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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

EDNA MARIA CAMELO CHAVES

AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] DE

ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO

FORTALEZA

2012


AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] DE

ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO

Tese apresentada ao Programa de Pós - Graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Orientador (a): Profª. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos

FORTALEZA

2012


AÇÃO ANSIOLÍTICA E ANTICONVULSIVANTE DA 6-[(E)-ESTERIL-PIRAN-2-ONA] DE ANIBA PANURENSIS EM CAMUNDONGOS: POSSÍVEL MECANISMO DE

AÇÃO

Tese apresentada à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.

Aprovado em: ___ /____ /____.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________

Profª. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos (Orientadora) Universidade Federal do Ceará

___________________________________________

Profª Dra. Luiza Kalyne Almeida Moreira Leal Universidade Federal do Ceará

______________________________________________

Profª. Dra. Paula Matias Soares Universidade Estadual do Ceará

_______________________________________________

Profª Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar Universidade Federal do Ceará

______________________________________________

Profª. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa Universidade Federal do Ceará

A Deus, fonte divina de luz, sabedoria e

amor, por toda a força e perseverança e

por ter colocado na minha vida pessoas tão

importantes que contribuíram para a

concretização deste sonho.

Aos meus pais, Antônio Camelo e Maria

Darci, pela oportunidade de viver e de

poder lutar para atingir meus objetivos.

Às amigas Tereza Cristina Freitas e Vilma

Freitas, pela amizade sincera, pelo

incentivo e apoio na execução desta Tese

de Doutorado.

Aos meus irmãos, Elizabete Camelo, Irani

Camelo, Irandi Camelo, Antônio Camelo,

Rocélio Camelo, em particular, à Davina

Camelo, pelo incentivo para imersão na

vida acadêmica.

AGRADECIMENTOS

À professora Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos, minha estimada

orientadora, grande pesquisadora do Laboratório de Neurofarmacologia, pela

amizade, pelos ensinamentos, pelas críticas e pela confiança para concretização de

mais um projeto na minha vida acadêmica e profissional. Muito obrigada pela valiosa

contribuição.

À professora Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pesquisadora do

Laboratório de Neurofarmacologia, por ter me aceito no Laboratório. Pessoa a quem

tenho admiração e respeito por ser uma grande pesquisadora. Muito Obrigada.

À professora Dra. Danielle Silveira Macedo, pesquisadora do Laboratório

de Neurofarmacologia, pelos ensinamentos, pela disponibilidade e contribuição na

realização deste trabalho e dos demais.

À professora Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal, pesquisadora do

Laboratório de Neurofarmacologia, por ter nos recebido no laboratório para

realização de experimentos, e por ter aceito gentilmente o convite para participar da

banca examinadora desta tese.

Às professoras Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy, Dra. Paula Matias

Soares e Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar, por terem gentilmente aceito o

convite para participar da banca examinadora da tese de doutorado.

Aos professores do Laboratório de Neurofarmacologia, Silvânia

Vasconcelos, Francisca Cléa, Glauce Viana, Marta Fontenele, Daniele Macedo, pela

contribuição em nossa formação acadêmica.

Ao professor José Maria Barbosa Filho, que gentilmente nos cedeu a

substância isolada para realização dos experimentos.

À doutoranda Ana Silvia Suassuna Carneiro Lúcio pelo isolamento da

substância utilizada nos experimentos.

Às professoras Maria Vera Moreira Leitão Cardoso, Maria do Socorro

Sherlock, Maria Veraci de Oliveira, pelo apoio e pelos ensinamentos, nesta trajetória

da pós-graduação.

Aos amigos do Laboratório de Neurofarmacologia, José Eduardo, Elaine

Cristina, Sarah Escudeiro, Raquel Lima, Marta Arruda, Clayton Aguiar, Márcia

Calheiros, Rita Neuma, Rafael Sampaio, Taciana Rodrigues, Valdécio Monteiro,

Naiara Ximenes, Caren Sousa, Germana Vasconcelos, Anália, Rodrigo Lobato,

Gilberto Cerqueira, Aline Holanda, Emiliano, Edith Venâncio, pela amizade, pelo

convívio agradável e préstimos.

Às amigas do Hospital Geral de Fortaleza, Albertisa Alves, Ilvana Lima,

Sônia Campos, Antonila Pimentel, Ana Érica, Gilvânia Grangeiro, Angela Timbó,

Luiza de Marilac, Mayrianne Brindeiro, pelo incentivo e apoio durante a realização do

doutorado.

Às amigas Leiliane Martins, Márcia Coelho, Regina Dodt, Ana Valeska,

sempre presentes em muitos momentos.

Aos técnicos do Laboratório de Neurofarmacologia, Vilani Rodrigues,

Arnaldo e Lena, pela amizade, disponibilidade e ajuda imprescindível em muitos

momentos.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, em

especial à Aura Rhanes Nogueira Yda pelo incentivo, presteza e colaboração

durante o período de realização desta tese.

Aos órgãos de fomento: CNPq, CAPES e FUNCAP, pelo apoio financeiro.

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação de Farmacologia e Fisiologia

da Universidade Federal do Ceará.

RESUMO

CHAVES, E.M.C. Ação ansiolítica e anticonvulsivante da 6-[(E)-esteril-piran-2-ona] de Aniba panurensis em camundongos: possível mecanismo de ação. 2012. 198f. Tese

(Doutorado). Orientadora: Silvânia Maria Mendes Vasconcelos. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. O gênero Aniba destaca-se por suas propriedades farmacológicas, tais como ansiolítica, antidepressiva e vasorelaxante. Dos frutos de Aniba panurensis conhecida popularmente por ―louro amarelo‖ foi identificada uma pirona natural, a 6-[(E)-esteril-piran-2-ona]. O objetivo do presente trabalho foi verificar os efeitos neurofarmacológicos da 6-[(E)-esteril-piran-2-ona (STY) obtida da Aniba parusinensi em camundongos através de testes comportamentais (atividade locomotora espontânea (ALE), rearing e grooming), testes de

indução de convulsão química e dosagens neuroquímicas de aminoácidos (glutamato (GLU), aspartato (ASP), ácido γ-aminobutírico (GABA), glicina (GLI), taurina (TAU), histidina (HIS) em córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE). Foram utilizados camundongos Swiss, machos, com peso médio de 28 gramas. Os animais foram tratados com dose única de STY (1, 5, 10 ou 20 mg) por via intraperitoneal. Trinta minutos após administração os animais foram submetidos aos testes comportamentais e teste de convulsão induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), estricnina, bicuculina e pilocarpina. Imediatamente após os testes os animais foram sacrificados e as áreas cerebrais de interesse dissecadas para a dosagem da concentração de aminoácidos através de HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography). No teste de ALE a STY na dose de 10 ou 20

mg/kg aumentou atividade locomotora quando comparada ao grupo controle. No Labirinto em cruz elevada e o teste da placa perfurada, a STY em todas as doses comprovou seu efeito ansiolítico, pois aumentou todos os parâmetros analisados. Na dosagem de aminoácidos neurotransmissores após o teste de comportamento houve aumento nas concentrações dos aminoácidos inibitórios (GABA, GLI, TAU, HIS) e excitatórios (ASP, GLU) no CPF, HC e CE. Após o pré-tratamento com STY os animais foram submetidos ao teste de indução de convulsão por PTZ (85 mg/kg) ou Bicuculina (12 mg/kg) foram observados aumentos na latência de convulsão e morte, com animais sobreviventes na maior dose. No teste com a indução de convulsão por estricnina (20 mg/kg/ ocorreu o aumento na latência de convulsão (STY-10: 50,42 ± 7,20; STY-20: 65,99 ± 3,22) e latência de morte (STY-1: 20 ± 1,72; STY-10: 19,17 ± 1,87; STY-20: 23,83 ± 1,55) em todos os animais pré-tratados com STY. Na indução de convulsão por pilocarpina ocorreu uma diminuição da latência de morte. Após os testes os animais realizou-se a dosagem da concentração dos aminoácidos (ASP, GLU, GLI, TAU e GABA). No CPF aumentaram ASP, TAU, GABA. Já no HC o aumentou GLU, ASP, GLI e GABA. Na indução de convulsão com estricnina no CPF ocorreu o aumento no ASP, TAU, GABA, enquanto no HC aumentou ASP, GLI, TAU, GABA. No modelo de indução com bicuculina no CPF aumentou o ASP, GLU, GLI, TAU, GABA, enquanto no HC aumentou ASP, GLU, GLI, TAU, GABA. No modelo de indução com pilocarpina no CPF aumentou ASP, GABA, GLI, enquanto no HC aumentou apenas o ASP. Conclui-se que a STY apresenta um efeito ansiolítico nos testes de comportamento, efeito protetor nos teste de indução de convulsão por PTZ, estricnina e bicuculina. Após o doseamento dos aminoácidos pode-se demonstrar a participação dos sistemas glutamatérgico, GABAérgico e glinérgico. Palavras-chave: Plantas medicinais. Aniba panurensis. Ansiedade. Convulsões.

Aminoácidos-Peptidérgicos.

ABSTRACT

CHAVES, E.M.C. Anxiolytic and anticonvulsant effects of 6-[(E)-styryl-pyran-2-one] of Aniba panurensis in mice: possible mechanism of action. 2012. 198p. Thesis (PhD).

Advisor: Silvânia Maria Mendes Vasconcelos. Pharmacology Graduate Program. Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceará, Fortaleza, 2012. The genus Aniba stands out for its pharmacological properties, such as anxiolytic, antidepressant and vasorelaxant. Of the Aniba panurensis fruits popularly known as ―louro amarelo‖ a natural pyrone, 6-[(E)-styryl-pyran-2-one], was identified. The objective of this study was to verify the neuropharmacological effects of 6-[(E)-styryl-pyran-2-one] (STY), obtained from Aniba panurensis, in mice through behavioral tests (spontaneous locomotor activity (SLA), rearing and grooming), tests of chemically induced seizures and neurochemical dosages of amino acids (glutamate (GLU), aspartate (ASP), γ-aminobutyric acid (GABA), glycine (GLY), taurine (Tau), histidine (HIS) in the prefrontal cortex (PFC), hippocampus (HC) and striatum (ST). We used Swiss mice, male, with an average weight of 28 grams. The animals were treated with a single dose of STY (1, 5, 10 or 20 mg) by intraperitoneal injection. Thirty minutes after administration, the animals were subjected to behavioral tests of chemically induced seizures by pentylenetetrazol (PTZ), strychnine, bicuculline and pilocarpine. Immediately after the tests, the animals were sacrificed and the brain areas of interest were dissected to estimate the amino acid concentration via HPLC (High Performance Liquid Chromatography). In the SLA test the STY at 10 or 20 mg/kg dose increased locomotor activity when compared to the control group. In the elevated plus-maze and hole-board tests, the STY in all doses proved its anxiolytic effect, because it increased all parameters analyzed. In the dosage of amino acid neurotransmitters after behavioral test there was an increase in inhibitory amino acid concentrations (GABA, GLY, TAU, HIS) and excitatory (ASP, GLU) in PFC, HC and ST. After pretreatment with STY, the animals were tested for seizures induced by PTZ (85 mg/kg) or Bicuculline (12 mg/kg), we observed an increase in the latency of seizures and death in surviving animals at the highest dose. During the strychnine-induced seizures test (20 mg/kg) there was an increase in seizure latency (STY-10: 50.42 ± 7.20; STY-20: 65.99 ± 3.22) and latency to death (STY-1: 20 ± 1.72; STY-10: 19.17 ± 1.87; STY-20: 23.83 ± 1.55) in all animals pretreated with STY. In the pilocarpine-induced seizures there was a decrease in the latency to death. After testing the animals, we conducted the dosage of amino acid concentrations (ASP, GLU, GLY, TAU and GABA). PFC increased ASP, TAU and GABA. HC increased GLU, ASP, GLY and GABA. In the strychnine-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, TAU and GABA, while the HC increased ASP, GLY, TAU and GABA. In the bicuculline-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, GLU, GLY, TAU and GABA, while the HC increased ASP, GLU, GLY, TAU and GABA. In the pilocarpine-induced seizure in PFC there was an increase in ASP, GABA, GLY, while the HC increased only ASP. We concluded that STY presents an anxiolytic effect in behavioral tests and a protective effect in tests of induced seizures by PTZ, strychnine and bicuculline. After the dosage of the amino acids we can demonstrate the involvement of glutamatergic, GABAergic and glycinergic systems. Keywords: Plants, Medicinal. Aniba panurensis. Anxiety. Seizures. Peptidergic Amino Acids.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

± Mais ou menos

% Percentagem

ºC Grau (s) Centígrado (s)

α Alfa

β Beta

γ Gama

5-HT Serotonina

® Marca Registrada

μL Microlitro

μg Micrograma

μg/g Micrograma/grama

μm Micromol/grama

μM Micromolar

ALE Atividade Locomotora

ANOVA Análise de Variância

Cm Centímetro

AMPA propionato de α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazole

AMPc Adenosina Monofosfato Cíclico

ASP Aspartato

ATV Área Tegmentar Ventral

Ca2+

Íon Cálcio

CA Cainato

CE Corpo Estriado

Cl -

Íon cloreto

CPF Córtex Pré-frontal

CPFvm Cortex Pré-frontal Ventromedial

CYP Sistema Enzimático P-450

DA Dopamina

D2 Receptor Dopaminérgico do Tipo D2



DZP Diazepam

EUA Estados Unidos da América

Fe3+

Íon férrico

FLU Flumazenil

G Grama

GABA Ácido Gama-Aminobutírico

GABAA

Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo A

GABAB

Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo B

GABAc Receptor do Ácido Gama-Aminobutírico do Tipo C

GLU Glutamato

GLI Glicina

G Gromming

H Hora

HC Hipocampo

HPLC High Perfomance Liquid Chomatography

i.p. Intraperitoneal

K+

Potássio

LCE Labirinto em Cruz Elevado

LTP Potenciação a Longo Prazo

M Molar

MEK-1 Map Quinase

mL/Kg Mililitros/quilograma

mg/kg Miligrama/quilograma

mm Milímetro

mmol/L Milimol/litro

mM Milimol

mL Mililitros

min Minuto

NEBA Número de Entradas nos Braços Abertos

NQ Número de Quedas

P Nível de Significância

PTB Pentobarbital Sódico

nm Namômetros

nmol/min/mg Nanomol/minuto/miligrama

NMDA N-metil-D-aspartato

NO Óxido Nítrico

OMS Organização Mundial de Saúde

PTZ Pentilenotetrazol

R Rearing

r.p.m Rotações por minuto

SNC Sistema Nervoso Central

SNpc Substância Negra Par Compacta

STY Estiril Pirona

TAU Taurina

TP Tempo de Permanência

TPBA Tempo de Permanência nos Braços

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1 – Esquema do Teste do Campo Aberto ............................................... 59

Esquema 2 – Esquema A e B do teste do Labirinto em Cruz elevado .................... 61

Esquema 3 – Esquema A e B do Teste da Placa perfurada .................................... 62

Esquema 4 – Esquema A e B do teste do Rota Rod ............................................... 64

Esquema 5 – Esquema do teste do tempo de sono induzido por pentobarbital

sódico........................................................................................................................ 65

Esquema 6 – Esquema do teste de indução de convulsão por pentilenotetrazol,

estricnina, bicuculina e pilocarpina ........................................................................... 68

Esquema 7 – Determinação de aminoácidos após os testes de comportamento ... 70

Esquema 8 – Determinação de Aminoácidos após os testes de Convulsão .......... 70

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Laurus nobilis ..........................................................................................23

Figura 2A – Estrutura química da 6-[(E)-esteril-piran-2 – ona] Aniba panurensis ... 26

Figura 2B – Estrutura química da Piper methysticum .............................................. 27

Figura 3A – Aniba parusinensi folhas e frutos .......................................................... 27

Figura 3B – Aniba parusinensi folhas e frutos .......................................................... 28

Figura 4 – Vias Gabeaérgicas .................................................................................. 42

Figura 5 – Receptor GABA-A ................................................................................... 44

Figura 6 – Efeito da STY sobre a atividade exploratória avaliada através do teste de

campo aberto em camundongos .............................................................................. 73

Figura 7 – Efeito da STY sobre o número de rearing avaliada através do teste de




Figura 9 – Efeitos da STY sobre o número de entradas no braço aberto (NEBA) no

teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ...................................................... 75

Figura 10 – Efeito da STY sobre o tempo de permanencia nos braços abertos

(TPBA) no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ..................................... 76

Figura 11 – Efeito da STY sobre o número de entradas nos braços fechados (NEBF)

no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos .................................................. 77

Figura 12 – Efeito da STY sobre o tempo de permanencia nos braços fechados

(TPBF) no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos ..................................... 77

Figura 13 – Efeito da STY sobre o número de mergulhos no teste da placa

perfurada .................................................................................................................. 79

Figura 14 – Efeitos da STY sobre os níveis de aminoácidos excitatórios (A) e

inibitórios (B) em córtex pré-frontal de camundongos .............................................. 90


inibitórios (B) em hipocampo de camundongos ....................................................... 91


inibitórios (B) em corpo estriado de camundongos .................................................. 93

Figura 17 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e

inibitórios (B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por PTZ ......... 115

Figura 18 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (18 A) e

inibitórios (18 B) em hipocampo de camundongos após convulsão induzida por

PTZ ......................................................................................................................... 117


inibitórios (19 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por

estricnina ................................................................................................................ 119

Figura 20 – Efeitos da STY concentração de aminoácidos excitatórios (20 A)


estricnina................................................................................................................. 121

Figura 21 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (21 A)


bicuculina................................................................................................................. 123


inibitórios (22 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por

bicuculina................................................................................................................. 125



pilocarpina............................................................................................................... 127


inibitórios (24 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por

pilocarpina............................................................................................................... 128

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Descrição das drogas utilizadas ............................................................ 56

Quadro 2 – Descrição dos equipamentos utilizados ................................................ 57

Quadro 3 – Resumo das alterações na dosagem de concentração dos aminoácidos

após administração de STY nas dose de 1 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral (CPF)

hipocampo (HC) corpo estriado (CE) de camundongos ......................................... 139


após administração de STY nas dose de 1 , 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral

(CPF) hipocampo (HC) de camundongos nos modelos de indução de convulsão por

pentilenotetrazol (PTZ) e estricnina ........................................................................ 140


após administração de STY nas doses de 1, 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral


bicuculina e pilocarpina .......................................................................................... 141

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Efeito da STY, flumazenil e diazepam no teste de Rota Rod ................ 80

Tabela 2 – Efeito da administração da STY na latência de sono e duração do sono

induzida por pentobarbital sódico ............................................................................. 81

Tabela 3 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis no modelo

convulsão induzido por PTZ em camundongos ..................................................... 101


convulsão induzido por estricnina em camundongos.............................................. 102


convulsão induzido por bicuculina em camundongos............................................. 103


convulsão induzido por pilocarpina em camundongos ........................................... 104

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 19

1.1 Generalidades ..................................................................................................... 19

1.2 Família Lauraceae .............................................................................................. 21

1.3 Gênero Aniba ....................................................................................................... 24

1.4 Pironas ................................................................................................................. 25

1.5 Ansiedade ............................................................................................................ 29

1.6 Modelos experimentais de ansiedade ............................................................... 32

1.7 Epilepsia: modelos animais de convulsão ........................................................ 34

1.8 Aminoácidos e neurotransmissão ..................................................................... 39

1.9 Áreas cerebrais estudadas ................................................................................. 48

2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA ........................................................................... 53

3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 54

4 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 55

4.1 Planta .................................................................................................................... 55

4.2 Animais ................................................................................................................ 55

4.3 Drogas utilizadas ................................................................................................. 56

4.4 Equipamentos ...................................................................................................... 57

4.5 Preparo das drogas ............................................................................................. 58

4.6 Protocolo de tratamento ..................................................................................... 58

4.7 Testes de comportamento .................................................................................. 58

4.7.1 Teste do Campo Aberto ................................................................................... 58

4.7.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE) ................................................... .60

4.7.3 Teste da placa perfurada ................................................................................. 62

4.7.4 Teste do Rota Rod ........................................................................................... .63

4.7.5 Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital ................................................. .65

4.8 Avaliação da Atividade Anticonvulsivante ........................................................ 66

4.8.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol ....................................... 66

4.8.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricinina ................................................ 66

4.8.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina ................................................ 67

4.8.4 Teste de Convulsão induzida por Pilocarpina ............................................... 67

4.9 Dosagem de Aminoácidos .................................................................................. 69

4.10 Análise Estatística ............................................................................................. 71

5 RESULTADOS ......................................................................................................... 72

5.1 Capítulo I: Efeitos da 6–estéril- 2 -pirona sozinha ou associada com

antagonista benzodiazepínico em testes comportamentais em camundongos .. 72

5.1.1 Teste do Campo Aberto ................................................................................... 72

5.1.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado ............................................................... 74

5.1.3 Teste da Placa perfurada ................................................................................. 78

5.1.4 Teste do Rota Rod ............................................................................................ 79

5.1.5 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico ........................ 81

5.1.6 Discussão ......................................................................................................... 82

5.1.7 Conclusão ......................................................................................................... 88

5.2 Capítulo II: Dosagem de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e

corpo estriado de camundongos tratados de forma aguda com STY após os

testes comportamentais ........................................................................................... 89

5.2.1 Resultados ........................................................................................................ 89

5.2.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal,

hipocampo e corpo estriado de camundongos após tratamento com STY ......... 89

5.2.1.2 Determinação das concentrações de aminoácidos no hipocampo de

animais pré-tratados com STY ................................................................................. 91

5.2.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no corpo estriado de

animais pré-tratados com STY ................................................................................. 92

5.2.2 Discussão ......................................................................................................... 94

5.2.3 Conclusões ...................................................................................................... 100

5.3 CAPITULO III: Efeitos da molécula de STY nos modelos de convulsão

induzidos por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina ................. 101

5.3.1 Resultados ....................................................................................................... 101

5.3.1.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol ................................... 101

5.3.1.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricnina ............................................. 102

5.3.1.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina ............................................ 103

5.3.1.4 Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina ........................................... 104

5.3.2 Discussão ........................................................................................................ 105

5.3.3 Conclusão ........................................................................................................ 113

5.4 CAPITULO IV: Dosagem de aminoácidos no CPF e HC de camundongos

pré-tratados com STY nos modelos de convulsão induzido por PTZ, estricnina,

bicuculina, pilocarpina............................................................................................. 114

5.4.1 Resultados ....................................................................................................... 114

5.4.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal

de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por

PTZ............................................................................................................................. 114


animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ .... 116


de animais pré-tratados com STY com em modelo de convulsão induzidas por

estricnina .................................................................................................................. 118


animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por

estricnina .................................................................................................................. 120



estricnina .................................................................................................................. 122


animais pré-tratados com STY comem modelo de convulsão induzidas por

bicuculina .................................................................................................................. 124


de animais pré-tratados com STY com em modelo de convulsão induzidas por

pilocarpina ................................................................................................................ 126


animais pré-tratados com STY comem modelo de convulsão induzidas por

pilocarpina ................................................................................................................ 128

5.4.2 Discussão ........................................................................................................ 129

5.4.3 Conclusão ........................................................................................................ 136

6 CONSIDERAÇÕES FINAS ..................................................................................... 138

7 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 142

REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 143

19

1 INTRODUÇÃO

1.1 Generalidades

Plantas medicinais, ao longo dos anos, vêm sendo utilizadas como fonte

de moléculas precursoras para desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta

de novas moléculas de origem vegetal com potencial terapêutico tem despertado

interesse de pesquisadores e da indústria farmacêutica.

Os produtos naturais revelam grande quantidade e diversidade de

moléculas com diferentes propriedades físico-químicas e biológicas. No entanto,

apesar do grande avanço nesta área, apenas cerca de 25 a 30% das plantas foram

avaliadas no que concerne ao potencial medicinal (CALIXTO, 2005; VEIGA-JÚNIOR;

MELLO, 2008). Desta maneira, as plantas medicinais constituem campo bastante

fértil em relação à pesquisa com finalidade de obtenção de novas drogas e

compostos com atividade terapêutica (EVANS, 1996).

Plantas medicinais e seus metabólitos secundários têm sido utilizados na

investigação de funções fisiopatológicas e sítios de ação de fármacos. Inúmeras

classes de diferentes produtos naturais têm sido empregadas como matéria-prima

para síntese de diferentes substâncias bioativas. Com os avanços tecnológicos

ocorridos na indústria química, as moléculas ativas presentes nas plantas medicinais

passaram a ser utilizadas de modo cada vez mais purificado, ao invés de extratos

vegetais, atingindo produção quantitativa e qualitativa em escala industrial

(CALIXTO, 2000; ELVIN-LEWIS, 2001).

O Brasil destaca-se no cenário mundial por sua biodiversidade. Muitas

plantas dos biomas brasileiros, como o Cerrado, a Caatinga, o Pantanal, a Floresta

Amazônica e a Mata Atlântica, têm sido utilizadas como fármacos naturais pelas

populações locais com baixo poder aquisitivo no tratamento de várias doenças,

como esquistossomose, leishmaniose, malárias e infecções fúngicas e bacterianas,

doenças cardíacas, doenças psiquiátricas, câncer, dores e cicatrizações

(ALBUQUERQUE; OLIVEIRA, 2007).

No Brasil, estudos clínicos têm demonstrado os benefícios das plantas no

tratamento de doenças que comprometem o SNC, citam-se alguns exemplos de

20

sucessos terapêuticos, como Valmane® ou Valeriane®, à base de um extrato

padronizado de Valeriana officinalis; Tebonin®, Tanakan®, Kiadon®, Equitan® ou

Ginkoba®, a base de extrato de Ginkgobiloba; Laytan® ou Kawa-kawa®, extratos

padronizados de Piper methysticum; Hyperico®, Iperisan®, Börnin®, Fiotan®,

Jarsin® ou Hiperex®, extratos padronizados de Hypericumperforatum (DUARTE,

2007).

Diante da importância do uso de plantas medicinais, pesquisadores da

Assembleia Mundial da Saúde vêm discutindo questões, com resoluções,

destacando os seguintes pontos: a maioria das populações, em vários países em

desenvolvimento, depende da medicina tradicional para cuidados primários de

saúde; a força de trabalho, representada pelos adeptos e praticantes da medicina

tradicional, é potencialmente significativa para os serviços de saúde; as plantas

medicinais são de grande importância para saúde individual e das comunidades

(BRASIL, 2004; CARVALHO et al., 2007).

Os medicamentos industrializados produzidos beneficiam parcela

pequena da população, pois o custo, muitas vezes, inviabiliza o tratamento, fazendo

com que vias alternativas e de menores custos sejam utilizadas. Por outro lado, a

desinformação e o mau uso das plantas medicinais geralmente provocam o

aparecimento de reações colaterais graves ou então o insucesso no tratamento,

causando descrença na sua eficácia (CARVALHO, 2001). Considera-se planta

medicinal aquela planta administrada sob qualquer forma e por alguma via ao

homem, exercendo algum tipo de ação farmacológica (FOGLIO et al., 2006).

Nesse contexto social que os produtos naturais, em particular as plantas

medicinais, adquirem grande relevância como agentes terapêuticos e, como tais,

devem ser considerados e analisados. Todavia, o uso popular e mesmo tradicional

não são suficientes para validar científica e eticamente as plantas medicinais como

medicamentos eficazes e seguros. Neste sentido, as plantas medicinais não se

diferenciam de qualquer outro xenobiótico sintético e sua preconização ou a

autorização oficial do seu uso medicamentoso devem ser fundamentadas em

evidências experimentais, comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles

que as utilizam é suplantado pelos benefícios que possam advir (VIANA et al.,1998;

BANDEIRA et al., 2002).

21

Parte das plantas nativas brasileiras ainda não possui estudos e são

usadas de forma empírica, sem respaldo científico quanto à eficácia e segurança.

Em um país como o Brasil, com enorme biodiversidade, existe grande lacuna entre a

oferta de plantas e as poucas pesquisas, o que sugere que ainda existe quantidade

considerável de moléculas a serem descobertas oriundas do reino vegetal (FOGLIO

et al., 2006).

Na região Nordeste, o estudo do uso tradicional das plantas e dos seus

produtos tem aumentado gradualmente durante os últimos anos e resultou em

significativo número de publicações nessa área. A região é reconhecida por sua

biodiversidade, principalmente com relação a plantas, e abrange desde a floresta

Amazônica, Mata Atlântica, sistema de mangues e dunas costeiras, até florestas

secas e savanas, sendo o principal ecossistema do Nordeste do Brasil o bioma

―caatinga‖ (AGRA et al., 2007).

Aniba panurensis é uma planta encontrada no Norte e em parte do

Nordeste do Brasil e faz parte da família Lauraceae, que tem várias substâncias

ativas com atividade biológica. Espécies da Aniba panurensis têm demonstrado

ação tóxica para fungos e bactérias (OGER et al., 1994; HAMMER et al., 1999).

Barbosa et al. (1988) demonstram que os extratos hexânicos e clorofórmicos dos

cálices e frutos de Aniba riparia e dos cálices de Aniba SP mostraram atividade

contra S. aureus, B. cereuse C albicans., sendo inativos contra Proteussp, S.

sallinarum e E. coli. Alguns estratos de plantas tropicais do gênero Aniba mostraram

toxicidade para raças resistentes ao AZOLE de C. albicans (KLAUSMEYER et al.,

2004).

1.2 Família Lauraceae

A família Lauracea tem sido alvo de pesquisas nos últimos anos, devido à

diversidade, sendo representada por mais de 2000-2500 espécies em 52 gêneros,

encontrados principalmente na Amazônia, America, Ásia Tropical, Austrália,

Madagascar e em pequena proporção no Sul da África (ROHWER, 1993). O gênero

inclui Persea (150spp.), Ocotea (300-400 spp.), Cinnamomum (250 spp.), Aniba (40

22

spp.), Litsea (400 spp.), Neolitsea (80 spp.), Lindera (100 spp.), Laurus (2 spp.) e

Cryptocarya (200-250 spp.) (EVANS, 1996).

No Brasil, as lauráceas apresentam ampla distribuição, sendo

encontradas nas restingas do litoral, nos cerrados e nas matas em geral. As

espécies desta família possuem importância econômica devido à produção de óleos

essenciais, utilizados como medicamentos e condimentos, além da qualidade e

aceitação de suas madeiras, aplicadas em diversos fins (CZARNESKI et al., 2001).

As árvores e os arbustos da família Lauraceae são geralmente aromáticos

monóicos, dioicos, ou gimnodioicos, sendo que o gênero cassita se apresenta como

produtor de espécies de trepadeiras (BARROSO, 2002). Encontrados nas florestas

tropicais e subtropicais com casca, folhas verdese frutos. A distribuição das espécies

arbóreas depende de fatores como habitat, a regeneração dos nichos ecológicos e

as variações fenomenológicas para manutenção das espécies (SRI-NGERNYUANG,

2003).

As Lauraceaes destacam-se entre as demais famílias pela importância

econômica. Muitas espécies têm sido utilizadas pelas indústrias para fabricação de

diversos produtos em marcenaria e construção, na indústria da perfumaria e química

e medicina popular. As espécies utilizadas na culinária são a Persea americana Mill,

fruto conhecido como abacate, que apresenta alto valor comestível da sua polpa,

além do Laurusnobilis L., que possui folhas usadas como tempero (MARQUES,

2001-2011).

O nome da família Lauraceae deriva de lauer que significa ―verde‖ e laus

―louvor‖, em alusão a coroar ou cingir de louros (Figura1), pois a folha de

Laurusnobilis, o loureiro, era utilizada para confecção de coroas, para homenagear

guerreiros e atletas vitoriosos.

23

Figura 1 – Laurusnobilis

Fonte: Antica Erboristeria Romana

A Lauraceae é uma das famílias mais importantes e mais difíceis na

identificação botânica de suas espécies. Sua prospecção química revela, em

algumas espécies, a presença de compostos como neolignanas, sesquiterpenos,

flavonóides e taninos, pironas classes de metabólitos especiais com atividades

biológicas já relatadas, como antioxidantes, substâncias envolvidas na prevenção do

desenvolvimento de patologias e no retardamento do envelhecimento celular

(CAVALHEIRO; YOSHIDA, 2000; CIESLIK; GRE; ADAMUS, 2006; BATISTA et al.,

2010).

http://www.anticaerboristeriaromana.it/

24

1.3 Gênero Aniba

O estudo botânico do gênero Aniba (família Lauracea), iniciado no século

passado, revelou dois grupos que despertaram interesse entre os pesquisadores,

tanto do ponto de vista químico como farmacológico. O primeiro grupo contendo as

2-pironas de ocorrência natural (GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB, KUBITKI, 1981). O

segundo grupo contendo neolignanas (GOTTLIEB, 1977; GOTTLIEB, 1960).

Estudos realizados trazem outras classes de substâncias, como os arilpropanoides,

ésteres de ácido benzoico, flavonoides, benzofenonas, 1-nitro—2-feniletano

(MANDARINO, 1985). Metabólitos secundários são considerados de interesse

fitoquímico (GOTTLIEB, 1972; GOTTLIEB; YOSHIDA, 1989).

Outras espécies do gênero Aniba canellilla são importantes fornecedoras

de óleos voláteis, valiosos na indústria química (MORAES et al., 1972; SILVA et

al.,2007). Dentre elas, destaca-se Aniba rosaeodora Ducke, cujo óleo, rico em

linalol, alcança alto valor na indústria de perfumaria (DUCKE, 1938, MAIA et al.,

2007). Algumas espécies desse gênero também têm sido frequentemente referidas

como medicinais, como A. canellita (H.B.K) Mez (SILVA et al., 2007; LIMA et al.,

2008), A. duckeiKosterm. E A. hostmanniana (Nees) Mez, todas com atividade

experimentalmente comprovada contra o ancilostomídeo humano (GOULART et al.,

1975), além de A. riparia (Nees) Mez, típica da região Amazônica, cujo extrato

obtido dos frutos e cálices persistentes possui atividade antimicrobiana (BARBOSA

et al., 1987,1988).

As espécies pertencentes ao gênero Aniba são de difícil identificação,

pois se consideram apenas os caracteres morfológicos, principalmente vegetativos,

devido à extrema semelhança entre elas (MARQUES; AZEVEDO, 2011).

Os primeiros isolamentos de 2-pirona ocorreram a partir das raízes de

Piper methysticum Forst, conhecida como cava ou cava-cava. Ressalta-se que esta

foi a primeira 2-pirona natural isolada no século passado. As raízes de Piper

methysticum Forsteram utilizadas pelos nativos da Polinésia no preparo de uma

bebida, que ingerida durante festas e rituais causavam efeito estimulante, e quando

as raízes e o caule eram mastigados, obtinha-se um efeito narcótico (MANDARINO,

1985; MORS et al., 1962).

25

Em ensaios clínicos realizados, obtiveram-se novas atividades

farmacológicas sobre as 2-pironas de Piper methysticum (cava-pironas), entre elas

proteção aos ratos contra convulsões e mortes causadas por doses tóxicas de

estricnina, atividades anti-inflamatória, antipirética, espasmolítica, antitetânica e

antifibrilatoria, antifúngica e anticarcinogênica (MANDARIM, 1985; BARBOSA et al.,

1988; ALCANTARA et al., 2010). As Cumarinas são compostas por anéis de

benzeno fundido e α-pirona e apresenta atividade anti-inflamatória, antioxidante,

antibacteriana, antiviral, antitrombótica, antimutagênica e vasodilatadora (HOULT;

PAYÁ, 1996; PAYA et al., 1992).

O grande interesse apresentado pelo grupo do Prof. Klaus, de pesquisa

de produtos naturais, deve-se à ocorrência de pironas naturais, encontradas em

espécies do gênero Aniba, que pertence à família Lauraceae, da qual o Brasil é rico

em representantes. Na família Lauraceae, os derivados de 2-pironas ocorrem em

quase todas as espécies de Aniba e desde há muito vêm sendo usados como

marcadores quimiossistematicos. No entanto, em poucas espécies do gênero Aniba,

como Aniba burohellie Aniba guianensis, tais compostos não foram isolados, sendo

que nestas espécies foi isolado neolignanas (MANDARINO, 1985).

1.4 Pironas

O anel piran-2-ona consiste em um éster cíclico de seis átomos com

propriedades físicas remanescentes de alquenos e aromáticos. O composto é

intermediário-chave na síntese de metabólitos, o mesmo se relaciona ao sistema de

defesa contra outros microorganismos, sendo encontrado em bactérias, plantas,

insetos e animais (MCGLACKEN; FAIRLAMB, 2005; ROSA et al., 2007).

Enquanto o papel natural desta pequena molécula de pirona ainda não é

conhecido, várias atividades biológicas e funções ecológicas têm sido associadas a

este complexo metabólito. A piran-2-ona encontra-se presente em um grande

número de compostos com atividade biológica, como antibióticos, antifúngicos,

neurotóxicos, citotóxicos, anti-HIV, antioxidante (MORA et al., 2007; ROSA et al.,

2007; LI et al., 2009; GUO et al., 2009; VALENTE, 2010).

26

As 2-pironas aromáticas derivam da rota dos policetídeos, sendo que os

precursores são os ácidos benzóicos, que conduzem aos 6-aril derivados, ou os

ácidos cinâmicos, que conduzem aos 6-estiril derivados e a seus derivados

reduzidos (MANDARINO, 1985).

Estudos recentes sobre análise por cromatografia, em fase gasosa com

detectores de ionização de chama (CG-DIC) e de espectrometria de massas (CG-

EM), possibilitou a determinação da composição química dos óleos essenciais

obtidos do caule e folhas da Aniba. No óleo essencial das folhas de A. panurensis,

foram detectados principalmente os hidrocarbonetos sesquiterpênicos b-cariofileno

(33,5%), germacreno-D (25,4%), a-copaeno (7,5%) e b-bourboneno (7,1%). A

somatória dos demais terpenos encontrados neste óleo equivale a menos de 10%

da sua composição total (ALCANTARA et al., 2010).

A 6-[(E)-esteril- piran-2 –ona] (STY), isolada da Aniba panurensis,

apresenta estrutura semelhante aos componentes químicos das kavalcatones

encontrados nakava-kava (Figuras 2A e 2B).

Figura 2A – Estrutura quimicada 6-[(E)-esteril-piran-2 – ona]

Aniba panurensis

O O

Fonte: Barbosa Filho, 1986.

27

Figura 2B – Estrutura química da Piper methysticum

Fonte: Mandarino (1985).

As folhas e os caules das espécies A. panurensis (Meisn.) Mez (registro:

1276) apresentam papilas que são projeções digitiformes na epiderme da face

inferior das folhas (Figura 3A). Dos frutos de Aniba panurensis (Figura 3B), foi

identificada pirona natural, a 6-[(E)-esteril- piran- 2 – ona], com peso molecular de

198 (BARBOSA-FILHO, 1986).

Figura 3A – Aniba parusinensi folhas e frutos

28

Figura 3B – Aniba parusinensi folhas e frutos

Fonte: KEW (Royal Botanic Gardens)

A busca por novas estruturas metabólicas obtidos de pironas naturais,

como os policetídeos, que atuam na biossíntese do Streptomyces, tem sido alvo de

pesquisa com o desenvolvimento de novos modelos de processo enzimáticos que

possam ser empregados na produção de agentes antitumorais e antifúngicos

(BUSCH; HERTWECK, 2009). Culturas de Polyporus hispidus, uso em meio líquido

com glicose, utilizadas como fonte de carbono, produzem pigmento amarelo (4-

hidroxi-6 (3,4-dihidroxiestéril – 2 – pirona ) que têm ação inibitória sobre a isofarma b

da proteína C kinase (GONINDARD et al., 1997) e ação antiviral (LI et al., 2009;

AWADH et al., 2003).

Estudos mostram atividades biológicas das várias espécies do gênero

Aniba, como efeitos antidepressivos e ansiolíticos (MELO, 2006; SOUSA et al, 2004,

2007) da Aniba riparia que apresenta como constituinte uma riparina II ou III; os

efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Aniba canelilla (LAHLOU et al., 2005);

atividade antibiótica da Aniba riparia contra fungo (Cândida albicans), bactérias

gram-negativas (Klebsiela pneunonae) e gram-positivos (Sthaphylococcus aureus e

29

bacilos cereus) (OGER et al., 1994; HAMMER et al., 1999; MARQUES, 2001);

Aniba panurensis, como objeto de estudo, tem publicações sobre a atividade

antimicrobiana na Candida albicans (KLAUSMEYER et al., 2004); ação

vasorelaxante em aorta de ratos (ASSI, 2007); efeitos ansiolíticos mediados

possivelmente por recerptor GABA (CHAVES et al., 2009); ação protetora no modelo

de convulsão por PTZ (CHAVES et al., 2011); efeito antioxidante e ação sobre

agregação plaquetária (ALCÂNTARA et al., 2010).

Apesar de poucos estudos realizados acerca das atividades centrais das

pironas, é importante que seja investigada quanto ao seu potencial no tratamento de

doenças relacionadas ao SNC.

1.5 Ansiedade

A ansiedade é uma condição clínica diagnosticada e avaliada

principalmente pelo relato dos clientes que buscam atendimento nos serviços de

saúde. É um tipo de emoção vivenciada pelo ser humano ao longo de sua vida. É

um fenômeno emocional comum e útil aos seres humanos, sem o qual estaríamos

vulneráveis aos perigos e ao desconhecido, funcionando com valor adaptativo frente

às alterações do meio ambiente que nos cerca (GRAEFF et al., 1999; GRAEFF,

2007).

A ansiedade foi positivamente selecionada ao longo do processo

evolutivo, estando presente não apenas em humanos, mas, possivelmente, também

nas demais espécies demamíferos, bem como em escalas filogenéticas mais antigas

de vertebrados (LEDOUX, 1995).

Segundo os critérios do Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders (DMS-IV-TR), a ansiedade generalizada é caracterizada por preocupação

excessiva e tensão contínua durante os vários eventos diários da vida, com duração

de, pelo menos, seis meses, e incapacidade em controlar estes sentimentos. A

condição vem acompanhada por, no mínimo, três ou mais sintomas adicionais, que

podem ser psíquicos, como agitação, dificuldade de concentração, irritabilidade, ou

somáticos, incluindo fadiga, tensão muscular e distúrbios do sono (DSM-IV-TR,

American Psychiatric Association, 2002; STAHL, 2010).

30

A ansiedade na sua forma patológica parece depender da interação entre

predisposição e fatores ambientais, incluindo-se os de natureza sociocultural e

situacional (DUARTE, 2007). A predisposição é, em parte, determinada

geneticamente, sofrendo influências de experiências marcantes durante o

desenvolvimento e do meio ambiente (CUTIN et al., 2003).

Os transtornos de ansiedade generalizada (TAG) são considerados os

mais frequentes entre as doenças psiquiátricas, com ansiedade generalizada,

representando a patologia mais comum nos indivíduos atendidos nos serviços de

saúde (WITTCHEN et al., 2002). O medo pode ser definido como reação a uma

situação perigosa real, visto por vários autores como entidade independente da

ansiedade. Embora, por vezes, pode ser difícil separação entre as duas (BELZUNG;

GRIEBEL, 2001).

Estudos mostram que 25% dos adultos estão predispostos a desenvolver

uma das seis formas de transtornos, como o de ansiedade, o de pânico, ansiedade

generalizada, ansiedade social, estresse pós-traumático e transtorno obsessivo

compulsivo, responsáveis pela alta morbidade e pelo impacto financeiro decorrente

da improdutividade dos pacientes (GORDON; HEN, 2004; KESSLER et al., 2005).

Nos países da Europa, os estudos epidemiológicos em populações na

faixa etária entre 18 e 65 anos, estimaram prevalência para ansiedade generalizada

em 1,5 % ao ano e 5,1 % ao longo da vida, sendo duas vezes mais frequente em

mulheres do que em homens (BALDWIN et al., 2005; KINRYS; WYGANT, 2005;

WITTCHEH; JACOB, 2005). Ainda não se compreende a causa que leva às

mulheres a terem maior risco de desenvolverem transtorno de ansiedade ao longo

da vida. Relativamente, poucos estudos investigaram se as características das

mulheres com transtornos de ansiedade diferem das dos homens com os mesmos

transtornos (KINRYS; WYGAN, 2005).

Nos Estados Unidos, americanos adultos são acometidos por esta

psicopatologia nas proporções de 2,1 % ao ano e 4,1 % ao longo da vida (GRANT et

al., 2005). No Brasil, a estimativa de prevalência foi nos transtornos de ansiedade

(TA), em crianças foi de 4,8% e adolescentes 5,8% (VIANNA; CAMPOS;

LANDEIRA-FERNANDEZ, 2010).

31

As taxas de prevalência ao longo da vida para transtorno de ansiedade

generalizada (TAG) são de aproximadamente 5,7%. Entre as mulheres com mais de

40 anos de idade, esse valor chega a quase 10%. O início das manifestações às

vezes ocorre precocemente, como também é mais comum a partir da metade até a

fase tardia da idade adulta, sendo observado aumento significativo da incidência na

faixa etária dos 35 aos 45 anos. O TAG é o transtorno de ansiedade mais comum

entre idosos (KUTZ, 2010; DYMOND, 2009; KESSLER et al., 2005).

Embora a fisiopatologia dos transtornos de ansiedade, ainda não estarem

totalmente elucidadas, existem possíveis mecanismos relacionados que são citados,

como o fluxo sanguíneo cerebral na região frontal, parietal, temporal e áreas do

cingulado; metabolismo na região frontal, temporal, parietal, cerebelo, tálamo,

sistema límbico e gânglios basais; alteração nos neurotransmissores GABA,

noradrenalina e serotonina e o sistema neuroendócrino (GRAEFF, 2007).

A participação dos receptores 5HT2 (B e C) do sistema nervoso central

(córtex frontal, gânglios da base e sistema límbico – hipotálamo, septo, amígdala,

cerebelo e MCP) é responsável pela regulação dos transtornos de humor e

ansiedade. Estudos apontam para o fato da ativação destes receptores promoverem

efeito ansiolítico na amígdala medial e ansiogênico no hipocampo dorsal (MENARD;

TREIT, 1999) e hipocampo ventral (FACHINNI et al., 2004). Assim, tem sido

sugerido que a 5-HT possui papel dual na regulação das respostas defensivas.

Os benzodiazepínicos (BZD) são as classes de medicamentos

tradicionalmente utilizadas no tratamento dos transtornos de ansiedade, por

exercerefeito rápido, aumentando a sinalização GABA-A no cérebro. O mecanismo

de ação do BZD consiste na ligação deste ao canal iônico de cloreto no SNC,

receptor GABAérgico, que inibe a atividade neuronal, pelo aumento do influxo de

íon cloreto nos neurônios, hiperpolarizando a célula nervosa, resultando nos efeitos

inibitórios (FLIGHT, 2010; ROSENBAUM, 2005).

Os pacientes que necessitam de tratamento com BZD, são submetidos à

terapêutica em longo prazo. O uso dos BDZ pode causar efeitos relacionados a este

receptor, como sedação e indução do sono, redução da agressão e ansiedade,

redução do tônus muscular e da coordenação motora, ação anticonvulsivante,

32

amnésia anterógrada e tolerância e dependência (SCHMITT; KAPCZINSKI, 2004;

RANG et al., 2007).

Outros medicamentos, como os antidepressivos, passaram a ser

utilizados para o tratamento da ansiedade, como os inibidores da recaptação das

monoaminas: noradrenalina e/ou serotonina. Todavia, esses fármacos têm se

mostrado muito eficazes e com boa tolerabilidade, porém levam de quatro a oito

semanas para apresentar resultados (SCHMITT; KAPCZINSKI, 2004). Ressalta-se

que a maioria desses fármacos ADT (somente os tricíclicos) apresentam importantes

efeitos colaterais como boca seca, visão turva, constipação e retenção urinária,

podendo limitar o seu uso em alguns pacientes (BALLENGER, 2001).

Com o desenvolvimento de novas linhas de pesquisas nos últimos anos

com plantas medicinais, novas moléculas têm sido identificadas como potenciais

para produção de novas drogas, capazes de se ligarem no receptor GABA-A

(JOHNSTON; BEART, 2004; KAVVADIAS et al., 2004; BAUR et al., 2005; DUARTE,

2007). Entre os diferentes sítios alostéricos presentes neste receptor, um dos mais

estudados intensivamente e que apresenta maior importância clínica é o sítio BDZ

(HANSON; CZAJKOWSKI, 2008; SANCAR; CZAJKOWSKI, 2011). O receptor GABA

possui sítio de ligação para os anticonvulsivntes (barbitúricos), ansiogênicos (β-

carbolinas) e agentes convulsantes (picrotoxina) (MACDERMOTT et al., 1999).

A procura por medicamentos de origem vegetal, produzidos a partir de

moléculas para tratar doenças que atingem o SNC, como ansiedade e epilepsia, que

comprometem sujeitos na fase produtiva, têm impulsionado pesquisadores a estudar

compostos biologicamente ativos, que apresentem menor número de efeitos

colaterais.

1.6 Modelos experimentais de ansiedade

Os modelos animais de ansiedade têm sido utilizados para avaliar

comportamentos bem esclarecidos na literatura e permitem também delinear

mecanismos neuroquímicos envolvidos nos transtornos de ansiedade, como

metabólitos de hormônios e neurotransmissores. Além disso, estudo de tecidos

encefálicos, pelo uso de marcadores específicos e testes de compostos, para fins

33

farmacológicos assumem grande importância quando se faz a homologia entre

animais de laboratório e humano. Apesar da relação entre estes modelos e os

transtornos de ansiedade em humanos não está totalmente elucidada. Sabe-se, que

as chances de reproduzir nos modelos animais todos os sintomas desencadeados

no humano são muito pequenas, o porquê estes modelos não acessam o mesmo

fenômeno psicobiológico, pois a ansiedade é fenômeno humano subjetivo. No

entanto, respostas fisiológicas e comportamentais semelhantes têm sido descritas

em diversas espécies animais (GROSS; HEN, 2004).

Modelos animais de ansiedade podem ser induzidos, pela simples

exposição do animal, a um novo ambiente ou estímulo, comportamentos de medo ou

defensivos, comparáveis a manifestações ansiosas em indivíduos com transtornos

de ansiedade. Os modelos usualmente utilizados na avaliação de propriedades

ansiolíticas de drogas incluem tanto os que confrontam roedores com novos

ambientes ou os que envolvem o uso de estímulos nocivos, como choque elétrico ou

drogas ansiogênicas (BELZUNG; LE PAPE, 1994; VASCONCELOS, 2003;

ALMEIDA, 2006).

Para um teste comportamental ser validado, em modelo animal, é

necessário que permita quantificar respostas que variem de maneira previsível pela

ação de drogas com reconhecidas propriedades ansiolíticas ou ansiogênicas em

humanos (OHL, 2003). A descoberta do primeiro benzodiazepínico

(clordiazepóxido), que apresentava grande eficácia em termos ansiolíticos,

possibilitou nova área na pesquisa da ansiedade, pois, a partir de então, os modelos

animais puderam ter melhor validação farmacológica. Esses modelos foram

desenvolvidos com dois objetivos principais: primeiro para se avaliar os efeitos

ansiolíticos ou ansiogênicos de determinados compostos e identificar seus

mecanismos de ação (FILE et al., 1993; FILE, 2001; RODGERS, 1992; RODGERS

et al., 1997).

Os modelos mais utilizados são Labirinto em Cruz Elevado (LCE); o

Campo Aberto (CA), placa perfurada e a Caixa de Movimentação Espontânea

(CME). Os animais são submetidos a situações ansiogênicas e às drogas

ansiolíticas em doses compatíveis in vivo com aquelas necessárias ao tratamento

clínico humano e, desta forma, torna-se possível observar o fenômeno da ansiedade

no animal, a fim de validar os chamados modelos experimentais.

34

Um dos modelos mais largamente utilizados na pesquisa da ansiedade

em ratos e camundongos é o Labirinto em Cruz Elevado, baseado em respostas

incondicionadas a ambientes potencialmente perigosos. Derivou do trabalho de

Montgomery (1958) e a premissa básica é que ambientes novos evocam curiosidade

e medo, criando, desta forma, um típico conflito de aproximação/esquiva. Este autor

constatou ainda que ratos apresentassem alto grau de exploração de espaços

fechados em comparação aos abertos e em uma chance de escolha como em um

labirinto em Y, preferiam consistentemente os braços fechados (RODGERS, 1992;

RODGERS et al., 1997; RAMOS et al.,1998, 2008). Em estudo, Montgomery (1958)

interpretou a aversão aos braços abertos como gerado pela neofobia, ―medo da

novidade‖, que induziria aversão e curiosidade, pela elevação do braço aberto.

No LCE, os estudos constataram que drogas ansiolíticas, como

diazepam, aumentavam a proporção entre entradas nos braços abertos e o total de

entradas, ao passo que agentes ansiogênicos diminuem o tempo gasto embraços

abertos (PELLOW et al.,1895).

1.7 Epilepsia: modelos animais de convulsão

A epilepsia é um distúrbio no funcionamento cerebral caracterizado pela

presença de convulsões recorrentes e não previsíveis. A prevalência na população

em geral é aproximadamente 1% (STAHL, 2010). O local da descarga anômala pode

se disseminar para outras áreas do cérebro. Os sintomas produzidos dependem da

função da região do cérebro afetada. Desta forma, o envolvimento do córtex motor

causa convulsão; o envolvimento do hipotálamo causa descarga autônoma periférica

e o envolvimento da formação reticular na parte alta do tronco encefálico ocasiona a

perda de consciência (RANG et al., 2007).

As descargas anormais podem ser produzidas por diversos fatores em

algumas áreas cerebrais, em decorrência dos desequilíbrios dos neurotransmissores

(monoaminas, aminoácidos e peptídeos) (MICHOTTE, 2000), pelo envolvimento dos

sistemas de segundos mensageiros (AMPc, DAG, IP3), por desordens no

metabolismo dos carboidratos, dos aminoácidos e lipídios, por infecções,

intoxicações, tumores ou traumas encefálicos ou pela elevação da temperatura

corporal (LOSCHER, 2002).

35

A epilepsia é uma desordem neurológica crônica comum e caracterizada

por crises convulsivas recorrentes não provocadas. Episódios únicos de crise

generalizada podem ocorrer em um indivíduo normal, e não caracterizam a

epilepsia, uma vez que reações como estresse fisiológico, privação do sono, efeito

do álcool ou drogas ou, ainda, traumatismo cranioencefálico podem ser

responsáveis por esses eventos. Todavia, processos infecciosos, tóxicos ou

metabólicos podem originar crises epilépticas recidivantes e limitadas, em indivíduos

com limiar reduzido, hereditário, sem síndrome epiléptica (LÖSCHER, 1998, 2002).

O envolvimento do L-glutamato e GABA nas epilepsias tem sido

demonstrado nos estudos extensamente. O aumento da atividade excitatória,

particularmente mediada pelo glutamato em seus receptores do tipo N-metil-D-

aspartato (NMDA), é importante na etiogênese das epilepsias ao longo dos anos

(BRADFORD, 1995). A neurotransmissão gabaérgica na patogenia das epilepsias

tem como hipótese a alteração do sistema inibitório, com redução da atividade

GABAérgica, e aumento da atividade excitatória, especialmente mediada pelo

glutamato (BRADFORD; DODD, 1976; MELDRUM, 1975).

A classificação atual define duas categorias principais de epilepsia, sendo

as crises parciais e as generalizadas. Levam-se em consideração as manifestações,

características clínicas, recorrência das crises, hereditariedade, causa alterações no

eletroencefalograma e início das crises epilépticas (GUYTON, 2006).

A fisiopatologia da epilepsia ainda não está totalmente elucidada. A

epilepsia do lobo temporal humano é uma desordem crônica, frequentemente

associada a um estímulo inicial precipitante, como estado epiléptico, trauma e

convulsões febris prolongadas (GUYTON, 2006). É um dos distúrbios neurológicos

mais comuns, apresentando taxa de prevalência de 1% (BANERJEE; HAUSER,

2008).

A epilepsia do lobo temporal é o tipo mais frequente, sendo responsável

por aproximadamente 40 a 60% das epilepsias nos adultos. Em decorrência da alta

prevalência e refratariedade ao tratamento medicamentoso, é uma das síndromes

neurológicas mais estudadas (ENGLER et al., 2004a). As áreas cerebrais que

apresentam maior perda neuronal são: hipocampo, corpo estriado, amígdala, córtex

piriforme e entorrial, septum lateral, tálamo e substância nigra. As sequelas mais

36

comuns compreendem os déficits neurológicos permanentes e a disfunção

intelectual.

O desenvolvimento de novas drogas antiepilepticas com potencial

terapêutico deve-se à pesquisa em neurociências, todavia, estes medicamentos

muitas vezes não conseguem controlar completamente as crises epilépticas,

tornando o indivíduo muitas vezes incapacitado para realizar atividades do seu

cotidiano.

Os mecanismos responsáveis pela resistência clínica aos medicamentos

não são totalmente elucidados, podem incluir a insensibilidade do sítio de ação do

fármaco, falha do fármaco em alcançar algumas regiões do cérebro,

desenvolvimento de tolerância ou presença deproteínas droga-resistentes

(STABLES et al., 2002).

A primeira geração de fármacos ainda é utilizada na clínica, foram

desenvovlvidos e introduzidos entre 1910 e 1980, como a fenitoína, carbamazepina,

valproato, benzodiazepínicos, etosuximida, fenobarbital e primidona. A segunda

geração foi introduzida em 1980 até o momento atual, incluindo a lamotrigina,

felbamato, oxcarbazepina, vigabatrina, tiagabina, topiramato, gabapentina,

zonisamida e levetiracetam (LÖSCHER, 1998; LÖSCHER; LEPPIK, 2002;

GUERREIRO, 2006). Em 2005, foi aprovada a pregabalina e, atualmente, ressalta-

se o desenvovlvimento de outros fármacos que estão em fase de estudo pré-clínico

e/ou clínico que comporão a terceira geração de drogas antiepilépticas

(GUERREIRO, 2006; CARLINI; MENDES, 2011).

Os modelos animais de convulsão são utilizados para estudar o

envolvimento dos sistemas de neurotransmissores como moduladores da

epileptogênese, além de permitir observar as alterações comportamentais,

histológicas, e outros parâmetros neuroquímicos relacionados com atividade

epiléptica. A estimulação de determinadas áreas cerebrais produz respostas

diferentes, afetando o comportamento animal, podendo induzir processos

patológicos, tais como a epilepsia (FREITAS et al., 2003).

Ao longo dos anos, o modelo da pilocarpina e o modelo do ácido caínico,

foram os mais utilizados, desde a década de 1980, pois ambos replicaram

características fenomenológicas das epilepsias humanas do lobo temporal (TURSKI

37

et al., 1983, 1989). Administração de ácido caínico e ou pilocarpina em altas doses

produz uma crise comportamental que é acompanhada por lesão cerebral muito

semelhante ao da epilepsia do lobo temporal, sendo essa administração

intraventricular (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008).

A pilocarpina é bastante utilizada no modelo de convulsão induzido em

animais para estudar a fisiopatologia do processo convulsivo, uma vez que reproduz

as alterações comportamentais e eletroencefalográficas que são semelhantes à

epilepsia do lobo temporal de humanos (BEM-ARI et al., 1985), além de permitir o

estudo dos neurotransmissores como moduladores da epileptogênese, observar

alterações comportamentais, histopatológicas, e outros parâmetros neuroquímicos

relacionados com a atividade epiléptica (COSTA-LOTUFO et al., 2002; FREITAS,

2008).

Nas últimas décadas, a pesquisa com modelos animais tem posibilitado a

identificação dos mecanismos etiopatológicos, eletroencefalográficos e

farmacológicos de substâncias ou moléculas biologicamente ativas.

O Pentilenotetrazol (PTZ) é uma das principais substâncias indutoras de

convulsão em modelos animais, tem sido utilizada na triagem pré-clínica de novos

fármacos anticonvulsivantes, podendo ser utilizada como modelo de crises

generalizadas do tipo ausência ou mioclônicas como de crises tônico-clônicas

(QUINTANS-JÚNIOR; MELLO, 2006; SMITH et al., 2007). O PTZ atua induzindo

convulsões por inibir os canaisde íon cloreto associados aos receptores GABA-A

(LÖSCHER, 1998).

A gravidade dos eventos comportamentais após a infusão de PTZ

depende da dose administrada e da via. Após administração sistêmica i.v. ou i.p.

observa-se abalosmioclônicos, que se tornam contínuos, podendo levar a crises

tônico-clônicasgeneralizadas (FISHER, 1998; JAIN et al., 2011). As crises motoras

clônicas podem ser denominadas crises mínimas, e as generalizadas tônico-

clônicas, crises máximas (VELISEK et al., 1992).

Outro modelo utilizado de indução de convulsão é o da estricnina. A

estricnina é um alcaloide natural, de núcleo indilomonoterpénico, obtido a partir das

sementes secas de Strychnos nux-vomicaum. Esta substância pode apresentar-se

sob a forma de cristais ou pó cristalino, não possui cor nem cheiro, todavia o sabor

38

amargo pode ser detectado em pequenas quantidades (BERNY, 2007;

MARKAROVSKY, 2008). Atua como antagonista competitivo dos receptores de

glicina localizados na medula espinhal, promovendo a diminuição dos efeitos

inibitórios da glicina sobre o SNC, resultando em uma crise convulsiva intensa,

levando geralmente ao óbito (GODMAN; GILMAN, 2012).

Entre as drogas com ação convulsivante, destacam-se as que são

antagonistas do receptor GABA. As duas substâncias clássicas são a bicuculina e a

picrotoxina que atuam por mecanismos diferentes. A bicuculina atua como

antagonista direta do recptor de GABA, enquanto a picrotoxina atua como

antagonista não competitivo de receptor GABAérgico junto com o PTZ pelo fato

dessas substâncias bloquearem os canais de cloreto (UENO et al., 1997;

MACDERMOTT; ROLE; SIEGELBAUM, 1999).

Como descrito, a bicuculina (um antagonista competitivo do receptor

GABA) reduz a frequência e o tempo médio de abertura do canal do íon cloro

(DELOREY; OLSEN, 1994). Após sua administração, as crises iniciam-se com

movimentos generalizados mioclônicos, estendendo-se, em breves segundos, a

espasmos flexores generalizados (TREIMAN; HEINEMANN, 1997).

Ressalta-se que, dependendo da concentração, a bicuculina pode ou não

causar convulsão nos animaisutilizados nos modelos experimentais. Salinas e

Mcgaug (1996) utilizaram em seu estudo a dosede 0,1nM e não desencadeou

convulsão nos animais. A dose convulsivante é 3 mg/kg (HANSEN; SPERLING;

SANCHEZ, 2004).

A utilização dos modelos animais em estudos experimentais torna-se

importante, pois os mecanismos de indução, propagação e manutenção da epilepsia

ainda não estão totalmente elucidados. A epilepsia é considerada grave problema de

saúde pública em muitos países. Estudos com moléculas de origem vegetal

despertam o interesse dos pesquisadores pela possibilidade de gerar um novo

produto, que possa ser utilizado como ferramenta farmacológica (SOUSA et al.,

2004; VASCONCELOS et al., 2007;PEREIRA et al., 2009).

39

1.8 Aminoácidos na neurotransmissão

O papel dos aminoácidos na neurotransmissão começou a ser postulado

em 1950 com os primeiros experimentos feitos com glutamato aplicado em áreas

motoras específicas do córtex cerebral de macacos, observava-se o movimento dos

membros relacionados. Na década de 1960, estabeleceu-se a existência tanto de

aminoácidos excitatórios quanto inibitórios no SNC. As respostas sinápticas

excitatórias eram mediadas pelo glutamato e aspartato, enquanto as inibitórias eram

mediadas pelo GABA e glicina (ALMEIDA, 2006; RANG et al

.,2007).

Os aminoácidos constituem o principal grupo de substâncias usado para

geração de potenciais sinápticos excitatórios e inibitórios no SNC. Os primeiros

estudos em 1950 sugeriram que o glutamato gerava ação excitatória no sistema

nervoso central através de uma variedade de receptores. Essa ideia precedeu a

caracterização desses receptores (WATKINS; JANE, 2006).

Os aminoácidos são considerados unidades formadoras de proteína e são

essenciais para produçãode neurotransmissores no SNC. O desequilíbrio na

produção destes aminoácidos provocam alterações no funcionamento do SNC

(RANG et al., 2007).

O sistema nervoso central apresenta altas concentrações de aminoácidos

que se ligam aos receptores pós-sinápticos, com ação inibitória e excitatória, sendo

o ácido γ-aminobutírico (GABA) e o glutatamato respectivamente, considerados os

mais importantes aminoácidos neuroativos. No contexto atual, a participação de

outros aminoácidos na neurotransmissão vem sendo estudada. Com ação inibitória,

destaca-se a glicina, a taurina e a histidina, com ação excitatória o ácido aspártico

(GOLAN, 2010; GOODMAN; GILMAN, 2012).

O ácido γ-aminobutírico (GABA), glicina (GLI) taurina (TAU) e histidina

representam os mais importantes aminoácidos neurotransmissores com ação

inibitória, enquanto o glutamato (GLU) e o aspartato (ASP) são aminoácidos

excitatórios no SNC.

40

Neurônios glutamatérgicos perfazem cerca de 80% da população total de

neurônios no córtex cerebral, nos núcleos da base e nas vias sensitivas,

apresentando altas concentrações e ampla distribuição, com influência em todas as

funções do SNC (COTMAN et al., 1995; SOMOGYL et al., 1998; RANG; DALE,

2007),

Os receptores ionotrópicos contêm canais iônicos que quando ativados

permitem a entrada de Na+ e K+, favorecendo a despolarização do neurônio. São

divididos em receptores NMDA e receptores não-NMDA, que, por sua vez, incluem

os receptores alfa-amino-3-hydroxi-5-methyl-4 lisoxazole propionic acid (AMPA) e

kainato. Os receptores AMPA e kainato se localizam em regiões telencefálicas e

mediam a transmissão rápida em sinapses excitatórias. Quando ativados, estes

receptores induzem uma despolarização rápida do neurônio pós-sináptico que

perdura somente alguns milissegundos (GOLAN, 2010; CAIATI et al.,2010;

GOODMAN; GILMAN, 2012).

Os receptores NMDA controlam a condutânciade Na+, K+e em especial

do Ca+2 através da membrana neuronal. Outros íons como o Mg+2 e ZN+2 bloqueiam

o receptor MNDA, o primeiro de maneira voltagem dependente e o segundo

independentemente agindo em sítios diferentes (CONN, PIN, 1997). Este

mecanismo intervém na formação do fenômeno da potenciação a longo termo (LTP,

long-termpotentiation) (RANG; DALE, 2007).

A exposição excessiva dos neurônios ao glutamato pode causar aumento

exagerado de entrada de cálcio através dos canais controlados pelos receptores

NMDA do glutamato, com consequente agravamento das lesões neuroniais pela

excitocidade, podendo ocasionar a morte celular e neurodegeneração (FRIEDELER,

2003).

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluR) agem através de

segundos mensageiros via ativação da proteína C. Em condições fisiológicas, a

ativação de mGluRs via glutamato produz corrente pós-sináptica lenta. Os mGluRs

estão presentes em todas a regiões do cérebro e vêm sendo considerados um dos

maiores moduladores de segundo mensageiros no SNC em mamíferos (LENT,

2004).

41

O GABA é um neurotransmissor inibitório quantitativamente importante no

SNC envolvido direta ou indiretamente na patogênese de muitas doenças

neurológicas, principalmente nas convulsões. Por muitos anos, acreditou-se que o

principal fator patogênico nas epilepsias era a falha na neurotransmissão

Gabaérgica (MELDRUM, 1975).

Estudos mostram que alterações nos níveis de neurotransmissores,

causam doenças neurológicas, como transtorno de ansiedade e epilepsia,

envolvendo os receptores GABA-A, alteração na transmissão glutamatérgica, pode

ocasionar o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas crônicas e

esquizofrenia (FARBER et al., 1998; OLNEY et al., 1999; WONG et al., 2003).

O GABA encontra-se distribuído em todas as partes do SNC, sendo

particularmente abundante (cerca de 10µmol/g de tecido). No sistema nigroestriatal,

(cerca de 2 a 5µmol/g) com maior concentração na substância negra e no núcleo do

globo pálido dos gânglios basais, seguidohipotálamo e hipocampo (RANG; DALE et

al., 2007, GOODMAN; GILMAN, 2012).

As sinapses inibitórias que contém GABA foram demonstradas entre os

neurônios de Purkinje do cerebelo, entre os interneurônios e as células eferentes

principais do córtex cerebelar, do bulbo olfatório, do núcleo cuneiforme, do

hipocampoe do núcelo septal lateral e entre o núcelo vestibular e os neurônios

motores trocleares (GOODMAN; GILMAN, 2012). O GABA no tecido estriatal é o

principal neurotransmissor e está localizado em interneurônios que se projetam para

a substância negra e o globo pálido (DE LUCIA et al., 2007).

42

Figura 4 – Vias Gabeaérgicas

Fonte: www.cnsforum.com/content/pictures/imagebank/hirespng/Neuro_path_GABA. png

O GABA é sintetizado pela descarbonilação do glutamato em um passo

único catalisado pela enzima ácido glutâmico-descarboxilase (GAD). A maior parte

da captação do mesmo ocorre nas células gliais. O desvio do GABA para as células

gliais produz glutamato, convertido em glutamina e transportado das células gliais

para os neurônios, em que é convertido novamente em glutamato. A glutamina,

portanto, serve como fonte de glutamato entre as células no SNC (SMITH et al.,

2007). Em humanos, a GAD apresenta duas diferentes isofarmas da enzima,

denominadas GAD-65 e GAD-67, em diferentes regiões do cérebro, o que possibilita

a síntese de GABA com ―pools‖ específicos, com funções diferentes (ESCLAPEZ et

al., 2000).

O conhecimento da composição estrutural do receptor GABA, bem como

o de sua distribuição ao longo do sistema nervoso central e periférico, tem permitido

a descoberta de drogas com potencial terapêutico para tratamento de distúrbios do

43

SNC. Os benzodiazepínicos, como o diazepam, são caracterizados como os

principais moduladores alostéricos do receptor GABA-A (JACOB et al., 2005;

JACOB; MOSS; JURD, 2008).

Os receptores para GABA podem ser inotrópicos (GABA-A e GABA-C) e

metabotrópicos (GABA-B). O GABA pode inibir neurônios por aumentar a

condutância de íons cloreto pela ativação dereceptores GABA-A e GABA-C, ou de

íons de potássio, via ação em receptores GABA-B, resultando na hiperpolarização

no adulto. GABA-A e GABA-B são encontrados nos terminais pré ou pós- sinápticos

(OWENS; KRIEGSTEIN, 2002). O GABA-A é responsável por aproximadamente

90% da transmissão sináptica inibitória no sistema nervoso central de mamíferos

(BEAR, 1996). O GABA-A faz parte da superfamília de canais iônicos reguladas por

neurotransmissores rápidos, incluindo os receptores nicotínicos periféricos e

neuronais da acetilcolina (nAChR), os receptores de serotonina tipo 3A/B (5HT3A/B) e

os receptores da glicina (GOLAN et al., 2010).

Algumas moléculas endógenas modulam de modo alostérico os

receptores GABA-A. O metabolismo dessas moléculas no cérebro produz

neuroesteroides como a pregnenolona, a desidroepiandrosterona (DHEA), a 5α-

diidrodesoxicorticosterona (DHDOC), 5α-tetraidrodesoxicorticosteronna (THDOC) e

a alopregnanolona (GOLAN et al., 2010; MODY; MAGUIRE, 2012).

Muitas drogas modificam a função do recptor GABA-A, como

benzodiazepínicos e os barbitúricos que aumentam a abertura do canal de cloreto

ou prolongam abertura deste canal (JACOB et al., 2008). Sabe-se que o receptor

GABA-A abre os canais de cloreto, sendo alvo de ação terapêutica para os

benzodiazepínicos e barbitúricos, todavia são antagonizados pela picrotoxina e

bicuculina que causam convulsões generalizadas (DALE; HAYLETT, 2010). Os

receptores GABA-B podem ser ativados seletivamente pela droga

antiespásticabaclofeno e estão acoplados à proteína G que inibem os canais de

cálcio ou ativam os canais de potássio (BORMANN, 1895), enquanto o faclofeno,

antagonista de recepptor GABA-B, é usado de forma experimental (DALE,

HAYLETT, 2010). O papel fisiológico dos receptores de GABA-C ainda não foram

esclarecidos, no entanto se sabem que são receptores ionotróficos, ligados a canais

iônicos, localizados na retina (STAHL, 2010; BORMANN; FEIGENSPAN, 1995).

44

O receptor GABA-A é uma glicoproteína estrutural heteroligomérica

constituído de cinco subunidades polipeptídicas pertencentes a diferentes famílias

ou classes, com suas respectivas isoformas: α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π e θ (KORPI et

al., 2002). Encontram-se identificadas até o momento 16 subunidades diferentes do

receptor GABA (Figura 5). As cinco subunidades dos receptores GABA-A circundam

um poro iônico central seletivo para o cloreto, que se abre na presença de GABA. O

GABA e outros agonistas liga-se a dois sítios, que estão localizados em porções

extracelulares do complexo receptor-canal na interface entre as subunidades α e β.

O receptor GABA apresenta outros sítios moduladores, em que ocorre ligação de

outros ligantes endógenos e/ou fármacos (DALE; HAYLETT, 2010).

Figura 5 – Receptor GABA-A

Fonte: AdaptadoTija C. Jacob, Stephen J. Moss and Rachel Jurd 2008.

45

As propriedades da resposta de sinalização dos interneurônios são

modaldas pelo tipo de receptor GABA-A expresso pré e pós sinapticamente. Os

receptores, contendo a combinação α1, α2, α3 ou α5 com as subunidades β-2 e y2,

são os mais predominantes no cérebro (CZAJKOWSKI, 2006).

O receptor GABA-A apresenta estrutura que desperta atenção dos

pesquisadores, pois contém variedade de sítios de ligação para drogas

farmacologicamente importantes que interagem alostericamente com os agonistas

GABA. Estes incluem ansiolíticos (benzodiazepínicos), anticonvulsivantes

(barbitúricos), ansiogênicos (β-carbolinas), agentes convulsantes (pricrotoxina)

(OLSEN 1982; TALLMAN; GALLAGER, 1985).

O agonista clássico do sítio GABA-A é muscimol, enquanto que o

principal antagonista é a bicuculina. No entanto, o antagonista competitivo dos

benzodiazepínicos mais conhecido é o flumazenil, utilizado clinicamente para

reverter os efeitos agonistas da superdosagem de benzodiazepínicos. Além desta

ação, é uma droga ansiogênica e convulsivante (RANG; DALE et al., 2007).

O flumazenil é um derivado imidabenzodiazepina, é um dos vários

derivados 1,4-benzodiazepínico, com alta afinidade pelo receptor benzodiazepínico

que age como antagonista competitivo. Na clínica, é o único antagonista dos

receptores BDZs, cuja ação consiste em bloquear algumas das ações dos BDZs,

porém não antagoniza os efeitos de outros sedativos-hipnóticos no SNC como

etanol, opióides e anestésicos gerais. O flumazenil também é utilizado como droga

para o diagnóstico de intoxicação pelos BDZs, pois se liga especificamente aos

receptores BDZs no cérebro, bloqueando os efeitos comportamentais, neurológicos

e eletrofisiólogicos de vários benzodiazepínicos, mas é desprovido de efeitos

farmacológicos (KLEINGEIST et al., 1998).

De acordo com a área cerebral, 20 a 50 % das sinapses usam GABA

como transmissor. Foi descoberto, posteriormente, que a neurotransmissão inibitória

pode ter importante papel na geração e manutenção de certos tipos de convulsão no

hipocampo e nos circuitos corticotalâmicos (AVOLI, 1996; ENGEL, 1996). O

aumento da atividade da GABA-transaminase no cérebro reduz as concentrações de

GABA o que leva à convulsão, coma e morte. A inibição desta enzima eleva

consideravelmente a concentração de GABA no cérebro, sendo alvo para o

46

desenvolvimento das novas drogas anticonvulsivantes, como a vigabatrina (RANG;

DALE et al., 2007).

O papel dos receptores GABA–B ainda é controverso no que se refere às

convulsões. Em alguns modelos de convulsão, agonistas deste receptor produzem

ação anticonvulsivante, enquanto em outros a ação é convulsivante. Como no caso

do baclofeno que tem ação convulsivante per se após infusão intraventricular em

roedores e após uso de doses terapêuticas em humanos (SNODGRASS, 1992),

mas atenuou o desenvolvimento do abrasamento ou kindlinginduzido por

pentilenotetrazol (PTZ) em roedores (SNEAD, 1996; QUINTAS-JÚNIOR et al., 2007).

Estudos farmacológicos revelaram que a microinjeção de antagonistas de

receptores GABA-A ou agonistas de diferentes subtipos de receptores de glutamato

causaram convulsões em experimentos animais in vivo (GOODMAN; GILMAN,

2012).

A origem da palavra glicina vem do grego glykos, que significa doce. Este

é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo, portanto, um dos

componentes das proteínas dos seres vivos, necessária para o funcionamento

adequado do SNC. O glutamato e a glicina estão entre os 20 aminoácidos que

constituem os blocos construtores das proteínas. Consequentemente, são

abundantes em todas as células do corpo como as renais, hepatócitos e células

endoteliais (EYNDEN et al., 2011).

A glicina é um neurotransmissor inibitório no SNC, especialmente no nível

da medula espinal, tronco cerebral e retina, sendo que na substância cinzenta da

medula espinhal é encontrada em concentrações particularmente altas (5 μmol/g). O

efeito inibitório da glicina é muito distinto de seu papel na ativação facilitadora dos

receptores de NMDA. Por não ser sintetizada pelos neurônios glutamatérgicos, é

obtida dos neurônios glicinérgicos ou de células da glia. A glicina não é armazenada

em vesículas sinápticas, mas associada ao aminoácido d-serina que supostamente

é armazenado em algum tipo de vesícula sináptica nas células da glia. A glicina no

citoplasma das células da glia, de alguma forma, fica disponível para liberação nas

sinapses, glutamatérgicas, escapando das células glias, por meio do transportador

Gly-T1 reverso. Outra forma de síntese da glicina ocorre a partir do aminoácido 1-

serina, derivado do espaço extracelular, da corrente sanguínea e da dieta,

47

transportado para o interior da célula glialpor um transportador de serina -1(SERT-

T), e convertido de 1-serina em glicina pela enzima glial serina

hidroximetiltransferase (SHMIT, 2007). Essa enzima converte 1-serina em glicina ou

glicina em 1-serina (STAHL, 2010).

O receptor da glicina é semelhante ao receptor GABA-A, sendo canal

iônico multimérico regulado por ligante. Foram encontradas mutações nos

receptores da glicina em alguns distúrbios neurológicos hereditários associados a

espasmos musculares e hiperexcitabilidade reflexa. Quando receptores de glicina

são ativados, o ânion cloreto entra no neurônio através de receptores ionotrópicos,

causando potencial pós-sináptico inibitório. A estricnina, alcaloide convulsivante que

atua principalmente sobre a medula espinhal, bloqueia tanto a resposta inibitória

sináptica quanto a resposta à glicina (RANG; DALE et al., 2007).

A glicina, junto com o glutamato, atua como coagonista de receptores

NMDA, facilitando ação da atividade excitatória dos receptores glutaminérgicos, em

contraste com a atividade inibitória da glicina. Os receptores da glicina são

antagonizados pela estricnina. A toxina tetânica bloqueia a exocitose de glicina

(GOODMAN; GILMAN, 2012).

A taurina ou ácido 2 –aminoetano sulfônico é um dos aminoácidos livres

mais abundantes em diferentes tecidos, sendo essencial para o funcionamento do

sistema nervoso central dos mamíferos, atuando na osmorregulação, estabilização e

manutenção da integridade da membrana neuronal, e na neuroproteção e no

controle da homeostasia do cálcio (SARANSAARI; OJA, 2007). Este aminoácido

pode ser encontrado em neurônios e células gliais, sendo armazenado em terminais

sinápticos, evidenciando possível ação neurotransmissora inibitória via receptores

GABA-A e de glicina (JUNYENT et al., 2009). Além disso, é capaz de modular a

atividade de diversas enzimas que podem estar relacionadas com insultos cerebrais

causados por drogas de abuso, como o etanol (GERLAI et al., 2006).

As maiores concentrações intracelulares de taurina são encontradas no

coração, leucócitos, músculo esquelético, retina e SNC, sendo o fígado o local de

maior variação nas concentrações de taurina, em que estas são dependentes da

dieta ingerida. O organismo humano, normalmente, possui entre 12 e 18g (100-

150mmol) de TAU (KENDLER, 1989).

48

Dentre as funções da taurina no cérebro estão as de neurorregulação,

neurodesenvolvimento, modulação da excitabilidade neuronal, manutenção da

função cerebelar, modulação da liberação hormonal e anticonvulsivante (KONTRO;

OJA, 1983). No cérebro, a taurina também desempenha papel osmorregulador,

protegendo-o contra a toxicidade dos íons de cálcio (LEHMAN et al., 1984). Um dos

papéis importantes da taurina vem sendo relacionado à excitoxicidade

glutamatérgica (WU; PRENTICE, 2010).

A histidina é o aminoácido precursor da histamina, importante

neurotransmissor do SNC. Esta amina biogênica é sintetizada a partir da

descarboxilação do aminoácido histidina, através da histidina-descarboxilse. As

sinalizações intracelulares da histamina são mediadas via proetina G e vários

segundos mensageiros, através da interação com quatro tipos de receptores, sendo

H1 e H2 encontrados em receptores pós-sinápticos no SNC e H3 em um receptor

pré-sináptico (HASS; SERGEEVA; SELBACH, 2008; NESTLER; HYMAN;

MALENKA, 2009). O receptor H4 tem sido relacionado com o sistema imunológico

(LIN et al., 2005). A histidina representa cerca de 3% dos aminoácidos das proteínas

do nosso organismo (BROWN; STEVENS; HAAS, 2001).

O sistema histaminérgico no SNC está envolvido com várias funções,

como a modulação do estado de excitação, vigília e sono, aprendizado e memória. A

enzima histidinadescarboxilase (HDC) converte a histamina no hipotálamo na área

do núcleo tuberomamilar e liberada para muitas áreas cerebrais como hipotálamo,

hipocampo, córtex pré-frontal (HAAS et al., 2008; WAMELEN et al., 2011).

A identificação dos aminoácidos neurotransmissores em estudos de

modelos animais é importante para ajudar na compreensão das ações

farmacológicas das moléculas estudadas que apresentam potencial terapêutico.

1.9 Áreas cerebrais estudadas

A experimentação animal tem considerável importância em pesquisas

científicas, pois vem contribuindo para o desenvolvimento da ciência e tecnologia.

Ao longo dos anos, a contribuição com descobertas de medidas profiláticas e

tratamentos de inúmeras enfermidades que acometem os seres vivos, foram

49

resultados dos estudos desenvolvidos com modelos animais, como a descoberta da

insulina, desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças e produção de soros.

Os animais foram responsáveis por descobertas que permitiram o uso terapêutico de

antibióticos, anestésicos, antidepressivos, entre outros (CHORILLI et al., 2007).

Os animais são utilizados em diversos modelos experimentais para

avaliação da atividade farmacológica de extratos vegetais, metabólitos e formas

farmacêuticas diversas. Os modelos animais foram desenvolvidos para avaliar os

diversos distúrbios, a partir de parâmetros de comportamento que indicam

ansiedade, depressão, status epilépticus, esquizofrenia em roedores, dor, entre

outros (ALMEIDA, 2006).

As áreas cerebrais estudadas neste estudo foram o córtex pré-frontal

(CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE).

O lobo frontal, constituído pelo córtex pré-frontal (CPF), córtex pré-motor e

córtex motor primário, é responsável pelo planejamento da ação e controle do

movimento (KANDEL, 2000). O CPF tem sido associado a diversos processos

emocionais, cognitivos, atencionais, entre outros (VERTES, 2006). Até o momento,

são reconhecidas três grandes regiões funcionais do CPF: a região ventromedial,

envolvida com o planejamento de ações e do raciocínio e com o ajuste social do

comportamento; a região dorso lateral, encarregada da memória operacional; e a

região cingulada anterior, envolvida com as emoções (LENT, 2004).

O córtex pré-frontal (CPF) foi originalmente descrito como região cortical

com interação recíproca acentuada com o núcleo mediodorsal do tálamo

(GOLDMAN; GILMAN, 2012; GROENEWEGEN et al., 1990). Existem diferentes

tipos celulares no córtex pré-frontal, incluindo neurônios piramidais excitatórios

(glutamato), eferentes colinérgicos, interneurônios gabaérgicos inibitórios e

interneurônios colinérgicos e esta área, além do que foi descrito, recebe projeções

de várias regiões cerebrais. O CPF recebe eferentes dopaminérgicos provenientes

da área tegmentar ventral (ATV) e envia projeções glutamatérgicas para ATV e

núcleo accumbens (SESACK; PICKEL, 1992). Com relação ao glutamato, as

terminações nervosas glutamatérgicas no CPF medial nascem principalmente de

projeções eferentes do núcleo mediodorsal do tálamo, do hipocampo e amígdala

50

(RUGGIERO et al., 2011). O núcleo da rafe, área produtora de serotonina (5HT),

recebe inervação glutamatérgica proveniente do CPF (SESACK; PICKEL, 1992).

Em seres humanos, o funcionamento anormal do CPF tem sido

correlacionado com psicopatologias incluindo esquizofrenia, sociopatia, transtorno

obsessivo compulsivo, depressão, entre outros. As interconexões do córtex pré-

frontal ventromedial (CPFvm) com a formação hipocampal parecem ser

unidirecionais, sendo que o CPFvm recebe projeções do hipocampo, principalmente

da porção CA1, mas apenas poucas fibras do CPFvm chegam à formação

hipocampal (HEIDBREDER; GROENEWEGEN, 2003; VERTES, 2006). Os aferentes

colinérgicos para o CPFvm são, em grande parte, projeções provenientes do núcleo

basal (GAYKEMA et al., 1991) e exercem papel fundamental na atenção, memória,

motivação e induzem processos de ansiedade (BERNSTON et al., 1998). A

atividade das vias colinérgicas está aumentada frente a estímulos estressantes, e

sugere-se que a hiperatividade das aferências colinérgicas para o CPF pode

contribuir para os estados de ansiedade (ROSSI et al., 2006).

O hipocampo e suas estruturas lobulares adjacentes, temporal e parietal,

denominados de formação hipocampal, tem numerosas conexões e, principalmente,

conexões indiretas com muitas porções do córtex cerebral, bem como com as

estruturas basais do sistema límbico – a amígdala, o hipotálamo, o septo e os

corpos mamilares. Quase qualquer tipo de experiência sensorial causa ativação de

pelo menos alguma parte do hipocampo. Distribui muitos sinais para o tálamo

anterior, hipotálamo e outras partes do sistema límbico, especialmente através do

fórnix, maior via de comunicação. Assim, o hipocampo é um canal adicional através

do qual sinais sensoriais podem iniciar reações comportamentais para diversos fins

(HASSELMO, 2005).

O hipocampo está tradicionalmente relacionado a processos cognitivos,

como aprendizado e memória, também parece estar envolvido com a resposta ao

estresse (RIEDEL; MICHEAU, 2001; LATHE, 2001). É ativado por diferentes

estressores e participa do processamento de informações sobre eventos

ameaçadores (LOPEZ et al., 1999). O hipocampo possui grande densidade de

receptores para glicocorticoides (GCs) que, quando ativados, inibem a atividade do

eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, limitando a resposta ao estresse (HERMAN;

CULLINAN, 1997). Além disso, também pode se tornar alvo para os efeitos

51

deletérios do estresse. Eventos estressantes teriam efeito neurotóxico sobre o

hipocampo, provavelmente mediado pelo aumento de GCs, predispondo ao

desenvolvimento da depressão (BROWN et al., 1991).

Outra área de destaque são os núcleos da base que se encontramo corpo

estriado, o globo pálido, a substância negra e os núcleos subtalâmicos. O corpo

estriado (CE) apresenta três subdivisões: o núcleo caudado, o putamen e o estriado

ventral, o qual inclui o núcleo accumbens. Este recebe impulsos de entradas

provenientes do córtex cerebral, tálamo e tronco encefálico. Os neurônios se

projetam para o globo pálido e a substância negra. as áreas do córtex emitem

projeções glutamatérgicas excitatórias para porções específicas do CE, além de

receber projeções dopaminérgicas do mesencéfalo e impulsos de entrada

serotonérgicos dos núcleos da rafe (DE LONGO et al., 2000). No corpo estriado, as

projeções de neurônios gabaérgicos espinhosos são de 90 a 95%. Esses neurônios

gabaérgicos projetam-se para o globo pálido e a substância negra. Cerca de 1 a 2%

constituem os interneurônios estriatais, que são do tipo não espinhoso e fazem

conexão com os espinhosos médios (GOLDMAN; GILMAN, 2012).

O corpo estriado apresenta área ventral e contígua, denominado corpo

estriado ventral e corpo estriado dorsal. O corpo estriado ventral é constituído por

três estruturas: a substância inominada, o núcleo accubems e o tubérculo olfatório.

A substância inominada situa-se na base do cérebro, superiormente ao trígono

olfatório e à substância perfurada anterior e ventralmente ao globo pálido e

à comissura anterior. O núcleo accumbens localiza-se em posição anterior e ventral

no cérebro, inferiormente ao putâmen (mais especificamente na porção em que ele

se liga à cabeça do núcleo caudado) e superiormente à substância perfurada

anterior. O tubérculo olfatório é uma pequena eminência situada posteriormente

ao trigono olfatório e anteriormente à porção substância perfurada anterior (MA,

1997).

O corpo estriado no homem não é proporcionalmente tão grande quando

comparado ao estriado de ratos. Em termos embriológicos, o estriado origina-se a

partir do telencéfalo, cuja etiologia do nome é latina: striatum, por causa da

aparência cheia de estrias, quando observado ao microscópio (LENT, 2004). Essas

estrias vêm dos axônios mielinizados da porção anterior da cápsula interna que, em

52

humanos, atravessam o estriado de forma a separar o caudado do putâmen. Em

roedores, caudado e putâmen representam estrutura única (MINK, 1999).

Dessa forma, ressalta-se a importância de estudos comportamentais,

farmacológicos e neuroquímicos para o esclarecimento dos mecanismos de ação de

moléculas, como a STY, objeto de estudo desta tese.

53

2 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

O uso de moléculas obtidas a partir da semissíntese de plantas

medicinais tem despertado interesse de pesquisadores, pois a partir dessas

moléculas, podem-se desenvolver fármacos para serem utilizados na população.

Nesse sentido, as fontes de origem vegetal apresentam atrativo inigualável na busca

por substâncias ativas que possibilitem o desenvolvimento de novos fármacos.

Considerando a biodiversidade existente na flora brasileira e seu potencial

como fonte de moléculas bioativas a serem estudadas e exploradas, acredita-se que

muitas pessoas possam apresentar efeitos promissores no tratamento dos distúrbios

no sistema nervoso central, como a ansiedade e a epilepsia, que apresentam

terapêutica com custo alto e efeitos colaterais que afetam a qualidade de vida destes

sujeitos e suas atividades profissionais.

As várias espécies do gênero Aniba tem sido objeto de estudo nos últimos

anos, pois este grupo tem em sua composição uma molécula de esterilpirona de

ocorrência natural-[(E) - esteril- piran- 2 – ona]. O anel piran-2-ona é um composto

intermediário-chave na biosíntese de metabólitos, sendo encontrados em plantas,

animais, bactérias e insetos (MCGLACKEN; FAIRLAMB, 2005).

Aniba panurensis é uma planta que contém esteril-2-pironas, cuja

estrutura é similar às kavalactonas (kava-kava) e as cumarinas que demonstraram

atividade no SNC. A 6-[(E) - esteril- piran - 2 - ona] poderia servir como molécula

alternativa para o tratamento das doenças que compremetem o SNC.

Como não existem na literatura muitos estudos demonstrando ação

central da 6-STY, e moléculas com estrutura semelhante têm demonstrado ação no

SNC, sentiu-se a necessidade de estudar os efeitos dessa molécula em modelos

comportamentais e dosagem de aminoácidos no SNC de camundongos. A partir

deste estudo, foi possível obter possível ação da STY nos modelos ansiedade e

indução de convulsão por substâncias utilizadas em modelos validados.

54

3 OBJETIVOS

Objetivou-se verificar os efeitos neurofarmacológicos STY obitidos da

Anibaparusinensi em camundongos através de testes comportamentais, e

neuroquímicos. Para possibilitar melhor compreensão, o estudo foi dividido em

quatro capítulos:

Capítulo I:

Estudar os efeitos comportamentais causados pela molécula de 6-esteril-

2-pirona (STY), obtidos da Aniba parusinensiem camundongos, por meio dos

modelos de ansiedade, teste do campo aberto (ALE, rearing e grooming), teste do

Labirinto em Cruz Elevado, teste da placa perfurada, coordenação motora com o

teste rota Rod e tempo de sono.

Capítulo II:

Determinar as concentrações de aminoácidos após os testes de

comportamento (Aspartato, Glutamato, Glicina, GABA, Taurina e Histidina) no CPF,

HC e CE, após tratamento com a STY em camundongos.

Capítulo III:

Estudar o efeito da moléculade STY no SNC, por meio dos modelos de

indução de convulsão por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina.

Capítulo IV:

Determinar os níveis de aminoácidos após os testes de convulsão

induzidos por PTZ, estricnina, bicuculina e pilocarpinano CPF, HC de camundongos,

após tratamento com STY.

55

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Planta

A STY foi obtida a partir dos frutos planta Aniba panurensis, conforme

descrição de Barbosa Filho (1986). Este material foi obtido pelo pesquisador Dr.

José Maria Barbosa Filho, do Laboratório de Tecnológio Farmacêutica – UFPB,

através de colaboração existente entre o Laboratório de Neurofarmacologia da UFC.

Frutos verdes da Aniba panurensis foram coletados pelo Dr. Hipólito P.

Ferreira Filho, em Humaitá, no Estado do Amazonas e identificado pelo Prof. Klaus

Kubitzki, da Universidade de Hamburg, que mantém no herbário o vouchers dessa

universidade. Os frutos verdes coletados (1000g) foram moídos e colocados em

solução contendo etanol. A solução foi filtrada e depois evaporada. O resíduo (48g)

foi redissolvido em solução aquosa de EtOH a 60%. A solução foi extraída, primeiro

com hexano e depois com clorofórmio. Os solventes foram evaporados do extrato de

CHCl3, dos quais obteve-se 8,5 g, submetidos à cromatografia em coluna (sílica gel

70%). A diluição de solventes e misturas CHCl3, CHCl3-EtOAc, CHCl3-MeOH de

polaridade crescente gerou nove frações brutas, cada uma por TLC cromatografia.

O composto 6-esteril-2-pirona foi obtido como cristais amarelos, com rendimento de

2,6g. A pureza química da 6-estéril-pirona foi mais de 98%, determinada por alto

desempenho de cromatografia líquida. O composto 6-esteril-pirona foi isolado da

Aniba parviflora e Goniothalamus umbrosus. As estruturas químicas de 6-estéril-

pirona foi identificada com base em dados de espectroscopia (1H and 13C NMR) e

comparados com valores reportados na literatura (BITTENCOURT et al., 1971;

BANERJIL et al., 1980; BARBOSA-FILHO, 1986; AHMAD; DIN, 2002). A Aniba

panurensis encontra-se depositada no herbarium do Royal BotanicGardens, Kew

(K), K000601914.

4.2. Animais

Foram utilizados Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss

Webster, adultos, machos, pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará

(UFC). O manejo e a manutenção desses animais, antes, durante e após

56

experimentação, foram realizadas de acordo com regras de manutenção e

manipulação de animais de laboratório, preconizadas pelo Colégio de Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA, 2008). Este projeto foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Nº protocolo 10/2008).

4.3 Drogas utilizadas

Quadro 1 – Descrição das drogas utilizadas.

Drogas Origem

Tween 80 a 4% - Polyoxyethilene Sorbitan

Mono-oleate

Sigma - USA

Diazepam Sigma - USA

Flumazenil Sigma – USA

Cremophor - Sigma-USA Sigma – USA

Pentilenotetrazol Sigma – USA

Estricnina Sigma – USA

Pilocarpina Sigma – USA

Bicuculina Tocris – USA

GABA, Glutamato, Glicina,Taurina, Aspartato e

Histidina

Sigma – USA

Água destilada Deionizador

Ácido perclórico Sigma – USA

57

4.4 Equipamentos

Quadro 2 – Descrição dos equipamentos utilizados.

Equipamentos Origem

Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça.

Balança para animais Filizola ID-1500 – (Brasil)

Banho-maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil.

Campo aberto para camundongos Fabricação própria

Centrífuga refrigerada Modelo 215 – Fanem (Brasil)

Cronômetros Incoterm, Brasil

Deionizador USF Elga, USA

Equipamento de HPLC (Cromatografia Líquida da Alta Performance) Detector de fluorescência e eletroquímico

Shimadzu, Japão

Freezer (-75ºC) Legacy Sistem, USA

Guilhotina Harvard, USA

Homogeinizadores elétricos Bellico, USA

Labirinto em Cruz Elevado para camundongos

Fabricação própria

Material cirúrgico

Micropipetas, H.E. Pedersen, Dinamarca

Placa Perfurada Ugo Basile, Italy

Equipamento do Rota Rod Ugo Basile, Italy

Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc. NY, USA

58

4.5 Preparo das drogas

A STY foi dissolvida em Tween 80 a 4,0% e diluída em água destilada,

obtendo-se a concentração final para ser administrada nas doses 1, 5, 10 ou 20

mg/kg, respectivamente. Os grupos controles receberam veículo (água destilada

emulsificada com Tween 80 a 4%). As drogas utilizadas ao longo do experimento

foram diazepam (1 ou 2 mg/kg), flumazenil (2,5 mg/kg), pentobarbital sódico (40

mg/kg), pentilenotetrazol (85 mg/kg), pilocarpina (400 mg/kg), estricnina (20 mg/kg) e

bicuculina (12 mg/kg). O volume total administrado nos animais foi de 10 mg/kg.

4.6. Protocolo de tratamento

Os animais foram tratados com STY de forma aguda, nas doses 1, 5, 10

ou 20 mg/kg, através da via intraperitoneal (i.p.) para o estudo das atividades no

sistema nervoso central. Os animais foram submetidos aos testes comportamentais

30 minutos (min) após o tratamento intraperitoneal ou subcutâneo para a pilocarpina.

Após uma hora da administração da STY os animais foram dissecados.

Após os testes de comportamento, os cérebros dos animais foram

decaptados e as áreas do córtex pré-frontal (CPF), hipocampo

(HC) e corpo estriado (CE), foram dissecados sobre gelo para realização dos testes

neuroquímicos. Os animais controles foram tratados com solução tween 80 4%,

conforme a diluição das substâncias pesquisadas, que foram comparadas a estes

grupos controles.

59

4.7 Testes de comportamento

4.7.1 Teste do Campo Aberto

O campo aberto é um modelo capaz de detectar ação no SNC

estimulante ou depressor. O aparato para camundongos é feito de acrílico (paredes

transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15 cm), dividido em nove quadrantes iguais. A

metodologia de Archer (1973) foi utilizada para avaliar a atividade exploratória do

animal. Os principais parâmetros para observação foram: número de cruzamentos

com as quatro patas (movimentação espontânea), número de comportamentos de

autolimpeza (―grooming‖), número de levantamentos (―rearing‖), registrados durante

um tempo de 5 minutos, cujo primeiro minuto foi de habituação (ARCHER, 1973). O

teste foi realizado meia hora após administração i.p. da STY (1,5, 10 ou 20 mg/kg),

FLU (2,5 mg/kg/ e DZP (1 ou 2 mg/kg). A tendência natural do animal em um

ambiente novo é a de explorá-lo, apesar do conflito com o medo provocado por este

mesmo ambiente (Esquema 1).

60

Esquema 1 – Esquema do Teste do Campo Aberto.

61

4.7.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

O Labirinto em Cruz Elevado (LCE) é baseado no modelo proposto, em

ratos, por Pellow et al. (1985), e validado por Lister (1987) para camundongos, e

consiste em dois braços abertos opostos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x

25 cm), também opostos, em forma de cruz. Os braços abertos e fechados estão

conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A plataforma, as paredes laterais

dos braços fechados são confeccionadas em acrílico transparente e o chão em

acrílico preto.

O aparelho está elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão. Após

meia hora, o tratamento com STY ou veículo por via i.p., os camundongos foram

colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para um dos braços

fechados e o comportamento observado por cinco minutos. As medidas

comportamentais registradas no LCE são: frequência de entradas e o tempo

despendido nos braços abertos e nos fechados. A frequência total de entradas é

obtida pela soma simples das frequências de entradas nos braços abertos e nos

fechados.

Dessa forma, os parâmetros utilizados para análise estatística dos dados

e confecção dos gráficos foram: número de entradas nos braços abertos (NEBA),

tempo de permanência no braço aberto (TPBA), número de entradas no braço

fechado (NEBF), tempo de permanência no braço fechado (TPBF). Aumento seletivo

nos parâmetros correspondentes aos braços abertos revela efeito ansiolítico

(PELOW et al. 1985), entre outros achados.

Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação da

STY, um grupo de camundongos foi tratado com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p.

antagonista do receptor GABA-A Benzodiazepnico e 15 min após receberam STY

(1,5, 10 ou 20 mg/kg i.p.) , sendo submetidos aos testes após 30 min. Foi utilizado

DZP (1 mg/kg i.p) como droga padrão ansiolítica (Esquema 2A e 2B).

62

Esquema 2 – Esquema A e B do teste do Labirinto em Cruz elevado.

Esquema A

Esquema B

63

4.7.3 Teste da placa perfurada

Camundongos tratados com STY nas doses (1, 5, 10 ou 20 mg/kg i.p.)

foram colocados individualmente no ―hole-board‖, que consiste em uma caixa

quadrada de acrílico transparente (50 x 50 cm) a 10 cm de altura, com 16 orifícios de

2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas. Foram registrados o

número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa

(CLARK et al., 1971), por um período de cinco minutos.

Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação da

STY camundongos que foram pré-tratados com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p. um

antagonista do receptor GABA-A Benzodiazepnico e 15 minutos após receberam

STY(1,5,10 ou 20 mg/kg) i.p., sendo submetidos aos testes após 30 minutos. Foi

utilizado DZP (1 mg/kg) i.p. como droga padrão ansiolítica (Esquema 3A e 3B).

64

Esquema 3 – Esquema A e B do Teste da Placa perfurada.

Esquema A

Esquema B

65

4.7.4 Teste do Rota Rod

O teste do Rota Rod foi realizado para avaliar cordenação motora. O

camundongo foi colocado com as quatro patas sobre uma barra de 2,5 cm de

diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm. Os animais foram

selecionados em sessões de um minuto de duração, 24 horas antes da realização

dos experimentos, sendo escolhidos aqueles que permanecem na barra giratória e

apresentaram até três quedas em um minuto. Os animais selecionados receberam o

tratamento, no dia do teste, e foram colocados no Rota Rod, por um minuto. Foram

registrados o tempo de permanência na barra giratória (em segundos) e o número

de quedas, com três reconduções, no máximo (DUNHAM; MIYA, 1957).

Posteriormente, com a finalidade de investigar mecanismo de ação de

STY camundongos que foram tratados com flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg i.p. um

antagonista do receptor GABA-A benzodiazepnico e 15 minutos após receberam

STY(1,5,10 ou 20 mg/kg) i.p., sendo submetidos aos testes após 30 minutos. Foi

utilizado DZP1 mg/kg, na dose ansiolítca e 2 mg/kg i. p, como padrão para

atividade relaxante muscular. Este teste permite avaliar se os tratamentos

promovem incoordenação motora nos animais por sedação e/ou relaxamento

muscular (Esquema 4A e 4B).

66

Esquema 4 – Esquema A e B do teste do Rota Rod

Esquema A

Esquema B

67

4.7.5 Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital

Os animais foram tratados com STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.), veículo

(controle) ou diazepam (1mg/Kg, i.p). Após 30 minutos, foi administrado

pentoparbital sódico (PTB) na dose de 40 mg/Kg, via i.p. Com o início da atividade

do PTB, os animais foram colocados na posição de decúbito dorsal. O tempo desde

a injeção do PTB até o animal perder o reflexo postural foi registrado como latência

de sono e o tempo de latência entre a perda e a recuperação voluntária do reflexo

postural é registrado como tempo de sono (WAMBEBE, 1985; ROLLAND et al.,

1991). O critério para recuperação dos reflexos foi fixado quando o animal saiu da

imposição por três vezes consecutivas (CARLINI et al., 1896; WANBEBE, 1985).

Foi estabelecido um tempo, máximo de 240 minutos, ou seja, animais, cujo tempo

de sono ultrapassava esse valor, o mesmo foi mantido (Esquema 5).

Esquema 5 – Esquema do teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico.

68

4.8 Avaliação da Atividade Anticonvulsivante

Os modelos de convulsão em animais reproduzem alterações

comportamentais e eletroencefalográficas que se assemelham à epilepsia em

humanos. Os convulsivantes químicos mais utilizados em pesquisas com modelo

animal são: o pentiletetrazol que inibe os canis de cloreto associados ao receptor

GABA; a estricnina que atua inibindo seletivamente os receptores de glicina pós-

sinápticos; a bicuculina que atua antagonizando o receptor GABA; e a

pilocarpinaque quando utilizada pode levar ao desenvolvimento do status epilepticus

(ALMEIDA, 2006).

4.8.1. Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol

Esse experimento teve como finalidade identificar a possível ação

anticonvulsivante da substância em teste. Os animais foram pré-tratados com STY

(1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.) veículo (controle) ou diazepam (1 mg/Kg, i.p). O

pentilenotetrazol (PTZ) 85 mg/Kg i.p. foi administrado como agente indutor das

convulsões após 30 minutos. Os animais foram colocados em gaiolas e observados

por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência de

convulsão (tempo entre a administração do PTZ até a primeira convulsão clônica ou

tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo decorrido da

administração de PTZ até a morte), em segundos (Esquema 6).

4.8.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricinina

A estricnina 20 mg/Kg i.p. foi administrada como agente indutor das

convulsões após 30 minutos do tratamento com STY(1, 10 e 20 mg/Kg, i.p.), veículo

(controle) ou diazepam (1mg/Kg, i.p). Os animais foram colocados em gaiolas e

observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência

de convulsão (tempo entre a administração da estricnina até a primeira convulsão

69

clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo

decorrido da administração de estricnina até a morte), em segundos.

4.8.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina

Esse experimento tem como finalidade identificar a possível ação

anticonvulsivante da substância em teste. A dose referenciada como convulsivante é

3 mg/kg, no entanto, parte dos animais que receberam STY não convulsionaram.

Bicuculina (12 mg/Kg i.p.) foi a dose na qual os animais exibiram convulsão. Foi

administrada como agente indutor das convulsões 30 min após tratamento com STY

(1, 10 e 20 mg/Kg, i.p.), veículo (controle), diazepam (1 mg/kg, i.p). Os animais foram

colocados em gaiolas e observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros

analisados foram latência de convulsão (tempo entre a administração do bicuculina

até a primeira convulsão clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de

morte dos animais (tempo decorrido da administração de bicuculina até a morte), em

segundos.

4.8.4. Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina

Pilocarpina (400 mg/kg s.c.) foi administrado como agente indutor das

convulsões 30 minutos após tratamento com STY(1, 10 ou 20 mg/Kg, i.p.), veículo

(controle) ou diazepam (1mg/kg)s.c. Os animais foram colocados em gaiolas e

observados por um período de 20 minutos. Os parâmetros analisados foram latência

de convulsão (tempo entre a administração da pilocarpinaaté a primeira convulsão

clônica ou tônico-clônica), em segundos, e a latência de morte dos animais (tempo

decorrido da administração da pilocarpina até a morte), em segundos.

70

Alterações comportamentais

O modelo de convulsão induzido por pilocarpina (400 mg/kg s.c. ) está

associado à epilepsia parcial complexa com foco no lobo temporal. Os animais

apresentam sinais colinérgicos, tremores, movimentos estereotipados (aumento da

atividade de roer, coçar, mastigar e wet-dog shakes – ato de sacudir semelhante a

um cachorro molhado), convulsões motoras límbicas que progridem com estado

epiléptico (TURSKI et al.,1987; FREITAS, 2011).

71

Esquema 6 – Esquema do teste de indução de convulsão por pentilenotetrazol,

estricnina, bicuculina e pilocarpina.

72

4.9 Dosagem de Aminoácidos

Para determinação das concentrações de aminoácidos, foi utilizado o

sistema HPLC (High Performance Liquid Chromatography), com detector de

fluorescência. A espectroscopia de fluorescência pode ser usada como método de

detecção específica, constituindo um dos mais sensíveis para compostos que

fluorescem. Fluorescência pode ser desenvolvida em compostos não fluorescentes

por reações de derivatização realizadas pré ou pós-coluna (HALLMAN et al., 1984).

Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por

30 s e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O

sobrenadante foi separado e filtrado através de uma membrana (millipore- 0,2 m)

e, posteriormente, associado a uma solução de derivatização pré-coluna, para

obtenção de fluorescência, em uma proporção de 1:1. Um minuto depois do início

dessa associação uma alíquota de 20 l foi retirada e injetada no equipamento de

HPLC para análise química.

Para análise dos aminoácidos, uma coluna RP-ODS(M) com comprimento

de 15 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 m, da Shimadzu-Japão foi

utilizada. A fase móvel foi utilizada em gradiente com duas fases: A- NaH2PO4

(50mM) e metanol (20%, v/v) em pH 5,5; B - metanol puro (100 %). Aspartato (ASP),

Glutamato (GLU), Glicina (GLI), Taurina (TAU) e GABA foram detectados com uso

de um detector de fluorescência (Modelo RF-535 da Shimadzu, Japão) com

comprimento de ondas de EX-Wavelength (370 nm) e EM-Wavelength (450 nm). Os

cromatogramas foram registrados e quantificados por um computador, usando

software da Shimadzu. A quantidade dos aminoácidos foi calculada por comparação

da altura dos picos obtidos com a média dos padrões e os resultados foram

expressos em mol/g de tecido.

Ressalta-se que, foram realizadas dosagens de aminoácidos do CPF, HC,

CE, após os testes de comportamento (Esquema 7) e teste de indução de convulsão

com PTZ, estricnina, bicuculina ou pilocarpina (Esquema 8). As áreas cerebrais

utilizadas para dosagem deaminoácidos, após os testes de indução de convulsão,

foram CPF e HC.

73

Esquema 7 – Determinação de aminoácidos após os testes de comportamento.

Esquema 8 – Determinação de Aminoácidos após os testes de Convulsão.

74

4.10 Análise Estatística

A análise estatística dos dados foi realizada através dosoftware Graph

Prism. Versão 5 para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA.

Os resultados que obedeciam a uma distribuição paramétrica foram

analisados por Análise de Variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey (post

hoc).

Os resultados foram expressos pela Média ± Erro Padrão da Média

(EPM), com número de animais entre parêntese e foi considerado o nível de

significância menor que 0,05 (p<0,05). Utilizaram-se as letras do alfabeto para

carcterizar significância.

75

5 RESULTADOS

5.1 Capítulo I: Efeitos da 6–estéril- 2 -pirona sozinha ou associada com

antagonista benzodiazepínico em testes comportamentais em camundongos

5.1.1 Teste do Campo Aberto

Os parâmetros avaliados neste experimento foram atividade locomotora

(ALE), rearing e grooming e os resultados foram expressos com média ± EPM do

número de travessias, rearings e groomings. Na Figura 6, observa-se que atividade

locomotora foi aumentada pela STY na dose de 10mg/kg (43,83 ± 1,78) e 20 mg/kg

(49,00 ± 3,10) quando comparados com o controle (33,44 ± 2,60 ). O diazepam 2

mg/kg, usado como droga padrão, reduziu a ALE em relação ao controle (24,20 ±

1,7 ). O flumazenil (2,5 mg/Kg) i.p. aumentou a atividade locomotora em relação ao

controle (53,40 ± 3,6) [F(6,68)=16,72; p<0,0001].

Como demonstrado na Figura 7, não houve diferença nas doses

administradas em relação ao controle. O diazepam 2 mg/Kg i.p., usado como droga

padrão, reduziu o número de rearing (DZP-2: 4,10 ± 0,76), enquanto o flumazenil

aumentou esse número (19,13 ± 1,88), comparado ao grupo controle (10,67 ± 1,50)

[F(6,66)=8,687; p<0,0001].

A Figura 8 mostra o comportamento de grooming após administração da

STY, DZP e FLU. Nenhum efeito foi observado pela STY nesse comportamento,

exceto pelo aumento de grooming após o tratamento com a maior dose da STY-

20mg/kg (4,00 ± 0,39), comparado ao controle (2,30 ± 0,55). Por outro lado, como

esperado, o diazepam 2 mg/Kg diminuiu esse comportamento em relação ao grupo

controle. Efeito inverso foi observado com o grupo tratado somente com FLU

(3,58±0,43) [F(6,71)=8,185; p<0,0001].

76

Figura 6 – Efeito da STY sobre atividade exploratória avaliada através do teste de

campo aberto em camundongos.

Para análise estatística foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey comotest

post hoc, a, b e c: p<0,05, quando comparado ao grupo controle, STY-1 e DZP-2.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

DZP

-2

FLU -2

,5

0

20

40

60

a,b

a,c

a

a,bN

úm

ero

de t

ravessia

s

77



Para análise estatística, foi utilizada ANOVA seguido por Tukey como test

post hoc, a e b: p<0,05 quando comparado ao grupo controle e STY-1.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

DZP

-2FLU

0

5

10

15

20

25

a,b

a

Nú

mero

de

reari

ng

78

Figura 8 – Efeito da STY sobre o número de rearing, avaliada através do teste de


Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey como

test post hoc, a, b e c: p<0,05, quando comparado ao grupo controle, STY e DZP-2.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

DZP

-2FLU

0

1

2

3

4

5 aa,b

a

Nú

me

ro d

eG

roo

min

g

79

5.1.2 Teste do Labirinto em Cruz Elevado Na Figura 9, administração da STY por

via i.p. nas doses (1, 5, 10 ou 20 mg/kg) mostrou aumento no número de entradas

nos braços abertos (STY-1: 4,0 ± 0,42; STY-5: 4,70 ± 0,42; STY-10: 4,58 ± 0,56 ou

STY- 20: 4,10 ± 0,55). A associação do FLU (2,5 mg/kg) antagonista do receptor de

benzodiazepínicos com STY bloqueou o efeito da STY ( STY- 1: 2,70 ± 0,43; STY-

5: 2,40 ± 0,42; STY-10: 2,72 ± 0,56; STY- 20: 2,50 ± 0,40, [F(11,122)= 17,88;

p<0,0001]. Efeito semelhante foi observado pelo pré-tratamento do FLU com DZP-1

(2,30 ± 0,51), quando comparado ao grupo do DZP-1 (9,00 ± 20,32)

[F(11,122)=17,81; P<0,001].

Como demonstrado na Figura 10, STY (1, 5, 10 ou 20 mg/kg) aumentou o

tempo de permanência dos animais nos braços abertos (STY-1: 90, 33 ± 10,84

STY-5: 92,67 ± 15,8; STY-10: 60,10 ± 8,53; STY- 20: 63,36 15,33), quando

comparado com o grupo controle (27,22 ± 5,25; p<0.0001). Nos grupos pré-tratados

com FLU + STY (FLU+STY-1: 22,90 ± 2,76; STY- 5: 38,20 ± 5,75; STY-10: 32,40 ±

5,17; STY- 20: 23,89 4,10), foi observado aumento da STY em relação ao controle.

No grupo pré-tratado com FLU+ DZP, esse efeito do DZP foi bloqueado [F(11, 112)=

13,10; p<0,0001].

Quanto ao número de entradas no braço fechado (Figura 11),

administração da STY, em todas as doses estudadas, não apresentou alteração em

relação ao grupo controle (4,10 ± 0,52). Efeito semelhante foi observado nos grupos

pré-tratados com flumazenil (FLU+STY). Como esperado, os animais tratados com

DZP (2,50 ± 0,52) diminuiu NEBA e esse efeito foi revertido pelo pré-tratamento com

FLU + DZP-1(6,20 ± 0,86) [F(11,118)= 4,054; p<0,0001].

Em relação ao outro parâmetro avaliado TPBF, nenhum efeito foi

observado após o tratamento com a STY (1, 5, 10 ou 20 mg/kg), quando comparado

ao grupo controle (208,5 ± 20,91). Por outro lado, o pré-tratamento com FLU (FLU +

STY) aumentou o TPBF dos animais, quando comparados aos animais tratados,

apenas com STY (STY-1: 192,8 ± 7,37; STY-5: 196,3 ± 15,23; STY-10: 209,4 ±

13,75; STY-20: 190,5 ± 16,39). Novamente, o DZP diminuiu o TPBF e esse teste foi

revertido pelo grupo pré-tratado com FLU (149,7 ± 13,68); [F(11,119)= 14,48;

p<0,0001].

80

Figura 9 – Efeitos da STY sobre o número de entradas no braço aberto (NEBA), no

teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.

Os valores da Figura 9 representam média ± EPM do número de entradas

nos braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por

Tukey, como test post hoc, a,b,c,d,e,f,g,: p< 0,05, quando comparado aos grupos

controle, STY-1, STY-5,STY-10,STY-20, DZP-1, FLU, respectivamente.

Controle

STY-1

STY-5

STY-10

STY-20

FLU+STY-1

FLU+STY-5

FLU+STY-10

FLU+STY-20

DZP-1FLU

FLU+DZP-1

0

5

10

15

a a a a

b

a

c d ef

f,g

NE

BA

81

Figura 10 – Efeito da STY sobre o tempo de permanência nos braços abertos

(TPBA), no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.

Os valores da Figura 10 representam média±EPM no tempo de

permanência nos braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA,

seguido por Tukey, como test post hoc, a,b,c,d,e,f,g,: p<0,05, quando comparado

aos grupos controle, STY-1, STY-5, STY-10, STY-20, DZP-1 e FLU,

respectivamente.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

FLU+S

TY-1

FLU+S

TY-5

FLU+S

TY-1

0

FLU+S

TY-2

0

DZP

-1FLU

FLU+D

ZP-1

0

50

100

150

aa

aa

a

b

cd

e

a

f,g

TP

BA

82

Figura 11 – Efeito da STY sobre o número de entradas nos braços fechados (NEBF),

no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.

Os valores representam média ± EPM do número de entradas nos braços

fechados. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey, como

test post hoc, a,b e c: p<0,05, quando comparado ao controle, STY-1 e FLU,

repectivamente.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

FLU+S

TY-1

FLU+S

TY-5

FLU+S

TY-1

0

FLU+S

TY-2

0

DZP

-1FLU

FLU+D

ZP-1

0

5

10

15

a

b

c

NE

BF

83

Figura 12 – Efeito da STY sobre o tempo de permanência nos braços fechados

(TPBF), no teste Labirinto Cruz Elevado em camundongos.

Os valores da representam a média ± EPM do tempo de permanência nos

braços abertos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguido por Tukey,

como test post hoc, a: p<0,05, quando comparado STY-1, STY-5, STY-20, DZP-1 e

FLU, respectivamente.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

FLU+S

TY-1

FLU+S

TY-5

FLU+S

TY-1

0

FLU+S

TY-2

0

DZP

-1FLU

FLU+D

ZP-1

0

100

200

300b

a

cd

eT

PB

F

84

5.1.3 Teste da Placa perfurada

Neste modelo experimental, após administração aguda de STY nas doses

de 1, 5, 10 ou20 mg/kg (i.p.), foi observada (Figura 13) aumento do número de

vezes que o animal colocou a cabeça no orifício da placa perfurada (STY-1: 9,0 ±

0,85; STY-5: 8,20 ± 0,61; STY-10: 8,70 ± 0,68; STY-20: 11,60 ± 1,42), comparado

ao controle (5,50 ± 0,59).

Para pesquisar a participação de mecanismos gabaérgicos no mecanismo

de ação da STY em relação a seu efeito ansiolítico, utilizou-se o flumazenil,

diazepam ou STY administrados isoladamente ou associados.

A análise do envolvimento dos receptores benzodiazepínicos no efeito da

STY mostrou que o grupo pré-tratado com FLU (FLU-2,5 +STY, i.p.) reverteu o efeito

ansiolítico da STY no parâmetro avaliado, pois ocorreu diminuição do número de

mergulhos na placa perfurada (head dips) em todas as doses administradas (STY-1:

6,0 ± 1.0; STY-5: 4,60 ± 0,42; STY-10: 5,40 ± 0,46; STY-20: 5,20 ± 0,62).

Como esperado o DZP aumentou o número de head dips, em que o efeito

foi bloqueado pelo pré-tratamento com flumazenil (FLU + DZP).

85

Figura 13 – Efeito da STY sobre o número de mergulhos no teste da placa perfurada.

Os valores da Figura 13 representam média ± EPM do número de

mergulhos. Para análise estatística, foi utilizada ANOVA, seguida por Tukey, como

test post hoc, a,b,c,d,e,f, p<0,05, quando comparado a STY-1, STY-5, STY-10, STY-

20, DZP-1 e FLU, repectivamente.

Contr

ole

STY

-1

STY

-5

STY

-10

STY

-20

FLU+S

TY-1

FLU+S

TY-5

FLU+S

TY-1

0

FLU+S

TY-2

0

DZP

-1FLU

FLU+D

ZP-1

0

5

10

15

aa

a

a

b

a

c d ej

Nú

mero

de m

erg

ulh

os

86

5.1.4 Teste do Rota Rod

No Teste Rota Rod, como demonstrado na Tabela 1, não foram

observadas alterações no número de quedas após o tratamento com STY nas doses

estudadas (STY-1: 0,40 ± 0,22; STY-5: 0,50 ± 0,16; STY-10: 0,40 ± 0,21 e STY-20:

0,40 ± 0,16), comparando com o grupo controle (00 ± 00). O diazepam, padrão

positivo, na dose de 2mg/Kg promoveu aumento no número de quedas DZP-2 (2,00

± 0,23), quando comparado ao controle (00 ± 00) [F(11,113)= 2,586; p<0,0061].

87

Tabela 1 – Efeito da STY, flumazenil e diazepam, no teste de Rota Rod.

Grupos Número de Quedas Tempo de Permanência

Controle 00 ± 00(n=10) 60,0 ± 0,0 (n=10)

STY-1 0,40 ± 0,22 (n=10) 61,40 ± 3,85 (n=10)

STY-5 0,50 ± 0,16 (n=10) 56,00 ± 1,33(n=10)

STY-10 0,40 ± 0,21 (n=10) 56,80 ± 1.69 (n=10)

STY-20 0,40 ± 0,16 (n=10) 56,00 ± 1,63 (n=10)

FLU+STY-1 0,66 ± 0,28 (n=10) 52,00 ± 2,06 (n=10)

FLU+STY-5 0,20 ± 0,13 (n=10) 59,00 ± 1,00 (n=10)

FLU+STY-10 0,30 ± 0,21 (n=10) 57,00 ± 1,52 (n=10)

FLU+STY-20 0,30 ± 0,39 (n=10) 57,00 ± 1,52 (n=10)

DZP-2 2,00 ± 0,23 (n=10) a 49,00 ± 2,76 (10) a

FLU 0,25 ± 0,16 (n=8) 56,25 ±1 ,83 (n=8)

FLU+ DZP-2 1,20 ± 0,41 (n=10) 55,80 ± 1,75 (n=10)

Efeito da STY (1, 5, 10 ou 20 mg/Kg) e DZP (2 mg/Kg) sozinho ou pré-

tratados com FLU (2,5 mg/Kg), no teste de Rota Rod. Valores representam média ±

EPM do número de quedas e tempo de permanência. Em parêntese, o número de

animais por grupo. Análise estatística foi realizada através da ANOVA, seguida por

teste de Tukey, como teste pos hoc. P<0,05: a e b, quando comparado ao controle e

DZP.

88

5.1.5 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico

Neste teste, foram analisados dois parâmetros: a latência de sono (LS)

em segundos e a duração do sono (DS), também em segundos. A STY aumentou a

LS na dose de 20 mg/kg (443,3 ± 86,01) quando comparado ao grupo controle

(241,2 ± 26,29). Como esperado, o diazepam diminuiu a latência de

sono [F(4,58)= 8,044; P < 0,0001].

Em relação à duração do tempo de sono, as doses administradas

aumentaram a DS em relação ao controle. O DZP-1 também aumentou o tempo de

duração do sono em relação ao controle [F(4,48)=38,43;P<0,0001].

Tabela 2 – Efeito da administração da STY na latência de sono e duração do sono

induzida por pentobarbital sódico.

Grupo Latência de sono (seg) Duração de sono (seg)

Controle 241,2 ± 26,29 (10) 1389 ± 158,5 (10)

STY1 mg/kg 269,2 ± 26,56 (10) 2494 ± 426,3 (9) a

STY 10mg/kg 383,7 ± 53,64 (10) 2534 ± 245,8 (10) a

STY 20mg/kg 443,3 ± 36,01 (9) a 2804 ± 284,1 (10) a

DZP-1 104,2± 3,48 (10) a 6047 ± 286,1 (10) a

Nota: Os valores representam a média ± EPM do número da latência de

convulsão e de morte. Em parêntese, o número de animais por grupo. Para análise

estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey como test post hoc. Valores

significativos representam os grupos com diferença estatística relacionada ao

controle.

89

5.1.6 Discussão

Na sociedade moderna, a ansiedade é um dos mais frequentes distúrbios

do sistema nervoso central, sendo considerado problema de saúde pública

significante, pois afeta amplo segmento da população, gerando gastos relacionados

diretamente com os cuidados da doença e das hospitalizações ou, indiretamente,

como no caso de mortalidades e morbidades (BALLENGER, 2000).

Os efeitos biológicos da STY encontradas no gênero Aniba panurensis no

SNC até o momento não foram elucidados. No presente estudo, foram encontradas

evidências farmacológicas do efeito ansiolítico e anticonvulsivante da molécula

estudada nos modelos clássicos para triagem de atividades sobre o sistema nervoso

central. Segundo Ohl (2003), os modelos de screening para o SNC fornecem

informações, tais como atividade locomotora, atividade ansiolítca, atividade

relaxante muscular, antidepressiva, sedativa/ hipnótica e anticonvulsivante.

O gênero Aniba tem sido utilizado em diversos estudos comportamentais

e neuroquímicos em modelos animais no SNC no Laboratório de Neurofarmacologia

da UFC. Da Aniba riparia foi isolado a riparina II que apresenta efeito ansiolítico na

dose de 25 mg/kg (SOUSA et al., 2007). Este efeito pode estar relacionado com o

receptor GABA-A /Benzodiazepínico (MELO et al., 2006). O efeito antidepressivo da

riparina II foi obtido na dose de 50 mg/kg e parece estar envolvido com o sistema

dopaminérgico (SOUSA et al., 2004, MELO, 2006).

Estudos científicos mostram atividades biológicas referentes às espécies

do gênero Aniba, como o efeito ansiolítico (MELO et al., 2006) e antidepressivo

(SOUSA et al., 2004). Sobre a espécie Aniba panurensis, poucas informações

científicas foram encontradas. O estudo de Klausmeyer (2004) mostra que extratos

obtidos da Aniba panurensis apresentam toxicidade para as raças resistentes ao

AZOLE de Candida albicans e o de Assis (2007) a ação vasorelaxante da STY em

aorta de ratos.

A ansiedade e as desordens de comportamento representam problema de

saúde que afeta inúmeros sujeitos na sociedade moderna. A ansiedade é um estado

emocional que envolve aspectos psicológicos e fisiológicos, que faz parte do

contexto normal das experiências humanas, sendo propulsora do desempenho. As

90

manifestações do estado ansioso normal ou patológico são complexas e difíceis de

serem definidas, todavia na forma patológica ocorre a exacerbação da atividade

nervosa central e autonômica, com manifestações clínicas como palidez, sudorese

palmar, palpitação, opressão cordial, constrição da testa, dificuldade respiratória,

distúrbios gastrointestinais, tremor, tontura, boca seca, insônia entre outros (SOUZA

et al., 2007).

Os benzodiazepínicos é a classe de medicamentos mais usada nos

transtornos de ansiedade, todavia não se recomenda o seu uso para tratamento em

longo prazo, pela possibilidade de desenvolver tolerância, alterações cognitivas e na

memória, dependência física e reação de abstinência (WALKER, 1998;

ALLGULANDER et al., 2004; MAGNANI et al., 2010). Esses fármacos são utilizados

como agente hipnótico, anticonvulsivante e relaxante muscular, por serem

considerados eficazes e seguros. Em virtude destes efeitos indesejáveis, estudos

com outras moléculas têm sido desenvolvidas em busca de novos agentes com

efeito ansiolítico. Outras drogas com ação serotonérgica central têm sido usadas,

tais como a buspirona, agonista parcial do receptor 5-HT1A e a ondansetron,

antagonista 5-HT3 (GORMAN et al., 2002; LALONDE; STRAZIELLE, 2009, 2010).

Vários testes comportamentais são utilizados para avaliar ação de

molécula no SNC. Entre estes, o teste de campo aberto, modelo de animal clássico

que permite avaliar efeitos autonômicos de drogas e atividade geral de animais

(NOVAS et al., 1988). O animal, em um ambiente novo, tem tendência para explorar,

apesar da tensão e do conflito. Este teste é utilizado para estudar os efeitos

ansiolíticos ou ansiogênicos de novas moléculas sobre o comportamento do animal

em um novo ambiente. Desta maneira, a locomoção, rearing e grooming em

roedores, observados no campo aberto, são os parâmetros comportamentais mais

usados para descrever ação da administração destas substâncias no SNC

(MONTGOMERY, 1958; ALMEIDA, 2006). Ressalta-se que estudos também

informam ausência de sensibilidade para modulação da ansiedade neste modelo

(SAUDOU et al., 1994).

Durante o experimento, observou-se o comportamento de locomoção

(número de linhas cruzadas no chão da arena pelo animal), frequência de

exploração vertical (rearing), autolimpeza (grooming).

91

Neste trabalho, no teste de campo aberto, foi observado aumento na

atividade locomotora após administração da STY nas maiores doses 10 ou 20

mg/kg. Estes resultados sugerem ação excitatória sobre o SNC e efeito ansiolítico. O

diazepam, na dose de 2 mg/kg, diminuiu atividade locomotora, mostrando efeito

sedativo, conforme esperado. o flumazenil aumentou a atividade locomotora. O

diazepam, na dose de 2 mg/kg, tem sido utilizado em experimentos para avaliar

atividade locomoto ra, mostrando seu efeito sedativo (SOUSA et al., 2007; MELO et

al, 2010). Aumento ou diminuição deste comportamento pode ser utilizado como

medida para o nível de ansiedade (CRAWLEY, 1985; PELLOW, 1985).

A atividade de rearing consiste em o animal levantar-se sobre as patas

traseiras, como que investigando o ambiente, parece estar relacionada com a

hiperatividade dopaminérgica (SWANSON et al., 1997). No presente trabalho, não

houve alteração de rearing entre as doses administradas de STY. O diazepam (2

mg/kg) diminuiu o rearing, enquanto o flumazenil (2,5 mg/kg) aumentou. Na

literatura, o número de rearings tem sido descrito como aspecto de comportamento

exploratório (ESPEJO, 1997; SWANSON et al., 1997).

O aumento de grooming foi observado em roedores apreensivos

(ARCHER, 1973), e, em alguns estudos, pesquisadores observaram que drogas

ansiolíticas reduzem o grooming em campo aberto (DUNN et al., 1981; MOODY et

al., 1993). De acordo com MacFarland e Reeder (1974), quase todos os animais

gastam significante parte do tempo no comportamento de grooming. Embora vários

transmissores possam modular a expressão deste comportamento (MOODY et al.,

1993), a dopamina está particularmente envolvida (DRAGO, 1999; SERAFIM;

FELÍCIO, 2001;KAUUEFF, TUOHIMAA, 2005). Neste estudo, a STY aumentou o

número de grooming no campo aberto na maior dose STY 20 mg/kg. Este resultado

pode estar relacionado com a modulação de neurotransmissores envolvidos neste

comportamento.

Conforme Starr et al., (1989), existe participação dos receptores

dopaminérgicos D1 e D2 interagindo na locomoção e na estereotipia. Ativação dos

receptores D1 leva a locomoção (STAR et al., 1989) enquanto que ativação de D2

produz o comportamento estereotipado (USHIJIMA et al., 1995). O número

excessivo de grooming tem sido usado como modelo para avaliar desordens

obsessivas compulsivas (FEUSNER; HEMBACHER; KATHARINE, 2009). Agonistas

92

de receptores dopaminérgicos podem causar comportamentos estereotipados em

animais e exacerbar os sintomas das desordens obsessivas compulsivas e tics

(GOODMAN; GILMAN, 2012). Há evidências do envolvimento da via glutamatérgica

no comportamento excessivo de grooming em modelo animal (WELCH et al., 2007).

Diante desses resultados, pode-se sugerir que STY em altas doses (20

mg/kg) estimula os receptores dopaminérgicos do tipo D1, já que aumentou

atividade locomotora espontânea e estimulou receptores D2, produzindo o

comportamento de grooming. Contudo, são necessários estudos adicionais com a

molécula de STY.

Outros modelos conceituados para avaliar o possível efeito ansiolítico ou

ansiogênico é o Labirinto de Cruz Elevado (LCE) e a placa perfurada. Estes testes

buscam verificar aversão natural de um roedor por espaços abertos. O LCE constitui

modelo animal de ansiedade validado primeiramente para ratos (PELLOW et al.,

1985) e, posteriormente, para camundongos (LISTER, 1987). Os roedores evitam os

braços abertos do labirinto, pois é área desprotegida, permanecendo nos braços

fechados, que é área protegida. Os índices de mensuração primária da ansiedade

neste modelo consistem de medidas relativas à frequência de entradas aos braços

abertos e o tempo gasto pelos animais nestas áreas aversivas do aparato.

O LCE permite a visualização do comportamento espontâneo do animal,

sem necessitar de treinamento prévio. Neste estudo, a STY em todas as doses

aumentou o número de entradas e do tempo de permanência nos braços abertos

dos camundongos. Estas alterações indicam atividade exploratória de áreas

consideradas potencialmente perigosas, indicando efeito ansiolítico resultante da

administração da STY em todas as doses administradas. Efeito similar foi observado

com o DZP, BDZ é um padrão utilizado como controle positivo, sugerindo ação do

tipo ansiolítico para esta molécula.

Portanto, para avaliar o mecanismo de ação envolvido no efeito

ansiolítico, utilizou-se o flumazenil (2,5 mg/kg) antagonista de receptores

benzodiazepínicos. Flumazenil liga-se com alta afinidade a receptores de BZD sem,

no entanto, apresentar atividade intrínseca (DELUCIA et al., 2007).

Para realização do experimento, foram utilizados diferentes grupos pré-

tratados com flumazenil, 15 minutos antes de serem tratados com STY. Os

93

resultados mostraram que o FLU bloqueou as ações ansiolíticas da STY e sugerem

o envolvimento dos receptores GABA-A. Estes resultados estão de acordo com os

dados de outros pesquisadores que demonstraram o efeito ansiolítico da estéril - 2-

pirona natural, encontrada em outras espécies de plantas, que apresentam estrutura

química semelhante a utilizada neste estudo, como a dihidroestiril-2-pironas e três

estiril-2-pironas isoladas da P. sabulosa (DUARTE et al., 2007), e 7, 8-

dihidrokavaína e 5, 6- dihidrokavaína Piper methysticum com ação ansiolítica

atribuída às kavalactonas (SMITH et al., 2001; BILIA et al., 2004).

O teste da placa comportamento de mergulho pode refletir os estados

ansiolíticos e ansiogênicos (TAKEDA et al., 1998). Com base nesses estudos e em

informações que a expressão de um estado ansiolítico em animais pode ser refletida

por um aumento no comportamento de mergulhos, os resultados forneceram

evidências que a STY apresentou efeito ansiolítico, nas doses 1,5,10 ou 20 mg/kg

administradas por via intraperitonal. Este efeito foi bloqueado com uso do FLU,

mostrando a participação dos receptores GABAérgicos no mecanismo de ação.

Flumazenil é um derivado imidabenzodiazepina, é um dos vários

derivados 1,4-benzodiazepínico com alta afinidade pelo receptor benzodiazepínico

que age como antagonista competitivo. É o único antagonista dos receptores BDZs

utilizado na clínica, pois sua ação consiste em bloquear algumas das ações dos

BDZs. No entanto, não antagoniza os efeitos de outros sedativos-hipnóticos no SNC

como etanol, opióides e anestésicos gerais. Flumazenil também é utilizado como

droga para o diagnóstico de intoxicação pelos BDZs. Flumazenil liga-se

especificamente aos receptores BDZs no cérebro, bloqueando os efeitos

comportamentais, neurológicos e eletrofisiólogicos de vários benzodiazepínicos, mas

desprovido de efeitos farmacológicos (KLEINGEIST et al., 1998).

Outro teste utilizado para avaliar ação da molécula no SNC é o teste de

Rota Rod, entretanto é amplamente usado para medir o desempenho da

coordenação motora em animais (SEDELIS et al., 2001). Desta forma, pode-se dizer

que é um modelo simples que serve para detectar déficits neurológicos em ratos e

camundongos (DUNHAM; MIYA, 1957).

Segundo Carlini e Burgos (1979), esse teste mede o efeito de

relaxamento muscular ou incoordenação motora. Nesse caso, quanto mais intenso

94

for o efeito, menor será o tempo em que o animal consegue se equilibrar sobre a

barra (ALMEIDA, 2006). No entanto, trata-se de um método não específico, uma vez

que mede indistintamente, efeitos neurológicos, estimulantes e depressores sobre a

coordenação motora, aos quais também é atribuído o termo neurotoxicidade

(DALLMEIER; CARLINI, 1981).

No presente estudo, a STY não causou alteração na coordenação motora

no teste de Rota Rod nas doses administradas. Este resultado sugere que a

molécula de STY não apresenta atividade miorelaxante.

Outro teste realizado foi o do tempo de sono induzido por pentobarbital

sódico, com a finalidade de investigar possível atividade do tipo hipno-sedativa da

Aniba panurensis. Este teste permite identificar se determinada droga apresenta

efeito sedativo/hipnótico, considerando que duas drogas, quando apresentam o

mesmo efeito farmacológico, somam-se.

Os BDZ apresentam ação nos subtipos específicos de receptores GABA-

A, as ações dos barbitúricos, como o pentobarbital, são mais extensas e menos

específicas (JOHNSTON, 1996). O pentobarbital é uma droga capaz de induzir sono

em roedores e humanos por sua ação direta sobre o sítio de ligação de barbitúricos,

localizado especificamente entre as subunidades α1 e β1, que compõem o canal de

cloreto do complexo receptor GABA-A (GOTTESMANN, 2002;MUROI, Y.;

CZAJKOWSKI, JACKSON, 2006), aumentando a influência inibitória sobre o sistema

nervoso central.

Os barbitúricos, de maneira geral, induzem sono de ondas lentas e são

capazes de inibir o sono paradoxal. A estimulação dos sítios de ligação pelos

barbitúricos, particularmente na área pré-óptica ventrolateral, inibe o núcleo

tuberomamilar hipotalâmico, os núcleos da rafe e o locus coeruleus (na formação

reticular), estruturas que causam ativação cortical e excitação comportamental.

Assim, a inibição destas estruturas suprime o alerta e a ativação comportamental,

resultando no sono ou hipnose (CARLSON, 2002; GOTTESMANN, 2002; DUARTE,

2007).

Os resultados da STY mostram aumento na latência do sono na maior

dose (20 mg/kg) e na duração do tempo de sono nas doses administradas. Neste

experimento, o aumentona latência de sono está em consonância com o resultado

95

no teste do campo aberto, do qual os animais tratados STY tiveram aumento na

alteração da atividade locomotora espontânea.

Um resultado positivo neste teste não garante efeito hipno-sedativo puro,

uma vez que a interferência de fatores farmacocinéticos não pode ser descartada,

pois os barbitúricos são drogas metabolizadas hepaticamente, pelo complexo

citocromo P-450 NADPH e O2 (GOODMAN; GILMAN, 2012).

Os testes de comportamento em modelos animais realizados com STY

fornecem evidências da ação ansiolítica, sem interferência na coordenação motora.

Este estudo contribui consideravelmente para a pesquisa na área de plantas

medicinais, pois fornece informações relevantes sobre os efeitos biológicos molécula

dessas no SNC.

96

5.1.7 Conclusão

Os resultados com a STY nos modelos animais de ansiedade e tempo de

sono permitiu as seguintes conclusões.

No teste do campo aberto, a STY aumentou atividade locomotora

espontânea dos animais, efeito dose dependente da dose (doses altas), sugerindo

que a molécula apresenta efeito excitatório, desprovido de efeito sedativo.

No teste do Labirinto em Cruz Elevado e placa perfurada, a STY

comprovou seu efeito ansiolítico em todas as doses administradas.

O mecanismo de ação ansiolítico da STY pareceu estar relacionado

com o receptor GABA-A benzodiazepinico, pois o seu efeito ansiolítico foi revertido

pelo flumazenil, antagonista deste receptor.

No teste Rota Rod, a coordenação motora dos animais não foi alterada,

mostrando que os efeitos desta molécula não estavam relacionados com o bloqueio

neuromuscular periférico, mas com ação central.

No teste de indução do tempo de sono por pentobarbital, a STY

potencializou a latência de sono somente na maior dose. Por outro lado, em todas

as doses a STY aumentou o tempo de sono. Este efeito pode estar envolvido com

alterações farmacocinéticas do pentobarbital ou mecanismo de regulação do sono.

97

5.2 Capítulo II: Dosagem de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e

corpo estriado de camundongos tratados de forma aguda com STY após os

testes comportamentais

5.2.1 Resultados

5.2.1.1 Determinação das concentrações de aminoácidos no córtex pré-frontal,

hipocampo e corpo estriado de camundongos após tratamento com STY

Os resultados da Figura 14A mostram a concentração dos aminoácidos

excitatórios no CPF, após administrações de STY (1 ou 20 mg/kg, i.p.) ou veículo

sobre as concentrações de aminoácidos (μmol/g de tecido) em camundongos. Após

administração de STY, a concentração de ASP foi reduzida somente na dose de

1mg/kg (3596 ± 225,1), quando comparado ao controle (4427 ± 193) [F(3,22)=4,705;

p<0,0001]. STY elevou as concentrações de GLU nas doses de 10 ou 20 mg/kg em

210,8% e 253,5%, respectivamente (STY-1: 6822 ± 573,6; STY-20: 8203 ± 127,3

quando comparado ao controle (3235 ± 524) [F(3,23)=31,83; p<0,0001].

Quanto aos aminoácidos inibitórios no CPF, após administração da STY,

houve redução da GLI na dose de 20 mg/kg (3805 ± 395,8), quando comparado ao

controle (7463 ± 536,2) [F(3,23)=16,30; p<0,0001]. Houve aumento nas

concentrações de HIS (8309 ± 1288) e TAU (20,33 ± 1,78) somente na maior dose

(20 mg/kg), quando comparado ao grupo controle (HIS: 1819 ± 222,7; TAU: 3120 ±

294,7), [F(3,22)=20,97; p<0,0001]. Esse aumento de TAU equivale a 651,6%

[F(3,20)=74.12; p<0,0001]. Foi observado aumento do GABA 462,5% e 722,4%,

repectivamente, após STY (STY-1: 6915 ± 641,6; STY-20: 10801 ± 1,17), quando

comparada ao controle (1495 ± 194,3) [F(3,23)=35,91; p<0,0001].

98


inibitórios (B) em córtex pré-frontal de camundongos

Figura A

Figura B

Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 7-

8). Análise estatística foi realizada através de ANOVA e teste de Tukey como post

hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP),

glutamato (GLU), glicina (GLI), histidina (HIS), taurina (TAU) e ácido γ-aminobutírico

(GABA).

Córtex pré-frontal

Contr

ole

STY-1

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-20

0

2000

4000

6000

8000

10000

ASPGLU

a

aa

µm

ol/

g d

e t

ecid

o


Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

0

5000

10000

15000

20000

25000

GLI HIS TAU GABA

a,b

a,b

a,b

a

a,b

µm

ol/

g d

e te

cid

o

99


animais pré-tratados com STY

Foi observado aumento na concentração de ASP, Figura 15 A, após o

tratamento agudo com STY em ambas as doses (STY-1: 5304 ± 499,8; STY-20:

7271 ± 348,7) quando comparado com o controle (3143 ± 535,5) [F(3,23)=19,43;

p<0,0001]. Efeito semelhante foi encontrado nas concentrações de GLU, porém

somente com tratamento na maior dose (STY-20: 9214 ± 558,8), quando comparado

ao controle (4053 ± 683,3) [F(3,23)=24,70; p<0,0001].

Em relação aos aminoácidos inibitórios, Figura 15 B, após a

administração da STY, a concentração de GLI aumentou 1.242%, na dose STY-20

(85,73 ± 1,80), comparado ao controle (6,09 ± 1,10) [F(3,23)=776,6; p<0,0001].

Aumento semelhante foi observado nas concentrações de HIS, TAU e GABA, com

maior dose de STY (HIS:10,38 ± 431,3; TAU:18,34±570.7; GABA: 23758 ± 1,33),

quando comparado ao controle (HIS:1919 ± 301,5; TAU: 4555 ± 642,9; GABA: 3843

± 569,6). Na maior dose de STY, o percentual de aumento foi TAU 541% e GABA

617%. HIS, TAU, GABA [F(3,23)=138,7; p<0,0001], [F(3,23)=170,2; p<0,0001],

[F(3,23)=115,1; p<0,0001], respectivamente.

100


inibitórios (B) em hipocampo de camundongos.

Figura A

Figura B



hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP),


(GABA).

Hipocampo

Contr

ole

STY-1

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-20

0

5000

10000

15000

ASP GLU

a

a,b

a,b

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

Hipocampo

Contr

ole

STY

-1

STY

-20

Contr

ole

STY

-1

STY

-20

Contr

ole

STY

-1

STY

-20

Contr

ole

STY

-1

STY

-20

0

20000

40000

60000

80000

100000

GLI HIS TAU GABA

a

a,b

a,ba,b

a,b

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

101

5.2.1.3 Determinação das concentrações de aminoácidos no corpo estriado de

animais pré-tratados com STY

Após administração de STY, as concentrações de ASP aumentaram na

menor dose administrada (STY-1: 36415 ± 735,6), quando comparado com o

controle (11036 ± 1085) [F(3,23)= 251,2; p<0,0001]. Efeitos opostos foram

observados nas concentrações de GLU. A menor dose reduziu (STY-1: 5399 ±

655,8), enquanto a maior dose aumentou a concentração (18195 ± 845,2),

comparado ao controle (12370 ± 1,371 (8) [F(3,23)=40,70; p<0,0001] (Figura 16A).

A Figura16 B aduz os resultados dos aminoácidos inibitórios após a

administração da STY. A concentração de GLI, TAU e GABA aumentou na maior

dose (GLI: 14639 ± 749,8; TAU: 84325 ± 1884; GABA: 23838 ± 803,6), comparado

ao controle (GLI: 5281 ± 881,4; TAU: 24954 ± 3327; GABA: 19094 ± 1160). GLI

[F(3,23)=40,35; p<0,0001]; TAU: [F(3,24)=53,26; p<0,0001] GABA: [F(3,23)=102,9;

p<0,0001] e HIS [F(3,23)=40,35; p<0,0001]. Contudo, administração de STY em

baixa dose reduziu a concentração de HIS e GABA (HIS: 19554 ± 1734; GABA:

16906 ± 1160), comparado ao controle (HIS: 5179 ± 588.6; GABA: 19094 ± 1160).

102


inibitórios (B) em corpo estriado de camundongos.

Figura A

Figura B



hoc, p< 0,05: a e b quando comparado ao controle e STY-1. Asparaginina (ASP);


(GABA).

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

0

10000

20000

30000

40000

ASP GLU

Corpo estriado

a

a,b

a

µmol

/g d

e te

cido

Corpo estriado

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

Controle

STY-1

STY-20

0

20000

40000

60000

80000

100000

GLI HIS TAU GABA

a,b

a

a,b

a,ba

aµmol

/g d

e te

cido

103

5.2.2 Discussão

Os aminoácidos, como neurotransmissores e suas funções no sistema

nervoso central, tem despertado o interesse de pesquisadores nos últimos anos.

Desta forma, procurou-se determinar a influência da STY administrada de forma

aguda nas concentrações dos aminoácidos mais estudados no SNC, sendo o

glutamato (GLU) e aspartato (ASP) excitatórios, seguidos da glicina (GLI), histidina

(HIS), taurina (TAU) e o ácido γ-aminobutírico (GABA) inibitórios (DANBOLT, 2001;

HAN et al., 2011).

Neste estudo, as concentrações de GLU, ASP, GLI, HIS, TAU e GABA

foram determinados no córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado de

camundongos, após administração de STY (1 ou 20 mg/kg, i.p.).

No córtex pré-frontal, após administração aguda de STY, as

concentrações dos dois principais aminoácidos GLU e GABA aumentaram em

ambas as doses, mostrando alteração destes aminoácidos. De acordo com Del Arco

e Mora (1999), o glutamato tem efeito modulatório sobre o sistema gabaérgico em

que um aumento de glutamato endógeno no córtex pré-frontal está relacionado com

concentrações aumentadas de GABA extracelular. O córtex pré-frontal

funcionalmente regula a liberação de dopamina no estriado dorso lateral, que é

mediado por receptores do ácido γ-aminobutírico tipo GABA-A, alterando as funções

de locomoção e rearing (DEL ARCO; MORA, 1999).

O córtex pré-frontal é uma das estruturas que compõem o sistema

límbico, juntamente com hipocampo, hipotálamo, amígdala, tálamo e giro cingulado

(LENT, 2004). O córtex pré-frontal medial (CPFM) tem sido alvo de interesse dos

pesquisadores, por possuir conexões proeminentes com amígdala e outras

estruturas límbicas. O sistema límbico é considerado o centro emocional do cérebro.

Nesta área, encontram-se os mecanismos que regulam o medo e a ansiedade

(PRICE; DREVETS, 2010). O CPFM participa de funções importantes, como

memória, aprendizado e tomada de decisões, planejamento e execução de tarefas

complexas, além de participar da modulação autonômica e endócrina em resposta

ao estresse (CZEH et al., 2008). Anormalidades nessa área cortical parecem

104

favorecer o desenvolvimento de ansiedade, depressão (MUSAZZI et al. 2010, 2011)

e toxicodependência (GOLDSTEIN; VOLKOW, 2011).

O glutamato é o neurotransmissor mais predominante no SNC de

mamíferos, medeia à transmissão química na maioria das sinapses do sistema

nervoso central, em aproximadamente 50%, e está envolvido em muitos processos

fisiológicos, desde o desenvolvimento da formação de sinapses à aprendizagem e

memória. O glutamato está envolvido na síntese de ácidos graxos, e incorporado em

proteínas, contribui com a regulação dos níveis de amônia e o controle do balanço

osmótico e aniônico, serve como precursor para o GABA e vários intermediários do

Ciclo de Krebs (ALMEIDA, 2006).

O glutamato é convertido a GABA pela ação da enzima mitocondrial

glutamato descarboxilase (GAD), que é encontrada quase que exclusivamente em

neurônios gabaérgicos. O GABA pode ser inativado através da receptação por

transportadores de alta afinidade que se encontram localizados nos neurônios e nas

células gliais através da reação de transaminação catalisada pela enzima GABA

transferase (PURVES et al., 2005; GOLAN, 2010).

O aspartato atua como agonista relativamente seletivo de receptores

glutamatérgicos NMDA extrassinápticos, que estão relacionados com a

excitotoxidade (BRADFORD; NALDER, 2004). O entendimento do mecanismo da

modulação mútua entre os aminoácidos é complexo, pois envolve muitas vezes mais

de um sistema. Os dados obtidos no presente estudo, no teste de comportamento

(EPM e PF), sugerem que a STY é uma molécula que produz efeitos ansiolíticos.

Esse efeito excitatório do glutamato pode estar sendomodulado pela atividade

serotonérgica. Torna-se difícil o estudo dos aminoácidosem virtude da interligação

entre os excitátórios e inibitórios.

O GABA é encontrado em abundância no tecido cerebral (cerca de 10

µmol/g tecido), no sistema nigroestriado, e em concentração menor em toda a

substância cinzenta (2-5µmol/g tecido) (RANG et al., 2007). Este aminoácido atua

como neurotransmissor em muitas vias diferentes do SNC e também na medula

espinhal. É liberado principalmente por interneurônios curtos, sendo que os únicos

tratos gabaérgicos longos são projetados do cerebelo para o estriado (RANG et al.,

2007). As alterações ocorridas nesse aminoácido são descritas na fisiopatologia de

105

doenças como ansiedade, epilepsia e, possivelmente, esquizofrenia (SHAH et al.,

2002).

Além disso, administração de STY, nas maiores doses, aumentou a

concentração dos aminoácidos inibitórios HIS e TAU no CPF. Segundo L’Amoreaux

(2010), a TAU interage com os receptores GABA-A, no entanto a identidade

molecular do receptor de TAU não está totalmente elucidada. Nos resultados deste

estudo, observou-se aumento de TAU e GABA no CPF com percentual de 651,6% e

722,4%, respectivamente. Para L’Amoreaux (2010), a relação entre o aumento das

concentrações de GABA sugere que os efeitos da STY relacionados a este

aminoácido são similares aos encontrados em drogas benzodiazepínicas. Sabe-se

que os BZDs aumentam as concentrações de GABA (PEREIRA, 2009).

Estudos dos aminoácidos na neurotransmissão têm sido realizados em no

laboratório pesquisado. Várias substâncias estão sendo estudadas e os aminoácidos

determinados em diferentes concentrações. Dentre estas substâncias, a cumarina,

de origem vegetal que em testes comportamentais, mostra a diminuição da

atividade locomotora, no teste do campo aberto, confirmando o efeito inibitório e

sugerindo que este efeito comportamental está relacionado com elevação nas

concentrações de GABA no córtex pré-frontal (PEREIRA, 2009).

Outra área estudada foi o hipocampo, região do lobo temporal, envolvida

nos processosde consolidação da memória, como a espacial e contextual

(FERBINTEANU; SHIRVALKAR; SHAPIRO, 2011), além de possuir também função

mais geral no processamento das informações e subsequente regulação no

comportamento.

A STY, na maior dose, após os teste de comportamento na maior dose

(20 mg/kg), aumentou a concentração dos aminoácidos no hipocampo: GLU

(excitatório), GLI, GABA e TAU (inibitórios). Neurônios glutamatérgicos no

hipocampo podem liberar GABA, por mecanismo de compensação, que atuaria de

forma a minimizar a excitação produzida pela atividade excessiva do glutamato

(HIBBERT et al., 2005). A função inibitória do GABA no hipocampo tem sido bem

relatada na literatura (CASTRO-SIERRA et al., 2007; RANG et al.,2007 ). O aumento

de GABA nesta estrutura faz com se pense em uma correlação da STY com

ansiedade nessa região.

106

Outro aminoácido estudado foi a taurina, encontrado em grande

quantidade no hipocampo, nos interneurônios, nos neurônios piramidais e nas

células granulares denteadas (MAGNUSSON et al., 1989). Estudos têm

demonstrado que os receptores do glutamato ionotrópicos NMDA, agonistas do

cainato e AMPA evocam a liberação de taurina no cérebro em desenvolvimento e

em adultos (MAGNUSSON et al., 1991; SARANSAARI; OJA 1991). A taurina inibe o

dano nos neurônios piramidais do hipocampo, por meio do aumento da condutância

do íon clotero que leva a hiperpolarização. Para Frosini et al. (2003), a taurina é um

agonista dos receptor GABA-A, uma vez que o influxo de cloro ativa os neurônios

pós-sinápticos deste receptor. No entanto, para Smith et al. (2006), a TAU é

considerada agonista fraco dos receptores GABA-A.

Como demonstrado nos experimentos, ocorreu aumento de TAU, nas

áreas estudadas: córtex pré-frontal (651,6%) hipocampo (541%) e corpo estriado

(541%) após administração da STY (20 mg/kg). Esses resultados mostram que a

STY altera as concentrações de TAU somente na maior dose. O aminoácido

inibitório taurina tem apresentado importante papel na manutenção da homeostase

cerebral, além de ter uma ação protetora sobre os neurônios diante dos efeitos

excitotóxicos evocados pelos aminoácidos excitatórios, atenuando o influxo de cálcio

durante a isquemia (WANG et al., 2005, 2007). Em estudo prévio, TAU elevou a

condutância da membrana íon cloreto, ao abrir os canais de cloreto, então,

induzindo a hiperpolarização dos neurônios no hipocampo, e reduzindo a

excitabilidade celular (DEL OLMO et al., 2000).

A histidina precursora do neurotransmissor histamina está envolvida com

várias funções no SNC. Dentre estas, citam-se o ritmo circadiano e o sono (DERE et

al., 2003), a motivação, as alterações comportamentais (IMAIZUMI et al., 1994), a

ansiedade (FAGNELLO; MATTIOLLI, 2007), o medo, a percepção da dor, a

aprendizagem e memória (GIANLORENÇO; CANTO-DE-SOUZA, MATTIOLI, 2010,

2011).

Os receptores de histamina H3 encontram-se localizados nos neurônios

pré-sinápticos, podendo atuar como autorreceptores, além de estarem envolvidos

com a síntese e regulação da liberação de histamina. Os corpos celulares

histaminérgicos são encontrados no núcleo tuberomamilar do hipotálamo posterior e

107

inervam praticamente todas as regiões do SNC (HASS; SERGEEVA; SELBACH,

2008).

O estudo de Zarrindast et al. (2006) mostra que após microinjeção de

histamina no hipocampo dorsal de ratos expostos ao LCE, ocorreu aumento do

percentual de entradas nos braços abertos, caracterizando, assim, efeito ansiolítico

da histamina. Os autores sugerem que o efeito ansiolítico da histamina é mediado

por receptores H1, pois ao administrar microinjeções de pirilamina (antagonista H1)

e histamina, os animais diminuíram o tempo percentual e a entrada nos braços

abertos. No estudo de Gianlorenço, Canto-De-Souza e Mattioli (2011), após

administração de L-histidina no hipocampo dorsal de camundongos, os resultados

mostraram efeito ansiolíticos no teste do LCE.

No presente trabalho, o tratamento com STY 20 mg/kg promoveu o

aumento da histidina no córtex pré-frontal e hipocampo. Este resultado confirma os

achados no LCE, em que os animais aumentaram o TEBA e TPBA. Resultado

similar confirmando ação ansiolítica foi encontrado no teste da placa perfurada com

o aumento dos mergulhos no equipamento utilizado para o teste. No corpo estriado,

ocorreu o aumento da histidina na menor dose, com ação ansiolítica no LCE e placa

perfurada. Os resultados obtidos apontam para efeito ansiolítico da STY, mediado

pelos receptores H1, que se encontram localizados principalmente no hipocampo

dorsal de camundongos.

Outro aspecto importante do sistema histaminérgico é a participação na

regulação, síntese e liberação de histamina neural e de outras aminas biogênicas

tais como acetilcolina, glutamato e GABA (HASS; SERGEEVA; SELBACH, 2008).

A dosagem da concentração de aminoácidos no SNC pode fornecer

informações novas, no sentido de facilitar a compreensão das alterações ocorridas.

No estudo de Chan et al. (2010), foi determinada a concentração de aminoácidos

no sistema nervoso central em camundongos alimentados e em jejum no córtex

pré-frontal, hipotálamo, hipocampo, amígdala e medula. Os resultados encontrados

mostram que o glutamato foi encontrado em todas as áreas estudadas. As

concentrações de GLU, GABA e ASP não sofreram alterações, enquanto que a

glutamina e leucina foram aumentadas no hipocampo. Neurônios de fibras

excitatórias do hipocampo (glutamatérgicas) podem liberar GABA, principalmente

108

quando atividade excitatória estiver aumentada (CHAN et al., 2010). A STY no

hipocampo aumentou as concentrações de ASP, GLU, GLI, HIS, TAU e GABA,

demonstrando a complexidade em relação à modulação destes aminoácidos.

O corpo estriado foi outra área utilizada nos experimentos para

identificação da concentração dos aminoácidos. Em relação aos aminoácidos

excitatórios, na menor dose, ocorreu o aumento do ASP, enquanto GLU aumentou

na maior dose. Os aminoácidos inibitórios aumentaram na maior dose GLI (27,7%),

TAU (337%) e GABA (12,4%).

O estriado é constituído por aproximadamente 95% de neurônios

GABAérgicos do tipo espinhososmédios. Estes neurônios dão origem a quase todos

os impulsos de saída estriatais, projetam-se para o globo pálido e a substância

negra, e são alvo de impulsos de entradas excitatórias proveniente do córtex e

tálamo de fibras dopaminérgicas originárias da substância negra e área tegmentar

ventral, de axônios locais colaterais, de outros neurônios espinhais e de

interneurônios estriatais (GERFEN, 1992). Os interneurônios estriatais, que são do

tipo não espinhosos e fazem conexão com os espinhosos médios (MINK, 1999).

Esses interneurônios diferem em seus tamanhos e em neurotransmissores. Os

neurônios piramidais corticoestriatais são, em sua maioria, glutamatérgicos

(GERFEN, 2003).

Os neurônios que chegam ao estriado, vindos do córtex cerebral, têm

seus corpos nas seguintes áreas: sensoriais; pré-frontal; motoras; pré-motoras; e

límbicas (GERFEN, 2003). Dourmap et al. (1997) demonstraram que o corpo

estriado possui uma importante inervação dos sistemas opioide e glutamatérgico.

A STY aumenta as concentrações de aminoácidos excitatórios ASP e

GLU nos neurônios estriatais, podendo ser relacionado com aumento da

neurotransmissão glutamatérgica, possivelmente por interagir com receptores

ionotrópicos do tipo NMDA (RANGE et al., 2007). A STY aumenta a concentração de

aminoácidos inibitórios, em particular de GABA, produzindo efeito similar aos

benzodiazepínicos. Possivelmente, esta molécula tem afinidade pelos subtipos de

receptores GABA-A.

109

A quantificação da concentração dos aminoácidos neurotransmissores em

modelos animais é importante ferramenta para identificação de novas moléculas

com potencial terapêutico.

110

5.2.3 Conclusões

Os resultados da concentração dos aminoácidos após a STY, nas áreas

cerebrais do córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado, permitiu as seguintes

conclusões:

No córtex pré-frontal, o aumento do GLU pode explicar o

aumento nos parâmetros comportamentais, enquanto os inibitórios, parecem

modular este comportamento, sem causar sedação, o que pode explicar ação

ansiolítica da STY nos modelos de LCE e placa perfurada.

No hipocampo, em camundongos tratados com STY, mostraram

que esta molécula aumentouas concentrações de GLU e ASP e aumento d as

concentrações de GLI, HIS, TAU e GABA. Esses resultados sugerem que a

STY tem ação não seletiva nesses aminoácidos, podendo interferir nos

aminoácidos excitatórios e inibitórios ao mesmo tempo.

No corpo estriado, o principal efeito observado foi aumento dos

aminoácidos inibitórios, porém esse efeito somente foi observado, após o uso

da STY na maior dose.

111

5.3 Capítulo III: Efeitos da molécula de STY nos modelos de convulsão

induzidos por pentilenotetrazol, estricnina, bicuculina e pilocarpina

5.3.1 Resultados

5.3.1.1 Teste de Convulsão Induzida por Pentilenoterazol

No modelo de convulsão induzido por PTZ, os parâmetros de latência de

convulsão e latência de morte encontram-se na Tabela 1. Nenhuma alteração foi

observada na latência de convulsão nos grupos pré-tratados com STY (em todas as

doses estudadas), quando comparadas ao controle (61,60 ± 4,78). Como esperado,

o grupo pré-tratado com DZP (1 mg/kg) intensificou esse parâmetro. Neste teste, os

animais exibiram convulsão [F(4,50)=24,63; p<0,0001].

Por outro lado, a STY aumentou a latência de morte nas doses de 10

mg/kg (343,7 ± 30,03) e 20 mg/kg (3,44 ± 69,68) comparado com o grupo controle

(154±17,27). Apenas os animais do grupo STY-20 e DZP apresentaram percentual

de sobrevivência de 10 e 70%, respectivamente [F(4,49)=36,25; p<0,0001].

Tabela 3 – Efeito da administração da STY obtida da Aniba panurensis, no modelo

convulsão induzido por PTZ em camundongos.

Grupo

(mg/kg)

Latência de

Convulsão (s)

% Animais

exibidindo

convulsão

Latência de

Morte (s)

Animais

sobreviventes(%)

Controle 61,60 ±4,78 (10) 100 154,0 ±17,27 (10) 0

STY-1 60,70 ±2,48(10) 100 215,8 ±16,60(10) 0

STY-10 67,27 ±3,0 9 (10) 100 343,7 ±30,03(10)a 0

STY-20 68,90 ±3,49 (10) 100 344 ±69,68 (10)a 10

DZP-1 122,5 ±9,44 (10)a 100 1007 ±98,98(10)a 70

112

Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da

latência de convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido

por Tukey no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em

relação ao grupo controle.

5.3.1.2 Teste de Convulsão Induzida por Estricnina

Outro modelo utilizado foi a convulsão induzida por estricnina (Tabela 2).

Neste modelo, os animais pré-tratados com STY nas doses 10 ou 20 mg/kg

aumentaram a latência de convulsão (STY-10: 50,42 ± 7,20; STY-20: 65,99 ± 3,22),

quando comparado ao grupo controle (26,73 ± 2,73). Efeito semelhante, também, foi

observado com o grupo pré-tratado com diazepam, (DZP-1: 30,90 ± 1,12)

[F(4,53)=9,318 ; p<0,0001].

Nos grupos pré-tratados com STY, houve aumento na latência de morte

dos animais (STY-1: 20 ± 1,72; STY-10: 19,17 ± 1,87; STY-20: 23,83 ± 1,55)

comparado ao controle (12,18 ± 0,93). Diazepam (1 mg/kg) também aumentou a

latência de morte (DZP-1: 71 ± 6,89), quando comparado ao grupo controle

[F(4,54)=53,59; p<0,0001]. Os animais convulsionaram e, posteriormente, morreram.


convulsão induzido por estricnina em camundongos.

Grupo

(mg/kg)

Latência de

Convulsão (s)

% Animais

exibidindo

convulsão

Latência de

Morte (s)

Animais

sobreviventes

(%)

Controle 26,73 ± 2,73(11) 100 12,18 ± 0,93 (11) 0

STY-1 38,90 ± 6,93(10) 100 20,0 ± 1,72 (12)a 0

STY-10 50,42 ± 7,20 (12)a 100 21,30 ± 1,45(10)a 0

STY-20 65,99 ± 3,32 (11)a 100 23,83 ± 1,55(12)a 0

DZP-1 30,90 ± 1,12 (10) 100 71,0 ±6 ,89 (10)a 0

113

Nota: Os valores numéricos da Tabela representam a média ± EPM da latência de

convulsão e morte. Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido por Tukey

no test post hoc. Valores significativos: p<0,05: representa a diferença em relação ao

grupo controle.

5.3.1.3 Teste de Convulsão Induzida por Bicuculina

No modelo de convulsão induzido por bicuculina (Tabela 5), os animais

pré-tratados com STY aumentaram a latência de covulsão somente quando

administradas em doses altas (10 ou 20 mg/kg) (STY-10: 125,9 ± 7,97; STY-20:

160,3 ± 6,49), quando comparado ao controle (75,00 ± 6,02). De maneira

semelhante, o diazepam aumentou a latência de convulsão quando comparada ao

grupo controle [F(4,50)=152,1; p<0,0001]. Os animais exibiram convulsão.

No entanto, em relação à latência de morte ocorreu aumento nesse

parâmetro somente com dose mais alta de STY (361,2 ± 108,1), comparado ao

grupo controle (156,9 ± 22,77). Apenas os animais do grupo STY-20 e DZP

apresentaram percentual de sobrevivência de 10 e 100%, respectivamente

[F(4,47)=82,02; p<0,0001].


convulsão induzido por bicuculina em camundongos.

Grupo

(mg/kg)

Latência de

Convulsão (s)

% Animais

exibidindo

convulsão

Latência de

Morte (s)

Animais

sobreviventes

(%)

Controle 75,0 ± 6,0 (10) 100 156,9 ± 22,7 (10) 0

STY-1 81,4 ± 9,1(10) 100 159,8±17,3 (10) 0

STY-10 125,9 ± 7,9 (10)a 100 237,7±18,0 (10) 0

STY-20 160,3 ± 11,5(10)a 100 361,2±108,1(9)a 10

DZP-1 596,2 ± 35,6 (10)a 100 1.200±0,0(10)a 100

114




grupo controle.

5.3.1.4 Teste de Convulsão Induzida por Pilocarpina

No modelo de convulsão induzida por pilocarpina, não houve alteração

na latência de convulsão nos grupos pré-tratados com STY, quando comparado ao

controle (476,4 ± 27,29) [F(4,37)=0,8816; p>0,4603].

Nas doses administradas de STY, houve aumento na latência de morte

dos animais que utilizaram STY-1 (STY-1: 294,4 ± 41,09), quando comparado ao

controle (160,9 ± 20,43). O diazepam 1 mg/kg aumentou a latência de morte (DZP-

1: 771 ± 6,89 (10) [F(4,38)=13,02; p<0,0001]. Os animais morreram.


convulsão induzido por pilocarpina em camundongos.

Grupo

(mg/kg)

Latência de

Convulsão (s)

%

Animais

exibidindo

convulsão

Latência de

Morte (s)

Animais

sobreviventes

(%)

Controle 476,4 ± 27,29(9) 100 160,9 ± 20,43 (9) 0

STY-1 464,2 ± 38,5 (10) 100 294,4± 41,09(10)a 0

STY-10 437,4 ± 20,64(10) 100 103,1±12,46 (10)b 0

STY-20 497,9 ±10,85(9) 100 95,60±18,37 (10)b 0

DZP-1 431,2 ± 56,84(8) 100 771,636,84(8)a 0




grupo controle.

115

5.3.2 Discussão

A epilepsia é um dos principais transtornos neurológicos. É uma

desordem neurológica crônica comum, caracterizada por crises convulsivas

recorrentes não provocadas, que afeta cerca de 0,5-1% da população mundial, tem

incidência cumulativa para toda a vida em cerca de 3-4% dos pacientes, em que

estima-se que mais de 50 milhões de pessoas no mundo apresentem algum tipo

desse transtorno (ROPPER; BROWN, 2005). A prevalência da epilepsia nos países

desenvolvidos variou entre 4 e 10 casos por 1.000, enquanto que nos países em

desenvolvimento variou de 14 a 57 por 1.000 (CARPIO; HAUSER, 2008; TÉLLEZ-

ZENTENO; HERNÁNDEZ-RONQUILLO, 2012). O impacto psicossocial e

socioeconômico, além de problemas relacionados à independência, mobilidade,

educação, ao emprego e a relacionamentos pessoais, gera sofrimento ao indivíduo

(FISHER et al., 2005).

As crises convulsivas podem ser não epilépticas, quando provocadas em

cérebro normal por tratamentos, como eletrochoque ou administração de

convulsivantes químicos, ou podem ser epilépticas quando ocorrem sem estímulo

provocativo (GERGEL et al., 1994). Em indivíduo normal, episódios únicos de

crisesconvulsivas generalizadas podem ocorrer e não caracterizam a epilepsia, uma

vez que reações como estresse fisiológico, privação do sono, efeito de drogas de

abuso ou, ainda, traumatismo cranioencefálico podem ser responsáveis por esses

eventos (RAMOS, 2008). Além disso, outras condições clínicas, podem desencadear

as crises epilépticascomo, os processos infecciosos, tóxicos ou metabólicos,

hereditário, sem síndrome epiléptica manifestada (LÖSCHER; SCHMIDT, 2002).

Elucidação para o estabelecimento da epilepsia é a inibição da síntese do

GABA, expressão alterada dos receptores GABA, bloqueio de neurotransmissores

inibitórios no SNC, perda de interneurônios GABAérgicos (KANG;KLESSIG, 2008).

Isso poderia resultar em estimulação intensa e, consequentemente, manifestada

através de convulsões generalizadas.

Nos mecanismos pré-sinápticos, dois acontecimentos permitem o

aumento nos níveis da concentração de glutamato na fenda sináptica: a diminuição

da autorregulação da liberação do glutamato, regulação mediada pelos receptores

http://www.hindawi.com/78162989/

116

pré-sinápticos, e a diminuição da capacidade dos transportadores de glutamato, o

retirarem da fenda sináptica. Entre os mecanismos pós-sinápticos podem ocorrer

alterações da função e do número dos receptores pós-sinápticos (MORIMOTO et al.,

2004).

A atividade convulsiva pode está associada a mudanças bioquímicas em

algumas áreas cerebrais e afeta diversos neurotransmissores, como dopamina,

glutamato, serotonina e ácido γ-aminobutírico (GABA) (CAVALHEIRO et al., 1994).

O metabolismo dos carboidratos, os sistemas de segundos mensageiros e a

expressão gênica, são também processos envolvidos na fisiopatologia das

alterações neuronais (SIMONIC et al., 2000).

As drogas que tem ação depressora do SNC, como os BZD e

barbitúricos, ligam-se especificamente a um sítio de ligação do GABA, e atuam de

modo alostérico, aumentando a afinidade do GABA pelo receptor. Outros

mecanismos de ação dos antiepilépticos são a inibição da função dos canais de

sódio e a inibição dos canais de cálcio (RANG et al., 2007).

Neste estudo, para mimetizar características específicas relacionadas às

convulsões, a fim de identificar o envolvimento dos possíveis Sistema GABAérgico,

Glutamatérgico, Colinérgico e as vias da Glicina envolvidos na ocorrência de

convulsões, foram utilizados modelos de indução de convulsão química.

Os modelos de convulsão são usados para estudar o envolvimento dos

aminoácidos neurotransmissores, na epileptogênese, além de permitir observar as

alterações comportamentais, histológicas relacionadas com o processo convulsivo

(MARINHO et al., 1997, 1998). Os modelos de convulsão químicos utilizados no

presente estudo foram PTZ (VELISEK et al., 1992), estricnina (ALMEIDA, 2006),

bicuculina (FUKUDA et al., 1997) e pilocarpina (TURSKI et al., 1987). Sabe-se que

os modelos de indução de convulsão química ou elétrica são utilizados na

identificação de possíveis moléculas que possam originar novos prótotipos de

drogas. Os produtos naturais obtidos a partir de metabólitos de plantas podem

contribuir significativamente para descoberta de novas drogas antiepilépticas com

melhor perfil de segurança e eficácia.

No modelo de convulsão induzido por PTZ, os animais que recebram

previamente STY não apresentaram alterações em relação à latência de convulsão.

117

No entanto, em doses altas, os animais apresentaram um aumento na latência de

morte, mostrando um efeito parcialmente protetor. O PTZ (85 mg/kg) na dose

utilizada é considerada convulsivante, capaz de suprimir os efeitos inibitórios da

transmissão GABAérgica e desencadear crises convulsivas (FRADLEY et al.,

2007). Esse modelo é utilizado para detectar compostos com atividade

anticonvulsivante das crises tônico-clônica (grande mal). Assim, a STY no presente

estudo apresentou efeito protetor, pois aumentou a latência de morte através do

modelo estudado. Este efeito pode estar relacionado ao sistema GABAérgico, por

possível interação do receptor GABA-A/Benzodiazepínico com a STY. Como

esperado, o diazepam, utilizado como padrão positivo, aumentou a latência de

convulsão e ocorreu 70% de sobrevivência dos animais.

Os benzodiazepínicos exercem atividade anticonvulsivante verificada em

testes realizados em modelos animais. Estudos mostram que BDZ são altamente

eficazes contra convulsões quimicamente induzidas, causadas pelo leptazol,

bicuculina e por drogas semelhantes, mas sua eficácia é reduzida em relação a

convulsões eletricamente induzidas (WANG, 2005; UENO, 1997).

Outras classes de fármacos anticonvulsivantes tendem a refrear a

excitabilidade neuronal ao prolongar as ações inibitórias do GABA, como os

barbitúricos e benzodiazepinas, outras diminuem a tendência de certos neurônios

dispararem potenciais de ação de alta frequência, como a fenitoína e carbamazepina

(FRADLEY et al., 2007).

Estados epilépticos podem ser induzidos experimentalmente por bloqueio

dos receptores de GABA. A diminuição na inibição GABA permite o desequilíbrio

nos neurotransmissores, prevalecendo os excitatóriosque que levam aos estados

convulsivos. Drogas que antagonizam o receptor GABA-A, como a bicuculina e a

picrotoxina são utilizadas nos modelos animais de indução de convulsão

(GODMAN;GILMAN, 2012).

Muitos dos fármacos anticonvulsivantes apresentam vários mecanismos

de ação, como a estimulação de mecanismos inibitórios centrais (GABAérgicos) ou a

inibição dos mecanismos excitatórios centrais (glutamatérgicos). Além disso, tais

compostos podem agir inibindo a excessiva descarga da membrana via canais de

Ca+2, Na+1 ou K+1. Muitas dessas drogas antiepilépticas possuem múltiplas ações,

118

contribuindo para as suas eficácias. Todavia, nenhuma é ideal para os diversos tipos

de crises, sendo necessárias várias associações com uso crônico (COSSART;

BERNARD; BEN-ARI, 2005).

Entre as substâncias indutoras de convulsão utilizadas na triagem pré-

clínica de novos fármacos anticonvulsivantes, o PTZ tem sido o mais utilizado nos

modelos animais (LÖSCHER; SCHMIDT, 1998, 2002), podendo ser utilizado como

modelo de crise generalizada dos tipos ausência, mioclônicas e de crises tônico-

clônicas (OLIVEIRA et al., 2001).

O PTZ é um derivado tetrazólico, com atividade convulsivante em várias

espécies, como ratos, camundongos, gatos, cães e primatas, quando administrado

por via sistêmica (FISHER et al.,2005). O tipo e a gravidade da crise induzida pelo

PTZ estão relacionados à dose e via de administração utilizada (LÖSCHER;

FASSBENDER; NOLTING, 1991). No teste de PTZ subcutâneo (s.c.), doses entre

80 a 100 mg/kg em camundongos e 70 a90 mg/kg em ratos são capazes de induzir

crises clônicas generalizadas em todos os animais do grupo. Doses maiores são

necessárias para induzir crises tônicas (LÖSCHER; COLS, 1998).

A utilização do PTZ para indução química de convulsão é um dos

modelos mais usados em experimentos realizados com animais (ELISABETSKY,

BRUM, 1999). A capacidade do PTZ em suscitar convulsões e,

correspondentemente, induzir um estado convulsivo, começa com a sua influência

na liberação e ação pós-sinápticado receptor GABA. Uma consequência disso

parece ser a liberação de uma multiplicidade de mecanismos sinápticos mediados

pela ativação de três principais receptores ionotrópicos do glutamato (NMDA – N-

metil-D-aspartato, AMPA- (ácidoalfa-amino-3-hidróxido-5-metil-4 isoxazole

propionico e cainato) (DHIR et al., 2005).

Estudos têm demonstrado que os efeitos específicos do PTZ são

largamente mediados pelo receptor GABA-A, embora o mecanismo de bloqueio do

receptor pelo PTZ ainda não tenha sido esclarecido (JUNG et al., 1997; HANSEN et

al., 2004).

Apesar do mecanismo das convulsões por PTZ não ser compreendido, é

relatado que esta substância é capaz de inibir a condutância do canal de cloreto por

ligação dos sítios do complexo receptor GABA-A (JUNG et al., 1997; HANSEN et al.,

119

2004), aumentando a densidade dos receptores de glutamato ( SCHRODER;

BECKER; LOSSNER, 1993). No estudo de Cremer et al. (2007), foi demonstrado o

efeito de convulsões induzidas por PTZ sobre as densidades de cainato, o NMDA,

A1, e nos locais de ligação para BZD, no cérebro epiléptico, alterando o equilíbrio

entre a excitação de receptores (NMDA) e modulação destes (A1, BZ, locais de

binding, kainato).

Estudos têm demonstrado que o tratamento com o PTZ produz dano

neuronal em nível de DNA, proteínas e lipídios (ILHAN et al., 2004, 2005; AKBAS, et

al., 2005; GUZMAN et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008). Outros estudos, com

metabólitos de plantas, têm demonstrado o efeito potetor nos modelos de convulsão

estudados, como a lectina isolada a partir das sementes de A. Angustifólia

(VASCONCELOS et al., 2009), a rutina um flavonoide com ação anticonvulsivante

(NASSIRI-ASL; SHARIATI-RAD; ZAMANSOLTANI, 2008), a proteína do látex obtida

do Calatropis procera mostram este efeito neuroprotetor (LIMA et al., 2012),

Erythrina mulugu, com ação anticonvulsivante (VASCONCELOS et al., 2007).

Apesar do mecanismo do PTZ não ter suas ações bem compreendidas,

Ramanjaneyulu e Ticku (1984) sugerem que o PTZ atue como antagonista do sítio

sensível à picrotoxina (domínio transmembrânico TM2, que forma o canal de cloreto)

do complexo receptor GABA-A (deprimindo a corrente mediada pelo GABA). Em

relação à farmacodinâmica, o PTZ parece interagir com o complexo receptor GABA-

benzodiazepínico-ionóforo-cloreto (FISHER, 1989). A sua atividade convulsivante,

utilizando o mecanismo via íons cloreto foi descrita por Pellmar e Wilson (1977).

Estudos eletrofisiológicos confirmam essa hipótese, mostrando que o PTZ inibe a

corrente de íons cloreto ativado por GABA-A, de maneira concentração dependente

e voltagem-independente (HUANG et al., 2001). Estudos sugerem a contribuição de

aminoácidos excitatórios nos efeitos convulsivantes do PTZ, sendo que essa

atividade nos receptores N-metil-D- aspartato (NMDA) pode estar relacionada à

redução da neurotransmissão GABAérgica (LÖSCHER,POTSCHKA, 2002).

A estricinina foi outra droga utilizada nos experimentos em animais.

Sabe-se que esta provoca convulsões por inibição, bloqueando principalmente os

receptores de glicina na coluna vertebral, atuando através de receptor que se

120

assemelha ao receptor GABA-A um canal iônico de cloro multimérico (RANG et al.,

2007).

Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a STY, no modelo

de indução de convulsão por estricnina (20 mg/kg), aumentou a latência de

convulsão nas doses de 10 e 20 mg/kg e de morte em todas as doses

administradas quando comparada ao controle, demonstrando efeito de proteção da

STY, com a possível participação do sistema glicinérgico.

A estricnina é um antagonista competitivo dos receptores da glicina, que

atua bloqueando a resposta inibitória sináptica da glicina no SNC. Desta forma, a

estricnina é capaz de produzir forte crise convulsiva tônico-clônica de maneira

generalizada, pois atua especificamente na medula espinhal, bloqueando o

funcionamento dos neurônios inibitórios, as células Renshaw, inibindo o seu receptor

específico de glicina (SORACI et al., 2001; ANDRADE, 2003). A diminuição do efeito

inibitório pós-sináptico do arco reflexo causa excitação incontrolada do reflexo

espinhal (TILLEY et al., 2003). A morte do animal ocorre por parada respiratória, em

decorrência do comprometimento do músculo diafragmático (ANDRADE, 2003).

A morte por envenenamento pela estricnina resulta da paralisação do

centro respiratório do cérebro e não pelas convulsões. Pode ser facilmente

absorvida, inalada, feita por via parenteral, podendo causar intoxicação em poucos

minutos, pois sua formulação extremamente tóxica. Spinosa (2008) relata que se a

via for oral, há necessidade de 40 minutos de exposição para visualização de traços

no plasma. Os sinais incluem as câimbras, crises musculares, em especial na região

cervical e lombar, rigidez, contrações, sonolência, dores de cabeça e grande

deficiência do oxigênio em tecidos do corpo. O mau funcionamento renal pode

ocorrer como efeito secundário (SCHMITT, 2011).

Outro teste utilizado nos experimentos foi modelo de indução da

convulsão por bicuculina, considerado potente antagonista dos receptores GABA-A

em verterados. Atua competindo com o GABA, reconhecendo o mesmo sítio do

receptor (CZAJKOWSKI, 2006). É uma droga convulsivante, que reduz por

diminuição de frequência de abertura e tempo a entrada do canal para abertura do

cloro (Cl- ). Dependendo da concentração, a bicuculina pode causar convulsão em

modelo animal.

121

Neste estudo, a dose utilizada para induzir convulsão foi de 12 mg/kg de

bicuculina por via i.p. Na indução por bicuculina, ocorreu aumento na latência de

convulsão nas maiores doses (10 ou 20 mg/kg). Em relação à latência de morte, a

maior dose apresentou efeito protetor. Nesta dose, um animal sobreviveu. O DZP,

como esperado, apresentou efeito protetor, pois os animais sobreviveram.

Observa-se, portanto, que a STY apresenta ação anticonvulsivante parcial

na dose de 12 mg/kg de bicuculina, pois ocorreu aumento signitificativo na latência

de morte dos animais e de convulsão, demonstrando, assim, efeito protetor, durante

o desenvolvimento do processo convulsivo. Sugere-se que a STY possa atuar no

sistema de GABAérgico como agonista, com ação semelhante aos BZDs.

Sabe-se que mecanismo de ação dos benzodiazepínicos consiste em

potencializar a resposta ao GABA, facilitando a abertura dos canais de cloreto

ativados pelo receptor GABA-A (GODMAN; GILMAN, 2012).

A utilização de benzodiazepínicos no controle das convulsões, como o

diazepam, encontra-se amplamente discutido na literatura. Como esperado, os

resultados deste estudo expõem a diminuição da intensidade das crises convulsivas

e sobrevivência dos animais nos modelos de indução de convulsão por PTZ e

bicuculina. Os benzodiazepínicos no SNC apresentam propriedades depressoras,

ansiolíticas, sedativo-hipnóticas e/ou anticonvulsivantes (LÖSCHER, 2002).

A fim de investigar a participação da STY no sistema colinérgico, utilizou-

se o modelo de convulsão induzida por pilocarpina (400 mg/kg) em camundongos.

A convulsão pode ser caracterizada por episódios de alteração no comportamento

dos animais, como piloereção, acinesia inicial, ataxia tremores, automatismo

mastigatório como mioclonia dos músculos faciais e movimentos de cachorro

molhado, que persiste de 10 a 15 minutos, seguido de convulsões motoras límbicas,

incluindo movimentos clônicos das extremidades superiores que ocorrem em

aproximadamente 30 minutos após administração de pilocarpina (TURSKI, 1983a,

1989, 2008; FREITAS, 2004).

Na indução de convulsão por pilocarpina, os animais que receberam STY

não apresentaram alteração em relação à latência de convulsão. Enquanto na

latência de morte, a dose de 1 mg/kg apresentou efeito protetor, com as doses de 10

ou 20 mg/kg, os animais morreram em um tempo menor, mostrando que não há

122

proteção em doses maiores. Nas maiores doses, a STY parece está hiperexcitando

a síntese e/a liberação de acetilcolina e modificando a atividade do sistema

colinérgico.

Em condições fisiológicas, a estimulação colinérgica induzida por ACh é

importante para os processos cerebrais de memória e aprendizagem (BARTUS et

al., 1982). No entanto, altas concentrações de ACh estão associadas à

hiperexcitação elétrica dos neurônios que pode causar convulsão (TURSKI et al.,

1983a,b,c).

A pilocarpina na dose convulsivante (400 mg/kg) parece interargir com o

sistema GABAérgico, uma vez que ativação do receptor GABA-A pode estar

diminuída em decorrência do aumento da concentração do cálcio intracelular

induzida pelos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, que pode ser essencial

para instalação e propagação da atividade epiléptica (PISANI et al., 2004; FREITAS,

2011).

Para o estudo da Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), um dos modelos que

melhor mimetiza as alterações funcionais e morfológicas é o de indução sistêmica

por Pilocarpina (400 mg/kg) (TURSKI et al., 1989). É conhecido que em doses

elevadas, a pilocarpina, um agonista muscarínico,

induz alterações comportamentais, como convulsões e lesões cerebrais em

roedores através superestimulação cortical (LIMA, 2012).

A pilocarpina administrada em doses altas por via periférica é capaz de

produzir convulsão em roedores. O início dessas convulsões pode ser bloqueado

pela atropina, atenuando atividade colinérgica endógena (JOPE et al., 1986;

MARINHO et al., 1997). Assim, o processo convulsivo decorrente da utilização de

pilocarpina em doses convulsivas parece envolver ativação dos receptores

muscarínicos, podendo envolver o metabolismo de fosfoinositídios e sendo capaz

de produzir alterações comportamentais e lesões cerebrais (MARINHO et al., 1998).

Atividade epiléptica no hipocampo é responsável pela morte neuronal e

formação de fibras musgosas. Em animais em desenvovlvimento, interfere na

neurogênese e na atividade sináptica (ZHANG et al., 2004).

Os estudos mostram a interação da pilocarpina com alguns sistemas de

neurotransmissores cerebrais, como a inibição das convulsões por antagonista do

123

receptor 5HT2 (JOPE; WILLIANS, 1995), agonista do receptor GABA-A (GAISOR, et

al., 1999), antagonista do receptor NMDA (GRIFFITH et al., 2004), bloqueador dos

canais de sódio e cálcio (NASCIMENTO et al., 2006), participação dos receptores

dopaminérgicos (FREITAS et al., 2005a), receptores muscarínicos (MARINHO et al.,

1998).

Esse modelo envolve principalmente a participação do sistema

colinérgico, e drogas, como o DZP, não são eficazes de reverter a convulsão.

Embora vários sistemas de neurotransmissão estejam envolvidos nos modelos

experimentais de convulsão, a STY quanto aos efeitos observados no presente

estudo nos modelos de PTZ, estricnina e bicuculina, assemelha-se a drogas que

interagem com o receptor GABA/BZD.

124

5.3.3 Conclusão

De acordo com os experimentos utilizando-se os modelos de convulsão

induzido por PTZ(85 mg/kg), estricnina (20 mg/kg), bicuculina (12 mg/kg) e

pilocarpina (400 mg/kg) com STY, pôde-se concluir:

No modelo de PTZ, os animais exibiram convulsões com aumento na

latência de morte nas doses de 10 e 20 mg/kg. Na maior dose, obteve-se um

sobrevivente.

No modelo de estricnina, os animais convulsionaram e não houve

sobrevivente. No entanto, o tempo para latência de convulsão foi aumentado nas

doses de 10 e 20 mg/kg, enquanto que a latência de morte foi aumentada em todas

as doses administradas.

No modelo de bicuculina, os animais convulsionaram. Ocorrreu o

aumento para latência de convulsão nas doses de 10 e 20 mg/kg. Na latência de

morte, ocorreu o aumento na maior dose 20 mg/kg, sendo que nesta, teve-se um

sobrevivente.

No modelo de pilocarpina na latência de convulsão, não houve

alteração. No entanto, na latência de morte, na menor dose 1mg/kg, houve

diferença. No entanto, na dose de 10 e 20 mg/kg, os animais morreram em menor

tempo. Neste modelo não houve animais sobreviventes.

A STY, portanto, aumentou o tempo de latência de convulsão nos

modelos de estricinina e bicuculina, enquanto que a latência de

morte aumentou nos modelos PTZ, estricnina e bicuculina e morte através de

mecanismos GABAérgicos e glicinérgica. A via colinérgica parece estar envolvida

apenas na menor dose 1mg/kg, possivelmente interagindo com o sistema

GABAérgico.

125

5.4 Capítulo IV: Dosagem de aminoácidos no CPF e HC de camundongos pré-

tratados com STY nos modelos de convulsão induzido por PTZ, estricnina,

bicuculina, pilocarpina

5.4.1 Resultados


de animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ

Os resultados da Figura 17 apresentam a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de

STY(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por PTZ (85

mg/kg).

O pré-tratamento da STY não alterou as concentrações de ASP nos

animais submetidos ao modelo de convulsão induzido por PTZ. No entanto, a STY,

nas maiores, doses aumentou a concentração de GLU 314% e 363% (STY-10: 1,07

± 0,16; STY-20: 1,09 ± 0,15), comparado ao controle (0,34 ± 0,04) [F(3,23)=11,39;

p<0,0001].

Quanto à concentração dos aminoácidos inibitórios, Figura17 B, o pré-

tratamento com STY encontrou-se aumentado nas maiores doses e aumentou a

concentração em 288% GLI (STY-20: 1,87 ± 0,50), comparado ao controle (0,67 ±

0,07), no modelo de PTZ. [F(3,27)=8,768; p<0,0004]. Efeito semelhante foi

observado nas concentrações de TAU e GABA, somente no pré-tratamento da STY

nas de doses de STY-10 (TAU:1,49 ± 0,77; GABA: 1,39 ± 0,5) ou STY-20 (TAU: 2,58

± 0,37; GABA:1,43± 0,61), quando comparado ao grupo controle (TAU:0,77 ± 0,12;

GABA: 0,6 ± 0,1), TAU [F(3,26)=15,59 p<0,0001], GABA [F(3,27)=9,045 p<0,0003].

126

Figura 17 – Efeitos da STY na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e

inibitórios (B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por PTZ.

A

B


8). Para análise estatística, foram utilizados ANOVA e o teste de Tukey como post

hoc, p<0,005. Valores significativos: a,b,c, quando comparados com o controle, STY-

1, STY-10. Asparaginina (ASP), glutamato (GLU), glicina (GLI), taurina (TAU) e ácido

γ-aminobutírico (GABA).


Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.5

1.0

1.5

ASP

a,ba,b

GLU

µm

ol/

g d

e te

cid

o


Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

GLI GABA

a,b,c

a,b,c

a,b a,b a,b

TAU

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

127


animais pré-tratados com STY em modelo de convulsão induzidas por PTZ

Os resultados da Figura 18 evidenciam a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B), no hipocampo de camundongos, após

administrações de STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.), no modelo de convulsão induzido

por PTZ (85 mg/kg). Concentração de ASP foi aumentada após tratamento com

STY em todas as doses estudadas (STY-1: 1,67 ± 0,25; STY-10: 1,67 ± 0,33; STY-

20: 2,95 ± 1,5), comparado ao controle (0,98 ± 0,08), sendo que na maior dose o

aumento foi de 304% [F(3,27)=13,13; p<0,0001]. Enquanto o GLU aumentou 400%

somente na maior dose (1,98 ± 0,16), comparado ao controle (0,51 ± 00)

[F(3,27)=17,73; p<0,0001].

Em relação aos aminoácidos inibitórios, a concentração de GLI aumentou

220%, após o tratamento da STY na maior dose (STY-20: 3,07 ± 0,25), comparado

ao controle (1,39 ± 0,37 ) [F(3,27)=62,48; p<0,0004]. Nenhuma alteração foi

observada nas concentrações de TAU nas doses estudadas [F(3,26)=0,6264;

p<0,6264]. A concentração de GABA foi aumentada 167% e 169%, após

administração da STY 10 ou 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 1,37 ± 0,15); STY-

20: 1,39 ± 0,13), comparada ao controle (0,82 ± 0,17) [F(3,27)=4,315; p<0,0001].

128


inibitórios (18 B) em hipocampo de camundongos após convulsão induzida por PTZ.

A

B






.

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0 Hipocampo

ASP GLU

a,b,c

a a a,b,c

µm

ol/

g d

e te

cid

o

Hipocampo

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

GLITAU GABA

a,b,c

a,b a,b

µm

ol/

g d

e te

cid

o

129



estricnina

Os resultados da Figura 21 mostram a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B), no CPF de camundongos, após administração de

STY (1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por

estricnina (20 mg/kg).

A concentração de ASP se comporta de maneira diferente, dependendo

da dose. Em baixas doses, diminui a concentração ASP, enquanto em altas doses,

aumentou a concentração 174% (STY-20: 0,84 ± 0,08), comparado ao controle (0,49

± 0,1) [F(3,29)=17,10; p<0,0001]. No entanto, a concentração de GLU não sofreu

alteração em nenhuma das doses administradas, quando comparada ao grupo

controle [F(3,29)=1,558; p<0,2234].

Quanto aos aminoácidos inibitórios, a concentração de GLI não sofreu

alteração nas doses administradas [F(3,30)=2,252; p<0,1051]. No entanto, verificou-

se aumento em TAU nas doses administradas (STY-1: 0,94 ± 0,1; STY- 10: 1,97 ±

0,09; STY-20: 1,93 ± 0,24), comparado ao controle (0,29 ± 0,05). O percentual para

a dose de 10 e 20mg/kg foi 679,3 % e 665,5%. [F(3,31)= 26,81; p<0.0001], e em

GABA nas doses de 10 e 20mg/kg (194% e 276%), respectivamente (STY-10: 0,97

± 0,1); STY-20: 1,38 ± 0,15), comparada ao controle (0,56 ± 0,17 (7)

[F(3,31)=10,90; p<0,0001].

130


inibitórios (19 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por estricnina.

A

B







Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

ASP GLU

a

b

a,b,c

µm

ol/

g d

e te

cid

o


Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

GLI TAU GABA

a

a,ba,b

a

a,b

µm

ol/

g d

e te

cid

o

131



estricnina

Após o teste de convulsão induzido por estricnina, Figura 22, realizou-se

a dosagem da concentração dos aminoácidos excitatórios (A) e inibitórios (B), após

administração de STY (1, 10 ou 20 mg/kg, i.p.) ou veículo e estricnina (20 mg/kg). A

concentração de ASP aumentou nas maiores doses 223% e 1.059%, STY (STY-10:

0,86 ± 0,2; STY-20: 3,39 ± 0,44), comparado ao controle (0,37 ± 0,01),

[F(3,39)=29,09; p<0,0001]. A concentração de GLU aumentou após administração

de STY em todas as doses (STY-1: 0,85 ± 0,08); STY-10: 1,44 ± 0,11; STY-20: 1,74

± 0,2), comparado ao controle (0,21 ± 0,08). Nas doses de 10 e 20 mg/kg (685,7% e

828,5%), respectivamente [F(3,32)=8,688; p<0,0003].

Os aminoácidos inibitórios aumentaram em todas as doses, após o teste

de convulsão induzido por estricnina. A GLI apresentou aumento de 150,7% e

167,9%, nas doses STY-10 (1,93 ± 0,17) e STY-20 (2,15 ± 0,16), comparado ao

controle (1,28 ± 0,25) [F(3,31)=4,966; p<0,0069]. A TAU aumentou a concentração

nas maiores doses (STY-10: 2,02 ± 0,23; STY-20: 1,87 ± 0,22), comparado ao

controle (0,97 ± 0,31). O percentual nas doses foi de 10 e 20 mg/kg (208,2% e

192,7), respectivamente [F(3,30)= 10,98; p<0,0001]. Enquanto GABA aumentou em

todas as doses administradas (STY-1: 1,37 ± 0,23; STY-10: 1,87 ± 0,22; STY-20:

2,08 ± 0,12) comparada ao controle (0,24 ± 0,10) [F(3,31)=19,31; p<0,0001].

132

Figura 20 – Efeitos da STY concentração de aminoácidos excitatórios (20 A)

inibitórios (20 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por estricnina.

A

B






Hipocampo

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

ASP GLU

a

a,b,c

a

aa,b

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

Hipocampo

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

GLI TAU GABA

a,ba a,b a,b

a

aa

µmol

/g d

e te

cido

133



bicuculina

Os resultados da Figura 23 mostram a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de STY

(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por bicuculina

(12 mg/kg).

A concentração de ASP aumentou nas maiores doses (STY-10: 0,35 ± 0,0

e STY-20: 0,3 4± 0.0), comparado ao controle (0,01 ± 0,0). Na maior dose, o

percentual foi de 340%. A concentração de GLU aumentou nas doses 10 e 20

mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,04 ± 0.,3; STY-20: 2,05 ± 0,42), comparado ao

controle (0,01 ± 0,00) [F(3,37)=26,89; p<0,0001].

Os aminoácidos inibitórios após a administração de STY e bicuculina (12

mg/kg) em córtex pré-frontal aumentaram todas as concentrações. A concentração

GLI aumentou nas doses de 10 e 20 mg/kg, 310% e 430, respectivamente (STY-10:

0,31 ± 0,06 e STY-20: 0,43 ± 0,0), comparado ao controle (0,10 ± 0,0)

[F(3,38)=9,618; P<0,0001. A concentração de TAU aumentou nas doses

administradas (STY-10: 1,3 ± 0,17; STY-20: 1,91 ± 0,32), comparado ao controle

(0,55 ± 0,15), [F(3,37)= 23,09; p<0,0001]. A concentração de GABA aumentou nas

doses de 10 e 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 1,83 ± 0,2 e STY-20: 1,91 ±

0,0) comparada ao controle (0,57 ± 0,13) [F(3,35)=50,83; p<0,0001].

134


inibitórios (21 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por bicuculina.

A

B

Dados em μmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n = 6 -






Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

ASP GLU

a,b,c

a,c

µmol

/g d

e te

cido


Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

GLITAU GABA

a

aa,b

a a,b a,b

a,b

µm

ol/

g d

e te

cid

o

135



bicuculina

Os resultados da Figura 22 demonstram a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B) no HC de camundongos após administração de STY

(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por bicuculina

12 mg/kg).

Após o teste de indução de convulsão por bicuculina (12 mg/kg), foram

realizados a dosagem da concentração dos aminoácidos no hipocampo. A

concentração de ASP aumentou na dose de 20 mg/kg (0,40 ± 0,07), comparado ao

controle (0,11± 0,02 ) [F(3,36)=14,30; P<0,0001] GLU, aumentou nas doses 10 e

20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,02 ± 0,0 ); STY-20: 0,40 ± 0,0)

[F(3,36)=48,51; P<0,0001].

Em relação à concentração dos aminoácidos inibitórios, a GLI aumentou

nas doses de 10 e 20 mg/kg, respectivamente (STY-10: 0,57 ± 0,01; STY-20: 0,79 ±

0,1), comparado ao controle (0,02 ± 0,0) [F(3,38)=11,00; p<0,0001]. Verificou-se

aumento na concentração de TAU na dose de 20 mg/kg (1,33 ± 0,21), comparado

ao controle (0,15 ± 0,09 ) [F(3,37)= 16,42; p<0,0001]. A concentração de GABA

aumentou na dose de 20 mg/kg (2,17± 0,37), comparada ao controle (0,02 ± 0,05)

[F(3,38)=75,58; p<0,0001].

136


inibitórios (22 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por bicuculina.

A

B






Hipocampo

Conto

rle

STY-1

STY-10

STY-20

Conto

rle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.2

0.4

0.6

ASP GLU

a,b,ca,b,c

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

Hipocampo

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

1.0

2.0

3.0

GLITAU GABA

a,b

a,b,c

a,b,c

a,b,c

µm

ol/

g d

e te

cid

o

137



pilocarpina

Os resultados da Figura 25 revelam a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B) no CPF de camundongos após administração de STY

(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por pilocarpina

(400 mg/kg).

A concentração de ASP reduziu na menor dose (STY-1: 0,15 ± 0,0) e

aumentou na maior dose (STY-20: 0,49 ± 0,03), comparado ao controle (0,46 ± 0,0).

[F(3,25)=14,81; p<0,0001]. A concentração de GLU aumentou na menor dose (STY-

1: 0,16 ± 0,0), comparada com o controle (0,0 ± 0,0) [F(3,23)=50,98; p<0,0004].

Os aminoácidos inibitórios a concentração de GLI aumentaram nas doses

de 1 mg/kg (0,03 ± 0,0), comparado ao controle (0,0 ± 0,0) [F(3,24)=5,99; p<0,0041].

Não houve alteração nos níveis da TAU [F(3,26)= 1,847 p<0,597]. A concentração

de GABA aumentou nas doses administradas (STY-1: 0,12 ± 0,0; STY-10: 0,04 ±

0,01; STY-20: 0,04 ± 0,02), comparada ao controle (0,05 ± 0,0) [F(3,25)=9,426;

p<0,0003].

138


inibitórios (23 B) em CPF de camundongos após convulsão induzida por pilocarpina.

A

B







Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

ASP GLU

a

a

b bµm

ol/

g d

e t

ecid

o


Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

Contr

ole

STY-1

STY-10

STY-20

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20GLI

TAU

GABA

GLI TAU GABA

a

a

b b

µm

ol/

g d

e t

ecid

o

139



pilocarpina

Os resultados da Figura 26 demonstram a concentração dos aminoácidos

excitatórios (A) e inibitórios (B) no HC de camundongos após administração de STY

(1, 10 ou 20 mg/kg i.p) ou veículo no modelo de convulsão induzida por pilocarpina

(400 mg/kg).

Em relação à ASP, ocorreu aumento na menor dose (STY-1: 0,03 ± 0,0),

enquanto que nas maiores doeses ocorreu a diminuição (STY-10: 0, 0 ± 0,0; STY-

20: 0,0 ± 0,0), comparado ao controle (0,02 ± 0,0) [F(3,26)=16,56; p<0,0001]. Não

houve alteração na concentração de GLU nas doses administradas [F(3,27)=2,238;

p< 0,1098].

A concentração de GLI diminuiu nas doses de 10 ou 20 mg/kg (STY-10:

0,03 ± 0,0); STY-20: 0,05 ± 0,0), comparado ao controle (0,0 ± 0,0 ) [F(3,27)=10,03;

p<0,0002]. Não houve alteração nas concentrações da TAU e GABA

respectivamente, [F(3,27)= 1,027 p<0,3982]; [F(3,27)=5,482; p<0,9127].

140


inibitórios (24 B) em HC de camundongos após convulsão induzida por pilocarpina.

A

B






Hipocampo

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

ASPGLU

a

a,b

a,b

µmol

/g d

e te

cido

Hipocampo

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

Controle

STY-1

STY-10

STY-20

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

GLI TAU GABA

aa

a,b,c

µmol

/g d

e te

cido

141

5.4.2 Discussão

Os aminoácidos no SNC encontram-se em altas concentrações, em

particular, o glutamato, com ação excitatória, e o GABA com ação inibitória. Sabe-se

que as anormalidades na neurotransmissão ocorrem quando há desequilíbrio na

transmissão excitatória e inibitória, podendo motivar diversas doenças neurológicas.

A epilepsia é uma dessas disfunções cerebrais desordenadas, decorrentes de

anormalidade e hipersincronia da atividade neuronal, muito associada a processos

patológicos secundários (NAGA et al., 2004).

A fisiopatologia da convulsão ocorre principalmente pelo desequilíbrio

entre os aminoácidos excitatórios e inibitórios do SNC. Entre esses aminoácidos, os

mais importantes durante a crise convulsiva são o glutamato e o aspartato que são

aminoácidos excitatórios, e o GABA e a glicina que são inibitórios. Entretanto, outros

neurotransmissores podem atuar de maneira direta ou indireta nesses aminoácidos

e induzir crise convulsiva, como o sistema colinérgico (modelo de pilocarpina) e

glicina (estricinina) entre outros (GODMAN; GILMAN, 2012; COSSART;

BERNARD;BEN-ARI, 2005).

A identificação dos possíveis mecanismos de ação de moléculas com

potencial para o desenvolvimento de novas drogas, que interfiram com a

neurotransmissão GABAérgica ou mesmo glutamatérgica, justifica-se em

decorrência dos diversos tipos de distúrbios que comprometem o SNC pelo

desequilíbrio entre os aminoácidos. Dentre estas neuropatologias humanas, citam-

se epilepsias, Coreia de Huntington, ansiedade, esclerose amiotrófica lateral e

isquemia, dentre outras (WONG et al., 2003).

As concentrações de aminoácidos ASP, GLU, GLI, TAU e GABA, após

administração de STY, nos testes de convulsão induzidos por PTZ (85 mg/kg),

estricnina (20 mg/kg), bicuculina (12 mg/kg) e pilocarpina (400 mg/kg), em CPF e HC

foram estudados em camundongos com idade de dois meses que apresentaram

convulsão e sobreviveram ou morreram. As pesquisas envolvendo mecanismos de

epilepsia têm sido focadas nas mudanças na atividade de aminoácidos inibitórios em

particular, o ácido aminobutírico – GABA e excitatórios, glutamato e aspartato

(SZYNDLER et al., 2006). A desordem do equilíbrio dos aminoácidos excitatórios e

142

inibitórios no tecido cerebral dá origem à atividade epiléptica (MODY, 1999).

Neurotransmissores excitátorios e inibitórios medeiam a transmissão sináptica e

controlam a estabilidade e eficiências das conexões sinápticas (LOSCHER;

SCHMIDT, 2002; MELDRUM; ROGAWSKI, 2007; KAUL et al, 2011).

Entre as áreas cerebrais mais comprometidas, cita-se o hipocampo que é

mais vulnerável à lesão isquêmica (PULSINELLI, 1992), uma vez que a inervação

excitatória é realizada por neurônios glutamatérgicos, o que provalvemente resulta

em excitoxidade através dos receptores de glutamato NMDA e não NMDA (cainato e

AMPA).

O PTZ foi utilizado neste estudo no modelo de indução de convulsão, pois

esta droga tem ação convulsivante e atua reduzindo a neurotransmissão mediada

por receptores GABA-A (OWENS; KRIEGSTEIN, 2002;). Além disso, estudos têm

demonstrado que o tratamento com o PTZ produz dano neuronal em nível de DNA,

proteínas e lipídios (ILHAN et al., 2004, 2005; AKBAS et al., 2005; D'ANTUONO et

al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008).

Os resultados obtidos após administração de STY e indução da convulsão

por PTZ demonstram aumento na concentração do GLU, no CPF, e HC e ASP, no

HC. Esses resultados sugerem possível diminuição na taxa de metabolização do

GLU nesta área cerebral, favorecendo o desenvolvimento do foco epiléptico. Por

outro lado, os aminoácidos inibitórios aumentaram tanto no córtex quanto no

hipocampo. O aumento de AAE e AAI no córtex pré-frontal pode estar relacionado,

com efeito, modulatório do glutamato sobre o sistema gabaérgico, em que um

aumento de glutamato endógeno no córtex pré-frontal está relacionado com o

aumento nas concentrações de GABA extracelular (DEL ARC; MORA, 1999).

Assim, aumento da liberação de GABA pode ocorrer por exocitose clássica ou

transporte reverso ou, ainda, por aumento de sua atividade em seus receptores,

bem como a sua reduzida recaptação da fenda sináptica, poderia contribuir para

proteção do SNC contra as convulsões (BRADFORD,1995).

No estudo de Luca et al. (2005), foram dosadas as concentrações de

aminoácidos em camundongos após subdoses de PTZ (20-30 mg/kg) no modelo de

kindling em dois grupos de camundongos, o primeiro grupo, o controle, sem

modificação genética e o segundo grupo de camundongos geneticamente

143

modificados para investigar convulsões de ausência. Os resultados obtidos após

administração do PTZ mostram o aumentou do GABA, no CPF e HC. A

concentração de glutamato aumentou no CPF e HC. Após o uso do PTZ por 60 dias,

foram encontradas diferentes alterações nos aminoácidos, com aumento dos

animoácidos excitátórios.

Outro aspecto abordado diz respeito à concentração de aminoácidos após

o uso do PTZ para induzir convulsão. No fluido intersticial de células gliais,

evidenciou-se aumento dos AAE neurotransmissores glutamato e aspartato, nos

primeiros 10 minutos, sendo que glicina, taurina, glutamina e fosfoserina foram mais

evidentes nos minutos seguintes. Segundo Sechi et al. (1997), esse aumento de

glutamato e aspartato pode ser devido à excessiva liberação sináptica ou ativação

de vias bioquímicas nas células neuronais ou gliais. A glicina pode estar envolvida

na manutenção das crises, devido ao seu efeito modulador nos receptores NMDA,

potenciando a resposta excitatória. Prado et al. (2011) citam que para que ocorra a

síntese de glutamato/glutamina, o cérebro necessita do aminoácido aspartato.

A liberação de aminoácidos excitatórios de estruturas neurais durante a

hipóxia e isquemia tem sido observada tanto in vitro (PELLEGRINI-GIAMPIETRO et

al., 1990; COLLARD; MENON-JOHANSSON, 1993; O’REGAN et al., 1995) quanto

in vivo (BENVENISTE et al., 1984; HAGBERG et al., 1985; GLOBUS et al., 1988).

Aminoácidos excitatórios são neurotóxicos em excesso e a hiperestimulação

resultante dos seus receptores contribui para a morte neuronal durante os insultos

cerebrais. Na isquemia induzida, a presença de radicais livres e aminoácidos

excitatórios agravam os danos neuronais (PELLEGRINI-GIAMPIETRO et al., 1990).

Adicionalmente, alterações nas funções GABAérgicas têm sido relatadas

em ratos geneticamente propensos à epilepsia, no modelo de indução de convulsão

com o PTZ (SEJIMA, 1997; LI et al., 2000). De fato, drogas que bloqueiam os

receptores GABA-A são convulsivantes muitos potentes, como é o PTZ, picrotoxina,

e bicuculina, usadas em modelos animais.

A estricnina, outro agente convulsivante, foi utilizada para induzir

convulsão. Essa substância provoca convulsões tônicas típicas por ação

predominante na medula espinhal. Interfere apenas na inibição pós-sináptica (PIPS

– potencial inibitório pós-sináptico) espinhal, bloqueando a glicina nesse local (DE

144

LUCIA et al., 2007). A ação convulsivanteda estricnina 20 mg/kg, no estudo, foi

observada, pois os animais apresentaram crise convulsiva tônico-clônica

generalizada, com rigidez tônica dos membros, seguida de tremor por interrupção

do tônus por relaxamento. No entanto, demonstrou-se que STY apresenta efeito

protetorparcial, já que houve aumento no tempo de latência de morte.

No modelo de convulsão induzido por estricnina, os animais tratados com

STY demonstraram que o ASP, no CPF, e o HC aumentaram nas maiores doses

174% e 1.059%, respectivas áreas estudadas. Por outro lado, os aminoácidos

inibitórios aumentaram tanto no córtex quanto no hipocampo. Nas maiores doses no

CPF TAU 679% e 665,5%, enquanto GABA aumentou 194% e 2276%. No

hipocampo, ocorreu o aumento da concentração de GLU na dose de STY-10

(685,7%) ou STY-20 (828,5%). Os aminoácidos inibitórios aumentaram todos no

hipocampo. A glicina aumentou a concentração nas doses de 10 ou 20 mg/kg

(150,7% e 167,9%), enquanto TAU aumentou 208,2% e 192,7%, respectivamente.

O GABA aumentou em todas as doses estudadas, 1,10 ou 20 mg0kg (570%, 779%

e 866%), respectivamente. Sugere-se que a estricnina pode atuar bloqueando a

ação da glicina no sistema nervoso central, gerando hiperexcitabilidade do neurônio,

mas não bloquendo a concentração de outros aminoácidos inibitórios.

Apesar de os animais terem morrido após o teste de indução de

convulsão por estricnina, os resultados demonstram o aumento da latência de morte

nas doses estudadas. A STY conduz ao aumento das concentrações de GLI, no HC,

e o aumento de GABA e TAU, no CPF. O aumento de TAU produz neuroproteção

contra a neurotoxidade em nível celular produzido pelas convulsões (KONTRO;

OJA, 1987; EL IDRISSI; L’AMOREAUX, 2008).

A glicina é um neurotransmissor inibitório no sistema nervoso central,

encontrado na medula espinal, sendo liberada por interneurônios inibitórios,

chamados de células de Renshaw e tronco cerebral. Quando receptores de glicina

são ativados, o ânion cloreto entra no neurônio através de receptores ionotrópicos,

causando potencial pós-sináptico inibitório. Este potencial limita ativação de

neurônios motores e possibilita o relaxamento muscular. A estricnina atua

especificamente como antagonista nos receptores ionotrópicos de glicina, inibindo

ação do neurotransmissor (SPINOSA et al., 2008; NICHOLSON, 2004; ANDRADE,

145

2003). Além disso, a glicina é um coagonista de receptores NMDA, facilitando ação

excitatória dos receptores glutamatérgicos.

Neste estudo, a dose utilizada na indução de convulsão foi de 20 mg/kg.

Em experimentos anteriores realizados no laboratório de Neurofarmacologia, esta

foi a dose estabelecida. A dose tóxica da estricnina para animais pequenos é de

0,25 a 2 mg/kg, enquanto para cães e gatos considera-se 0,75 a 2 mg/kg (SPINOSA

et al., 2008; SCHMITT, ROSSATO, 2011 ). As alterações clínicas, dependendo da

dose, manifestam-se em média nos primeiros 10 minutos, com episódios de

convulsão, rigidez extensora e muscular, opistótono, taquicardia, apneia, hipertermia

e raramente vômito (ANDRADE, 2003).

O aminoácido glicina pode modular a sinalização do cálcio nas células

gliais. As concentrações de glicina no fluido cérebro espinhal foram encontradas em

torno de 10 µM, enquanto a concentração do neurotransmissor no interior do citosol

pode chegar a 10 µM. O estudo mostra que depois da morte de neurônios

glicinérgicos, a sinalização de cálcio microglial pode ser modulada. Além disso, em

células não neuronais, foi demonstrado que a glicina protege diferentes tipos de

células contra a morte celular isquêmica, como células renais, hepatócitos e células

endoteliais (EYNDEN et al., 2011).

No presente estudo, outro modelo utilizado foi o da indução de convulsão

por bicuculina. O mecanismo deação da bicuculina é por antagonismo dos

receptores GABA-A (FUKUNDA et al., 1997). Após administração da STY, ocorreu

no CPF o aumento da concentração de ASP e GLU, nas maiores doses. ASP

aumentou 39% e 157%, enquanto o GLU aumentou 47,5% e 200%,

respectivamente. A GLI aumentou 31,1% na maior dose, enquanto TAU aumentou

nas doses de 10 e 20 mg/kg, 306% e 382%, respectivamente. GABA aumentou nas

maiores doses 940% e 1.010%, respectivamente. No HC, os aminoácidos

excitatórios e inibitórios aumentaram na maior dose. GABA aumentou 217% e TAU

133%. Sugere-se que a STY tenha ação similar às drogas BZD por ativar os

receptores GABAérgicos que pertencem a uma superfamília de canais iônicos,

favorecendo o aumento da abertura do canal de cloro para entrada desse ânion,

levando à hiperpolarização do neurônio pós-sináptico (DELOREY; OLSEN, 1994;

MACDERMOT et al., 1999).

146

A função inibitória do GABA em hipocampo é descrita pela literatura

(CURTIS et al., 1970). Portanto, quando ocorre inibição do GABA-A, nos modelos

animais, pode ocorrer aumento, seguido por estabilização dos PEPS. O aumento na

concentração dos AA inibitórios GABA pode ser mediado através dos canais de

sódio voltagem-dependente, uma vez que os camundongos apresentaram aumento

na latência de convulsão e tempo de morte, sugerindo que a STY apresenta efeito

sobre a latência de morte nos animais, similar às drogas gabaérgicas.

No estudo realizado por Szyndler et al. (2006) foi observada elevação

nos níveis de glutamato no hipocampo durante ou após ataques epiléticos em

humanos, bem como em ratos. Além disso, diminuição da função dos receptores

GABA foi observada tanto in vitro quanto in vivo em modelos de convulsão, como na

epilepsia clínica (GROVES et al., 2006).

As células granulares e piramidais são as principais componentes

envolvidas na fisiologia do hipocampo, sendo que o GABA e glutamato os

neurotransmissores dominantes. Em camundongos modificados geneticamente,

observou-se que as concentrações de aminoácidos no cérebro eram diferentes,

alguns animais apresentavam predisposição maior para convulsão. Após 60 dias, a

expressão dos receptores é considerada completa (ENGSTROM; WOODBURY,

1988; MUSUMECI et al., 2000).

A concentração dos aminoácidos livres no cérebro de camundongos com

predisposição para convulsão após a administração de várias drogas com ação

anticonvulsivante foi demonstradas no estudo de Honda (1984), do qual os animais

tratados com fenobarbital aumentaram as concentrações de glutaminina e histidina,

enquanto a fenitoina aumentou a concentração de glutamina. No grupo tratado com

ACTH (0,05mg/kg), ocorreu o aumento nas concentrações de aspartato, ácido

glutâmico, glutamina, glicina e GABA. Outro grupo recebeu vitamina B6 e obteve-se

aumento na concentração de taurina. As substâncias utilizadas alteram as

concentrações dos aminoácidos livres no cérebro, sendo importante a identificação

do possível mecanismo de ação para melhor condução da terapêutica

medicamentosa.

No modelo experimental de epilepsia induzido por pilocarpina, os

sistemas de neurotransmissão ainda não estão completamente definidos. Esse

147

modelo de convulsão em animais é bastante utilizado para estudar a fisiopatologia

do processo convulsivo, uma vez que reproduz alterações comportamentais,

eletroencefalográficas e neuroquímicas que são semelhantes à epilepsia do lobo

temporal em humanos (FREITAS, 2011; CAVALHEIRO et al., 1991; TURSKI et al.,

1983a).

A pilocarpina é um alcaloide extraído das folhas da planta jaborandi

(Pilocarpus jaborandi), a qual possui propriedades colinérgicas capazes de

induzir status epilepticus, culminando com lesões encefálicas específicas e

movimentos estereotipados convulsivantes. A pilocarpina é capaz de induzir status

epilepticus tanto administrada diretamente no encéfalo ou por via intraperitonial

(TURSKI et al., 1983). As crises convulsivas motoras e límbicas iniciam-se por volta

de 15-25 minutos após a injeção de pilocarpina. Os animais evoluem para estado

de crises contínuas clônicas, que caracterizam o status epilepticus (SANABRIA;

CAVALHEIRO, 2000).

Após administração de STY e indução da convulsão por pilocarpina,

demonstrou-se alteração na concentração de GLU e GABA na menor dose no CPF.

No HC, o ASP aumentou na menor dose. A pilocarpina foi capaz de modificar a

concentração dos aminoácidos excitatórios, quando comparado ao controle. O

processo convulsivo decorrente de altas doses de pilocarpina parece envolver o

sistema glutamatérgico, com ativação do receptor NMDA (ISOKAVA et al., 1998).

Freitas (2006) cita que concentração dos aminoácidos ASP, Tirosina (TIR), GLI, GLU

podem atuar durante a propagação e/ou manutenção da atividade epiléptica.

A concentração dos aminoácidos neurotransmissores possibilita

oentendimento dos mecanismos que levam ao desenvolvimento das epilepsias,a

partir dos modelos experimentaisrealizados com animais, principalmente ratos e

camundongos. O modelo experimental se faz valer pela capacidade deste em

representar o processo convulsivo no tratamento agudo e crônico.

148

5.4.3 Conclusão

No modelo de PTZ, os AAE aumentaram, no CPF e HC. O GLU

aumentou nas duas áreas estudadas, enquanto o ASP aumentou no hipocampo. Os

AAI, GLI, TAU e GABA aumentaram no CPF, enquanto no HC aumentaram GLI e

GABA. Neste modelo, na maior dose, teve-se um animal sobrevivente, sugerindo a

participação dos aminoácidos inibitórios, conferindo maior proteção contra o agente

convulsivante.

No modelo de estricnina, ocorreu o aumento da ASP no CPF e HC,

enquanto o glutamato aumentou no HC nas doses administradas. Os AAI TAU e

GABA aumentaram nas maiores doses, enquanto no HC, demonstrou-se o aumento

de GLI, TAU e GABA. Neste modelo, os animais não sobreviveram, no entanto

obteve-se aumento na latência de convulsão e de morte, sugerindo o envolvimento

do AAIs.

No modelo de bicuculina, os AAEs (ASP e GLU) aumentaram tanto no

CPF quanto no HC. Os inibitórios GLI, TAU e GABA aumentaram no CPF e HC.

Neste modelo, na maior dose, sobreviveu um animal, sugerindo o envolvimento do

sistema GABAérgico.

No modelo de pilocarpina, o ASP aumentou no CPF e HC, enquanto o

GLU aumentou no CPF. Enquanto os AAIs, no CPF, aumentou glicina e GABA. No

HC, ocorreu a diminuição da glicina e GABA. Neste modelo, sugere-se o

envolvimento do sistema glutamatérgico .Os animais que receberam pilocarpina 400

mg/kg apresentaram convulsões intensas com mortalidade de 100% em um intervalo

menor de tempo nas maiores doses.

A STY, portanto, aumentou a concentração dos AAEs e AAIs nos

modelos estudados, com destaque para envolvimento do sistema GABAérgico e

glutamatérgico.

149

6 CONSIDERAÇÕES FINAS

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, no teste do campo aberto

(Capítulo I), a STY aumentou a atividade locomotora espontânea dos animais,

sugerindo que a molécula apresenta efeito excitatório, desprovido de efeito sedativo.

No rearing, não ocorreu alteração, enquanto no grooming, ocorreu aumento na

maior dose. No teste do labirinto em cruz elevada e placa perfurada, a STY

comprovou efeito ansiolítico em todas as doses administradas.

O mecanismo de ação ansiolítico da STY parece estar relacionado com o

receptor GABA-A Benzodiazepinico, pois o efeito ansiolítico foi revertido pelo

flumazenil, antagonista deste receptor.

No teste Rota Rod, a coordenação motora dos animais não foi alterada,

mostrando que os efeitos desta molécula não estão relacionados com o bloqueio

neuromuscular periférico, mas com ação central.

No teste de indução do tempo de sono por pentobarbital, a STY

potencializou o efeito sedativo/hipnótico do pentobarbital sódico, o que não parece

ser efeito específico, já que o efeito sedativo não foi confirmado no campo aberto.

Este efeito pode estar envolvido com alterações farmacocinéticas do pentobarbital

ou mecanismo de regulação do sono.

A STY alterou tanto a concentração de aminoácidos excitatórios quanto

inibitórios nas áreas cerebrais estudadas. No Quadro 3, encontra-se o resumo das

concentrações estudadas.

Nos modelos de convulsão induzidas por PTZ, estricnina e bicuculina,

demonstra-se o efeito parcial anticonvulsivante da STY, enquanto o modelo de

pilocarpinaa STY não apresentou proteção.

Nos Quadros 4 e 5, encontram-se os aminoácidosexcitatórios e inibitórios

que sofreram alterações após o uso do agente químico indutor da convulsão em

modelo animal.

150


após administração de STY nas doses de 1 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral (CPF)

hipocampo (HC) corpo estriado (CE) de camundongos.

Controle STY-1 STY-20

CPF

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

Histidina

-

-

-

-

-

-

↓

↑

↑

-

-

-

↑

↑

↑

↑

↓

↑

HC

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

Histidina

-

-

-

-

-

-

↑

-

-

-

↑

-

↑

↑

↑

↑

↑

↑

CE

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

Histidina

-

-

-

-

-

-

↑

↓

↓

↑

-

↑

↓

↑

↑

↑

↑

↓

Símbolos: ↑ ou ↓ em relação ao controle quando estatisticamente significativo; − ausência de efeito significativo.

151


após administração de STY nas doses de 1 , 10 ou 20 mg/kg em córtex pré-frontral


pentilenotetrazol (PTZ) e estricnina.

Pentilenotetrazol (85mg/kg) STY-1 STY-10 STY-20

CPF

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

-

-

-

-

-

-

↑

↑

↑

-

-

↑

↑

↑

↑

HC

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

↑

-

-

-

-

↑

-

↑

-

-

↑

↑

↑

-

↑

Estricnina (20 mg/kg)

CPF

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

↓

-

-

↑

-

↑

-

↑

↑

-

↑

-

↑

↑

-

HC

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

-

↑

↑

-

-

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑


152


após administração de STY nas doses de 1 , 10 ou 20mg/kg em córtex pré-frontral


bicuculina e pilocarpina.

Bicuculina(12 mg/kg) STY-1 STY-10 STY-20

CPF

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

-

-

-

↓

↓

-

-

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

↑

HC

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

-

-

-

-

-

-

-

-

-

↑

↑

↑

↑

↑

↑

Pilocarpina (400 mg/kg)

CPF

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

↓

↑

↑

-

-

-

↓

↓

-

-

↑

↓

↓

-

-

HC

Aspartato

Glutamato

GABA

Taurina

Glicina

↑

-

-

-

-

↓

-

-

-

↓

↓

-

-

-

↓


153

7 CONCLUSÕES

A molécula de STY no teste atividade locomotora apresenta efeito

excitatório, desprovido de efeito sedativo;

O mecanismo de ação ansiolítico da STY parece estar relacionado com

o receptor GABA-A Benzodiazepinico, pois o efeito ansiolítico foi revertido pelo

flumazenil, antagonista deste receptor;

No teste Rota Rod, os efeitos desta molécula não estão relacionados

com o bloqueio neuromuscular periférico, mas com ação central;

O Aumento do GLU no córtex pré-frontal pode explicar o aumento nos

parâmetros comportamentais, enquanto os inibitórios modularam este

comportamento, sem causar sedação, o que pode explicaração ansiolítica da STY

nos modelos de LCE e placa furada;

A STY, portanto, apresentou efeito anticonvulsivante, uma vez que

ocorreu aumento no tempo de latência de morte e sobrevivência dos animais nos

modelos PTZ, estricinina e biculina. A via colinérgica parece está envolvida apenas

na menor dose 1 mg/kg, possivelmente, interagindo com o sistema GABAérgico.

A STY, portanto, aumentou a concentração dos AAEs (GLU, ASP) e

AAIs (GABA, TAU, GLI), nos modelos estudados, sugerindo o possível

envolvimento dos sistemas glutamatérgico, GABAérgico.

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universidade federal do cearÁ faculdade … · na indução de convulsão com estricnina no cpf...

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