universidade federal do rio de janeiro centro de …livros01.livrosgratis.com.br/cp116909.pdf ·...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA Pós- Graduação em Química Biológica

CLARA RODRIGUES FERREIRA

ALTERAÇÕES EM PARÂMETROS BIOENERGÉTICOS

MITOCONDRIAIS PELO 3-BROMOPIRUVATO

Rio de Janeiro

2009

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Rodrigues Ferreira, Clara

Alterações em parâmetros bioenergéticos mitocondriais pelo 3-bromopiruvato/ Clara Rodrigues Ferreira, Rio de Janeiro: UFRJ/IBqM, 2009.

xiv, 83 f.

Orientador: Antonio Galina Filho

Dissertação: Mestre em Ciências ( Química Biológica)

1. Cadeia Transportadora de Elétrons. 2. 3-Bromopiruvato. 3. Succinato

Desidrogenase. I. Galina, Antonio. II. Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós- graduação em

Química Biológica. III. Alterações em parâmetros bioenergéticos

mitocondriais pelo 3-bromopiruvato

FICHA CATALOGRÁFICA

ii




Dissertação apresentada ao Curso de

Pós-Graduação em Química Biológica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito para obtenção do Grau de Mestre Modalidade Química Biológica.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Galina Filho

Rio de Janeiro

2009

iii




Dissertação submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas modalidade Química Biológica. Aprovada em setembro de 2009 por: __________________________________________________________ DR. ANTONIO GALINA FILHO – ORIENTADOR PROFº ADJUNTO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA/ UFRJ __________________________________________________________ DR. JOÃO BATISTA TEIXEIRA DA ROCHA PROFº ASSOCIADO DO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA- CCNE/ UFSM __________________________________________________________ DR. JOSÉ ROBERTO MEYER FERNANDES PROFº ADJUNTO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA/ UFRJ __________________________________________________________ DR. ROBSON DE QUEIROZ MONTEIRO PROFº ADJUNTO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA/ UFRJ __________________________________________________________ DR. WAGNER SEIXAS DA SILVA PROFº ADJUNTO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA/ UFRJ __________________________________________________________ DR. MARCELO EINICKER LAMAS PROFº ADJUNTO DO INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO/ UFRJ

Rio de Janeiro/2009

iv

Dedico este trabalho primeiramente à Deus por tudo. Aos meus pais e minha avó Maria (in memoriam) por sempre estarem ao

meu lado em todos os momentos.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus em primeiro lugar, pois sem ele nada disso seria possível.

Ao meu pai, minha mãe e minha avó (que não está mais presente) pelo amor,

dedicação, companherismo, amizade e principalmente pela paciência.

A toda minha família, tios, tias, primos, primas que são essenciais na minha vida.

Aos meus irmãos do coração Rafaela, Marianna, Andréia, Fernanda, Dimitri, Elisa,

Laura, André e Vanessa por sempre estarem presentes na minha vida em todos os

momentos.

A todos os meus amigos que fiz no Instituto de Bioquímica Médica, sem dúvida

pessoas que somaram muito na minha trajetória.

Ao meu querido orientador Antonio Galina por tudo que me ensinou.

A toda equipe do laboratório antiga e atual Marne, Nattascha, Laudiene, Bruno,

André, Juliana, Ana Paula Pereira, Ana Paula Santiago, Vagner, Andreza, Douglas,

Murilo, Luiza e Daniele pelo carinho, amizade e ajuda.

A todas as pessoas importantes que já passaram pela minha vida e aos meus novos

amigos.

vi

RESUMO

Carcinoma hepatocelular (HCC) é um dos tumores malignos mais letais, apesar dos avanços científicos para detecção de HCC em estágio avançado. A maioria das lesões se desenvolve em pacientes com cirrose ou hepatite viral. Experimentos iniciais mostraram que o agente alquilante 3-Bromopiruvato (3-BrPA) tem atividade anti-tumoral baseada nas propriedades anti- proliferativas em células do hepatoma. Tem sido proposto que 3-BrPA causa distúrbios na glicólise e no consumo de oxigênio levando a uma diminuição na taxa de síntese de ATP. Apesar desta observação, o mecanismo bioquímico detalhado de ação do 3-BrPA na respiração mitocondrial em células tumorais e normais é desconhecido. Trabalhos recentes descreveram que 3-BrPA inibe a atividade da succinato desidrogenase (SDH) reagindo com grupamentos – SH, mas a influência no estado respiratório mitocondrial é desconhecido. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do 3-BrPA nos aparatos da fosforilação oxidativa da mitocôndria de fígado de camundongo; ex. na cadeia transportadora de elétrons (CTE) e a atividade da FoF1-ATPsintase. A atividade ATPase da FoF1-sintase foi somente parcialmente inibida (25%) por 1mM 3-BrPA. Nenhuma inibição na atividade ATPase foi detectada em concentrações mais baixas de 3-BrPA. Porém, a atividade da succinato desidrogenase (SDH) (complexo II) é inibida 50% em 100µM de 3-BrPA na presença ou ausência de ADP. A atividade da NADH: ubiquinona oxidoredutase (complexo I) não foi inibida por 500µM de 3-BrPA. Todavia, a pré- incubação da mitocôndria por 30 minutos com 3-BrPA causou uma grande inibição em 75 µM de 3-BrPA. As inibições observadas pelo 3-BrPA nas atividades dos complexos da CTE foram observadas na respiração e no potencial de membrana (ΔΨm). A inibição mais evidente da respiração e ΔΨm foi observada usando succinato como substrato. Em adição, quando a mitocôndria estava em um estado fosforilando ADP (estado 3), o efeito induzido pelo 3-BrPA foi maior. O agente desacoplador (FCCP), causando o mesmo nível de despolarização do estado 3, não foi capaz de aumentar inibição pelo 3-BrPA da respiração estimulada pelo succinato. Esses efeitos inibitórios do 3-BrPA foram revertidos ou atenuados pela glutationa reduzida (GSH) na mitocôndria de fígado de camundongo. Quando a respiração semelhante ao estado 3 foi induzida pela reação da HK de levedura, 3-BrPA inibiu mais rapidamente do que na ausência da reação catalisada pela HK. Os mesmos resultados foram observados usando mitocôndria de cérebro de camundongo que apresenta HK ligada a membranas externas. Esses resultados foram confirmados quando o carreador ANT foi parcialmente ou totalmente bloqueado por carboxiatractilosídeo. Esses resultados sugerem que HK-II ligada mitocondrialmente encontrada em tumores facilita a inibição pelo 3-BrPA em mitocôndrias de tumores através da ciclagem de ADP. A proteção causada pelo GSH sugere que importantes grupos - SH presentes no sítio catalítico da succinato desidrogenase são potencialmente alvos de alquilação promovida pelo 3-BrPA.

vii

ABSTRACT

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most lethal tumors despite of the scientific improvements for detection of HCC in advance it. The most injuries occur in patients with cirrhosis or viral-induced hepatitis. Early experiments showed that the alkylating agent 3-Bromopyruvate (3-BrPA) has been used as an anti-tumoral drug based on its anti-proliferative property in hepatomas cells. This effect has been proposed to occur by disturbance of glycolysis and respiration leading to a decreased rate of ATP synthesis. Despite of this observation, the detailed mechanism of action of 3-BrPA in mitochondrial respiration in normal and tumor cells is unknown. Previous works described that 3BrPA inhibits succinate dehydrogenase (SDH) activity reacting with SH groups, but the influence of mitochondrial respiration states is unknown. The aim of this study was investigate the effect of 3-BrPA on mice liver oxidative phosphorylation apparatus of mitochondria; i.e. electron transport chain (ETC) and FoF1-ATPsynthase activity. The FoF1-ATPase activity was only partially inhibited (25%) by 1mM 3-BrPA. No inhibition in ATPase activity was detected at lower 3-BrPA concentration. However, the succinate dehydrogenase (SDH) activity (complex II) is inhibited in 50 % at 100 µM 3-BrPA either in the presence or in the absence of ADP. The NADH: oxidoreductase activity (complex I) was not inhibited by 500 µM 3-BrPA. However, pre-incubation of mitochondria by 30 minutes with 3-BrPA caused a pronounced inhibition at 75 µM 3-BrPA. The inhibitions observed by 3-BrPA in the ETC complexes activities were coupled to respiration and membrane potential (ΔΨm). The most pronounced inhibition of respiration and ΔΨm was observed using succinate as substrate. In addition,when the mitochondria was in a phosphorylating ADP state (state 3), the effect induced by 3-BrPA was even more marked. The proton uncoupler (FCCP), set to cause the same level of ΔΨm depolarization of state 3, was not able to improve the 3-BrPA inhibition of respiration sustained by succinate. These inhibitory effects of 3-BrPA were reverted or attenuated by reduced glutathione (GSH) on mice liver mitochondria. When the respiration was induced by yeast HK reaction (state 3 like), 3-BrPA inhibition was faster than in the absence of HK catalyzed reaction. The same results were observed using mice brain mitochondria that present HK bound to the outer membranes. These results were confirmed when the ANT carrier was partially or totally blocked by carboxyatractiloside. These results suggest that mitochondrially bound HK type II found in tumors facilitates the 3-BrPA inhibition in tumors mitochondria through ADP re-cycling. The protection caused by GSH suggest that important –SH groups present at the catalytic site of succinate dehydrogenase are potentially target of alkylation promoted by 3-BrPA.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

ADP: adenosina 5'- difosfato ANT: adenine nucleotide translocator ATP: adenosina 5'- trifosfato

BSA: do inglês : bovine serum albumin COX: citocromo c oxidase CTE: cadeia transportadora de elétrons

DCIP: 2,6- diclorofenolindofenol EDTA: do inglês : Ethylenediamine tetraacetic acid

EGTA: do inglês :

ethylene glycol tetraacetic acid

FAD+

: do inglês : flavine adenine dinucleotide

FADH2 : do inglês : flavine adenine dinucleotide hydrogenase

FCCP: do inglês : Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone

FDG: fluor-deoxiglicose FMN: flavina mononucleotídeo GSH: do inglês : Glutathione G-6-P: glicose 6- fosfato

HCC: hepatocarcinoma

HK: hexocinase HK- II: hexocinase tipo II NADH: do inglês: nicotinamide adenine dinucleotide hydrogenase NEM: N- etilmaleimida

PET: do inglês: positron emission tumography Pi: fosfato inorgânico

PMS: fenazina metilsulfato

ix

SDH: succinato desidrogenase TACE: do inglês: Transarterial chemoembolization Triton X-100: (t- Octilfenoxipolietoxietanol) VDAC: do inglês: Voltage-dependent anion

‘ channel

3-BrPA: 3-bromopiruvato

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Variações regionais na taxa de mortalidade causada pelo HCC 5

Figura 2: Método usado na administração de agentes quimioterapêuticos via

injeção intraarterial direta em tumor de fígado.

7

Figura 3: Estrutura e reatividade do 3-BrPA 15

Figura 4: Identificação das estruturas mitocondriais 19

Figura 5: Esquema representando a cadeia transportadora 22

Figura 6: Estados respiratórios 30

Figura 7: Atividade da NADH:Ubiquinona Oxidoredutase em presença

de 3BrPA 41

Figura 8: 3-BrPA não afeta o consumo de oxigênio quando

utilizados substratos do complexo IV

42

Figura 9: Efeito do 3-BrPA na hidrólise de ATP pela FoF1 44 -ATPase

Figura 10: Efeito do 3BrPA na atividade da succinato desidrogenase

na presença e na ausência de ADP

46

Figura 11: 3-BrPA diminui a formação do potencial de membrana

mitocondrial (ΔΨm) pela cadeia transportadora de elétrons(ETC)

49

Figura 12: Inibição do consumo de oxigênio é dependente do

estado respiratório mitocondrial

51

Figura 13: Efeito do 3-BrPA na despolarização do potencial de

membrana mitocondrial (ΔΨm) usando succinato

(substrato do complexo II) nos estados respiratórios 3 e 4

53

Figura 14: Diferenças na despolarização da formação potencial

de membrana mitocondrial (ΔΨm) usando substratos do

complexo I e II da cadeia transportadora de elétron (ETC)

na presença de 3-BrPA no estado 3

54

Figura 15: Glutationa reduzida (GSH) protege a dissipação do potencial

de membrana (ΔΨm) promovida pelo 3BrPA

56

Figura 16: Ciclagem ADP/ATP promovida pelo

complexo ANT.F0F1ATPsintase.HK aumenta a

sensibilidade da succinato desidrogenase ao 3-BrPA

58

xi

Figura 17: Despolarização parcial do potencial de membrana

Mitocondrial (ΔΨm) pelo ionóforo de próton FCCP não aumenta

a sensibilidade da succinato desidrogenase a inibição pelo

3-BrPA comparada a reciclagem de ADP pela atividade da HK

60

Figura 18: Importância da ciclagem de ADP no efeito do 3-BrPA 61

Figura 19: Correlação entre a taxa da respiração induzida pela atividade

da HK e a reatividade ao 3-BrPA

63

xii

SUMÁRIO

Resumo Vi Abstract Vii Lista de Abreviaturas Viii Lista de Figuras X 1- INTRODUÇÃO 2 1.1- Câncer 2 1.2- Epidemiologia do câncer de fígado 3 1.3- Hepatocarcinoma 4 1.4- Tratamento para o hepatocarcinoma 6 1.5- Aspectos gerais do metabolismo energético em células tumorais 8 1.6- Hexocinase 10 1.7- Hexocinase tipo II e células tumorais 12 1.8- 3-Bromopiruvato como um agente antitumoral promissor 13 1.9- Aspectos gerais da mitocôndria e fosforilação oxidativa 17 1.9.1- NADH: ubiquinona Oxidoredutase ou complexo I 23 1.9.2- Succinato- ubiquinona oxidoredutase ou complexo II 24 1.9.3- Ubiquinol: Citocromo c oxidoredutase, complexo citocromo

bc1

25

ou complexo III 1.9.4- Citocromo c oxidase ou complexo IV 26 1.9.5- ATP sintase ou complexo V 27 1.10- Estados respiratórios mitocônddriais 29 2- OBJETIVOS 32 2.1- Objetivo Geral 32 2.2- Objetivos Específicos 32 3- MATERIAIS E MÉTODOS 34 3.1- Animais 34 3.2- Isolamento de mitocôndria 34 3.3- Preparo da solução de 3-BrPA 35 3.4- Hidrólise de ATP 35 3.5- Consumo de oxigênio em mitocôndrias isoladas 35 3.6- Medidas do potencial de membrana mitocondrial (∆ψm 36 ) 3.7- Determinação da atividade da NADH: ubiquinona oxidoredutase 36 3.8- Ensaio da atividade da succinato desidrogenase 37 3.9- Quantificação de proteínas 38 3.10- Análise Estatística 38 4-RESULTADOS 40

4.1- Efeito do 3-BrPA nas atividades dos complexos I e IV da cadeia

transportadora de elétrons

40

4.2 - 3-BrPA não afeta a atividade da FoF1 43 - ATPsintase 4.3- 3-BrPA inibe a atividade da SDH 45 4.4- Inibição da formação do potencial de membrana (ΔΨm) e

consumo de oxigênio pelo 3-BrPA confirmam os efeitos na CTE

47

4.5- 3-BrPA reage diferentemente com os complexos da CTE e

depende dos estados respiratórios

50

4.6- Efeito protetor da glutationa reduzida (GSH) a inibição pelo 55

xiii

3BrPA 4.7- O efeito inibitório do 3-BrPA é modulado pelos estados

respiratórios da mitocôndria

57

5- DISCUSSÃO 65 6- CONCLUSÕES 71 7- REFERÊNCIAS 73

1- INTRODUÇÃO _______________________________________

Introdução |2

1- INTRODUÇÃO:

1.1- Câncer.

Apesar da enorme quantidade de estudos sobre o câncer durante a metade

do século passado por agências consolidadas através do mundo, a guerra contra

esta doença frequentemente fatal não se mostra iminente. Alguns estudos relatam

que atualmente um em cada dois homens e uma em cada três mulheres morre de

câncer. Embora durante o século passado um número de doenças tenham sido

seriamente encurtadas, o câncer está se tornando a doença número um no mundo

(Pedersen, 2007).

Câncer é caracterizado pelo crescimento descontrolado e propagação de

células anormais conhecido como neoplasias, que podem ser benignas ou malignas,

invadindo tecidos e órgãos podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do

corpo resultando em morte se essa propagação não for controlada.

Existem diferentes tipos de câncer correspondentes aos vários tipos de

células do corpo. Se o câncer tem início em tecidos epiteliais como pele ou

mucosas, é denominado carcinoma. Em tecidos conjuntivos como osso, músculo ou

cartilagem é chamado de sarcoma, linfa (linfoma), células neuroendrócrinas

(carcinóide), células geminativas (teratoma e seminoma), vasos sanguíneos

(hemangiossarcomas), vasos biliares (colangiossarcomas) e vasos linfáticos

(linfangiossarcomas)

Em 2005, de um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer

foi responsável por 7,6 milhões, o que representou 13%. Os principais tipos de

câncer com maior mortalidade foram: pulmão (1,3 milhão), estômago (cerca de 1

milhão), fígado (662 mil), cólon (655 mil) e mama (502 mil).

. O câncer é causado por ambos, fatores externos (tabaco,

organismos infecciosos, químicas e radiação) e fatores internos (mutações

herdadas, hormônios, condições imunes e mutações que ocorrem do metabolismo)

sendo que esses fatores podem agir juntos ou de maneira sequencial no

desenvolvimento da carcinogênese (American Cancer Society, 2009).

Introdução |3

Do total de óbitos por câncer ocorridos em 2005, mais de 70% ocorreram em

países de média ou baixa renda (World Health Organization, 2006). Estima-se que

em 2020 os números de casos novos anuais sejam da ordem de 15 milhões, tendo

cerca de 60% desses caos ocorrendo em países em desenvolvimento. Acredita-se

que um terço dos casos novos de câncer diagnosticados anualmente no mundo

poderia ser prevenido. Parkin et al. (2001) estimaram para o ano de 2000 que o

número de casos novos de câncer em todo o mundo seria maior que 10 milhões. No

Brasil, as estimativas para o ano de 2008 e válidas também para o ano de 2009

apontam que ocorrerão 466.730 novos diagnósticos (INCA, 2008).

1.2- Epidemiologia do câncer de fígado.

Dentre os tipos de câncer que estão apresentando um aumento na sua

incidência está o câncer de fígado. Este é dividido em duas categorias: o primário e

o secundário ou metastático (originado em outro órgão e que atinge também o

fígado). O termo "primário" é usado nos tumores originados no fígado, como o

hepatocarcinoma ou carcinoma hepatocelular (tumor maligno primário mais

frequente que ocorre em mais de 80% dos casos), o colangiocarcinoma (que

acomete os ductos biliares dentro do fígado), angiossarcoma (tumor do vaso

sangüíneo) e o hepatoblastoma (que acomete as crianças).

O câncer de fígado é o sexto tipo mais comum no mundo, apresentando

626.241 casos novos por ano. Sua incidência é 2,5 vezes maior em homens do que

em mulheres. Entre 1973 e 1997 a taxa de incidência aumentou em todas as partes

do mundo sendo que sua taxa de incidência para ambos, homens e mulheres, são

mais altas em regiões menos desenvolvidas (Kamangar et al., 2006).

Introdução |4

1.3- Hepatocarcinoma.

Dos quatro tipos de tumores primários de fígado citados acima, o carcinoma

hepatocelular (HCC) é o mais predominante. É um neoplasma comumente originado

de um fígado doente sendo um dos poucos cânceres com fatores de riscos bem

definidos (Bosch et al.,1999). A primeira descrição científ ica foi feita por

Eggel em 1901, mostrando o resultado de mais de 200 autópsias. É a

forma mais comum de câncer de fígado primário e um dos mais letais no mundo

(Saha et al., 2001), apresentando-se entre 85-90% dos cânceres primários de

fígado. É o quinto tipo mais comum no mundo e a terceira maior causa de

mortalidade (Parkin, 2001). Dentre as numerosas vítimas, não estão somente

aqueles com tumores primários que se desenvolvem diretamente no fígado, mas

aqueles com tumores secundários que frequentemente aumentam neste órgão

metabólico crítico como resultado de metástases de outros tecidos (Saha et al.,

2001). Em 80% dos casos, o HCC se desenvolve em fígados com cirrose que é o

fator que mais predispõe o desenvolvimento de tumores (Colombo, 2003).

Outros fatores de riscos para o desenvolvimento de HCC são doenças

crônicas causadas por infecção viral, hepatites B e C (Poynard et at.,1991). O HCC

apresenta diversas características epidemiológicas que incluem variações entre

regiões geográficas, raciais, grupos étnicos, sexo e aspectos ambientais (El-Serag e

Rudolph, 2007). Sua distribuição não é uniforme, e a maioria dos casos tem sido

observada na África subsaariana e Sudeste da Ásia (> 80%) onde a infecção pelo

vírus da hepatite B é comum juntamente com a ingestão de aflatoxina B

(micotoxinas) através de alimentos contaminados. Na América do Norte, América do

Sul, Oceania e Norte da Europa as taxas de incidências são menores apresentando

menos que 5 casos a cada 100.000 pessoas (Parkin, 2002, Liaw et al.,1986 e Sun et

al., 1999) (Figura 1).

Introdução |5

Figura 1: Variações regionais na taxa de mortalidade causada pelo HCC. As taxas são

correspondentes a cada 100.000 habitantes. Figura retirada de El-Serag e Rudolph, 2007.

Introdução |6

1.4- Tratamento para o hepatocarcinoma.

Embora o HCC ocasione mais do que um milhão de mortes por ano, poucas

opções de tratamento estão disponíveis aos pacientes. O prognóstico para esses

pacientes é geralmente ineficiente, apresentando taxas de respostas baixas,

toxicidades severas e altas taxas de recorrência (Geschwind et al., 2002). Somente

uma minoria desses pacientes são candidatos a tratamentos de cura, tal como

excisão cirúrgica. Pouco menos de 10% dos pacientes sobrevivem cinco anos

depois do diagnóstico, e o período médio de sobrevivência é de quatro a seis meses

para pacientes com tumores não removíveis cirurgicamente (Okuda et al., 1985;

Rustgi, 1987; Di Bisceglie et al., 1988). Uma alternativa atualmente seria a

embolização e a quimioembolização.

Estas terapias levam vantagem pelo fato de que, tumores primários de fígado,

recebem a maior parte do suprimento sanguíneo da artéria hepática, ao contrário do

tecido do fígado normal que recebe predominantemente da veia porta (Breedis e Ko,

1954; Geschwind et al., 2000). Portanto, a embolização envolve o bloqueio da artéria

hepática alimentando o tumor com um material tipo resina misturado com uma base

de óleo (álcool polivinil em itiodol), deprivando o tumor de nutriente e oxigênio. A

quimioembolização arterial transcateter (TACE) refere-se ao mesmo procedimento,

mas com a inclusão de um ou mais agentes antitumorais (Ramsey et al., 2002).

Todavia, a artéria hepática seria um possível alvo para injeção de agentes

quimioterapêuticos em tumores de fígado embolizando-os (figura 2A e 2B). Estas

terapias têm sido amplamente investigadas e utilizadas em tratamentos de tumores

hepáticos. Os benefícios de TACE têm sido provados através de triagens clínicas

ocasionais, porém, a eficácia terapêutica é ainda limitada e a deterioração da função

do fígado é inevitável (Llovet et al., 2002). Todavia, uma nova estratégia para o

tratamento do HCC faz-se necessária.

Introdução |7

Figura 2: A e B método usado na administração de agentes quimioterapêuticos via injeção intraarterial direta em tumor de fígado. C, locais de ação do 3-BrPA na produção de ATP. Uma vez

dentro da célula tumoral, o 3-BrPA inibe a produção de ATP pela glicólise e fosforilação oxidativa.

Retirado de Geschwind et al., 2002.

Introdução |8

1.5- Aspectos gerais do metabolismo energético em células tumorais.

Em estudos bioquímicos e fisiológicos, células tumorais são geralmente

classificadas de acordo com a taxa de crescimento: lento, intermediário ou rápido

(Pedersen, 1978). Para tumores em animais experimentais, a taxa de crescimento é

determinada pelo tamanho e volume, taxa mitótica, grau de diferenciação e

incorporação de timidina (Weber, 2001). Exemplos de tumores de crescimento

rápido em camundongo incluem dois cânceres experimentais, tais como AS-30D e

carcinoma hepatocelular CH-252. Em tumores humanos, a classificação é baseada

nas características histológicas e estágio de desenvolvimento clínico. Todavia, pelo

estágio de desenvolvimento avançado e propriedades metastáticas, alguns tumores

considerados por ser de crescimento rápido são carcinoma ovariano, carcinoma da

tireóide e carcinoma uterino (Pedersen, 1978; Zu e Guppy, 2004).

Células tumorais exibem profundas diferenças histológicas, bioquímicas e

genéticas quando comparadas a tipos celulares originais e não transformadas. A

grande maioria dos tipos celulares de tumores de crescimento rápido sofre uma

grande modificação no metabolismo energético em comparação ao tecido de

origem. O mesmo se aplica a tumores experimentalmente desenvolvidos em

roedores.

A mais notória alteração do metabolismo energético em células tumorais é a

aumentada capacidade glicolítica mesmo na presença de uma alta concentração de

oxigênio (Warburg, 1930 e Pedersen, 1978). Foi observada em alguns tumores a

ocorrência de uma alta expressão de uma forma de hexocinase associada à

mitocôndria, que posteriormente foi identificada como sendo do tipo II (Nakashima et

al., 1988; Shinohara et al., 1991; Thelen e Wilson, 1991; Rempel e Mayer, 1994).

Esta enzima catalisa o primeiro passo na via glicolítica no qual o fosfato gama do

ATP é transferido para o carbono 6 da glicose. Propõe-se que a enzima teria um

papel significante em células altamente malignas na promoção do crescimento e

sobrevivência. Por esta razão, esta enzima representaria um dos possíveis alvos

para intervenção terapêutica.

Introdução |9

Outra justificativa para a glicólise aumentada em células tumorais com alta

taxa de proliferação, geralmente envolve as enzimas mitocondriais, na qual é

suposta por ser defeituosa ou menos efetiva do que enzimas glicolíticas na

competição por intermediários comuns (Warburg, 1930; Gosálvez et al., 1974).

Parlo e Coleman (1984), propuseram que a alta atividade glicolítica em

algumas células tumorais é causada pela disfunção mitocondrial a nível do ciclo de

Krebs, no qual resultaria numa baixa disponibilidade de equivalentes redutores para

a cadeia respiratória e portanto uma baixa fosforilação oxidativa, causando assim,

uma deficiência na produção de ATP que é muito importante para o crescimento do

tumor. Em tumores avançados "altamente glicolítico", é encontrado que a fonte de

energia (ATP) é derivada tanto da fosforilação oxidativa como da glicólise (Aisenberg

1961). Em um dos casos mais extremos estudados, a produção de ATP mitocondrial

foi estimada em aproximadamente 40% e a produção de ATP glicolítico em

aproximadamente 60% (Nakashima et al., 1984). Assim, a glicólise aumentada

contribuiria mais significativamente para a demanda energética por ATP. Isso é

contrastante com a maioria das células normais onde a mitocôndria é responsável

pela produção de 60% a 90% do ATP necessário a célula.

Todavia, estudos também determinaram que as taxas de oxidação de

piruvato, malato, citrato, acetoacetato e descarboxilação do acetato em células AS-

30D seriam similares a células não-tumorigênicas. De fato, as atividades de todas as

enzimas do ciclo de Krebs estavam 1-30 vezes mais alta em mitocôndria do

hepatoma AS-30D do que em mitocôndria de fígado normal (Dietzen e Davis, 1993).

Outras hipóteses para explicar a baixa eficiência do metabolismo oxidativo em

tumores altamente malignos seriam o baixo conteúdo mitocondrial por célula, cadeia

respiratória deficiente, sensibilidade aumentada do DNA mitocondrial ao estresse

oxidativo. Porém, estudos feitos em diversos tipos de hepatoma não mostraram

nenhuma diferença significativa quando comparados a células normais (Moreno-

Sánchez et al., 2007). De fato, existem linhagens de tumores nas quais certamente

exibem uma diminuída função mitocondrial, mas isso não se aplica a todos os tipos.

Introdução |10

Apesar de todas essas controvérsias, Muller et al., (1986) originalmente

propuseram que uma estratégia bioquímica para suprimir a proliferação acentuada

do tumor era o bloqueio simultâneo de ambos os modelos geradores de ATP

(glicólise e fosforilação oxidativa). Diversas drogas foram estudadas e uma delas

tem apresentado resultados satisfatórios no tratamento, o agente alquilante 3-

bromopiruvato (3-BrPA), que tem mostrado ser um inibidor em potencial da

hexocinase do tipo II (HK-II). Alguns estudos tem sido realizados sobre a ação do 3-

BrPA nesta enzima, mas há relatos da sua ação também na diminuição do consumo

de oxigênio em células do hepatoma que será explorado mais adiante (Ko et al.,

2001).

1.6- Hexocinase.

Tumores altamente malignos exibem a capacidade de metabolizar glicose a

lactato em taxas muito maiores do que células normais. Esta alta taxa é dependente

de níveis elevados de hexocinases. Em hepatomas com alta taxa de crescimento, a

hexocinase do tipo II (HK-II), uma forma capaz de se associar a membrana

mitocondrial externa, é a isoenzima predominantemente com níveis elevados

(Nakashima et al., 1988; Mathupala et al., 1995). Uma proposta de terapia

anticâncer seria o bloqueio do metabolismo energético através da inibição da HK-II.

O sufixo "cinase" (do inglês "Kinase") foi introduzido por Otto Meyerhof em

1927, quando este pesquisador verificou um grande aumento na taxa de ácido lático

ao adicionar glicose e extrato de levedura em homogenados de músculo. Meyerhof

decidiu buscar no extrato de levedura o fator protéico que promovia tal fenômeno.

Isolou uma fração protéica que em extratos de músculo era capaz de acelerar a

formação de lactato. Resolveu batizar a enzima como hexocinase (do inglês

hexokinase), ou enzima capaz de acelerar o uso da glicose no músculo (Kinase-

enzima que favorece a dinâmica (o metabolismo); hexose = açúcar de seis

carbonos. No inglês: hexokinase, no português hexocinase).

Introdução |11

Posteriormente Euler e Adler em 1935 verificaram a formação de hexose-

monofosfato quando misturavam hexose, ATP e íons de magnésio na fração

protéica purificada por Meyerhof. A hexocinase (EC 2.7.1.1) é uma enzima presente

em fungos, bactérias e todos os tecidos animais de vertebrados e invertebrados e

vegetais.

Hexocinase (ATP: D-hexose-6-fosfotransferase) catalisa o primeiro passo no

metabolismo da glicose:

Glicose + ATP → glicose-6- fosfato + ADP

A base para esta reação é o armazenamento da glicose-6-fosfato (G-6-P)

dentro da célula para sua utilização na via glicolítica, primeiramente para a geração

de energia (ATP) via glicólise e fosforilação oxidativa, metabolismo do glicogênio ou

a utilização desse metabólito para a via das pentoses sendo importante

principalmente para reações biossintéticas (Pedersen, 2007).

Em mamíferos há quatro isoformas diferentes de hexocinase (HK-I, -II, -III e –

IV ou glicocinase), nas quais diferem em propriedades cinéticas, expressão tecidual

e localização subcelular. Tipos I, II e III mostram alta afinidade pela glicose

apresentando o KM 250 vezes menor para glicose (KM = ~0.02 mM), são inibidas

pelo produto glicose-6-fostato (G-6-P). Todavia, a isoenzima do tipo IV tem afinidade

muito baixa pela glicose (KM

A isoforma tipo I é predominantemente encontrada no tecido cerebral

associada à membrana externa da mitocôndria através da porina. Também é

encontrada no seio, rim, retina e está presente também em alguns tumores

altamente glicolíticos (Kurokama et al., 1982; Parry et al., 1983; Arora et al., 1990;

Rempel et al., 1994), mas em níveis muito baixos relativo a Hexocinase do tipo II

(HK-II).

= 5 mM) sendo insensível a inibição por G-6-P

(Pedersen et al., 2002 e Pedersen, 2007). Baseado em análises de sequências

primária de aminoácidos, postula-se que o gene HK-IV, precursor das HKs sofreu

duplicação e fusão. Assim, a enzima HK-IV tem uma massa molecular de

aproximadamente 50 kDa enquanto as outras hexocinases tem uma massa

molecular de 100 kDa (Pedersen, 2007).

Introdução |12

A isoforma tipo II está presente no músculo esquelético, adipócitos e é

também a isoforma predominante em células tumorais. Esta isoforma também

apresenta a propriedade de se associar a mitocôndria. A isoforma III possui uma

localização perinuclear na região citoplasmática cerebelar do neurônio de Purkinje e

a isoforma do tipo IV é expressada em células do fígado (hepatócitos) e em células

pancreáticas recebendo o nome de glicocinase tendo uma localização nuclear ou

citosólica dependendo da disponibilidade de glicose no fígado, não se apresentando

associada à mitocôndria.

1.7- Hexocinase tipo II e células tumorais.

Em células tumorais de crescimento rápido, com exceção dos tumores

cerebrais nos quais possuem a HK-I como isoforma predominante, a HK-II é a

isoforma predominante e apresenta uma atividade de 20 a 306 vezes maior em

hepatomas de Novikoff, H19 e AS-30D do que em hepatócitos (Parry e Pedersen,

1983; Nakashima et al., 1988; Marin-Hernandez et al., 2006). Isto não é

característico de todos os tumores, mas sim de tumores com alta taxa de

proliferação pobremente diferenciados e que são altamente malignos.

A HK-II se liga a canais transmembranares formados pela proteína

denominada "porina" ou "VDAC" (canais de ânion voltagem dependente) inserida na

membrana mitocondrial externa (Nakashima et al., 1986). Esta interação reduz

marcadamente a sensibilidade da enzima à inibição pela G-6-P, provê acesso ao

ATP produzido pela mitocôndria e protege contra a degradação proteolítica (Rose e

Warms, 1982; Arora e Pedersen, 1988). Como já foi descrito pelo grupo do Dr.

Pedersen, essas propriedades combinadas juntamente com uma alta quantidade

desta enzima em tumores malignos resultam em uma rápida produção de G-6-P.

Este intermediário metabólico chave serve não somente como uma fonte de carbono

para biossíntese, que é essencial para o crescimento e rápida proliferação dos

tumores, mas também como substrato inicial para glicólise que gera ATP na

conversão à lactato.

Introdução |13

Células cancerígenas altamente malignas utilizam HK-II não somente para

protegê-las durante mudanças bruscas no estado metabólico e fisiológico, mas

também contra a morte celular. Tem sido demonstrado que a HK-II inibi a ligação de

BAX, uma proteína pró-apoptótica, a membrana mitocondrial externa inibindo a

liberação do citocromo c e, portanto, a apoptose (Pastorino et al., 2003). Como uma

forma de detecção, testes diagnósticos e PET (Tumografia de Emissão de Positron)

são importantes na identificação de tumores altamente glicolíticos com altos níveis

de HK-II. PET é uma técnica que provê imagens de processos metabólicos

utilizando FDG (18F-2-fluoro-2-deoxi-D-glicose), um análogo radiofarmacêutico da

glicose. Este é captado e fosforilado de maneira similar a glicose e a taxa de

captação pelas células tumorais é proporcional a atividade metabólica das mesmas.

(Rohren et al., 2004; Kapoor et al., 2004).

Considerando os vários papéis que a HK-II apresenta em células tumorais,

esta se tornou um alvo atrativo para intervenções terapêuticas. Geschwind em 2000,

propôs que HKII seria alvo de alquilação pelo 3-BrPA. Neste estudo, os autores

através de injeção intra-arterial deste composto, identificaram a HKII como alvo

principal até o momento, embora trabalhos já tenham sugerido sua ação na

fosforilação oxidativa (Ko et al., 2001, Pereira da Silva et al., 2009).

1.8- 3-Bromopiruvato como um agente antitumoral promissor.

Uma alternativa para interromper o crescimento de tumores caracterizados

como "altamente glicolíticos" e que demanda de quantidades significantes de ATP

seria a descoberta de um agente que fosse capaz de bloquear a formação de ATP

nas vias metabólicas das células tumorais.

Dessa forma, Ko e colaboradores em 2001 fizeram um exaustivo estudo de

vários compostos buscando por inibidores mais potentes e específicos de ambas as

vias, glicólise e fosforilação oxidativa. Neste estudo, foi usado o tumor VX2, que é

um tumor epidermóide de coelho induzido pelo vírus papiloma.

Introdução |14

Esse tumor tem sido descrito como um bom modelo para o estudo das

propriedades de crescimento e do sistema de vascularização encontrado em

tumores de fígado humano (Pauser et al., 1996; Geschwind et al., 2000).

Semelhante aos tumores de fígado, o tumor VX2 é alimentado através da artéria

hepática, enquanto o fígado é alimentado através da veia porta.

Dentre compostos testados, 3-Bromopiruvato (3-BrPA) mostrou-se um

potente inibidor das vias de síntese de ATP (Ko et al., 2001). Esse agente alquilante

agiria como uma potente droga antitumoral capaz de inibir a proliferação de células

do hepatoma (figura 3). Este composto é um análogo do lactato e baseado na

hipótese da similaridade estrutural ao lactato, é sugerido que entre nas células

cancerígenas pelo mesmo transportador que o lactado e induzir a depleção de ATP

(Ko et al., 2001; Geschwind et al., 2002) (figura 2C).

Introdução |15

d

Figura 3: Estrutura e reatividade do 3-BrPA segundo Ko et al., 2004.

Ácido lático Ácido Pirúvico 3-BrPA

Piruvilação da proteína (HK) (3-BrPA) HK HBr

Introdução |16

Com a descoberta do 3-BrPA como um inibidor da proliferação em modelos

de fatias de tumores VX2 em cultura, estudos foram realizados focando na

administração direta desse agente via injeção intra-arterial em tumores VX2

implantados no fígado de coelho para observar a capacidade de inibição do

crescimento (Geschwind et al., 2002). Os resultados obtidos comprovaram o grande

potencial desta droga em inibir a viabilidade das células tumorais com uma única

dose, pois comparado ao grupo controle (tumores não tratados com 3-BrPA), que

apresentou 100% das células viáveis, a droga foi capaz de reduzir a viabilidade das

células tumorais em 84% de células não viáveis sem causar qualquer dano no tecido

sadio.

Outro estudo também feito pelo grupo do Dr. Pedersen utilizou o hepatoma

AS-30D como modelo. Esse tumor é extensivamente estudado por ser altamente

glicolítico e apresentar altos níveis de HK-II associada à mitocôndria. Nesse estudo,

foi observado o efeito inibitório do 3-BrPA em tumor crescendo na cavidade

abdominal de ratos em diferentes estágios. A administração única da droga foi capaz

de inibir tumores moderadamente avançados até tumores sólidos avançados. Os

resultados obtidos mostraram a regressão e o completo desaparecimento dos

tumores entre 1-4 semanas sem qualquer recorrência meses após o tratamento e

sem necessidade de terapia adicional (Ko et al., 2004).

Análises histológicas do tecido hepático localizado perifericamente ao local da

administração do 3-BrPA seja por administração direta no tumor ou por injeção intra-

arterial, não apresentou nenhum dano. Esse resultado difere das terapias

convencionais, embolização ou quimioembolização descritos anteriormente, nos

quais se observa danos significantes no tecido próximo ao tecido maligno. Também

não foram observados danos aparentes em outros tecidos dos animais com tumor

de fígado tratados com 3-BrPA .

Até recentemente acreditava-se que o principal alvo da inibição pelo 3-BrPA

seria a HKII (Nakashima et al., 1988; Marin-Hernandez et al., 2006). Alguns estudos

demonstraram que 5 mM de 3-BrPA é capaz de inibir a reação da HK (Ko et al.,

2001). No entanto, 3-BrPA foi também descrito por ser um inibidor irreversível da

piruvato desidrogenase (Maldonado et al.,1972) e da succinato desidrogenase

(Sanborn et al., 1971; Kenney , 1975), da glutamato desidrogenase (Baker e Rabin,

Introdução |17

1969) e enzima málica (Chang e Hsu, 1973; Satterlee e Hsu, 1991) agindo então na

respiração mitocondrial. Assim como também de enzimas da via glicolítica como a

gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e a fosfoglicerato cinase (Jones et al., 1995).

Apesar destes estudos, o mecanismo de ação desta droga na respiração

mitocondrial de células normais e tumorais em concentrações mais baixas ainda não

foi investigado. O estudo a nível mitocondrial foi iniciado pelo nosso grupo utilizando

mitocôndrias isoladas de fígado sadio e células tumorais. Em células tumorais, foi

utilizado como modelo a HepG2 que apresenta um fenótipo glicolítico semelhante a

de outras células tumorais. Neste estudo, a HK mitocondrial não parece ser o alvo

preferencial do 3-BrPA quando doses baixas foram utilizadas. Outras enzimas da via

glicolítica parecem ser mais afetadas em concentrações mais baixas desta droga.

Porém, para estas concentrações, especulou-se que a succinato desidrogenase

possa ser um alvo promissor (Pereira da Silva et al., 2009).

Para uma melhor compreensão de como esta droga poderia estar agindo na

fisiologia mitocondrial, será apresentada uma breve revisão sobre a fosforilação

oxidativa e uma descrição dos complexos transportadores de elétrons localizados na

membrana interna mitocondrial que são o foco deste estudo.

1.9- Aspectos gerais da mitocôndria e fosforilação oxidativa.

As primeiras observações realizadas acerca das organelas que conhecemos

como mitocôndrias datam de meados do século XIX e foram feitas por diversos

citologistas que as descreveram como elementos granulares e inclusões presentes

no citoplasma de diferentes tipos celulares (Lehninger, 1965). Hoje, a mitocôndria é

considerada a principal organela transdutora de energia em células eucarióticas. É

nesta organela que ocorre a fase aeróbica do catabolismo das hexoses, ácidos

graxos e alguns aminoácidos que são oxidados a moléculas de acetil-coenzima A

(acetil-CoA) e alimentam as reações do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de

Krebs), gerando o potencial redutor a ser utilizado na fosforilação oxidativa. A

principal função mitocondrial é a conversão de energia armazenada em NADH e

FADH2 de processos metabólicos que ocorrem na matriz mitocondrial para a

molécula de ATP.

Introdução |18

São compostas de 2 compartimentos (espaço intermembrana e a matriz),

cada um com funções metabólicas específicas, demarcadas pelas membranas

mitocondriais internas e externas. A membrana externa envolve a organela,

enquanto a membrana interna envolve o espaço da matriz. O espaço intermediário é

localizado entre as duas membranas (figura 4). A membrana externa é impermeável

a moléculas maiores do que 1500 Da. O espaço intermembrana contém grupos

distintos de proteínas, incluindo o carreador de elétron móvel, citocromo c. A

membrana interna apresenta uma superfície de membrana maior com grande

quantidade de invaginações formando as cristas, que contêm a cadeia

transportadora de elétrons (CTE), aparatos da fosforilação e transportadores de

membrana, sendo porções da membrana interna que se aproximam da membrana

externa formando áreas de contato (Nicolay et al., 1990; Brdiczka e Wallimann,

1994). Essas áreas de contato participam da importação de proteínas, nucleotídeos

de adenina e ácidos graxos para a mitocôndria. Proteínas translocases,

translocadores de nucleotídeo de adenina (ANT), canais de ânion voltagem

dependente (VDAC), bem como enzimas de ativação e transporte de ácidos graxos,

são componentes dessas áreas de contato (Kerner e Hoppel, 2000).

Na CTE, os doadores de elétrons NADH e FADH2

Além do NADH e FADH

, são equivalentes redutores

formados na glicólise, oxidação de ácidos graxos e no ciclo do ácido cítrico. Essas

moléculas são ricas em energia, cada uma contendo um par de elétrons e possuindo

um grande potencial de transferência.

2

, três outros tipos de moléculas transportadoras de

elétrons funcionam na cadeia respiratória: uma quinona hidrofóbica (ubiquinona) e

dois tipos diferentes de proteínas que contêm ferro (citocromos e proteína ferro-

enxofre). Nas proteínas ferro-enxofre, o ferro está presente não no grupamento

heme, mas associados a átomos de enxofre inorgânico ou a átomos de enxofre de

resíduos de cisteína na proteína, ou a ambos.

Introdução |19

Figura 4: Identificação das estruturas mitocondriais. Retirada de

library.thinkquest.org/C004535/mitochondria.htlm.

Introdução |20

A transferência de elétrons de NADH ou FADH2 para oxigênio é acoplada ao

transporte ativo de prótons da matriz para o lado citosólico da membrana interna

formando um gradiente como descrito pela teoria quimiosmótica de Mitchell (Mitchell,

1976). Este gradiente, também conhecido como força próton motriz, é gerado pelos

três complexos respiratórios (I, III e IV) nos quais utilizam a energia livre liberada

durante o transporte de elétron para translocar prótons da matriz mitocondrial para o

espaço intermembrana. A força próton motriz tem dois componentes: o potencial de

membrana, no qual surge do movimento de cargas positivas através da membrana

interna (gradiente elétrico) e o gradiente de pH (gradiente químico). A membrana

interna da mitocôndria é impermeável aos prótons e eles voltam para matriz

somente através de canais específicos para prótons (Fo

O sistema de enzimas mitocondriais e moléculas carreadoras nas quais

transportam equivalentes redutores dos substratos ao oxigênio são coletivamente

conhecidos como sistema de transporte de elétron ou cadeia respiratória. A CTE é

composta de cinco complexos multienzimáticos nos quais suas características serão

brevemente exploradas: NADH: ubiquinona oxidoredutase, succinato- ubiquinona

oxidoredutase, ubiquinol: Citocromo c oxidoredutase, citocromo c oxidase e ATP

sintase.

). A força próton motriz que

direciona os prótons de volta para a matriz propicia a energia para a síntese de ATP

que é catalisada pela FoF1-ATPsintase (complexo V). Tanto a fosforilação oxidativa

como a teoria quimiosmótica estão representadas na figura 5.

Introdução |21

Fumarato

Figura 5: Esquema representando a cadeia transportadora de elétrons na membrana interna mitocondrial. A oxidação do piruvato gera NADH que é oxidado pelo complexo I. Este doa

elétrons para a coenzima Q que vai ser oxidada pelo complexo III. Assim, o complexo III reduz o

citocromo c. Citocromo c oxidase (complexo IV) transfere elétrons do citocromo c ao oxigênio

molecular. Succinato é oxidado pelo complexo II, reduzindo Q. Os elétrons do NADH e outros

substratos oxidáveis passam através de uma cadeia de carregadores arranjados na membrana

interna. O fluxo de elétrons é acompanhado por uma transferência de prótons através da membrana

produzindo um gradiente químico (∆pH) e um gradiente elétrico (ΔΨ), conhecido como força próton

motriz , sendo o intermediário para a síntese de ATP no modelo quimiosmótico estabelecido por

Mitchell, 1976. (adaptado do livro the mitochondrion, Lehninger,1965).

Matriz

Espaço Intermembrana

Citocromo c

Succinato

Complexo I Complexo II Complexo III Complexo IV Complexo V

Introdução |22

1.9.1- NADH: ubiquinona Oxidoredutase ou complexo I.

O complexo I é um dos pontos de entrada para os

elétrons na cadeia respiratória. Este se encontra localizado na

membrana interna mitocondrial e catalisa a transferência de

elétrons de NADH para o pool de ubiquinona. Os componentes

redox intrínsecos envolvem uma flavina mononucleotídeo ligada

não covalentemente (FMN), seis grupamentos ferro-enxofre (Fe-

S) detectáveis por ressonância paramagnética de elétrons (RPE)

e duas espécies de quinona distintas ligadas a proteína (Grigorieff, 1999).

NADH: ubiquinona oxidoretudase é o maior complexo e têm sido bem

estudado em células de mamíferos, plantas, fungos e bactéria. A composição das

subunidades de Escherichia coli, N.crassa e enzimas bovinas indica homologia entre

as subunidades apresentando uma massa molecular variando de 550KDa para a

enzima bacteriana a ~1000KDa na mitocôndria de coração bovina (Grigorieff, 1999).

Este complexo tem um centro comum de 14 subunidades onde são encontradas em

bactérias, enquanto em eucariotos apresentam subunidades adicionais com um total

de 45 em mitocôndrias de coração bovina (Vonck e Schäfer, 2009). Nesse

complexo, a etapa inicial é a transferência de elétrons do NADH para a flavina

mononucleotídeo (FMN) originando FMNH2

Em todos os organismos, o complexo I tem a forma de L e consiste de um

braço na membrana e outro braço periférico ou na matriz (Vonck e Schäfer, 2009).

Os elétrons são então transferidos do FMNH

(forma reduzida).

2 para uma série de centros ferro-

enxofre (Fe-S) que é o segundo grupo prostético da NADH desidrogenase e

exercem um papel crítico nas reações de redução em sistemas biológicos. O

complexo I tem diversos grupos tióis críticos e que são vulneráveis a modificações

oxidativas resultando em perda da atividade. A inibição do complexo I pode provocar

o escape de elétrons resultando na geração de estresse oxidativo, que leva a

inibição da enzima (Balijepalli et al., 1999).

Introdução |23

Os elétrons nos centros Fe-S são então encaminhados à coenzima Q

(ubiquinona) que depois de receber dois elétrons origina o ubiquinol (QH2

). A

transferência de elétrons está acoplada ao bombeamento de prótons da matriz para

o espaço intermembranar que contribui para a formação do gradiente de prótons

pelo complexo I e pelos complexos subsequentes na cadeia respiratória (citocromo

c: ubiquinona oxidoredutase ou complexo III e citocromo c oxidase ou complexo IV).

1.9.2- Succinato- ubiquinona oxidoredutase ou complexo II.

O complexo II (succinato-ubiquinona oxidoredutase (SQR);

EC 1.3.5.1) é uma enzima do ciclo do ácido cítrico integral da

membrana interna mitocondrial. Consiste de quatro subunidades

codificadas pelo DNA nuclear onde a maioria das estruturas e genes

foi conservada ao longo da evolução. Duas dessas subunidades

formam a succinato desidrogenase (SDH): a subunidade maior, uma

flavoproteína de 70 KDa (Fp; SDH A) contendo um sítio ativo

hipotético de FAD ligado covalentemente a parte da enzima e quatro

átomos de ferro não heme, e a proteína ferro-enxofre (Ip; SDH B,

30KDa), subunidade carregando 3 grupos ferro distintos. A SDH

está ancorada a membrana por duas subunidades adicionais, C e D (15 e 12.5 KDa

respectivamente) ligando um citocromo tipo- b, nas quais contém um único grupo

heme e os sítios de ligação para a ubiquinona. O complexo II faz parte tanto do ciclo

do ácido tricarboxílico quanto da cadeia respiratória mitocondrial catalisando a

transferência de seus elétrons a centros Fe-S e em seguida para a coenzima Q, a

fim de dar continuação a cadeia transportadora de elétrons. (Pierre e Agnes, 2002,

Pierre et al., 2002).

Introdução |24

Estudos prévios sugerem que o alvo de inibição da succinato desidrogenase

por 3-BrPA e N- etilmaleimida (NEM) seriam os grupamentos sulfidrilas em altas

concentrações (Sanborn et al., 1971 ). A participação de grupos sulfridilas na

oxidação de succinato em tecidos animais já foi demonstrada em trabalhos clássicos

(Hopkins et al., 1938). Desde então a sensibilidade da succinato desidrogenase aos

reagentes sulfidrilas foi registrada. Os grupos sulfidrilas estão envolvidos em uma

ligação estreita do inibidor oxalacetato a molécula da proteína e a uma espontânea

inativação da enzima. Estes grupos sulfidrilas estariam localizados na subunidade

contendo FAD+

da enzima. Foi demonstrado por Felberg, N. T. e Hollocher, T. C. em

1972 a incorporação de ['4C] NEM nesta mesma subunidade. Estes resultados

levam a conclusão que a inibição da enzima pelos reagentes alquilantes não é

devido a reação com o sítio ativo diretamente. Esses dados sugerem que os grupos

sulfidrilas estão envolvidos na primeira etapa da oxidação de succinato. Todavia,

muito pouco é conhecido sobre as propriedades químicas desses grupos na

molécula da enzima (Andrei et al., 1976).

1.9.3- Ubiquinol: Citocromo c oxidoredutase, complexo citocromo bc1

O complexo III é um complexo homodimérico,

apresentando 11 subunidades diferentes por monômero com

domínio substancial na matriz. O centro funcional é formado por

três subunidades: o citocromo b com seus dois hemes, a

proteína ferro-enxofre Riesk (na qual o átomo de Fe está

coordenado a dois resíduos de histidina em vez de dois

resíduos de cisteína) com seu centro 2Fe-2S e o citocromo c

ou complexo III.

1

com o seu heme. Esse complexo acopla a transferência de

elétrons do ubiquinol (QH2) para o citocromo c via carreadores

de elétrons (citocromo b562, b566, c1 e c) resultando no

transporte de prótons da matriz para o espaço intermembrana. O citocromo c é uma

proteína solúvel do espaço intermembranar. Após o seu único heme aceitar um

elétron do complexo III, o citocromo c se difunde ao complexo IV para doar o elétron

para um centro de cobre binuclear nesta enzima.

Introdução |25

1.9.4- Citocromo c oxidase ou complexo IV.

A citocromo c oxidase (COX) ou complexo IV

(ferrocitocromo c: oxigênio oxiredutase, EC 1.9.3.1) é a enzima

terminal da cadeia respiratória em eucariotos e alguns

procariotos. O complexo está presente na membrana agindo

como um dímero, tendo uma das suas partes voltada para o

espaço intermembrana, onde se apresenta mais inserida e a outra

voltada para a matriz. Apresenta um papel chave transportando

quatro elétrons de quatro moléculas de citocromo c para o

oxigênio molecular reduzindo-o a duas moléculas de H2

É uma proteína grande possuindo quatro subunidades em bactérias e em

mamíferos. Além das quatro subunidades contidas em bactérias, possui mais nove

totalizando treze subunidades (Vonck e Schäfer, 2008). Dentre as treze

subunidades, três são críticas para a função do transporte (Cox1p, Cox2p e Cox3p)

nas quais são codificadas pelo DNA mitocondrial e formam o centro ativo da enzima

representando a maior parte do complexo. As outras subunidades são codificadas

pelo genoma nuclear, traduzidas nos ribossomos citosólicos e transportadas para a

mitocôndria. Procariotos possuem três subunidades que apresentam homologia

significativa com as subunidades sintetizadas na mitocôndria (Khalimonchuk e

Rödel, 2005). Os centros catalíticos de todas as oxidases heme-cobre, incluindo a

COX, são altamente conservados a nível estrutural. Sobre os centros catalíticos

somente o centro Cu

O e

bombeando prótons (Khalimonchuk e Rödel, 2005). COXs são

membros de uma superfamília de heme e cobre contendo

oxidases terminais.

A será comentado por apresentar os grupamentos cisteínas

importantes na discussão do trabalho. O centro CuA está localizado no domínio

Cox1pA no lado externo da membrana mitocondrial interna e é o ponto de entrada

dos elétrons do citocromo c. A função do centro CuA é enviar elétrons para outros

centros redox localizados no Cox1pA (Khalimonchuk e Rödel, 2005).

Introdução |26

Contém dois íons cobre complexados aos grupos–SH de dois resíduos de

cisteína em um centro binuclear, além de conter dois resíduos de histidina, um de

metionina e um oxigênio carbonil. A subunidade a e a3 contém dois grupos heme e a

CuB outro íon. O heme a3 e o CuB formam um segundo centro binuclear que aceita

elétrons do heme a e então os transfere para o O2 ligado ao heme a3. Para cada

quatro elétrons que passam através desse complexo, a enzima consome quatro H+

da matriz convertendo O2 em H2

O. Ela também usa a energia dessa reação redox

para bombear um próton para o espaço intermembrana para cada elétron

transportado, aumentando o potencial eletroquímico.

1.9.5- ATP sintase ou complexo V.

A ATP sintase mitocondrial é uma ATPase do tipo F,

similar na estrutura e no mecanismo às ATP sintases de

cloroplastos e bactérias. Esse grande complexo enzimático da

membrana mitocondrial interna catalisa a formação de ATP

através de ADP e Pi acompanhado do retorno de prótons do

espaço intermembranas para a matriz. A ATP sintase apresenta

dois componentes distintos: F1, uma proteína periférica de

membrana, e Fo, uma proteína integral de membrana. A porção

é composta de 12 peptídeos estendidos através da membrana e

uma subunidade a. Está presente nas mitocôndrias,

cloroplastos, bactérias aeróbicas e fotossintéticas. A ATP

sintase translocadora de H+ é conhecida como FoF1

F

-ATPase (Nicholls e Fergunson,

2001).

1-ATPase é uma porção globular não membranar da enzima FoF1-

ATPsintase possuindo a mesma composição em todos organismos aeróbicos na

qual catalisa a síntese de ATP e H2O a partir de ADP e H2PO4 fazendo uso da força

próton motriz. Este também é capaz de bombear prótons através das membranas

usando a energia química de hidrólise de ATP.

Introdução |27

A “cabeça” da porção F1 é formada por três subunidades α e três subunidades

β entre as quais ficam três centros ativos. A “haste” entre Fo e F1 é formada por uma

subunidade γ e uma ε. Dois outros polipeptídeos, β e δ formam um “estabilizador”,

fixando as subunidades α e β em relação à porção Fo. A Fo contém uma via

condutora de prótons que opera junto a F1

O ciclo catalítico é dividido em três fases, as quais ocorrem em cada um dos

três centros ativos. Primeiramente, ADP e P

sintetizando de ATP e consumindo ΔΨm

ou hidrolizando ATP gerando ΔΨm dependendo das condições fisiológicas ou

experimentais.

i, se ligam formando uma ligação

anidrida e, em seguida o produto é separado. Cada vez que um próton flui através

do canal Fo

Já é bem estabelecido que os grupamentos sulfidrilas tenham um papel

importante na manutenção da integridade das membranas biológicas. E em

particular da membrana interna mitocondrial. Modificações dos grupamentos tióis da

membrana mitocondrial podem levar ao mau funcionamento de proteínas integrais

de membrana, como exemplo, os carreadores de fosfato e de nucleotídeos de

adenina que são consideravelmente diminuídos quando a mitocôndria é tratada com

agentes alquilantes (Lippe et al, 1988).

para a matriz, todos os três centros ativos passam de seus estados

momentâneos para o próximo. A energia do transporte de prótons primeiramente é

convertida em uma rotação da subunidade γ, que por outro lado, modifica

ciclicamente a conformação das subunidades α e β, em pos ição relativa com a

porção Fo, levando assim, à formação de ATP (Rohn S e Kroh LW, 2005).

Quanto a ATP sintase mitocondrial, o complexo enzimático na qual catalisa a

síntese e hidrólise de ATP, tem sido mostrado que grupos tióis pertecentes a Fo

estariam envolvidos no mecanismo de acoplamento entre Fo, a parte integrada a

membrana e F1,

a parte hidrofílica da enzima contendo os sítios catalíticos e estes

seriam modulados pela presença de ADP em proteínas de 25-27 kDa (subunidade b

ou Fo1) tornando-os livres através de mudanças conformacionais e susceptíveis a

reação com agentes redutores ou alquilantes interferindo na atividade da enzima

(Lippe et al, 1988, Dünschede et al., 2003).

Introdução |28

1.10- Estados respiratórios mitocondriais.

A produção de energia nas células envolve várias vias metabólicas ligadas

por intermediários comuns. A necessidade de ATP e a produção de precursores

para a construção de outras moléculas tornam essencial o controle destas vias.

Os fatores que controlam a respiração dependem de uma série de

características. A taxa de respiração é regulada pela concentração de ADP, Pi e o

produto ATP da fosforilação oxidativa acoplada ocorrendo na cadeia respiratória. O

requerimento de ADP para taxas máximas de respiração em mitocôndrias

fosforilando intactas foi primeiro estudado sistematicamente por Lardy e Wellman em

1952, que fizeram uma importante sugestão sobre a concentração de ADP que

poderia controlar a taxa de respiração dentro da célula.

A partir dos estudos feitos por Lardy e Wellman, Chance e Williams em 1956

sistematizaram as condições gerais que afetam a taxa respiratória de mitocôndrias

intactas. Estado 1 é a condição na qual ambos ADP e substrato respiratório estão

presentes. Estado 2 é a condição na qual somente o substrato respiratório está

ausente. O estado 3 refere-se a um aumento no conteúdo de ADP (aumento da

hidrólise de ATP devido o aumento da demanda energética) no qual aumenta a taxa

de fosforilação pelo complexo V, atenuando o gradiente de próton e estimulando o

transporte de elétron e o consumo de oxigênio. Estado 4 é quando uma baixa

concentração de ADP (baixa demanda energética) reduz a taxa de fosforilação

levando a um aumento do gradiente de próton através da membrana interna e

reduzindo a taxa de transporte de elétron. E finalmente o estado 5 é quando o

oxigênio está ausente (figura 6).

Introdução |29

Figura 6: Estados respiratórios. Estado 1, condição onde ambos ADP e substrato estão ausentes;

estado 2, somente o substrato respiratório está presente; estado 3, adição de ADP.ativa a fosforilação

oxidativa havendo consumo de oxigênio e fosforilação do ADP; estado 4, o ADP exógeno é

consumido e o consumo de oxigênio diminui e estado 5, onde a disponibilidade de oxigênio é zero.

Figura retirada de Chance e Williams, 1956.

2- OBJETIVOS ___________________________________

Objetivos |32

2- OBJETIVOS:

2.1- Objetivo Geral.

Apesar de diversos estudos terem investigado a ação do 3-BrPA em

hepatocarcinomas, todos eles identificaram efeitos somente sobre a glicólise, mais

especificamente na hexocinase pelo grupo do Dr. Peter Pedersen. Sua ação a nível

mitocondrial foi mostrada somente por Ko et al, 2001. Recentemente, nosso grupo

demonstrou que as doses de 3-BrPA que induzem a morte em tumores não são

capazes de causar qualquer inibição na atividade da HK mitocondrial (Pereira da

Silva et al., 2008) e que estas doses parecem ter efeito mais específico na atividade

da succinato desidrogenase. Apesar disso, estudos mais aprofundados eram

necessários para esclarecer a ação do 3-BrPA a nível mitocondrial analisando o seu

efeito na atividade das enzimas dos diferentes complexos da cadeia respiratória.

2.2- Objetivos Específicos.

Avaliar o efeito do 3-BrPA sobre a atividade catalítica dos Complexo I,

II, III, IV e Fo F1

Avaliar o efeito do 3-BrPA sobre os parâmetros bioenergéticos

mitocondriais em diferentes estados respiratórios (fosforilativo e não-fosforilativo)

usando diferentes substratos oxidáveis (substratos ligados a síntese de NADH e

substrato ligado a síntese de FADH

ATPase.

2

- Medidas de potencial de membrana (∆Ψ

.

m

- Consumo de oxigênio.

).

Estabelecer a cinética de inativação da respiração pelo 3-BrPA em

mitocôndrias isoladas de fígado e cérebro de camundongo.

Avaliar a relação causal entre a atividade de mitocôndrias exibindo

atividade hexocinase associadas ou não-associadas com a inibição da respiração

mitocondrial.

3- MATERIAIS E MÉTODOS _____________________________________________________________

Materiais e Métodos |34

3- MATERIAIS E MÉTODOS:

3.1- Animais.

Os animais utilizados nesta pesquisa foram mantidos e sacrificados segundo

as normas de biossegurança determinadas pelo comitê de ética da UFRJ. Foram

utilizados camundongos suíços disponibilizados pelos biotérios localizados no

Instituto de Bioquímica Médica e Instituto de Microbiologia da Universidade Federal

do Rio de Janeiro. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas forradas com

maravalha autoclavada em ambiente à 23ºC e ciclo de luz (12h/12h), recebendo

suplemento vitamínico semanal, ração apropriada e água filtrada.

3.2- Isolamento da mitocôndria.

Mitocôndrias de fígado e cérebro de camundongo suíço de aproximadamente

2 meses de idade foram isoladas por centrifugação diferencial como descrito por

Rosenthal et. al., 1987. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento

cervical, o fígado foi rapidamente removido e colocado em 10 ml de tampão de

isolamento 1:10(v/v) gelado contendo: 225 mM manitol; 75 mM sacarose; 10 mM K-

Hepes; 1 mM EGTA; 0,1% BSA (livre de ácido graxo); pH 7,4). O tecido foi cortado

em pedaços pequenos e lavado pelo menos três vezes com o tampão de

isolamento. Um Potter-Elvehjem (Wheaton Sci, USA) de vidro de 30 ml foi utilizado

para a homogeneização manual em 11 ciclos do tecido. O homogenado foi então

centrifugado por 5 min a 600 g à 4ºC (Hitachi Himac SCR 20B,Tokyo, Japão)

utilizando o rotor RPR20-2. Depois da centrifugação o sobrenadante foi

recentrifugado por 10 min a 12000g à 4ºC. O precipitado foi ressuspendido em 10 ml

de tampão de isolamento e novamente centrifugado por 10 min à 12000g à 4ºC. O

sobrenadante foi descartado e o precipitado final ressuspendido em 300 µl de

tampão de isolamento. Para o isolamento de mitocôndrias de cérebro foram

utilizados os mesmos tampões e o mesmo procedimento tendo como diferencial

somente a primeira centrifugação, 3 min a 2000g à 4ºC.


3.3- Preparo da solução de 3-BrPA.

A solução de 3-BrPA (Sigma) foi preparada para uma concentração final de

25 mM em tampão Tris-HCl , pH 7.4. As soluções foram feitas minutos antes do

início de cada experimento.

3.4- Hidrólise de ATP.

Atividade da F1Fo-ATPase mitocondrial foi medida em 3 tempos 0, 30 e 60

minutos de incubação em um meio de reação contendo 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 2

mM ATP e 10 mM MgCl2 a 37ºC na presença ou ausência de 1 mM 3-BrPA. A

reação foi iniciada pela adição da proteína (0,2 mg/ml concentração final). Como

controle foi feito o mesmo procedimento na presença de NaN3 que é um inibidor da

FoF1-ATPase mitocondrial e na ausência da droga. A medida da inibição da

hidrólise pelo 3-BrPA foi feita através da quantificação do fosfato inorgânico liberado

(Pi) pelo método de Fiske & Subbarow em 1925 através da atividade NaN3

sensível.

A reação de quantificação de Pi foi determinada no espectrofotômetro a 660nm.

3.5- Consumo de oxigênio em mitocôndrias isoladas.

O consumo de oxigênio foi monitorado através de respirometria de alta

resolução (OROBOROS® Oxygraph-2K, Instruments, Innsbruck, Austria) utilizando

mitocôndrias (0,2 mg/ml) de fígado e de cérebro de camundongo. Os ensaios foram

feitos em uma câmara contendo 2 ml de tampão de respiração (10 mM Tris-HCl pH

7.4; 320 mM manitol; 8 mM Pi-Tris; 4 mM MgCl2

; 0.08 mM EDTA e 1 mg/mL BSA

FFA; pH7,4 à 37ºC).


3.6- Medidas do potencial de membrana mitocondrial (∆ψm

O potencial de membrana mitocondrial foi avaliado em função de sinais

fluorescentes de um corante catiônico, safranina O. Este tem sua fluorescência

suprimida dentro de uma mitocôndria energizada, ou seja, que esteja mais positiva

no espaço intermembranas e menos na matriz (Akerman e Jarvisalo, 1980).

).

Foram incubadas 0.2 mg/ml de proteína mitocondrial no meio de respiração

padrão (vide seção 3.5) suplementado com 6,7 µM de safranina O. Utilizando-se

substratos, a medida da formação do potencial de membrana foi feita para os quatro

complexos: I, II, III e IV da cadeia transportadora de elétrons. Inicialmente utilizamos

em um fluorímetro Hitachi modelo F-3010 (Tokyo, Japan). Estudos posteriores foram

feitos somente para os complexos I e II em um fluorímetro (multi-mode microplate

reader spectrofluoremeter Spectra Max®

M5 (Molecular Devices) em uma placa de

96 poços. A fluorescência foi detectada no comprimento de onda de 495 nm de

excitação e 586 nm de emissão.O ensaio foi conduzido à 37ºC imediatamente após

o isolamento mitocondrial. As adições de substratos e reagentes são devidamente

indicadas na legenda da figura 13. Os ensaios foram feitos em diferentes

concentrações de 3-BrPA (0 – 1000µM).

3.7- Determinação da atividade da NADH: ubiquinona oxidoredutase.

A atividade da NADH: ubiquiquinona oxidoredutase foi determinada usando o

aceptor de elétrons ubiquinona-1 (CoQ1

NADH + H+ + ubiquinone-1 (CoQ1) → NAD+ + dihydroubiquinone-1 (CoQH2)

). A reação catalizada pelo complexo I segue

abaixo:

O tampão fosfato foi utilizado para o ensaio juntamente com 15 mM NADH, 1

mM KCN e 2 mM NaN3. Para a medida da atividade, a suspensão mitocondrial

estocada a -80ºC foi sonicada em dois ciclos de 20s no gelo (Bandelin Sonopuls HD

200 ultrasonicator (MS 73 probe tip; Berlin, Germany)).


A concentração final da proteína no ensaio foi de 0,1 mg/ml. A reação foi

iniciada com 0.1 mM coenzima Q1 após pré-incubações por 1 min com diferentes

concentrações de 3-BrPA (75, 150 e 500 µM) em um volume final de 1 ml. O tempo

de leitura foi de 3 min sendo a absorbância registrada a cada 15 segundos. Após

90s de reação, foi adicionado 5 µM rotenona para determinar a atividade insensível

a rotenona. A atividade real foi feita pela diferença da fração sensível pela

insensível. A leitura foi feita no espectrofotômetro a 340 nm e a diminuição linear da

absorbância devido à redução da coenzima Q1

foi então monitorada.

3.8- Ensaio da atividade da succinato desidrogenase.

A atividade da succinato desidrogenase foi determinada à temperatura

ambiente pelo ensaio DCIP-fenazina metilsulfato utilizando o tampão de respiração

contendo 10 mM Tris-HCl pH 7.4; 320 mM manitol; 8 mM Pi-Tris pH 7.4; 4 mM

MgCl2; 0.08 mM EDTA e 1 mg/mL BSA FFA; 4 mM NaNO3

, 10 mM DCIP; 0,2 mM

PMS e diferentes concentrações de 3-BrPA (0-1000 µM) em um volume final de 1ml.

A concentração final da proteína no ensaio foi de 0,1 mg/ml. Todas as amostras de

proteína foram tratadas com triton X-100 (0,1% concentração final). A reação foi

iniciada pela adição de diversas concentrações succinato após 1 min de pré-

incubação com as diferentes concentrações de 3-BrPA. O tempo de leitura foi de 3

min sendo a absorbância registrada a cada 15 segundos. A leitura foi feita no

espectrofotômetro a 600 nm e a diminuição linear da absorbância devido a oxidação

do DCIP foi então registrada. DCIP e PMS são aceptores de elétrons. Esses dois

compostos quando misturados desenvolvem uma coloração esverdeada que é

proporcional ao estado de oxidação do DCIP. Foram feitos brancos na ausência de

succinato.


3.9- Quantificação de proteínas.

A quantificação de proteínas utilizadas nos experimentos foi realizada pelo

método de Lowry et al. (1951).

3.10- Análise Estatística.

A análise estatística e a construção dos gráficos foram realizadas pelo

programa Origin® 8.0 (Originlab Corporation,USA).

4- RESULTADOS _______________________________________

Resultados |40

4- RESULTADOS:

4.1- Efeito do 3-BrPA nas atividades dos complexos I e IV da cadeia transportadora de elétrons.

Os experimentos foram feitos em concentrações que variam de 0-1000 µM, já

que trabalhos anteriores sempre utilizaram concentrações acima de 1 mM. A

atividade da NADH: ubiquinona oxidoredutase ou complexo I foi medida em 3

concentrações diferentes da droga 0, 75, 150 e 500 µM com a fração mitocondrial de

fígado sonicada e pré-incubada por 1 e 30 min tendo a leitura da absorbância

medida a cada 15 s por 3 min. Não foi observado inibição da atividade em qualquer

concentração em 1 min. de incubação da partícula mitocondrial, embora apresente

um efeito inibitório principalmente quando usado 500 µM da droga mostrando ser

dependente de tempo quando medida em 30 min. de pré- incubação da partícula

mitocondrial com 3-BrPA. (figura 7). Todavia, quando medimos a atividade do

complexo IV através da taxa de consumo de oxigênio utilizando TMPD/ ascorbato

como substratos respiratórios na ausência ou presença de 100 µM 3-BrPA, não

observamos inibição na taxa do consumo de oxigênio neste complexo tanto no

estado 2 como no estado 3 (figura 8).

Resultados |41

0,00

0,01

0,02

500150

Ativ

idad

e es

pecí

fica

(nm

ol/m

in X

mg

ptn)

3-BrPA (µM)

Controle 75

0 30 60 90 120 150 180

0,930

0,945

0,960

0,975

0,990

1,005

Pré- incubada 30 minutos

B

Abso

rbân

cia

(nm)

Tempo (seg)

Controle 75 µM 3-BrPA 150 µM 3-BrPA 500 µM 3-BrPA

A

Pré- incubada 1 minuto

0 30 60 90 120 150 180

0,930

0,945

0,960

0,975

0,990

1,005

Rotenona 5µM

Rotenona 5µM

0,000

0,006

0,012

0,018

0,024

0,030

Espe

cifc

Act

ivity

(nm

ol/m

in X

mg

ptn )

50015

075

contr

ole

3-BrPA (µM)

Figura 7: Atividade da NADH:Ubiquinona Oxidoredutase em presença de 3BrPA. Preparação de

mitocondria de fígado (0.1 mg/ml). (A) Pré-incubada por 1 minuto e em (B) pré-incubada por 30

minutos em três concentrações diferentes de 3-BrPA usando 0.3 mM NADH, 0.1 mM coenzima Q1,

1 mM KCN e 2 mM NaN3

. Os valores representam a média ± EP de cinco experimentos

independentes.

Resultados |42

0

300

600

900

1200

1500

1800

Cons

umo

de O

2

(pm

ol O

2/ s

ec. m

g pt

n)

Basal TMPD/ Asc ADP 3-BrPA

Figura 8: 3-BrPA não afeta o consumo de oxigênio quando utilizados substratos do complexo IV. Mitocôndria de fígado de camundongo (0.2 mg/ml) foi usada na medida da taxa de consumo de

oxigênio quando 100 µM de 3-BrPA foi utilizado na presença de substratos do complexo IV ( 100 µM

TMPD/ 250 µM Ascorbato) e 1 mM de ADP. Os valores representam a média ± EP de três

experimentos independentes.

Resultados |43

4.2- 3-BrPA não afeta a atividade da FoF1

Em trabalhos prévios (Ko et al., 2001; Geschwind et al., 2002) demonstraram

uma grande baixa nos níveis de ATP em células tratadas com 150 µM de 3-BrPA.

Com o objetivo de avaliar se os efeitos da droga sob a quantidade de ATP celular

poderiam ser devido à inibição da síntese de ATP mitocondrial, resolvemos medir a

atividade da hidrólise de ATP de mitocôndria de fígado de camundongo. Avaliamos

o efeito de 1 mM 3-BrPA na hidrólise de ATP catalisada pelo complexo da FoF1-

ATPase sem pré- incubar ou pré-incubadando por 30 e 60 minutos na presença e

ausência de azida (inibidor do complexo V). O resultado obtido mostra uma pequena

inibição da atividade da FoF1-ATPase de aproximadamente 25%, sugerindo que o

3-BrPA não tem ação nesse sítio na concentração utilizada (figura 9).

- ATPsintase.

Resultados |44

0 30 600,00

0,05

0,10

0,15

µm

ol P

i/ m

g. 1

0min

. Controle 1 mM 3-BrPA

Tempo de pré-incubaçao (minutos)

Figura 9: Efeito do 3-BrPA na hidrólise de ATP pela FoF1-ATPase. Mitocôndria de fígado de

camundongo foi isolada por centrifugação diferencial. A atividade ATPase mitocondrial (FoF1-

ATPase) foi medida em um meio de reação descrito na seção 3.4 “metodologia” na presença ou

ausência de 5 mM NaN3 e 1 mM 3-BrPA a 37o

C. A reação foi iniciada adicionando proteína

mitocondrial (0,1 mg/ml) e a atividade medida em três tempos (0, 30 e 60 minutos) de pré- incubação.

A quantificação de Pi liberado foi determinada pelo método colorimétrico Fiske & Subbarow, 1925. Os

dados são referentes a média ± EP de quatro experimentos independentes.

Resultados |45

4.3- 3-BrPA inibe a atividade da SDH.

Estudos anteriores mostraram o efeito de 5 mM 3-BrPA na inibição da

succinato desidrogenase (Sanborn et al., 1971) porém essa concentração é

considerada elevada. A partir desses resultados prévios resolvemos testar o efeito

do 3-BrPA diretamente na atividade da enzima succinato desidrogenase (SDH)

através do ensaio fenazina metilsulfato (PMS) utilizando concentrações menores de

3-BrPA (ver materiais e métodos). Esse experimento foi realizado utilizando

diferentes concentrações de 3-BrPA na presença ou ausência de ADP. O resultado

obtido na figura 10 mostra que, SDH é fortemente inibida por 3-BrPA. O ADP não

influenciou na modulação da atividade de SDH pelo 3-BrPA, apesar de trabalhos

anteriores mostrarem que a succinato desidrogenase é regulada por nucleotídeos

(Affourtit et al., 2001).

Resultados |46

0 200 400 600 800 10000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ativ

idad

e SD

H, t

axa

rela

tiva

(Vi/

Vo)

3 BrPA, uM

Sem ADP 1 mM ADP

Figura 10: Efeito do 3BrPA na atividade da succinato desidrogenase na presença e na ausência de ADP. A preparação de mitocôndria de fígado de camundongo (0.1 mg/ml) foi usada

para determinação da atividade da succinato desidrogenase (SDH) usando 0.05 mM DCIP, 0.2 mM

PMS, 0.1% (v/v) Triton X-100, 4 mM NaN3

e concentrações diferentes de 3-BrPA como indicado na

figura. Círculos abertos, representam o ensaio na presença de 1mM de ADP e círculos fechados sem

adição de ADP. A preparação foi pré-incubada por 1 minuto com 3-BrPA. Os valores são médias ±

EP de cinco experimentos independentes.

Resultados |47

Os resultados apresentados até o momento mostraram o efeito do 3-BrPA

diretamente sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória. Todavia, uma

avaliação mais realística dos efeitos desta droga requer medidas dos complexos

através da avaliação de parâmetros da fisiologia mitocondrial.

4.4 - Inibição da formação do potencial de membrana (ΔΨm) e consumo de oxigênio pelo 3-BrPA confirmam os efeitos na CTE.

Na tentativa de descobrir o mecanismo de ação do composto 3-BrPA na

fosforilação oxidativa, primeiramente testamos o quanto este agia nos complexos

respiratórios. Assim, investigamos seu efeito na formação do potencial de membrana

utilizando a sonda safranina O (ver materiais e métodos) para analisar cada

complexo separadamente com os seus respectivos substratos oxidáveis e inibidores

(legenda figura 11). Esse experimento foi realizado utilizando-se diferentes

concentrações de 3-BrPA variando de 0 a 1000 µM. Nosso objetivo também foi

achar uma concentração mínima de ação da droga já que em estudos prévios

(Sanborn et al., 1971), foi observado um efeito do 3-BrPA no complexo II porém em

uma dose maior (1 mM) que a provável em condições terapêuticas. A figura 11

mostra o efeito do 3-BrPA sobre os diferentes substratos respiratórios em

mitocôndria de fígado. Nela, é apresentada a atividade dos complexos I, II e IV

através da formação do ΔΨm (figura 11A).

Os ensaios foram feitos pré-incubando a fração mitocondrial (0,2 mg/ml) por 1

minuto com a droga antes da adição dos substratos. Na figura 11B observa-se

claramente o efeito de 250 µM 3-BrPA nos complexos, sendo o complexo II

majoritariamente afetado em relação ao complexo I e IV. O resultado mostrado na

figura 11B fica mais evidente na figura 11C, onde são mostrados os valores

máximos da inibição da formação do potencial de membrana para os complexos I, II

e IV em uma maneira dose dependente de 3-BrPA. Todavia, mostrando de uma

forma mais clara a inibição preferencial do complexo II que apresentou o IC50 de

170 µM, enquanto nessa concentração inibiu apenas 20% dos complexos I e IV.

Resultados |48

Para mostrar que o efeito da inibição do ΔΨm era realmente causado pelo 3-

BrPA, um ânion que poderia afetar a polaridade da membrana, foi feita uma medida

da formação do potencial de membrana utilizando o substrato do complexo II para

avaliar o efeito do 3-BrPA comparado com piruvato, seu análogo. Diante da

mitocôndria pré-energizada com 10 mM de succinato, foi feita uma titulação tanto

com 3-BrPA quanto com seu análogo piruvato (figura 11D). Os resultados obtidos

revelam que o efeito da inibição do ΔΨm pelo bombeamento de H+

provocado pelo

3-BrPA poderia ser pela inibição da atividade da SDH (figura 11C e 11D).

Resultados |49

FCCPSucc

Rot

2 min.

TMPD/Asc

Ant A

250 µM 3-BrPA

Mito+ Piruvato/Mal

Controle BA

FCCP

TMPD/Asc

Ant A

Succ

Rot

Mito+ Piruvato/Mal

10 AUF

Pir, µM4 min250

100150

50

250 200 150

100

3BrPir, µM

50

Succ

SuccSucc

Piruvato + Succ

Succ

40 AUF

D

200

3-BrPA + Succ

0 200 400 600 800 10000

20

40

60

80

100

% do

valor

máx

imo d

e ∆Ψ m

3- Bromopiruvato , µM

Piruvato/ Malato Succinato TMPD

C

Figura 11: 3-BrPA diminui a formação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) pela cadeia transportadora de elétrons(ETC). ΔΨm foi determinado pelo método de supressão de

fluorescência da safranina O usando o mesmo tampão usado na medida do consumo de oxigênio e

6,7μM safranina O. Perfil representativo da formação do ΔΨm pelos complexos I, II e IV (A). Painel

(B) gráfico representativo da inibição da formação do ΔΨm por 250µM 3-BrPA. No painel (C) Inibição

da formação do ΔΨm em uma maneira dose dependente depois de pré- incubar a mitocôndria com 3-

BrPA por 1 minuto e iniciar a reação usando os substratos oxidáveis para os diferentes complexos da

CTE. Para o complexo I (5 mM piruvato/malato), complexo II (10 mM succinato + rotenona 5 µM) e

complexo IV (0.3 mM TMPD/ 0.2 mM ascorbato + 5 µM rotenona + 1 µg/ml antimicina A). Estes

experimentos foram feitos com mitocôndrias isoladas de fígado (0.2 mg/ml). Os resultados

representam o efeito do 3-BrPA na mudança máxima no ΔΨm (B). No painel (D) dose resposta para

concentrações crescentes de 3-BrPA em uma mitocôndria pré-energizada com 10 mM succinato.

Como controle, foi adicionado a mesma quantidade de piruvato no lugar de 3 Br-PA. Os valores são

médias de quatro experimentos independentes.

Resultados |50

4.5- 3-BrPA reage diferentemente com os complexos da CTE e depende dos estados respiratórios.

Os efeitos observados do 3-BrPA sobre a formação do ΔΨm sugerem uma

ação inibitória sobre a atividade do complexo II. Entretanto, estas medidas envolvem

o estado de permeabilidade da membrana interna mitocondrial. Com o objetivo de

esclarecer se os efeitos do 3-BrPA afetam a atividade da SDH ou a permeabiblidade

de membrana, foram feitas medidas de consumo de oxigênio utilizando os

substratos para o complexo I e II . O consumo de O2

Estudos prévios (Sanborn et al., 1971; Maldonado et al., 1972), descreveram

o efeito desta droga na piruvato desidrogenase. Com base nessas informações,

avaliamos se o efeito do 3-BrPA que estávamos observando era em desidrogenases

ou era especificamente na piruvato desidrogenase. Para isso adicionamos

substratos para o complexo I com e sem piruvato (figuras 12C, 12D, 12E e 12F).

Verificamos que quando piruvato é adicionado junto aos outros subtratos o efeito

inibitório é maior do que na sua ausência (figuras 12E e 12F). Assim, o 3-BrPA age

na piruvato desidrogenase e favorece a inibição da respiração. Porém, também tem

efeito menor em outras enzimas como a NADH: ubiquinona oxidoredutase, malato

desidrogenase e glutamato desidrogenase em concentrações maiores. (figuras 12C

e 12D).

induzido por succinato

mostrou-se mais sensível a inibição pelo 3-BrPA (figuras 12A e 12B), onde em

concentrações baixas de 3-BrPA apresentam maior efeito comparadas com os

resultados utilizando substratos do complexo I, onde são necessárias concentrações

maiores para a inibição.

Resultados |51

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

estado 2 - succinato

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2B

estado 3 - succinato 1min 10min 20min

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2 C

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2D

estado 3 - PMG

0 10 100 10000,0

0,3

0,6

0,9

1,2 E

estado 2 - MG

estado 2 - PMG

3BrPA (µM)

A

0 10 100 10000,0

0,3

0,6

0,9

1,2F

estado 3 - MG

Vi/V

o, c

onsu

mo

de o

xigê

nio

rela

tivo

Figura 12: Inibição do consumo de oxigênio é dependente do estado respiratório mitocondrial.

Mitocôndria de fígado de camundongo (0.2 mg/ml) foi usada na medida da taxa de consumo de

oxigênio. No painel (A) Efeito de diferentes concentrações do 3-BrPA na taxa respiratória na

presença de succinato sem ADP. No painel (B) Succinato com 1 mM ADP.Em (C), piruvato, malato e

glutamato sem ADP e (D) piruvato,malato e glutamato com 1 mM ADP. Nos painéis (E) e (F)

glutamato e malato sem e com 1 mM ADP respectivamente. Os valores representam quatro


Resultados |52

Como mostrado na figura 12, no estado 3, as baixas concentrações de 3-

BrPA já são suficientes para prover a inibição. Isto sugere que o estado redox da

CTE poderia estar influenciando nessa potencialização através do potencial de

membrana (figura 13). Utilizando-se succinato como substrato do complexo II,

observamos que o 3-BrPA foi capaz de promover a despolarização (diminuição do

ΔΨm). Este efeito foi maior quando as mitocôndrias estavam no estado 3 (figura

13A) do que quando estavam no estado 4.

Porém, ao utilizarmos substratos para o complexo I, além de observarmos

uma inibição significativamente menor quando comparado ao complexo II, não

houve grande diferença frente aos diferentes estados respiratórios (estado 3 e

estado 4). Todavia, ao ser adicionado o succinato juntamente com os substratos do

complexo I observamos um aumento substancial na inibição da formação do ΔΨm

pelo 3-BrPA, sugerindo um efeito sinérgico ou potencializador (figura 14A e 14B).

Resultados |53

FCCP Oligomicina succinato 25uM 3-BrPA 50uM 3-BrPA 100uM 3-BrPA 1mM 3-BrPA

0 200 400 600 800 1000 12000

200

400

600

800B Succinato (estado 4)

Tempo (seg)

Succinato (estado 3)

Unid

ade

de F

luor

escê

ncia

da

Safra

nina

O

A

0 200 400 600 800 1000 12000

200

400

600

800

Figura 13: Efeito do 3-BrPA no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) usando succinato (substrato do complexo II) nos estados respiratórios 3 e 4. O ΔΨm foi determinado pelo método

de fluorescência safranina O usando o mesmo tampão padrão usado para medidas de consumo de

oxigênio e 6,7 μM safranina O. Os painéis (A) e (B) são gráficos representativos mostrando o efeito

de diferentes concentrações de 3-BrPA na despolarização do potencial de membrana mitocondrial na

presença de succinato e ADP. No painel (A) presença de succinato com ADP (estado 3). No painel

(B) presença de succinato sem ADP (estado 4). Os valores são representativos de quatro


Resultados |54

FCCP Oligomicina Substratos oxidáveis 25uM 3-BrPA 50uM 3-BrPA 100uM 3-BrPA 1mM 3-BrPA

0 200 400 600 800 100012000

200

400

600

800

1000

1200

A PMGS (estado 3)PMG (estado 3)

Unid

ade

de F

luor

escê

ncia

da S

afra

nina

O

Tempo (seg)

B

0 200 400 600 800 1000 12000

200

400

600

800

1000

1200

Figura 14: Diferenças na despolarização da formação potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) usando substratos do complexo I e II da cadeia transportadora de elétron (ETC) na presença de 3-BrPA no estado 3 . O ΔΨm foi determinado pelo método de fluorescência safranina

O usando o mesmo tampão padrão usado para medidas de consumo de oxigênio e 6,7 μM safranina

O. Os painéis (A) e (B) são gráficos representativos mostrando o efeito de diferentes concentrações

de 3-BrPA na despolarização da formação do potencial de membrana mitocondrial na presença de

piruvato, malato, glutamato e succinato. No painel (A) presença de piruvato, malato e glutamato

(PMG) e 1 mM ADP. No painel (B) presença dos substratos do complexo I e II (PMGS) e 1 mM ADP.

Os valores são representativos de quatro experimentos independentes.

Resultados |55

4.6- Efeito protetor da glutationa reduzida (GSH) a inibição pelo 3BrPA.

Estudos prévios mostraram que o principal local da ação de agentes

alquilantes como 3-BrPA no complexo II, são em grupamentos tióis localizados no

sítio ativo da succinato desidrogenase, sugerindo que os resíduos sulfidrilas são

essenciais para a atividade desta enzima ( Sanborn et al., 1971; Maldonado et al.,

1972). A partir desses estudos testamos se o efeito observado do 3-BrPA poderia

ser revertido ou bloqueado pela adição de um agente redutor de grupamentos tióis

na succinato desidrogenase e na NADH: oxidoredutase. Para tal finalidade nós

usamos 2 mM GSH (agente redutor usado para estabilizar enzimas e proteínas que

possuem grupos sulfidrilas).

A figura 15A mostra o efeito do GSH na manutenção do potencial de

membrana em uma mitocôndria pré-energizada com 10 mM de succinato ou 5 mM

piruvato/malato na presença de diferentes concentrações de 3-BrPA e 1 mM de

ADP. Como controle foi utilizado o ionóforo de prótons FCCP. A figura 15B é um

gráfico representativo mostrando a proteção desse agente redutor. Estes resultados

sugerem que os grupos–SH presentes no sítio catalítico da succinato desidrogenase

e na estrutura da NADH: oxidoredutase seriam realmente os alvos potenciais da

alquilação promovida pelo 3-BrPA.

Resultados |56

0,0

0,1

0,2

0,3

3,57,0

10,5

3-BrPA, µM +GSH

100050

025

020

015010

07550

Taxa

de

desp

olar

izaçã

o do

∆Ψ

m(R

FU/s

ec x

0. 2

mg

ptn)

Succinato estado 3 Pir/Mal/Glut estado 3

FCCP

1000

sem

GSH

25

A

0 200 400 600 800 1000 12000

200

400

600

800

1000

FCCP Oligomicina 25mM 3-BrPA 50mM 3-BrPA 75mM 3-BrPA 100mM 3-BrPA 250µM 3-BrPA 500µM 3-BrPA 1mM 3-BrPA

Unid

ade

de F

luor

escê

ncia

d

a sa

frani

na O

Tempo (seg)

Figura 15: Glutationa reduzida (GSH) protege a dissipação do potencial de membrana (ΔΨm) promovida pelo 3BrPA. No painel (A) o ΔΨm foi determinado pelo método de fluorescência

safranina O usando o mesmo tampão para medir o consumo de oxigênio e 6,7 μM safranina O. GSH

2 mM foi adicionado previamente no meio de reação contendo a fração mitocondrial (0.2 mg/ ml) na

presença de 1 mM de ADP (estado 3) e diferentes concentrações de 3-BrPA utilizando os substratos

oxidáveis do complexo I (5 mM piruvato/malato e 2 mM glutamato) e complexo II (10 mM succinato +

rotenona 5 µM). 1 µM de FCCP e 1 µg/ml de oligomicina foram adicionados como controle. O painel

(B) é um gráfico representativo do efeito de GSH sobre a respiração usando succinato como

substrato. Os valores são representativos de três experimentos independentes.

Resultados |57

4.7- O efeito inibitório do 3-BrPA é modulado pelos estados respiratórios da mitocôndria.

Trabalhos prévios do nosso grupo demonstraram que a ciclagem de ADP

promovida pelo sistema ANT, FoF1ATPsintase, HK pode representar um importante

mecanismo de defesa antioxidante (da-Silva, 2004), inibição da apoptose e é

característico de várias linhagens tumorais. Nós decidimos investigar se a maior

sensibilidade da SDH ao 3-BrPA apresentada em estado 3 (1mM ADP) estaria

sendo mantida pela atividade do sistema ANT, FoF1ATPsintase, HK. Neste sentido,

facilitando a reação com 3-BrPA, já que em células de hepatocarcinomas há um

aumento da expressão de HKII associada a membrana externa da mitocôndria e

trabalhos anteriores descrevem um efeito majoritário nestes tipos celulares quando

comparados a hepatócitos na qual não apresentam HK associada a membrana

externa mitocondrial.

Neste ensaio, utilizamos além de mitocôndrias de hepatócitos, mitocôndrias

de cérebro de camundongo, uma vez que este tecido apresenta HK associada à

mitocôndria assim como as células tumorais. Nas figuras 16A e 16B estimulamos as

mitocôndrias de fígado e cérebro, respectivamente, com 10 mM de succinato e 200

µM de ADP. Após ter sido obtido o controle respiratório (estado 4), adicionamos 100

µM 3-BrPA e observamos a cinética de inibição do consumo de oxigênio total

provocada pela droga em ambas as preparações mitocondriais. Nas figuras 16C e

16D as mitocôndrias de fígado e cérebro respectivamente foram estimuladas de

forma semelhante como descrito acima.

Foi adicionado em ambas as preparações, 20 mM 2-DOG, que é um substrato

da HK análogo da glicose onde o produto dessa reação, 2-DOG-6P, não inibe a

enzima mantendo-a sempre ativa. Isso não acontece quando glicose é utilizada,

uma vez que há acúmulo de glicose-6-fosfato que inibe a reação da HK. Na figura

16C, a resposta da inibição quando 100 µM 3-BrPA foi adicionado foi semelhante a

figura 16A, pois mitocôndrias de hepatócitos não apresentam HK ligada a sua

membrana externa. Por outro lado, na figura 16D, quando 20 mM 2-DOG foi

adicionado ativando a HK e em seguida foi incluído 100 µM 3-BrPA, a resposta de

inibição do consumo de oxigênio foi imediata comparada a figura 16B onde a enzima

está inativa.

Resultados |58

10 20 30 400

1000

2000

3000

4000

5000

6000Mitocôndria de fígado

3BrPA 100µMADP 200µM

Flux

o de

02

por m

assa

[p

mol

/(s x

mg)

]

Tempo (min)

A

10 20 30 400

1000

2000

3000

4000

3BrPA 100µM2DOG 20mMADP

200µM

Tempo (min)

Flux

o de

02

por m

assa

[p

mol

/(s x

mg)

]

C

0 10 20 30 40 50 600

200

400

600

800

3BrPA 100µM

2DOG 20mM

ADP 200µM

Flux

o de

02

por m

assa

[p

mol

/(s x

mg)

]

Tempo (min)

D

0 10 20 30 40 50 600

200

400

600

800

3BrPA 100µMADP 200µM

Flux

o de

02

por m

assa

[p

mol

/(s x

mg)

]

Tempo (min)

Mitocôndria de cérebroB

Figura 16: Ciclagem ADP/ATP promovida pelo complexo ANT.F0F1ATPsintase.HK aumenta a sensibilidade da succinato desidrogenase ao 3-BrPA . Mitocôndrias de fígado e cérebro de

camundongo (0.2 mg/ml) foram usadas para medir a taxa de consumo de oxigênio. No painel (A)

mitocôndria de fígado foi estimulada pelo substrato do complexo II (10mM succinato) e 200µM ADP.

Ensaio semelhante foi feito no painel (B), onde mitocôndria de cérebro foi usada por apresentar

hexokinase ligada a membrana externa mitocondrial semelhante às células tumorais. Nos painéis (C) e (D) foi adicionado 20mM de 2-DOG (ativador da HK). Os gráficos representam cinco experimentos

independentes.

Resultados |59

Para confirmar que a maior sensibilidade observada no estado 3 seria

regulada pelo potencial de membrana como sugerido por resultados anteriores ou

pela presença do nucleotídeo, nós dissipamos parcialmente a formação do potencial

de membrana utilizando o ionóforo de prótons FCCP. O nível de dissipação por

FCCP foi ajustado de modo a ser o mesmo nível do induzido por 200 µM de ADP,

mimetizando a respiração em estado 3 porém, desacoplada (figura 17A). Na figura

17B, após a dissipação da formação do potencial de membrana, 50 µM de 3-BrPA

foi adicionado e uma leve inibição dependente de tempo foi observada.

Estes resultados são semelhantes aos resultados observados no estado 4. A

figura 17C sugere a partir dos resultados da figura 17A e 17B que a ciclagem de

ADP é fundamental para uma maior sensibilidade ao 3-BrPA e não o nível do ΔΨm e

nem a presença de nucleotídeos (ADP ou ATP). A ciclagem de ADP então

promoveria essa maior reatividade do 3-BrPA a SDH e demais complexos. Também

é sugerido nesta figura, que a HK ligada a mitocôndria de tumores coloca estas

mitocôndrias em um estado respiratório semelhante ao estado 3 permanente. Essa

característica, pelos resultados obtidos nesta dissertação, seria uma propriedade

facilitadora da reação inibitória do 3-BrPA as desidrogenases mitocondriais.

A importância do papel da ciclagem de ADP na potencialização do efeito do 3-

BrPA é melhor representada na figura 18. Neste ensaio, inibimos o ANT com

diferentes concentrações de carboxiatractilosídeo (figura 18).

Resultados |60

3BrPA

FCCPADPA

B

C3BrPA

20 min.Flux

o po

r mas

sa d

e O

2

(pm

ol/s

eg.m

g) 2000

HK+ Glc

Figura 17: Despolarização parcial do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) pelo ionóforo de próton FCCP não aumenta a sensibilidade da succinato desidrogenase a inibição pelo 3-BrPA comparada a reciclagem de ADP pela atividade da HK. Mitocôndria de fígado de

camundongo (0.2mg/ml) foi usada para medir o consumo de oxigênio. No painel (A) gráfico controle

onde a mitocôndria de fígado foi estimulada pelo substrato do complexo II (10mM succinato) e 200µM

ADP. FCCP foi titulado até promover uma despolarização semelhante à promovida pela adição do

ADP (estado 3). No painel (B) 50µM de 3-BrPA foi adicionado após a despolarização feita pelo FCCP.

No painel (C) 0.01U HK de levedura exógena e 10mM de glicose foram adicionados a mitocôndria de

fígado estimulada pelo substrato do complexo II (10mM succinato) e dois pulsos de 200µM ADP.

50µM de 3-BrPA e 1µM de FCCP foram adicionados. Os gráficos representam quatro experimentos

independentes.

Resultados |61

0

8000

16000

24000

0.5 µM

0.005 µM

0.1 µM

0.01 µM

A

3-BrPAGlic +HK Carboxi

ADP

0

8000

16000

24000

ADPCarboxi

Glic +HK

3-BrPA

E

D

C

B

0

8000

16000

24000

ADP

Carboxi

Glic +HK 3-BrPA

C

onsu

mo

de O

2

(pmol

O2/ s

ec. m

g pt

n)

0

8000

16000

24000

CarboxiGlic +HK

ADP

3-BrPA

10 20 30 400

8000

16000

240003-BrPA

ADP

Glic +HK

Controle

Tempo (min)

Figura 18: Importância da ciclagem de ADP no efeito do 3-BrPA. Mitocôndria de fígado de

camundongo (0.2mg/ml) foi usada para medir o consumo de oxigênio em diferentes concentrações de

carboxiatractlosídeo. O ensaio foi feito na presença de 10 mM succinato, 10 mM de glicose, 1 mM HK

de levedura e 100 µM 3-BrPA. No painel (A) mitocôndria de fígado na presença de 0,5µM de

carboxiatractilosídeo. No painel (B) 0,1 µM de carboxiatractilosídeo. Painel (C) 0,01 µM de

carboxiatractilosídeo. Painel (D) 0,005 µM de carboxiatractilosídeo e no painel (E) controle. Os

gráficos representam quatro experimentos independentes.

Resultados |62

Os resultados apresentados mostram a importância da ANT no efeito do 3-

BrPA corroborando com os resultados anteriores (figura 16 e 17). Em doses maiores

(0,5 µM de carboxiatractilosídeo) (figura 18A), a inibição pelo 3-BrPA foi mais lenta,

levando aproximadamente 13 minutos para inativar 50% da respiração induzida pela

hexocinase quando comparada ao controle na qual levou aproximadamente 3

minutos (figura 19). Além da importância da ciclagem de ADP, outro efeito curioso

que notamos foi a existência de 2 fases de inibição ( figura 18C e 18D), uma mais

lenta e outra mais rápida, sugerindo que a droga poderia está atuando em, pelo

menos 2 sítios, um de efeito imediato, que é apresentado quando o ANT está menos

inibido e outro em tempo maior, quando o trocador ANT esta mais inibido.

Resultados |63

0,000 0,01 0,1 1

2

4

6

8

10

12

14

T1/2

par

a a

inat

ivaç

ão d

e 50

%

da re

spira

ção

pelo

3-B

rPA

(min

.)

Carboxiatractilosídeo, µM

500

1000

1500

2000

2500

Tempo requerido para inativação de 50% da respiração pelo 3BrPA Respiração induzida pela hexocinase

Resp

iraçã

o in

duzi

da p

ela

hexo

cina

se

(

pmol

O2.

sec-1

. mg-1

)

Figura 19: Correlação entre a taxa da respiração induzida pela atividade da HK e a reatividade ao 3-BrPA. Mitocôndria de fígado de camundongo (0.2mg/ml) foi usada para medir o consumo de

oxigênio em diferentes concentrações de carboxiatractlosídeo. O ensaio foi feito na presença de 10

mM succinato, 10 mM de glicose, 1 mM HK de levedura e 100 µM 3-BrPA. Os valores são médias ±

EP de quatro experimentos independentes.

5- DISCUSSÃO ______________________________________

Discussão |65

5- DISCUSSÃO:

Diversos estudos propõem que o 3-BrPA poderia atuar como um potente

inibidor em certos tumores, particularmente em hepatocarcinomas. Entretanto, o

mecanismo bioquímico de ação desta droga não está completamente esclarecido.

Pedersen e colaboradores (Pedersen, 2007) têm enfatizado que o alvo celular

preferencial desta droga estaria na reação de fosforilação da glicose catalisada pela

hexocinase do tipo II presente em altos níveis nos carcinomas hepáticos. Os

tumores apresentam uma alta taxa glicolítica mesmo em presença de oxigênio,

efeito este observado por Otto Warburg em 1930. Vários mecanismos bioquímicos

têm sido propostos para explicar o fato de que a alta demanda energética requerida

pelo tumor é resultado de uma alta percentagem de síntese de ATP pela glicólise

(cerca de 60%,) e 40 % pela fosforilação oxidativa realizada pelas mitocôndrias

(Nakashima et al., 1984). Neste cenário a inibição do fluxo glicolítico em uma etapa

de grande controle sobre o fluxo desta via poderia explicar o potente efeito tóxico

desta droga sobre os tumores.

Todavia, estudos prévios já descreviam efeitos do 3-BrPA sobre a atividade

de preparações de enzimas mitocondriais tais como, piruvato desidrogenase e

succinato desidrogenase (Sanborn et al., 1971; Maldonado et al., 1972, Korotchkina

et al., 1999 e Acan e Ozer, 2001). Assim como também na glutamato desidrogenase

(Tunnicliff, 1978). Entretanto, nestes estudos preliminares as concentrações

experimentais utilizadas eram sempre bastante elevadas (entre 1 a 20 mM), sendo

de difícil significado terapêutico para justificar uma investigação detalhada sobre o

mecanismo de ação desta droga sobre a fosforilação oxidativa em um contexto

terapêutico. Porém, observações do grupo do Dr. Pedersen também confirmaram os

efeitos desta droga sobre o consumo de oxigênio (Ko et al., 2001) sugerindo um

outro potencial alvo de ação do 3-BrPA. De acordo com esses dados prévios, nosso

grupo iniciou um estudo detalhado analisando os possíveis alvos de ação do 3-

BrPA, tanto na glicólise como na respiração mitocondrial, em células de

hepatocarcinoma HepG2 (Pereira da Silva et al., 2009). Foi sugerido por Pereira da

Silva (2009) que um alvo importante do 3-BrPA seria a succinato desidrogenase,

independente da fonte de carbono (glicose ou glutamina) usado para o cultivo

celular. Interessantemente, a hexocinase não teve a sua atividade afetada pelo

Discussão |66

tratamento das células HepG2 com 3-BrPA, como sugerido por Pedersen e

colaboradores (Pereira da Silva et al., 2009).

Com base nos dados prévios da literatura (Sanborn et al., 1971; Maldonado et

al., 1972, Korotchkina et al., 1999 e Acan e Ozer, 2001 e Tunnicliff, 1978),

inicialmente foram feitas medidas diretas das atividades das enzimas do complexo II

(SDH), complexo I (NADH: oxidoredutase) em concentrações menores de 3-BrPA

que as estudadas previamente. Observamos que o 3-BrPA inibiu completamente a

atividade da SDH apresentando um IC50

Estes resultados foram confirmados quando analisamos mais profundamente

a ação do 3-BrPA em diferentes parâmetros mitocondriais ( medidas de potencial de

membrana e consumo de oxigênio). Na figura 11C, está mostrado que a formação

do potenxial de membrana (ΔΨm) é inibida em 50 % com 170 µM de 3-BrPA quando

o substrato é o succinato e em 20 % quando o substrato é ao nível de complexo I

(piruvato/malato) ou ao nível complexo IV (TMPD/ascorbado). Entretanto, a menor

inibição observada para os complexos I e IV para doses relativamente baixas do

agente alquilante não descarta um efeito inibitório sinérgico sobre a respiração ainda

maior em condições fisiológicas, ou seja, na presença tanto de piruvato como de

succinato como mostrado na figura 13, onde, quando o succinato foi adicionado

juntamente com os substratos do complexo I (piruvato, malato e glutamato) o efeito

sobre a despolarização da formação do ΔΨm foi potencializado. Este efeito sinérgico

sobre a respiração poderia depender da quantidade relativa de cada complexo na

CTE que determina a velocidade do fluxo total de consumo de oxigênio – limiar

inibitório de cada complexo sobre a respiração (Rossignol et al., 2003).

de aproximadamente 100 µM (figura 10).

Todavia nenhuma inibição foi observada na atividade da NADH: ubiquinona

oxidoredutase quando incubada por 1 minuto. Porém, quando as mitocôndrias de

fígado de camundongo são pré-incubadas por 30 minutos com a droga, observou-se

uma significativa inibição da atividade da NADH: ubiquinona oxidoredutase

mostrando ser dependente do tempo (figura 7). Nenhuma inibição da atividade do

complexo IV foi observada (figura 8), concluindo ser a succinato desidrogenase a

mais sensível a ação da droga.

Em trabalhos prévios foi mostrado uma queda dos níveis de ATP nas células

tumorais sob a ação do 3-BrPA (Ko et al., 2001; Geschwind et al., 2002). Este efeito

Discussão |67

não pode ser relacionado a uma inibição da atividade de síntese de ATP já que não

foi observado inibição da atividade ATPásica azida sensível da FoF1 ATPase (figura

9). Este dado sugere a queda nos níveis de ATP das células tumorais pode

depender de outros fatores. Uma possibilidade interessante é que a inibição da SDH

pelo 3-BrPA uma vez promovendo a queda do ΔΨm pode levar a FoF1 ATP sintase

a passar a funcionar como uma FoF1 ATPase na tentativa de restabelecer o ΔΨm

(notar que esta atividade não é inibida pelo 3-BrPA). O que facilitaria ainda mais o

decréscimo nos níveis intracelulares de ATP.

Os estudos de respirometria de alta resolução em mitocôndrias isoladas de

fígado de camundongo revelaram com maior clareza o caráter diferencial da

reatividade do 3BrPA frente aos diferentes estados respiratórios da mitocôndria

(figura 12). Os valores para inibição do consumo de oxigênio por 3-BrPA em

preparação de mitocôndrias isoladas foi maior no estado 3 quando comparado ao

estado 2 e 4 frente aos substratos do complexo I e complexo II. Estes dados

sugerem que talvez o fluxo de elétrons na CTE e a magnitude do ΔΨm possam estar

contribuindo para que a SDH se estabilize em uma conformação mais reativa ao 3-

BrPA. Em estados respiratórios não fosforilantes (estados 2 e 4), as unidades de

SDH não mobilizadas na transferência de elétrons poderiam existir em microestados

conformacionais de baixa reatividade ao 3-BrPA, como os revelados pelo maior

tempo de inibição (figuras 12, 16-19). Assim como na respiração, o efeito inibitório

do 3-BrPA sobre o ΔΨm foi mais pronunciado quando o ADP foi incluído ao meio

induzindo ao estado 3 da respiração (figura 13). Este efeito é bem claro quando

succinato é usado como substrato respiratório. Uma possível explicação para esta

maior inibição da SDH em estado 3 seria que a presença de nucleotídeos, tais

como, ADP e ATP, poderiam modular a atividade da SDH alterando a reatividade do

3-BrPA. De fato, já foi demonstrado que a SDH de planta tem a sua atividade

regulada por ADP e ATP e oxalacetato (Affourtit et al., 2001; Gutman, 1978). Na

figura 17, foi mostrado que a maior reatividade do 3-BrPA no estado 3 foi

independente do nível do ΔΨm, pois quando FCCP (ionóforo de prótons) foi utilizado

para despolarizar o potencial de membrana ao nível da despolarização equivalente a

obtida pelo estado 3 (ADP), não se observou uma reatividade tão rápida como a

observada pela ciclagem de ADP/ATP.

Discussão |68

Assim, a inibição por 3-BrPA da SDH poderia ser dependente do tipo de

nucleotídeo (ATP ou ADP) a da sua localização (dentro e/ou fora da matriz

mitocondrial) ou mesmo do fluxo de troca de ATP/ADP catalisada pelo ANT.

Entretanto, nós não fomos capazes de responder a estas questões no presente

estudo e outros experimentos serão conduzidos para se tentar esclarecer o papel

dos ATP/ADP na inibição da SDH causada pelo 3-BrPA.

Outro mecanismo possível para a inibição da SDH seria a reação do 3-BrPA

com os prováveis sítios de alquilação, resíduos de cisteína (-SH) e/ou treonina (-OH)

presentes na molécula da SDH e NADH-Oxidoredutase. De fato, Sanborn et al.,

1971 mostrou que a succinato desidrogenase de rato possui resíduos de cisteína no

sítio catalítico da enzima tornando assim a SDH mais reativa ao 3-BrPA. Estudos

demonstraram que a alquilação da succinato desidrogenase solúvel por NEM direto

no sítio ativo provoca a inibição da enzima (Kenney, 1975 e Vonogradov et al.,

1976). Observação importante foi o fato de que agentes redutores tal como GSH

protegem do efeito inibitório do 3-BrPA tanto sobre a respiração como para a

formação do ΔΨm usando succinato e piruvato/malato como substratos respiratórios

(figura 15) sugerindo que o estado redox da mitocôndria pode desempenhar também

um papel importante sobre a potência dos efeitos da droga. Sendo assim, uma

possibilidade seria que agentes redutores fisiológicos como a glutationa e NADPH2

Uma grande fração de tumores, inclusive hepatocarcinomas humanos,

apresenta uma grande quantidade de hexocinase associada à membrana

mitocondrial externa (Nakashima et al., 1988). Esta associação da HK a mitocôndria

acopla a glicólise extramitocondrial com a ativação da fosforilação oxidativa

intramitocondrial por um mecanismo de ciclagem de ADP (da-Silva, 2004). Nesta

situação, a glicose que entra no citoplasma recebe imediatamente um grupo fosforil

a partir do ATP gerado pela mitocôndria produzindo glicose 6-fosfato e enviando de

volta para a matriz mitocondrial o ADP que promove a ativação permanente da

respiração para um estado similar ao de estado 3. Outro fato curioso foi a diferença

de reatividade dos sítios de inibição, um lento e outro rápido sugerindo que o 3-BrPA

possam afetar o estado redox da respiração sobre certas condições metabólicas

influenciando a reatividade do 3-BrPA sobre a SDH.

Discussão |69

poderia estar agindo com 2 tipos de grupamentos sulfidrilas que estariam envolvidos

no sítio ativo da succinato desidrogenase, como já sugerido por LeQuôc et al., 1981.

A importância da ciclagem de ADP foi mostrada nas figuras 18 e 19, onde se

evidencia o papel crucial do ANT no tempo de inibição da respiração pelo 3-BrPA.

Assim sendo, mostramos que a presença favorável da HK nas preparações

mitocondriais de tumores levam a respiração mitocondrial deste tipo celular a

estados de ciclagem de nucleotídeos que se mostraram mais reativos ao 3-BrPA

culminando na inibição da respiração e colapso do ΔΨm. O colapso do ΔΨm

representa uma importante etapa na ativação das vias de morte celular. Desta

forma, se por um lado a localização preferencial da HK no VDAC funciona para os

tumores como um potente mecanismo de prevenção a morte, por outro, a atividade

da HK associada ao VDAC em tumores em que o efeito Warburg é proeminente, os

coloca em uma situação de vulnerabilidade ao agente alquilante 3-BrPA. Estes

achados podem representar um dos primeiros mecanismos descritos da fragilidade

do metabolismo energético das células cancerosas.

6- CONCLUSÃO ___________________________________

Conclusões |71

6- CONCLUSÕES.

Em mitocôndrias de fígado de camundongo 3-BrPA inibe tanto a taxa

de consumo de oxigênio e a formação do potencial de membrana (ΔΨm

)

principalmente a nível da succinato desidrogenase (complexo II).

O agente redutor GSH protege tanto o consumo de oxigênio o ΔΨm

da

inibição pelo 3-BrPA.

Na presença de outros substratos respiratórios, tais como glutamato,

malato e piruvato; a presença de succinato aumenta o efeito inibitório do 3-BrPA.

3-BrPA foi mais efetivo em dissipar o ΔΨm

e inibir o consumo de

oxigênio quando o ADP foi incluído no meio de reação.

A cinética de inativação da respiração pelo 3-BrPA é complexa sendo

mais rápida quando a mitochondria está sintetizando ATP e reciclando ADP pela

reação da hexoquinase.

A inativação da respiração sustentada por succinato pelo 3-BrPA não

é dependente do ΔΨm já que a sua dissipação parcial (ao mesmo nível do ADP)

induzida por ionóforo não foi capaz de causar uma reatividade equivalente. A

ciclagem de ADP/ATP pelo sistema do ANT, F0F1ATPsintase e HK afeta a

sensibilidade da succinato desidrogenase ao 3-BrPA .

7- REFERÊNCIAS __________________________________________

Referências |73

7- REFERÊNCIAS .

Acan NL; Ozer N. Modification of human erythrocyte pyruvate kinase by an active site-directed reagent: bromopyruvate. J. Enzyme Inhib, 16, 457-464, 2001.

Affourtit C; Krab K; Leach GR; Whitehouse DG; Moore AL. New insights into the regulation of plant succinate dehydrogenase. On the role of the protonmotive force. J Biol Chem

.,35, 32567- 32574, 2001.

Aisenberg AC. Studies on normal and neoplastic mitochondria. I. Respiration. Cancer Res., 21, 295- 303, 1961.

Akerman KE; Järvisalo JO. Effects of ionophores and metabolic inhibitors on the mitochondrial membrane potencial within isolated hepatocytes as measured with the safranine method. Biochem J, 192, 183-190, 1980.

American Cancer Society. Cancer facts and figures 2009. Atlanta: American Cancer Society; 2009.

Andrei DV; Eleonora VG; Victor VZ. Reactivity of the Sulfhydryl Groups of Soluble Succinate Dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 63, 365-371 1976.

Arora KK; Pedersen PL. Functional significance of mitochondrial bound hexokinase in tumor cell metabolism: Evidence for preferential phosphorylation of glucose by intra-mitochondrially generated ATP. J. Biol. Chem. 263, 14422-14428, 1988.

Arora KK; Fanciulli M; Pedersen PL. Glucose phosphorylation in tumor cells. Cloning, sequencing and overexpression in active form of a full-length cDNA enconding a mitochondrial bindable form of hexokinase. J. Biol. Chem. 265, 6481-6488, 1990.

Referências |74

Baker JP; Rabin BR. Effects of bromopyruvate on the control and catalytic properties of glutamate dehydrogenase. Eur. J. Biochem., 11, 154- 159, 1969.

Balijepalli S; Annepu J; Boyd MR; Ravindranath, V. Effect of thiol modification on brain mitochondrial complex I activity. Neuroscience Lett., 203- 206, 1999.

Bosch X,;Ribes J, Borràs J. Epidemiology of primary liver cancer. Semin Liver Dis; 19: 271–85, 1999.

Brdiczka D; Wallimann T. The importance of the outer mitochondrial compartment in regulation of energy metabolism. Mol. Cell Biochem. 133-134, 69-83, 1994.

Breedis C; Young G. Blood supply in neoplasms. Am. J. Pathol. 30, 969-985, 1954.

Chance B; Williams GR. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. 17, 65-134, 1956.

Chang GG; Hsu RY. The substrate analog bromopyruvate as a substrate, an inhibitor and a alkylating agent of malic enzyme of pigeon liver. Biochem. Biophys. Res. Commun., 55, 580- 587, 1973.

Colombo M. Risk groups and preventive strategies. In: Berr F,Bruix J, Hauss J, Wands J, Wittekind Ch, eds. Malignant livertumors: basic concepts and clinical management. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers BV and Falk Foundation, 67–74,2003.

da-Silva WS, Gómez-Puyou A, de Gómez-Puyou MT, Moreno-Sanchez R, De Felice FG, de Meis L, Oliveira MF, Galina A. Mitochondrial bound hexokinase activity as a preventive antioxidant defense: steady-state ADP formation as a regulatory mechanism of membrane potential and reactive oxygen species generation in mitochondria. J Biol Chem., 38, 39846- 39855, 2004.

Referências |75

Nicholls DG; Ferguson SJ. Bioenergetics 3, 4º ed.London: Academic press, 2001. 297 p. cap. 7, p. 195-216.

Di Bisceglie AM; Rustgi VK; Hoofnagle JH; Dusheiko GM; Lotze MT. NIH conference. Hepatocellular carcinoma. Ann. Intern. Med. 108, 390-401, 1988.

Dietzen DJ; Davis EJ. Oxidation of pyruvate, malate, citrate, and cytosolic reducing equivalents by AS-30D hepatoma mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 305, 91-102, 1993.

Dünschede F, Zwicker K, Ackermann H, Zimmer G. ADP- and oligomycin-sensitive redox behavior of F0 b thiol in ATPsynthase depends on neighbored primary structure: Investigations using 14-C-labeled alpha lipoic acid. Biofactors, 19, 19-32, 2003.

El-Serag, HB; Mason, AC. Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States. N. Engl. J. Med. 340, 745-750, 1999.

El- Serag, HB; Rudolph, KL. Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenegis. Gastroenterology, 132, 2557- 2576, 2007.

Euler HV; Adler EZ. Über die komponenten der dehydrasesysteme. 6. Dehyrierung von hexosen unter mitwirkung von adenosintriphosphorsäure.Physiol. Chem 235:122, 1935.

Felberg NT, Hollocher TC. Inactivation of succinate dehydrogenase by N-ethylmaleimide. Stoichiometry and chemistry. J Biol Chem

., 14, 4539-42, 1972.

Fink MP; Evans TW. Mechanisms of organ dysfunction in critical illness: report from a Round Table Conference held in Brussels. Intensive Care Med. 28, 369-375,2002.

Referências |76

Fiske, CF; Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem. 56,2, 375-400, 1925.

Geschwind JF; Artemov D; Abraham S; Omdal D; Huncharek C; McGee C; Arepally, A; Lambert, D; Venbrux, AC; Lund, GB. Chemoembolization of liver tumor in a rabbit model: Assessment of tumor cell death with diffusion-weighted MR imaging and histologic analysis. J. Vasc. Interv. Radiol. 11,1245-1255, 2000.

Geschwind JF; Ko YH; Toberson MS; Magee C; Pedersen PL. Novel therapy for liver cancer: direct intraarterial injection of a potent inhibitor of ATP production. Cancer Res. 3909-3913, 2002.

Gosálvez M; Perez-Garcia J; Weinhouse S. Competition for ADP between pyruvate kinase and mitochondrial oxidative phosphorylation as a control mechanism in glycolysis. Eur. J. Biochem. 46, 133-140, 1974.

Grigorieff, N. Structure of the respiratory NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I). Current Opinion in Structural Biology, 9, 476- 483, 1999.

Gutman M. Modulation of mitochondrial succinate dehydrogenase activity, mechanism and function. Mol Cell Biochem

., 1, 41- 60, 1978.

Instituto Nacional de Câncer; Ministério da Saúde. Estimativas 2008: Incidência de Câncer no Brasil, Rio de Janeiro (Brasil): INCA; 2007. Disponível em: http://www.inca.gov.br/estimativa/2008

Jones AR; Gillan L; Milmlow D. The anti- glycolitic activity of 3-bromopyruvate on mature boar spermatozoa in vitro. Contraception, 52, 317- 320, 1995.

Kamangar F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J. Clin. Oncol. 24, 2137-2150, 2006.

http://www.inca.gov.br/estimativa/2008�

Referências |77

Kapoor, V; McCook, BM; Torok, FS. An introduction to PET-CT imaging. Radiographics 24,523-543, 2004.

Kenney WC. The reaction of N-ethylmaleimide at the active site of succinate dehydrogenase. J Biol Chem

., 8, 3089- 3094, 1975.

Kenney WC. The reaction of N-ethylmaleimide at the active site of succinate dehydrogenase. J Biol Chem.

, 25, 3089- 3094, 1995.

Kenney WC. The reaction of N-ethylmaleimide at the active site of succinate dehydrogenase. J Biol Chem

., 8, 3089- 3094, 1975.

Kerner, J and Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1486, 1-17, 2000.

Khalimonchuk, O and Rödel, G. Biogenesis of cytochrome c oxidase. Mitochondrion, 5, 363- 388, 2005.

Ko, YH; Pedersen, PL; Geschwind, JF. Glucose catabolism in the rabbit VX2 tumor model for liver cancer: characterization and targeting hexokinase. Cancer Let.t 173, 1, 83-91,2001.

Ko, YH; Smith, BL; Wang, Y; Pomper, MG; Rini, DA; Torbenson, MS; Hullihen, J; Pedersen, PL. Advanced cancers: eradication in all cases using 3-bromopyruvate therapy to deplete ATP. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 324, 269-275, 2004.

Korotchkina LG, Showkat AM E Patel MS. Involvement of alpha-cysteine-62 and beta-tryptophan-135 in human pyruvate dehydrogenase catalysis. Arch. Biochem. Biophys. 369, 277-287, 1999.

Referências |78

Kurokawa, M; Oda, S; Tsubotani, E; Fujiwara, H; Yokoyama, Y; Ishibashi, S. Characterization of hexokinase isoenzyme types I and II in ascites tumor mitochondrial membrane. Mol. Cell. Biochem. 45, 151-157, 1982.

Lardy HA; Wellman, H. Oxidative phosphorylations; rôle of inorganic phosphate and acceptor systems in control of metabolic rates. J Biol Chem

., 1, 215- 224, 1952.

Lê-Quôc, K.; Lê-Quôc, D.; Gaudemer, Y. Evidence for the existence of two classes of sulfhydryl groups essential for membrane-bound succinate dehydrogenase activity. Biochemistry, 20, 7, 1705-1710, 1981.

Lehninger AL. Molecular basis of structure and function. W. A. Benjamin, Inc. New York, 1, 1-14, 1965.

Lesnefsky, EJ and Hoppel, CL. Oxidative phosphorylation and aging. Ageing Res. Reviews 5, 402-433, 2006.

Liaw YF, Tai DI, Chu CM, et al. Early detection of hepatocellular carcinoma in patients with chronic type B hepatitis: a prospective study. Gastroenterology, 90, 263–67, 1986.

Lippe G, Sala FD, Sorgato MC. ATP Synthase Complex from Beef Heart Mitochondria : Role of the thiol group of the 25-kDa subunit of Fo in the coupling mechanism between Fo and F1. J. Biol. Chem. 263, 35, 18627-18634, 1988.

Llovet J; Real ML; Montana X. Arterial embolisation or chemoembolisation versus symptomatic treatment in patients with unresectable hepatocellular carcinoma: A randomized controlled trial. Lancet 359, 1734-1739, 2002.

Lowry OH; Rosebrough JN; Farr AL; Randall RJ. Protein measurements with the folin phenol reagent. J Biol. Chem 193, 265-275, 1951.

Referências |79

Maldonado ME; Oh K; Frey PA. J. Studies on Escherichia coli pyruvate dehydrogenase complex. I. Effect of bromopyruvate on the catalytic activities of the complex. Biol. Chem. 247, 2711-2716, 1972.

Marín-Hernandez A; Rodríguez-Henríquez S; Vital-Gonzalez PA; Flores-Rodríguez FL; Macias-Silva M; Sosa-Garrocho M; Moreno-Sánchez R. Determining and understanding the control of glycolysis in fast-growth tumor cells. Flux control by an over-expressed but strongly product-inhibited hexokinase. FESB J. 273, 1975-1988, 2006.

Mathupala SP; Rempel A; Pedersen PL. Glucose catabolism in cancer cells: Isolation, sequence, and activity of the promoter for type II hexokinase. J. Biol. Chem. 270, 16918-16925, 1995.

Meyerhof O. Die chemischen vorgange im muskel. Biochem. Z 183, 176-215, 1927.

Mitchell P. Possible molecular mechanisms of the protonmotive function of cytochrome systems. J. Theor. Biol. 62, 327-367, 1976.

Moreno-Sánchez R; Rodríguez-Enríquez S; Marín-Hernández A; Saavedra E. Energy metabolism in tumor cells. FESB J. 274, 1393-1418, 2007.

Muller M; Siems W; Buttgereit F; Dumdey R; Raport SM. Quantification of ATP- producing and consuming processes of Ehrlich ascites tumour cells. Eur. J Biochem 161, 701-705, 1986.

Nakashima RA; Mangan PS; Colombini M; Pedersen PL. Hexokinase receptor complex in hepatoma mitochondria: evidence from N,N'-dicyclohexylcarbodiimide-labeling studies for the involvement of the pore-forming protein VDAC. Biochemistry 25, 1015-1021, 1986.

Referências |80

Nakashima RA; Paggi MG; Pedersen PL. Contributions of glycolysis and oxidative phosphorylation to adenosine 5´- triphosphate production in AS-30D hepatomas cells. Cancer Res. 44, 5702-5706, Cancer Res. 44, 5702-5706, 1984.

Nakashima RA; Paggi MG; Scott LJ; Pedersen PL. Purification and characterization of a bindable form of mitochondrial bound hexokinase from the highly glycolytic AS-30D rat hepatoma cell line. Cancer Res. 48, 913-919, 1988.

Nelson, Davi L.; Cox, Michael M. Fosforilação Oxidativa e Fotofosforilação.In: .Lehninger Princípios de Bioquímica. 3º ed.São Paulo: Sarvier, 2002. 975 p. cap. 19, p. 515-526.

Nicolay K; Rojo M; Wallimann T; Demel R; Hovius R. The role of contact sites between inner and outer mitochondrial membrane in energy transfer. Biochim. Biophys. Acta 1018, 229-233, 1990.

Okuda K; Ohtsuki T; Obata H; Tomimatsu M; Okazaki N; Hasegawa H; et al. Natural history of hepatocellular carcinoma and prognosis in relation to treatment. Study of 850 patients. Cancer 56, 918-928, 1985.

Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol 2:533–543, 2001.

Parkin DM. Cancer Incidence in five continents. IARC scientific publications volume VIII[No. 155]. 2002. Lyon: IARCPress.

Parry DM; Pedersen PL. Intracellular localization and properties of particulate hexokinase in the Novikoff ascites tumor. Evidence for an outer mitochondrial membrane location. J. Biol. Chem. 258, 10904-10912, 1983.

Parlo RA; Colemam PS. Enhanced rate of citrate export from cholesterol-rich hepatoma mitochondria. The truncated Krebs cycle and other metabolic

Referências |81

ramifications of mitochondrial mebrane cholesterol. J. Biol. Chem. 259, 9997-10003, 1984.

Pastorino JG; Hoek JB. Hexokinase II the integration of energy metabolism and control of apoptosis. Curr. Med. Chem. 10, 1535-1551, 2003.

Pauser S; Wagner S; Lippmann M; Rohlen U; Reszka R; Wolf KJ; Berger G. Evaluation of efficient chemoembolization mixtures by MR imaging therapy monitoring: An experimental atudy on the VX2 tumor in the rabbit liver. Cancer Res. 56, 1863-1867, 1996.

Pedersen PL; Mathupala S; Rempel A; Geschwind JF; Ko YH. Mitochondrial bound type II hexokinase: a key player in the growth and survival of many cancers and an ideal prospect for therapeutic intervention. Biochim. et Biophys. Acta 1555, 14-20, 2002.

Pedersen PL. Tumor mitochondria and the bioenergetics of cancer cells. Prog. Exp. Tumor Res. 22, 190-274, 1978.

Pedersen PL. The cancer cells "power plant" as promising therapeutic targets: An overview. J. Bioenerg. Biomembr., 2007.

Pereira da Silva AP; El-Bacha T; Kyaw N; dos Santos RS; da-Silva WS; Da Poian, AT; Galina A. Differential inhibition of energy- produncing pathways of HepG2 cells by 3- Bromopyruvate. Biochem J

., 3, 717- 726, 2009.

Pierre R; Agnes R. Inborn errors of complex II- Unusual human mitochondrial diseases. Biochimica et Biophysica Acta 1553,117-122, 2002.

Pierre R, Arnold M, Agnès R. Succinate dehydrogenase and human diseases: new insights into a well-known enzyme. European Journal of Human Genetics 10, 289-291, 2002.

Referências |82

Poynard T, Aubert A, Lazizi Y, Bedossa P, Hmelin B, Terris B, et al. Independent risk factors for hepatocellular carcinoma in French drinkers. Hepatology,13:896-901,1991.

Ramsey DE; Kernagis LY; Soulen MC; Geschwind JF. Chemoembolization of hepatocellular carcinoma. J. Vasc. Interv. Radiol. 13, S211-S221, 2002.

Rempel A; Bannasch P; Mayer D. Differents in expression and intracellular distribution of hexokinase isoenzymes in rat liver cells of differents transformation stages. Biochem. Biophys. Acta 1219, 660-668, 1994.

Rohn S, Kroh LW. Electron spin resonance--a spectroscopic method for determining the antioxidative activity. Mol Nutr Food Res

., 10, 898- 907, 2005.

Rohren EM; Turkington TG; Coleman RE. Clinical applications of PET in oncology. Radiology 231, 305-332, 2004.

Rose IA; Warms JVB. Stability of hexokinase II in vitro and in ascites tumor cells. Arch. Biochem. Biophys. 213, 625-634, 1982.

Rossignol R; Faustin B; Rocher C; Malgat M; Mazat JP; Letellier T. Mitochondrial threshold effects. Biochem. J. 370, 751-762, 2003.

Rous P; Kidd JG; Smith WE. Experiments on the cause of the rabbit carcinomas derived from virus-induced papillomas. II. Loss by the VX2 carcinomas of the power to immunize hosts against the papilloma virus. J. Exp. Med. 96, 159-174, 1952.

Rustgi VK. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. Gastroenterol Clin. North Am 16, 545-551, 1987.

Saha S; Bardelli A; Guckhaults P; Velculescu VE; Rago C; St. Croix G; Romans KE; Choti MA; Lengauer C; Kinzler KW; Vogelstein BA. Phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science 294, 1343-1346, 2001.

Referências |83

Sanborn BM; Feldeberg NT; Hollocher TC. The inactivation of succinate dehydrogenase by bromopyruvate. Biochim. Biophys. Acta 227, 219-231, 1971.

Satterlee J; Hsu RY. Duck liver malic enzyme: sequence of a tryptic peptide containing the cysteine residue labeled by the substrate analog bromopyruvate. Biochim. Biophys. Acta, 1079, 247- 252, 1991.

Shinohara Y; Ichihara J; Terada H. Remarkably enhaceded expression of the type II hexokinase in rat hepatoma cell line AH130. FEBS Lett. 291, 55-57, 1991.

Syroeshkin AV, Vasilyeva EA, Vinogradov AD. ATP synthesis catalyzed by the mitochondrial F -F0 ATP synthase is not a reversal of its ATPase activity. FEBS Lett. 366, 29-32, 1995.

Sun Z, Lu P, Gail MH. Increased risk of hepatocellular carcinoma in male hepatitis B surface antigen carriers with chronic hepatitis whohave detectable aflatoxin metabolite M1. Hepatology,30: 379–83,1999.

Thele AP; Wilson, JE. Complete amino acid sequence of the type II isozyme of rat hexokinase, deduced from the cloned cDNA: comparison with a hexokinase from novikoff ascites tumor. Arch. Biochem. Biophys. 286, 645-651, 1991.

Tunnicliff G, Ngo TT. Mechanism of inactivation of brain glutamic decarboxylase by 3-bromopyruvate. Int. J. Biochem. 9, 249-252, 1978.

Vonck J; Schäfer E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim. Biophys. Acta, 117- 124, 2009.

Vinogradov AD, Gavrikova EV, Goloveshkina VG. Kinetic and structural characteristics of succinate dehydrogenase components reacting with natural and artificial electron acceptors. Biokhimiia., 7, 155- 1168, 1976.

Referências |84

Weber, G. Ordered biochemical program of gene expression in cancer cells. Biochemistry (Moscou) 66, 1164-1173,2001.

Warburg, O. The Metabolism of Tumors. London Constable Co. Ltd, 1930.

Williams, GR. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advan. Enzymol, 17, 65, 1956.

World Health Organization. Cancer. Fact sheet N°297. February 2006. [homepage on the Internet]. Geneva: World Health Organization; c2007 [cited 2007 oct. 10]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/print.html.

Zu XL; Guppy M. Cancer metabolism: facts, fantasy, and fiction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313, 459-465, 2004

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/print.html�

Nome: Clara Rodrigues Ferreira Nascimento: 15/05/1983 Naturalidade: Rio de Janeiro Formação Acadêmica . Faculdade de Biologia – Modalidade Biologia do Desenvolvimento pela Universidade Fluminense, outubro 2003 a outubro 2007. . Mestrado em Química Biológica no Departamento de Bioquímica Médica – Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade Federal do Rio de Janeiro. Orientação de Estudante

1. Andreza da Silva Lima – iniciação científica de janeiro/2008 a novembro/2009.

Comunicação em Congresso . 4 comunicações em congressos nacionais. Publicações 1. Cosentino-Gomes, Daniela, Russo-Abrahão, Thais, Fonseca-de-Souza, André Luiz, Rodrigues-Ferreira, C., Galina, Antonio, Meyer-Fernandes, José Roberto. (2009) Modulation of Trypanosoma rangeli ecto-phosphatase activity by hydrogen peroxide. Free Radical Biology & Medicine. , p.11 – 48.

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







universidade federal do rio de janeiro centro de …livros01.livrosgratis.com.br/cp116909.pdf ·...

Documents