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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC CNPq e

PIBIC UFPA

RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO

Período: 08/2012 a 08/2013 ( ) PARCIAL ( x ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Estudo

de fungos endofíticos de espécies de plantas da amazônia como produtores de

aleloquímicos

Nome do Orientador: Lourivaldo da Silva Santos

Titulação do Orientador: Doutor

Departamento: Faculdade de Química

Unidade: ICEN

Laboratório: Química – Pesquisa

Título do Plano de Trabalho:

Atividade anti-leshmaniose de Virola surinamensis (Myristicaceae).

Nome do Bolsista: Steven Souza Paes

Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPa

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INTRODUÇÃO.

O gênero Virola passou a ter maior atenção cientifica após a divulgação que

algumas de suas espécies são usadas por tribos da Amazônia no preparo de um

chá alucinógeno e como veneno utilizado para caças (RODRIGUES 1972).

A Virola surinamensis (Rol.) Warb. é muito utilizada contra reumatismo e artrite

(HOEHNE,1939). Na medicina popular também é utilizada como cicatrizante e no

tratamento de cólicas e dispepsias (SCHULTES e HOLMSTED, 1971). A resina

obtida das cascas é utilizada para o tratamento de erisipelas e inflamação

(SCHULTES e HOLMSTED, 1971; BERGER, 1992).

Dentre as mais conhecidas espécies de Virola está a V. surinamensis (Rol)

Warb. pertencente à família Myristicaceae, e conhecida popularmente como ucuuba,

ucuuba-branca, ucuúba-cheirosa, ucuúba-de-igapó, ucuúba-da-várzea, ucuúba-

verdadeira, bicuíba, bicuíba-branca, árvore-de-sebo, virola, entre outros.

JUSTIFICATIVA

As plantas medicinais são de grande utilidade para pessoas que não tem

condições financeiras para se medicar através da quimioterapia. Mas a utilização de

plantas apesar de seu efeitos benéficos pode trazer consequências danosas à

saúde daqueles que utilizam esse modo de automedicação. A utilização de plantas

medicinais é feita de maneira indiscriminada pela população, e pode, assim como a

quimioterapia, causar efeitos adversos àqueles esperados, necessitando, portanto,

um conhecimento prévio de seus componentes químicos, pois a presença de

substâncias nelas contidas pode produzir efeitos que desconhecemos

principalmente se ingerida em longo tempo, podendo assumir natureza tóxica a

exemplo do “pau d’arco” (Tabebuia avellanedeae), “barbatimão” (Stryphnodendron

obovatum), “confrei” (Symphytum officinale), dentre outros (ALMEIDA, 1993).

É necessário, portanto, um engajamento dos pesquisadores brasileiros no

sentido de investigar nossas plantas medicinais, não somente com o objetivo de

isolar seus componentes químicos como também, interagir com farmacólogos,

verificar suas propriedades tóxicas e comprovar seus efeitos medicinais na medicina.

Um grave problema de saúde pública, acometendo aproximadamente 350

milhões de homens, mulheres e crianças em 98 países ao redor do mundo está

relacionado às leishmanioses que são causadas por protozoários do gênero

Leishmania (WHO, 2010; PAHO, 2012). Trata-se de uma doença infecciosa

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zoonótica afetando homem e animais, causada pela infecção por Leishmania spp.

podeendo abranger as formas tegumentar, mucocutânea e a leishmaniose visceral.

A leishmaniose tegumentar é a forma mais comum da doença, podendo evoluir em

humanos desde lesões cutâneas auto limitadas (com possível cura espontânea) a

lesões graves, de difícil resolução. A forma visceral da leishmaniose, também

conhecida por calazar, é a mais severa da doença e sua apresentação clínica pode

variar desde quadros assintomáticos a polissintomáticos, e graves, com desfecho

invariavelmente fatal sem o tratamento adequado. (MULLER et. al., 2008; WHO,

2010). A transmissão da doença ao homem ocorre quando os mosquitos flebótomos,

dos gêneros Lutzomyia e Psychopopygus, infectam-se ao picar o animal portador da

doença, aspirando macrófagos parasitados ou amastigotas livres no sangue ou

tecidos e podendo assim, transmitir a doença ao homem.

Atualmente mais de 450 lignanas e neolignanas, com mais de quarenta

tipos diferentes de esqueletos carbônicos, são descritos na literatura. Estudos com

este grupo de substâncias mostraram que alguns lignoides são capazes de inibir a

transcriptase reversa e conseqüentemente a atividade do vírus HIV (EICH et al.,

1996). Desta forma, com base nos dados apresentados na literatura do potencial

farmacológico e variedades dos constituintes químicos da V. surinamensis verifica-

se a necessidade da realização de mais estudos químicos e farmacológicos da

espécie.

A surinamensina uma das substâncias muito comum das folhas de V.

surinanensis apresentou atividade in vitro contra espécies de Leishmania donovani

promastigota com concentração inibitória de 50 μM, enquanto que para amastigota

em macrófagos a substância foi ativa em 100 μM, entretanto, revelou-se tóxica para

o macrófago (BARATA, et al., 2000). Análogos de neoliganas 8.O.4’ apresentaram

100% de inibição para Leishmania amazonensis à 80 μg/mL (AVENIENTE et. al,

2007), enquanto que compostos β-cetoeteres e β-cetoaminanas revelaram-se ativas

nas concentrações de 30 a 100 μM frente ao Leishmania donovani (BARATA, et al.,

2000). A atividade leishmanicida das espécies V. oleifera, V. surinamensis,

V.donovani e V. pavonis foi atribuída à presença de neolignanas (FERNANDES et

al., 1993). Levando em consideração os ensaios farmacológicos que têm confirmado

a eficácia de determinadas plantas da Amazônia contra diferentes cepas de

Leishmania (WABWOBA et al., 2010; MOREIRA et al., 2007), e a necessidade da

busca de novos fármacos para o tratamento das leishmanioses, quer por problemas

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de alta toxicidade, resistência parasitária ou muitas reações adversas, tem-se

também como objetivo da pesquisa fornecimento de frações e substâncias para a

avaliação da atividade contra espécies de Leishmania.

OBJETIVO GERAL.

Isolar e identificar substâncias da Virola surinamensis, e realizar ensaios de

atividade biológica frente a Leshmania .

ATIVIDADES PROGRAMADAS PARA O PERÍODO DA BOLSA:

1. Atualização bibliográfica: Objetivo alcançado

Foram feitos levantamentos biográficos referentes à espécie V.surinamensis

nas principais bases de dados, como Web of Science e Scifinder.

2. Coleta e identificação botânica da planta: Objetivo alcançado

Vide em materiais e métodos, coleta e identificação.

3. Preparação dos extratos brutos: Objetivo alcançado

Vide em materiais e métodos, extração do material botânico.

4. Fracionamento cromatográfico: Objetivo alcançado

Vide em materiais e métodos, fracionamento do extrato acetato de etila.

5. Identificação estrutural dos constituintes isolados: Objetivo alcançado

A identificação dos constituintes foi realizada através das técnicas de RMN

uni e bi dimensional.

6. Isolar e identificar substâncias das folhas de Virola surinamensis, e

realizar ensaios de atividade anti- Leshmania de frações e substâncias: Objetivo

parcialmente alcançado

7. Relatório Parcial: Objetivo alcançado.

Foi apresentado e Aprovado o Relatório Parcial com atividades dos seis

meses iniciais de bolsa.

8. Relatório Final: Objetivo alcançado.

Está sendo apresentado o relatório Final referente aos doze meses de bolsa.

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MATERIAIS E MÉTODOS:

Materiais.

1. Vidrarias diversas (becker, erlenmeyer, pipetas graduadas, volumétricas e

pasteur, buretas, provetas, balões, funis, bastões de vidro).Alem de

espátulas de alumínio garras de fixação, aros e vidrinhos de penicilina.

2. O espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear utilizado na obtenção

dos espectros foi modelo Mercury 300 (VARIAN).

3. Evaporadores rotativos a vácuo: BÜCHI, modelo 461 e QUIMIS, modelo

Q-344-2, utilizados na concentração dos extratos.

4. Câmara de análise de fluorescência por luz ultravioleta: Cabine e luz

SPECTROLINE, modelos CM-10/ ENF-260C, para visualização de CCDC

(cromatografia em camada delgada comparativa).

5. Balanças Analíticas: SARTORIUS, modelo BP210S.

6. Os solventes utilizados para extração e nos diversos procedimentos

cromatográficos foram solventes graus P.A. hexano, acetato de etila,

metanol, diclorometano (SYNTH, NUCLEAR, VETEC). Alem da utilização

de solventes retificados no LPN (Laboratório de Produtos Naturais) da

UFPA

7. Os espectros de RMN foram obtidos em solventes deuterados

(clorofórmio-d e metanol-d4 ).

8. Nos fracionamentos cromatográficos em coluna foi utilizada sílica gel60

70-230 mesh.

9. Nos procedimentos cromatográficos em camada delgada comparativa foi

empregada sílica gel 60 para CCD do tipo HF254, (MERCK).

10. Reagentes utilizados na revelação das placas de CCDC: Solução de

Ce(SO4)2 1%

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Métodos.

Coleta e Identificação:

Um espécime de V. surinamensis foi coletado nas matas da Embrapa em

Belém por um parataxônomo com larga experiência onde uma exsicata está

depositada no museu paraense EMILIO GOELDI-MPEG.

Secagem, Moagem:

As folhas foram secas em estufa a uma temperatura de 40ºC por um período

de dois dias. Depois de secas, as folhas foram trituradas e moídas em moinho de

facas resultando em 6,2 kg de material.

Extração do material botânico:

Folhas secas e moídas de V. surinamensis (4,0 kg) foram extraídas

seqüencialmente com hexano (8 L), acetato de etila (6 L) e metanol (5 L) durante

sete dias para cada solvente. Após filtração e evaporação dos solventes foram

obtidos 61,7 g de extrato bruto hexânico (EBH), 120,8 g de extrato bruto Acetato de

etila (EBAcOET) e 244,3 g de extrato bruto metanólico (EBMeOH). A figura 1 mostra

o fluxograma relativo à extração a frio do material botânico.

Figura 1: Obtenção dos extratos brutos de Hex, AcOEt e MeOH.

Material Botânico

4,0 kg

Resíduo 1 Extrato Hexânico

61,7g

Resíduo 2 Extrato AcOEt

120g

Resíduo 3 Extrato MeOH

244g

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Fracionamento do extrato acetato de etila (AcOEt)

O extrato AcOEt (15,0 g) foi fracionado em coluna filtrante utilizando como

eluentes misturas de hexano (hex), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH) em

gradientes de polaridades crescentes, onde foram coletadas 26 alíquotas (1 a 26) de

400 mL cada, conforme dados apresentados na tabela 1.

Tabela 1: Fracionamento Cromatográfico do extrato acetato de etila e reuniões das

alíquotas.

Sistema de

Solventes

N º de aliquotas Nº das frações

resultante das

reuniões

HEX- 100% 1-3 1

HEX/AcOEt–5% 4-8 2-6

HEX/AcOEt–50% 9-11 7

HEX/AcOEt–75% 12-14 8-10

AcOEt– 100% 15-17 11-13

AcOEt/MeOH– 5% 18-20 14

AcOEt/MeOH–15% 21-22 15-16

AcOEt/MeOH–50% 23-24 17

MeOH–100% 25-26 18-19

As 26 alíquotas foram concentradas em evaporador rotativo e submetidas a

análises por meio de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC). As

alíquotas que apresentaram perfil cromatográfico semelhantes foram reunidas,

dando origem a 19 frações (tabela 1). A Fração 7 foi submetida a cromatografia em

coluna dando origem a substância S1 como um óleo de coloração amarelada.

Partição do extrato AcOEt.

O extrato bruto AcOEt (10 g) foi solubilizado em 1L de solução hidroalcoólica

MeOH/H2O (7:3) e extraído com 700 mL de hexano (4x). As frações hexânicas foram

reunidas, secadas com sulfato de sódio anidro, e após filtração e concentração sob

vácuo obteve-se 500 mg da Fase Hexânica. A Fase Hidroalcoólica resultante da

extração com hexano foi extraída com acetato de etila (4x 700mL) e após o mesmo

8

procedimento usado anteriormente obteve-se 2,0 g da Fase Acetato de Etila. A

figura 2 ilustra o fluxograma da partição.

Figura 2: fluxograma da partição do extrato bruto AcOEt

MeOH/H2O 7:3 1L

Partição com 700mL de Hex

A Fase AcOEt (2,0 g) foi fracionada por cromatografia de coluna (CC) sendo

utilizados sistemas de solventes empregando hexano (hex), acetato de etila

(AcOET) e metanol (MeOH) em gradientes de polaridades crescentes. Foram

coletadas 191 alíquotas as quais foram analisadas por cromatografia em camada

delgada comparativa (CCDC) e as alíquotas que apresentaram perfis

cromatográficos semelhantes foram reunidas dando origem a 30 subfrações. Análise

das subfrações levou às Frações ST2, ST3, ST4 e ST5 que foram utilizadas nos

testes biológicos. O fluxograma da figura 3 apresenta de maneira simplificada o

procedimento utilizado.

Extrato Bruto AcOEt

10g

Solução Hidroalcoólica

Resíduo 1 Fase Hexânica

(500 mg)

Resíduo 2 Fase AcOEt

(2,0 g)

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Figura 3: Fluxograma da obtenção de ST2, ST3, ST4 E ST5.

ST2 ST3 ST4 ST5

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A substância S1 (10 mg) foi isolada por cromatografia em coluna como um óleo

de coloração amarelada, a partir da fração 7 do fracionamento do extrato acetato de

etila. Na análise do espectro de RMN 1H de S1 (Figura 4, anexo) foi observado

grande número de sinais em regiões diferentes do espectro, onde foi possível notar

que a referida substância se apresenta em mistura. No espectro se destaca dois

sinais: um mutipleto em δH 4,41 (1H) e um dupleto centrado em δH 4,73 (d, J = 7,8

Hz, 1H), característicos respectivamente dos prótons metínicos de C-8 e C-7 de uma

substância da classe das neolignanas alcoólicas 8.O.4’ com configuração treo

(BARATA, 1976), além de um dupleto em δH 1,22 (J = 6,3 Hz) atribuído aos

hidrogênios metilícos de C-9. Na região de hidrogênios aromáticos, observam-se

seis sinais, sendo dois duplos dupletos, um em δH 7,44 (dd, J = 1,8 e 8,1 Hz) e o

FASE AcOEt. 2,0 g

30 SUBFRAÇÕES

Subfração 5 Hex/AcOEt 5%,300 mg

Subfração 16 Hex/AcOEt 33%,475mg

Subfração 14 Hex/AcOEt 25%,

87 mg

Subfração 9 Hex/AcOEt 15%,

40 mg

10

outro em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz), dois dupletos orto relacionados em δH 7,06

(d, J = 8,1 Hz) e δH 6,84 (d, J = 8,1 Hz), e dois dupletos meta relacionados em δH

7,45 (d, J = 1,8 Hz) e δH 6,95 (d, J = 2,1 Hz).

A partir da análise mapa de correlações COSY H1 x H1 (Figura 5, anexo),

verifica-se a corelação do duplo dupleto em δH 7,44 com o dupleto em δH 7,06, e o

duplo dupleto em δH 6,93 com o dupleto em δH 6,84, sugerindo a presença de dois

anéis aromáticos 1,3,4 substituídos, na estrutura, como ilustrado a seguir:

Observou-se também no espectro de RMN 1H (Figura 4, anexo) três intensos

singletos na região dos sinais de hidrogênios de metoxilas aromáticas em δH 3,88,

3,89 e 3,96, além de um intenso singleto em δH 9,87 que pode ser atribuído a

hidrogênio de aldeído ou de uma hidroxila fenólica. No espectro de RMN 13C

(Figura 6, anexo) e DEPT (Figura 7, anexo) observam-se sinais em δC 109,78,

109,83, 110,87, 115,04, 119,90, 126,40, 130,90, 131,90, 149,10, 150,74, 153,10 e

153,31 de dois anéis aromáticos, além dos sinais em δC 55,90, 55,96 e 56,12 de

metoxilas ligadas a anel aromático, além de um sinal em δC 190,90 que caracteriza

a presença de uma carbonila conjugada de aldeído. Ainda no espectro de RMN 13C

(Figura 7, p. 19) observam-se dois sinais em δC 81,96 e 77,86 com deslocamentos

característicos dos carbonos metinícos C- 8 e C-7. Enquanto que, no mapa de

correlações HETCOR (Figura 8, anexo), verifica-se as seguintes correlações: do

carbono δC 81,96 com mutipleto em δH 4,45- 4,36, do carbono δC 78,86 com o

dupleto centrado em δH 4,73 e do carbono δC 16,40 com o dupleto em δH 1,22. No

mapa de correlação HMBC (Figura 9, anexo) verifica-se a correlação 2JC,H do

Ar

O

Ar

OH

7

8

11

carbono em δC 81,96 com o dupleto em δH 4,73 e a correlação 2JC,H com o

dupleto em δH 1,22, assim como a correlação 2JC,H do carbono em δC 77,86 com o

multipleto em δH 4,45-4,36 e a 3JC,H com o dupleto em δH 1,22. Levando em

considerações as referidas correlações, podem-se realizar as seguintes atribuições:

Ar

CH

CH

H3C O

Ar

OH

C-8 81,96H-8 m 4,40

C-7 77,86H-7 d 4,73

C-9 16,40H-9 d 1,22

A partir do mapa de correlação HETCOR (Figura 8, anexo) verifica-se as

seguintes correlações: sinais de carbono em δC 119,90, 109,80 e 110,90 com os

sinais de hidrogênios em δH 6,95 (d, J = 2,1 Hz), 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz) e 6,84

(d, J = 8,1 Hz), respectivamente; e sinais de carbono em δC 126,40, 109,80 e 115,05

com os sinais de hidrogênios em δH 7,45 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 8,7 e 2,1

Hz, 1H) e 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H) respectivamente.

De acordo com a expansão do mapa de correlações HMBC (Figura 9, anexo),

verifica-se uma correlação 2JC,H do sinal de carbono em δC 131,90 com o dupleto

em δH 4,73, as outras correlações existentes com esse dupleto é somente com

carbonos protonados, sendo assim a única correlação com um carbono totalmente

substituído é com o sinal em δC 131,90, sendo este atribuído ao carbono C-1 de

neolignanas 8.O.4’, e ainda conforme o mapa de correlações HMBC (Figura 11, p.

21 ) apresenta uma correlação 3JC,H com o dupleto em δH 6,84 (J = 8,1 Hz), o que

leva a conclusão que o conjunto de sinais aromáticos em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1

Hz), 6,84 (d, J = 8,1 Hz), 6,95 (d, J = 2,1 Hz) pertence ao anel A.

Estudos sobre a síntese de formil neolignanas foram realizados por Criss et.

al., (1998), Xia e Wang, (2010) e Tsai et. al., (1996). Esses autores realizaram

estudos sobre neolignanas com esqueleto básico representado a seguir:

Figura 4: Esqueleto Básico de formil lignanas.

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Tomando como base as neolignanas alcoólicas 8.O.4’ e levando em

consideração os estudos de Barata (1976), Criss, et. al. (1998), Xia e Wang (2010) e

Tsai et. al. (1996), pode-se realizar as seguintes atribuições para a estrutura de S1:

os sinais de hidrogênios que caracterizam um anel aromático 1,3,4-trissubstituído,

em δH 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,44 (dd, J = 8,7 e 2,1 Hz, 1H) e 7,45 (d, J = 2,1 Hz,

1H) e de carbono em δC 115,05, 109,8, 126,40 podem ser assinalados,

respectivamente, aos hidrogênios e carbonos H-5’/C-5’, H-6’/C-6’ e H-2’/C-2’, de um

dos anéis aromáticos, que a partir da correlação observada dos dois últimos sinais

de carbono citados com o singleto em δH 9,90 típico de aldeído, é possível assinalar

este anel como anel B; o conjunto de sinais de hidrogênios e carbonos aromáticos

em δH 6,93 (dd, J = 2,1 e 8,1 Hz), 6,84 (d, J = 8,1 Hz), 6,95 (d, J = 2,1 Hz) e δC

109,8, 110,90 e 119,90 pertencem ao anel A, também 1,3,4-trissubstituído,

assinalados respectivamente como H-6/C-6, H-5/C-5 e H-2/C-2. No mapa de

correlação HMBC (Figura 12 p. 22) observam-se as correlações: a 3JC,H do sinal de

carbono em δC 153,10 com o sinal de hidrogênio em δH 7,44 (dd) e a 2JC,H com o

sinal em δH 7,05 (d); a 3JC,H do sinal de carbono em δC 150,74 com o sinal de

hidrogênio em δH 7,05 (d) e a 2JC,H com o sinal em δH 7,45 (d), além da correlação

a 3JC,H do sinal de carbono em δC 130,90 com o sinal de hidrogênio em δH 7,05

(d) e a 2JC,H com o sinal em δH 9,90 (s). Assim, diante dessas correlações atribui-

se ao carbono C-4’ o sinal em δC 153,10, ao carbono C-2’ o sinal em δC 150,74 e

ao carbono C-1’ o sinal em em δC 130,90 que são carbonos aromáticos oxidados, e

consequentemente ao ao carbono C-7’ o sinal em 190,90 e ao H-7’ o sinal em δH

9,90 (s), confirmando a presença do grupo aldeído na estrutura.

Ainda conforme o mapa de correlação HMBC (Figura 12, p. 22) observam-se

também as correlações: a 3JC,H do sinal de carbono em δC 149,10 com o sinal de

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hidrogênio em δH 6,93 (dd) e a 2JC,H com o sinal em δH 6,48 (d) e a correlação a

3JC,H do sinal de carbono em δC 131,90 com o sinal de hidrogênio em δH 6,84 (d),

logo, atribui-se respectivamente C-4 e C-1. Neste anel aromático (A) ainda resta a

posição C-3 a ser atribuída, no entanto, observa-se a presença de sinal de carbono

em δC 153,31(Figura 7, p. 19) que não revela nenhuma correlação no mapa de

correlação, entretanto, este sinal de carbono é tipicamente aromático oxidado

restando a ele a posição C-3.

Os sinais no espectro de RMN 13C (Figura 7, p. 19) em δC 55,89, 55,96 e 56,12 são

referentes aos carbonos das três metoxilas aromáticas. No espectro de RMN de 1H

os sinais em δH 3,86, 3,88 e 3,96 são devidos aos hidrogênios das três metoxilas

aromáticas. O espectro de massas de S1 (Figura 13, p. 22 ) apresentou o íon

molecular [M+.] 346 u.m.a., compatível com a fórmula molecular C19H22O6. A

reunião dos dados apresentados permitiu concluir que a substância S1 é a treo-1-

(3,4-dimetoxifenil)-2-(2-metoxi-4-formilfenoxi)-propan-1-ol, produto natural. A Tabela

3 (p. 14) reúne os dados de RMN 1H, 13C, HETCOR e HMBC de S1 em

comparação com os dados da substância obtida por síntese (CRISS et. al., 1998). A

figura 76 demonstra as correlações citadas conforme o mapa de correlação HMBC.

Para confirmar a proposta estrutural é necessária a obtenção do espectro de

massas de alta resolução da substância.

Figura 5: Correlações observadas no mapa de correlação HMBC de S1.

MeO

MeO

OH

O

OMe

O

2J3J

Tabela 3: Dados de RMN 13C, 1H, HETCOR e HMBC para S1.

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S6 δC(HETCOR) δH HMBC δH*

1 131,90 ---- ---- ----

2 119,90 6,95 (d, J = 2,1

Hz, 1H) 77,86 (3J) 6,86-7,50 (m)

3 153,31 ---- ---- ----

4 149,10 ---- ---- ----

5 110,90 6,84 (d, J = 8,1

Hz, 1H) 131,90 (3J) 6,86-7,50 (m)

6 109,8 6,93 (dd, J = 2,1

e 8,1 Hz, 1H) 77,86 (3J) 6,86-7,50 (m)

7 77,86 4,73 (d, J = 7,8

Hz, 1H)

81,96 (2J)

131,90 (2J)

4,84 (d, J = 4,4 Hz, 1H)

8 81,96 4,41 (m) 77,86 (2J) 4,74 (m)

9 16,40 1,22 (d, J = 6,3

Hz, 3H)

81,96 (2J)

77,86 (3J)

1,29 (d, J = 6,1 Hz, 3H)

1’ 130,90 ---- ---- ----

2’ 126,40 7,45 (d, J = 2,1

Hz, 1H) 150,74 (2J) 6,86-7,50 (m)

3’ 150,74 ---- ---- ----

4’ 153,10 ---- ---- ----

5’ 115,50 7,05 (d, J = 8,7

Hz, 1H)

153,10 (3J)

150,74 (3J)

130,90 (3J)

6,86-7,50 (m)

6’ 109,8 7,44 (dd, J = 2,1

e 8,7 Hz, 1H) 153,10 (3J) 6,86-7,50 (m)

7’ 190,90 9,90 (s) 130,90 (2J) 9,84 (s)

3x(OMe) 55,89; 55,96 e

56,12 3,88; 3,86; 3,96

(s) 3,77; 3,81;

3,90 (s)

* RMN de 1H (300 MHz, acetona-d6) (Criss, et. al., 1998)

Teste Biológico.

15

Atividade antipromastigota.

O ensaio de avaliação da atividade anti-leishmaníase foi realizado em

parceria com a Prof. Dra. Fani Dolabela do Programa de Pós-graduação em

Ciências Farmacêuticas do ICS-UFPA e a aluna de mestrado do programa de pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas do ICS-UFPA Andreza Veiga. Foram

testadas a substância S1 e as frações ST2, ST3, ST4 e ST5 das folhas de Virola

surinamensis contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis.

A viabilidade das formas promastigotas foi avaliada com base no

metabolismo do MTT, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada

em espectofotômetro, sob comprimento de onda igual a 490 nm.

Tabela 1. CIM e CI50 das obtido das folhas de Virola surinamensis testados em

formas promastigotas de Leishmania amazonensis.

Legenda: CIM=Concentração inibitória mínima; CI50 = Concentração inibitória 50%; DP= Desvio padrão; (1)= intervalo de confiança de 95%

As amostras testadas nos ensaios anti-leishmaníase não apresentaram

inibição da fase promastigota de Leishmania amazonensis testadas na concentração

inibitória mínima de (CIM> 200μg/mL e CI50> 200μg/mL), sendo portanto,

consideradas inativas.

CONCLUSÃO

Amostra L.amazonensis

CIM (µg/mL)

CI50 (µg/mL)±DP(1)

SSTT11

SSTT22

SSTT33

SSTT44

SSTT55

AAnnffootteerriicciinnaa BB

>>220000

>>220000

>>220000

>>220000

>>220000

00,,33990066

>>220000

>>220000

>>220000

>>220000

>>220000

00,,11669999±0,004

16

Neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico e a avaliação da atividade

anti-leshmaniose (Leishmania chagasi e L. amazonensis) de folhas da espécie

amazônica Virola surinamensis (Myristicaceae). Foram obtidos os extratos hexânico,

acetato de etila e metanólico das folhas de V. surinamensis e a partir do extrato

acetato de etila foi isolada e identificada a substância S1 e obtidas as frações ST2,

ST3, ST4, ST5.

A partir do extrato acetato de etila foi identificada a formil neolignana treo-1-

(3,4-dimetoxifenil)-2-(2-metoxi-4-formilfenoxi)-propan-1-ol (S1). Outras substâncias

foram isoladas mas não foram identificadas devido a problemas técnicos com o

aparelho de ressonância magnética.

Nos ensaios anti-leshmaniose as amostras testadas não apresentaram

atividade de inibição da fase promastigota frente à Leishmania amazonensis na

concentração (CIM> 200μg/mL e CI50> 200μg/mL).

REFERÊNCIAS

ALMEIDA, E.R. Plantas Medicinais Brasileiras. Conhecimentos populares e científicos. Hemus Editora Ltda. 1993. São Paulo – SP. AVENIETE, M.; PINTO, E. F.; SANTOS, L. S.; BERGMAN, B. R.; BARATA, L. E. S. Bioorganic & Medicinal Chemistry v. 15, p.7337–7343, 2007 BARATA, L. E. S.; SANTOS, L. S.; FERRI, P. H.; PHILLIPSON, D.; PAINE, A.; CROFT, S. L. Phytochemistry v. 55 p. 589±595, 2000.

BERGER, M.E., 1992. Plantas Medicinais da Amazônia, 2nd edition. CNPq, Brasil, p. 207. BORGES, F C, SANTOS, L. S., CORREA, M. J. C., OLIVEIRA, M N, SOUZA FILHO, A P S. Atividade alelopática de duas neolignanas isoladas de folhas de Virola surinamensis (Myristicaceae). Planta Daninha V.25, 51 - 59, 2007. BORGES, F C. Dissertação de mestrado com o titulo Estudo fitoquímico, alelopático e farmacológico de constituintes químicos das folhas de Virola michelii (Heckel) e Virola surinamensis (rol. Warb.), p.83-87 2003. CRISS, D. L.; COLLIER, W. E.; FISHER, T. H.; SCHULTZ, T. P. Holzforschung / v. 52, No. 2, 1998. EICH, E. PERTZ, H., KALOGA, M., SCHULZ, J., FESEN, M. R.,MAZUMDER, A., POMMIER, Y. J. Med. Chem. v.39, p.86 ± 95, 1996 FERNANDES, A. M. A. P; BARATA, L. E. S; FERRI, P. H. Phytochemistry, v.32, No.6, p.1567-72, 1993.

17

MOREIRA, R. C. R., COSTA, G. C., LOPES, T. C.; BEZERRA, J. L.; GUERRA, R. N.M., REBÊLO, J. M. M.; RIBEIRO, M. N. S.; NASCIMENTO, F. R.F.; COSTA, J. M. L. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.17, No.1, p. 59-63, jan/mar. 2007 MÜLLER I.; HAILU, A.; CHOI, B.S, ABEBE, T.; FUENTES, J.M.; MUNDER, M.; MODOLELL, M.; KROPF, P. Neglected Tropical Diseases, v.14, No.5, p.1-10, may. 2008. Disponível em: http://www.plosntds.org/article. PAHO, PAN AMERICAN HEALTH ORGANIZATION (PAHO). Leishmaniasis. Ultima atualização 2 mar 1012. Dísponivel em: http://new.paho.org/hq/index.php?option=com_content&task=blogcategory&id=3835&Itemid=4098&lang=en. Acesso em 2 jan 2012. RODRIGUES, W. A., Acta Amazônica V. 2, (2), 29(1972). SCHULTES, R. E.; HOLMSTED, B. Comments on poisonous plants from tropical new world.8. Miscellaneous plants of South-America. Lloydia, v.34, n.1, p.61-90, 1971.

TSAI, I. L.; HSIEH, C. F.; DUH, C. Y.; CHEN, I. S. CYTOTOXIC NEOLIGNANS FROM PERSEA OBOVATIFOLIA. Phytochemistry, v.43, No. 6, p. 1261-1263, 1996. WABWOBA, B.W.; ANJILI, C.O.; NGEIYWA, M.M.; NGURE, P.K.; KIGONDU, E.M.; INGONGA, J.; MAKWALI, J. Journal of Vector Borne Diseases, v.47, p.160-167, 2010.Disponível em : http:// www.mrcindia.org/journal. WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION. Lancet Infect. Dis. v.2, No.4, p.209-218, 2009

XIA, Y.; WANG, W. Chemical Papers v.64 No.5 p.630–636, 2010.

18

Figura 4 : Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de S1.

Figura 6: Espectro de RMN 13C de S1 (CDCl3, 75 MHz).

19

Figura 5: Mapa de correlação COSY 1H x 1H de S1 (CDCl3, 300 MHz).

Figura 7: Espectro de DEPT de S1 (CDCl3, 75MHz).

20

Figura 8: Mapa de correlação HETCOR de S1 (CDCl3).

Figura 9: Mapa de correlação HMBC de ST1 (CDCl3).

21

Figura 10 : Mapa de correlação HMBC de S1, expansão (CDCl3).

Figura 11: Espectro de massas de S1.

22

DIFICULDADES

Dificuldade na obtenção dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear de

1H e de 13C, devido a defeito no aparelho.

PARECER DO ORIENTADOR

O bolsista desenvolveu seu trabalho de maneira satisfatória alcançando os

objetivos inicialmente propostos. A avaria no espectrômetro de Ressonância

Magnética Nuclear dificultou o trabalho. Os resultados do trabalho são significativos

e serão submetidos a apresentação em Congresso Científico da área. Assim, sou de

parecer FAVORÁVEL a aprovação deste Relatório Final.

DATA: 09/08/2013

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Lourivaldo da Silva Santos ORIENTADOR

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Steven Souza Paes BOLSISTA