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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS

THAÍSA ABRANTES ELIAS

EFEITO DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO SOBRE

A REAÇÃO DE MAILLARD EM SISTEMAS-MODELO

RIO DE JANEIRO

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS



Volume Único Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, do Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira Co-orientadora: Profª. Drª. Nathália Moura Nunes

RIO DE JANEIRO

2016

A161

Abrantes, Thaísa Elias.

Efeito da adição de ácido gálico sobre a Reação de Maillard

em sistemas-modelo / Thaísa Abrantes Elias – Rio de Janeiro:

UFRJ/IQ, 2016.

106f. : il.

Dissertação (Mestrado em Ciência) – Universidade Federal

do Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-

Graduação em Ciências de Alimentos, Rio de Janeiro, 2016.

.

Orientador: Daniel Perrone Moreira

Coorientador: Nathália Moura Nunes

1. Reação de Maillard 2. Sistemas-modelo. 3. Ácido gálico. I.

Moreira, Daniel Perrone. (Orient.). II. Nunes, Nathália Moura.

(Coorient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto

de Química. Programa de Pós-Graduação em Ciências de

Alimentos.

CDD: 664.001



Thaísa Abrantes Elias

Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira

Co-orientadora: Profª. Drª. Nathália Moura Nunes

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de

Alimentos, do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.

Aprovada por:

___________________________________________________________________

Presidente, Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira, Instituto de Química/UFRJ

___________________________________________________________________

Profa. Dra. Nathália Moura Nunes, Instituto de Nutrição/UERJ

___________________________________________________________________

Prof. Dr. Alexandre Guedes Torres, Instituto de Química/UFRJ

___________________________________________________________________

Prof. Dr. Julio Beltrame Daleprane, Instituto de Nutrição/UERJ

Rio de Janeiro

Abril de 2016

AGRADECIMENTOS

Confesso que eu nunca sonhei em fazer uma faculdade de nutrição. Apesar das

matérias mais ligadas à química prenderem um pouco mais da minha atenção, posso dizer que

me senti um tanto quanto “perdida” durante boa parte do curso. Com certeza, uma das

melhores partes da graduação foi conhecer pessoas maravilhosas que sempre me apoiavam de

alguma forma. Indo para o sexto período, conheci a minha atual co-orientadora, Nathália

Moura, e por meio dela conheci um pouco mais da área de Ciência de Alimentos. Fiquei

muito feliz quando ela aceitou me orientar no meu trabalho de conclusão de curso. Achei

fantástico poder utilizar a cerveja (uma das minhas paixões) como objeto de estudo e ter a

oportunidade de trabalhar em conjunto com uma professora que eu tanto admirava. Durante o

desenvolvimento do trabalho, me vi cada vez mais envolvida com a área de pesquisa e resolvi

me preparar para a seleção de Mestrado. Colocando na balança esses últimos dois anos, no

final das contas eu vi que realmente valeu muito a pena enfrentar todos os desafios que

apareceram pela frente. Essa etapa da minha vida com certeza me fez crescer muito nos

âmbitos profissional e pessoal. Aos amigos, meus agradecimentos:

À minha turminha da faculdade de nutrição (Luiz Fernando, Letícia, Mari Rampini e

Crícila): Obrigada pelas tardes no nosso “banquinho zen”, pelas festas no apê do Luiz e por

todo o apoio desde sempre.

À Letícia por estar sempre do meu lado em todas as situações. Você é meu porto

seguro.

Aos professores do curso de Nutrição que contribuíram para a minha bagagem

acadêmica, em especial para: Nathália Moura, Anete Esteves, Lélia Cápua, Giovanna

Faillace, Fernanda Retondaro, Fernanda Kamp, Maria Helena.

À minha querida co-orientadora prof.ª Nathália Moura: Não tenho palavras para

agradecer todo o apoio que você me deu nesses últimos anos. Já te disse que você é

praticamente minha “mãe” nesse mundo (rsrs). Obr igada pelos conselhos e por estar presente

em todos os momentos. Carrego comigo muito do que você me ensinou, tanto no âmbito

pessoal quanto profissional.

Ao meu orientador prof. Daniel Perrone por ser sempre muito presente em todas as

etapas do projeto. Sempre atento aos mínimos detalhes e fornecendo valiosas contribuições ao

projeto. A convivência com você contribuiu muito para o meu amadurecimento. Obrigada por

tudo!

Ao prof. Alexandre Torres, primeiramente, por abrir as portas do LBNA para mim

ainda no meu trabalho de conclusão de curso da graduação. Esse contato com a parte

experimental do projeto fez com que meu interesse pela área acadêmica despertasse. Muito

obrigada também por todas as contribuições ao longo desses anos e por ser sempre muito

solícito.

Aos demais professores e funcionários da UFRJ, aos quais eu tive contato, e que de

alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho.

Aos colegas de laboratório que me ajudaram em alguma etapa do trabalho. Em

especial, para minhas amigas Bia e Luiza por toda a parceria ao longo desses anos.

Às minhas amigas Carla e Jully, que conheci na seleção de Mestrado. Carla, considero

você uma grande amiga. Você foi um dos maiores presentes que o Mestrado me trouxe! Jully,

você também é uma amiga muito querida! Obrigada por sempre me motivar e me divertir.

À minha família, em especial à minha mãe por sempre fazer de tudo pra me ajudar. Ao

longo da minha vida, eu percebi o quanto você se esforçou em prol do meu bem-estar. É

lógico que minha gratidão por você é eterna, não importa o que aconteça. Você é a pessoa que

eu mais amo no mundo!

Aos meus demais amigos, por ouvir meus anseios e pelos momentos de leveza e

descontração. Em especial à Maíra, a irmã que eu não tive, e à Amanda, sempre com

conselhos motivacionais.

RESUMO

A Reação de Maillard (RM) compreende diversas vias de reações químicas que são

essenciais no desenvolvimento de coloração, aroma e flavor característicos de alimentos

processados termicamente. O estudo das vias da RM é dificultado em função de sua

complexidade, mas a utilização de ferramentas de estudo simplificadas, tais como os

sistemas-modelo (SM), auxiliam na elucidação dessa reação. A inclusão de compostos

fenólicos em SM permite, portanto, avaliar sua participação na RM, contribuindo para um

maior entendimento acerca das potenciais implicações da presença de sses compostos na

formação de produtos da RM em alimentos. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi

avaliar o efeito da adição de ácido gálico (GA) sobre a RM. Prepararam-se SM a partir da

mistura de aminoácidos (alanina, arginina, glicina, lisina e prolina) e açúcares (frutose,

glicose e sacarose) (0,5 mol/L), contendo ou não GA (0,01 mol/L), em tampão acetato

(1 mol/L, pH 5), sob refluxo (125 ºC) por 6 horas. A intensidade do escurecimento foi

determinada pela absorbância em 420 nm. A atividade antioxidante (AA) foi avaliada pelos

ensaios de FRAP e TEAC. O consumo dos reagentes, bem como a formação de

5-hidroximetilfurfural (5-HMF), foram avaliados por HPLC. Os SM apresentaram as maiores

intensidade de escurecimento e AA quando constituídos de glicose e/ou lisina, que foram os

reagentes que também apresentaram o maior consumo na RM (p < 0,05). A formação de

5-HMF relacionou-se tanto com o consumo de açúcares quanto com o de aminoácidos,

indicando a possível formação desse composto a partir do conjunto de fragmentação de

compostos nitrogenados, na etapa intermediária. A menor degradação de lisina em presença

do GA, assim como a correlação entre concentração molar de GA e de açúcares (r = 0,743)

indicam a provável reação desse composto fenólico com compostos do conjunto de

fragmentação de açúcares. A adição de GA promoveu aumentos expressivos (entre 69 % e

486 %) na AA de todos os SM. Quando aquecido isoladamente, o GA não sofreu degradação

ou modificação de sua AA, corroborando sua participação na RM e na formação de

compostos com AA ao longo da reação. A correlação entre a concentração molar de GA e AA

na ausência dos SM contendo glicina (r < -0,726) sugeriu a formação de compostos com

atividade pró-oxidante nesses SM. Os resultados obtidos no presente estudo evidenciaram,

pela primeira vez, a participação do GA na RM, contribuindo para o entendimento da

formação de substâncias derivadas de compostos fenólicos via RM.

Palavras-chave: Reação de Maillard; Sistemas-modelo; Ácido gálico; 5-hidroximetilfurfural.

ABSTRACT

The Maillard Reaction (MR) comprises many pathways that are essential to the development

of color, aroma and flavor typical of thermal processed food. The understanding of MR

pathways is limited due to its complexity. However, studies with simplified tools such as

model systems (MS) are useful to elucidate these reaction mechanisms. Thus, the addition of

phenolic compounds in MS allows evaluating its participation in MR, contributing for a

greater understanding of the potential implications of these compounds on the MR products

formation in foods. The aim of this study was to evaluate the effect of gallic acid (GA)

addition on the MR. The MS were prepared by mixing amino acids (alanine, arginine,

glycine, lysine and proline) and sugars (glucose, fructose and sucrose) (0.5 mol/L), with or

without GA (0.01 mol/L), in acetate buffer solution (1 mol/L, pH 5), under reflux (125 ºC)

during 6 hours. The intensity of browning was determined by the absorbance at 420 nm. The

antioxidant activity (AA) was evaluated by FRAP and TEAC assays. The consumption of

reactants as well as 5-hydroxymethylfurfural formation (5-HMF) were evaluated by HPLC.

The MS showed higher AA and intensity of browning when composed of glucose or/and

lysine, which were the reactants with higher consumption in the MR (p < 0.05). 5-HMF

formation was related both to sugars and amino acids consumption, indicating that this

compound could be possibly formed from the nitrogenous compounds fragmentation pool in

the intermediate stage. The lower degradation of lysine in the presence of GA as well as the

correlation between GA and sugars molar concentrations (r = 0.743) indicate the probable

reaction of this phenolic compound with compounds of the sugar fragmentation pool. GA

addition led to expressive increments (from 69 % to 486 %) on the AA of all MS. When

heated alone, GA did not degrade nor modify its AA, corroborating with its participation in

the MR and in the formation of compounds with AA during the reaction. The correlation

between GA molar concentration and AA excluding all MS containing glycine (r < -0.726)

suggested the formation of compounds with pro-oxidant activity in these MS. The results

obtained in the present study showed, for the first time, the participation of GA in the MR,

contributing for the understating of phenolic derivative compounds formation via MR.

Keywords: Maillard Reaction; Model systems; Gallic acid; 5-hydroxymethylfurfural.

Resumos publicados em anais de congressos

ABRANTES, T. E.; NUNES, N. M. ; MOREIRA, D. P. . Efeito da adição de ácido gálico

sobre a Reação de Maillard em sistemas-modelo de melanoidinas: Caracterização físico-

química e atividade antioxidante. In: 11º Simpósio Latino Americano de Ciência de

Alimentos (SLACA), 2015, Campinas - SP. Simpósio Latino Americano de Ciência de

Alimentos, 2015.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1. DESCRIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DA REAÇÃO DE MAILLARD: UMA ABORDAGEM

CONCEITUAL. ..................................................................................................................... 20

FIGURA 2. FORMAÇÃO DA GLICOSAMINA-N-SUBSTITUÍDA A PARTIR DE UMA ALDOSE .............. 21

FIGURA 3. FORMAÇÃO DO PRODUTO DE AMADORI (FORMA CETÔNICA) A PARTIR DA

GLICOSAMINA-N-SUBSTITUÍDA .......................................................................................... 22

FIGURA 4. DIFERENÇAS ESTRUTURAIS ENTRE OS PRODUTOS DE AMADORI E HEYNS ................. 22

FIGURA 5. EXEMPLOS DE ROTAS DE FRAGMENTAÇÃO DE AÇÚCARES NA REAÇÃO DE

MAILLARD ......................................................................................................................... 25

FIGURA 6. ESQUEMAS DE POSSÍVEIS MECANISMOS DE CLIVAGEM HIDROLÍTICA DE Β-DICARBONIS

(B1/B2) E CLIVAGEM OXIDATIVA DE Α-DICARBONIS (A1/A2) ........................................... 26

FIGURA 7. EFEITO DA REAÇÃO DE MAILLARD NO PROCESSO DE TORREFAÇÃO DE

GRÃOS DE CAFÉ ................................................................................................................ 30

FIGURA 8. FORMAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS PRECURSORES DE FLAVORS E AROMAS A

PARTIR DA REAÇÃO DE MAILLARD .................................................................................... 31

FIGURA 9. FÓRMULA ESTRUTURAL DA ACRILAMIDA ................................................................. 36

FIGURA 10. FORMAÇÃO DE ACRILAMIDA A PARTIR DA REAÇÃO DE MAILLARD ........................ 37

FIGURA 11. FÓRMULAS ESTRUTURAIS DE AMINAS AROMÁTICAS HETEROCÍCLICAS FORMADAS

DURANTE A COCÇÃO DE CARNES ........................................................................................ 38

FIGURA 12. FÓRMULA ESTRUTURAL DO 5-HIDROXIMETILFURFURAL ........................................ 39

FIGURA 13. ESTRUTURA QUÍMICA DO GRUPAMENTO FENOL ...................................................... 43

FIGURA 14. VIA METABÓLICA DO ÁCIDO CHIQUÍMICO EM PLANTAS .......................................... 44

FIGURA 15. CLASSES E SUBCLASSES DE COMPOSTOS FENÓLICOS ORIGINADOS A PARTIR DA

FENILALANINA ................................................................................................................... 45

FIGURA 16. ESTRUTURA PRIMÁRIA DOS DERIVADOS DO ÁCIDO CINÂMICO E OS PRINCIPAIS

EXEMPLOS DA CLASSE........................................................................................................ 47

FIGURA 17. ESTRUTURA PRIMÁRIA DOS DERIVADOS DO ÁCIDO BENZÓICO E OS PRINCIPAIS

EXEMPLOS DA CLASSE........................................................................................................ 48

FIGURA 18. FÓRMULA ESTRUTURAL DO ÁCIDO GÁLICO ............................................................ 48

FIGURA 19. POSSÍVEIS ROTAS PARA A BIOSSÍNTESE DO ÁCIDO GÁLICO EM VEGETAIS ............... 49

FIGURA 20. VARIAÇÃO DE PH DOS SISTEMAS-MODELO GLICOSE/GLICINA E SACAROSE/GLICINA

UTILIZANDO ÁGUA OU TAMPÃO ACETATO DE SÓDIO 1 MOL/L (PH 5,0) COMO MEIOS

REACIONAIS ....................................................................................................................... 56

FIGURA 21. INTENSIDADE DE ESCURECIMENTO DO SISTEMA-MODELO GLICOSE/GLICINA COM

REAGENTES NAS CONCENTRAÇÕES 0,2 MOL/L, 0,5 MOL/L E 1,0 MOL/L. ............................ 57

FIGURA 22. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO GLICOSE AO LONGO DE 6

HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO ............................................................................ 58

FIGURA 23. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO FRUTOSE AO LONGO DE 6


FIGURA 24. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO SACAROSE AO LONGO DE 6


FIGURA 25. INTENSIDADE DE ESCURECIMENTO (AUC, ABS.MIN) DOS SISTEMAS-MODELO

INVESTIGADOS, AGRUPADOS POR AÇÚCAR ......................................................................... 61

FIGURA 26. INTENSIDADE DE ESCURECIMENTO (AUC, ABS.MIN) DOS SISTEMAS-MODELO

INVESTIGADOS, AGRUPADOS POR AMINOÁCIDO. ................................................................ 62

FIGURA 27. ESTRUTURAS DE RESSONÂNCIA DO GRUPAMENTO GUANIDINA PROTONADO DA

CADEIA LATERAL DA ARGININA ......................................................................................... 63

FIGURA 28. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELOS ENSAIOS DE FRAP E

TEAC, DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO GLICOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE

AQUECIMENTO SOB REFLUXO ............................................................................................. 64


TEAC, DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO FRUTOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE



TEAC, DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO SACAROSE AO LONGO DE 6 HORAS DE


FIGURA 31. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AUC, MMOL TROLOX.MIN/L), MEDIDA PELOS ENSAIOS

DE FRAP E TEAC, DOS SISTEMAS-MODELO INVESTIGADOS, AGRUPADOS POR AÇÚCAR (A)

E POR AMINOÁCIDO (B). ..................................................................................................... 67

FIGURA 32. CONCENTRAÇÃO (MOL/L) DOS AÇÚCARES (GLICOSE, FRUTOSE E SACAROSE) (A) E

DOS AMINOÁCIDOS (GLICINA, ARGININA E LISINA) (B) NOS TEMPOS INICIAL (T=0 MIN, ☐) E

FINAL (T=360 MIN, ■) DE REAÇÃO. ................................................................................... 70

FIGURA 33. GRÁFICO DE CORRELAÇÃO ENTRE O CONSUMO MOLAR DE AÇÚCARES E DE

AMINOÁCIDOS NOS SISTEMAS-MODELO INVESTIGADOS (N = 9) .......................................... 71

FIGURA 34. CONCENTRAÇÃO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL (5-HMF) (ΜG/ML) NOS SISTEMAS-

MODELO CONTENDO GLICOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB

REFLUXO ............................................................................................................................ 72


MODELO CONTENDO FRUTOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB

REFLUXO ............................................................................................................................ 72


MODELO CONTENDO SACAROSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB

REFLUXO ............................................................................................................................ 73

FIGURA 37. FORMAÇÃO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL (5-HMF) (AUC, ΜG.MIN/ML) NOS

SISTEMAS-MODELO INVESTIGADOS, AGRUPADOS POR AÇÚCAR (A) E POR

AMINOÁCIDO (B). .............................................................................................................. 74

FIGURA 38. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO GLICOSE, ADICIONADOS OU

NÃO DE GA, AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO ............................... 76

FIGURA 39. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO FRUTOSE, ADICIONADOS OU

NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO .............. 77

FIGURA 40. ESCURECIMENTO DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO SACAROSE, ADICIONADOS OU

NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO .............. 78

FIGURA 41. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO NA INTENSIDADE DO ESCURECIMENTO

(AUC, ABS.MIN) DA REAÇÃO DE MAILLARD. OS SISTEMAS-MODELO FORAM AGRUPADOS

POR AÇÚCAR (A) E POR AMINOÁCIDO (B). ......................................................................... 79

FIGURA 42. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELO ENSAIO DE FRAP ,

DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO GLICOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO

LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO......................................................... 80

FIGURA 43. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELO ENSAIO DE FRAP,

DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO FRUTOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO


FIGURA 44. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELO ENSAIO DE FRAP,

DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO SACAROSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO,

AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO ................................................... 82

FIGURA 45. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELO ENSAIO DE TEAC,

DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO GLICOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO



DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO FRUTOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO



DOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO SACAROSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO,

AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO ................................................... 85

FIGURA 48. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, MEDIDA

POR FRAP E TEAC (AUC MMOL DE TROLOX.MIN/L) DOS SISTEMAS-MODELO

INVESTIGADOS QUANDO AGRUPADOS POR AÇÚCAR (A) E POR AMINOÁCIDO (B). ............... 86

FIGURA 49. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (MMOL TROLOX/L), MEDIDA PELO ENSAIO DE FRAP (A)

E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO (B), AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB

REFLUXO DE UMA SOLUÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO EM TAMPÃO ACETATO.. ............................. 87

FIGURA 50. CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO (ΜG/ML) NOS SISTEMAS-MODELO CONTENDO

GLICOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO ..................................... 88


FRUTOSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO. ................................... 88


SACAROSE AO LONGO DE 6 HORAS DE AQUECIMENTO SOB REFLUXO. ................................. 89

FIGURA 53. CONCENTRAÇÃO (µG/ML) DE ÁCIDO GÁLICO NOS TEMPOS INICIAL (T=0 MIN, ☐) E

FINAL (T=360 MIN, ■) DE REAÇÃO. ................................................................................... 90

FIGURA 54. CONCENTRAÇÃO (MOL/L) DOS AÇÚCARES (GLICOSE, FRUTOSE E SACAROSE) (A) E

DOS AMINOÁCIDOS (GLICINA, ARGININA E LISINA) (B) NOS TEMPOS INICIAL (T=0 MIN, ☐) E

FINAL (T=360 MIN, ■) DE REAÇÃO NOS SISTEMAS-MODELO COM ADIÇÃO DE ÁCIDO

GÁLICO. ............................................................................................................................. 91


MODELO CONTENDO GLICOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO LONGO DE 6



MODELO CONTENDO FRUTOSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO LONGO DE 6



MODELO CONTENDO SACAROSE, ADICIONADOS OU NÃO DE ÁCIDO GÁLICO, AO LONGO DE 6


FIGURA 58. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO NA FORMAÇÃO DE 5-

HIDROXIMETILFURFURAL (5-HMF) (AUC, ΜG.MIN/ML). OS SISTEMAS-MODELO FORAM

AGRUPADOS EM DOIS GRUPOS DISTINTOS: POR AÇÚCAR (A) E POR AMINOÁCIDO (B) ......... 95

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1. CONJUNTO DE COMPOSTOS DE FRAGMENTAÇÃO PRIMÁRIA DA REAÇÃO DE

MAILLARD ......................................................................................................................... 23

QUADRO 2. MODIFICAÇÕES NA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO CAFÉ OCASIONADAS PELO PROCESSO

DE TORREFAÇÃO. ............................................................................................................... 30

QUADRO 3. TEOR DE ACRILAMIDA (ΜG/ KG) EM ALIMENTOS..................................................... 36

QUADRO 4. TEOR DE AMINAS AROMÁTICAS HETEROCÍCLICAS (AAH) (NG/G) EM

ALIMENTOS. ....................................................................................................................... 39

QUADRO 5. PRINCIPAIS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DO HIDROXIMETILFURFURAL ........... 40

QUADRO 6. TEOR DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL (MG/KG) EM ALIMENTOS............................... 41

QUADRO 7. PRINCIPAIS SUBCLASSES DE ÁCIDOS FENÓLICOS E EXEMPLOS DE SUA OCORRÊNCIA

EM ALIMENTOS................................................................................................................... 46

QUADRO 8. RELAÇÃO ENTRE O CONSUMO DE AÇÚCARES E AMINOÁCIDOS NA REAÇÃO DE

MAILLARD EM SISTEMAS-MODELO .................................................................................... 71

QUADRO 9. RELAÇÃO MOLAR ENTRE O CONSUMO DE AÇÚCARES E AMINOÁCIDOS NOS SISTEMAS-

MODELO CONTENDO ÁCIDO GÁLICO EM COMPARAÇÃO COM OS SISTEMAS-MODELO SEM

ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO ................................................................................................. 92

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-CQA – Ácido-5-cafeoilquínico

5-HMF – 5-hidroximetilfurfural

5-SMF – 5-sulfoximetilfurfural

AA – Atividade Antioxidante

Aa – Atividade de água

AAFRAP – Atividade Antioxidante mensurada pelo ensaio FRAP

AAH – Aminas Aromáticas Heterocíclicas

AATEAC – Atividade Antioxidante mensurada pelo ensaio TEAC

ABTS – 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)

AUC – do inglês, Area Under Curve

FAL – Fenilalanina Amônia- liase

FRAP – do inglês, Ferric Reducing Antioxidant Power

GA – do inglês, Ácido Gálico

GC/MS – do inglês, Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry

HMFA – 5-hidroximetil-ácido-furóico

HMFG - Hidroximetil-2-furoil-glicina

HPLC – do inglês, High Performance Liquid Chromatography

HPLC-DAD – do inglês, High Performance Liquid Chromatography coupled to Diode Array

Detector

HPLC-ELSD – do inglês High Performance Liquid Chromatography coupled to Evaporative

Light Scattering Detector

IARC – do inglês, International Agency for Reserch on Cancer

LC-MS-MS – do inglês, Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometry

ORAC – do inglês, Oxygen Radical Absorbance Capacity

pH – Potencial Hidrogeniônico

RM – Reação de Maillard

SM – Sistema-modelo

TEAC – do inglês, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity

TPTZ – (2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 16

2. OBJETIVOS 18

2.1. GERAL 18

2.2. ESPECÍFICOS 18

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19

3.1. REAÇÃO DE MAILLARD 19

3.1.1. Química da Reação de Maillard 20

3.1.1.1 Conjunto principal de compostos da Reação de Maillard 21

3.1.1.2. Conjunto de compostos de fragmentação primária, de auto- interação e de

interação secundária da Reação de Maillard 23

3.1.1.3 Conjunto de compostos de interação múltipla da Reação de Maillard 27

3.1.2. Fatores que afetam a Reação de Maillard 28

3.1.3. Implicações sensoriais da Reação de Maillard em alimentos 29

3.1.4. Implicações da Reação de Maillard na composição química de alimentos 33

3.2. INTERMEDIÁRIOS DA REAÇÃO DE MAILLARD 36

3.2.1. Acrilamida 36

3.2.2. Aminas aromáticas heterocíclicas (AAH) 38

3.2.3. 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) 39

3.3. COMPOSTOS FENÓLICOS 43

3.3.1. Ácidos fenólicos 46

3.3.3. Derivados do ácido cinâmico 46

3.3.2. Derivados do ácido benzóico 47

3.3.2.1. Ácido gálico 48

4. MATERIAIS E MÉTODOS 50

4.1. REAGENTES 50

4.2. TESTES PRELIMINARES 50

4.3. PREPARO DOS SISTEMAS-MODELO 50

4.3. INTENSIDADE DO ESCURECIMENTO 51

4.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 52

4.4.1. FRAP 52

4.4.2. TEAC 52

4.5. CONSUMO DOS REAGENTES DA REAÇÃO DE MAILLARD 53

4.5.1. Açúcares e aminoácidos 53

4.5.2. Ácido gálico 54

4.6. FORMAÇÃO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL 55

4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 55

5.1. TESTES PRELIMINARES 56

5.2. INTENSIDADE DO ESCURECIMENTO 58

5.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 63

5.4. CONSUMO DOS REAGENTES E FORMAÇÃO DE

5-HIDROXIMETILFURFURAL 69

5.5. EFEITO DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO SOBRE A REAÇÃO DE

MAILLARD EM SISTEMAS-MODELO 75

5.5.1. Intensidade de escurecimento 75

5.5.2. Atividade antioxidante 80

5.5.3. Consumo dos reagentes e formação de 5-hidroximetilfurfural 88

6. CONCLUSÃO 96

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97

16

1. INTRODUÇÃO

A Reação de Maillard (RM) compreende diversas vias de reações químicas

responsáveis pelo desenvolvimento de cor, sabor, aroma, flavor e textura em alimentos

processados termicamente (Bastos et al., 2011). A ocorrência da reação pode ser influenciada

por diversos fatores, tais como o pH, os aspectos qualitativos e quantitativos dos reagentes, a

atividade da água, e a temperatura, sendo esse último o mais importante (Ribeiro e Seravalli,

2007). O desenvolvimento da RM tem seu início no ataque nucleofílico do grupamento

carbonila de um açúcar redutor a uma amina (proveniente de aminoácidos ou proteínas)

(Hodge, 1953). Segue-se, então, uma etapa intermediária, caracterizada pela fragmentação de

açúcares, aminoácidos e produtos de Amadori e de Heyns. Os produtos finais da RM são

compostos heterogêneos, nitrogenados e de elevado peso molecular denominados

melanoidinas, responsáveis pelo desenvolvimento de coloração marrom característica nesses

alimentos (Wang et al., 2011). Além do impacto sensorial, já foram relatados efeitos

possivelmente benéficos das melanoidinas no organismo humano, tais como atividade

prebiótica (Ludwig et al., 2014) e prevenção a danos oxidativos (Moreira et al., 2012).

Entretanto, além desses produtos, substâncias potencialmente tóxicas ao organismo humano

podem ser geradas durante a RM (Omaye, 2004), tais como a acrilamida e o 5-

hidroximetilfurfural (5-HMF) (Fogliano e Capuano, 2011).

A complexidade e a diversidade da RM tornam difíceis a elucidação de seus

mecanismos em alimentos (Martins et al., 2001). Um dos aspectos que contribuem para a alta

complexidade da RM nessas matrizes é a possibilidade de outros componentes, além dos

açúcares e aminoácidos, participarem da reação, tais como lipídeos (Nursten, 2005) e

compostos fenólicos. A incorporação de compostos fenólicos à estrutura de melanoidinas já

foi relatada em café (Perrone et al., 2012) e pão (Alves e Perrone, 2015). Em sistemas-modelo

(SM), utilizados para melhor controle do meio reacional e exclusão de interferentes presentes

em matrizes alimentares, a influência de alguns compostos fenólicos (e.g. epicatequina, ácido

ferúlico e ácido clorogênico) sobre a RM já foi investigada (Totlani e Peterson, 2007; Silván

et al., 2011, Bin et al., 2012; Zhang et al., 2016). Entretanto, ainda não foi avaliada a

influência do ácido gálico (GA) na RM em SM. A escolha do GA justifica-se por sua

estrutura química simples, por sua elevada atividade antioxidante (AA) e por estar presente

em uma grande variedade de alimentos vegetais, tanto em sua forma livre quanto na forma de

galotaninos. Tendo em vista os aspectos observados e levando em consideração a

17

complexidade da RM, esses resultados possibilitarão a realização de novos estudos a fim de

elucidar os mecanismos pelos quais ocorre a formação de substâncias derivadas de compostos

fenólicos via RM.

18

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

o Investigar a participação do ácido gálico na Reação de Maillard em sistemas-modelo

contendo açúcares e aminoácidos livres.

2.2. ESPECÍFICOS

o Determinar a intensidade de escurecimento e a atividade antioxidante em sistemas-

modelo da Reação de Maillard contendo combinações de diferentes açúcares (glicose,

frutose e sacarose) e aminoácidos (glicina, alanina, prolina, lisina e arginina),

adicionados ou não de ácido gálico;

o Avaliar o consumo de reagentes e a formação de 5-hidroximetilfurfural em sistemas-

modelo da Reação de Maillard contendo combinações de diferentes açúcares (glicose,

frutose e sacarose) e aminoácidos (glicina, lisina e arginina), adicionados ou não de

ácido gálico;

o Investigar associações entre a intensidade de escurecimento, a atividade antioxidante,

a formação de 5-hidroximetilfurfural e o consumo de reagentes nos sistemas-modelo

investigados;

o Investigar o efeito da adição de ácido gálico sobre a Reação de Maillard, no que se

refere à intensidade de escurecimento, à atividade antioxidante, à formação de 5-

hidroximetilfurfural e ao consumo de açúcares e aminoácidos.

19

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. REAÇÃO DE MAILLARD

O nome dado à reação é uma homenagem ao químico francês Louis Camil le Maillard

(1878-1936). Em meados de 1912, através do estudo de aminoácidos e açúcares submetidos

ao aquecimento, Maillard sugeriu que os compostos químicos responsáveis pela produção de

CO2 e de coloração marrom (aos quais denominou de melanoidinas) eram gerados através de

um mecanismo de reação específico (Somoza e Fogliano, 2013). Maillard prosseguiu seus

estudos a fim de elucidar tais mecanismos e, em 1953, foi publicado o primeiro esquema geral

de compreensão da reação que ocorre entre açúcares e aminoácidos sob aquecimento em SM,

denominada então de RM (Hodge, 1953). Devido à sua extrema complexidade, a RM ainda

não foi plenamente elucidada. A dificuldade em esclarecer todas as rotas da reação pode ser

explicada pela possibilidade de produtos intermediários e finais variarem em função de

diferentes substratos e condições de reação (Nursten, 2005; Somoza e Fogliano, 2013).

Em alguns alimentos processados termicamente (como por exemplo, o cacau e o café),

a RM é responsável por gerar os atributos sensoriais (cor, aroma, flavor e textura)

fundamentais na aceitação e caracterização desses produtos (Rizzi, 1994; Martins et al.,

2001). Entretanto, no caso de alimentos nos quais esses atributos sensoriais não são desejáveis

(sucos pasteurizados, leite em pó e produtos submetidos a tempos de estocagem prolongados,

por exemplo), é necessária a utilização de técnicas que visam prevenir ou inibir o

desenvolvimento da reação (Nursten, 2005).

Recentemente, foi reconhecido o fato de que a RM também pode ocorrer in vivo. Os

produtos da RM gerados sob condições fisiológicas, em humanos, na presença de glicose,

foram denominados de “produtos de glicação avançada” (Singh et al., 2001). Esses compostos

parecem estar relacionados com o processo de envelhecimento, com algumas doenças

neurodegenerativas e com o diabetes mellitus (Goh e Cooper, 2008; Takeuchi e Yamagishi,

2008; Grillo e Colombatto, 2008).

Os principais aspectos químicos, nutricionais e fisiológicos da RM serão abordados

nos tópicos a seguir.

20

3.1.1. Química da Reação de Maillard

A primeira descrição dos mecanismos da RM está baseada na sua classificação em três

diferentes estágios (Hodge, 1953) e ainda é bastante aplicada nos dias de hoje. Entretanto,

devido à complexidade da reação e às descobertas ao longo das últimas décadas, outra

descrição da RM foi proposta a partir de uma abordagem conceitual (Yaylayan, 1997)

(Figura 1).

Figura 1. Descrição e classificação da Reação de Maillard : Uma abordagem conceitual (Fonte:Adaptado de

Yaylayan, 1997).

Nessa nova abordagem, Yaylayan (1997) dividiu a RM em "pools", que podem ser

traduzidos do inglês como conjuntos, classificados a partir dos diferentes conjuntos de

compostos formados. Essa descrição da RM será detalhada a seguir.

21

3.1.1.1 Conjunto principal de compostos da Reação de Maillard

O conjunto principal de compostos da RM, segundo Yaylayan (1997), é análogo ao

estágio inicial da reação, proposto por Hodge (1953). Sendo assim, consiste nos compostos

formados pela condensação de um açúcar com um aminoácido e pela reação de rearranjo de

Amadori (no caso de aldoses) ou de Heyns (cetoses). Desta forma, esse conjunto de

compostos é formado por 3 precursores bem definidos: açúcares, aminoácidos e produtos de

Heyns ou de Amadori. O tipo, bem como as proporções desses precursores, sob condições

específicas, irão determinar o rumo da reação (Yaylayan. 1997).

Considerando que a função aldeído ou cetona provém de um açúcar redutor (aldose ou

cetose, respectivamente) e a amina primária provém de um aminoácido ou proteína, a

condensação dessas substâncias dá origem a uma imina através de adição nucleofílica ao

grupo carbonila do açúcar redutor (Figura 2). A faixa de pH ótima dessa reação é entre 4 e 5

(Solomons et al., 2013).

A partir da imina formada (Base de Schiff) origina-se a glicosamina-N-substituída

(Figura 2), um composto cíclico e instável.

Figura 2. Formação da glicosamina-N -substituída a partir de uma aldose (Fonte: Adaptado de Nursten, 2005)

A formação da glicosamina-N-substituída é fundamental para que ocorra o rearranjo

de Amadori ou de Heyns. O produto final dessa reação é a 1-amino-1-desoxi-2-cetose

(produto de Amadori) ou a 2-amino-2-desoxi-1-aldose (produto de Heyns). Na Figura 3 é

possível observar a geração do produto de Amadori a partir da formação e isomerização do

22

íon imônio (Püssa, 2013; Rufián-Henarez e Pastoriza, 2016). As reações de rearranjo são

irreversíveis e os produtos formados são estáveis devido a sua conformação hemiacetal

semelhante à de carboidratos (Rufián-Henarez e Pastoriza, 2016).

Figura 3. Formação do produto de Amadori (forma cetônica) a part ir da g licosamina-N -substituída (Adaptado de

Nursten, 2005)

A formação do produto de Heyns ocorre de forma semelhante ao de Amadori. As

diferenças entre as estruturas dos produtos de Amadori e de Heyns são exemplificadas na

Figura 4.

Figura 4. Diferenças estruturais entre os produtos de Amadori e Heyns (Fonte: Adaptado de Yaylayan, 1 997)

23

3.1.1.2. Conjunto de compostos de fragmentação primária, de auto- interação e de interação

secundária da Reação de Maillard

Os compostos de fragmentação primária são provenientes da decomposição dos

compostos do conjunto principal. As reações que ocorrem nessa etapa são análogas àquelas

do estágio intermediário da RM (Hodge, 1953). Sendo assim, esse conjunto compreende

todos os compostos gerados pela fragmentação de açúcares, de aminoácidos e de produtos de

Amadori e de Heyns (Quadro 1).

Quadro 1. Conjunto de compostos de fragmentação primária da Reação de Maillard

Compostos originados a partir da fragmentação dos produtos de Amadori e de Heyns

Derivados C3: Produto de Amadori-gliceraldeído, propanona-aminoácido, propanal-

aminoácido, etc;

Derivados C4: tetradiuloses-aminoácido, butanonas-aminoácido;

Derivados C5: pentadiuloses-aminoácidos;

Derivados C6: hexadiuloses-aminoácidos, betaína pirílium.

Compostos originados a partir da fragmentação dos açúcares

Fragmentos C1: formaldeído, ácido fórmico;

Fragmentos C2: glioxal, glicoaldeído, ácido acético;

Fragmentos C3: gliceraldeído, piruvaldeído, hidroxiacetona, dihidroxiacetona, etc.;

Fragmentos C4: tetroses, 2,3-butanodiona, 1-hidroxi-2-butanona, 2-hidroxibutanal, etc.;

Fragmentos C5: pentoses, pentuloses, derivados desoxi, furanonas, furanos;

Fragmentos C6: piranonas, furanos, glicosonas, desoxiglicosonas.

Compostos originados a partir da fragmentação dos aminoácidos

Aminas;

Ácidos carboxílicos;

Alcanos e compostos aromáticos;

Fragmentos de cadeias laterais específicas.

Fonte: Adaptado de Yaylayan, (1997)

24

Os compostos de fragmentação primária podem interagir de três formas na RM: 1)

Com compostos de um mesmo conjunto, formando os chamados compostos de auto-

interação; 2) Com componentes de outros conjuntos, formando os compostos de interação

secundária; 3) Com componentes de todos os tipos de conjuntos, formando os compostos de

interação múltipla (Yaylayan, 1997).

Os fragmentos dos produtos de Amadori e de Heyns podem dar origem a produtos de

fissão ou seguir por duas rotas principais (Ames, 2003; Nursten, 2005; Rufián-Henarez e

Pastoriza., 2016):

1) Em pH < 5: Enolização 1,2 via 3-desoxi-1,2-dicarbonis com consequente formação de

furfural (pentoses) ou 5-hidroximetilfurfural (hexoses);

2) Em pH > 7: Enolização 2,3 via 1-desoxi-2,3-dicarbonis com consequente formação de

redutonas.

Essa mesma lógica é utilizada para descrever os mecanismos pelos quais ocorre a

desidratação de açúcares (Ames, 2003; Nursten, 2005). Mas, de forma distinta, a

fragmentação de açúcares advém, em sua maioria, de reações de retro-aldolização, apesar de

ser reconhecido que processo de fissão oxidativa (através da clivagem de α- e β-dicarbonis)

também tenha uma participação significativa nesse processo (Nursten, 2005).

Complementarmente, através da técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de

massas (CG-MS), foi observado que a clivagem de derivados da hexose poderia ocorre r entre

C5/C1, C4/C2 ou C3/C3 (Tressl et al., 1995). É possível observar na Figura 5 que

fragmentos de açúcares podem ser originários não só dos açúcares diretamente, como também

de desoxiozonas, produtos de Amadori e produtos de Heyns (Nursten, 2005).

25

Figura 5. Exemplos de rotas de fragmentação de açúcares na Reação de Maillard (Fonte: Adaptado de Nursten,

2005)

Em estudo acerca da formação de ácidos carboxílicos de cadeia curta em sistemas-

modelo (SM) de RM, demontrou-se que existe uma forte evidência da coexistência de duas

novas rotas de fragmentação de hexoses. A primeira é a clivagem hidrolítica de β-

dicarbonilados (B1 e B2), considerada o principal mecanismo de clivagem, enquanto a

segunda é a clivagem oxidativa de α-dicarbonis (A1 e A2), considerada o mecanismo

alternativo de clivagem, sendo fortemente induzido por espécies reativas de oxigênio

(Davidek et al., 2006) (Figura 6).

26

Figura 6. Esquemas de possíveis mecanis mos de clivagem h idrolítica de β -dicarbonis (B1/B2) e clivagem

oxidativa de α-d icarbonis (A1/A2) (Fonte: Adaptado de Davidek et al., 2006)

A produção de alguns compostos dicarbonilados, a partir da fragmentação de açúcares,

em SM da RM e da caramelização (sem componente amínico) também já foi avaliada

(Weenen e Apeldoorn, 1996). Observou-se que os SM de caramelização apresentaram menor

produção de compostos dicarbonilados quando comparados com os meios reacionais de

Maillard. Este comportamento pode ter relação com a degradação de Strecker, que é

caracterizada pela produção de um aldeído a partir da degradação de um α-aminoácido (Rizzi,

1999; Martins et al., 2001).

A degradação de Strecker apresenta papel fundamental no desenvolvimento do flavor

e do aroma característicos da RM. Ambos os atributos são fatores fundamentais na

caracterização sensorial de alimentos submetidos a processamentos térmicos como, por

exemplo, a cocção e a torrefação (Van Boekel, 2006). Primeiramente, foi proposta a teoria de

27

que compostos carbonilados promoveriam a desidrogenação de um α-aminoácido, gerando

um iminoácido que, em meio aquoso, daria origem a uma molécula de CO2, de NH3 e de

aldeído de Strecker (Schonberg e Moubacher, 1952). Apesar dessa teoria ainda ser válida

atualmente, há indícios da existência de possíveis rotas de formação do aldeído de Strecker

que independem desse mecanismo de reação clássico. Como por exemplo, a partir de

aminoácidos por descarboxilação oxidativa, promovida ou não por α-dicarbonilados, a partir

de aminoácidos por decomposição térmica ou a partir de produtos de Amadori (Yaylayan,

2003).

É importante citar que a reação que origina o aldeído de Strecker acontece somente

com a presença de aminoácidos livres na matriz. Entretanto, a RM desenvolve-se facilmente

no leite, por exemplo, apesar da escassez de aminoácidos livres no meio. Uma teoria é que a

degradação ocorre por meio da reação com as cadeias laterais reativas dos resíduos de lisina

(Van Boekel, 2006). É necessário levar em consideração que a geração de diferentes tipos de

flavor a partir de peptídeos depende de alguns fatores, como por exemplo: posição do

aminoácido, tamanho do peptídeo e a resistência das ligações peptídicas (Izzo e Ho, 1992).

3.1.1.3 Conjunto de compostos de interação múltipla da Reação de Maillard

As interações múltiplas são análogas aos estágios finais da RM propostos por Hodge

(1953). Nessa etapa, ocorre a formação de compostos poliméricos e de alto peso molecular,

denominados melanoidinas (Yaylayan, 1997; Wang et al., 2011). Atualmente, entende-se por

melanoidinas o grupo de compostos heterogêneos, nitrogenados, de alto peso molecular, na

maior parte dos casos, e que são comumente identificados nos comprimentos de onda cujos

valores variam entre 360 nm e 420 nm (Wang et al., 2011). Apesar dos mecanismos que

levam à formação das melanoidinas serem desconhecidos, algumas teorias relativas ao

assunto já foram propostas. São elas:

1) Agrupamento de melanoidinas de baixo peso molecular com a cadeia lateral reativa

de aminoácidos como lisina, cisteína e arginina (Wang et al., 2011).

2) Polimerização de compostos de baixo peso molecular nos estágios finais da reação,

como por exemplo, os furanos (Hayase et al., 2006).

3) Condensação aldólica de compostos derivados do -dicarbonil (reação dependente

de pH e temperatura) (Kroh et al., 2008).

28

Alguns estudos também indicam a possível formação das melanoidinas a partir da

incorporação de outros compostos da matriz alimentar à sua estrutura, além dos carboidratos e

aminoácidos como, por exemplo, os compostos fenólicos (Bekedam et al., 2008; Perrone et

al., 2012).

3.1.2. Fatores que afetam a Reação de Maillard

O conhecimento sobre os fatores que exercem influência na RM é de suma

importância na área de alimentos, pois permite que os mesmos possam ser controlados para

intensificar ou até mesmo impedir a ocorrência da reação (Ames, 2003).

Os tipos de reagentes e suas concentrações são exemplos de fatores que influenciam

diretamente nos produtos formados na RM (Ribeiro e Seravalli, 2007; Borelli et al., 2002).

Considerando os açúcares, especialmente os redutores, a ordem decrescente de reatividade é:

pentose > hexose (aldose > cetose) > dissacarídeos (Ribeiro e Seravalli, 2007; Laroque et al.,

2008). A utilização da sacarose na RM representa um caso especial, pois suas terminações

redutoras estão ocupadas por uma ligação glicosídica e, portanto, sua estrutura precisa ser

hidrolisada para que seus respectivos monômeros redutores (glicose e frutose) atuem na

reação. Quanto aos tipos de aminoácidos, a ordem decrescente de reatividade é: básico >

ácido > neutro, sendo a lisina o mais reativo por conta de sua cadeia lateral reativa (ε-amino).

Logicamente, a velocidade de reação é afetada em função do ponto isoelétrico de cada

aminoácido (Deman, 1999).

Como mencionado anteriormente, o pH do meio é de extrema importância na

determinação do curso da reação. Em valores de pH próximos à neutralidade, a velocidade da

reação atinge valores máximos (Arnoldi, 2004). Em contrapartida, a diminuição do pH

promove a protonação do grupamento NH2, eliminando a nucleofilicidade desse grupo e,

consequentemente, impedindo sua interação com as carbonilas dos açúcares redutores

(Arnoldi, 2004; Ribeiro e Seravalli, 2007; Brião et al., 2011). Paralelamente, é importante

atentar ao fato de que, durante a RM, são gerados compostos de caráter ácido responsáveis

pela diminuição do pH do meio reacional (Martins e Van Boekel, 2005).

O tempo e a temperatura agem de forma independente entre si, de forma que maiores

tempos de reação e menores temperaturas poderão formar um perfil de compostos distinto s de

quando a reação for realizada de maneira inversa (Ames, 2003). Vale destacar que a RM

ocorre de forma lenta em temperaturas mais amenas e apresenta aumento expressivo na

velocidade de reação a partir dos 40 ºC (Shibao e Bastos, 2011).

29

A atividade de água (Aa) também é um fator a ser considerado por dificultar a

ocorrência da RM se muito alta ou muito baixa. A faixa ótima de Aa para este fim

compreende valores entre 0,5 e 0,8 (Ames, 2003; Arnoldi, 2004). A diminuição da velocidade

da RM em valores elevados de Aa deve-se à água ser um produto formado em diversas etapas,

o que desloca os equilíbrios químicos na direção dos reagentes.

Alguns íons são conhecidos por atuarem como catalisadores da RM. Foi observado o

tampão fosfato, quando adicionado no meio reacional de Mailllard, praticamente dobrou a

taxa de reação quando comparado ao tampão Bis/Tris (Rizzi, 2004). Em contrapartida,

sulfitos são conhecidos pela sua eficiência em praticamente interromper a reação em seu

estágio inicial (Nursten, 2005).

3.1.3. Implicações sensoriais da Reação de Maillard em alimentos

A análise sensorial engloba um conjunto de técnicas que utilizam a percepção humana,

a partir do estímulo dos cinco sentidos, para gerar respostas objetivas a fim de caracterizar

uma matriz (Piggot et al., 1998). A RM é considerada uma das mais importantes reações que

ocorrem em alimentos processados termicamente. Sua ocorrência é responsável por alterar

atributos relevantes na caracterização desses alimentos, como cor, aroma, flavor, sabor e

textura (Bastos et al., 2011) a partir de transformações na composição química do alimento

em questão, tal como observado para o café (Quadro 2). Essas modificações dependem

diretamente da composição da matriz alimentar bem como das condições de reação

(principalmente do tempo e da temperatura) (Wang et al., 2011). Um exemplo da influência

da RM em alimento é o café, apresentado na Figura 7. No caso de algumas matrizes (como

produtos de panificação), a RM ocorre de forma predominante na superfície do alimento em

questão (Jaeger et al., 2010).

30

Quadro 2. Modificações na composição química do café ocasionadas pelo processo de torrefação.

Fonte: Adaptado de Wei e Tanokura, (2014).

Figura 7. Efeito da reação de Maillard no processo de torrefação de grãos de café (Fonte: Adaptado de

Heirloom Coffee, 2016)

Componentes

(% do peso seco)

Arábica Robusta

Grãos de café

(verde)

Grão de café

(torrados)

Grãos de café

(verde)

Grão de café

(torrados)

Polissacarídeos 50,0-55,0 24,0-39,0 37,0-47,0 -

Oligossacarídeos 6,0-6,8 0-3,5 5,0-7,0 0-3,5

Lipídeos 12,0-18,0 14,5-20,0 9,0-13,0 11,0-16,0

Aminoácidos livres 2,0 0 2,0 0

Proteínas 11,0-13,0 13,0-15,0 11,0-13,0 13,0-150

Ácidos clorogênicos 5,5-8,0 1,2-2,3 7,0-10,0 3,9-4,6

Cafeína 0,9-1,2 0-1,0 1,6-2,4 0-2,0

Trigonelina 1,0-1,2 0,5-1,0 0,6-0,8 0,3-0,6

Ácidos graxos 1,5-2,0 1,0-1,5 1,5-2,0 1,0-1,5

Minerais 3,0-4,2 3,5-4,5 4,0-4,5 4,6-5,6

Melanoidinas - 16,0-17,0 - 16,0-17,0

31

A coloração marrom, característica da RM, é responsável por agregar valor a diversos

alimentos, como o café, o cacau, os produtos de panificação e as carnes. A formação desses

cromóforos, denominados melanoidinas, é uma das principais características observadas na

RM (Bastos et al., 2011; Somoza e Fogliano, 2013). Apesar de sua estrutura pouco elucidada,

sabe-se que as melanoidinas são compostos heterogêneos e que, portanto, apresentam

composição que varia de acordo com os componentes da matriz alimentar em questão (Wang

et al., 2011).

O desenvolvimento de aroma e flavor na RM depende das condições de reação, assim

como o desenvolvimento de cor. Em geral, o tempo determina os tipos de compostos

formados, enquanto a temperatura exerce influência em parâmetros cinéticos (Bastos et al.,

2011). Um panorama relativo à formação de compostos voláteis responsáveis pela geração de

flavors é apresentado na Figura 8.

Figura 8. Formação de compostos voláteis precursores de flavors e aromas a partir da Reação de Maillard

(Fonte: Adaptado de Van Boekel, 2006)

32

Os compostos voláteis proveniente da RM podem ser classificados em três grupos

distintos (Nursten, 1981):

1) Derivados da fragmentação ou desidratação de açúcares (furanos, piranos, α-dicarbonis);

2) Derivados da degradação de aminoácidos (aldeídos de Strecker, compostos nitrogenados,

compostos sulfurados);

3) Produzidos pela interação entre açúcares e aminoácidos (pirróis, tiazóis, piridinas).

Podemos citar os furanos e piranos como os compostos mais abundantes na RM. São

responsáveis pelo flavor caramelado e adocicado e estão presentes em todos os alimentos

submetidos à RM (Fisher e Scott, 1997). Quanto à degradação de Strecker, alguns

aminoácidos são precursores de diversos flavors, como os pirróis da prolina e os tiazóis da

cisteína. Esses dois aminoácidos, por exemplo, são responsáveis por caracterizar alimentos à

base de cereais, bem como carnes, respectivamente (Teranishi et al., 1999; Mottram, 2007).

Provenientes das interações entre açúcares e aminoácidos, destaca-se a classe dos pirróis,

amplamente difundida em grãos de café torrados (Mottram, 2007). Além disso, as pirazinas

também são descritas por estarem fortemente relacionadas com notas de torrefação (Arnoldi,

2001). Os ácidos orgânicos produzidos através da degradação de açúcares, apesar de não

estarem descritos no esquema acima por não serem voláteis, podem influenciar no perfil

sensorial do alimento (Fisher e Scott, 1997). Exemplos de ácidos produzidos a partir da RM

são os ácidos fórmico e acético (Martins et al., 2001).

Como já descrito anteriormente, a RM promove complexas interações entre os

componentes de uma matriz alimentar que, consequentemente, são responsáveis por aumentar

a aceitação dos consumidores em relação a esse novo produto. Recentemente, a textura vem

sendo considerada como um objeto de estudo em aspectos sensoriais. Trata-se de uma

propriedade sensorial derivada da modificação estrutural da matriz alimentar (Szczesniak,

2002). A influência da RM sobre a textura dos alimentos ocorre via cross-link de proteínas.

Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais esse mecanismo afeta a textura

dos alimentos (Bastos et al., 2011).

Apesar de atribuir características desejáveis a diversos alimentos, a RM é indesejada

em algumas matrizes e acontece em decorrência de métodos de conservação dependentes de

temperatura, como por exemplo, a pasteurização, a secagem e a esterilização (Martins et al.,

2001; Jaeger et al., 2010; Bastos et al., 2011). Em alimentos com matriz rica em aminoácidos

e açúcares redutores, esse problema é ainda mais crítico. No caso do leite, por exemplo,

33

processamentos térmicos mal executados (pasteurização ou secagem) podem promover

escurecimento e gerar off-flavors que descaracterizam o produto (Van Boekel, 1998).

3.1.4. Implicações da Reação de Maillard na composição química de alimentos

Em meados do século XX, Louis-Camille Maillard foi motivado a dar continuidade

em seus estudos por acreditar que os produtos da RM poderiam desempenhar papéis

importantes na saúde (Somoza e Fogliano, 2013). De fato, atualmente já está descrito que a

RM exerce influências no perfil de nutrientes presentes em matrizes alimentares, o q ue pode

levar à modificações no metabolismo desses compostos nos organismos vivos (Nursten,

2005). Especialmente, estudos sobre os efeitos dos produtos da RM sobre a saúde humana

vêm sendo realizados ao longo das últimas décadas (Somoza, 2005; Ames, 2009; Tessièr e

Birlouez-Aragon, 2012; Ayseli e Ayseli, 2016). Os produtos da RM vêm sendo estudados

quanto à sua toxicidade (Lee e Shibamoto, 2002) e relação com doenças crônico-

degenerativas (Zhang et al., 2008). Por outro lado, os efeitos benéficos da RM vêm sendo

relatados, principalmente no que diz respeito a formação de substâncias com potencial

atividade antioxidante (AA). As principais consequências da RM, do ponto de vista

nutricional, estão citadas abaixo e serão explicadas ao longo dos próximos parágra fos. São

elas (Friedman, 1996; Martins et al., 2001; Rufián-Henares e Pastoriza, 2016):

1) Perda nutricional de aminoácidos essenciais e de algumas vitaminas;

2) Diminuição da atividade de enzimas;

3) Interações com íons;

4) Formação de substâncias potencialmente mutagênicas e/ou carcinogênicas;

5) Aumento da atividade antioxidante;

6) Formação de substâncias antimutagênicas;

7) Formação de substâncias com atividade antimicrobiana.

Os ácidos ascórbico e dehidroascórbico podem participar da RM sem que suas funções

biológicas como nutrientes fiquem comprometidas (Nursten, 2005). Entretanto, outras

vitaminas, principalmente aquelas que apresentam grupamento amino livre, como a tiamina, a

piridoxina, a colabamina e o ácido pantotênico, podem participar da RM gerando perdas

nutricionais (Rufián-Henares e Pastoriza., 2016).

34

A ocorrência da RM também pode ocasionar na perda de aminoácidos em matrizes

alimentares, pois os mesmos são utilizados como substratos nessa reação. Apesar da

susceptibilidade desses compostos em geral, a perda nutricional de lisina é, indubitavelmente,

um dos fatores que merecem maior atenção, já que lisina não pode ser sintetizada pelo

organismo humano e, portanto, é obtida exclusivamente pela alimentação (Oetterer et al.,

2006). Outro fator agravante é que seu grupo ε-amino continua reativo mesmo em peptídeos e

proteínas, o que a torna propensa a maiores perdas nutricionais durante o processamento de

matrizes alimentares as quais está inserida (Nursten, 2005). Em países nos quais a base da

alimentação são os cereais, a lisina é o aminoácido mais limitante na dieta (Baker, 2007). Isso

significa que, mesmo que esse aminoácido esteja presente em baixas quantidades na dieta,

todos os outros aminoácidos presentes, mesmo que em quantidades suficientes, serão

mobilizados para a síntese proteica na mesma proporção (Matthews, 2012).

Visto que as enzimas constituem um grupo de substâncias de natureza proteica, a

diminuição da atividade enzimática, tanto em alimentos como em organismos vivos se dá por

glicação ou por interação com as melanoidinas (Nursten, 2005). Consequentemente, esse

mecanismo pode levar a prejuízos na digestibilidade de proteínas e carboidratos mediante a

influência na atividade de proteases e glicosidases (Arnoldi, 2001; Ames, 2003). Por

exemplo, foi demonstrado o forte efeito inibitório da polifenol-oxidase e da peroxidase a

partir de diferentes ensaios in vitro, tanto utilizando-se produtos da RM derivados de SM

(Maillard et al., 2007) quanto de alimentos (Nicoli et al., 1991) que poderia ser interessante

do ponto de vista tecnológico, já que essas enzimas, quando em contato com O2, causam

escurecimento (muitas vezes indesejado) em tecidos vegetais (Gava et al., 2009).

A RM também pode exercer efeitos de interação com outros nutrientes. Como

exemplo, o poder quelante da RM sobre metais pode ser atribuído às melanoidinas, por conta

da natureza aniônica desses compostos, bem como a outros produtos formados ao longo da

RM (como as redutonas, por exemplo) (Ames, 2003; Wang et al., 2011). Sendo assim, podem

haver perdas nutricionais de metais importantes na nutrição humana, tais como Cu+2, Zn+2,

Fe+2 e Ca+2 (Rufián-Henares e Pastoriza, 2016). Sob outra perspectiva, a capacidade de quelar

metais, assim como o poder redutor de produtos da RM são fatores que contribuem para a AA

(Ames, 2003; Wang et al., 2011; Rufián-Henares e Pastoriza, 2016). Diversos estudos vêm

demonstrando o poder quelante e de sequestro de radicais livres dos produtos da RM (Yilmaz

e Toledo, 2005; Maillard et al., 2007; Hwang et al., 2011; Vhangani e Van Wyk, 2013). Esse

conjunto de fatores poderia possibilitar a aplicação desses produtos em processos

35

tecnológicos, como o de conservação e estabilidade microbiológica de alimentos (Wang et al.,

2011).

Através da ocorrência da RM em matrizes alimentares, é possível observar a produção

concomitante de produtos que são fundamentais na caracterização sensorial de alimentos

processados termicamente e substâncias potencialmente tóxicas para o organismo humano

(Omaye, 2004). A essas substâncias dá-se o nome de contaminantes alimentares, visto que são

inerentes ao processamento, e pode-se citar como exemplo a acrilamida, a acroleína, os

furanos e as aminas heterocíclicas aromáticas. Para avaliar os riscos que esses contaminantes

representam ao organismo humano, é feita uma identificação e avaliação de perigo aliada a

dados referentes à exposição à substância em questão. Ainda é possível que a substância

exerça sua toxicidade de forma indireta, por exemplo, a partir de algum metabólito (Lineback

e Stadler, 2009).

Por outro lado, produtos da RM, tais como as melanoidinas, podem exercem efeitos

biológicos positivos (Dittrich et al., 2003; Moreira et al., 2012; Ludwig et al., 2014). As

melanoidinas foram capazes de desempenhar diversas atividades biológicas a partir de

diferentes tipos de ensaios, como atividade antimicrobiana (Summa et al., 2008), prebiótica

(Ludwig et al., 2014), antioxidante (Delgado-Andrade et al., 2005; Rufián-Henares e Morales,

2007) e anticâncer (Langner e Rzeski, 2014).

36

3.2. INTERMEDIÁRIOS DA REAÇÃO DE MAILLARD

Nos tópicos a seguir, serão abordados aspectos relativos à caracterização química,

ocorrência em alimentos, mecanismos de formação e toxicidade dos produtos intermediários

da RM de maior relevância em alimentos.

3.2.1. Acrilamida

A acrilamida é uma amida insaturada de fórmula molecular C3H5NO (Figura 9).

Figura 9. Fórmula estrutural da acrilamida

A presença de acrilamida em alimentos foi identificada, pela primeira vez, com o

auxílio de técnicas modernas de análise, como CG-MS e LC-MS-MS (cromatografia líquida

acoplada à espectrometria de massas em tandem, do inglês High performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry) (Tareke et al., 2002). Como é originada no

processamento térmico de alimentos é, portanto, considerada um contaminante alimentar. A

acrilamida pode estar presente em uma diversidade de alimentos, industrializados ou caseiros

(Mills et al., 2009) (Quadro 3).

Quadro 3. Teor de acrilamida (μg/ kg) em alimentos.

Fonte: Adaptado de Mills et al., (2009).

Alimento Acrilamida (µg/kg)

Mínimo Máximo

Batata frita 117 4215

Cereal matinal < 10 1649

Produtos de panificação e biscoitos 18 3324

Chocolate < 2 826

Café 45 935

Chá < 9 567

Papinhas infantis < 10 121

37

A RM consiste na principal via de formação da acrilamida. A sua produção é

potencializada se o aminoácido asparagina juntamente com os açúcares glicose e/ou frutose

estiverem presentes no meio reacional. Compostos como α-dicarbonis e aldeídos também

podem participar dessa reação (Figura 10) (Stadler e Studer, 2016).

Figura 10. Formação de acrilamida a part ir da Reação de Maillard (Fonte: Adaptado de Stadler e Studer, 2016)

A acrilamida é classificada pela Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer,

IARC (do inglês, International Agency for Research on Cancer), como um potencial

composto carcinogênico para humanos (IARC, 1994). O estudo dos efeitos da acrilamida na

saúde humana são dificultados em decorrência da inexistência de um método padronizado

para quantificação dessa substância em alimentos, além das grandes variações desses teores

em função do tipo de alimento e de métodos de cocção (Xu et al., 2014). Sua propensão a

reagir com grupamentos amino e tiol que constituem biomoléculas e sua biotransformação a

38

glicidamina são alguns dos fatores que podem explicar a possível carcinogenicidade da

acrilamida (Rice, 2005).

3.2.2. Aminas aromáticas heterocíclicas (AAH)

Estas substâncias apresentam uma estrutura heterocíclica constituída por carbono,

hidrogênio e nitrogênio e podem ser classificadas quimicamente em dois grupos, polares e

apolares. As AAH polares podem ser ainda classificadas como imidazolquinolinas e

imidazolquinoxalinas e as AAH apolares subdividem-se naquelas que possuem uma fração

piridoindol ou dipiroimidazol) (Figura 11).

Figura 11. Fórmulas estruturais de aminas aromáticas heterocíclicas formadas durante a cocção de carnes

(Fonte: Adaptado de Turesky, 2007)

As AAH polares são formadas geralmente como resultado da RM sob temperatura que

varia entre 150-250 ºC, sendo esse processo dependente de creatinina (Murkovic, 2004;

Turesky, 2007). A formação de AAH apolares normalmente ocorre, em temperaturas

superiores a 250 ºC, através da pirólise de aminoácidos como o triptofano, o ácido glutâmico,

a fenilalanina e a ornitina (Turesky, 2007).

As AAH podem ser encontradas, mais comumente, em peixes e carnes processadas

termicamente (Quadro 4).

39

Quadro 4. Teor de aminas aromáticas heterocíclicas (AAH) (ng/g) em alimentos.

Alimento Teor total de AAH (ng/g)

Bacon frito 7,6 - 19,4

Bife grelhado 1,3

Frango frito 1,1 - 12,0

Peixe grelhado 60,7

Lombo grelhado 11,6

Fonte: Adaptado de Skog et al., 1998

As AAH são compostos químicos com potencial carcinogênico e mutagênico em

bactérias (Murkovic, 2004; Turesky, 2007). Em humanos, embora já existam indícios acerca

de sua toxicidade, os efeitos da ingestão de AAH sobre a saúde humana ainda não foram

esclarecidos. A escassez de informações sobre o metabolismo das diferentes espécies de

AAH, sobre as consequências da ocorrência de polimorfismos e sobre como as AAH

interagem com outros componentes da dieta e com enzimas metabolizadoras de xenobióticos,

por exemplo, contribuem para esse panorama (Turesky et al., 2005; Turesky, 2007).

3.2.3. 5-hidroximetilfurfural (5-HMF)

O 5-HMF (também conhecido como hidroximetilfurfural, 5-hidroximetilfurfural-2-

furaldeído ou 5-hidroximetilfurfural-2-furanocarbaldeído) é um aldeído cíclico, derivado do

furano, que possui seis carbonos em sua estrutura (Figura 12) (Morales, 2009; Kowalski et

al., 2013).

Figura 12. Fórmula estrutural do 5-hidroximetilfurfural

40

As principais propriedades físico-químicas desse composto estão descritas no

Quadro 5.

Quadro 5. Principais propriedades físico-químicas do hidroximet ilfurfural

Propriedades físico-químicas Valores

Fórmula molecular C6H6O3

Peso molecular 126,11 g/mol

Ponto de ebulição 114-116 ºC

Ponto de fusão 32-34 ºC

Ponto de inflamação 79 ºC

Índice de refração 1,5627 (a 18ºC)

Densidade 1,2062 g/cm3

Absorção UV máxima 284 nm

Solubilidade Solúvel em solventes polares

(água, metanol, etanol)

Fonte: Adaptado de Morales (2009) e Kowalski et al. (2013)

A formação de 5-HMF é intrínseca ao ato de submeter um alimento ao tratamento

térmico. Entretanto, o acúmulo dessa substância também pode ocorrer durante o período de

estocagem desses alimentos, especialmente em matrizes ricas em carboidratos precursores de

5-HMF, como por exemplo, o mel (Morales, 2009). No Quadro 6 é apresentada uma relação

de alimentos e seus respectivos teores de 5-HMF.

41

Quadro 6. Teor de 5-hidroximetilfurfural (mg/kg) em alimentos.

Fonte: Adaptado de Morales, (2009)

Em alimentos, a formação de 5-HMF ocorre tanto por vias cíclicas e acíclicas (Van

Putten et al., 2013; Kowalski et al., 2013). A taxa de formação desse composto é dependente

de condições como: tipo de açúcar (especificamente, hexoses), pH, atividade de água e

concentração de cátions divalentes, ácidos orgânicos ou inorgânicos e sais no meio (Morales,

2009; Capuano e Fogliano, 2011).

A reação da glicose com um grupamento amino resulta no tautomerismo entre a base

de Schiff e o composto cíclico glicosilamina-N-substituída. A glicosilamina então sofre uma

série de reações que resulta na formação de um enol (1,2-enaminol) (Angyal, 2001). A partir

dessa etapa, a reação pode seguir por duas vias principais (Kowalski et al., 2013):

1) Isomerização (rearranjo) e ciclizações, que darão origem ao produto de Amadori. Os

tautômeros ceto-enólicos deste produto estão susceptíveis a sofrer reações de desaminação,

desidratação, fragmentação ou enolização, que podem vir a originar 5-HMF;

2) Desidratação do 1,2-enaminol seguida de desanimação e subsequente hidratação, gerando

3-desoxi-2,3-diulose, que é uma substância precursora do 5-HMF;

As etapas que resultam no rearranjo de Heyns e de Amadori são as mesmas. O produto de

Heyns é o 2-amino-2-desoxi-1-aldose na forma cíclica. Entretanto, o precursor de 5-HMF é o

2-amino-2-desoxi-1-aldose na forma acíclica. Esse composto pode apresentar-se como 1-

amino-2-imino (forma tautomérica), que após desaminação e hidratação interconverte-se no

produto de Amadori (1-amino-1-desoxi-2-cetose) e segue pela reação por essa mesma via

(Miljkovic, 2009; Kowalski et al., 2013).

O 5-HMF é uma molécula reativa e, portanto, pode interagir com outros componentes

presentes no meio, como por exemplo, aminas aromáticas (Lewkowski, 2001), aminas

Alimentos Teores de 5-HMF (mg/kg)

Café 100-1900

Malte 100-6300

Mel 10,4-58,8

Pão 3,4-68,8

Cereais matinais 6,9-240,5

Frutas secas 25-2900

Suco de frutas (pasteurizado) 2-22

42

primárias e secundárias (Nikolov e Yaylayan, 2011), em especial com lisina (Mastrocola e

Munari, 2000) e alcoóis (Solomons et al., 2013). Sua degradação ocorre em processamentos

térmicos prolongados e/ou que utilizem temperatura elevada (Morales, 2009).

A metabolização do 5-HMF contempla a sua biotransformação hepática, em especial

quando a forma oxidada 5-hidroximetil-2-ácido furóico (HMFA) está conjugada com o

aminoácido glicina formando o composto hidroximetil-2-furoil glicina (HMFG) (Capuano e

Fogliano, 2011). A ação de sulfotransferases, por exemplo, pode originar o

5-sulfoximetilfurfural (5-SMF) a partir do 5-HMF (Abraham et al., 2011; Sachse et al., 2016).

A toxicidade e a genotoxicidade do 5-HMF não são atribuídos propriamente a ele, mas sim ao

metabólito 5-SMF (Kowalski et al., 2013).

43

3.3. COMPOSTOS FENÓLICOS

Os compostos fenólicos são metabólitos secundários que desempenham papel de

extrema importância no crescimento, reprodução e proteção (contra doenças e predadores

naturais) de plantas (Angelo e Jorge, 2007). Na natureza, as formas glicosiladas e

esterificadas insolúveis desses compostos são mais comumente encontradas que suas formas

solúveis (Shahidi e Naczk, 2003).

Quimicamente, os compostos fenólicos são caracterizados pela presença de uma ou

mais hidroxilas ligadas a um anel aromático (benzeno) (Figura 13) (Vermerris e Nicholson,

2007). Essa forma estrutural básica provê aos compostos fenólicos AA expressiva, seja pelo

mecanismo de sequestro de radicais livres ou pela capacidade de quelar metais (Soares, 2002).

Figura 13. Estrutura química do grupamento fenol

A biossíntese da maioria dos compostos fenólicos em plantas é realizada através da via

do ácido chiquímico, sendo a fenilalanina o aminoácido precursor da maioria das classes de

compostos fenólicos amplamente distribuídos na natureza (Figura 14) (Taiz e Zeiger, 2002).

44

Figura 14. Via metabólica do ácido chiquímico em p lantas (Fonte: Adaptado de Taiz e Zeiger, 2002)

Na Figura 15 é apresentado detalhadamente o surgimento das principais classes e

subclasses de compostos fenólicos presentes na natureza a partir da fenilalanina. A primeira

etapa da reação é catalizada pela enzima fenilalanina amônia- liase (FAL), componente

fundamental na regulação do metabolismo secundário de plantas (Taiz e Zeiger, 2002).

45

Figura 15. Classes e subclasses de compostos fenólicos originados a partir da fen ilalanina (Adaptado de Taiz e

Zeiger, 2002)

Os compostos fenólicos mais amplamente distribuídos na natureza são os ácidos

fenólicos, as cumarinas e os flavonóides (Salunkhe e Chavan, 1989). Nos tópicos a seguir,

serão discutidas as principais características dos ácidos fenólicos, em especial do ácido gálico

(GA), objeto de estudo desse trabalho.

46

3.3.1. Ácidos fenólicos

Essa classe de compostos fenólicos é dividida em dois grupos: derivados do ácido

benzóico e derivados do ácido cinâmico. Ambos os grupos apresentam papel central no

metabolismo das plantas, por serem precursores de outras classes de compostos fenólicos, e

também por estarem susceptíveis a sofrer vários tipos de reações relevantes biologicamente,

como, por exemplo, conjugações, degradações e polimerizações (Harbone, 1989). No Quadro

7 são apresentados alguns exemplos de ácidos fenólicos e sua ocorrência em alimentos.

Quadro 7. Principais subclasses de ácidos fenólicos e exemplos de sua ocorrência em alimentos

Fonte: Adaptado de Zamora-Ros et al., (2013) e Rothwell et al., (2013)

3.3.3. Derivados do ácido cinâmico

A presença de um anel benzênico com um ou mais substituintes hidroxílicos, ligados a

um grupo carbonila por dois carbonos adicionais (em dupla ligação), é o que caracteriza este

grupo quimicamente (Figura 16). Os ácidos ferúlico, cafeíco e quínico são exemplos desses

compostos. Esses compostos fenólicos são predominantemente encontrados na natureza em

suas formas esterificadas (Giada, 2013).

Subclasse Composto fenólico Ocorrência em alimentos

Derivados do ácido

benzoico

Ácido siríngico Pão, pêra, maçã, vinho tinto, tomilho,

azeitona preta

Ácido vanílico Pão, vinho, cerveja, tâmara seca, tomilho,

sálvia, manjericão

Ácido elágico Castanha, frutas vermelhas

Ácido gálico Cerveja, amora, chá preto, sálvia, orégano,

vinagre, cravo-da-índia, castanhas

Ácido benzoico Frutas vermelhas

Derivados do ácido

cinâmico

Ácido ferúlico Trigo, centeio, chocolate amargo, tâmara

seca, manjerona, azeitona verde

Ácido cafeico Frutas vermelhas, maçã, condimentos, ervas,

batata

Ácido cinâmico Azeitona, frutas vermelhas, canela chinesa

Ácido p-coumárico Café, vinho, frutas vermelhas, ervas,

sementes, azeitona verde

47

Figura 16. Estrutura primária dos derivados do ácido cinâmico e os principais exemplos da classe (Fonte:

Adaptado de Giad ia, 2013)

Como exemplo, os ácidos clorogênicos são ésteres formados originados a partir de

alguns dos derivados do ácido hidroxicinâmico com o ácido quínico (Garambone e Rosa,

2007). Esse classe de compostos pode ser encontrada em uma gama de alimentos

amplamente consumidos pelo mundo, como por exemplo: café, cacau, diversos tipos de frutas

e em algumas ervas utilizadas na elaboração de chás (Cammelia sinensis e Ilex

paraguariensis) (Clifford, 1999). Consequentemente, diversos estudos epidemiológicos vêm

sendo feitos a fim de avaliar relações de causa e efeito entre os ácidos clorogênicos

(utilizando esses alimentos fonte) e a saúde humana (Ranheim et al., 2005; Bonita et al.,

2007). Apesar de ainda haver a necessidade de mais estudos que esclareçam essa possível

relação, ensaios in vitro indicam o principal composto dessa classe, o ácido 5-cafeiolquínico

(5-CQA), como um potente antioxidante (Garambone e Rosa, 2007).

3.3.2. Derivados do ácido benzóico

São as substâncias que apresentam a estrutura química mais simples dentre os

compostos fenólicos. Diferem-se dos derivados do ácido cinâmico apenas por apresentarem a

carbonila ligada diretamente ao anel benzênico (Figura 17). Podem ser citados como

exemplos de compostos pertencentes a essa classe os ácidos gálico, valínico, siríngico e p-

hidroxibenzóico (Giada, 2013).

48

Figura 17. Estrutura primária dos derivados do ácido benzóico e os principais exemplos da classe (Fonte:

Adaptado de Giad ia, 2013)

3.3.2.1. Ácido gálico

O composto 3,4,5-ácido trihidroxibenzóico (Figura 18), mais conhecido como GA, é

um ácido orgânico de coloração branca, inodoro e solúvel em água (PubChem, 2016). Fo i

isolado pela primeira vez em meados de 1770 pelo químico suíço Carl Wilhelm Scheele,

através da exposição de uma solução de noz de galha ao ar livre por várias semanas (Haslam,

1992).

Figura 18. Fórmula estrutural do ácido gálico

Em plantas, o GA é comumente encontrado em suas formas esterificadas que são

extremamente diversificadas, podendo variar de simples monoésteres a poliésteres complexos,

de peso molecular elevado, unidos a monômeros de glicose (Haslam, 1992). Por exemplo, o

GA é o principal precursor de taninos hidrolisáveis, como os elagitaninos e galotaninos, sendo

49

essas suas formas amplamente distribuídas na natureza (Lewis e Yamamoto, 1989; Vemerris e

Nicholson, 2007).

Os mecanismos propostos para a biossíntese do GA nos vegetais são (Dewick e

Haslam, 1969) (Figura 19):

A) A partir de fenilalanina, via derivado do ácido cinâmico;

B) A partir do ácido 3-deidrochiquímico (intermediário da via do ácido chiquímico);

C) A partir do ácido protocatecuico (Chandran e Frost, 2001).

Figura 19. Possíveis rotas para a biossíntese do ácido gálico em vegetais (Fonte: Adaptado de Werner et al.,

2004)

Algumas propriedades físico-químicas do GA podem ser explicadas pela sua estrutura

química. Por exemplo, a presença de dois substituintes hidroxílicos na posição meta do anel

benzênico caracteriza uma ligação de hidrogênio mais estável entre os grupamentos hidroxila

e, portanto, essa ligação requer mais energia para ser desfeita. Essa particularidade explica seu

elevado ponto de ebulição e elevada solubilidade (252 ºC e 12 g/L de água, respectivamente)

(Vermerris e Nicholson, 2007; PubChem, 2016).

50

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. REAGENTES

Os seguintes reagentes, com grau analítico, foram utilizados: D-glicose, D-sacarose,

D-frutose, L-glicina, L-prolina, L-alanina, ácido gálico monohidratado, acetato de sódio

anidro, 5-hidroximetilfurfural, 2'-azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS), 2

ácido-6-hidroxi-2,5,7,8 tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox), 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-

triazina (TPTZ), persulfato de potássio (Sigma-Aldrich, Alemanha), L-arginina HCl, metanol,

acetonitrila, ácido acético glacial, ácido fórmico (Tedia, EUA), L-lisina (Bioworld, EUA),

cloreto de ferro hexahidratado (Vetec, Brasil) e ácido clorídrico (Merck).

4.2. TESTES PRELIMINARES

Os testes preliminares consistiram, primeiramente, na escolha do meio reacional: Água

ou sistema-tampão. Após escolha da melhor condição, foram feitos ajustes na faixa de

trabalho de pH bem como na concentração dos açúcares e aminoácidos a fim de obter-se as

melhores condições de análise. A temperatura utilizada no presente estudo (100ºC) foi

escolhida a fim de favorecer o aumento da velocidade de reação da RM (Ames, 1990).

4.3. PREPARO DOS SISTEMAS-MODELO

Os SM foram preparados baseando-se na metodologia empregada por Bailey et al.

(1996). Foram preparadas soluções-estoque dos açúcares (glicose, frutose e sacarose) (1,25

mol/L), dos aminoácidos (glicina, lisina, arginina, prolina e alanina) (1,25 mol/L) e do GA

(0,05 mol/L) em tampão acetato de sódio (1 mol/L). Foi utilizado ácido acético glacial para o

ajuste do pH (5,0) de todas as soluções, com auxílio de um potenciômetro (Hanna HI-2222).

Em um balão de fundo chato foram adicionadas as soluções de açúcares e aminoácidos (10

mL de cada) contendo ou não GA (5 mL do composto fenólico ou 5 mL de tampão acetato de

sódio, respectivamente). Deste modo, os açúcares e os aminoácidos atingiram concentração

final de 0,5 mol/L e o GA, quando presente, de 0,01 mol/L. Posteriormente, as soluções

representativas dos SM foram submetidas ao aquecimento por 360 minutos em banho de óleo

51

mineral termostatizado a 125 ºC (fazendo com que a temperatura no interior do balão

atingisse o valor médio de 100 ºC). O aparato experimental consistiu em um agitador

magnético com aquecimento (IKA C-MAG HS 10) acoplado a um controlador de temperatura

(IKA ETS-D5) e a um condensador de bolas. O experimento foi conduzido no interior de uma

capela.

Para avaliar a reprodutibilidade dos experimentos, triplicatas dos SM Sacarose/Glicina

e Glicose/Lisina foram preparadas. A escolha desses SM foi realizada em função de suas

intensidades de escurecimento, que em ensaios anteriores apresentaram-se pouco intensa e

muito intensa, respectivamente. Ambos os SM apresentaram boa reprodutibilidade no que se

refere à intensidade de escurecimento ao longo do tempo (coeficiente de variação entre

4 e 5 %). Dessa maneira, julgou-se adequado o preparo de apenas uma replicata por SM

investigado no presente trabalho.

Alíquotas (± 2 mL) dos SM foram retiradas nos tempos 0, 60, 120, 180, 240 e 360

minutos, sendo avaliadas quanto à intensidade de escurecimento e à AA após resfriamento em

banho de gelo, realizado com o intuito de interromper a reação. O material foi armazenado em

freezer (-18 ºC) até o momento das demais análises.

Para as análises de quantificação de 5-HMF e GA, alíquotas (± 1,5 mL) nos tempos de

0, 20, 40, 60, 120, 180, 240, 300 e 360 minutos foram retiradas e submetidas imediatamente à

análise após o resfriamento em banho de gelo. As alíquotas referentes aos tempos zero e 360

minutos foram armazenadas em ultrafreezer (-80 ºC) para a realização das análises de

degradação de açúcares e aminoácidos.

4.3. INTENSIDADE DO ESCURECIMENTO

A intensidade do escurecimento foi medida em espectrofotômetro (UV-1800,

Shimadzu), no comprimento de onda de 420 nm, utilizando-se uma cubeta de quartzo com

caminho óptico de 1 cm. Água ultra-pura foi utilizada para diluir as amostras, de zero a 1000

vezes, e também como prova em branco no espectrofotômetro. Os resultados de intensidade

de escurecimento ao longo do tempo foram expressos como área abaixo da curva (AUC, do

inglês, Area Under Curve) (abs.min).

52

4.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A AA in vitro dos SM foi avaliada por dois métodos distintos:

4.4.1. FRAP (do inglês, Ferric reducing antioxidant power)

O método FRAP foi adaptado de Moreira et al. (2005). O mecanismo deste ensaio

consiste na redução do íon Fe+3 presente no complexo Fe+3- TPTZ para Fe+2 em meio ácido

(pH = 3,6). O complexo reduzido apresenta coloração azul escuro e tem absorção máxima em

593 nm (Benzie e Strain, 1996)

Foi preparada uma solução de Trolox 2 mM para a construção da curva padrão. A

partir desta solução-mãe foram realizadas diluições sucessivas para obtenção de soluções de

Trolox nas concentrações de 0,05, 0,1, 0,15, 0,20, 0,30 e 0,35 mM. Em seguida, o reagente de

FRAP [tampão acetato de sódio (300 mM, pH 3,6), TPTZ (10 mM) e cloreto de ferro (20

mM), na proporção de 10:1:1, respectivamente] foi preparado e colocado em banho-maria a

37 °C. Os SM, previamente diluídos (de zero a 625 vezes), foram adicionados à microplaca

(20 μL por micropoço) e, em seguida, o reagente de FRAP foi injetado manualmente (180 μL)

em cada micropoço por meio de uma pipeta multicanal. As amostras foram submetidas à

leitura em espectrofotômetro (VICTOR 1420, Multilabel Counter, Perkinelmer Precisely)

ajustado no comprimento de onda de 595 nm. O tempo de reação do ensaio foi de 4 minutos,

sendo os resultados ao longo do tempo expressos como AUC (mmoles de Trolox.min/L de

amostra).

4.4.2. TEAC (do inglês, Trolox equivalent antioxidant capacity)

O método TEAC foi adaptado de Re et. al (1999). Nesta análise, é testada a habilidade

dos antioxidantes sequestrarem o radical ABTS•+, comparando esta atuação com a solução de

Trolox (Re et al., 1999). As moléculas antioxidantes reduzem o cátion radical ABTS•+ à

ABTS, fazendo com que a solução passe da coloração azul-esverdeada para incolor. O cátion

radical ABTS•+ apresenta absorção máxima em 734 nm (Pinchuk et al., 2012)

No dia anterior à análise foi preparada uma solução de ABTS contendo 0,0066 g de

persulfato de potássio e 0,0384 g de ABTS diluídos com água ultra-pura em um balão

volumétrico de 10 mL. A solução foi envolvida em papel alumínio e mantida em temperatura

53

ambiente no escuro por 12 a 16 horas. No dia de análise, foi preparada uma solução de

trabalho utilizando-se 1 mL da solução estoque de ABTS e 50 mL de água ultra-pura. Essa

solução foi mantida em banho-maria com temperatura em torno de 37 °C. Sua absorbância

inicial foi medida, verificada e, caso necessário, ajustada para apresentar uma absorbância de

0,70 ± 0,02. Para a elaboração da curva padrão, foi utilizada uma solução alcoólica de Trolox

2 mM. A partir dessa solução-mãe, foram preparadas soluções de Trolox nas respectivas

concentrações: 0,05, 0,1, 0,25, 0,50 e 0,75 mM. Os SM, previamente diluídos (de zero a 625

vezes), foram adicionados à microplaca (10 μL em cada micropoço) e, em seguida, a solução

de ABTS•+ foi injetada manualmente (190 μL) em cada micropoço por meio de uma pipeta

multicanal. As amostras foram submetidas à leitura em espectrofotômetro (VICTOR 1420,

Multilabel Counter, Perkinelmer Precisely) ajustado no comprimento de onda de 720 nm. O

tempo de reação do ensaio foi de 6 minutos, sendo os resultados ao longo do tempo expressos

como AUC (mmoles de Trolox.min/L de amostra).

4.5. CONSUMO DOS REAGENTES DA REAÇÃO DE MAILLARD

4.5.1. Açúcares e aminoácidos

Foram preparadas duas soluções-estoque: uma de açúcares (frutose, glicose e

sacarose), utilizando-se água ultra-pura, e outra de aminoácidos (glicina, arginina e lisina),

utilizando-se HCl 0,01 mol/L, em concentrações de 10000 ppm. A partir dessas soluções-

estoque, foram preparadas soluções mais diluídas destes compostos, para a construção da

curva de calibração, nas concentrações de 25, 50, 75, 100 e 200 ppm (para a sacarose ta mbém

foi preparado um ponto de 400 ppm). Os SM, previamente diluídos (100 vezes), foram

submetidos à análise por CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) com detector de

espalhamento de luz evaporativo (ELSD, do inglês Evaporative Light Scattering Detector).

O sistema de cromatografia líquida (Shimadzu, Kyoto, Japan) utilizado foi composto

por bomba quaternária (LC-10Advp), injetor manual (Rheodyne) equipado com alça de

injeção de 20 µL, degaseificador (DGU-14A) e detector (ELSD-LT II) ajustado na

temperatura de 40 ºC, ganho 4 e pressão de fluxo de nitrogênio de 350 kPa. Os teores de

açúcares e aminoácidos foram determinados em duplicata. A separação dos analitos foi

realizada por meio de coluna de fase reversa C18 (SUPELCO, 250 x 4,6 mm, 5 µm),

utilizado-se um fluxo de 1,0 mL/min. O tempo de corrida variou de 5 a 7 minutos. Foi

54

utilizado modo isocrático de eluição com duas fases móveis, uma consistindo em água ultra-

pura acidificada com ácido fórmico (1,0%) e a outra, em acetonitrila, na proporção 99:1,

respectivamente. A quantificação dos açúcares e dos aminoácidos foi realizada por

padronização externa. Entretanto, foi obtida uma resposta não linear do detector ELSD no

presente trabalho, assim como já relatado previamente (Kimball, 2004; Dvoracková et al.,

2014). Deste modo, a quantificação foi realizada a partir da transformação de uma curva de

regressão de potência em um modelo linear, como representado na equação a seguir

(Marcuzzo, 2014):

log (Y) = a log (x) + log (b), em que:

Y = área do analito;

a = inclinação da reta;

x = concentração do analito;

b = intercepto.

A identificação dos analitos de interesse foi realizada por meio da comparação dos

tempos de retenção com seus respectivos padrões. Os resultados foram expressos em mol/L

de amostra.

4.5.2. Ácido gálico

Foi preparada uma solução-estoque de GA utilizando-se água ultra-pura, em

concentrações que variaram de 100 a 200 ppm. A partir dessa solução-mãe, foram preparadas

soluções mais diluídas deste padrão nas concentrações de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 ppm para a

construção da curva de calibração. Os SM, previamente diluídos (100 vezes), foram

submetidos à análise por CLAE com detector de arranjo diodos (DAD, do inglês Diode Array

Detector) no comprimento de onda de 220 nm.

O sistema de cromatografia líquida (Shimadzu, Kyoto, Japan) utilizado foi composto

por bomba quartenária (LC-10Advp), forno (CTO-10Asvp), injetor manual (Rheodyne)

equipado com loop de 20 µL, degaseificador (DGU-14A) e detector de arranjo de diodos

(SPD M10Avp). Os teores de 5-HMF foram determinados em duplicata. A separação dos

analitos foi realizada por meio de coluna de fase reversa C18 (SUPELCO, 250 x 4,6 mm, 5

55

µm) mantida à temperatura constante de 40 ºC. Foi utilizado fluxo de 1,0 mL/min e o tempo

de corrida foi de 10 minutos. A fase móvel A foi composta por água ultra-pura acidificada

com ácido fórmico (0,3%) e a fase móvel B por metanol. Foram utilizadas proporções de 90%

de fase A e 10% de fase B em modo de eluição isocrático. A identificação e quantificação do

GA foram realizadas em comprimento de onda de 220 nm por meio da comparação do tempo

de retenção e espectro de UV do composto nas amostras com os mesmos parâmetros do

padrão externo. Os resultados foram expressos em µg/mL de amostra.

4.6. FORMAÇÃO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL

Uma solução-estoque do composto 5-hidroximetilfurfural foi preparada utilizando-se

água ultra-pura com 10% de metanol, em concentrações que variaram de 100 a 200 ppm. A

partir dessa solução-mãe, foram preparadas soluções deste composto nas concentrações de

0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 ppm para a construção da curva de calibração. Os SM,

previamente diluídos (de 0 a 10 vezes), foram submetidos à análise por CLAE-DAD.

Para a quantificação de 5-HMF nos SM, foi utilizada a mesma metodologia

empregada na quantificação de GA. A identificação do 5-HMF foi realizada em comprimento

de onda de 280 nm por meio da comparação do tempo de retenção e espectro de UV do

composto nas amostras com os mesmos parâmetros do padrão externo. As curvas foram

expressas em µg/mL de amostra. A formação de 5-HMF ao longo do tempo foi expressa em

AUC (µg.min/mL).

4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

A avaliação do efeito da composição do SM (diferentes açúcares e aminoácidos) na

intensidade de cor, AA, consumo de reagentes e formação de 5-HMF foi investigada a partir

de análise de variância (Two-way ANOVA) com pós-teste de Fisher (α = 5%). O efeito da

adição de GA ao SM sobre as variáveis supracitadas foram avaliadas pelo teste t de Student

pareado (α = 5%). O software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc.) foi utilizado

para a realização dessas análises. A existência de possíveis correlações entre as diferentes

análises realizadas no presente estudo foi avaliada em Matriz de Pearson (α = 5 %) por meio

do software Statistica 7.0 (StatSoft Inc.).

56

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. TESTES PRELIMINARES

Inicialmente, avaliou-se a utilização de água ou solução-tampão como solvente do

meio reacional dos SM. Na Figura 20 é apresentada a variação do pH dos SM

Glicose/Glicina e Sacarose/Glicina (ambos na concentração de 1,0 mol/L) quando utilizado

água ou tampão acetato de sódio (1,0 mol/L, pH 5,0) como meios reacionais. A queda gradual

do pH ao longo do desenvolvimento da RM foi observada no presente trabalho, e está de

acordo com os resultados de outros estudos da literatura (Monti et al., 1998; Kim e Lee,

2009). Essa queda é atribuída à perda de grupamentos amino, devido ao seu caráter básico, e à

produção de furfural e ácidos orgânicos, ambas substâncias de caráter ácido (Martins e Van

Boekel, 2005). Apesar do decaimento do pH em ambos os meios reacionais, com os SM

tamponados foi possível minimizar a queda do pH. Além disso, valores de pH menos ácidos

são considerados favoráveis para o desenvolvimento da RM, assim como mais próximos

àqueles observados na maioria das matrizes alimentares. Desta forma, os SM tamponados

foram utilizados para as análises do presente estudo.

Figura 20. Variação de pH dos sistemas-modelo Glicose/Glicina e Sacarose/Glicina utilizando água ou tampão

acetato de sódio 1 mol/L (pH 5,0) como meios reacionais

57

A escolha do tipo de solução-tampão foi baseada em trabalhos previamente relatados

na literatura (Bell, 1997; Rizzi, 2004), os quais sugerem que o sistema tampão utilizado pode

exercer influência sobre a quantidade e os tipos de produtos da RM gerados (Chen e Kitts,

2011). Comparando-se as soluções-tampão de acetato e fosfato, aquelas mais amplamente

utilizadas para esse fim, relata-se a menor influência na RM quando a solução-tampão de

acetato foi utilizada. Por outro lado, íons fosfato e outros ânions poliatômicos podem acelerar

a taxa de escurecimento da RM pelo fornecimento de intermediários reativos que agem

diretamente na degradação dos açúcares (Rizzi, 2004).

Após a escolha do tampão acetato como meio reacional, foi avaliada a influência da

concentração dos reagentes utilizados na intensidade do escurecimento da RM. Na Figura 21

é apresentada a intensidade de escurecimento do SM Glicose/Glicina em três situações: 1)

aminoácidos, açúcares e solução-tampão a 1,0 mol/L; 2) aminoácidos, açúcares e solução-

tampão a 0,2 mol/L; 3) aminoácidos e açúcares a 0,5 mol/L e solução-tampão a 1,0 mol/L.

Observou-se que maiores intensidades de escurecimento à medida em que aumentava-se a

concentração dos reagentes.. Portanto, em função do alto custo dos aminoácidos, foi escolhida

a concentração inicial de 0,5 mol/L para açúcares e aminoácidos, e solução-tampão acetato de

sódio 1 mol/L (pH 5,0), a fim de evitar quedas drásticas de pH e manter a reação na faixa de

pH desejada.

Figura 21. Intensidade de escurecimento do sistema-modelo Glicose/Glicina com reagentes nas concentrações

0,2 mol/L, 0,5 mol/L e 1,0 mol/L. Em ambos os sistemas foi utilizado tampão acetato de sódio (pH 5,0), como

meio reacional, nas concentrações 0,2 mol/L, 1,0 mol/L, respectivamente

58

5.2. INTENSIDADE DO ESCURECIMENTO

O escurecimento dos SM elaborados no presente estudo foi monitorado ao longo de 6

horas de aquecimento sob refluxo. Nas Figuras 22 a 24 são apresentadas as curvas de

escurecimento dos SM contendo glicose, frutose e sacarose, respectivamente.

Figura 22. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo glicose ao longo de 6 horas de aquecimento sob

refluxo

59

Figura 23. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo frutose ao longo de 6 horas de aquecimento sob

refluxo

60

Figura 24. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo sacarose ao longo de 6 horas de aquecimento sob

refluxo

Nos SM, os diferentes açúcares (glicose, frutose e sacarose) e aminoácidos (alanina,

arginina, glicina, lisina e prolina) testados exerceram influência sobre a formação de cor,

expressa como AUC da absorbância ao longo das 6 horas de teste. O escurecimento foi maior

nos SM contendo glicose do que nos SM contendo frutose e sacarose (p < 0,01), que

apresentaram intensidades de escurecimento equivalentes (Figura 25).

61

Figura 25. Intensidade de escurecimento (AUC, abs.min) dos sistemas-modelo investigados, agrupados por

açúcar. Letras diferentes sobre as barras indicam diferença estatística (Two-way ANOVA, p < 0,05)

A diferença de reatividade existente entre glicose e frutose pode ser explicada em

função dos grupamentos funcionais presentes em suas estruturas (aldeído e cetona,

respectivamente). Cetonas são consideradas menos reativas do que aldeídos por apresentarem

maior impedimento estérico, devido à ligação de dois substituintes alquila ao carbono da

carbonila. Adicionalmente, os grupamentos alquila são doadores de elétrons, o que torna o

carbono da carbonila menos eletrofílico e, portanto, menos susceptível a participar de reações

de adição. Aldeídos apresentam apenas um substituinte alquila ligado à carbonila e, por isso,

são mais reativos (Solomons et al., 2013). Além disso, os produtos de Heyns apresentam

menor velocidade de formação quando comparados aos produtos de Amadori (Pilková et al.,

1990). A maior reatividade da glicose em relação à frutose na RM já foi observada em SM

(Kwak e Lin, 2004).

Os SM contendo sacarose apresentaram menor intensidade de escurecimento em

relação àqueles contendo glicose em função dos dois carbonos anoméricos da sacarose

estarem envolvidos na ligação glicosídica (Wrolstad, 2012). Consequentemente, é preciso que

a sacarose seja hidrolisada a fim de possibilitar seus respectivos monômeros (glicose e

frutose) a participarem da RM (Ribeiro e Seravalli, 2007). De maneira geral, é sabido que

dissacarídeos são menos reativos frente à RM do que monossacarídeos (Lamberts et al.,

2008).

Em relação aos aminoácidos, os SM contendo lisina apresentaram maior formação de

cor do que aqueles contendo os demais aminoácidos (Figura 26). A alta reatividade da lisina

62

(Ajandouz e Puigserver, 1999; Kwak e Lin, 2004) pode ser explicada pela existência de um

grupamento ε-amino em sua cadeia lateral, além do grupamento α-amino comum a todos os

aminoácidos (Miller et al., 1984).

Figura 26. Intensidade de escurecimento (AUC, abs.min) dos sistemas-modelo investigados, agrupados por

aminoácido. Letras diferentes sobre as barras indicam d iferença estatística (Two-way ANOVA, p < 0,05)

Assim como para a lisina, a presença de arginina em SM já foi associada com

escurecimento rápido e intenso (Danehy, 1986). De maneira geral, aminoácidos básicos

apresentam maior reatividade na RM quando comparados aos demais aminoácidos (Rooney et

al., 1967). No presente estudo, os SM contendo arginina apresentaram menor intensidade de

escurecimento do que aqueles contendo lisina (Figura 26). Apesar da maior tendência de

doação de elétrons do grupamento guanidino da arginina (pKa = 12,48) frente ao grupamento

ε-amino da lisina (pKa = 10,53), dados na literatura relatam a maior reatividade da lisina em

relação aos outros aminoácidos (Simpson et al., 2012), como observado no presente estudo.

A menor reatividade da arginina, em relação à lisina, poderia ser explicada pela distribuição

favorável de cargas positivas ao longo dos três diferentes átomos de nitrogênio nas possíveis

estruturas de ressonância desse aminoácido em sua forma protonada, ocasionando maior

estabilidade (Ishikawa, 2009) (Figura 27).

63

Figura 27. Estruturas de ressonância do grupamento guanidina protonado da cadeia lateral da arg inina

5.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A AA dos SM foi avaliada pelos ensaios de FRAP (AAFRAP) e TEAC (AATEAC), ao

longo das 6 horas de reação, sendo expressas como AUC. Nas Figuras 28 a 30 são

apresentadas as curvas de AAFRAP e AATEAC dos SM contendo glicose, frutose e sacarose,

respectivamente. Uma correlação positiva foi observada entre os ensaios utilizados para

avaliar a AA (r = 0,952, p < 0,001, n = 75).

64

Figura 28. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelos ensaios de FRAP e TEAC, dos sistemas -

modelo contendo glicose ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

65


modelo contendo frutose ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

66


modelo contendo sacarose ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

Os resultados agrupados por açúcares e aminoácidos presentes nos SM são

apresentados na Figura 31. De maneira geral, a AAFRAP foi influenciada pelo açúcar presente

nos SM (p = 0,020) e marginalmente influenciada pelos diferentes aminoácidos (p = 0,066).

Por outro lado, a AATEAC foi influenciada somente pelo açúcar presente nos SM (p = 0,051),

mas não pelos diferentes aminoácidos (p = 0,133).

67

Figura 31. Atividade antioxidante (AUC, mmol Tro lox.min/L), medida pelos ensaios de FRAP e TEAC, dos

sistemas-modelo investigados, agrupados por açúcar (A) e por aminoácido (B). Para um mesmo ensaio, letras

distintas indicam diferença estatística entre os sistemas -modelo investigados (Two-way ANOVA, p < 0,05)

68

Os SM contendo glicose apresentaram os maiores valores de AA dentre os SM

investigados (p < 0,05), ao passo que os SM contendo sacarose e frutose apresentaram AA

equivalentes entre si, independentemente do ensaio utilizado (Figura 31A). Os SM contendo

lisina apresentaram as maiores AAFRAP e AATEAC, exceto quando comparados aos SM

contendo alanina. Além disso, todos os SM, com exceção daqueles contendo lisina,

apresentaram AAFRAP e AATEAC equivalentes (Figura 31B). Os maiores valores de AA dos

SM contendo glicose e/ou lisina podem ser explicadas pelas maiores intensidades de

escurecimento desses SM. Dados da literatura indicam que, dentre os produtos formados na

RM, as melanoidinas (compostos de coloração marrom) seriam os principais contribuintes

para a AA (Wang et al., 2011). Em consequência da escassez de dados referentes às vias de

formação e estrutura química das melanoidinas, ainda não há consenso acerca dos

mecanismos responsáveis pela AA das mesmas. Entretanto, as principais teorias baseiam-se

na formação de complexos inativos a partir da captação de espécies eletrofílicas, do sequestro

de espécies reativas de oxigênio e da quelação de metais (Yoshimura et al., 1997; Delgado-

Andrade et al., 2005). Além das melanoidinas, já foi relatado que as redutonas, formadas a

partir de conjuntos de fragmentação primária, também apresentam elevada AA (Ames, 2003).

Entretanto, o pH ligeiramente ácido do meio reacional (entre 4,8 e 5,1) no presente estudo não

favorece a via de formação dessas substâncias (Nursten, 2005).

No presente estudo, foi encontrada correlação entre a intensidade do escurecimento e a

AA dos SM, independentemente do método utilizado (r > 0,90; p < 0,001, n = 75). Em SM e

em matrizes alimentares processadas termicamente, a relação entre a AA e a intensidade de

escurecimento já foi observada. Em SM, foi observada correlação positiva entre a AA,

medida por ORAC (do inglês, Oxygen Radical Absorbance Capacity), e a formação de

compostos nos estágios avançados da RM, ou seja, a partir de conjuntos de interação (Chen e

Kitts, 2008). Em bebidas de café, a AA está diretamente relacionada com o grau de torrefação

(Delgado-Andrade et al., 2005; Perrone et al., 2012). A AA de melanoidinas isoladas de

cascas de pão, medida por FRAP e TEAC, aumentou em função do tempo de forneamento,

indicando uma relação entre a intensidade de escurecimento e a AA nessa matriz (Alves e

Perrone, 2015). Em modelo de casca de pão, foi observada uma correlação positiva entre a

intensidade de escurecimento (medida como absorbância em 420 nm) e a AA (medida pelo

ensaio de FRAP) (Yilmaz e Akgun, 2008). Esses resultados reforçam a ideia de que produtos

cromóforos formados na RM, como as melanoidinas, podem contribuir de forma relevante

com a AA de alimentos nos quais ocorre a RM.

69

5.4. CONSUMO DOS REAGENTES E FORMAÇÃO DE 5-HIDROXIMETILFURFURAL

Dos SM contendo lisina, alanina, glicina, arginina ou prolina, aqueles contendo lisina,

arginina ou glicina foram selecionados para a continuação do estudo. A lisina e a arginina

foram escolhidas em função da presença de cadeias laterais reativas, amina e guanidina,

respectivamente. Além disso, os SM contendo lisina apresentaram, em média, os maiores

valores de intensidade de escurecimento e de AA. A escolha dos SM contendo glicina em

detrimento daqueles contendo alanina, ambos aminoácidos de estrutura semelhante, ocorreu

em função da glicina ser mais estudada, o que possibilitaria a comparação dos resultados do

presente estudo com dados da literatura. Os SM contendo prolina foram excluídos em função

da sua baixa intensidade de escurecimento e AA.

A quantificação dos açúcares e aminoácidos foi realizada nos tempos inicial (0 min) e

final (360 min) da RM em SM. De maneira geral, a concentração inicial da maioria dos

reagentes medida experimentalmente foi superior (entre 0,58 mol/L e 0,86 mol/L) à teórica

(0,5 mol/L), com exceção da glicina que apresentou valores de concentração inferiores (entre

0,39 mol/L e 0,52 mol/L). Essas diferenças podem ser atribuídas a um possível efeito de

matriz quando esses analitos são quantificados utilizando-se um detector de espalhamento de

luz evaporativo, como o utilizado no presente estudo. Sabe-se que algumas características

químicas dos analitos, tais como a absortividade molar e a estrutura química, podem

influenciar de forma expressiva a dispersão da luz (Righezza e Guiochon, 1988; Urano et al.,

2012). Apesar disso, o consumo (expresso em número de moles) dos reagentes apresentou

comportamento consistente com dados da literatura, que indicam maior reatividade de glicose

e lisina em SM (Oetterer et al., 2006; Lamberts et al., 2008). No presente estudo, os maiores

consumos molares foram observados para glicose (entre 0,56 e 0,67 moles) e lisina (entre 0,09

e 0,33 moles), em relação aos demais açúcares e aminoácidos, respectivamente (Figura 32).

O consumo molar de açúcares e de aminoácidos apresentou correlação positiva (r = 0,931, p <

0,001, n = 9) e, a partir do gráfico de correlação (Figura 33), puderam-se observar diferentes

relações molares entre os açúcares e aminoácidos nos SM investigados (Quadro 8). O menor

consumo dos aminoácidos em relação aos açúcares poderia ser explicado pelas vias reacionais

da etapa inicial da RM, na qual o aminoácido que inicialmente se condensa com o açúcar

(Figura 2) retorna para o meio reacional após a formação de 3-desoxihexosona a partir dos

produtos de Amadori (Figura 3). De fato, já foi relatado que açúcares estão mais fortemente

envolvidos na RM, de um ponto de vista quantitativo, do que aminoácidos (Martins e Van

Boekel, 2005).

70

O consumo molar dos açúcares e dos aminoácidos na RM foi diretamente

correlacionado com a intensidade de escurecimento (r > 0,76, p < 0,018, n = 9), o que está de

acordo com as teorias propostas, que afirmam que os compostos intermediários provenientes

dos conjuntos de fragmentação primária e de interação secundária da RM, como os compostos

dicarbonílicos e produtos da degradação de Strecker, respectivamente, são precursores de

melanoidinas (Kroh et al., 2008).

Figura 32. Concentração (mol/L) dos açúcares (glicose, frutose e sacarose) (A) e dos aminoácidos (glicina,

arginina e lisina) (B ) nos tempos inicial (t=0 min, ☐) e final (t=360 min, ■) de reação. O número de moles

consumido de cada reagente é apresentado sobre as barras

71

Figura 33. Gráfico de correlação entre o consumo molar de açúcares e de aminoácidos nos sistemas -modelo

investigados (n = 9)

Quadro 8. Relação entre o consumo de açúcares e aminoácidos na Reação de Maillard em sistemas -modelo

Sistema-modelo Número de moles consumidos Relação molar

(Açúcar/Aminoácido) Açúcar Aminoácido

Glicose/Glicina 0,56 ± 0,03 0,20 ± 0,03 2,8:1,0

Glicose/Arginina 0,59 ± 0,00 0,20 ± 0,01 3,0:1,0

Glicose/Lisina 0,67 ± 0,05 0,32 ± 0,07 2,1:1,0

Frutose/Glicina 0,13 ± 0,01 0,02 ± 0,01 6,5:1,0

Frutose/Arginina 0,18 ± 0,01 0,05 ± 0,00 3,6:1,0

Frutose/Lisina 0,29 ± 0,00 0,13 ± 0,00 2,2:1,0

Sacarose/Glicina 0,05 ± 0,06 0,02 ± 0,03 2,5:1,0

Sacarose/Arginina 0,16 ± 0,01 0,10 ± 0,00 1,6:1,0

Sacarose/Lisina 0,12 ± 0,00 0,09 ± 0,01 1,3:1,0

No presente trabalho, a formação de 5-HMF foi avaliada nos SM, sendo expressa

como AUC. Nas Figuras 34 a 36 é apresentada a formação dessa substância, ao longo de 6

horas, nos SM contendo glicose, frutose e sacarose, respectivamente.

72

Figura 34. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo glicose ao

longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

Figura 35. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo frutose ao


73

Figura 36. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo sacarose ao


Observou-se que a composição do SM, bem como o tempo de reação, foram fatores

que influenciaram na formação de 5-HMF (p < 0,05). A formação desse composto, expressa

como AUC, correlacionou-se positivamente com o número de moles consumidos de açúcares

(r = 0,885, p < 0,001, n = 9) e aminoácidos ao longo da RM (r = 0,770, p = 0,015, n = 9),

evidenciando que ambos substratos estão relacionados com a produção de 5-HMF, conforme

já descrito na literatura (Nursten, 2005). Os SM contendo glicose apresentaram maior

formação de 5-HMF em relação aqueles contendo frutose e sacarose, que não diferiram entre

si (Figura 37A). Sabe-se que, em reações de caramelização ou catálise ácida com açúcares

isolados, a frutose apresenta velocidade de formação de 5-HMF superior à da glicose, que por

sua vez é superior à da sacarose. Entretanto, já foi observado aumento na velocidade de

formação de 5-HMF a partir de glicose e sacarose na presença de alanina, ácido aspártico e

ácido γ-aminobutírico, enquanto que esse comportamento não foi observado quando a frutose

era o substrato da reação (Lee e Nagy, 1990). Nesse sentido, a presença dos aminoácidos nos

SM contendo glicose e sacarose avaliados no presente trabalho pode ter aumentado a

velocidade de formação de 5-HMF em relação aqueles contendo frutose. Não foram

observadas diferenças estatísticas para a formação de 5-HMF quando os SM contendo os

diferentes aminoácidos foram comparados entre si (Figura 37B).

74

Figura 37. Formação de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (AUC, μg.min/mL) nos sistemas -modelo investigados,

agrupados por açúcar (A) e por aminoácido (B). Letras distintas sobre as barras indicam diferença estatística

(Two-way ANOVA, p < 0,05)

A maior velocidade de formação de 5-HMF foi observada no SM Glicose/Lisina

(Figura 34), no qual o pico máximo de concentração de 5-HMF ocorreu entre 40 e 60

minutos. A partir desse tempo, a diminuição do teor de 5-HMF ocorre, possivelmente, pela

polimerização desse composto, gerando melanoidinas (Feather e Nelson, 1984), o que pode

ter relação com a maior intensidade de escurecimento deste SM em comparação a todos os

outros. Outra teoria baseia-se na reação entre o grupamento ε-amino da lisina e o HMF, visto

que já foi relatada a diminuição da concentração de HMF em presença de lisina (Zou et al.,

2016). A maior formação de 5-HMF ao longo da reação ocorreu no SM Glicose/Glicina

(Figura 34) em relação aos demais SM investigados (p < 0,01) (Figuras 35 e 36). A

possibilidade da glicina presente no meio acelerar o processo de conversão de glicose para 5-

HMF já foi relatada (Nursten, 2005). Os teores de 5-HMF nesse SM atingiram um máximo

em 240 minutos, mantendo-se constantes até o final da reação.

A formação de 5-HMF nos SM contendo frutose e sacarose apresentou perfis similares

entre si (Figura 35 e 36, respectivamente). Assim, é interessante notar que o tipo de açúcar

75

influenciou na quantidade de 5-HMF formada, enquanto o tipo de aminoácido influenciou na

velocidade de formação dessa substância, especialmente nos SM contendo glicose.

Foram observadas correlações entre a concentração de 5-HMF e a intensidade de

escurecimento (r = 0,369, p = 0,013, n = 45), o que era esperado considerando-se que esse

composto é um indicador da ocorrência e da intensidade da RM. A concentração de 5-HMF

correlacionou-se com a AA medida por FRAP (r = 0,315, p = 0,035, n = 45) e TEAC

(r = 0,3138, p = 0,036, n = 45). Esse resultado foi surpreendente, visto que soluções-padrão de

5-HMF não apresentam AA (Verzelloni et al., 2007). Nesse caso, a correlação observada

pode ser uma evidência indireta da formação de outros compostos dos conjuntos de

fragmentação primária e de interação (etapas intermediárias da RM) que possuem atividade

antioxidante, tais como os pirróis e outros compostos heterocíclicos (Yanagimoto et al.,

2002), não avaliados no presente estudo.

5.5. EFEITO DA ADIÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO SOBRE A REAÇÃO DE MAILLARD EM

SISTEMAS-MODELO

5.5.1. Intensidade de escurecimento

O efeito da adição de ácido gálico sobre a intensidade do escurecimento dos SM, ao

longo da RM, foi avaliado no presente estudo. Nas Figuras 38 a 40 são apresentadas as

curvas relativas ao escurecimento dos SM adicionados de GA contendo glicose, frutose e

sacarose, respectivamente, juntamente com as curvas relativas aos SM sem adição de GA.

76

Figura 38. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo glicose, adicionados ou não de GA, ao longo de 6

horas de aquecimento sob refluxo

77

Figura 39. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo frutose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo

de 6 horas de aquecimento sob refluxo

78

Figura 40. Escurecimento dos sistemas-modelo contendo sacarose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo

de 6 horas de aquecimento sob refluxo

79

Observou-se que a adição de GA não influenciou na intensidade de escurecimento dos

SM investigados (Figura 41). De fato, em um experimento em que o GA foi aquecido

isoladamente em tampão acetato, a intensidade de escurecimento observada foi desprezível

(absorbância = 2,77; t = 360 minutos) quando comparada às observadas nos SM.

Figura 41. Influência da ad ição de ácido gálico na intensidade do escurecimento (AUC, abs.min) da reação de

Maillard. Os sistemas-modelo foram agrupados por açúcar (A) e por aminoácido (B). Não houve diferença

estatística quando o ácido gálico fo i adicionado aos sistemas -modelo (Teste t Student, p > 0,05)

80

5.5.2. Atividade antioxidante

Nas Figuras 42 a 44 são apresentadas as curvas relativas à AAFRAP dos SM,

adicionados ou não de ácido gálico, contendo glicose, frutose e sacarose, respectivamente.

Figura 42. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelo ensaio de FRAP , dos sistemas -modelo

contendo glicose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

81

Figura 43. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelo ensaio de FRAP, dos sistemas -modelo

contendo frutose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

82

Figura 44. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelo ensaio de FRAP, dos sistemas -modelo

contendo sacarose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

83

Nas Figuras 45 a 47 são apresentadas as curvas relativas à AATEAC dos SM,

adicionados ou não de ácido gálico, contendo glicose, frutose e sacarose, respectivamente.

Figura 45. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelo ensaio de TEAC, dos sistemas -modelo

contendo glicose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

84


contendo frutose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquec imento sob refluxo

85


contendo sacarose, adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

86

Independentemente do método utilizado para medir a AA dos SM, a adição de GA

resultou em um aumento expressivo (entre 69 % e 486 %) da AA em todos os SM

investigados (p < 0,05) (Figura 48). Esse aumento pode ser explicado tanto pela presença do

próprio GA, que apresenta AA isoladamente (Pulido et al., 2000), quanto pela formação de

outros compostos com elevada AA a partir de reações envolvendo o GA. Quando o GA foi

aquecido isoladamente em tampão acetato, não foi observada variação na AAFRAP do meio

reacional (Figura 49A) e na sua concentração (Figura 49B).

Figura 48. Influência da ad ição de ácido gálico na atividade antioxidante, medida por FRAP e TEAC (AUC

mmol de Trolox.min/L) dos sistemas-modelo investigados quando agrupados por açúcar (A) e por aminoácido

(B). A ad ição de GA levou ao aumento significat ivo da AA em todos os SM (Teste t Student, p < 0,05). O

aumento percentual foi expresso sobre as barras.

87

Figura 49. Atividade antioxidante (mmol Trolox/L), medida pelo ensaio de FRAP (A) e concentração de ácido

gálico (B ), ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo de uma solução de ácido gálico em tampão acetato.

Não foram observadas diferenças estatísticas ao longo do tempo (p > 0,05).

Apesar da adição de GA ter resultado em aumento da AA em todos os SM, de maneira

inesperada não foi observada correlação entre a concentração molar de GA e a AA.

Entretanto, quando os SM contendo glicina foram excluídos da análise estatística, observou-se

correlação negativa entre a concentração molar de GA e a AAFRAP (r > - 0,735, p < 0,001, n =

30) e AATEAC (r = - 0,726, p < 0,001, n = 30), o que sugere a possibilidade da formação de

compostos com atividade pró-oxidante nos SM contendo glicina.

88

5.5.3. Consumo dos reagentes e formação de 5-hidroximetilfurfural

O comportamento do GA ao longo da RM foi avaliado no presente estudo nos SM

contendo glicose, frutose e sacarose (Figuras 50 a 52).

Figura 50. Concentração de ácido gálico (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo glicose ao longo de 6 horas de

aquecimento sob refluxo

Figura 51. Concentração de ácido gálico (μg/mL) nos sistemas -modelo contendo frutose ao longo de 6 horas de

aquecimento sob refluxo.

89

Figura 52. Concentração de ácido gálico (μg/mL) nos sistemas -modelo contendo sacarose ao longo de 6 horas

de aquecimento sob refluxo.

Na Figura 53 são apresentados os dados relativos à concentração do GA nos SM

investigados nos tempos inicial e final de reação. O SM Glicose/Glicina/GA foi o que

apresentou a maior perda percentual de GA (50%) dentre todos os SM. Adicionalmente, os

SM contendo glicina apresentaram as maiores perdas percentuais de GA, independentemente

do açúcar presente. Esse resultado pode ser explicado pela possível formação de compostos

com atividade pró-oxidante nesses SM, conforme discutido anteriormente. Os SM contendo

lisina e arginina apresentaram perdas percentuais semelhantes de GA (para um mesmo

açúcar), exceto no caso do SM Glicose/Lisina/GA, que apresentou perda percentual de GA

cerca de duas vezes maior que o SM Glicose/Arginina/GA.

90

Figura 53. Concentração (µg/mL) de ácido gálico nos tempos inicial (t=0 min, ☐) e final (t=360 min, ■) de

reação. A variação percentual da concentração é apresentada sobre as barras

Sabe-se que o GA apresenta maior estabilidade em pH ácido (Boles et al., 1988),

sendo susceptível à degradação em pH básico (Friedman e Jurgens, 2000). Entretanto, dados

relativos à estabilidade térmica do GA são controversos. Na forma sólida, a degradação ocorre

comumente na faixa entre 222 ºC e 240 ºC (Pubchem, 2016). No presente trabalho, não foram

observadas perdas significativas de GA ao longo do tempo, quando aquecido isoladamente

nas mesmas condições utilizadas no preparo dos SM (Figura 49B). Assim, é provável que os

compostos gerados durante o curso da RM tenham reagido com o GA e, consequentemente,

interferido na sua estabilidade.

Na Figura 54 são apresentados os teores de açúcares e aminoácidos nos SM

analisados, nos tempos inicial (0 minuto) e final (6 horas) de reação. De maneira geral, os

resultados assemelham-se aos observados anteriormente para os SM que não continham GA.

91

O açúcar que apresentou maior consumo foi a glicose. Além disso, o maior consumo de

aminoácido foi observado nos SM contendo glicose. No Quadro 9 estão apresentados os

resultados relativos à influência do ácido gálico no que diz respeito às relações molares de

consumo entre açúcares e aminoácidos na RM.

Figura 54. Concentração (mol/L) dos açúcares (glicose, frutose e sacarose) (A) e dos aminoácidos (glicina,

arginina e lisina) (B ) nos tempos inicial (t=0 min, ☐) e final (t=360 min, ■ ) de reação nos sistemas-modelo com

adição de ácido gálico. Os valores de consumo molar são apresentados sobre as barras

92

Quadro 9. Relação molar entre o consumo de açúcares e aminoácidos nos sistemas -modelo contendo ácido

gálico em co mparação com os sistemas-modelo sem adição de ácido gálico

Sistema-modelo

Número de moles

consumidos

Relação molar (Açúcar/

Aminoácido) dos

sistemas-modelo com

adição de ácido gálico

Relação molar

(Açúcar/

Aminoácido) dos

sistemas-modelo sem

adição de ácido gálico

Açúcar Aminoácido

Glicose/Glicina/GA 0,41 ± 0,01 0,08 ± 0,01 5,1:1,0 2,8:1,0

Glicose/Arginina/GA 0,57 ± 0,00 0,18 ± 0,01 3,2:1,0 3,0:1,0

Glicose/Lisina/GA 0,69 ± 0,02 0,27 ± 0,03 2,6: 1,0 2,1:1,0

Frutose/Glicina/GA 0,11 ± 0,01 0,02 ± 0,01 5,5: 1,0 6,5:1,0

Frutose/Arginina/GA 0,16 ± 0,00 0,01 ± 0,00 16,0: 1,0 3,6:1,0

Frutose/Lisina/GA 0,20 ± 0,00 0,05 ± 0,01 4,0: 1,0 2,2:1,0

Sacarose/Glicina/GA 0,14 ± 0,06 0,04 ± 0,07 3,5: 1,0 2,5:1,0

Sacarose/Arginina/GA 0,09 ± 0,02 0,10 ± 0,02 0,9: 1,0 1,6:1,0

Sacarose/Lisina/GA 0,21 ± 0,00 0,04 ± 0,01 5,2: 1,0 1,3:1,0

De acordo com o Quadro 9, pôde-se observar uma tendência ao menor consumo de

aminoácidos em presença do GA. Essa diferença pode estar relacionada com a redução dos

compostos α-dicarbonílicos pelo GA, diminuindo a quantidade disponível desses

intermediários na degradação de Strecker. De fato, já foi demonstrado o poder inibitório de

derivados do ácido gálico sobre a formação de compostos intermediários da RM, através de

um mecanismo de competição com a lisina (Yin et al., 2014). Além disso, a concentração

molar de GA foi mais intensamente correlacionada com a concentração molar de açúcares (r

= 0,743, p < 0,001, n = 18) do que com a de aminoácidos (r = 0,538, p < 0,021, n = 18), o que

reforça a preferência de reação entre GA e intermediários da degradação de açúcares, tais

como os compostos α-dicarbonílicos.

O 5-HMF é um dos compostos reativos formados a partir de conjuntos de

fragmentação primária e, portanto, há possibilidades de sua reação com o GA. Nas Figuras

55 a 57 são apresentadas as curvas de formação dessa substância ao longo do tempo de reação

93

(6 horas) nos SM adicionados de ácido gálico contendo glicose, frutose e sacarose,

respectivamente.

Figura 55. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo glicose,

adicionados ou não de ácido gálico, ao longo de 6 horas de aquecimento sob refluxo

Figura 56. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo frutose,


94

Figura 57. Concentração de 5-hidroximet ilfurfural (5-HMF) (μg/mL) nos sistemas-modelo contendo sacarose,


De forma semelhante àquela observada para os SM sem adição de GA, a composição

do SM, bem como o tempo de reação, foram fatores que influenciaram na formação de

5-HMF (Two-way ANOVA, p < 0,05). Nos SM Glicose/Arginina, Sacarose/Arginina,

Sacarose/Lisina e Frutose/Glicina foi observada menor formação de 5-HMF quando na

presença de GA (p < 0,05), o que reforça a hipótese de que o GA pode reduzir o 5-HMF

formado. Por outro lado, em outros SM, foi observada maior formação de 5-HMF em

presença de GA, como no caso dos SM Frutose/Arginina e Glicose/Lisina (p < 0,05). De

forma similar, demostrou-se que o 5-CQA aumenta a formação de 5-HMF em SM (Zhang et

al., 2016). O fenônemo foi atribuído à presença de grupamentos dihidroxifenil e carboxila na

estrutura do 5-CQA.

Apesar dos resultados descritos anteriormente, não foram percebidas diferenças

estatísticas significativas na formação de 5-HMF ao longo do tempo quando a análise foi feita

entre os grupos de açúcares e aminoácidos (Figura 58).

95

Figura 58. Influência da ad ição de ácido gálico na formação de 5-hidroximetilfu rfural (5-HMF)

(AUC, μg.min/mL). Os sistemas -modelo foram agrupados em dois grupos distintos: por açúcar (A) e por

aminoácido (B). Não houve diferença estatística significativa entre os diferentes tratamentos (Teste t Student, p >

0,05)

A concentração de 5-HMF foi correlacionada ao consumo percentual de GA

(r = 0,705, p = 0,034, n = 9). De forma similar ao observado para os SM sem adição de GA,

foi encontrada correlação entre a concentração de 5-HMF e a AA, independentemente do

ensaio utilizado (r > 0,338, p < 0,023, n = 45). Entretanto, excluindo-se os SM contendo

glicina da análise estatística, essas variáveis correlacionaram-se mais fortemente (r > 0,625,

p < 0,001, n = 30).

96

6. CONCLUSÃO

De maneira geral, a glicose e a lisina foram os reagentes mais consumidos durante a

RM e que levaram à maior intensidade de escurecimento e AA dos SM. A correlação

encontrada entre intensidade de escurecimento e AA indica que compostos cromóforos de

elevada AA são formados durante a RM. As razões observadas entre o consumo de açúcares e

aminoácidos durante a RM evidenciam uma maior reatividade dos produtos de degradação

dos açúcares, assim como a “reciclagem” dos aminoácidos ao longo da etapas inicial e

intermediária da RM. A formação de 5-HMF, classicamente associada à desidratação de

açúcares, pode ter ocorrido, nos SM investigados no presente trabalho, também em função da

participação dos aminoácidos na RM. Dessa maneira, esse composto também poderia ser

formado em alimentos a partir da fragmentação de compostos nitrogenados, como os produtos

de Amadori e de Heyns. Além disso, o tipo de açúcar influenciou na quantidade total de 5-

HMF formado ao longo da RM, enquanto o tipo de aminoácido influenciou na velocidade de

formação desse composto.

A adição de GA em SM da RM não influenciou a intensidade de escurecimento e a

formação de 5-HMF, o que poderia ser explicado pela grande variabilidade observada entre os

resultados em função das diferentes combinações de açúcares e aminoácidos estudadas. Por

outro lado, observou-se que o GA participa da RM levando à formação de compostos com

elevada AA. Além disso, o GA parece reduzir os compostos oriundos do conjunto de

fragmentação de açúcares.

O presente estudo foi o primeiro a observar a participação do GA na RM,

principalmente no que diz respeito a sua reatividade com compostos do conjunto de

fragmentação de açúcares e consequente formação de outros compostos de elevada AA.

Tendo em vista os aspectos observados e levando em consideração a complexidade da RM,

esses resultados possibilitarão a realização de novos estudos a fim de elucidar os mecanismos

pelos quais ocorre a formação de substâncias derivadas de compostos fenólicos via RM.

97

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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