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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : 08/2014 a 08/2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Pesquisa de patógenos emergentes e reemergentes em morcegos nas mesorregiões metropolitana de Belém e nordeste do estado do Pará.

Nome do Orientador: Valíria Duarte Cerqueira

Titulação do Orientador: Doutora

Faculdade: Faculdade de Medicina Veterinária

Unidade: Campus Castanhal

Laboratório: Laboratório de Patologia Animal

Título do Plano de Trabalho: Pesquisa de patógenos emergentes e reemergentes em morcegos capturados nas mesorregiões metropolitana de Belém e nordeste do estado do Pará

Nome do Bolsista: Luis Otávio Cerqueira Lopes

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( X ) PIBIC/FAPESPA ( ) PRODOUTOR ( ) PARD - renovação ( ) PIBIC/PIAD

( ) PIBIC/AF-CNPq ( ) PIBIC/AF-UFPA ( ) PIBITI

( ) PADRC

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)) )

INTRODUÇÃO

A Amazônia brasileira tem experimentado, de acordo com seu histórico de uso

da terra, uma dinâmica muito veloz no processo de desmatamento. A área

desflorestada neste bioma chegou a 19% de sua área total em 2011 (INPE, 2012;

FERREIRA et al., 2012). Os estados que mais vem contribuindo para isso são:

Pará, Mato Grosso, Rondônia e Acre, onde o desmatamento é mais intenso ao

longo das principais rodovias existentes e ao longo do chamado “Arco do

Desmatamento” (BARRETO et al., 2005).

A escolha dos quirópteros como indicadores de monitoramento de patógenos

se deve ao papel dos morcegos nas doenças virais ser bem estabelecido,

particularmente com relação aos alfavirus, flavivirus, rhabdovirus e arenavirus

(MACKENZIE, FIELD AND GUYATT, 2003). A grande diversidade de espécies de

morcegos, a vida longa, a capacidade de se dispersar por longas distâncias e a

facilidade de algumas espécies de se adaptarem em ambientes periurbanos são

atributos que tornam os morcegos bons reservatórios de agentes não só virais,

mas bacterianos e parasitários também (CALISHER et al., 2006). Os morcegos

também podem estar ligados de diversas maneiras à emergência de doenças

infecciosas, sendo reservatório para o coronavírus responsável pela Síndrome

respiratória aguda grave (SARS-CoV) na China, assim como são conhecidos

reservatórios de muitas outras doenças emergentes no mundo como o Nipah

vírus, Hendra vírus, sendo hospedeiro potencial para o Ebola e doença de

Marburg, assim como de outros patógenos antigos e mais conhecidos como o

vírus rábico (FAO, 2011). Somado a isso, o Pará é o estado com o maior número

de espécies de morcego registradas (120), sendo que a lista de espécies para a

região não está esgotada e é bastante plausível que a Amazônia Brasileira

contenha mais de 160 espécies de morcegos (BERNARD et al., 2011).

As arboviroses são um exemplo de doença causada por alterações nos

ecossistemas pelo envolvimento de mosquitos, aves e animais silvestres,

mostrando um ciclo complexo entre vetores, hospedeiros e ecossistemas

(COLLINGE & RAY, 2007). A proximidade entre o homem, a fauna silvestre e a

doméstica leva à possibilidade de transmissão de agentes infecciosos pelo contato

direto ou por vetores artrópodes, ameaçando a saúde humana, dos animais

domésticos, mas principalmente, dos animais silvestres (GRATZ, 1994). Este

padrão tem sido observado muitas vezes em relação ao desmatamento,

agricultura e pecuária (DAHLBERG, 1992; PETERS, 1997; LACHER et al. 1999;

RUEDAS et al., 2004; CARROLL et al., 2005).

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JUSTIFICATIVA:

A Amazônia brasileira tem experimentado, de acordo com seu histórico de

uso da terra, uma dinâmica muito veloz no processo de desmatamento. A área

desflorestada neste bioma chegou a 19% de sua área total em 2011 (INPE, 2012;

FERREIRA et al. 2012). Os estados que mais vem contribuindo para isso são:

Pará, Mato Grosso, Rondônia e Acre, onde o desmatamento é mais intenso ao

longo das principais rodovias existentes e ao longo do chamado “Arco do

Desmatamento” (BARRETO et al. 2005). A escolha dos quirópteros como

indicadores de monitoramento de patógenos se deve ao papel dos morcegos nas

doenças virais ser bem estabelecido, particularmente com relação aos alfavirus,

flavivirus, rhabdovirus e arenavirus (MACKENZIE, FIELD AND GUYATT, 2003). A

grande diversidade de espécies de morcegos, a vida longa, a capacidade de se

dispersar por longas distâncias e a facilidade de algumas espécies de se

adaptarem em ambientes periurbanos são atributos que tornam os morcegos bons

reservatórios de agentes não só virais, mas bacterianos e parasitários também

(CALISHER et al, 2006). Os morcegos também podem estar ligados de diversas

maneiras à emergência de doenças infecciosas, sendo reservatório para o

coronavírus responsável pela Síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV) na

China, assim como são conhecidos reservatórios de muitas outras doenças

emergentes no mundo como o Nipah vírus, Hendra vírus, sendo hospedeiro

potencial para o Ebola e doença de Marburg, assim como de outros patógenos

antigos e mais conhecidos como o vírus rábico (FAO, 2011). Somado a isso, o

Pará é o estado com o maior número de espécies de morcego registradas (120),

sendo que a lista de espécies para a região não está esgotada e é bastante

plausível que a Amazônia Brasileira contenha mais de 160 espécies de morcegos

(BERNARD et al., 2011).

As arboviroses são um exemplo de doença causada por alterações nos

ecossistemas pelo envolvimento de mosquitos, aves e animais silvestres,

mostrando um ciclo complexo entre vetores, hospedeiros e ecossistemas

(COLLINGE & RAY, 2007). A proximidade entre o homem, a fauna silvestre e a

doméstica leva à possibilidade de transmissão de agentes infecciosos pelo contato

direto ou por vetores artrópodes, ameaçando a saúde humana, dos animais

domésticos, mas principalmente, dos animais silvestres (GRATZ, 1994). Este

padrão tem sido observado muitas vezes em relação ao desmatamento,

agricultura e pecuária (PETERS, 1997; LACHER et al. 1999; RUEDAS et al., 2004;

CARROLL et al., 2005). Muitos desses arbovírus ainda não possuem um ciclo e

reservatórios conhecidos, sendo necessária a investigação em animais silvestres

que possam ser reservatórios desses agentes. A distribuição geográfica do

hospedeiro define a área máxima em que a doença pode ser endêmica, e a

extensão da área geográfica em que o hospedeiro infectado pode ser encontrado

indica a área em que a doença humana pode ser endêmica. A dinâmica e fatores

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que controlam estes processos são desconhecidos, mas indicam que, embora um

estudo transversal único se possa estimar o intervalo de infecção, levantamentos

repetidos ou estudos longitudinais são necessários para elucidar padrões

temporais e espaciais.

Muitas vezes, a vigilância dessas áreas fornece uma visão mais clara do

potencial de doenças endêmicas do que a vigilância de doenças em seres

humanos, mesmo quando a incidência da doença humana é extremamente baixa

(por exemplo, em áreas endêmicas de Síndrome Pulmonar Hemorrágica - SPH -

por hantavírus). A distribuição do hospedeiro e do patógeno entre diferentes

comunidades bióticas e tipos de habitat indica o risco de infecção humana nos

vários habitats dentro de uma região geográfica. É provável que os agentes

patogênicos periodicamente sejam extintos em populações de reservatórios locais,

para serem reintroduzidos pelas populações vizinhas. O estudo da ecologia dos

reservatórios levará a integração e aplicação dos dados em relação ao

desenvolvimento ou refinamento de modelos preditivos que ajudem a identificar

para as autoridades de saúde pública os locais que podem representar uma

ameaça para saúde. Além de alertar precocemente para as ameaças, estes

modelos podem sugerir quando, onde e como intervir (por exemplo, sob a forma

de controle do reservatório ou modificação do habitat) para quebrar o ciclo de

transmissão ou para diminuir a incidência de infecção humana. Estudos de

reservatórios são um componente essencial de qualquer resposta de saúde

pública integrada para estabelecer doenças zoonóticas emergentes (MILLS &

CHILDS, 1998).

Na região Amazônica, a dinâmica da Leishmaniose visceral (LV) ainda é

pouco conhecida, mas ao longo dos anos tem-se observado o aumento da

incidência da doença principalmente no estado do Pará (Crescente, 2008).

Segundo Chagas et al. (2008) essa expansão pode estar associada às alterações

ambientais que têm influenciado na transmissão do agente. No Brasil, a espécie

Leishmania infantum chagasi é o agente etiológico da LV e tem como principal

vetor o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, sendo incriminada também a espécie

Lutzomyia cruzi em Corumbá, estado do Mato Grosso do Sul (Galati et al., 1997;

Santos et al., 1998) e em Jaciara, Mato Grosso (Missawa et al., 2011). Assim

como a LV, a Leishmania Tegumentar (LT) também apresenta alta incidência e

ampla distribuição geográfica, ocorrendo nas Américas desde o sul dos Estados

Unidos até o norte da Argentina. No Brasil as principais espécies causadoras

desta enfermidade são a Leishmania (Viannia) braziliensis e a Leishmania

(Leishmania) amazonensis, transmitidas por diferentes espécies de Lutzomyia.

(Medeiros e Roselino, 1999; Neves et al., 2005). Em muitas espécies de

mamíferos têm sido diagnosticada a infecção por L. i. chagasi no território

brasileiro, sendo o cão (Canis familiaris), o principal reservatório no ciclo urbano

da doença e o lobinho (Cerdocyon thous), o principal reservatório no ciclo silvestre

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(Rey, 2010). Outros canídeos silvestres como o cachorro vinagre (Speothos) e a

raposinha (Lycalopex vetulus) (Almeida et al., 2011), roedores (Rattus rattus)

(Ministério da Saúde, 2006), morcegos (Lima et al., 2008), onça (Dahroug et al.,

2010; Dahroug et al., 2011) e gambás (Didelphis spp.) (CARREIRA et al., 2010)

também albergam este protozoário e podem atuar como reservatórios, sendo

necessários mais estudos para avaliar a sua importância na manutenção dos

ciclos epidemiológicos destes agentes.

OBJETIVOS

Captura de quirópteros

Realização de necropsias em quirópteros capturados

Análises macroscópicas, histopatológicas e/ou imuno-histoquímicas dos

quirópteros

Análises moleculares quando necessária a investigação mais aprofundada

dos quirópteros.

Mapear as áreas de interesse para a conservação e de risco para

transmissão de patógenos tanto para animais silvestres, quanto domésticos

e o homem.

MATERIAIS E MÉTODOS:

Esforço Amostral

Foram realizadas viagens de campo em áreas de floresta nas mesorregiões

Metropolitana de Belém e Nordeste do Pará. Para tanto, foram utilizadas redes de

neblina que armadas durante a noite, por duas noites consecutivas, assim como

uma rede de dossel.

Captura e identificação de quirópteros

A captura de morcegos foi realizada com a utilização de redes-de-neblina (mist-

nets) de 2,5m x 9m de comprimento, dispostas juntas, em linha ou em forma de L,

armadas ao final do entardecer e posicionadas em locais estratégicos, em geral,

áreas comuns de passagem na mata, de modo a assegurar êxito na captura

(MANGINI; NICOLA, 2003). Os indivíduos coletados foram identificados com

auxílio de chaves específicas (VIZOTTO; TADDEI, 1973; GREGORIN; TADDEI,

2002), medidos, pesados, seguindo-se a anotação dos dados relativos a sexo,

idade e estado reprodutivo.

Os animais capturados foram acondicionados em sacos de pano e pelo menos

dois exemplares de cada espécie serão sacrificados para a coleta de material

biológico e para a coleção de referência. Os mesmos serão sedados com uma

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associação de ketamina e xilazina por via intramuscular e posteriormente

eutanasiados com superdosagem de lidocaína no forâmen magno, conforme

recomendação do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

(CONCEA). Os animais foram necropsiados in locu e fragmentos de todos os

órgãos coletados em duplicata, sendo conservados a -196ºC e em formalina

tamponada a 10 %, para posteriores análises.

Coleta de ectoparasitos

Durante o trabalho de campo, os ectoparasitos em fase parasitária foram

colhidos a partir de uma inspeção minuciosa sobre os quirópteros capturados.

Todos os ectoparasitos colhidos foram acondicionados em frascos protegidos com

algodão ou tecido e transportados até o Laboratório de Parasitologia Animal da

Universidade Federal do Pará, para triagem e identificação.

Análise histopatológica e imunohistoquímica

Parte dos fragmentos de diferentes órgãos foram colhidos e criopreservados a

- 80ºC em recipientes estéreis, visando os estudos moleculares. Os fragmentos de

diferentes órgãos fixados em formol a 10%, tamponado com fosfatos, e, após a

fixação, o material foi clivado, desidratado em álcool etílico, diafanizado em xilol e

incluído em parafina. Fragmentos foram cortados a 5µm para coloração com

hematoxilina e eosina (HE) (PROPHET et al., 1994) e para imuno-histoquímica

(IHQ). A IHQ, quando necessária, seria realizada a partir de protocolo pré-

estabelecido (TUNTASUVAN et al., 2000). O bloqueio da peroxidase endógena

será realizado com peróxido de hidrogênio a 3% em água destilada. A

recuperação antigênica será por calor em tampão citrato (pH 6,0). O bloqueio das

reações inespecíficas será realizado com leite desnatado (Molico, Nestlé®) 5% em

água destilada. Serão utilizados anticorpos primário para os vários patógenos a

serem estudados. Após a incubação no anticorpo primário será aplicado o

anticorpo secundário biotinilado, o conjugado estreptavidina-peroxidase (Dako

LSAB+kit, peroxidase, Dako Corporation, Carpinteria, USA) e o cromógeno DAB

(Diaminobezidina, Dako Corporation, Carpinteria, USA). Os cortes serão

contracorados com hematoxilina de Harris. Como controle positivo serão utilizados

tecidos sbidamente positivos para os respectivos patógenos.

RESULTADOS:

Foram realizadas quatro viagens para captura de morcegos (figura 1, 2 e 3).

Foram necropsiados 53 quirópteros (4). Todos os órgãos foram coletados, fixados

em formol a 10%, tamponado com fosfatos. Após a fixação, o material foi clivado,

desidratado em álcool etílico, diafanizado em xilol e incluído em parafina.

Fragmentos foram cortados a 5µm e corados com hematoxilina e eosina (HE)

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(PROPHET et al., 1994). Quando possível, era coletado o sangue, fezes em

formol e fragmentos de tecido e armazenados no nitrogênio.

Figura 1. Armação das redes-de-neblina para captura noturna dos quirópteros

Figura 2. Verificação das redes-de-neblina ao longo da noite de captura.

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Figura 3. Verificação da rede de dossel ao longo da noite de captura (seta

amarela).

Figura 4. Realização de necropsia de um quiróptero durante a captura noturna.

Abaixo segue a tabela da captura de quirópteros com a data e identificação

do local de coleta:

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IDENTIFICAÇÃO DATA DE ENTRADA SEXO PROCEDÊNCIA

1 CH01/14 16/10/2014 Macho

Assentamento Expedito Ribeiro - Sta. Bárbara

2 CH02/14 16/10/2014 Fêmea


3 CH03/14 16/10/2014 Macho


4 CH04/14 16/10/2014 Macho


5 CH05/14 16/10/2014 Fêmea


6 CH06/14 16/10/2014 Fêmea


7 CH07/14 16/10/2014 Fêmea


8 CH08/14 16/10/2014 Fêmea


9 CH09/14 16/10/2014 Macho


10 CH10/14 16/10/2014 Macho


11 CH11/14 16/10/2014 Macho


12 CH12/14 16/10/2014 Macho


13 CH13/14 16/10/2014 Fêmea


14 CH14/14 16/10/2014 Fêmea


15 CH15/14 16/10/2014 Macho


16 CH16/14 16/10/2014 Fêmea


17 CH17/14 16/10/2014 Macho


18 CH18/14 16/10/2014 Macho


19 CH19/14 16/10/2014 Fêmea


20 CH20/14 17/10/2014 Macho


21 CH21/14 17/10/2014 Fêmea


22 CH22/14 17/10/2014 Macho


23 CH23/14 17/10/2014 Fêmea


24 CH24/14 17/10/2014 Macho


25 CH29/14 21/10/2014 Macho


26 CH30/14 27/10/2014 Macho


27 CH31/14 29/11/2014

Fernandes Belo / Fazenda Salinas - Viseu

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Foram confeccionadas lâminas de todos os sistemas dos 53 morcegos

necropsiados. Todas as lâminas foram lidas sem que houvessem alterações

dignas de nota. Desta forma, não foram realizadas análises ultraestruturais,

imuno-histoquímicas e moleculares deste material, uma vez que não havia

sugestão de lesões que indicassem outras análises.

28 CH32/14 30/11/2014 Fêmea Açaiteua - Viseu

29 CH33/14 30/11/2014 Macho Açaiteua - Viseu

30 CH34/14 30/11/2014 Fêmea Açaiteua - Viseu

31 CH35/14 30/11/2014 Macho Açaiteua - Viseu

32 MO67/14 04/07/2014 Fêmea Nova Timboteua











43 GNF33/14 11/11/2014 Fêmea Gov. Nunes Freire/MA





48 GNF59/14 11/11/2014 Macho Gov. Nunes Freire/MA

49 GNF61/14 11/11/2014 Macho Gov. Nunes Freire/MA

50 PC36/14 11/11/2014

Macho Parque Estadual Chandless - Manoel

Urbano/AC

51 PC34/14 11/11/2014

Macho Parque Estadual Chandless - Manoel

Urbano/AC

52 PC28/14 11/11/2014

Fêmea Parque Estadual Chandless - Manoel

Urbano/AC

53 PC35/14 11/11/2014

Fêmea Parque Estadual Chandless - Manoel

Urbano/AC

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PUBLICAÇÕES: Ainda não foram geradas publicações com o projeto, mesmo

porque o mesmo será finalizado ainda.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DIFICULDADES – Não foram encontradas dificuldades para realização do projeto.

PARECER DO ORIENTADOR: O aluno desempenhou as suas atividades com responsabilidade, tanto no laboratório quanto no trabalho de campo. A captura de morcegos é um trabalho extenuante, demandando o período da noite e o aluno esteve presente demonstrando atenção e iniciativa própria em todos os momentos.

DATA : 10/08/2015

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

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ASSINATURA DO ALUNO

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