferem nas alteraccedilotildees fenotiacutepicas sofridas

durante o processo de diferenciaccedilatildeo em foam cells

Neste contexto proteiacutenas envolvidas no processo de difrenciaccedilatildeo de macroacutefagos em

foam cells como CD36 (receptor de LDLox) HMG-CoA redutase (enzima reguladora da

siacutentese endoacutegena de colesterol) e fatores nucleares como NF-κB e PPAR-γ satildeo de especial

interesse para o esclarecimento do processo aterogecircnico

Da mesma forma a compreensatildeo dos processos que regulam a maquinaria

intracelular de apoptose pode trazer grandes progressos na busca de terapias eficazes para o

combate desta doenccedila Destacam-se o fator supressor de tumor p53 o PPAR-γ proteiacutenas da

famiacutelia das caspases e proteiacutenas da famiacutelia Bcl

36

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem o objetivo de verificar os possiacuteveis efeitos das prostaglandinas

ciclopentenocircnicas PGA2 e 15-d-PGJ2 sobre a expressatildeo gecircnica do fator nuclear PPAR-γ do

receptor de scavenger CD36 das proteiacutenas de apoptose p53 caspase 3 e Bcl-xL e da enzima

chave da siacutentese endoacutegena de colesterol HMG-CoA redutase em macroacutefagos e macroacutefagos

foam cells

37

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 Separaccedilatildeo das lipoproteiacutenas do plasma

Para a induccedilatildeo da diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas preacute-monociacuteticas humanas (linhagem

U937) em macroacutefagos foam cells mediada por LDL oxidada fez-se necessaacuterio isolar

partiacuteculas destas lipoproteiacutenas nativas do plasma humano e oxidaacute-las no laboratoacuterio Deste

modo foram realizados os procedimentos experimentais subsequumlentemente descritos

As lipoproteiacutenas foram separadas do plasma segundo Havel et al (1955) com

algumas modificaccedilotildees

Foram coletadas bolsas de sangue de indiviacuteduos saudaacuteveis normolipidecircmicos do

sexo masculino com idade entre 25 e 35 anos Apoacutes a coleta hematoacutecrito e plasma foram

separados por centrifugaccedilatildeo a 2500 rpm (10 min 4degC) Ao plasma foram adicionados os

inibidores de protease Aprotinina (2ugmL) PMSF (1mM) e Benzamidina (2 mM) e o

antioxidante BHT (20mM) a fim de inibir a atividade de proteases presentes na amostra e

evitar a oxidaccedilatildeo preacutevia das lipoproteiacutenas durante o procedimento de separaccedilatildeo

Na primeira etapa de separaccedilatildeo foi feita ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial das

lipoproteiacutenas ajustando-se a densidade do plasma para d=1019 gmL com sal de KBr Apoacutes

12 horas de centrifugaccedilatildeo em rotor 50 Ti (Beckmann) 4degC 40000 rpm obteve-se uma fraccedilatildeo

de plasma livre de quilomiacutecrons e VLDL eliminando-se o sobrenadante que continha essas

38

lipoproteiacutenas A este plasma adicionou-se sal de KBr para novo ajuste de densidade desta vez

para d=1055 gmL (para a obtenccedilatildeo de uma fraccedilatildeo livre de Lp(a) segundo Havel et al 1955)

O plasma entatildeo livre de quilomiacutecrons e VLDL passou por uma nova etapa de centrifugaccedilatildeo

desta vez durante 20 horas a 40000 rpm 4degC rotor 50 Ti (Beckmann) para a separaccedilatildeo da

fraccedilatildeo contendo LDL

As lipoproteiacutenas assim obtidas foram entatildeo dialisadas contra PBS contendo o

antioxidante EDTA 001 (100 vezes o volume) em dialisador giratoacuterio durante 12 h em

geladeira e ao abrigo da luz para a remoccedilatildeo do sal de KBr anteriormente adicionado As

concentraccedilotildees de colesterol (Kit Biosystemreg cat ndeg 11505) e trigliceriacutedeos (Kit Biosystemreg

cat ndeg 11528) totais presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica de LDL foram determinadas atraveacutes de

meacutetodos enzimaacuteticos utilizando-se reagentes comerciais (Biosystemreg Barcelona Espanha)

Os valores obtidos foram ajustados para um iacutendice de recuperaccedilatildeo de 100 visando

contornar as perdas ocorridas durante o processo de ultracentrifugaccedilatildeo

Quadro 1 ndash Soluccedilatildeo de Diaacutelise para LDL (10 x concentrada)

NaCl8788 g EDTA N2372 g NaN3 (tritriplex)195 g Trizma1211 g H2O milli-Q qsp1000 mL

O pH da soluccedilatildeo foi ajustado em 74 e esta foi guardada em geladeira ateacute o momento

da sua utilizaccedilatildeo quando foi diluiacuteda (110 em H2O milli-Q)

39

311 Purificaccedilatildeo da LDL por HPLC

As amostras de LDL separadas por ultracentrifugaccedilatildeo foram purificadas por HPLC

utilizando-se a teacutecnica descrita por Hodis et al (1994) com algumas modificaccedilotildees Este

procedimento teve como objetivo eliminar eventuais partiacuteculas de HDL ou outras

lipoproteiacutenas que natildeo LDL que possam estar presentes na fraccedilatildeo lipoproteacuteica obtida apenas

por centrifugaccedilatildeo visto que a natureza heterogecircnea destas partiacuteculas com respeito agrave sua

densidade jaacute foi bem descrita na literatura

Como primeiro passo para a purificaccedilatildeo das lipoproteiacutenas por HPLC as amostras

foram purificadas em colunas de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover

possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas (Hi TrapTM Blue Amersham

Pharmacia Biotech) e depois concentradas em concentrador MolecularPorreg (Spectrumreg

Califoacuternia EUA) com membrana MolecularPorreg Type C (CE) MWCO 50000 ateacute a

concentraccedilatildeo proteacuteica de 1mgmL (Lowry 1950) Com este procedimento partiacuteculas menores

que 50000 KDa passam pelo filtro e satildeo eliminadas enquanto partiacuteculas de tamanho superior

a 50000 KDa como a LDL com 55000 KDa permanecem retidas no filtro Para evitar a

preacutevia oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas pela exposiccedilatildeo ao ar luz ou calor o concentrador utilizado

era preenchido com atmosfera de N2 sua superfiacutecie transparente era envolvida externamente

em papel alumiacutenio e o concentrador permanecia em gelo durante o tempo necessaacuterio ao

procedimento

Apoacutes a LDL foi filtrada em filtro Nalgenereg de 022 microm para eliminaccedilatildeo de

partiacuteculas de poeira bacteacuterias ou outras capazes de danificar a coluna ou as amostras e

40

purificada por cromatografia liacutequida de alta performance com o auxiacutelio de uma coluna de

troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) O sistema de tampotildees utilizado para a separaccedilatildeo por

gradiente foi composto pelas seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A constituiacuteda de Tris (20 mM)

pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20mM) ndash NaCl (1M) pH 74

Quadro 2 ndash Soluccedilatildeo A (TRIS 20 mM)

Tris (grau HPLC)2422g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 78 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Quadro 3ndash Soluccedilatildeo B (TRIS 20 mM ndash NaCl 1 M)

Tris (grau HPLC)2422 g NaCl58440 g H2O milli-Q qsp1000 mL Ajustar pH em 74 e filtrar em filtro 022 microm (Milliporereg)

Foram reconhecidos trecircs picos no cromatograma LDL nativa LDL-1 e LDL-2

conforme apresentado na figura 1 Como LDL nativa entendam-se as partiacuteculas de LDL que

permaneceram iacutentegras LDL-1 corresponde a LDL eletronegativa forma fisiologicamente

modificada de LDL cuja partiacutecula apresenta um aumento na sua carga negativa Quanto ao

pico aqui denominado LDL-2 este compreende partiacuteculas de LDL oxidadas durante o

processo de purificaccedilatildeo que apresentam aumento ainda mais acentuado em sua carga

negativa

41

LDL

nativ

a

L DL- 1

LDL-2

Figura 4 ndash Purificaccedilatildeo de lipoproteiacutenas de baixa densidade por HPLC As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas por ultracentrifugaccedilatildeo sequumlencial de plasma humano foram dialisadas contra PBS e purificadas por uma coluna de cromatografia por afinidade com a proteiacutena A para remover possiacuteveis contaminaccedilotildees com albumina e imunoglobulinas Depois as amostras foram concentradas em concentrador Molecular conforme descrito em materiais e meacutetodos As lipoproteiacutenas foram entatildeo purificadas por HPLC passando por uma coluna de troca iocircnica (PRP-X500 Hamilton) A separaccedilatildeo por gradiente utilizou as seguintes fases moacuteveis soluccedilatildeo A Tris (20 mM) pH 78 e soluccedilatildeo B Tris (20 mM) ndash NaCl (1 M) pH 74 A fraccedilatildeo de lipoproteiacutenas injetada em cada corrida apresentava trecircs picos LDL nativa que era coletada apoacutes 6 minutos de corrida LDL-1 minimamente oxidada detectada apoacutes 17 minutos de corrida e LDL-2 fortemente eletronegativa detectada apoacutes 23 minutos de corrida

As amostras referentes ao pico da LDL nativa foram coletadas e novamente dialisadas

contra PBS com EDTA 001 para a remoccedilatildeo dos sais contidos na fase moacutevel do HPLC e

concentradas em atmosfera de N2 no gelo e ao abrigo da luz conforme anteriormente descrito

A concentraccedilatildeo de proteiacutena na LDL purificada e concentrada foi determinada pelo meacutetodo de

Lowry (1950) As lipoproteiacutenas purificadas foram filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em

condiccedilotildees esteacutereis aliquotadas e acondicionadas em frascos esteacutereis em atmosfera de N2 e

permaneceram em geladeira a 4degC e ao abrigo da luz ateacute o momento de sua utilizaccedilatildeo

Para assegurar a ausecircncia de HDL e Lp(a) na fraccedilatildeo purificada foi realizado dot blot

na amostra Neste procedimento gotas de amostra foram adicionadas a pedaccedilos de membrana

42

de nitrocelulose ateacute sua total absorccedilatildeo (30 a 60 minutos em temperatura ambiente) Apoacutes as

membranas foram lavadas em PBS e mergulhadas em soluccedilatildeo de bloqueio (blotto) rica em

proteiacutena no caso albumina durante 60 minutos

Passado este periacuteodo as membranas foram novamente incubadas em soluccedilatildeo de

bloqueio contendo anticorpos especiacuteficos diluiacutedos (Goat anti-human-α-lipoprotein (HDL)

Mouse anti-human Lp(a) e Goat anti-human-β-lipoprotein (LDL)) durante 60 minutos

lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) e incubadas com os anticorpos

conjugados agrave enzima peroxidase reativos a imunoglobulina G do animal produtor dos

anticorpos especiacuteficos por mais 60 minutos sob agitaccedilatildeo em temperatura ambiente As

membranas foram entatildeo lavadas em PBS (3x de 10 minutos cada em agitaccedilatildeo) para a

remoccedilatildeo dos conjugados livres e reveladas por reaccedilatildeo com peroacutexido de hidrogecircnio As

soluccedilotildees foram preparadas conforme segue

Quadro 4 ndash Soluccedilatildeo de Bloqueio (BLOTTO)

BSA1 g NaN320 mg Tween 2050 microL PBS qsp100 mL

Quadro 5 ndash Substrato para Peroxidase

33rsquo-diaminobenzidina (DAB-4HCl)601 mg H2O2 30 10 microL Tris (pH = 76) qsp10 mL

Quadro 6 ndash PBS

NaCl 1368 mM8 g

43

KCl 27 mM020 g KH2PO4 09 mM012 g Na2HPO4 64 mM091 g H2O milli-Q qsp1000 mL

Os resultados do dot blot para HDL (Goat anti-human-α-lipoprotein) LDL (Goat

anti-human-β-lipoprotein) e Lp(a) (Mouse anti-human Lp(a)) satildeo apresentados na figura 5

Figura 5 ndash Dot blot LDL HDL e Lp(a) Foram aplicadas gotas de amostras purificadas em membrana de nitrocelulose que posteriormente foi incubada com anticorpos especiacuteficos (Goat anti-human-α-lipoprotein Goat anti-human-β-lipoprotein e Mouse anti-human Lp(a)) Num segundo momento as mesmas membranas foram lavadas em PBS e incubadas com os anticorpos anti IGg dos animais que forneceram o primeiro anticorpo conjugados agrave enzima peroxidase A reaccedilatildeo da peroxidase com o substrato pode ser visualizada na membrana O sinal (+) corresponde agrave regiatildeo de aplicaccedilatildeo da amostra purificada e o sinal (-) corresponde a aplicaccedilatildeo de albumina seacuterica bovina (BSA) utilizada como controle negativo

312 Curva de xidaccedilatildeo da LDL

Para a obtenccedilatildeo de LDL oxidada as amostras de LDL nativa purificada (1 mgmL de

proteiacutena) foram novamente dialisadas contra PBS durante 12 h conforme anteriormente

descrito para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA 001 e incubadas a 37degC sob agitaccedilatildeo

anti apo B-100 anti apo A-1 anti Lp(a)

44

constante com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 5 microM e 500 microM durante 1 2 e 3horas

para o estabelecimento da metodologia mais adequada para a oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas Esta

curva de oxidaccedilatildeo foi elaborada em virtude da grande variaccedilatildeo nos protocolos para a oxidaccedilatildeo

de lipoproteiacutenas disponiacuteveis na literatura principalmente no tocante a concentraccedilatildeo de CuSO4

e tempo de incubaccedilatildeo (Hiroaki et al 2000 Valkonen et al 1998 Liu et al 1999) Deste

modo buscou-se verificar que tipo de oxidaccedilatildeo seria mais conveniente para o experimento

capaz de realizar a lipoperoxidaccedilatildeo na partiacutecula de LDL com geraccedilatildeo de produtos derivados

do processo para sua mensuraccedilatildeo poreacutem sem prejudicar a integridade estrutural da

apolipoproteiacutena da partiacutecula de LDL

Ao final dos tempos de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada

com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1mL de reaccedilatildeo) As amostras de LDL

foram entatildeo novamente dialisadas contra PBS com EDTA 001 (24h em geladeira) para a

remoccedilatildeo total do CuSO4 e filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm em condiccedilotildees esteacutereis

Todas as amostras foram mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos

Uma das teacutecnicas mais utilizadas para se avaliar o grau de oxidaccedilatildeo de lipiacutedeos eacute o

teste do malondialdeiacutedo (MDA) O MDA eacute um dialdeiacutedo formado como um produto

secundaacuterio durante a oxidaccedilatildeo de AGPI por cisatildeo beta dos AGPI peroxidados principalmente

o aacutecido araquidocircnico Eacute volaacutetil possui baixo peso molecular (C3H4O2 PM = 7207) tem uma

cadeia curta 13-dicarbonil e eacute um aacutecido moderadamente fraco (pKa = 446) Em condiccedilotildees

apropriadas de incubaccedilatildeo (meio aacutecido e aquecimento) reage eficientemente com uma

variedade de agentes nucleofiacutelicos para produzir cromoacutegenos com alta absortividade molar no

espectro visiacutevel (Janero 1990 Benzie 1996)

45

A sua condensaccedilatildeo com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) forma produtos que podem ser

determinados por absorccedilatildeo no visiacutevel (532 nm) ou por fluorescecircncia (λexc = 515 nm e λem =

553 nm) O teste padratildeo consiste na medida de um cromoacutegeno roacuteseo formado pela reaccedilatildeo do

MDA com duas moleacuteculas de aacutecido tiobarbituacuterico em meio aacutecido e sob alta temperatura

sendo conhecido como ldquoteste das substacircncias reativas com o aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS)rdquo

Este meacutetodo eacute de faacutecil aplicaccedilatildeo e fornece informaccedilotildees sobre a extensatildeo da LPO em sistemas

simples in vitro (Esterbauer et al 1984)

Para a aplicaccedilatildeo do teste de TBARS as amostras de LDL oxidadas conforme

anteriormente descrito foram separadas em aliacutequotas de 50 microl Adicionou-se a cada aliacutequota

200 microl de aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) a 30 As amostras foram agitadas em vortex por 1

minuto e em seguida acrescidas de 200 microl de tampatildeo Tris-HCl pH 74 Apoacutes a adiccedilatildeo do

tampatildeo as amostras foram agitadas por mais um minuto Feito isso adicionou-se 200 microl de

aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) a 073 Finalmente as amostras foram homogeneizadas e

incubadas em banho fervente por uma hora Passado este periacuteodo procedeu-se a centrifugaccedilatildeo

das amostras durante 5 minutos a 2500 rpm 4ordmC O sobrenadante foi coletado sendo a

absorbacircncia monitorada em 535 nm em espectrofotocircmetro (Beckman Model DU640 -

EUA) Os valores foram expressos em nmol de equivalentes de TBARSmg de proteiacutena Todas

as anaacutelises foram realizadas em triplicata

Quadro 7 ndash TRIS-HCl (pH = 74)

Soluccedilatildeo (A) (Tris 02 M)

Trishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2424 g H2O milli-Q qsp100 mL

46

Soluccedilatildeo (B) (HCl 01 N)

HCl08309 mL H2O milli-Q qsp100 mL

25 mL de soluccedilatildeo (A) + 4243 mL de soluccedilatildeo (B) e H2O milli-Q qsp 500 mL

Ajustar pH em 74

As substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico (TBARS) como o MDA que foram

produzidas em cada ponto da curva de oxidaccedilatildeo foram quantificadas e utilizadas como

indicador da eficiecircncia da reaccedilatildeo de lipoperoxidaccedilatildeo da LDL nativa purificada no laboratoacuterio

Deste modo os diferentes tempos de incubaccedilatildeo e diferentes concentraccedilotildees de CuSO4

utilizadas na montagem do protocolo de oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas foram testados quanto agrave

sua eficiecircncia em produzir TBARS Os resultados obtidos podem ser visualizados na figura

que segue

47

Curva de oxidaccedilatildeo (LDL)

03904

03234

02089

03185

02276

01897

01857

0 005 01 015 02 025 03 035 04 045

LDLox 3h (50uM)

LDLox 2h (50uM)

LDLox 1h (50uM)

LDLox 3h (5uM)

LDLox 2h (5uM)

LDLox 1h (5uM)

LDLnat

Tra

tam

ento

s

Concentraccedilatildeo de MDA (nM)

Figura 6 ndash Curva de oxidaccedilatildeo da LDL As lipoproteiacutenas de baixa densidade obtidas apoacutes purificaccedilatildeo por HPLC foram dialisadas contra PBS para a remoccedilatildeo do antioxidante EDTA e oxidadas por incubaccedilatildeo a temperatura de 37 degC sob agitaccedilatildeo com CuSO4 em PBS nas concentraccedilotildees de 50 microM e 500 microM durante 1 2 e 3 horas Ao teacutermino de cada tempo de incubaccedilatildeo a reaccedilatildeo de oxidaccedilatildeo com CuSO4 foi bloqueada com EDTA 1mM em PBS (20 microL de EDTA para cada 1 mL de reaccedilatildeo Os resultados obtidos satildeo expressos em nM de MDAmg de proteiacutena e mostram uma maior produccedilatildeo de MDA nas partiacuteculas de LDL oxidadas com CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) indicando a eficiecircncia destes protocolos na oxidaccedilatildeo das partiacuteculas de LDL

314 Integridade das lipoproteiacutenas oxidadas

Apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo experimental das LDL previamente purificadas fez-se

necessaacuterio avaliar a integridade estrutural das partiacuteculas uma vez que estas devem ter suas

caracteriacutesticas de reatividade bioloacutegica preservadas

Particularidades como tamanho das partiacuteculas peso molecular e mobilidade

eletroforeacutetica bem como reconhecimento por anticorpos especiacuteficos como na teacutecnica de

immunoblotting satildeo uacuteteis na avaliaccedilatildeo da situaccedilatildeo estrutural das lipoproteiacutenas Neste sentido

48

a teacutecnica de eletroforese em gradiente vincula a migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas atraveacutes da

matriz com o concomitante aumento na concentraccedilatildeo do gel de poliacrilamida O tamanho do

poro da matriz eacute progressivamente reduzido conforme as concentraccedilotildees do gel aumentam

Isto resulta em um diferencial de retardo na migraccedilatildeo de partiacuteculas carregadas sendo uacutetil na

descriccedilatildeo de subpopulaccedilotildees de HDL e LDL (Krauss amp Burke 1982)

Assim as lipoproteiacutenas experimentalmente oxidadas foram submetidas agrave eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 com a

finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo em

cada tratamento

Para o procedimento foram preparados simultaneamente dois geacuteis de poliacrilamida

de diferentes concentraccedilotildees 5 e 15 Uma vez preparados os geacuteis foram distribuiacutedos em

bomba de gradiente e aplicados a cuba Passadas cerca de 12h periacuteodo referente agrave

polimerizaccedilatildeo o gel de entrada foi carregado com as amostras de LDL ndash 25 microL de amostra (1

mgmL) + 6 microL de tampatildeo de amostra + 9 microL de aacutegua milli-Q As primeiras 2 horas de corrida

ocorreram com amperagem variaacutevel e voltagem constante em 50 V Nas 4 horas seguintes a

voltagem utilizada foi de 150 V As soluccedilotildees utilizadas foram preparadas conforme segue

Quadro 8 ndash Soluccedilatildeo AcrilamidaBis-Acrilamida

Acrilamida3000g Bis-acrilamida080g H2O milli-Q qsp10000mL

Quadro 9 ndash Tris (Separaccedilatildeo)

Tris base 15 M1817 g

49

SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 88

Quadro 10 ndash Tris (empilhamento)

Tris base 05 M606 g SDS 20 200 mL H2O milli-Q qsp10000 mL O pH foi ajustado em 68

Quadro 11 ndash Gel de Entrada (Empilhamento ndash 5 )

Acrilamidabis067 mL Tris (empilhamento)100 mL H2O milli-Q230 mL TEMED1000 microL APS (10 )3000 microL

Quadro 12 ndash Geacuteis de Separaccedilatildeo

GEL 5 15 Acrilamidabis17 mL50 mLTris (separaccedilatildeo)25 mL25 mLH2O milli-Q58 mL25 mLTEMEDhelliphelliphellip100 microLhelliphellip50 microL APS (10 )500 microLhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip500 microL

Quadro 13 ndash Tampatildeo de Amostra

Tris 00625 M Glicerol (vv) 10 SDS 3 2-mercaptoetanol 5 Azul de bromofenol 0001 HCl para o ajuste de pH em 68

50

Quadro 14 ndash Tampatildeo de Eletroforese (10 x concentrado)

Tris 025 M Glicina 192 M SDS 1 H2O qsp

Quadro 15 ndash Corante

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 10 Comassie blue 01 H2O qsp

Quadro 16 ndash Descorante Forte

Metanol 50 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Quadro 17 ndash Descorante Fraco

Metanol 35 Aacutecido aceacutetico 7 H2O qsp

Analisando-se a figura 6 como os pontos CuSO4 5 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) e

CuSO4 50 microM (2 e 3 horas de incubaccedilatildeo) apresentaram maiores valores de TBARS realizou-se

eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a

51

15 com a finalidade de verificar a integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de

LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva

A visualizaccedilatildeo do gel indica uma maior integridade da apolipoproteiacutena B-100 das

partiacuteculas de LDL oxidadas utilizando-se CuSO4 na concentraccedilatildeo de 5 microM com tempo de

incubaccedilatildeo de 3h em relaccedilatildeo aos demais pontos da curva que apresentaram maior TBARS

Bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

O gel fotografado foi carregado com LDL nativa LDLox (CuSO4 5 microM 3h) LDLox

(CuSO4 5 microM 2h) LDLox (CuSO4 50 microM 3h) LDLox (CuSO4 50 microM 2h) e padratildeo de alto peso

molecular para eletroforese (High Molecular Weight Calibrration Kit for Electrophoresis ndash

Pharmacia Biotech)

52

Figura 7 ndash Eletroforese em gel de poliacrilamida das LDL purificadas e oxidadas (SDS-Page) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) em gradiente com concentraccedilotildees de 5 a 15 As amostras de LDL oxidadas com CuSO4 nas concentraccedilotildees de 5 microM e 50 microM com tempos de incubaccedilatildeo de 2h e 3h foram submetidas a eletroforese para a verificaccedilatildeo da integridade das apolipoproteiacutenas B-100 das partiacuteculas de LDL apoacutes o processo de oxidaccedilatildeo nestes pontos da curva Todos os poccedilos foram carregados com 5 microg de proteiacutena sendo que bandas com rastro e sem delimitaccedilatildeo indicam fragmentaccedilatildeo das lipoproteiacutenas

Apoacutes a verificaccedilatildeo das bandas no gel as quais foram coradas com comassie blue

colocadas sobre uma placa de vidro e escaneadas o procedimento de eletroforese das amostras

de LDL nativa e oxidada foi repetido para a eletrotransferecircncia das apolipoproteiacutenas presentes

no gel para uma membrana de nitrocelulose teacutecnica conhecida por western blot

Este procedimento teve por objetivo a confirmaccedilatildeo da integridade das

apolipoproteiacutenas oxidadas experimentalmente em comparaccedilatildeo com a apolipoproteiacutena B-100

da LDL nativa Deste modo o ponto selecionado na curva de oxidaccedilatildeo de LDL com maior

TBARs e menor degradaccedilatildeo (conforme visualizaccedilatildeo do gel na seccedilatildeo resultados) foi submetido

agrave teacutecnica de western blot juntamente com a amostra de LDL nativa Para a eletrotransferecircncia

foi utilizada cuba de transferecircncia semi-dried e a soluccedilatildeo de transferecircncia eacute especificada

53

abaixo Apoacutes a transferecircncia a membrana de nitrocelulose foi tratada de forma idecircntica agrave

descrita na teacutecnica de dot blot por incubaccedilatildeo com tampatildeo contendo anticorpo especiacutefico anti-

apolipoproteiacutena B-100 (Goat anti-human-β-lipoprotein Sigma L8016) na concentraccedilatildeo de

11000

Quadro 18 ndash Tampatildeo de Transferecircncia

Tris6 g Glicina288 g Metanol400 mL H2O milli-Q qsp1000 mL

As bandas na figura 8 indicam a ligaccedilatildeo do anticorpo especiacutefico aacutes apolipoproteiacutenas

B-100 das partiacuteculas de LDL nativa e oxidada (CuSO4 5 microM 3h)

Figura 8 ndash Western blot das bandas de LDL nativa e LDLoxidada As amostras de LDL nativa e LDL oxidada (CuSO4 5 microM 3h) foram submetidas agrave eletroforese e Western blot para a verificaccedilatildeo da presenccedila da apolipoproteiacutena B-100 bem como da integridade do siacutetio de ligaccedilatildeo ao anticorpo Procedimento descrito em materiais e meacutetodos

Uma vez estabelecido o protocolo de oxidaccedilatildeo das lipoproteiacutenas de baixa densidade

estas foram aliquotadas nas formas nativa e oxidada filtradas em filtro Nalgenereg de 022 microm

em condiccedilotildees esteacutereis e mantidas em geladeira e ao abrigo da luz ateacute a execuccedilatildeo dos

experimentos com cultura de ceacutelulas

(LDL ox) (LDL nat)

54

32 Cultura de Ceacutelulas

Ceacutelulas da linhagem preacute-monociacutetica humana U937 foram obtidas junto ao Banco de

ceacutelulas do Rio de Janeiro (Bio-Rio) e cultivadas em meio RPMI 1640 com 10 de soro fetal

bovino (SFB) e antibioacuteticos penicilina (10 UmL) e estreptomicina (10 microgmL) (Gibco BRL ndash

Life Tecnologies New York USA) As culturas foram mantidas em estufa (Sanyo Japatildeo)

sob atmosfera de 5 CO2 a 37 degC com densidade maacutexima de 10 x 106 ceacutelulasmL em

garrafas T 25

321 Grupos Experimentais

As ceacutelulas cultivadas conforme descrito no item anterior receberam os seguintes

tratamentos

a) Controle (CT) apenas com meio de cultura

b) LDL nativa (20 microM)

c) LDL oxidada (20 microM)

d) PGA2 (20 microM)

55

e) PGJ2 (15 microM)

f) LDL nativa (20 microM) + PGA2 (20 microM)

g) LDL nativa (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

h) LDL oxidada (20 microM) + PGA2 (20 microM)

i) LDL oxidada (20 microM) + PGJ2 (15 microM)

As ceacutelulas (exceto os grupos (a) (d) e (e)) foram primeiramente incubadas em

presenccedila de LDL nat ou LDL ox no meio de cultura nas concentraccedilotildees indicadas acima

durante 18 horas para o iniacutecio da sua diferenciaccedilatildeo em foam cells Apoacutes este periacuteodo as

culturas foram lavadas com PBS para a remoccedilatildeo da LDL oxidada e novamente incubadas

conforme cada tratamento citado acima jaacute com as prostaglandinas em seus grupos

experimentais correspondentes por mais 24 horas Com este procedimento as alteraccedilotildees

metaboacutelicas promovidas pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave LDL nativa e LDL oxidada tecircm iniacutecio

antes de as ceacutelulas serem expostas agraves prostaglandinas Ao teacutermino da incubaccedilatildeo as ceacutelulas

foram lavadas em PBS esteacuteril pH 74 e submetidas agrave extraccedilatildeo de RNA total

56

322 Extraccedilatildeo de RNA total e RT-PCR

O RNA total foi extraiacutedo de 1 x 107 ceacutelulas utilizando TRIZOL seguindo o protocolo

do fabricante O procedimento para extraccedilatildeo utiliza isotiocianato de guanidina e fenol-

clorofoacutermio conforme descrito por Chomczynski e Sacchi (1987) Resumidamente as ceacutelulas

coletadas por centrifugaccedilatildeo foram homogeneizadas com 1 mL do reagente de extraccedilatildeo e

incubadas agrave temperatura ambiente por 5 minutos O RNA total foi isolado das proteiacutenas e

restos celulares acresentando-se 02 mL de clorofoacutermio seguido por agitaccedilatildeo durante 15

segundos e incubaccedilatildeo a temperatura ambiente por 3 minutos O material foi entatildeo

centrifugado por 12000 x g durante 15 minutos agrave temperatura de 4 oC O RNA presente na

fase aquosa (superior) foi precipitado com 05 mL de isopropanol por 10 minutos agrave

temperatura ambiente e sedimentado por centrifugaccedilatildeo (12000 x g por 10 minutos agrave 4oC) O

ldquopelletrdquo foi lavado com etanol a 75 centrifugado por 7000 x g por 5 minutos seco a

temperatura ambiente e ressuspenso em aacutegua DEPC (dietilpirocarbonato)

A concentraccedilatildeo de RNA foi estimada por espectofotometria agrave 260 nm segundo a

foacutermula (RNA microgmL)= Abs x 4419 x diluiccedilatildeo onde 4419 eacute o coeficiente de extinccedilatildeo molar

para RNA A pureza do RNA foi determinada pela razatildeo 260280 nm onde a relaccedilatildeo igual ou

maior que 18 indica alto grau de pureza (Sambrook et al 1989) A integridade do RNA foi

avaliada atraveacutes de eletroforese em gel de agarose a 1 contendo formaldeiacutedo MOPS e 05

microgmicroL de brometo de etiacutedio onde verificou-se a presenccedila de bandas niacutetidas do RNA

ribossocircmico 18S e 28S e ausecircncia de material degradado

57

323 Siacutentese de cDNA - reaccedilatildeo de RT (Reverse Transcriptase)

As amostras de 2 microg de RNA tratadas com DNAse (5Umg) foram transcritas para

cDNA em um termociclador (modelo Techne Genius ndash Unicience do Brasil SP) agrave temperatura

de 42 oC durante 50 minutos utilizando 146 ng de ldquoprimersrdquo randocircmicos 500 microM de

trifosfato de desoxinucleotiacutedeos (dNTP) 5 mM de DTT e 200 U de transcriptase reversa

(SuperScript TM II Rnase H-RT Life Technologies) seguindo todas as etapas de siacutentese

conforme protocolo do fornecedor O cDNA obtido foi armazenado a ndash20oC ateacute a realizaccedilatildeo

da PCR

324 Amplificaccedilatildeo do DNA alvo ndash reaccedilatildeo de PCR (Polimerase Chain Reaction)

Para a amplificaccedilatildeo do cDNA alguns paracircmetros da PCR tais como temperatura de

anelamento dos ldquoprimersrdquo concentraccedilatildeo de MgCl2 e nuacutemero de ciclos foram padronizados

Para uma anaacutelise semi-quantitativa a β-actina foi utilizada como controle pois este

ldquohousekeepingrdquo natildeo se alterou em nenhum tratamento

O sistema de reaccedilatildeo da PCR para cada gene sondado continha 200 pmol de cada

ldquoprimerrdquo 10 microM dNTP e 2 U de Taq DNA polimerase Esta mistura foi acrescentada agrave 2 microL

de cDNA A amplificaccedilatildeo foi processada em um termociclador

58

Os produtos de PCR (10 microL) foram acrescidos de tampatildeo de amostra para DNA (azul

de bromofenol 025 xilenocianol-FF 025 e glicerol 30) e avaliados por meio de

separaccedilatildeo eletroforeacutetica em gel de agarose a 15 em TBE corado com brometo de etiacutedio

(05 microgmL) A visualizaccedilatildeo foi realizada por exposicatildeo do gel agrave luz ultravioleta no

transiluminador (modelo Macrovue da Pharmacia LKB ndash Pharmacia Biotech Inc Uppsala

Sueacutecia)

O material amplificado foi fotografado utilizando o sistema de cacircmera digital da

KODAK (DC 120 Zoom digital camera system Life Technologies) analisado e quantificado

utilizando o programa Kodak Digital Science 1D Image Analysis (Life Technologies) A

anaacutelise da expressatildeo dos genes investigados eacute expressa em valores relativos entre a

intensidade da banda do gene de interesse e a intensidade da banda do gene controle (gene de

interessegene β-actina) Os dados seratildeo apresentados em relaccedilatildeo aos respectivos controles os

quais receberatildeo um valor arbitraacuterio de 1 em cada experimento

O ensaio de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi realizado para a detecccedilatildeo de mRNA

para a enzima HMG-CoA redutase o fator nuclear PPAR-γ e as proteiacutenas CD36 Bcl-xL p53 e

caspase 3 usando-se sempre o gene da proteiacutena β-actina como controle Aos tubos de reaccedilatildeo

adicionou-se 2 microg de cDNA sintetizado na reaccedilatildeo de RT juntamente com os demais reagentes

(tampatildeo PCR 10x primer sense e primer anti-sense Taq DNA polimerase (5UmicroL)) As reaccedilotildees

foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees

bull CD36 (389 pb) e β-actina (550 pb) humano ndash 33 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

55 degC por 1 minuto (anelamento)

59

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull p53 (494 pb) humano ndash 30 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Caspase 3 (256 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

58 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull Bcl-xL (496 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull HMG-CoA redutase (298 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

56 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

bull PPAR-γ (476 pb) ndash 35 ciclos

94 degC por 1 minuto (desnaturaccedilatildeo)

60

59 degC por 1 minuto (anelamento)

72 degC por 1 minuto (extensatildeo)

As sequumlecircncias de primers utilizadas nos experimentos para cada gene estudado

foram as seguintes

bull CD36

ANTI ndash TTTCAACTGGAGAGGCAAAGGC

SENSE ndash GAGAACTGTTATGGGGCTAT

bull p53

ANTI ndash CTTGCATTCTGGGACAGCCAAG

SENSE ndash GCACAAACACGCACCTCAAAGC

bull Caspase 3

ANTI ndash GTCGATGCAGCAAACCTCAGGG

SENSE ndash TGTTTCAGCATGGCACAAAGCG

bull Bcl-xL

ANTI ndash CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC

SENSE ndash GGTCAGTGTCTGGTCATTTCCG

bull HMG-CoA redutase

ANTI - TACCATGTCAGGGGTACGTC

SENSE ndash CAAGCCTAGAGACATAATCATC

61

bull PPAR-γ

ANTI ndash TCTCTCCGTAATGGAAGACCA

SENSE ndash GCATTATGAGACATCCCCAC

33 Tratamento Estatiacutestico

A anaacutelise estatiacutestica dos dados foi realizada por anaacutelise de variacircncia (ANOVA one-

way) A comparaccedilatildeo entre os grupos foi feita pelo teste T de student considerando variacircncias

equivalentes O niacutevel de significacircncia considerado foi Plt005 Todos os experimentos foram

feitos em triplicata

62

4 RESULTADOS

O papel citoprotetor das prostaglandinas ciclopentenocircnicas particularmente

prostaglandina A2 e prostaglandina J2 em diversas populaccedilotildees de ceacutelulas envolvidas na

progressatildeo da aterosclerose tem sido bastante discutido (ver introduccedilatildeo) embora os exatos

mecanismos de accedilatildeo destas moleacuteculas permaneccedilam desconhecidos Tambeacutem se sabe que as

CP-PGs da famiacutelia da prostaglandina J2 satildeo ativadoras e ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ

podendo participar do desenvolvimento da aterosclerose enquanto as CP-PGs da famiacutelia da

PGA2 mostram-se citoprotetoras e redutoras das concentraccedilotildees intracelulares de colesterol em

macroacutefagos (Senna et al 1998)

Por outro lado em lesotildees ateroscleroacuteticas jaacute estabelecidas um grande nuacutemero de

debris celulares resultantes da liberaccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos foam cells satildeo

encontrados na regiatildeo do core lipiacutedico da placa O processo apoptoacutetico neste caso tem sido

relacionado agrave pouca celularidade das placas ateromatosas que resulta na sua instabilidade e

possiacutevel rompimento

Considerando os fatores acima relacionados foram verificados os efeitos dos

tratamentos descritos em materiais e meacutetodos (CP-PGs) sobre a expressatildeo dos genes para

PPAR-γ CD36 e HMG-CoA redutase envolvidos no processo de diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells bem como genes que codificam os fatores proacute-apoptoacuteticos p53 e

caspase 3 e o gene que codifica o fator anti-apoptoacutetico Bcl-xL nas ceacutelulas da linhagem preacute-

monociacutetica humana U937

63

41 Genes envolvidos na diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

411 PPAR-γ

O PPAR-γ ou peroxissome proliferator activated receptor-γ pertence a uma

superfamiacutelia de receptores esteroacuteides nucleares (PPARs) Estes receptores tecircm sido

identificados como controladores criacuteticos da atividade de enzimas-chave que catalisam a

oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (Zhang amp Young 2002) Existem trecircs membros conhecidos na

superfamiacutelia de PPARs PPAR-α PPAR-βδ e PPAR-γ O PPAR controla a lipogecircnese e

termogecircnese celulares pela regulaccedilatildeo da expressatildeo de uma seacuterie de genes envolvidos no

metabolismo lipiacutedico e da glicose e diferenciaccedilatildeo de adipoacutecitos Trabalhos recentes sugerem

que PPARs particularmente o PPAR-γ e seus ligantes fisioloacutegicos exercem um papel central

no desenvolvimento de respostas imunes e inflamatoacuterias (Zhang amp Young 2002)

Deste modo as ceacutelulas U937 cultivadas e tratadas segundo materiais e meacutetodos

responderam aos diferentes tratamentos conforme mostrado na figura 9 no tocante agrave expressatildeo

gecircnica do fator nuclear PPAR-γ

64

PPAR gama

0

02

04

06

08

1

12

14

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PPAR-γ 476 pb

Figura 9 ndash Expressatildeo do gene do fator PPAR-γ em ceacutelulas U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para PPAR-γ estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e PPAR-γ Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 9 mostra uma inibiccedilatildeo significativa na expressatildeo do gene que codifica o fator

nuclear PPAR-γ nas ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) da ordem de 33 A CP-PG 15-

d-PGJ2 (15microM) por sua vez intensificou significativamente a expressatildeo gecircnica deste fator

nuclear na proporccedilatildeo de 35 quando comparado ao grupo controle

65

As ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa tiveram a transcriccedilatildeo de mRNA para PPAR-

γ significativamente inibida em 65 em comparaccedilatildeo ao grupo controle LDL nativa

combinada com PGA2 (20microM) mostra inibiccedilatildeo na expressatildeo gecircnica para PPAR-γ similar ao

observado no tratamento com apenas PGA2 (35 em relaccedilatildeo ao controle)

Ceacutelulas tratadas com LDL nativa combinada com 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo mostraram

alteraccedilatildeo na expressatildeo gecircnica de PPAR-γ em comparaccedilatildeo ao controle tratado apenas com meio

de cultura o que tambeacutem se verifica no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada

As CP-PGs PGA2 (20microM) e 15-d-PGJ2 (15microM) mostraram-se inibidoras da siacutentese de

mRNA para PPAR-γ mesmo em presenccedila de LDL oxidada O tratamento com LDLox + PGA2

(20microM) inibiu e expressatildeo deste fator nuclear em 64 enquanto esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 88

para o tratamento das ceacutelulas com LDLox +15-d-PGJ2 (15microM)

412 CD36

O receptor de Scavenger CD36FAT reconhece e internaliza LDL modificada

contribuindo para a ativaccedilatildeo de macroacutefagos e formaccedilatildeo de foam cells Esta proteiacutena de

membrana tambeacutem estaacute envolvida na fagocitose de corpos apoptoacuteticos por macroacutefagos Os

tratamentos experimentais realizados no laboratoacuterio visando verificar o efeito das CP-PGs

sobre a expressatildeo gecircnica do receptor de scavenger CD 36 promoveram os resultados

apresentados abaixo (figura 10)

66

CD 36

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat+ PGA2

LDLnat+ PGJ2

LDLox LDLox+ PGA2

LDLox+ PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CD36 389 pb

Figura 10 ndash Expressatildeo do gene do receptor de scavenger CD36FAT em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para CD36FAT estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e CD36FAT Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

A figura 10 mostra que enquanto a CP-PG PGA2 (20microM) inibiu a expressatildeo gecircnica do

receptor de scavenger CD36FAT em 42 a CP-PG 15-d-PGJ2 (15microM) aumentou a expressatildeo

gecircnica desta proteiacutena em 23 quando comparado ao grupo controle

67

Os tratamentos das ceacutelulas U937 com LDL nativa ou LDL oxidada natildeo interferiram na

expressatildeo de mRNA para CD 36 a qual permaneceu nos niacuteveis observados no grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 (20microM) + LDL nativa sofreram significativa reduccedilatildeo na

expressatildeo gecircnica de CD36 (26 comparado ao grupo controle) Quando as ceacutelulas foram

tratadas com 15-d-PGJ2 (15microM) + LDL nativa a sua resposta fisioloacutegica foi de ativaccedilatildeo da

expressatildeo de mRNA para CD36 da ordem de 10

Embora as ceacutelulas tratadas com LDL oxidada + 15-d-PGJ2 (15microM) natildeo tenham sofrido

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica de CD36 o tratamento com LDL oxidada + PGA2 (20microM)

intensificou a expressatildeo deste gene em 124 comparando-se ao controle

413 HMG-CoA redutase

O processo de diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells eacute caracterizado tanto pelo

aumento da captaccedilatildeo de partiacuteculas modificadas de LDL contendo colesterol como por

alteraccedilotildees nos processos de siacutentese e esterificaccedilatildeo de colesterol pelas ceacutelulas aleacutem da reduccedilatildeo

na capacidade de exportaccedilatildeo de liacutepides por macroacutefagos inflamatoacuterios Como o acuacutemulo de

liacutepides por macroacutefagos pode estar relacionado com disfunccedilotildees na sua capacidade de regulaccedilatildeo

da siacutentese e exportaccedilatildeo destas moleacuteculas a medida da expressatildeo gecircnica de mRNA para HMG-

CoA redutase enzima reguladora da siacutentese intracelular de colesterol foi efetuada em

diferentes condiccedilotildees experimentais

68

HMG CoA redutase

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

HMG 298pb

Figura 11 ndash Expressatildeo do gene que codifica a enzima HMG-CoA redutase em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para HMG-CoA redutase estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e HMG-CoA redutase Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

69

A PGA2 (20microM) inibiu significativamente a expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase nas ceacutelulas U937 Este efeito natildeo se verifica com respeito a CP-PG 15-d-PGJ2

(15microM) uma vez que o tratamento com este autacoacuteide natildeo alterou a expressatildeo gecircnica para HMG-

CoA redutase nas condiccedilotildees experimentais utilizadas neste trabalho

Os tratamentos com LDL tanto nativa como oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica

para HMG-CoA redutase de modo estatiscamente significativo sendo este aumento de 52

para o tratamento com LDLnat e 40 para o tratamento com LDLox em relaccedilatildeo ao grupo

controle

Do mesmo modo os tratamentos com PGA2 (20microM) + LDL nativa e 15-d-PGJ2

(15microM) + LDL nativa aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica para HMG-CoA

redutase em 39 para o primeiro tratamento (PGA2 + LDLnat) e 47 para o segundo

tratamento (15-d-PGJ2 + LDLnat)

O grupo experimental tratado com PGA2 + LDLox exibiu aumento na expressatildeo gecircnica

de HMG-CoA redutase (127 ) enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo produziu

alteraccedilatildeo significativa na expressatildeo gecircnica desta enzima pois os valores permaneceram

semelhantes aos observados no grupo controle

70

42 Proteiacutenas reguladoras de apoptose

Moleacuteculas aterogecircnicas e trombogecircnicas bem como enzimas degradativas liberadas

de macroacutefagos em processo de morte por apoptose contribuem de forma definitiva para a

aterogecircnese ruptura da placa e trombose aguda Do mesmo modo ruptura da placa e trombose

aguda estatildeo fortemente associadas com a presenccedila de cores lipiacutedicos nas lesotildees regiotildees

caracterizadas por conter debris e corpos apoptoacuteticos de macroacutefagos mortos (Ball et al 1995

Barberian et al 1990)

Assim quanto aos genes envolvidos com rotas de morte celular por apoptose tanto os

genes que codificam as proteiacutenas intracelulares proacute-apoptoacuteticas p53 e caspase 3 quanto o gene

que codifica a proteiacutena intracelular anti-apoptoacutetica Bcl-xL tiveram sua expressatildeo quantificada

para avaliar a resposta celular aos tratamentos experimentais anteriormente descritos

71

421 Caspase 3

Os resultados da expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 perante os

diferentes tratamentos aos quais as ceacutelulas U937 foram submetidas podem ser observados na

figura 12

Caspase 3

0

05

1

15

2

25

3

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

caspase 3 256 pb

Figura 12 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica Caspase 3 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para caspase 3 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do

72

gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e caspase 3 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica caspase 3 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Ceacutelulas U937 tratadas com LDL nativa mostraram aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de caspase 3 (39 ) mas os tratamentos com PGA2 + LDLnat e 15-d-PGJ2 +

LDLnat mantiveram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em valores semelhantes aos do grupo

controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 (95 ) embora curiosamente o tratamento com PGA2 + LDLox aumente a

expressatildeo de mRNA para esta proteiacutena tambeacutem de forma muito acentuada (166 ) Quando as

ceacutelulas foram submetidas a tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox os niacuteveis de expressatildeo gecircnica da

caspase 3 permaneceram semelhantes aos observados no grupo controle

422 p53

A proteiacutena supressora de tumor p53 exerce efeitos tanto antiproliferativos como proacute-

apoptoacuteticos em diversas ceacutelulas (Lohrum et al 2000 Gottlieb amp Oren 1998 Sheikh amp

Fornace 2000) Sabe-se que lipoproteiacutenas oxidadas ativam p53 atraveacutes da inibiccedilatildeo da sua rota

73

bioquiacutemica de degradaccedilatildeo (Lohrum et al 2000) e sabe-se que nas lesotildees ateroscleroacuteticas p53

co-localiza-se com macroacutefagos natildeo-proliferativos ou apoptoacuteticos

Desta forma os resultados obtidos com os diferentes tratamentos impostos agraves ceacutelulas

U937 se refletiram na modulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53

conforme ilustrado na figura 13

p 53

0

05

1

15

2

25

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

p53 494 pb

Figura 13 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para p53 estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina

74

Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e p53 Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 promoveu inibiccedilatildeo

da expressatildeo gecircnica da proteiacutena supressora de tumor p53 em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Esta inibiccedilatildeo foi da ordem de 49 para o tratamento com PGA2 e 36 para o tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2

Os grupos experimentais tratados com LDL nativa e LDL oxidada mostraram

aumento na expressatildeo gecircnica de p53 estatisticamente significativo em relaccedilatildeo ao grupo

controle Este aumento foi de 34 para o tratamento com LDL nativa e 71 para o

tratamento com LDL oxidada

As ceacutelulas que foram incubadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilotildees na

expressatildeo de mRNA para p53 enquanto aquelas tratadas com 15-d-PGJ2 + LDLnat aumentaram a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena em 34 em relaccedilatildeo ao grupo controle

O grupo experimental incubado com PGA2 + LDLox aumentou a sua expressatildeo gecircnica

de p53 significativamente (117 ) em comparaccedilatildeo ao grupo controle No caso do tratamento das

ceacutelulas com 15-d-PGJ2 + LDLox houve um efeito inibitoacuterio estatisticamente significativo sobre a

expressatildeo de p53 aumento este da ordem de 16 em relaccedilatildeo ao grupo controle

75

423 BclxL

O efeito dos tratamentos experimentais sobre a expressatildeo do gene que codifica o fator

anti-apoptoacutetico BclxL pertencente agrave uma subfamiacutelia da famiacutelia Bcl2 pode ser verificado na

figura 14

BCL-xl

0

02

04

06

08

1

12

14

16

CT PGA2 PGJ2 LDLnat LDLnat +PGA2

LDLnat +PGJ2

LDLox LDLox +PGA2

LDLox +PGJ2

Tratamentos

Exp

ress

atildeo m

RN

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

β-actina 550 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bcl-xL 496 pb

Figura 14 ndash Expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL em ceacutelulas da linhagem U937 nos diferentes tratamentos Ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 foram cultivadas segundo materiais e meacutetodos com meio de cultura RPMI 1640 (grupo 1 controle) em presenccedila PGA2 (20microM) (grupo 2) ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 3) LDL nativa (20microM) (grupo 4) LDL oxidada (20microM) (grupo 5) LDLnat + PGA2 (20microM) (grupo 6) LDLnat + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 7) LDL ox + PGA2 (20microM) (grupo 8) LDL ox + ∆12-PGJ2 (15microM) (grupo 9) durante 18h (LDL nat e LDLox preacute-incubaccedilatildeo) e CP-PGs durante 24h (incubaccedilatildeo) Resultados quantitativos em referentes agrave densidade oacutetica (unidades arbitraacuterias) do mRNA para Bcl-xL estatildeo representados no graacutefico relacionados agrave expressatildeo do gene da β-actina Abaixo do graacutefico os fragmentos de 560 pb e 476 pb correspondem respectivamente aos produtos de RT-PCR para β-actina e Bcl-xL

76

Resultados expressos como meacutedia + DP com niacutevel de significacircncia Plt005 (teste ldquotrdquo de student) Todos os grupos experimentais satildeo comparados ao grupo controle

As ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humna U937 tratadas com PGA2 natildeo tiveram a

expressatildeo gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL alterada poreacutem o tratamento com a CP-

PG 15-d-PGJ2 intensificou a expressatildeo deste gene significativamente em relaccedilatildeo ao grupo

controle (49 )

O tratamento das ceacutelulas com LDL nativa e tambeacutem com LDL oxidada inibiu a

expressatildeo de mRNA para Bcl-xL em 18 e 29 para cada tratamento respectivamente

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 + LDLnat natildeo sofreram alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica de Bcl-xL em comparaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito natildeo se verifica no grupo

tratado com 15-d-PGJ2 + LDLnat visto que este tratamento inibiu a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL

de modo significativo em relaccedilatildeo ao grupo controle em 34

Ceacutelulas tratadas com PGA2 + LDLox tiveram a siacutentese de mRNA para Bcl-xL inibida em

19 em relaccedilatildeo ao grupo controle Jaacute o tratamento com 15-d-PGJ2 + LDLox natildeo alterou a

expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

5 DISCUSSAtildeO

51 Proteiacutenas relacionadas agrave diferenciaccedilatildeo macroacutefagosfoam cells

511 PPAR-γ

Diversas pesquisas demonstram a expressatildeo de PPAR-γ em monoacutecitos e macroacutefagos

(Greene et al 1995 Jiang et al 1998 Ricote et al 1998) e Tontonoz et al (1998) e Ricote et

al (1998) demonstraram que o PPAR-γ atua na formaccedilatildeo de foam cells O PPAR-γ pode ser

ativado por LDL oxidada (Ricote et al 1998) de modo que a expressatildeo de PPAR-γ em

macroacutefagos fagociacuteticos eacute de grande importacircncia no contexto da lesatildeo ateromatosa vascular

(Pelton et al 1999)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ em macroacutefagos leva agrave expressatildeo do receptor de scavenger

CD36FAT caracteriacutestica de macroacutefagos foam cells (Tontonoz et al 1998) O aumento no

nuacutemero de receptores CD36FAT resulta em aumento no input de LDL oxidada nos

macroacutefagos que iniciam sua diferenciaccedilatildeo em foam cells

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 tiveram a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ inibida em

relaccedilatildeo ao grupo controle Este efeito se manteve mesmo em presenccedila de LDL nativa e LDL

oxidada Observa-se ainda que o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa tambeacutem exerce

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo deste fator nuclear Jaacute o tratamento com LDL oxidada

aumentou significativamente a expressatildeo de PPAR-γ quando comparado ao grupo controle

Este efeito mediado por LDL oxidada jaacute era esperado pois sabe-se que esta LDL tem altas

concentraccedilotildees de derivados lipiacutedicos oxidados como o 9- e o 13-HODE (aacutecido hidroacutexi-

78

octadecadienoacuteico) que satildeo ativadores diretos do PPAR-γ (Nargy et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ mediada por LDL oxidada desencadeia a expressatildeo de

receptores de scavenger para a internalizaccedilatildeo de cada vez mais LDL oxidadas contendo mais

ativadores do PPAR-γ o que contribui para a diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells

Neste contexto tanto a PGA2 como a 15-d-PGJ2 inibiram a expressatildeo do PPAR-γ quando em

presenccedila de LDL oxidada que eacute potencialmente aterogecircnica

Eacute importante salientar que as CP-PGs da famiacutelia da 15-d-PGJ2 satildeo ativadoras e ligantes

fisioloacutegicos do fator nuclear PPAR-γ (Forman et al 1995 Kliewer et al 1995) conforme se

confirma pelos resultados obtidos com a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em presenccedila desta CP-PG Em

presenccedila de LDL nativa a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ permaneceu nos niacuteveis observados no

grupo controle e aleacutem disso a 15-d-PGJ2 tambeacutem foi capaz de inibir a expressatildeo de PPAR-γ

nas ceacutelulas tratadas com LDL oxidada Sabe-se que o tratamento de macroacutefagos peritoniais

com 15-d-PGJ2 inibe a trascriccedilatildeo gecircnica do receptor de scavenger A em resposta a

estimulaccedilatildeo com PMA (Ricote et al 1998)

A ativaccedilatildeo do PPAR-γ por ligantes pode resultar na induccedilatildeo de apoptose em

macroacutefagos diferenciados Este processo eacute acompanhado pelo surgimento de subunidades

proteoliacuteticas ativas da protease sinalizadora de morte celular caspase 3 (Chinetti et al 1998)

Tambeacutem tecircm sido demonstrado que o NF-κB protege macroacutefagos da morte celular induzida

por TNF-α e o PPAR-γ interfere com esta sinalizaccedilatildeo A ativaccedilatildeo do PPAR-γ induzindo

apoptose tambeacutem tecircm sido constatada em ceacutelulas canceriacutegenas gaacutestricas (Takahashi et al

1999) Os ligantes fisioloacutegicos do PPAR-γ ciglitizona e PG 15-dJ2 tambeacutem induzem apoptose

em ceacutelulas endoteliais (Bishop-Bailey et al 1999)

79

512 CD36

Sabe-se que a oxidaccedilatildeo de lipoproteiacutenas do plasma particularmente LDL tem

demonstrado diversas propriedades proacute-aterogecircnicasTalvez a mais notaacutevel contribuiccedilatildeo da

LDL oxidada para o desenvolvimento da aterosclerose seja a sua captaccedilatildeo por macroacutefagos no

espaccedilo vascular Diversos trabalhos descrevem o papel da raacutepida e desregulada captaccedilatildeo de

LDL oxidada na transformaccedilatildeo de monoacutecitosmacroacutefagos em foam cells nas lesotildees

ateroscleroacuteticas

Um grande nuacutemero de proteiacutenas presentes na membrana celular capazes de se ligar

com grande afinidade agrave LDL oxidada tecircm sido identificado na superfiacutecie de macroacutefagos

ceacutelulas endoteliais e ceacutelulas musculares lisas Uma caracteriacutestica comum destes receptores de

scavenger eacute a sua habilidade em se ligar com grande afinidade a diversos ligantes

estruturalmente diferentes (Dhaliwal amp Steinbrecher 1999) Dentre os receptores de scavenger

que sabidamente interagem com LDL oxidada tecircm-se SR-AIII CD36 SR-BI CD68 LOX-1

e SREC (Baljinder amp Steinbrecher 1999)

O CD36 um receptor de scavenger classe B eacute uma glicoproteiacutena presente na

membrana plasmaacutetica de monoacutecitos plaquetas ceacutelulas endoteliais epiteacutelio da glacircndula

mamaacuteria e adipoacutecitos de murinos que dependendo do tipo de ceacutelula em que eacute encontrado

pode ter diferentes pesos moleculares (78 88 ou 94 kDa) correspondendo agrave diferentes

glicoformas (Greenwalt et al 1992 Alessio et al 1991) Esta proteiacutena foi primeiramente

identificada como receptor para LDL oxidada mas o CD36 tem afinidade por diversos

80

ligantes diferentes incluindo lipoproteiacutenas nativas (aleacutem de oxidadas) aacutecidos graxos

fosfolipiacutedios aniocircnicos colaacutegenos tipo I e tipo IV bem como eritroacutecitos parasitados com

Plasmodium falciparum

O CD36 liga-se agrave lisina de proteiacutenas modificadas como LDL acetilada ou oxidada e

tambeacutem estaacute envolvido na fagocitose de ceacutelulas apoptoacuteticas ou de fragmentos celulares

Entretanto a sua importacircncia quantitativa na captaccedilatildeo de LDL oxidada por macroacutefagos

permanece desconhecida O CD36 tambeacutem eacute reportado como envolvido na fagocitose de

neutroacutefilos e lifoacutecitos T apoptoacuteticos por macroacutefagos (Alessio et al 1995)

Sabe-se que a expressatildeo gecircnica de CD36 em macroacutefagos eacute estimulada por

interleucina 4 (IL-4) macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) LDL modificada

conteuacutedo intracelular de colesterol e PPAR-γ e eacute inibida ou down regulada por interferon- γ

transforming growth factor-β1 (TGF- β1) e TGF- β2 (Yesner et al 1996 Han et al 1997 Han

et al 1999 Tontonoz et al 1998 Nakagawa et al 1998 Han et al 2000) Sabe-se tambeacutem

que partiacuteculas de LDL nativa acetilada e oxidada estimulam a captaccedilatildeo de emulsatildeo rica em

trigliceriacutedeos por macroacutefagos atraveacutes de diversos mecanismos dos quais se destacam os

mediados por receptores de scavenger (Quintatildeo et al 2002)

Os experimentos apresentados neste trabalho (figura 10) demonstraram que o

tratamento das ceacutelulas da linhagem proacute-monociacutetica humana U937 com LDL nativa e LDL

oxidada natildeo interferiu na expressatildeo gecircnica de CD36 embora inuacutemeros autores jaacute tenham

descrito aumento na expressatildeo de CD36 em diversos modelos experimentais em resposta agrave

presenccedila de LDL oxidada Assim eacute possiacutevel que um aumento no tempo de tratamento das

culturas com LDL oxidada altere este perfil

81

A exposiccedilatildeo das culturas de ceacutelulas a CP-PGs alterou significativamente a expressatildeo

gecircnica de CD36 poreacutem de modo antagocircnico pois enquanto a PGA2 inibiu a 15-d-PGJ2

intensificou a expressatildeo gecircnica deste receptor de scavenger quando comparado ao controle

Em presenccedila de LDL nativa a PGA2 continuou exercendo efeitos inibitoacuterios sobre a

expressatildeo gecircnica de CD36 mas curiosamente resultados inesperados foram observados no

tratamento das ceacutelulas com PGA2 em presenccedila de LDL oxidada Este tratamento intensificou a

expressatildeo de CD36 provavelmente por uma via independente de PPAR-γ uma vez que a

PGA2 reduziu a expressatildeo deste fator nuclear de modo significativo em todos os tratamentos

(ver figura 9)

Por outro lado verificou-se aumento significativo na expressatildeo gecircnica de CD36 apoacutes

tratamento com 15-d-PGJ2 em presenccedila ou ausecircncia de LDL nativa o que se deve

provavelmente ao efeito da 15-d-PGJ2 em si sem a interferecircncia da LDL nativa acrescida ao

meio de cultura Este efeito pode estar relacionado com o aumento concomitante na expressatildeo

do fator nuclear PPAR-γ (figura 9) uma vez que a 15-d-PGJ2 eacute um conhecido ligante

fisioloacutegico do PPAR-γ conforme anteriormente descrito

Eacute interessante mencionar que embora a 15-d-PGJ2 aumente a expressatildeo de PPAR-γ

bem como a sua ativaccedilatildeo jaacute descrita na literatura que pode levar ao concomitante aumento na

expressatildeo de CD36 esta CP-PG tambeacutem se mostrou eficiente em reduzir dramaticamente a

expressatildeo de PPAR-γ quando em presenccedila de LDL oxidada Tal efeito inibitoacuterio pode ter

contribuiacutedo para a manutenccedilatildeo da expressatildeo de CD36 em niacuteveis semelhantes aos observados

no grupo controle

82

513 HMG-CoA redutase

No caso da enzima HMG-CoA redutase responsaacutevel pelo controle da siacutentese

intracelular de colesterol o tratamento com PGA2 inibiu significativamente sua expressatildeo

gecircnica enquanto o tratamento com 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo desta enzima

Eacute importante mencionar que inibidores da HMG-CoA redutase tambeacutem satildeo capazes de reduzir

a adesatildeo de monoacutecitos humanos a ceacutelulas endoteliais (Thiery et al 2001)

Tanto o tratamento das ceacutelulas U937 com LDL nativa como o tratamento com LDL

oxidada aumentaram significativamente a expressatildeo gecircnica da HMG-CoA redutase quando

comparado ao grupo controle Assim a internalizaccedilatildeo de LDL (contendo colesterol) pelas

ceacutelulas na sua forma nativa ou oxidada eacute capaz de promover ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de

HMG-CoA redutase Este resultado eacute inesperado uma vez que estaacute bem estabelecido que a

atividade desta enzima eacute inibida por altos niacuteveis intracelulares de colesterol num processo de

feedback negativo Este aumento na expressatildeo da HMG-CoA redutase em presenccedila de LDL

pode promover uma ativaccedilatildeo na maquinaria celular de siacutentese de colesterol que associado ao

aumento na expressatildeo de CD 36 com maior imput de LDL modificada contendo colesterol

contribui para o aumento de colesterol intracelular Aleacutem disso Curi e Bittencourt (1997)

demonstraram que macroacutefagos foam cells tem sua capacidade de transferir colesterol a

linfoacutecitos em co-cultura bastante reduzida o que resulta em acuacutemulo ainda maior de colesterol

intracelular

83

O tratamento das culturas de ceacutelulas com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 parece natildeo

interferir no aumento da expressatildeo gecircnica para HMG-CoA redutase induzido pela LDL

nativa Curiosamente quando as ceacutelulas satildeo tratadas com LDL oxidada e PGA2 a expressatildeo

gecircnica desta enzima aumenta consideravelmente

Sabe-se que a PGA2 intensifica a siacutentese de fosfolipiacutedeos enquanto reduz

concomitantemente as concentraccedilotildees intracelulares de colesterol aacutecidos graxos livres

trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol em macroacutefagos de rato possivelmente via regulaccedilatildeo da

expressatildeo gecircnica ou da atividade da HMG-CoA redutase (Bittencourt et al 1998) Assim este

dado vem ao encontro do efeito observado no tratamento das ceacutelulas com PGA2 em ausecircncia

de LDL pois esta CP-PG ocasionou reduccedilatildeo na expressatildeo de mRNA para a enzima HMG-

CoA redutase Curiosamente o tratamento com PGA2 e LDL oxidada aumentou a expressatildeo

de mRNA para esta enzima

Jaacute com relaccedilatildeo a 15-d-PGJ2 embora esta CP-PG natildeo tenha alterado a expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase os resultados obtidos no tratamento combinando 15-d-PGJ2 e

LDL oxidada demonstram uma clara capacidade desta CP-PG em trazer os niacuteveis de expressatildeo

gecircnica da HMG-CoA redutase a valores similares aos observados no grupo controle Este

efeito parece se contrapor agrave estimulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica da enzima que se verifica no

tratamento com LDL oxidada e nativa em ausecircncia de 15-d-PGJ2

84

52 Proteiacutenas relacionadas a apoptose

O processo de apoptose ou morte celular programada caracteriza-se por mudanccedilas

estruturais tais como alteraccedilotildees em membranas plasmaacuteticas fragmentaccedilatildeo do DNA

condensaccedilatildeo da cromatina fragmentaccedilatildeo nuclear e diminuiccedilatildeo celular A aterosclerose eacute um

processo complexo em que a significacircncia da apoptose depende de numerosos fatores que

estatildeo relacionados agrave placa ateroscleroacutetica tais como seu estaacutegio de desenvolvimento

localizaccedilatildeo e os tipos celulares relacionados

A significacircncia do processo de apoptose em macroacutefagos e em ceacutelulas musculares lisas

pode ser completamente diferente A apoptose em macroacutefagos pode ser beneacutefica para a

estabilidade da placa se os corpos apoptoacuteticos forem removidos Por outro lado ceacutelulas

apoptoacuteticas natildeo removidas podem ativar a trombina e induzir trombose Sabe-se tambeacutem que

lesotildees consistindo somente de ceacutelulas musculares lisas apresentam-se com muito pouca

apoptose o que enfraquece a caacutepsula fibrosa pela diminuiccedilatildeo da siacutentese de fibras colaacutegenas

contribuindo assim para a instabilidade da placa (Drager et al 2002)

Estes fenocircmenos tecircm sido cada vez mais estudados em modelos animais e humanos

sendo proposto que a associaccedilatildeo de apoptose com a ativaccedilatildeo de um complexo sistema

envolvendo inuacutemeros mediadores inflamatoacuterios contribui tanto para o remodelamento vascular

como para a instabilidade da placa a sua ruptura e a formaccedilatildeo de trombos A caracterizaccedilatildeo do

papel da apoptose e sua interaccedilatildeo com processos inflamatoacuterios criam perspectivas de novos

rumos terapecircuticos para a estabilizaccedilatildeo da placa que poderiam levar a eventos coronaacuterios

85

Sabe-se que os macroacutefagos tecircm a capacidade de direcionar a morte celular no

remodelamento de diversos tecidos Assim macroacutefagos recrutados do sangue podem

direcionar a apoptose em ceacutelulas endoteliais e podem tambeacutem deletar ceacutelulas residentes

durante o remodelamento das regiotildees inflamadas induzindo apoptose em ceacutelulas proacuteximas por

mecanismos que incluem a liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (Duffield et al 2000)

A capacidade dos macroacutefagos em direcionar a morte celular eacute regulada pela captaccedilatildeo

de ceacutelulas apoptoacuteticas Por exemplo a citoacutelise de ceacutelulas tumorais por macroacutefagos ativados eacute

inibida pela ingestatildeo de ceacutelulas apoptoacuteticas Em algumas circunstacircncias a captaccedilatildeo de ceacutelulas

apoptoacuteticas pode engatilhar a liberaccedilatildeo da citocina indutora de morte CD95 por macroacutefagos

resultando na apoptose das ceacutelulas adjacentes (Savill amp Fadok 2000)

Eacute fato conhecido que o estresse celular como o causado por danos ao DNA hipoxia

ou lipoproteiacutenas oxidadas ativam a proteiacutena supressora de tumor p53 e elevados niacuteveis de

p53 levam a respostas antiproliferativas e proacute-apoptoacuteticas Por outro lado a deficiecircncia de p53

estaacute associada com o aumento no tamanho da lesatildeo ateroscleroacutetica

Sabe-se tambeacutem que as caspases cisteiacuteno-proteases que clivam proteiacutenas nas

proximidades de resiacuteduos de aacutecido aspaacutertico especiacuteficos satildeo efetoras do processo de morte

celular por apoptose Estas proteases podem ter seus efeitos proacute-apoptoacuteticos inibidos pelas

proteiacutenas da famiacutelia Bcl-2 presentes nas membranas mitocondriais Em mitococircndrias isoladas

Bcl-2 ou Bcl-x intensificam a extrusatildeo de proacutetons da mitococircndria e aumentam a capacidade de

tamponamento do caacutelcio mitocondrial (Nguyen et al 1994 Mazel et al 1996) de modo que

estas proteiacutenas talvez se comuniquem funcionalmente ou fisiologicamente com proteiacutenas da

membrana mitocondrial interna que controlam o transporte de iacuteons

86

521 Caspase 3

As CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 natildeo interferiram na expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-

apoptoacutetica caspase 3 nas condiccedilotildees experimentais aqui apresentadas em comparaccedilatildeo ao

grupo controle Poreacutem quando estas CP-PGs foram combinadas com LDL nativa a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 manteve-se nos niacuteveis observados no grupo controle Como o tratamento

com LDL nativa aumentou significativamente a expressatildeo gecircnica da caspase 3 podemos supor

que este efeito tenha sido anulado pela adiccedilatildeo das CP-PGs ao meio de cultura contendo LDL

nativa (figura 12)

O tratamento das ceacutelulas U937 com LDL oxidada inibiu drasticamente a expressatildeo

gecircnica da caspase 3 quando comparado ao grupo controle Este efeito anti-apoptoacutetico

induzido pela LDL oxidada foi anulado pela adiccedilatildeo de CP-PGs ao meio de cultura Observe-se

que PGA2 e LDL oxidada quando combinadas aumentaram a expressatildeo gecircnica de caspase 3

o que pode levar a um efeito proacute-apoptoacutetico No caso do tratamento das ceacutelulas com a

combinaccedilatildeo de 15-d-PGJ2 e LDL oxidada a expressatildeo gecircnica da caspase 3 retorna aos valores

do grupo controle o que se contrapotildee agrave reduccedilatildeo observada no tratamento com LDL oxidada

87

522 p53

O tratamento das ceacutelulas U937 com as CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 inibiu

significativamente a expressatildeo do gene que codifica a proteiacutena proacute-apoptoacutetica p 53 quando

comparado ao grupo controle (figura 13) Ao contraacuterio os tratamentos com LDL nativa e LDL

oxidada aumentaram a expressatildeo gecircnica desta proteiacutena

Embora a LDL nativa promova um aumento na expressatildeo gecircnica de p53 quando as

ceacutelulas satildeo tratadas com LDL nativa e PGA2 combinadas a expressatildeo gecircnica retorna aos

valores observados no grupo controle Este efeito natildeo se observa no tratamento que combina

15-d-PGJ2 e LDL nativa cujos resultados permanecem semelhantes aos observados em

presenccedila apenas de LDL nativa

No caso do tratamento com LDL oxidada observou-se um aumento significativo na

expressatildeo gecircnica de p53 em relaccedilatildeo ao grupo controle Tal aumento se intensifica ao se

adicionar a CP-PG PGA2 ao meio de cultura Ao contraacuterio o tratamento combinando a CP-PG

15-d-PGJ2 com LDL oxidada inibiu a expressatildeo gecircnica da proteiacutena proacute-apoptoacutetica p53 em

comparaccedilatildeo ao grupo controle

88

523 Bcl-xL

As ceacutelulas U937 tratadas com PGA2 natildeo sofreram qualquer alteraccedilatildeo na expressatildeo

gecircnica da proteiacutena anti-apoptoacutetica Bcl-xL Jaacute a 15-d-PGJ2 aumentou a expressatildeo de mRNA

para esta proteiacutena em comparaccedilatildeo ao grupo controle

Tanto LDL nativa como LDL oxidada inibiram a expressatildeo gecircnica de Bcl-xL em

comparaccedilatildeo ao grupo controle Ao se adicionar PGA2 agraves culturas contendo LDL nativa

verifica-se um retorno dos niacuteveis de expressatildeo gecircnica de Bcl-xL aos valores observados no

grupo controle Este efeito natildeo eacute visiacutevel no tratamento das ceacutelulas com LDL oxidada e PGA2

pois este grupo experimental mostra resultado semelhante ao do grupo tratado somente com

LDL oxidada Jaacute no tratamento com 15-d-PGJ2 e LDL oxidada combinadas a expressatildeo

gecircnica para Bcl-xL eacute similar agrave observada no grupo controle embora a LDL oxidada tenha

efeito inibitoacuterio sobre a expressatildeo desta proteiacutena quando comparado ao grupo controle

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho tanto PGA2 como 15-d-

PGJ2 parecem exercer efeitos de inibiccedilatildeo do processo apoptoacutetico nas ceacutelulas U937 por um

lado inibindo a expressatildeo gecircnica de p53 e por outro lado estimulando a expressatildeo de Bcl-xL

(15-d-PGJ2) Os tratamentos com LDL nativa favorecem a apoptose das ceacutelulas aumentando a

expressatildeo de p53 e caspase aleacutem de inibir Bcl-xL Jaacute a LDL oxidada parece estimular a

apoptose aumentando p53 e inibindo a expressatildeo de Bcl-xL mas inibe a expressatildeo de caspase

3 o que sugere rotas especiacuteficas para a sua atividade proacute-apoptoacutetica Estes achados vecircm de

encontro aos de Yoshifumi et al (2000) e Yao amp Tabas (2000) que atribuem a induccedilatildeo de

apoptose em macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas agrave presenccedila de LDL oxidada e colesterol

livre nos meios de cultura

89

Ceacutelulas U937 tratadas com de LDL oxidada mostram uma forte tendecircncia agrave apoptose

apesar do efeito inibitoacuterio das CP-PGs PGA2 e 15-d-PGJ2 sozinhas sobre a expressatildeo de p53

Jaacute a 15-d-PGJ2 parece natildeo interferir na expressatildeo gecircnica da caspase 3 embora demonstre

anular o efeito inibitoacuterio da LDL oxidada sobre a expressatildeo desta proteiacutena No caso da

expressatildeo de p53 esta CP-PG por si soacute promove reduccedilatildeo na expressatildeo gecircnica efeito este que

se manteacutem em presenccedila de LDL oxidada Esta tendecircncia anti-apoptoacutetica da 15-d-PGJ2 se

confirma tambeacutem pelo aumento na expressatildeo gecircnica de Bcl-xL promovido pelo autacoacuteide

quando administrado sozinho no meio de cultura

Estes resultados indicam um possiacutevel papel anti-apoptoacutetico das CP-PGs que se

contrapotildee aos efeitos proacute-apoptoacuteticos jaacute bem descritos exercidos pela exposiccedilatildeo das ceacutelulas agrave

LDL oxidada como verificado por Curi et al (2004) que relatam efeitos da 15-d-PGJ2 no

sentido de induccedilatildeo de apoptose em ceacutelulas Jurkat e Raji

Para maiores esclarecimentos a respeito dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre

as rotas moduladoras dos processos de morte celular por apoptose em macroacutefagosfoam cells

satildeo necessaacuterios estudos mais aprofundados de expressatildeo gecircnica neste e em outros modelos

experimentais verificando-se vias especiacuteficas de accedilatildeo destes autacoacuteides

90

6 CONCLUSOtildeES

De acordo com os resultados obtidos experimentalmente e ora apresentados neste

trabalho a CP-PG 15-d-PGJ2 mostra-se citoprotetora para as ceacutelulas da linhagem proacute-

monociacutetica humana U937 reduzindo a expressatildeo gecircnica de PPAR-γ e mantendo a expressatildeo

de CD36 em niacuteveis semelhantes aos do no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL

oxidada

A PGA2 exerce efeito semelhante suprimindo a expressatildeo gecircnica tanto do fator

nuclear PPAR-γ como tambeacutem de CD36 Esta resposta fisioloacutegica pode ser de grande utilidade

na terapecircutica da aterosclerose uma vez que o receptor de scavenger CD36 eacute capaz de

reconhecer e internalizar partiacuteculas de LDL oxidada participando da diferenciaccedilatildeo de

macroacutefagos em foam cells

PGA2 inibe a expressatildeo gecircnica da enzima HMG-CoA redutase reguladora da siacutentese

intracelular de colesterol Esta constataccedilatildeo associada a futuras pesquisas no sentido de se

avaliar tambeacutem a atividade da enzima HMG-CoA redutase frente ao tratamento com CP-PGs

e LDL nativa e oxidada pode auxiliar efetivamente no desenvolvimento de terapias eficazes

no combate agrave aterosclerose

A 15-d-PGJ2 parece manter a expressatildeo da HMG-CoA redutase aos niacuteveis observados

no grupo controle mesmo em presenccedila de LDL oxidada Por outro lado esta CP-PGP sozinha

natildeo altera a expressatildeo gecircnica da enzima pelo menos nas condiccedilotildees em que foram realizados

os experimentos Assim seria interessante verificar o efeito deste eicosanoacuteide sobre a

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expressatildeo dos genes estudados em periacuteodos mais prolongados de tratamento tanto para PGA2

como para 15-d-PGJ2

Com relaccedilatildeo aos genes relacionados aos processos de apoptose tanto proacute-apoptoacuteticos

como p53 e caspase 3 como anti-apoptoacutetico como no caso da Bcl-xl as CP-PGs parecem

exercer efeitos anti-apoptoacuteticos nas ceacutelulas estudadas Estes efeitos se contrapotildeem ao papel

proacute-apoptoacutetico jaacute bem descrito da LDL oxidada sobre macroacutefagos e ceacutelulas musculares lisas

vasculares

Embora as CP-PGs 15-d-PGJ2 e PGA2 mostrem-se por um lado inibidoras da

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells pela inibiccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados

a este processo e por outro lado tambeacutem interferem positivamente na regulaccedilatildeo do processo

de apoptose muitos pontos permanecem por ser esclarecidos

Assim novas pesquisas acerca dos mecanismos de accedilatildeo das CP-PGs sobre a

diferenciaccedilatildeo de macroacutefagos em foam cells bem como seus efeitos sobre os processos que

modulam os processos de sobrevivecircncia e morte destas ceacutelulas satildeo de especial importacircncia

para uma possiacutevel terapecircutica no tratamento da aterosclerose

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