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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI - UFSJ
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU - CCO
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
GISELE CAPANEMA DE OLIVEIRA
EFEITOS DE NOVOS DERIVADOS DA DIGOXINA NA ATIVIDADE
ANTITUMORAL DE CÉLULAS HELA E NA MODULAÇÃO DA
NA,K-ATPASE E TIROSINA QUINASE SRC
DIVINÓPOLIS - MG
FEVEREIRO - 2016
GISELE CAPANEMA DE OLIVEIRA
EFEITOS DE NOVOS DERIVADOS DA DIGOXINA NA ATIVIDADE
ANTITUMORAL DE CÉLULAS HELA E NA MODULAÇÃO DA
NA,K-ATPASE E TIROSINA QUINASE SRC
Dissertação apresentada ao Programa
Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e
Biologia Molecular da Universidade Federal de
São João Del Rei, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre.
Orientador: Vanessa Faria Cortes
Co-orientador: Carlos Frederico Leite Fontes
DIVINÓPOLIS - MG
FEVEREIRO - 2016
ii
Aos meus pais que fizeram possível a realização
de mais uma etapa importante em minha vida.
Ao meu amor e melhor amigo Thiago pela
presença em minha vida, por todos os dias
dedicados a mim, paciência e companheirismo.
E a todos que contribuíram para esta conquista!
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que se faz sempre presente em minha vida. Por ter guiado
meu caminho, sempre me iluminando e me tranquilizando para que eu conseguisse chegar até
aqui.
Agradeço eternamente aos meus professores orientadores Vanessa Faria Cortes e Leandro
Augusto de Oliveira Barbosa. A Vanessa por me aceitar como sua aluna de mestrado e por
todos os conselhos, ensinamentos e discussões do projeto, que foram essenciais para o seu
desenvolvimento. Ao meu orientador Leandro por continuar com a orientação do mesmo
projeto que vem sendo estruturado desde a iniciação científica. Obrigada por toda a dedicação
ao projeto, pela paciência em me ouvir, sanando todas as dúvidas, e pelos sábios ensinamentos.
Agradeço à professora Hérica Lima Santos por todo o apoio, ensinamentos e conselhos durante
todos esses anos da vida acadêmica e no Laboratório de Bioquímica Celular da UFSJ, em
especial no primeiro ano em que Vanessa e Leandro ficaram afastados durante o pós-doutorado.
Obrigada por me concederem a oportunidade de fazer parte desta equipe durante estes 5 anos.
Todo o meu conhecimento e desenvolvimento profissional devo a vocês!! Vocês são FERAS!!
E os tenho como um grande exemplo a ser seguido de grandes profissionais!
Agradeço ao meu co-orientador Carlos Frederico por aceitar participar deste trabalho. Obrigada
por todas as sugestões.
A todos os amigos do Laboratório de Bioquímica Celular, em especial Letícia e Marco Túlio,
que me ensinaram todos os procedimentos e minuciosos cuidados com a cultura de células. A
técnica Grazi, que esteve sempre apta a ajudar em tudo que precisamos durante todos estes
anos, desde a iniciação científica. A Duane, pelos ensinamentos de algumas técnicas como o
Western Blot. Ao Israel, por sempre estar presente e sanar todas as dúvidas. E a todos
doutorandos, mestrandos e alunos de IC do laboratório, que estão sempre fazendo companhia e
auxiliando no que for preciso.
Agradeço ao Professor José Augusto Villar, à aluna Silmara Lúcia Grego Alves e aos demais
alunos envolvidos do Laboratório de Síntese Orgânica por ceder os esteroides cardiotônicos
utilizados nos ensaios biológicos deste trabalho.
iv
Agradeço aos professores e alunos dos laboratórios vizinhos por ceder equipamentos e materiais
para serem utilizados em diversas técnicas. À professora Valéria por ceder diversos
equipamentos e reagentes necessários para o desenvolvimento do trabalho. Ao professor Fábio
do Laboratório de Biologia Celular, às professoras Débora e Luciana, e ao técnico Flávio, do
Laboratório de Biologia Molecular, e ao professor Fernando por ceder algumas células do
Laboratório de Química Medicinal.
Agradeço aos professores Valéria Ernestânia Chaves e Júlio Alberto Mignaco por aceitarem
contribuir com o trabalho como membros da banca.
À turma do mestrado, que sempre unida foi essencial para o estudo e aprendizado nas
disciplinas do Programa Multicêntrico.
A minha amada família, meu porto seguro, que está sempre ao meu lado. Aos meus pais Márcio
e Nilza por sempre me concederam um amor incondicional e por me apoiarem, fazendo possível
e o impossível para que eu conseguisse vencer mais esta etapa da minha vida. Aos meus irmãos
Aline e Rodrigo por todo o amor, carinho, companheirismo e momentos de descontração. Amo
vocês!
Agradeço ao meu grande amor, amigo e companheiro Thiago por estar sempre me apoiando em
minhas decisões e me confortando nas horas mais difíceis. Obrigada por tornar esta caminhada
menos árdua e me trazer muitos momentos de felicidade que foram essenciais para o
desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por sempre me acompanhar todos os finais de
semana em Divinópolis. Os domingos sem você não seriam os mesmos, foi uma energia muito
positiva para começar a semana. Obrigada também por às vezes passar os sábados e domingos
me fazendo companhia no laboratório.
Às minhas amigas e companheiras Débora, Deisi e Nathália, obrigada por fazer parte no dia-a-
dia, dividindo todas as aflições e alegrias.
À UFSJ e ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular
pelo apoio institucional e financeiro para a realização do trabalho. E a todos os professores
envolvidos nas disciplinas do programa e à secretária Soraia por estar sempre disposta a auxiliar
em qualquer situação.
v
A Fundação Ezequiel Dias (FUNED) pela doação das células de carcinoma de colo uterino
(HeLa) utilizadas no trabalho.
E aos órgãos de fomento CAPES, CNPq e FAPEMIG agradeço pelo apoio financeiro.
vi
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me
em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.
(Isaac Newton)
vii
RESUMO
Esteroides cardiotônicos são uma família de compostos naturais com uso tradicional em
cardiologia, e foram sugeridos recentemente para exercer efeitos anticancerígenos potentes,
agindo através da Na,K-ATPase e levando à ativação de diversas vias de sinalização celular.
Devido ao crescente interesse na pesquisa e no desenvolvimento desta classe de compostos
como potenciais quimioterápicos, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos antitumorais
de 6 novos compostos γ-benzilidenos derivados da digoxina (1-BD, 2-BD, 3-BD, 4-BD, 5-BD
e 6-BD) em células de carcinoma de colo uterino (HeLa) e investigar a modulação da atividade
e expressão da enzima Na,K-ATPase e da tirosina quinase Src. Assim como a digoxina, o
composto 21-p-dimetilaminobenzilideno digoxina (4-BD) foi o único composto capaz de inibir
a atividade da Na,K-ATPase de células HeLa após 24 horas de tratamento. A inibição da enzima
ocorreu sem nenhuma mudança no conteúdo da subunidade α1. Por outro lado, sabe-se que 4-
BD é menos potente para a inibição direta da Na,K-ATPase em preparações de hemisfério
cerebral de rato e de rim humano, quando comparado aos derivados mais potentes, 1-BD, 3-
BD, e digoxina. Portanto, o efeito antitumoral dos compostos observados em estudos anteriores,
não parece estar relacionado com a inibição da atividade da Na,K-ATPase, ou alteração da sua
expressão. A proliferação celular foi avaliada em diferentes concentrações e tempos de
tratamento com 4-BD e houve uma redução significativa da proliferação celular. O conteúdo
de Src fosforilada também foi reduzida em todas as concentrações de 4-BD testadas. Como Src
está envolvida em uma cascata de sinalização que conduzem à proliferação celular,
sobrevivência, diferenciação, adesão, migração e progressão de diversos tipos de cânceres,
nossos dados sugerem que 4-BD pode estar reduzindo a proliferação celular através da inibição
de alguma via relacionada a Src. Diversos estudos vem mostrando a atuação da Na,K-ATPase
no envolvimento da transdução de sinais para a regulação de vários processos celulares
importantes e destacando potenciais papeis terapêuticos em muitas doenças, como o câncer. A
inibição da Na,K-ATPase por 4-BD pode estar levando a um mecanismo de sinalização
complexo, com possíveis interações proteína-proteína, que pode estar causando a diminuição
da atividade quinásica de Src e consequentemente levando aos efeitos antiproliferativos
observados em células HeLa. Assim, o mecanismo molecular de 4-BD merece ser investigado
como um candidato promissor a ser utilizado para a quimioterapia do câncer.
Palavras chave: Câncer, Esteroides cardiotônicos, Sinalização celular, Na,K-ATPase, Src
viii
ABSTRACT
Cardiotonic steroids are a family of natural compounds with traditional use in cardiology, and
has recently been suggested to exert potent anticancer effects, acting through Na,K-ATPase and
leading to activation of several signaling pathways. Due to the growing interest in research and
development of this class of compounds as potential chemotherapy, the study aimed to evaluate
the anti-tumor effects of 6 new compounds γ-benzylidene derivatives of digoxin (BD-1, BD-2,
BD-3, BD-4, BD-5 e BD-6) in cervical carcinoma cells (HeLa) and investigate the activity and
modulation of the expression the enzymes Na,K-ATPase and tyrosine kinase Src. As digoxin,
21-p-dimethylaminobenzylidene digoxin (BD-4) is the only compound capable of inhibiting
the Na,K-ATPase activity of HeLa cells after 24 hours of treatment. Enzyme inhibition
occurred without any change in content of the α1 subunit. On the other hand, it is known that
BD-4 is less potent for direct Na,K-ATPase inhibition in preparations of cerebral hemisphere
from rat and human kidney, when compared to the most powerful derivatives, BD-1and BD-3
and digoxin. Therefore, the anticancer effect of the compounds seen in previous studies, were
not related to their inhibition of Na, K-ATPase activity or alteration of its expression. Cell
proliferation was evaluated using different BD-4 concentrations and times of treatment,
resulting in a significant reduction of cell proliferation. The phosphorylated Src content was
also reduced at all concentrations of BD-4 tested. Src is involved in a signaling cascade leading
to cell proliferation, survival, differentiation, adhesion, migration and progression of various
types of cancers. Thus our data suggest that BD-4 may reduce cellular proliferation by
inhibition of one Src-related pathway. Several studies have shown the involvement of Na,K-
ATPase in signal transduction for the regulation of many important cellular processes, and
highlighting potential therapeutic targets in many diseases, such as cancer. Na,K-ATPase
inhibition by BD-4 may lead to a complex signaling mechanism with possible protein-protein
interactions that may cause the decrease in Src kinase activity and consequently lead to the
antiproliferative effects observed in HeLa cells. Therefore, the molecular mechanism of BD-4
deserves more investigation as a promising candidate for a useful drug on cancer chemotherapy.
Key words: Cancer, Cardiotonic steroids, Cell signaling, Na, K-ATPase, Src
ix
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. xi
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
1.1 Câncer e quimioterapia.................................................................................................. 1
1.2 Esteroides cardiotônicos e síntese dos γ-benzilidenos digoxina ................................... 3
1.3 Na,K-ATPase ................................................................................................................ 6
1.4 Interação dos esteroides cardiotônicos com a Na,K-ATPase ........................................ 9
1.5 Transdução de sinais através dos esteroides cardiotônicos e Na,K-ATPase............... 11
1.5.1 Tirosina quinase Src .......................................................................................... 12
1.5.2 Transativação de EGFR .................................................................................... 13
1.5.3 Via de sinalização Ras / MAPK ....................................................................... 14
1.5.4 Via PI3K / Akt .................................................................................................. 15
1.5.5 Ativação de PKC por segundos mensageiros intracelulares: Ca2+ e IP3 .......... 16
1.5.6 Cálcio como um sinal de morte celular ............................................................. 16
1.5.7 Sinalização de cálcio ativa NF-κB .................................................................... 17
1.6 Mecanismo antitumoral da digoxina ........................................................................... 17
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 21
2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 21
2.2 Objetivos específicos................................................................................................... 21
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 22
3.1 Cultura de células ........................................................................................................ 22
3.2 Preparo dos esteroides cardiotônicos .......................................................................... 23
3.3 Preparo do homogenato de membrana celular ............................................................ 23
3.4 Determinação da atividade ATPásica da Na,K-ATPase ............................................. 24
3.5 Proliferação celular - ensaio de exclusão Trypan Blue ............................................... 24
3.6 Extrato total de células para avaliação da sinalização celular por Immunoblotting .... 25
3.7 Análises de expressão proteica da Na,K-ATPase e Src por Immunoblotting ............. 26
x
3.8 Análises estatísticas.....................................................................................................27
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 28
4.1 Atividade ATPásica da Na,K-ATPase ........................................................................ 28
4.2 Immunoblotting da subunidade α1 da NA,K-ATPase ................................................. 29
4.3 Ensaio de Proliferação celular ..................................................................................... 30
4.4 Immunoblotting da tirosina quinase Src ...................................................................... 31
5. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 334
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 41
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 42
8. ANEXO................................................................................................................................49
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Hallmarks do câncer....................................................................................................2
Figura 2. Estrutura química dos cardenolídeos ouabaína e digoxina..........................................3
Figura 3. Estrutura geral dos esteroides cardiotônicos..............................................................4
Figura 4. Síntese dos benzilidenos digoxina...............................................................................5
Figura 5. Representação da estrutura da Na,K-ATPase.............................................................7
Figura 6. Ciclo de reação da Na,K-ATPase proposto por Post-Albers......................................8
Figura 7. Efeitos da ligação dos esteroides cardiotônicos à Na,K-ATPase...............................9
Figura 8. Proteínas envolvidas na transdução de sinal a partir da ligação dos esteroides
cardiotônicos à Na,K-ATPase atuando como um sinalossoma em cavéolas.............................12
Figura 9. Mecanismo proposto para atividade antitumoral da digoxina..................................18
Figura 10. Imagem de microscópio invertido de células HeLa cultivadas em meio DMEM no
Laboratório de Bioquímica Celular (UFSJ)...............................................................................22
Figura 11. Efeito dos derivados da digoxina na atividade da Na,K-ATPase.............................28
Figura 12. Immunoblotting da subunidade α1 da Na,K-ATPase...............................................29
Figura 13. Ensaio de proliferação celular................................................................................30
Figura 14. Immunoblotting de Src...........................................................................................32
Figura 15. Immunoblotting de Src na presença do inibidor de Src PP2..................................33
Figura 16. Mecanismo de sinalização celular a ser investigado nos próximos estudos..........38
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
1-BD 21-p-metoxi-benzilideno digoxina (p-OMe)
2-BD 21-2,3-diclorobenzilideno digoxina (2,3-Cl)
3-BD 21-p-fluorbenzilideno digoxina (p-F)
4-BD 21-p-dimetilaminobenzilideno digoxina (p-N(CH3)2)
5-BD 21-m-nitrobenzilideno digoxina (m-NO2)
6-BD 21-p-clorobenzilideno digoxina (6-BD) (p-Cl)
ADP adenosina difosfato
Akt (ou PKB - Proteína Quinase B) - serina/treonina quinase
AP-1 ativador de proteína 1
AR receptor de andrógeno
ASK-1 sinal de regulação da apoptose da quinase-1
ATP trifosfato de adenosina
ATPases adenosina trifosfatases
BSA albumina sérica bovina
Ca2+ íon cálcio
CO2 dióxido de carbono
CTS esteroides cardiotônicos
DAG diacilglicerol
DGB5 denominação rotineira de 4-BD (21-p-dimetilaminobenzilideno digoxina)
DMEM meio de cultura (Dulbecco's Modified Eagle's médium)
DMSO dimetilsulfóxido
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF fator de crescimento epidérmico
EGFR receptor do fator de crescimento epidérmico
ER receptor de estrogênio
ERK 1/2 quinase citosílica (MAP quinase) da via Ras-Raf-Mek-Erk
FAK quinase de adesão focal
FXYD proteínas reguladoras da Na,KATPase
FXYD2 subunidade γ da Na,KATPase
GPI glicosilfosfatidilinositol
GSK3 glicogênio sintase quinase-3
HeLa células de carcinoma de colo uterino
xiii
HEPES tampão N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico)
HER elemento responsivo a hipóxia
HIF-1α fator induzido por hipóxia–1
InsP3R receptor de IP3
INCA Instituto Nacional do Câncer
IP3 inositol 1,4,5-trifosfato
JNK membro de MAP quinase
K+ íon potássio
KCl cloreto de potássio
LLC-PK1 linhagem de células renais epiteliais originalmente derivadas de rins de
porco
MAPK proteína quinase ativada por mitógeno
MDCK células epiteliais normais de rim canino
MEK quinase citosílica (MAP quinase-quinase) da via Ras-Raf-Mek-Erk
Mg2+ íon magnésio
MgCl2 cloreto de magnésio
Na+ íon sódio
NaCl cloreto de sódio
Na,K-ATPase adenosina trifosfatase dependente de Na+ e K+ ou bomba sódio-potássio
NCX1 transportador Na+ / Ca2+
NF-κB fator nuclear κB
PBS tampão fosfato salino
p21/CIP1 inibidor de quinase dependente de ciclina1
PDK1 quinase dependente de fosfoinositídeos-1
Pi fosfato inorgânico
PI3K fosfoinositídeo3-quinase ou fosfatidilinositol 3-quinases (PI3-quinases)
PIP2 fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PIP3 fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato
PKA proteína quinase A
PKB proteína quinase B (ou Akt)
PKC proteína quinase C
PLC fosfolipase C
PMSF fenilmetanosulfonilfluoreto (inibidor de serina protease);
PP2 inibidor da via de sinalização de Src- Life Technologies
xiv
PSA antígeno específico da próstata
RAS proteína da via Ras-Raf-Mek-Erk
RAF quinase citosólica (MAP quinase-quinase-quinase) da via Ras-Raf-Mek-
Erk
RKO células de câncer de cólon intestinal humano
ROS espécies reativas de oxigênio
SDS dodecil sulfato de sódio
SFKs quinases da família Src
SOCs supressores fisiológicos de sinalização de citocinas
SP sódio potássio ATPase
Src tirosina quinase Src
c-Src Src total
p-Src Src fosforilada
TGES motivo do domínio atuador da Na,K-ATPase
TRIS tris-hidroximetilaminometano
VEGF fator de crescimento endotelial vascular
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Câncer e quimioterapia
Câncer é o nome dado ao conjunto de doenças onde ocorre um crescimento
descontrolado de células anormais que podem invadir e se espalhar por qualquer parte do corpo,
podendo afetar diferentes órgãos. Os tipos de câncer que mais afetam os homens são pulmão,
próstata, colorretal, estômago e câncer de fígado. Entre as mulheres inclui-se mama, colorretal,
pulmão, colo uterino e estômago (OMS, 2015). Sete milhões de mortes que ocorrem a cada
ano são decorrentes desta doença, correspondendo a 13% das mortes em todo o mundo. Estima-
se que até 2020 haverá entre 15 e 17 milhões de novos casos de câncer a cada ano, dentre eles,
60% estarão em países em desenvolvimento e as taxas de sobrevivência dessas regiões são
frequentemente a metade daquelas dos países desenvolvidos (LÓPEZ-GÓMEZ et al., 2013).
As estimativas realizadas pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) para os anos de 2016 e
2017, preveem que o Brasil deverá registrar 596 mil casos de câncer no próximo ano. Entre as
mulheres, são esperados 300.800 casos, e entre os homens 295.200 casos (INCA, 2016).
O crescimento das células tumorais é determinado pela manifestação de seis alterações
essenciais na fisiologia celular que são comuns a maioria dos tumores humanos e que foram
descritas em 2000 por Hanahan e Weinberg (“The Hallmarks of Cancer”). Elas incluem:
autossuficiência em sinais de crescimento, insensibilidade a sinais antiproliferativos, evasão da
morte celular programada (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada,
e a capacidade de invadir tecidos e gerar metástases (HANAHAN; WEINBERG;
FRANCISCO, 2000). Além destas seis características descritas, Luo et al. descreveram em
2009 características adicionais, referidas como os fenótipos de estresse de cânceres, sendo estes:
estresse metabólico, estresse proteotóxico, estresse mitótico, estresse oxidativo, e estresse ao
dano e replicação do DNA (LUO; SOLIMINI; ELLEDGE, 2009). Em 2011, Hanahan e
Weinberg descreveram ainda mais dois marcadores emergentes: a evasão da destruição pelo
sistema imune e a perda da regulação energética celular (HANAHAN; WEINBERG, 2011). A
Figura 1 mostra o conjunto destas características de uma célula tumoral, chamado de hallmarks
do câncer.
2
A resistência à quimioterapia é o que contribui para o fracasso no tratamento de
pacientes com câncer. As células cancerígenas são capazes de resistir a vários agentes
citotóxicos, pois possuem um conjunto de mecanismos que controlam a resposta aos
quimioterápicos, desenvolvendo assim a resistência durante o tratamento. Atualmente, tem-se
aumentado a busca por quimioterápicos dirigidos a alvos moleculares específicos, com
atividade inibitória contra o alvo e ao mesmo tempo, redução dos efeitos tóxicos inespecíficos
causados pelos antineoplásicos clássicos e tradicionais.
A Na,K-ATPase, com seus ligantes altamente específicos (ou seja, os esteroides
cardiotônicos), tem sido estudada como um possível alvo para vencer a resistência aos
quimioterápicos. Uma variedade de publicações enfatizam a expressão alterada de subunidades
da bomba de sódio em diferentes tecidos cancerígenos, quando comparado aos tecidos normais
correspondentes, sendo considerado portanto, um novo alvo contra diversos tipos de cânceres
(gliomas, melanomas, câncer do pulmão de células não pequenas, câncer do cólon e carcinomas
de células renais) (HANAHAN; WEINBERG, 2011; MIJATOVIC; KISS; REVIEWS, 2013;
MIJATOVIC et al., 2007a).
Figura 1. Hallmarks do câncer
(LUO; SOLIMINI; ELLEDGE, 2009)
3
1.2 Esteroides Cardiotônicos e Síntese dos γ-benzilidenos digoxina
Esteroides cardiotônicos, também conhecidos como digitálicos ou glicosídeos
cardíacos, são um grupo de compostos naturais (a maioria derivados de plantas) capazes de se
ligarem à superfície extracelular da Na,K-ATPase e inibir a sua atividade. As espécies vegetais
mais estudadas são a Neriumoleandere Strophantusgratus da família Apocynaceae (contendo,
respectivamente, a oleandrina e a ouabaína como principais esteroides cardiotônicos) e a
Digitalis purpúrea e Digitalis lanata da família Scrophulariaceae (contendo os esteroides
digitoxina, gitoxina e digoxina como mais abundantes) (Figura 2) (MELERO; MEDARDE;
SAN FELICIANO, 2000).
Em 1785, William Withering descreveu as propriedades e usos medicinais da dedaleira
(Digitalis purpurea) (WITHERING, 1785). Em 1799, John Ferriar descobre a ação direta do
extrato desta planta, conhecido como digitalis, no tecido cardíaco (FERRIAR, 1799). Desde
então, estes compostos têm sido amplamente estudados para o tratamento de doenças
cardiovasculares. A digoxina é um glicosídeo cardíaco isolado da dedaleira, que foi conhecida
como um potente inibidor da bomba Na,K-ATPase presente na membrana celular. Ela é
utilizada há muitos anos no tratamento de várias doenças cardíacas, incluindo insuficiência
cardíaca e arritmia (GHEORGHIADE, 2004; SHIM; LIU, 2014). Estudos recentes vem
mostrando atuações adicionais a estes efeitos conhecidos dos esteroides cardiotônicos na Na,K-
ATPase, envolvendo a transdução de sinais para a regulação de vários processos celulares
importantes e destacando potenciais papeis terapêuticos em muitas doenças, a exemplo do
câncer (PRASSAS; DIAMANDIS, 2008).
Figura 2. Estrutura química dos cardenolídeos ouabaína e digoxina (BAGROV, SHAPIRO;
FEDOROVA, 2009).
4
O interesse nas aplicações terapêuticas dos esteroides cardiotônicos para o tratamento
do câncer começou em 1970 devido à descoberta de que células malignas apresentam um
aumento na permeabilidade de Na+ e na atividade da Na,K-ATPase (SHEN et al., 1978).
Stenkvist e colaboradores observaram que pacientes que faziam uso de esteroides cardiotônicos
para o tratamento da insuficiência cardíaca raramente morriam de câncer. E em 1979,
demonstraram alterações morfológicas em células de câncer de mama de mulheres
mastectomizadas tratadas com digoxina. As células obtidas de mulheres que fizeram o uso de
digitálicos tiveram uma característica mais benigna do que células de pacientes-controle que
não receberam o tratamento (STENKVIST et al., 1980). Após cinco anos da mastectomia, a
recorrência entre as pacientes que não estavam usando digitálicos foi 9,6 vezes maior do que
nas pacientes em tratamento com estes fármacos (STENKVIST et al., 1982).
Quimicamente, os esteroides cardiotônicos possuem um núcleo esteroidal, um anel
lactônico na posição C17β, e pode conter uma porção glicosídica com uma ou mais unidades
de açúcar na posição C3β. Eles são divididos em dois grupos: cardenolídeos e bufadienolídeos
(Figura 3) (MIJATOVIC et al., 2007b).
Figura 3. Estrutura geral dos esteroides cardiotônicos. A lactona define a classe funcional de
cada componente. Cardenolídeos contém um anel insaturado de cinco membros, enquanto
bufadienolídeos contém um anel insaturado de seis membros (PRASSAS; DIAMANDIS, 2008).
5
Novos compostos derivados da digoxina foram sintetizados no Laboratório de Síntese
Orgânica da Universidade Federal de São João Del-Rei Campus Centro-Oeste Dona Lindu,
coordenado pelo Professor Doutor José Augusto Ferreira Perez Villar. A síntese foi realizada a
partir da condensação de aldeídos aromáticos, contendo diferentes grupos terminais na
molécula de digoxina: metoxi (1-BD), cloro (2-BD), flúor (3-BD), dimetilamino (4-BD), nitro
(5-BD) e cloro (6-BD) (Figura 4) (ALVES, 2013; ALVES et al., 2015).
Dos γ-benzilidenos digoxina sintetizados, 21-p-dimetilaminobenzilideno digoxina (4-
BD – também denominado por DGB5 em nosso grupo de pesquisa) foi o esteroide cardiotônico
que apresentou melhor efeito citotóxico contra células de carcinoma de colo uterino (HeLa) e
células câncer de colón intestinal humano (RKO), como demonstrado por nosso grupo em Alves
et al. (2015).
Anel
Lactônico
Figura 4. Síntese dos benzilidenos digoxina. A) Derivados de digoxina propostos neste trabalho
B) Síntese de 1-BD a 6-BD: Z-21-p-metoxi-benzilideno digoxina (1-BD) (p-OMe),
diclorobenzilideno digoxina (2-BD) (2,3-Cl), 21-p-flúorbenzilideno digoxina (3-BD) (p-F), Z-
21-p-dimetilaminobenzilideno digoxina (4-BD) (p-N(CH3)2), 21-m-nitrobenzilideno digoxina
(5-BD) (m-NO2) e 21-p-clorobenzilideno digoxina (6-BD) (p-Cl). Fonte: Adaptado de Alves et
al. (2015).
6
1.3 Na,K-ATPase
A Na,K-ATPase é uma enzima integral da membrana plasmática dependente da
hidrólise do ATP para o transporte ativo dos íons Na+ e K+. Ela é responsável por manter uma
baixa razão Na+/K+ intracelular, garantindo a homeostase iônica e o potencial de membrana.
Também conhecida como “bomba de Na+ e K+”, é um membro da família das ATPases do tipo
P presente em células eucarióticas (SKOU; ESMANN, 1992). A enzima é um heterodímero
composto por dois principais polipeptídios. A subunidade α é um polipeptídio transmembranar
com peso molecular entre 110 e 112 kDa, responsável pela atividade catalítica e pelo transporte
iônico. Existem quatro isoformas já identificadas da subunidade α (α1, α2, α3 e α4). A
subunidade β, também transmembranar, possui três isoformas (β1, β2 e β3). É considerada
essencial para a atividade normal da Na,K-ATPase e contém vários locais de glicosilação, com
peso molecular entre 40 e 60 kDa, dependendo da isoforma tecido-específica e das diferenças
na glicosilação (BLANCO, 2005; JORGENSEN; HÅKANSSON; KARLISH, 2003;
KAPLAN, 2002). A subunidade γ (ou FXYD2) é um pequeno polipeptídio hidrofóbico, de peso
entre 8 e 14 kDa, que interage com a Na,K-ATPase com funções modulatórias, sendo
considerado em alguns tecidos a terceira subunidade desta enzima (CORTES et al., 2011).
Apesar deste polipeptídio não ser essencial para a atividade da enzima, ele influencia no
transporte e propriedades cinéticas da Na,K-ATPase, a exemplo da velocidade máxima (Vmáx),
que é aumentada na presença deste peptídeo sem que ocorra modificação na afinidade (Km)
pelo substrato ATP(MIJATOVIC et al., 2007b).
A combinação das isoformas α e β é expressa de forma específica em cada tecido. A
subunidade α1 associada à β1 é encontrada em praticamente todos os tecidos, sendo a principal
isoenzima encontrada no rim, órgão classicamente utilizado como fonte da Na,K-ATPase para
estudos experimentais (BLANCO; MERCER, 1998; SWEADNER, 1989). A isoforma α2 está
localizada no cérebro (MCGRAIL; JOSEPH M. PHILLIPS, 1991), adipócitos (LYTTONS;
LIN; GUIDOTTI, 1985), coração (ZAHLER, 1992), músculo esquelético (HUNDAL, 1992) e
músculo vascular liso (ZHANG et al., 2005), cartilagem e osso (MOBASHERI et al., 2000a).
A isoforma α3 é expressa principalmente em tecido nervoso (MCGRAIL; JOSEPH M.
PHILLIPS, 1991). A isoforma α4 parece ser específica do testículo (SHULL; GREEB;
LINGREL, 1986). Já a subunidade β2 é expressa em tecido nervoso (PENG; MARTIN-
VASALLO; SWEADNER, 1997), músculo (LAVOIE et al., 1997) e na glândula pineal
(SHYJAN et al., 1990), enquanto a subunidade β3 está presente na retina, fígado, testículos e
pulmão (ARYSTARKHOVA; SWEADNER, 1997).
7
A subunidade catalítica α da Na,K-ATPase possui 10 segmentos transmembranares com
os sítios de ligação específicos para os íons Na+, K+, ATP e os esteroides cardiotônicos (Figura
5). Os segmentos extracelulares de subunidade α formam um local de ligação para esteroides
cardiotônicos (mostrado em vermelho) que inclui as alças TM1-TM2, TM5-TM6, TM7-TM8 e
vários aminoácidos das regiões transmembranares M4, M6 e M10. O local de ligação para o
ATP está localizado no laço intracelular entre o segmento TM4-TM5 (em azul), que constitui
o "bolso" de nucleotídeos. O domínio P (mostrado em laranja) é o domínio responsável pela
fosforilação da enzima; está localizado na extremidade proximal e distal de partes do segmento
intracelular TM4-TM5 e contém uma sequência altamente conservada DKTGT que é um
motivo de fosforilação, usualmente encontrado em outras ATPases do tipo P (SHINODA et al.,
2009). O domínio atuador, especificamente o seu motivo TGES, é responsável pelo processo
Figura 5. Representação da estrutura da Na,K-ATPase. Esteroides cardiotônicos ligam-se à
Na,K-ATPase em sítios formados na parte extracelular da subunidade α, nos segmentos
transmembrana TM1-TM2, TM5-TM6, TM7-TM8 (setas vermelhas). Alguns aminoácidos da
região transmembrana (M4, M6 e M10) também interagem com ouabaína (BAGROV;
SHAPIRO; FEDOROVA, 2009).
8
de desfosforilação da enzima; ele é constituído pelo laço intracelular TM2-TM3 (mostrado em
verde) e pela porção citoplasmática NH2-terminal (BAGROV; SHAPIRO; FEDOROVA,
2009).
A subunidade β é uma proteína transmembranar que interage com um motivo
conservado no laço extracelular TM7-TM8 da subunidade α. E a terceira subunidade da enzima,
a subunidade γ, contém um motivo conservado FXYD para todas as sete proteínas desta família.
A subunidade γ (conhecida como FXYD2) e as outras proteínas desta família, modulam as
propriedades catalíticas da Na,K-ATPase. Apesar de não serem uma parte integrante da bomba
de sódio, estão associadas com domínios específicos do complexo αβ (BAGROV; SHAPIRO;
FEDOROVA, 2009).
O ciclo de reação da Na,K-ATPase baseia-se na mudança de afinidade pelos íons Na+ e
K+, bem como pelo ATP, além da mudança conformacional de toda a enzima para guiar os íons
através da membrana, gerando assim, um gradiente eletroquímico (Figura 6 ).
Inicialmente, os íons Na+ se ligam na forma da enzima E1ATP com alta afinidade, na
presença do cofator Mg2+. Isso gera uma mudança na estrutura tridimensional da proteína para
que a molécula de ATP seja clivada. O ADP é liberado, o Pi fica ligado na enzima em um
Figura 6. Ciclo de reação da Na,K-ATPase proposto por Post-Albers (KAPLAN, 2002).
9
resíduo de aspartato, e os íons Na+ são ocluídos. Para que a enzima mude da conformação E1
para E2, os íons Na+ são liberados para o meio extracelular. E2P liga-se aos íons K+ no meio
extracelular, seguido da liberação de Pi, e os íons K+ são ocluídos. A liberação de dois íons K+
é o passo limitante deste ciclo de reações e pode ser acelerado, em condições fisiológicas, por
altas concentrações de ATP intracelulares. Esta etapa é catalisada pela ligação de outra
molécula de ATP com baixa afinidade, fazendo com a enzima volte à conformação E1
(KAPLAN, 2002).
1.4 Interação dos esteroides cardiotônicos com a Na,K-ATPase
Os moduladores da Na,K-ATPase, como os esteroides cardiotônicos, podem atuar em
dois mecanismos de ação distintos: na inibição do bombeamento de íons e na ativação de uma
cascata de sinalização celular (Figura 7).
Figura 7. Efeitos da ligação dos esteroides cardiotônicos à Na,K-ATPase (BAGROV;
SHAPIRO; FEDOROVA, 2009).
10
Com atuação no bombeamento de íons, o mecanismo pelo qual os esteroides
cardiotônicos levam à inibição da atividade da Na,K-ATPase e afetam a contratilidade cardíaca
é através da ligação específica às alças extracelulares (TM1-TM2, TM5-TM6, TM7-TM8) da
subunidade α (Figura 5). A primeira alça extracelular da subunidade α (aminoácidos de 111 a
122) é o componente mais importante do sítio de ligação aos esteroides cardiotônicos. Alguns
aminoácidos das regiões transmembranares (M4, M6 e M10) também interagem com ouabaína,
sugerindo assim, que uma região hidrofóbica dos esteroides cardiotônicos pode ser inserida na
membrana, auxiliando na interação com a subunidade α (BAGROV; SHAPIRO; FEDOROVA,
2009; BURNS; NICHOLAS; PRICE, 1996; CROYLE; WOO; LINGREL, 1997).
Os esteroides cardiotônicos são específicos e potentes inibidores da Na,K-ATPase, e a
ouabaína possui alta afinidade pela forma E2P desta fosfoenzima (LAURSEN et al., 2015). Em
concentrações terapêuticas, ocorre uma inibição parcial da Na,K-ATPase (aproximadamente
30%) que resulta em um aumento temporário na concentração de Na+ intracelular. Com isso, o
transportador Na+/Ca2+ diminui sua taxa de troca, fazendo com que a concentração de Ca2+
intracelular aumente. O aumento da concentração de Ca2+ citosólico estimula a contratilidade
muscular cardíaca, levando ao efeito ionotrópico. Em doses não terapêuticas (inibição
enzimática maior que 60%), os altos níveis de Na+ e Ca2+ intracelulares resultam em efeitos
tóxicos, demonstrados pelos sintomas de arritmias cardíacas (MELERO; MEDARDE; SAN
FELICIANO, 2000; THOMAS; GRAY; ANDREWS, 1990). A inibição da Na,K-ATPase pelos
esteroides cardiotônicos apresenta também efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos,
resultando em um controle seletivo sobre tumores humanos, mas não na proliferação celular
normal (NEWMAN et al., 2008; WOLLE et al., 2014).
A diferença de sensibilidade da bomba de sódio a uma variedade de esteroides
cardiotónicos, que incluem os cardenolídeos e bufadienolídeos, ocorre devido às diferenças na
sequência de aminoácidos entre as diferentes espécies e isoformas (BLANCO et al., 1999;
MOBASHERI et al., 2000b). A fosforilação da Na,K-ATPase por proteínas quinases também
ocorre de maneira tecido e isoforma específica (BLANCO; MERCER, 1998). A subunidade α1
da Na,K-ATPase pode ser fosforilada por proteínas quinase C (PKC) e proteínas quinase A
(PKA). Esta fosforilação pode inibir a atividade da enzima, seja por redução da atividade de
transporte ou por indução de internalização enzima mediada por clatrina (BERTORELLO et
al., 1991).
11
1.5 Transdução de sinais através dos esteroides cardiotônicos e Na,K-ATPase
A Na,K-ATPase não é só uma bomba de íons, mas também um importante receptor que
é capaz de transduzir sinais a partir da ligação de esteroides cardiotônicos. Além do efeito
ionotrópico, os esteroides cardiotônicos têm sua ação antitumoral a partir da ligação à Na,K-
ATPase, que funciona como um importante receptor capaz de desencadear uma cascata de
sinalização celular (Figura 7 e 8). A enzima atua como um transdutor de sinais através de
interações proteína-proteína, a partir da membrana plasmática para o núcleo, podendo
apresentar semelhanças e diferenças de um tipo celular para outro (XIE; ASKARI, 2002).
Cavéolas são invaginações na membrana plasmática que parecem ser muito importantes
para as vias de sinalização da Na,K-ATPase. São porções da membrana ricas em colesterol,
glicoesfingolipídeos, proteínas ancoradas à membrana por GPI (glycosylphophatidyl-inositol)
e proteínas estruturais, como as caveolinas-1, -2, -3. As caveolinas são responsáveis pela
regulação de diversas moléculas de sinalização celular, e sua desregulação está envolvida na
patogênese de muitas doenças humanas. Vários estudos em cultura de células indicam que a
caveolina-1, a principal proteína constituinte da cavéola, possui papel importante em uma
variedade de cânceres (COHEN et al., 2004). Lisanti e colaboradores foram os primeiros a
descrever o importante papel das cavéolas, e observaram a abundância de moléculas de
sinalização, como proteínas da família Src (LISANTI et al., 1994). Estudos recentes observaram
que a sinalização a partir da Na, K-ATPase pode ocorrer em frações caveolares e não caveolares
de membrana. Em um estudo realizado por Askari e colaboradores, comparando as frações
caveolares e não caveolares de preparações de rim, foi observado que ambas as frações continha
Src, EGFR, PI3K e várias outras proteínas envolvidas na sinalização induzida por estímulos na
Na,K-ATPase, indicando que a sinalização não se limita a frações caveolares de membrana
(LIU et al., 2011).
As principais vias de sinalização celular desencadeadas pelos esteroides cardiotônicos
incluem: EGFR/Src/Ras/MEK/Erk1/2 (ARNAUD-BATISTA et al., 2012; HAAS; ASKARI;
XIE, 2000; HAAS, 2002; KOMETIANI; LIU; ASKARI, 2005a; KULIKOV et al., 2007; TIAN
et al., 2009; XIE; ASKARI, 2002), PI3K (LIU et al., 2004; ZHOU et al., 2001) e
PKC(AIZMAN et al., 2001b; FONTANA et al., 2013; MIYAKAWA-NAITO et al., 2003;
YUAN et al., 2005). E a interação entre a família tirosina quinase Src e Na,K-ATPase vem
sendo estudada como um complexo que funcionaria como um receptor envolvido na
transmissão de sinais (GABLE et al., 2014; JIANG TIAN, TING CAI et al., 2006). As proteínas
envolvidas neste complexo de sinalização celular estão representadas na Figura 8.
12
Figura 8. Proteínas envolvidas na transdução de sinal a partir da ligação dos esteroides
cardiotônicos à Na,K-ATPase atuando como um sinalossoma em cavéolas. Esteroides
cardiotônicos (CTS) estão envolvidos em várias vias de transdução de sinal. Akt, serina-
treonina quinase; AP-1, ativador de proteína 1; ASK-1, sinal de regulação da apoptose da
quinase-1; FAK, quinase de adesão focal; GSK3, glicogênio sintase quinase-3; IP3, inositol
1,4,5-trifosfato; IP3R, receptor de IP3; JNK, membro de MAP quinase; MEK, quinase
citosólica (MAP quinase-quinase) ativando ERK (MAP quinase); NCX1, transportador
Na+/Ca2+; NFκB, fator nuclear κB; PI3K, fosfatidilinositol 3-quinase; PLC, fosfolipase C; Raf,
quinase citosólica (MAP quinase-quinase-quinase); Ras, proteína da via Ras-Raf-Mek-Erk;
ROS, espécies reativas de oxigênio; SOCs, supressor fisiológico de sinalização de citocinas;
Src, tirosina quinase; EGFR, receptor do fator de crescimento epidérmico; SP, sódio potássio
ATPase (SCHONER; SCHEINER-BOBIS, 2007).
13
1.5.1 Tirosina Quinase Src
Quinases da família Src (SFKs) representam a maior família de tirosina quinases não
receptoras de 52 a 62 kDa que interagem diretamente com outras tirosina quinases receptoras,
receptores de esteroides, receptores acoplados a proteína G, ativadores de transcrição,
transdutores de sinal, e moléculas envolvidas na migração e adesão celular. Estas interações
levam a um conjunto diversificado de funções biológicas, incluindo a proliferação, crescimento
celular, diferenciação, morfologia, motilidade, migração, angiogênese, e sobrevivência celular
(WHEELER; IIDA; DUNN, 2009).
A família tirosina quinase Src possui nove membros: LYN, Fyn, LCK, Hck, FGR, BLK,
Yrk, SIM, e c-Src. Destes, c-Src é o mais estudado e mais frequentemente implicado na
oncogênese. O aumento na expressão e na atividade tirosina quinase de SFKs codificadas pelo
proto-oncogene c-Src está associado a um grande número de doenças malignas humanas, como
o desenvolvimento de diversos cânceres humanos e progressão da metástase. Além de aumentar
a proliferação celular, c-Src pode promover a invasão e a motilidade, contribuindo para a
progressão do tumor (YEATMAN, 2004).
Alguns estudos mostram que Na,K-ATPase interage diretamente com Src formando um
complexo receptor. A ligação ocorre nos domínios CD2 e CD3 da subunidade α1 da Na,K-
ATPase, interagindo com os domínios SH2 e os domínios quinase de Src, e mantendo a quinase
Src em um estado inativo (JIANG TIAN, TING CAI et al., 2006; YE et al., 2011). A interação
da ouabaína à Na,K-ATPase, leva a alterações conformacionais na enzima, sendo capaz de
liberar o domínio quinase de Src, levando assim, a sua ativação. A ativação de Src induzida
pela exposição de células intactas a inibidores da Na,K-ATPase, como a ouabaína, foi
primeiramente relatada por Haas et al. (HAAS; ASKARI; XIE, 2000). Estudos subsequentes
mostraram que a ligação da ouabaína aos domínios extracelulares da subunidade α1 leva a
mudanças conformacionais no complexo, conduzindo à ativação de Src associada, que atua
como um transdutor e amplificador de sinal ativando múltiplas cascatas, como a via EGFR /
Src / Ras / Raf / MEK / MAPK (LI; XIE, 2009; LIU; XIE, 2010; YE et al., 2011).
1.5.2 Transativação de EGFR
O EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) é um receptor transmembrana
membro da família de receptores tirosina quinase. Esta família é composta por quatro membros,
EGFR / ErbB1, HER2 / ErbB2, HER3 / ErbB3, e HER4 / ErbB4, que regulam várias funções
14
celulares como o crescimento, a diferenciação, a motilidade, e a sobrevivência celular. A
expressão anormal, ativação, e mutação dos membros da família de EGFR, foram todos
implicados na progressão de vários cânceres (WONG; GUILLAUD, 2004a).
Vários esteroides cardiotônicos, incluindo a ouabaína, podem se ligar à Na,K-ATPase,
ativando uma cascata de sinalização que inclui ativação de c-Src e subsequente fosforilação do
receptor de EGF (chamado de transativação de EGFR), que retransmite os sinais para quinases
citosólicas, exercendo um papel central na transdução de sinais (HAAS, 2002).
A cascata de sinais parece não depender da inibição da ação enzimática da Na,K-
ATPase, e ocorre quando esteroides cardiotônicos se ligam à Na,K-ATPase caveolar na
presença de Src e EGFR (WANG et al., 2004; XIE; ASKARI, 2002). A ligação de esteroides
cardiotônicos à Na,K-ATPase caveolar pode provocar a endocitose do complexo CTS-Na,K-
ATPase-Src-EGFR de modo similar aos receptores tirosina quinase clássicos (LIU; XIE, 2010).
Experimentos utilizando linhagem de células epiteliais e fibroblastos sugerem que Src e EGFR
agem sinergicamente para aumentar a proliferação e invasão celular (BOYER et al., 1997;
TICE et al., 1999). A ouabaína, por exemplo, é capaz de inibir a sinalização do EGFR em
células de meduloblastoma, mas não em células de glioblastoma, e impede a migração celular
induzida por EGF (WOLLE et al., 2014).
Deste modo, após a interação do ligante, os receptores formam homo ou heterodímeros,
ativando assim o domínio tirosina quinase intracelular e ativam outras proteínas que incluem a
Erk1/2 (MAPK) e vias dos fosfoinositídeos-3 (PI3K/Akt), que são conhecidas por desempenhar
papéis fundamentais na proliferação, sobrevivência, e diferenciação celular em fibroblastos e
em células epiteliais (WONG; GUILLAUD, 2004b).
1.5.3 Via de sinalização Ras/MAPK
A via Ras/MAPK é a principal via de sinalização celular associada à transativação de
EGFR. Esta via é capaz de controlar diversas funções celulares, como proliferação celular,
diferenciação, crescimento, migração, morte celular, e atividade neuronal, assim como
promover a angiogênese (OLSON; MARAIS, 2000). Resumidamente, a Na,K-ATPase sofre
uma mudança conformacional após a ligação da ouabaína e ativa a quinase citoplasmática Src
presente no complexo Na,K-ATPase-Src (TIAN, 2006). A ativação de Src induz a
autofosforilação de EGFR, que recruta três proteínas adaptadoras (SHC, GRB2 e SOS) que
induzem a ativação de Ras. Uma vez ativada, Ras leva à ativação subsequente da cascata Raf /
MEK/Erk1/2, como mostrado na Figura 8 (CSEH; DOMA; BACCARINI, 2014; ROSKOSKI,
15
2012). Ensaios realizados com rim de rato isolado mostraram que bufalina (um bufadienolídio
e esteroide cardiotônico) ativa a via Ras / Raf / MEK / Erk1/2 mediada pela Na,K-ATPase com
a pré-ativação de Src (ARNAUD-BATISTA et al., 2012). Um outro estudo investigou o efeito
anticancerígeno de ouabaína e cinobufagina em linhagem de células de hepatoma humano
(HepG2 e SMMC-7721) e observaram que os compostos induziram a paragem do ciclo celular
e inibiram a proliferação das células por meio de inibição da fosforilação da quinase Erk (XU
et al., 2011). Yin e colaboradores revisaram esta divergência demostrando que bufalina tem
efeitos anti-apoptóticos através da ativação ou inibição de MAPK dependente do tipo celular
(YIN et al., 2012).
1.5.4 Via PI3K/Akt
A via de sinalização PI3K/Akt é uma outra parte do complexo de sinalização Na,K-
ATPase, EGFR e Src, sendo a PI3K ligada a uma região rica em prolina da subunidade α
catalítica da Na,K-ATPase (YUDOWSKI et al., 2000). PI3K é uma quinase que fosforila
lipídios de membrana, como o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2). PIP2 forma o
fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) através da adição do fosfato, e este atua em muitas
proteínas de sinalização, como Akt (ou PKB - Proteína Quinase B) e PDK1 (quinase dependente
de fosfoinositídeos-1). Akt ativada leva a ativação de diversas proteínas, controlando a
progressão do ciclo celular e equilíbrio da apoptose, facilitando a proliferação e a migração
celular (SONG; OUYANG; BAO, 2005).
Alguns estudos mostraram que a inibição da Na,K-ATPase ativa PI3K levando a efeitos
diversos. A ligação de esteroides cardiotônicos leva à fosforilação de PI3K e Akt, ativando a
via (EVA; KIRCH; SCHEINER-BOBIS, 2006). A inibição da Na,K-ATPase em células LLC-
PK1 foi capaz de ativar a via PI3K/Akt e inibir a apoptose (ZHOU et al., 2001). Um estudo
recente mostrou que a ativação de PI3K por ouabaína é independente de Src. Estes resultados
em fibroblastos desprovidos de Src mostraram que, se o complexo pré-formado entre Src e
Na,K-ATPase existe, ele não é necessário para a ativação induzida por ouabaína da via PI3K /
Akt através da Na,K-ATPase. Isto é diferente do relatado para a via MAPK, em que Erk1/2 não
foi ativada por ouabaína em células desprovidas de Src, mas foi ativada em células contendo
Src (WU et al., 2013). Em meduloblastoma, foi identificado que embora a ouabaína não afete
diretamente a fosforilação de EGFR e ErbB2, ela inibe a ativação de Erk1/2 e sinalização de
Akt induzida por EGF (WOLLE et al., 2014).
16
1.5.5 Ativação de PKC por segundos mensageiros intracelulares: Ca2+ e IP3
Está bem descrito que a inibição da Na,K-ATPase por esteroides cardiotônicos aumenta
a concentração de [Na+]i, e, consequentemente, aumenta a [Ca2+]i momentaneamente. Além de
atuar no aumento da contratilidade cardíaca, o íon cálcio pode atuar como um segundo
mensageiro intracelular, ativando diversas proteínas quinases, como a proteína quinase C
(PKC). A PKC pode ser ativada por Ca2+ através outros mensageiros intracelulares, como o
diacilglicerol e IP3, via fosfolipase C. A ativação da fosfolipase C leva à hidrólise de PIP2,
liberando os mensageiros intracelulares inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG),
que irão participar na liberação do estoque de Ca2+ intracelular do retículo endoplasmático e
posteriormente levar à ativação de PKC (CARPENTER; JI, 1999).
A PKC pertence à família serina/treonina quinases e quando ativada, se liga e fosforila
diversas proteínas, como proteínas do citoesqueleto, enzimas e proteínas nucleares que regulam
a expressão de genes, desempenhando um papel importante no controle da divisão, crescimento
celular e angiogênese. Já foi descrito que o efeito dos esteroides cardiotônicos pode levar a um
aumento na concentração de Ca2+ que é capaz de inibir o crescimento de células tumorais
através da indução da apoptose, causando a liberação de citocromo C e a ativação da cascata de
caspases (MCCONKEY et al., 2000).
1.5.6 Cálcio como um sinal de morte celular
Sabe-se que sinais de Ca2+ governam uma série de funções celulares vitais e, portanto,
são necessários para a sobrevivência da célula. No entanto, estudos recentes têm enfatizado o
papel crucial do íon Ca2+ na regulação da morte celular. É bem estabelecido que a sobrecarga
celular de Ca2+, ou a perturbação da concentração de Ca2+ intracelular compartimentalizado,
pode provocar citotoxicidade e levar à sinalização da morte celular não só por apoptose, mas
também através de outras modalidades de morte celular, incluindo necrose, autofagia ou
anoikis. Assim, a morte celular pode ser provocada por uma perda do controle homeostático do
Ca2+, mas também pode ser desencadeada por alterações sutis de Ca2+ no interior de
compartimentos intracelulares. O estresse causado pelo esgotamento de Ca2+ do retículo
endoplasmático, ou alterações nos sistemas de transporte do Ca2+, pode ser ligada diretamente
à ativação caspases no processo de morte celular por apoptose (ZHIVOTOVSKY; ORRENIUS,
2011).
17
1.5.7 Sinalização de cálcio ativa NF-κB
A ativação do fator de transcrição NF-κB ocorre subsequentemente à ativação de Src e
oscilações de [Ca2+]i decorrentes da inibição da Na,K-ATPase por esteroides cardiotônicos. A
via de sinalização desencadeada pela ligação da ouabaína à Na,K-ATPase inclui a ativação de
Src, transativação de EGFR, ativação de Ras, que conduz à abertura de canais de potássio
mitocondrial sensíveis a ATP, resultando na produção de ROS, e posteriormente ativando
NF-κB. (XIE; ASKARI, 2002). O fator de transcrição NF-κB está envolvido em processos
relacionados ao crescimento, diferenciação, respostas imunológicas e de genes que modulam a
apoptose (NAKANISHI; TOI, 2005; SCHONER; SCHEINER-BOBIS, 2007).
Estudos do grupo de Anita Aperia mostraram que concentrações nanomolares de
ouabaína, que causam uma inibição parcial da Na,K-ATPase, levam a lentas oscilações do
cálcio intracelular, e subsequentemente à ativação de NF-κB, protegendo as células da
apoptose. Já em altas concentrações de esteroides cardiotônicos, ocorre um aumento sustentado
de [Ca2+]i, conduzindo a célula à apoptose. Essa geração de oscilações de [Ca2+]i que ocorre
após a ligação da ouabaína à Na,K-ATPase é dependente de uma associação entre Na,K-
ATPase e o receptor de IP3 (InsP3R), em um microdomínio funcional de sinalização
(AIZMAN et al., 2001a; FONTANA et al., 2013; MIYAKAWA-NAITO et al., 2003).
1.6 Mecanismo antitumoral da digoxina
A digoxina é o esteroide cardiotônico mais estudado como um possível antitumoral, e
mecanismos de ação para este efeito já foi proposto, como podemos observar na Figura 9.
A ligação de glicosídeos cardíacos à Na,K-ATPase sugere a ativação da tirosina quinase
Src e transativação do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), o que conduz à
fosforilação de Erk1 e Erk2, reguladas por sinais extracelulares. Estes efeitos resultam em um
aumento do nível do inibidor do ciclo celular p21/CIP, levando à interrupção do crescimento
em células cancerígenas. Digoxina e digitoxina em concentrações próximas aos níveis
plasmáticos terapêuticos tem efeitos em Erk 1/2 e na proliferação celular semelhantes aos
observados com ouabaína (KOMETIANI; LIU; ASKARI, 2005b; SHIM; LIU, 2014).
Além destes efeitos já descritos anteriormente, a digoxina inibe a via de sinalização do
receptor de andrógeno (AR). A inibição de AR impede que ele se ligue ao elemento responsivo
de AR (ARE), levando a uma diminuição de genes alvo de AR, tais como o PSA (antígeno
18
específico da próstata) nas células de câncer de próstata. A digoxina também inibe a síntese de
HIF-1α, reduzindo assim a ligação do elemento responsivo a hipóxia (HER) e suprimindo a
expressão de genes alvos de HIF-1α, tais como VEGF em células cancerosas (SHIM; LIU,
2014). A digoxina induz a parada do ciclo celular e apoptose dependente da inibição da
expressão de HIF-1α. Foi relatado que a digoxina e glicosídeos cardíacos afetam várias vias de
sinalização, o que sugere que os efeitos anticancerígenos da digoxina em células de câncer de
próstata podem ser multifatoriais (ZHANG et al., 2008).
Vários estudos investigaram se a terapia baseada em glicosídeos cardíacos poderia afetar
a incidência de tumores hormônio-sensíveis (MENGER et al., 2013). Alguns autores tem
sugerido que os glicosídeos cardíacos podem exercer efeitos antineoplásicos não apenas em
virtude da sua capacidade para inibir a Na,K-ATPase, mas também de atuar como antagonistas
do receptor de estrogênio (ER) (CHEN et al., 2006).
Acreditava-se que a digoxina suprimia o câncer de mama interferindo na sinalização do
receptor de estrogênio (ER) nas células malignas, suprimindo assim o crescimento do câncer
Figura 9. Mecanismo proposto para atividade antitumoral da digoxina (Adaptado de SHIM;
LIU, 2014)
19
de mama. Estudos subsequentes que avaliaram a associação entre esteroides cardiotônicos e a
incidência de câncer de mama foram contraditórios, mostrando que a população que estava em
tratamento com digitoxina, outro glicosídeo cardíaco, tinha uma maior incidência de câncer em
comparação com a população em geral, mas esta associação deve ser atribuída a fatores
subjacentes à indução e/ ou promoção do câncer e doenças cardiovasculares e não ao real uso
de digitálicos (HAUX et al., 2001). Mais recentemente, evidências contra estas conclusões
foram levantadas na literatura. O uso de digoxina, durante pelo menos 1 ano, tem sido associado
a um aumento do risco de câncer de mama invasivo em mulheres pós-menopausa (AHERN et
al., 2008). Entre os usuários de digoxina, houve maior risco de desenvolver câncer de mama
ER-positivo do que câncer de mama ER-negativos, e a digoxina imita o mecanismo do
estrogênio em mulheres idosas que provavelmente tinham baixos níveis de estrogênio natural.
O risco normalizou quando foi interrompido o uso de digoxina (BIGGAR et al., 2011). Estes
dados sugerem que a digoxina, em determinadas condições, pode atuar de forma semelhante a
uma molécula de estrogênio em vez de um anti-estrogênio em mulheres, aumentando assim o
risco de câncer de mama ER-positivo (SHIM; LIU, 2014).
O câncer de colo do útero e ovários não é estabelecido como fortemente sensível ao
estrogênio como o câncer de útero. Em um estudo avaliando estes três cânceres ginecológicos,
foi constatado que os riscos de câncer do útero foram significativamente aumentados em
mulheres em uso de digoxina e, possivelmente, em ex-usuárias. Em contraste, a incidência de
cânceres de ovário ou de colo do útero não estavam aumentados em usuárias de digoxina
(BIGGAR; WOHLFAHRT; MELBYE, 2012).
A digoxina foi identificada como um dos inibidores mais potentes da proliferação de
células de câncer de próstata. Um estudo demostrou que a digoxina reduziu significativamente
a incidência de câncer de próstata em 25% dos homens (PLATZ et al., 2011). Além disso, a
digoxina (e outros glicosídeos cardíacos) levou à diminuição da secreção do antígeno específico
de próstata (PSA) de células de câncer de próstata dependentes do receptor de andrógeno (AR)
(JUANG et al., 2010). Os estrógenos suprimem os níveis de andrógenos e inibem o crescimento
do câncer de próstata, sugerindo que o efeito estrogênico da digoxina é benéfico para o
tratamento de cânceres dependentes de andrógeno, tais como o de próstata (BIGGAR, 2012).
Ainda não se sabe como a digoxina mostrou efeitos opostos entre câncer de mama e
câncer de próstata. O fato da digoxina aumentar o risco em apenas cânceres sensíveis a
estrogênios sugere que o mecanismo de promoção do tumor é mediado através de seu efeito
estrogênico. No entanto, é evidente que a digoxina tem um efeito benéfico sobre certos tipos de
cânceres, e vários ensaios clínicos são realizados para o tratamento do câncer, como
20
monoterapia ou em combinação com outras drogas de quimioterapia (BIGGAR;
WOHLFAHRT; MELBYE, 2012; SHIM; LIU, 2014)
Várias vias de sinalização ativadas por esteroides cardiotônicos estão envolvidas na
proliferação, progressão do tumor e metástase, levando a uma perspectiva interessante para o
estudo da relação entre a Na,K-ATPase e o câncer. Importantes vias de sinalização celular são
moduladas por Na,K-ATPase, e o potencial de modificação química dos esteroides
cardiotônicos está em estudo para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer (DHALLA,
2016). Diante dos diversos efeitos antitumorais que os esteroides cardiotônicos (em especial a
digoxina) podem causar, o presente estudo justifica-se pela importância de se avaliar os efeitos
celulares dos novos derivados da digoxina, que estão em fase inicial de seus ensaios biológicos,
afim de atuarem como possíveis antitumorais.
21
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar o efeito de novos esteroides cardiotônicos sintéticos derivados da digoxina
na sobrevivência de células de câncer de colo uterino (HeLa) e avaliar se há correlação do efeito
antitumoral com a atividade da Na,K-ATPase e Src quinases.
2.2 Objetivos específicos
Realizar avaliação cinética da atividade da Na,K-ATPase frente aos esteroides cardiotônicos
1-BD, 2-BD, 3-BD, 4-BD, 5-BD, 6-BD e digoxina em células HeLa intactas;
Analisar o conteúdo de Na,K-ATPase por Immunoblotting após o tratamento com 4-BD e
digoxina;
Avaliar o efeito antiproliferativo de concentrações crescentes de 4-BD nas células HeLa;
Analisar o conteúdo de Src por Immunoblotting após tratamento com concentrações
crescentes de 4-BD.
Analisar o conteúdo de Src por Immunoblotting na presença do inibidor da proteína quinase
Src (PP2) e 4-BD.
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cultura de Células
A linhagem celular utilizada no estudo foi de carcinoma de colo de útero (HeLa)
adquirida do ATCC [ATCC®CCL-2TM] (Figura 10). Para manutenção e crescimento, as
células foram cultivadas em meio de cultura DMEM estéril suplementado com 10 % (v/v) de
soro fetal bovino, 60 μg/mL de estreptomicina e 100 μg/mL de penicilina ou 0,1% de
gentamicina. As células foram mantidas em frascos de cultura estéreis de 75 cm2 ou 25 cm2 em
estufa a 37 ºC, em atmosfera umedecida com 5 % de CO2. Para manutenção dos nutrientes
necessários à proliferação celular ideal, o meio de cultura foi descartado, as células lavadas com
tampão PBS estéril [pH=7,4] (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e PO43- 10 mM) e reincubadas com
meio novo, numa periodicidade de 2 dias.
No repique celular, o meio de cultura foi descartado, as células foram lavadas com PBS,
incubadas com tripsina 0,025 % por 3 minutos a 37 ºC em atmosfera umedecida de 5 % de CO2,
e novo meio de cultura foi adicionado para cessar a ação da tripsina. Posteriormente, a
suspensão celular foi centrifugada por 5 minutos a 1.063 g (ou 2.400 rpm - centrífuga Macro
IV EV:025 – EVLAB), o sobrenadante descartado, e o pellet ressuspendido em meio de cultura.
Para a padronização do número de células em cada procedimento experimental uma alíquota
da suspensão celular foi retirada e diluída 1:1 em azul de Tripan para a contagem das células
em câmara de Neubauer.
Figura 10. Imagem de microscópio invertido de células HeLa cultivadas em meio DMEM no
Laboratório de Bioquímica Celular (UFSJ).
40 X
23
3.2 Preparo dos esteroides cardiotônicos
A digoxina e os novos esteroides cardiotônicos foram sintetizados pelo Prof. Dr. José
Augusto Ferreira Perez Villar e sua aluna Silmara Lúcia Grego Alves, ambos do Laboratório
de Síntese Orgânica da UFSJ. A síntese e estruturas moleculares estão descritas em detalhes na
dissertação S. L. G. Alves e no artigo publicado por nosso grupo de pesquisa (ALVES, 2013;
ALVES et al., 2015). Os compostos foram preparados a partir de uma diluição dos produtos da
síntese, primeiramente em 100 % de DMSO (solução estoque) e posteriormente em tampão
PBS autoclavado ou meio de cultura. Durante o tratamento, as drogas foram diluídas afim de
manter uma concentração de, no máximo, 1 % de DMSO nas células, para que estas não
sofressem as ações tóxicas deste solvente. As soluções estoques foram preparadas e mantidas a
-20 °C.
3.3 Preparo do homogenato de membrana celular
Foram cultivadas 2,5x106 células em garrafas de cultivo de 75 cm2, onde as células
ficaram em crescimento até atingirem a confluência. Posteriormente, o meio de cultura foi
renovado e as células foram tratadas com digoxina a 150 nM durante 24 h de exposição, ou
com os seus derivados 1-BD, 2-BD, 3-BD, 4-BD, 5-BD e 6-BD nas concentrações de 150 nM
e 10 μM por 24 h, em condições estéreis. Após o período do tratamento o meio de cultura
contendo os esteroides cardiotônicos foi retirado das garrafas de cultivo. As células foram
lavadas três vezes com PBS gelado e removidas utilizando um “scraper rubber policeman”
(rodo para células em cultura) na presença de tampão de preparação de membrana (Tris 6 mM
[pH=6,8], imidazol 20 mM, sacarose 0,25 M, SDS 0,01 %, EDTA 3 mM e PMSF 2 mM). As
células foram maceradas em homogeneizador de tecidos tipo Potter Elvehjem (MARCONI) por
10 vezes, estando o potter inserido em gelo. Em seguida, estas foram sonicadas em disruptor de
células ultra-sônico (UNIQUE) em gelo por 10 segundos a 45 % de potência e descansadas
ainda em gelo por 5 segundos. O volume foi fracionado em eppendorfs e submetido à
centrifugação a 17.990 g (ou 14.000 rpm - microcentrífuga refrigerada CT-15000R -
CIENTEC) por 1 hora e 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido com 300 μL de tampão de preparação de membrana. Por fim, o conteúdo final
foi sonicado por 10 segundos a 25 % de potência até completa solubilização do homogenato.
24
3.4 Determinação da atividade ATPásica da Na,K-ATPase
O homogenato de membrana celular foi submetido primeiramente à dosagem de
proteínas pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). Depois a atividade ATPásica foi
determinada pela quantificação do fosfato inorgânico (Pi) liberado pela hidrólise de ATP pela
Na,K-ATPase, usando o método colorimétrico de Fiske (FISKE, 1925). A atividade da Na,K-
ATPase foi realizada em meio contendo Hepes 50 mM, NaCl 120 mM, KCl 20 mM, MgCl2 4
mM e ATP 3 mM. Os experimentos foram realizados em placas de ELISA de 96 poços. A
mesma quantidade de proteínas foi adicionada em cada poço (em média 17 µg de proteína), e
todos os ensaios foram realizados na presença e ausência do inibidor ouabaína (1 mM),
podendo-se assim descartar a atividade das outras enzimas presentes na fração de membrana.
A ouabaína foi incubada previamente com a enzima por 20 minutos à temperatura ambiente. A
reação enzimática foi iniciada com a adição de meio reacional contendo 3 mM de ATP, e a
placa foi incubada em estufa a 37 ºC por uma hora. Após o tempo de incubação, foi adicionado
100 μL de SDS 1 % sem fosfato em cada poço para parar a reação. Em seguida, foi adicionado
100μL da solução de molibdato de amônio/reagente de Fiske na proporção 5:1, que foi
preparada no momento do uso, por ser fotossensível. Após a adição da solução foram
aguardados 15 minutos para ocorrer a complexação do Pi, e em seguida as placas foram lidas
em leitor de placas (Biotek® - Power Wave XS2) em um comprimento de onda de 660 nm.
3.5 Proliferação celular - ensaio de exclusão Trypan Blue
O ensaio de exclusão do corante Trypan blue foi usado para determinar o número de
células viáveis presentes na suspensão celular. Este baseia-se no fato das células inviáveis
permitirem a entrada do corante, por apresentarem danos na membrana celular, adquirindo
assim, coloração azul no citoplasma. As células viáveis permanecem translúcidas, pois o
corante é impermeável a membranas intactas. Esta técnica detecta as células que possuem danos
na membrana celular, avaliando a morte celular e permitindo a contagem de viabilidade
reduzida (STROBER, 2001).
Foram cultivadas 2x105 células por poço, em placas de 6 poços, por 24 horas, que em
seguida foram tratadas com concentrações crescentes de 21-p-dimetilaminobenzilideno
digoxina (4-BD) por diferentes tempos de tratamento: 10 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM e 1
µM, por 24, 48, 72 e 96 horas. O meio de cultura foi renovado após 48 horas de tratamento e
25
novo meio foi adicionado no poço controle, sem tratamento. Após os tempos de tratamento, o
meio de cultura foi retirado e adicionado 500 µL de tripsina 0,025 % sobre a camada de células
confluentes; estas foram incubadas a 37 °C e atmosfera de 5 % de CO2 por 5 minutos. Após as
células se soltarem completamente da placa, pela ação da tripsina, foram adicionados 2 mL de
meio de cultura suplementado com 10 % de soro fetal bovino, e centrifugadas por 5 minutos a
1.063 g (ou 2.400 rpm - centrífuga Macro IV EV:025 – EVLAB). O pellet foi ressuspendido
em 500 µL de meio de cultura e uma alíquota foi retirada para diluição 1:1 em azul de Trypan
(50 µL da suspensão celular + 50 µL da solução Trypan blue 0,4 %) sendo estes
homogeneizados. A câmara de Neubauer foi preenchida com esta solução para a realização da
contagem das células viáveis em microscópio, afim de avaliar o potencial antiproliferativo da
4-BD.
3.6 Extrato total de células para avaliação da sinalização celular por Immunoblotting
Foram cultivadas 5x105 células HeLa, em placas de 6 poços, até atingir a confluência
(aproximadamente 48 horas). O meio de cultura foi renovado para um meio sem adição de soro
fetal bovino por 24 horas e as células foram submetidas a concentrações crescentes de 21-p-
Dimetilaminobenzilideno digoxina (4-BD): 10 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM e 1 µM por 15
minutos de tratamento. Um poço foi mantido sem o tratamento, nas mesmas condições dos
meios de cultura utilizados. Para a avaliação do efeito de 4-BD na expressão de Src as células
foram pré-tratadas com PP2 (Life Technologies- inibidor potente e seletivo das tirosina quinases
da família Src. Utilizado para sondar o envolvimento de Src na sinalização celular) por uma
hora e posteriormente tratadas com 4-BD por 15 minutos nas mesmas concentrações citadas
acima.
Após o tempo de tratamento, o meio de cultura foi retirado de cada poço da placa e as
células foram lavadas duas vezes adicionando-se 1mL de solução PBS gelado. Foram
adicionados 70 µL de tampão de lise (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Na3VO4 1
mM, PMSF 1 mM, Triton x-100 1 % e deoxicolato de sódio 0,25 %), e as células foram raspadas
com “scraper rubber policeman” (rodo para células em cultura), transferidas para eppendorfs
e incubadas em gelo por 15 minutos, com intervalos de agitação de 5 minutos em vórtex mixer.
A suspensão celular foi centrifugada a 14.000 g (12.356 rpm - microcentrífuga refrigerada CT-
15000R - CIENTEC) por 15 minutos a 4 °C, e o sobrenadante recolhido e utilizado para
dosagem de proteína pelo método de Bradford (1976) e Western Blotting.
26
3.7 Análises de expressão proteica da Na,K-ATPase e Src por Immunoblotting
Para a análise da expressão da enzima Na,K-ATPase e da proteína Src, as amostras de
extrato total de células e homogenato de membrana, respectivamente, foram preparadas para a
corrida em um gel de eletroforese. Cada amostra foi diluída em água MiliQ ultrapura e tampão
de amostra (Tris-HCl 0,125 mM [pH=6,8], Azul de Bromofenol 0,004 %, 2-Mercaptoetanol
10 %, Glicerol 20 %, e SDS 4 %) para uma concentração fixa de proteína.
Posteriormente, as amostras foram corridas em um gel de poliacrilamida 10 % e gel de
empacotamento 4 %. Foram aplicados 16 µg de proteínas do homogenato de membrana no gel
para a avaliação do conteúdo da Na,K-ATPase e 30 µg de proteína para a avaliação de Src.
As proteínas do gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose por 2 horas. A eficiência da transferência foi avaliada corando-se o gel de
poliacrilamida com solução de Azul de Coomassie Brilhante G-250, e a membrana de
nitrocelulose com solução de vermelho Ponceau Xilidina.
Para bloquear ligações inespecíficas dos anticorpos que foram utilizados, a membrana
de proteínas não fosforiladas, como a Na,K-ATPase e c-Src, foi bloqueada por 1 hora com leite
desnatado 5% diluído em T-TBS (Tris-Base 100 mM, NaCl 0,9 % e Tween 0,1 %), e a
membrana de proteínas fosforiladas, como a p-Src, foi bloqueada com BSA 5% diluído em T-
TBS.
Posteriormente, a membrana foi lavada duas vezes por 5 minutos com T-TBS e incubada
overnight com anticorpo primário anti-α1 da Na,K-ATPase (sc-21712 - SANTA CRUZ) diluído
1:1000, anti-p-Src (ab32078 - abcam®) diluído 1:500, e anti-c-Src (sc-8056 - SANTA CRUZ)
diluído 1:500. Todos os anticorpos foram diluídos em T-TBS.
No dia seguinte, a membrana foi lavada três vezes por 10 minutos, e incubada por 2
horas com anticorpo secundário anti-mouse (sc-2005 - Goatanti-mouseIgG-HRP – SANTA
CRUZ), diluído 1:2000 para a Na,K-ATPase e 1:500 para Src. Após a incubação, a membrana
foi lavada duas vezes, por 5 minutos, e revelada por método de quimioluminescência utilizando
uma mistura equimolar de duas soluções (Solução 1: Tris 100 mM [pH=8,5], Luminol 2,5 mM
e ácido p-cumárico 0,396 mM; Solução 2: Tris 100 mM [pH=8,5] e H2O2 0,06 %). Após a
exposição à mistura, a membrana foi revelada em filme radiográfico (Medical X-rayFilm-
KODAK). Os filmes radiográficos foram digitalizados, e as bandas correspondentes a cada
amostra foram quantificadas por densitometria, utilizando-se o programa Image J 1.47.
27
3.8 Análises estatísticas
As análises estatísticas e os todos gráficos deste trabalho foram realizadas utilizando-se
o programa GraphPad Prism 5 (Prism®, GraphPad Software Inc., versão 5). Foi utilizado o
teste One-way ANOVA (Analysis of Variance) para comparação de mais de duas médias ou o
teste Two-way ANOVA para comparação de mais de duas médias quando duas ou mais
variáveis interferissem na resposta. O teste posterior de Dunnet (Dunnet’s post-hoc test) ou de
Tukey (Tukey’s post-hoc test) para identificação das médias com diferença estatisticamente
significante foi utilizado em todas as análises envolvendo o teste One-way ANOVA, enquanto
o teste posterior de Bonferroni (Bonferroni post-hoc test) para identificação das médias com
diferença estatisticamente significante foi utilizado em todas as análises envolvendo o teste
Two-way ANOVA. Os resultados foram expressos em média e erro padrão da média e foram
estabelecidos p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), p < 0,0001(***); e n representa o número de
experimentos independentes.
28
4. RESULTADOS
4.1 Atividade ATPásica da Na,K-ATPase
A atividade da Na,K-ATPase foi realizada a partir de homogenato de membrana de
células HeLa tratadas por 24 horas com os esteroides cardiotônicos 1-BD, 2-BD, 3-BD, 4-BD,
5-BD, e 6-BD, nas concentrações de 150 nM ou 10 µM ou com digoxina a 150 nM. De todos
os novos esteroides cardiotônicos testados, 4-BD foi o único capaz de induzir uma inibição
significativa na atividade da enzima nas duas concentrações testadas (Figura 11). A redução da
atividade por 4-BD a 150 nM foi em torno de 60 % quando comparado ao controle (sem
tratamento), sendo similar à observada pela digoxina (com redução de 64 %). Na maior
concentração de 4-BD (10 µM) ocorreu uma inibição de 96 % da atividade da enzima.
0
2
4
6
150 n
M
10M
150 n
M
10M
150 n
M
10M
150 n
M
10M
150 n
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150 n
M
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Contr
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1-BD 2-BD 3-BD 4-BD 5-BD 6-BD
**
***Ativ
idade d
a N
a,K
-AT
Pase
(nm
ol P
i/m
in/m
g)
Figura 11. Efeito dos derivados da digoxina na atividade da Na,K-ATPase. Células HeLa foram
incubadas com os esteroides cardiotônicos por 24 h nas concentrações de 150 nM ou 10 μM. A
atividade da Na,K-ATPase foi expressa em nmol de Pi/min/mg de proteína de homogenato de
membrana celular. As diferenças estatisticamente significantes foram avaliadas pelo teste One-
way ANOVA com teste posterior de Dunnett (* = p < 0,05; *** = p < 0,0001); n = 3-5.
29
4.2 Immunoblotting da subunidade α1 da NA,K-ATPase
Como 4-BD foi o único esteroide cardiotônico capaz de inibir significativamente a
atividade da Na,K-ATPase, realizamos um Immunoblotting afim de verificar se seu efeito na
redução da atividade poderia estar relacionado à diminuição da expressão da enzima. Pode-se
observar pela Figura 12 que não houve alteração significativa da expressão da subunidade α1
da Na,K-ATPase no homogenato de membrana de células HeLa tratadas com 150 nM de
digoxina ou 4-BD nas concentrações de 150 nM ou 10 µM por 24 horas.
Contr
ole
Dig
oxina
150n
M
4-BD 1
50nM M
4-BD 1
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1)
(Tra
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Figura 12. Immunoblotting da subunidade α1 da Na,K-ATPase. Efeito de digoxina e 4-BD na
quantidade da subunidade α1 da Na,K-ATPase de homogenato de membrana de células HeLa
tratadas durante 24 horas, em 3 experimentos independentes. Linha 1: Controle (16 ug); linha
2: digoxina (150nM) (16 ug); linha 3: 4-BD (150nM) (16 ug); linha 4: 4-BD (10μM) (16 ug).
Figura 13.Immunoblotting da subunidade α1 da Na,K-ATPase. A) Efeito de digoxina e 4-BD
na expressão da subunidade α1 da Na,K-ATPase de homogenato de membrana de células HeLa
30
4.3 Ensaio de Proliferação celular
Como a atividade da Na,K-ATPase mostrou-se reduzida na presença de 4-BD e em
resultados prévios de nosso grupo este composto foi o que apresentou maior efeito citotóxico
em células de carcinoma de colo uterino (HeLa) e células de câncer de cólon intestinal humano
(RKO), avaliamos também se 4-BD poderia estar afetando a proliferação de células HeLa.
Figura 13. Ensaio de proliferação celular. Células HeLa foram tratadas por A) 24 horas; B) 48
horas; C) 72 horas; e D) 96 horas com concentrações crescentes de 4-BD. O número de células
foi obtido por ensaio de exclusão de Trypan Blue. Os resultados foram avaliados por One-way
ANOVA com teste posterior de Dunnett (* = p <0,05) n=4.
24 h
Contr
ole
10 n
M
100
nM
250
nM
500
nM M1
0
50
100
150
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4-BD
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ração
Cé
lula
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48 h
Contr
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10 n
M
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nM
250
nM
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0
50
100
150
*** *** ***
*
4-BD
Pro
life
ração
Cé
lula
s/m
L (
% d
o c
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tro
le)
72 h
Contr
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10 n
M
100
nM
250
nM
500
nM M1
0
50
100
150
*** *** ***
4-BD
Pro
life
ração
Cé
lula
s/m
L (
% d
o c
on
tro
le)
96 h
Contr
ole
10 n
M
100
nM
250
nM
500
nM M1
0
50
100
150
******
***
***
***
4-BD
Pro
life
ração
Cé
lula
s/m
L (
% d
o c
on
tro
le)
A) B)
C) D)
31
Para isso, selecionamos diferentes concentrações de 4-BD (na faixa de nano a micromolar) para
serem testadas de 1 a 4 dias (24 a 96 horas), afim de avaliar o efeito na proliferação das células
HeLa.
A Figura 13 mostra que a proliferação das células HeLa foi significativamente reduzida
na presença de diferentes concentrações de 4-BD e em diferentes tempos de exposição ao
tratamento. Nos tempos de 24 e 72 horas pode-se observar que as maiores concentrações de 4-
BD (250 nM, 500 nM e 1 µM) reduziram significativamente a proliferação das células HeLa
quando comparada ao controle, sem o tratamento. Em 48 horas esta redução significativa
ocorreu a partir de 100 nM. Enquanto em um maior tempo de exposição ao tratamento (96
horas), todas as concentrações de 4-BD testadas foram capazes de reduzir a proliferação celular
em uma curva dose-resposta.
4.4 Immunoblotting da tirosina quinase Src
Visto que a Na,K-ATPase pode estar interligada a diversas vias de sinalização celular
iniciadas pela interação dos esteroides cardiotônicos, a primeira proteína da cascata de
sinalização celular que estudamos foi a tirosina quinase Src. Iniciamos nossas investigações
realizando um imunnobloting de extrato total de células HeLa tratadas por 15 minutos com
diferentes concentrações de 4-BD afim de analisar a atividade de Src. A atividade de Src foi
observada através da relação entre Src fosforilada e Src total (p-src/c-src).
Observa-se na Figura 14 que todas as concentrações do esteroide cardiotônico 4-BD
ocasionaram uma diminuição significativa na proporção de Src fosforilada em relação ao
controle, com exceção da concentração 10 nM, que apresentou diferença significativa apenas
quando comparado à maior concentração de 4-BD (1 µM).
Afim de comparar este efeito inibitório de 4-BD na atividade de Src com o efeito de
inibidores específicos de Src, e avaliar se poderia estar ocorrendo um sinergismo entre 4-BD e
o inibidor de Src, o imunnobloting para Src também foi realizado utilizando células HeLa
tratadas com um inibidor específico de Src (PP2) por uma hora (Figura 15). Na presença de
5 µM ou 10 µM do inibidor PP2, a quantidade de Src fosforilada foi significativamente
diminuída quando comparada ao controle. Observamos que 250 nM de 4-BD sozinho também
foi capaz de causar um efeito inibitório da fosforilação em Src. Outro grupo celular foi tratado
previamente com o inibidor de Src por uma hora e posteriormente tratado com 250 nM de
4-BD por 15 minutos. Ao adicionar 4-BD nas células previamente tratadas com 5 µM de PP2,
32
a quantidade de Src fosforilada foi similar à do tratamento com 4-BD sozinho, com uma redução
de aproximadamente 50% no conteúdo de Src fosforilada quando comparado ao controle. No
tratamento com 10 µM do inibidor PP2 e 250 nM de 4-BD não houve diferenças significativas
em relação ao controle.
Contr
ole
10 n
M
100
nM
250
nM
500
nM1
uM
0.0
0.5
1.0
1.5
* * **
#
#
4-BD
pS
rc/S
rc
(% d
o c
on
tro
le)
Figura 14. Immunoblotting de Src. Efeito de 4-BD no conteúdo de Src (pSrc) em extrato total
de células HeLa tratadas por 15 minutos com concentrações crescentes de 4-BD. Os resultados
com diferenças significantes foram avaliados por One-way ANOVA com teste posterior de
Tukey (* = p < 0,05) (# = p < 0,05 - diferentes entre si) n=4.
33
0.0
0.5
1.0
1.5
**
**
4-BD 250 nM - + - - + +
PP2 5M - - + - + -
PP2 10M - - - + - +
pS
rc/S
rc
(% d
o c
on
tro
le)
Figura 15. Immunoblotting de Src na presença do inibidor de Src PP2. Efeito de 4-BD no
conteúdo de Src (pSrc) em extrato total de células HeLa tratadas por 1 hora com inibidor de
Src (PP2) e posteriormente tratadas com 250 nM de 4-BD por 15 minutos. As diferenças
estatisticamente significantes foram avaliadas pelo teste One-way ANOVA com teste posterior
de Tukey (** = p < 0,001; *** = p < 0,0001) n=4.
34
5. DISCUSSÃO
A Na,K-ATPase pode ser um alvo importante para o desenvolvimento de drogas
anticancerígenas, uma vez que atua como um transdutor de sinal versátil, tem um papel chave
na adesão celular, e a sua expressão e atividade aberrantes estão implicados no desenvolvimento
e progressão de diversos tipos de canceres (MIJATOVIC et al., 2007a). Os esteroides
cardiotônicos, inibidores da Na,K-ATPase, têm sido amplamente estudados para o
desenvolvimento de antitumorais contra diversos tipos de células malignas. O glicosídeo
cardíaco ouabaína, bloqueador da Na,K-ATPase, tem efeitos pró-apoptóticos em vários
sistemas celulares. No entanto, o mecanismo envolvido nestes efeitos não é claro. Um estudo
demonstrou que a incubação de células HeLa durante 24 h com concentrações nanomolares de
ouabaína ou digoxina provoca a morte apoptótica de 30-50% das células. A ouabaína induz a
apoptose, com liberação de citocromo c e a ativação de caspases -3/7 e -9, indicando que a
apoptose pode ser desencadeada por uma ação direta da ouabaína em mitocôndrias (ALONSO
et al., 2013).
Cinco membros da família dos glicosídeos cardíacos, incluindo a ouabaína, peruvoside,
digoxina, digitoxina, e estrofantina, mostraram ser capazes de inibir a Na,K-ATPase e
sensibilizar várias linhagens de células tumorais (de próstata (PCC-1 e PC-3), células cervicais
(HeLa), ovarianas (OVCAR3), e células de câncer da mama (T47D)) a anoikis. Anoikis é uma
forma de morte celular programada que ocorre em células epiteliais normais mediante
destacamento da matriz extracelular. As células epiteliais malignas com potencial metastático
podem resistir à anoikis e sobreviver usando um modo independente de ancoragem. Assim,
moléculas que sensibilizam estas células resistentes podem diminuir os efeitos da metástase
tumoral. Isso pode ocorrer pelo fato da ouabaína estar envolvida com a via mitocondrial de
ativação de caspases no processo de morte celular por apoptose e também por inibir a Na,K-
ATPase (SIMPSON et al., 2009). Outros estudos in vivo mostraram que a digoxina induziu
apoptose em leucemia linfoblástica aguda de células T humanas, e inibiu o crescimento do
tumor de neuroblastoma em camundongos (IHENETU et al., 2007; SVENSSON et al., 2005).
Estudos epidemiológicos têm relatado que pessoas em tratamento com glicosídeos
cardíacos são protegidos contra alguns tipos de canceres. Esta evidência, juntamente com as
observações de citotoxicidade seletiva dos glicosídeos cardíacos contra as células cancerosas,
tem levantado novo interesse nas propriedades anticâncer dessas drogas. Estudos in vitro vem
mostrando que concentrações nanomolares dos glicosídeos cardíacos não são tóxicos para as
células normais e podem proteger contra a apoptose, ou mesmo induzir a proliferação celular,
35
enquanto que em células cancerosas estas drogas bloqueiam a proliferação celular e induzem a
morte celular (KOMETIANI; LIU; ASKARI, 2005a; NEWMAN et al., 2008; TRENTI et al.,
2014; TREVISI et al., 2004). A seletividade destes compostos é uma característica interessante
a ser explorada na busca de novas terapias para substituir o efeito limitado dos tratamentos
existentes em alguns tipos de cânceres. Uma possível limitação do uso dos esteroides
cardiotônicos em alguns casos seria o índice terapêutico estreito, devido à toxicidade
cardiovascular. Portanto, o objetivo a ser alcançado é a busca de novos esteroides cardiotônicos
com potencial de inibição da proliferação celular de células cancerosas, sem o potencial de
causar toxicidade cardiovascular (TRENTI et al., 2014).
Nosso grupo de pesquisas têm demonstrado os efeitos moleculares de um novo esteroide
cardiotônico derivado da digoxina, o 21-benzilideno digoxina (21-BD), em diferentes linhagens
celulares normais e tumorais. Neste novo esteroide cardiotônico, assim como os utilizados neste
trabalho, foi adicionado um anel aromático na porção lactona da digoxina. Análises em modelos
computacionais mostraram que 21-BD tem a capacidade de se ligar à subunidade α1 da Na, K-
ATPase de modo semelhante aos esteroides cardiotônicos clássicos e conduzir a efeitos
interessantes. Esta nova molécula foi capaz de induzir citotoxicidade em células de carcinoma
HeLa e RKO, e nenhuma citotoxicidade foi observada em células normais MDCK. 21-BD não
tem efeito na Na,K-ATPase isolada, mas foi capaz de regular positivamente a subunidade α1 e
β1 da Na,K-ATPase nas concentrações micromolares em células intactas (ROCHA et al., 2014).
No presente trabalho, demostramos a atuação dos seis novos esteroides cardiotônicos
sintetizados a partir da digoxina (1-BD, 2-BD, 3-BD, 4-BD, 5-BD e 6-BD) na atividade
enzimática e na quantidade de Na,K-ATPase de células de HeLa. Dos seis compostos testados,
o único que alterou a atividade da Na,K-ATPase foi o 4-BD, após 24 horas de exposição às
células. 4-BD apresentou uma inibição da atividade enzimática de aproximadamente 60%
quando comparado ao controle (sem o tratamento), sendo similar à inibição apresentada pela
digoxina (que foi de 64 %). A inibição causada pela digoxina já é bem descrita em vários
estudos, e portanto, ela foi utilizada no estudo como um controle inibitório da Na,K-ATPase.
De acordo com dados prévios de nosso laboratório, na concentração de 150 nM, ocorre redução
da atividade enzimática de aproximadamente 80 % com 48 horas de exposição das células HeLa
(PESSOA, 2014).
Em outro estudo realizado por nosso grupo, foi avaliado o efeito dos seis esteroides
cardiotônicos diretamente na Na,K-ATPase de preparações de hemisfério cerebral de rato
(contendo as subunidades α2 e α3 da enzima) e de rim humano (contendo a subunidade α1).
Diferentemente do efeito inibitório apresentado por 4-BD na Na,K-ATPase de células HeLa
36
intactas após 24 horas de tratamento, o composto mostrou ser de 30 a 40 vezes menos potente
para a inibição direta da atividade da enzima presente em preparações de hemisfério cerebral
de rato e de rim humano. Já a digoxina e os compostos 1-BD e 3-BD, mostraram ser potentes
inibidores de todas as isoformas da Na,K-ATPase testadas (ALVES et al., 2015). Portanto, os
dados sugerem que a digoxina e seus novos derivados apresentam diferentes capacidades de
inibição da Na,K-ATPase, indicando que em células intactas o mecanismo molecular de 4-BD
pode ser mais complexo. Além disso, inibição enzimática por 4-BD ocorreu sem alterar o
conteúdo de Na,K-ATPase, como demonstrado pelo Immunoblotting. A quantidade da
subunidade α1 da Na,K-ATPase exposta a 10 μM de 4-BD foi diminuída quando comparada às
células sem o tratamento, porém esta redução não foi significativa.
Dos novos esteroides cardiotônicos testados, 4-BD também foi o que apresentou melhor
efeito citotóxico em células de carcinoma de colo uterino (HeLa) e em células de carcinoma de
cólon intestinal humano (RKO), apresentando o melhor índice de seletividade para as células
cancerígenas, quando comparado aos outros esteroides, como mostrado em Alves et al. (2015).
O efeito citotóxico observado não está relacionado com a inibição da atividade da Na,K-ATPase
(ALVES et al., 2015). Estes resultados sugerem que a citotoxicidade nestas células não é
dependente da inibição da “bomba de Na+” e pode ser modulada por outros mecanismos, tais
como as vias de sinalização celular mediada por Na, K-ATPase.
Já é bem descrito que a ligação da ouabaína a Na,K-ATPase provoca uma mudança
conformacional da enzima e pode controlar a geração de sinais que envolvem uma intricada via
de sinalização celular (BAGROV; SHAPIRO; FEDOROVA, 2009; TIAN et al., 2009). A
interação entre Na,K-ATPase e a família tirosina quinase Src vem sendo estudada como um
complexo que funciona como um receptor envolvido nesta transmissão de sinais. Os íons Na+
e K+ podem usar o receptor para regular a atividade de quinases pois suas concentrações afetam
as conformações E1 e E2 da Na,K-ATPase. Durante o ciclo de bombeamento, a subunidade α1
da Na,K-ATPase sofre uma transição de E1 para E2, e um dos domínios de Src devem se
dissociar para permitir a hidrólise do ATP. Assim, Src se associa à subunidade α1 da Na,K-
ATPase de forma dependente da conformação. Estudos demonstram que, enquanto a
conformação E1 da enzima inibe Src, a conformação E2 liberta o domínio da quinase Src, o
que resulta na ativação de Src associada à subunidade α1 da Na,K-ATPase. Então, a ouabaína
se liga à conformação E2 da Na,K-ATPase, levando à ativação de Src dependente da
conformação de Na,K-ATPase. Isto leva a evidências de uma relação entre a homeostase iônica
e a transdução de sinais (YE et al., 2011).
37
Embora muitos estudos sugiram uma alta evidência de interação direta entre a proteína
Na,K-ATPase e Src, foram propostos outros mecanismos de regulação de Src por esteroides
cardiotônicos. Um estudo recente mostrou que não existe uma interação molecular direta entre
Src e Na,K-ATPase em condições fisiológicas (GABLE et al., 2014). Outros estudos suportam
a ideia de que a atividade de Src é regulada tanto pelas concentrações de ATP quanto de ADP,
onde ATP ativa e ADP inibe a atividade de Src. Este estudo mostrou que não há nenhuma
evidência para uma interação direta entre Na,K-ATPase e Src, fornecendo assim, uma hipótese
alternativa a respeito do papel de Src na sinalização induzida por esteroides cardiotônicos
(WEIGAND et al., 2012). Portanto, a hipótese de que esteroides cardiotônicos se ligam à Na,K-
ATPase e transmitem seus eventos de sinalização celular através de Src ainda permanece
discutível. E também que outros mediadores secundários, tais como a razão ATP/ADP,
concentração dos íons (por exemplo, Na+, K+, Ca2+), e pH, também podem explicar os possíveis
indutores dos efeitos anticancerígenos (PRASSAS; DIAMANDIS, 2008; WANG;
O’DOHERTY, 2012).
Um estudo descreveu que Na,K-ATPase e Src de neurônios centrais
coimunoprecipitam. Dentre os nove membros da família tirosina quinase, Src, Yes, Fyn e Lyn
apresentam altas expressões no sistema nervoso central, e esse estudo mostrou que ocorre uma
interação direta entre Lyn quinase e a subunidade α3 da Na,K-ATPase. Foi também
demonstrado que a fosforilação da tirosina é um mecanismo regulador essencial para a Na,K-
ATPase. Porém, não está claro por que a fosforilação de tirosinas da Na,K-ATPase regula a
atividade da bomba, e pode ser possível que a fosforilação da tirosina em resíduos ou
subunidades diferentes pode provocar efeito oposto na atividade da Na,K-ATPase. A regulação
a longo prazo da Na,K-ATPase por tirosina quinases Src influenciando, por exemplo, a
expressão e a translocação da proteína na membrana, é um outro problema importante que deve
ser investigado. Contudo, estes dados sugeriram que a atividade da Na,K-ATPase é regulada
pela tirosina quinase Src por um mecanismo específico de interação proteína-proteína e pode
desempenhar papel na apoptose (WANG; YU, 2005).
Diferentes tirosina quinases possuem efeitos diferentes sobre a atividade da Na,K-
ATPase. A estimulação ou inibição da atividade da Na, K-ATPase parece ser possível,
dependendo de qual tirosina quinase foi usada para produzir a fosforilação da tirosina. A família
Src consiste em pelo menos nove membros, e estes compartilham estrutura global semelhante
mas são expressos de forma tecido-específica. Assim, a Na, K-ATPase poderia interagir com
outros membros da família Src de maneira tecido-específica. Isto talvez poderia explicar por
que, em alguns tecidos, a inibição da atividade de Na,K-ATPase é causada por fosforilação de
38
tirosina, enquanto que em outros é observada a estimulação da atividade Na,K-ATPase
(BOZULIC; DEAN; DELAMERE, 2005).
Observamos em nosso estudo que 4-BD não atua pelo mesmo mecanismo de sinalização
clássico dos esteroides cardiotônicos inibidores da Na,K-ATPase, como a ouabaína. Nosso
composto, ao invés de aumentar a atividade de Src (como já é descrito para a ouabaína, em que
a inibição da atividade da Na,K-ATPase leva à uma ativação de Src), atua inibindo a atividade
da Na,K-ATPase, e diminui a atividade da quinase Src, como mostrado pela redução de Src
fosforilada no Immunoblotting. Esse dado indica que possa estar ocorrendo alguma relação
específica entre a Na,K-ATPase e Src na presença de 4-BD que ainda deve ser melhor
investigada. Como a discussão sobre a interação direta entre Src e Na,K-ATPase ainda
permanece bastante complexa, e diversos trabalhos vem mostrando resultados controversos, a
investigação do mecanismo de 4-BD que pode estar levando a inibição da Na,K-ATPase e
redução da atividade da quinase Src merece melhor atenção.
A redução da fosforilação da tirosina quinase Src observada na presença de 4-BD pode
ser interessante, pois ela está envolvida em diferentes processos que conduzem à proliferação
celular observada em diversos tipos de tumores. Src regula diversos processos celulares, como
proliferação, migração, invasão, diferenciação, angiogênese, sobrevivência e transcrição
gênica. A desregulação ou alteração na expressão de Src é associada a cânceres humanos
(ELSBERGER, 2014). Estudos indicam que Src pode ativar diversas moléculas de sinalização,
e que o bloqueio da ativação de Src pode inibir estas vias de sinalização celular, resultando na
atividade antitumoral (ALESHIN; FINN, 2010). Estas características têm sido utilizadas como
potencial alvo terapêutico para o desenvolvimento de inibidores de Src. Inibidores seletivos de
Src reduzem significativamente proliferação, migração e invasão em células cancerígenas. Um
estudo recente indicou que a combinação de inibidores de Src e MEK tem sido promissor para
aumentar a eficácia na terapia do câncer (CUI et al., 2015). Como 4-BD foi capaz de diminuir
a expressão de Src fosforilada, sugere-se que a diminuição da proliferação celular observada
em células HeLa para concentrações crescentes de 4-BD, em diferentes tempos de tratamento,
possa ter uma relação com a diminuição da atividade de Src. A partir de 250 nM de 4-BD houve
uma diminuição da proliferação celular em todos os tempos de tratamento (24, 48, 72 e 96
horas), indicando que esta concentração atua tanto na redução da atividade de Src quanto na
redução da proliferação celular nos diferentes tempos de exposição.
A percepção de que o domínio N da Na,K-ATPase interage com o domínio de
fosforilação Y418 de Src levou pesquisadores a desenvolver um peptídeo análogo do domínio
N da Na,K-ATPase que poderia se ligar a Y418 de Src, inibindo sua fosforilação. Este estudo
39
conduziu à identificação de pNaKtide, um segmento de aminoácidos da subunidade α1 da
Na,K-ATPase. pNaKtide é um potente inibidor da fosforilação de Src Y418 in vitro. Ao
contrário do PP2 (inibidor da tirosina quinase Src), pNaKtide não afeta a maior parte da
atividade de Src basal em células vivas. Este inibidor torna-se eficaz quando a atividade celular
de Src é aumentada devido à regulação negativa da Na,K-ATPase. pNaKtide é eficaz na redução
da formação do complexo Na,K-ATPase-Src, atuando assim, como um antagonista específico
de esteroides cardiotônicos. Mecanisticamente, o peptídeo estimula a apoptose, inibe o
crescimento celular, e diminui a angiogênese tumoral. Alguns destes efeitos são provavelmente
relacionado com a ação inibitória de Src por pNaKtide. Assim, as novas descobertas
demonstram a eficácia in vivo de pNaKtide e sugerem que defeitos na transdução de sinal
mediada por Na,K-ATPase podem ser alvo para o desenvolvimento de novas terapias
antitumorais (LI et al., 2011).
Assim como os inibidores de Src, 4-BD também pode estar atuando na inibição de Src
e, consequentemente, desencadeando diversos processos celulares que podem estar envolvidos
na redução da proliferação de células HeLa. Afim de comparar o efeito de 4-BD com os
inibidores de Src, tratamos as células HeLa por uma hora com o inibidor de Src PP2.
Observamos que 4-BD foi capaz de causar um efeito inibitório em Src, levando a uma
diminuição da sua forma fosforilada, ou seja, a forma ativada. Quando tratamos as células HeLa
com 5 µM e 10 µM do inibidor de Src PP2, uma inibição significativa no conteúdo de Src
também foi observado quando comparado ao controle, como esperado. E quando avaliamos se
poderia estar ocorrendo um efeito sinérgico entre os dois inibidores, ao tratar as células HeLa
com PP2 por uma hora e posteriormente adicionar o 4-BD, este efeito não foi observado. A
redução do conteúdo de Src neste caso, foi similar à das células tratadas com 4-BD sozinho,
mostrando que 4-BD não atua de forma sinérgica com o inibidor de Src. PP2 pode talvez estar
atuando como um antagonista de 4-BD.
A digoxina tem sido relatada em alguns estudos como podendo exercer seus efeitos
antitumorais atuando em receptores de estrogênio em alguns tipos de cânceres hormônio-
sensíveis (SHIM; LIU, 2014). Portanto, a investigação de se o 4-BD também pode atuar em
células sensíveis ao estrogênio não deve ser descartada.
O mecanismo proposto de 4-BD a ser estudado em nossas futuras investigações está
representado pela Figura 16. Os efeitos de 4-BD já observados em nossos resultados, que
incluem a inibição da atividade da Na,K-ATPase sem alterar a quantidade da enzima, e a
redução da atividade da tirosina quinase Src em células HeLa intactas, podem assim estar
40
levando a redução da proliferação e viabilidade celular através de um mecanismo ainda
desconhecido.
Figura 16. Mecanismo de sinalização celular a ser investigado nos próximos estudos.
41
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dos seis novos compostos derivados da digoxina, o 21-p-dimetilaminobenzilideno
digoxina (4-BD) é tão potente quanto a digoxina contra células de carcinoma de colo
uterino (HeLa).
Diferentemente da digoxina, 4-BD é um fraco inibidor da Na,K-ATPase purificada, mas
após 24 horas de incubação com células HeLa intactas, este regula negativamente a
atividade da Na,K-ATPase, sem alterar seu conteúdo na membrana celular, o que sugere
que o mecanismo molecular clássico dos esteroides cardiotônicos não está envolvido
com o efeito citotóxico deste composto.
A proliferação das células HeLa também foi reduzida em concentrações e tempos de
exposição diferentes de 4-BD, o que pode estar relacionado com a redução da atividade
de Src.
Portanto, o mecanismo molecular de 4-BD na transdução de sinais mediado pela Na,K-
ATPase e Src, por interações proteína-proteína e ativação de proteínas sinalizadoras,
merece ser investigado afim de estudar o mecanismo de ação deste composto, o que
permitiria apontar/confirmar seu potencial como um possível antitumoral.
42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXO
c-Benzylidene digoxin derivatives synthesis and molecularmodeling: Evaluation of anticancer and the Na,K-ATPase activityeffect
Silmara L. G. Alves a,�, Natasha Paixão b,�, Letícia G. R. Ferreira c, Felipe R. S. Santos a, Luiza D. R. Neves c,Gisele C. Oliveira c, Vanessa F. Cortes c, Kahlil S. Salomé d, Andersson Barison d, Fabio V. Santos e,Gisele Cenzi f, Fernando P. Varotti f, Soraya M. F. Oliveira g, Alex G. Taranto g, Moacyr Comar g,Luciana M. Silva h, François Noël b, Luis Eduardo M. Quintas b, Leandro A. Barbosa c, José A. F. P. Villar a,⇑a Laboratório de Síntese Orgânica e NanoEstruturas, Universidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro Oeste Dona Lindu, Av Sebastião Gonçalves Coelho, 400,Bairro Chanadour, Divinópolis, MG CEP 35501-296, Brazilb Laboratório de Farmacologia Bioquímica e Molecular, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Av Carlos Chagas, 373, 21941-902 Rio deJaneiro, Brazilc Laboratório de Bioquímica Celular, Universidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro Oeste Dona Lindu, Divinópolis, MG 35501-296, Brazild Laboratório de RMN, Universidade Federal do Paraná, 81.531-990 Curitiba, PR, Brazile Laboratório de Biologia Celular e Mutagenicidade, Universidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro Oeste Dona Lindu, Divinópolis, MG 35501-296, Brazilf Laboratório de Bioquímica de Parasitos, Universidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro Oeste Dona Lindu, Divinópolis, MG 35501-296, Brazilg Laboratório de Bioinformática, Universidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro Oeste Dona Lindu, Divinópolis, MG 35501-296, Brazilh Laboratório de Biologia Celular e Inovação Biotecnológica, Fundação Ezequiel Dias, Rua Conde Pereira Carneiro 80, 305010-010 Belo Horizonte, Brazil
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 6 March 2015Revised 30 May 2015Accepted 10 June 2015Available online 17 June 2015
Keywords:Cardiotonic steroidsNa,K-ATPaseAnticancerCancerDigoxinc-Benzylidene
a b s t r a c t
Cardiotonic steroids (CS), natural compounds with traditional use in cardiology, have been recently sug-gested to exert potent anticancer effects. However, the repertoire of molecules with Na,K-ATPase activityand anticancer properties is limited. This paper describes the synthesis of 6 new digoxin derivatives sub-stituted (on the C17-butenolide) with c-benzylidene group and their cytotoxic effect on human fibroblast(WI-26 VA4) and cancer (HeLa and RKO) cell lines as well as their effect on Na,K-ATPase activity andexpression. As digoxin, compound BD-4 was almost 100-fold more potent than the other derivativesfor cytotoxicity with the three types of cells used and was also the only one able to fully inhibit theNa,K-ATPase of HeLa cells after 24 h treatment. No change in the Na,K-ATPase a1 isoform protein expres-sion was detected. On the other hand it was 30–40 fold less potent for direct Na,K-ATPase inhibition,when compared to the most potent derivatives, BD-1 and BD-3, and digoxin. The data presented heredemonstrated that the anticancer effect of digoxin derivatives substituted with c-benzylidene werenot related with their inhibition of Na,K-ATPase activity or alteration of its expression, suggesting thatthis classical molecular mechanism of CS is not involved in the cytotoxic effect of our derivatives.
� 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
The Na,K-ATPase is an enzyme that regulates the cellular home-ostasis of Na+ and K+, through the transport of 3 Na+ ions out and2 K+ ions into the cell. The enzyme is ubiquitously expressed inmammals and it has 3 subunits: a, b, and FXYD.1 Four a, three band seven FXYD isoforms have been described.2 The a subunit con-tains the binding sites for ATP, Na+, K+ and specific ligands known
as cardiotonic steroids (CS) and is responsible for the catalytic andion transport activities of the enzyme. The b subunit is necessaryfor the activity of the enzyme complex and the assembling of thepump to the cell membrane and FXYD family members may affectthe ionic transport properties of the Na,K-ATPase.1,2
CS are an important class of drugs classically known to inhibitthe ion transport of the Na,K-ATPase. This inhibition leads to thepositive inotropic effect derived from the increase of intracellularcalcium in the cardiac muscle, and can be also responsible for celldeath in toxic concentrations.3,4 Besides, the activation of intracel-lular signaling pathways induced by CS using the Na,K-ATPase as a
http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2015.06.0280968-0896/� 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.
⇑ Corresponding author. Tel.: +55 37 3221 1610.E-mail address: [email protected] (J.A.F.P. Villar).
� These authors equally contributed to this work.
Bioorganic & Medicinal Chemistry 23 (2015) 4397–4404
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Bioorganic & Medicinal Chemistry
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hormone receptor has been extensively investigated in recentyears.5
Digoxin and digitoxin are naturally occurring CS used for con-gestive heart failure and arrhythmia and recently have been sug-gested to exert potent anticancer effects. Cancer cells have beenshown to be highly sensitive to the toxic effects of CS and digoxinpresented anticancer activity with induction of cell death throughapoptosis6 and involvement of established cell signaling pathwaysrelated to cancer cell proliferation.7,8 Therefore, CS emerge as apromising class of molecules for cancer therapy.2
However, there are few works describing digoxin derivativeswith modifications at the butenolide moiety. Wiesner et al.9,10
described the synthesis of some cardenolides with important phar-macological properties related with modifications at C17b of ster-oidal skeleton keeping there a fractional positive charge, aiming atthe conservation of the positive inotropic effect with reducedcardiotoxicity.
Xu et al.11,12 described the synthesis and preliminary results ofc-alkylidenebutenolide derivatives, showing that some of themcould increase myocardial contractility without cardiac toxicity,which is a significant drawback against the anticancer utilizationof digoxin in humans. Huh et al.13 synthesized non-toxic deriva-tives 20,22-dihydrodigoxin-21,23-diol and digoxin-21-salicylideneand observed that they blocked TH17 cells differentiation andfunction, which can be important for the development of Crohn’sdisease, rheumatoid arthritis and psoriasis. These compoundsinhibited IL-17 production in human CD41 T cells. Recently, wehave described the proapoptotic properties of 21-benzylidenedigoxin (21-BD) in cancer cells and its effects on Na,K-ATPase, tightjunctions and cell proliferation.14
Here we describe the synthesis, molecular modeling, Na,K-ATPase inhibition and cytotoxicity in human cancer cell lines of aseries of c-benzylidene digoxin derivatives.
2. Material and methods
2.1. Chemistry
Reagents and solvents were purchased as reagent grade andused without further purification. All NMR data were acquired inCDCl3 or DMSO-d6 on a Bruker AVANCE 400 NMR spectrometer,observing 1H and 13C at 400.13 and 100.61 MHz, respectively orBruker ARX 200 NMR spectrometer, observing 1H and 13C at200.13 and 50.3 MHz, respectively. The spectrometers wereequipped with a 5-mm multinuclear direct detection probe withz-gradient. All 1H and 13C NMR chemical shifts are given in ppm(d) relative to the TMS signal at 0.00 ppm as internal referenceand the coupling constants (J) are in Hz. Preparative chromatogra-phy was performed using silica gel (230–400 mesh) following themethods described by Still et al.15 Thin layer chromatography (TLC)was performed using silica gel GF254, 0.25 mm thickness. For visu-alization, TLC plates were either placed under ultraviolet light,stained with iodine vapor or acidic vanillin. HPLC analysis was per-formed in a Shimadzu Prominence liquid chromatography,equipped with a LC-20AT pump, SPD-M20A Photodiode Arraydetector, SIL-20A automatic injector and a Shim-pack C-18 VP-ODS 4.6 � 250 mm 5 lm reverse phase column. HRMS analysiswas recorded on a micrOTOF-QII Bruker. IR spectra were recordedon a Shimadzu IRAffinity-1 spectrophotometer.
2.2. General procedure for the synthesis of 21-benzylidenesdigoxin (BD-1,2,3,5 and 6)
Aldehyde (1.8 mmol), digoxin (0.469 g, 0.6 mmol), anhydrousK2CO3 (0.249 g, 1.8 mmol) were added to 60 mL of methanol in around bottom flask. After stirring for 6 h at 70 �C, the solvent was
evaporated in a rotary evaporator. The crude product was dilutedwith 20 mL of water and extracted with hot ethyl acetate(3 � 30 mL). The organic layer was washed with brine, dried overanhydrous Na2SO4 and concentrated under vacuum. The crude pro-duct was purified by silica column chromatography (CH2Cl2/MeOH11:1). After purification, the pure product was diluted in THF,precipitated with hexane and concentrated under reducedpressure to give benzylidene digoxin derivative.
2.3. Procedure for the synthesis of 21-benzylidene digoxin (BD-4)
4-(Dimethylamino)benzaldehyde (0.298 g, 2 mmol), digoxin(0.781 g, 1.0 mmol), anhydrous K2CO3 (1.1 g, 0.152 mmol), wereadded to 4 mL of methanol and 2 mL THF in a round bottom flask.After stirring for 6 h at room temperature, the solvent was evapo-rated in a rotary evaporator. The crude product was diluted with20 mL of water and extracted with hot ethyl acetate (3 � 30 mL).The organic layer was washed with brine, dried over anhydrousNa2SO4 and concentrated under vacuum. The crude product waspurified by silica column chromatography (CH2Cl2/MeOH 11:1).After purification, the pure product was diluted in THF, precipi-tated with hexane and concentrated under reduced pressure togive benzylidene digoxin derivative (0.572 g, 0.63 mmol, 63%) asa yellow solid.
2.4. Cell culture
HeLa (human cervix carcinoma; ATCC CCL2), RKO-AS45-1(human colon carcinoma; ATCC CRL-2579) and WI-26 VA4 (lungfibroblast; ATCC CCL-95.1) cells were cultured in RPMI medium(Sigma�, St. Louis, MO, USA) supplemented with 10% fetal bovineserum (FBS) (Hyclone), 60 mg/mL streptomycin and 100 mg/mLpenicillin in a humidified atmosphere of 5% CO2. Cells were seededat 5 � 105 cells/cm2. The culture medium was changed every 48 hto avoid nutrient depletion.
2.5. Cytotoxicity assay
The cytotoxicity effect was assessed using a tetrazolium saltMTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide) (Sigma�, St. Louis, MO, USA) colorimetric method. Briefly,the cells were plated in 96-well plates (1 � 105 cells/well) andincubated for 24 h at 37 �C in humid atmosphere with 5% CO2 untiladhesion. After this period, the wells were washed with culturemedium and incubated for 48 h with the compounds at differentconcentrations (0.05–500 lm). After the incubation, the plateswere treated with MTT. The reading was performed in a microplatereader Spectramax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) at550 nm. Cytotoxicity was scored as the percentage of absorbancereduction when compared to untreated control cultures. All exper-iments were performed in triplicate. The results were expressed asthe means of IC50 (the drug concentration that reduced cell viabil-ity to 50%). A selectivity index (SI), corresponding to the ratiobetween the cytotoxic activity of each compound against thefibroblast cell and the carcinoma cells was calculated as follows:SI = IC50 WI-26 VA4/IC50 HeLa or RKO-AS45-1.
2.6. Molecular modeling studies
Initially, digoxin and six steroids (E and Z isomers) were gener-ated and refined by Universal Force Field (UFF)16 implemented inGaussian 09 W software.17 Following, a model of the humanNa,K-ATPase was built using the isoform ATP1A1 located at chro-mosome 1 with accession P0502318 in the Uniprot database.19
The search for suitable templates was carried out by theTemplate Identification Tool in the Swiss-Model Workspace.20
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The model was evaluated using the Ramachandran plot generatedusing the Procheck software.21 Once the model built and validated,a rigid re-dock of ouabain was carried out in order to validate themethodology. A grid box was constructed exploring all active sites,which was defined as a cube with the geometric centred in theligand, with dimensions of 18 � 10 � 24 Å, spaced points of 1 Åand X, Y and Z coordinates of 147.345, 15.455 and �6.352.Following, digoxin and others compounds were dockedagainst our ATPase human model using the AutoDockVina 1.0.2software.22 The search algorithm used was Iterated LocalSearch Global Optimizer for global optimisation. In this process, asuccession of steps with a mutation and local optimisation(Broyden–Fletcher–Goldfarb–Shanno [BFGS] method) wereconducted. Each step was followed by the Metropolis criterion.23
All molecular modeling figures were constructed by DSVisualizer 3.1.24
2.7. Na,K-ATPase preparation from human kidney and rat brainhemispheres
Normal human renal samples were obtained and prepared aspreviously described.25 All procedures for the use of discardedorgan portions were done in accordance to the InstitutionalEthical Committee from Hospital Universitário Clementino FragaFilho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil (process num-ber 038/08). Briefly, samples were homogenized with motor-dri-ven teflon Potter homogenizer in ice cold 0.25 M bufferedsucrose (pH 7.4), containing 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) and ultracentrifuged at 100,000g for 1 h. The final pelletswere resuspended in the same buffer without PMSF and storedin liquid N2.
Brain hemispheres from adult male Wistar rats were rapidlycollected after decapitation (protocol approved by theInstitutional Commission for Ethics in the Use of Animals, processcode DFBCICB011, and conformed to the Guide for the Care and Useof Laboratory Animals, published by US National Institute ofHealth—NIH publication No. 85-23, revised in 1996). The organ, asource of ouabain-sensitive (a2/a3) Na,K-ATPase isoforms washomogenized in 250 mM sucrose, 2 mM dithiothreitol, 0.1 mMPMSF, 5 mM Tris/HCl (pH 7.4) with a motor-driven teflon Potterhomogenizer. Subsequently, chaotropic treatment with 2 M KI for1 h under constant stirring and centrifugation for three times at100,000g for 1 h were performed. The final pellet was resuspendedin 250 mM sucrose, 0.1% sodium deoxycholate, 20 mMmaleate/Tris (pH 7.4), stored overnight at �20 �C and submittedto differential centrifugation after thawing.26 The final pelletswere resuspended in the same buffer without PMSF and storedin liquid N2.
2.8. Fractionation of cell lysate and preparation of membranehomogenate
2.5 � 106 cells were grown in 75 cm2 culture bottles and treatedwith the compounds. After 24 h of treatment, cells were washedthree times with cold PBS and scrapped from the culture bottlewith a rubber policeman in a membrane preparation buffer(6 mM Tris (pH 6.8), 20 mM imidazole, 0.25 M sucrose, 0.01%SDS, 3 mM EDTA and 2 mM PMSF). The cells were homogenizedten times in a potter in ice and sonicated in an ultrasonic cell dis-ruptor on ice for 10 s at 45% power with resting periods of 5 s. Thehomogenate was subjected to centrifugation at 20,000g for 1 h and30 min at 4 �C. The supernatant was discarded and the pellet resus-pended with 250 ll of membrane preparation buffer. Finally, thefinal content was sonicated for 10 s at 25% power until completedispersion of the homogenate.
2.9. Na,K-ATPase activity
Human kidney or rat brain hemispheres preparations wereincubated at 37 �C for 2 h in the presence of 87.6 mM NaCl,3 mM KCl, 3 mM MgCl2, 3 mM ATPNa2, 1 mM EGTA, 10 mMsodium azide and 20 mM maleic acid/Tris (pH 7.4). The cell mem-brane preparations were incubated at 37 �C for 1 h in the presenceof 120 mM NaCl, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 3 mM ATPNa2 and50 mM HEPES, (pH 7.5), both in the absence and presence of1 mM ouabain or increasing concentrations of the compounds.Na,K-ATPase activity was determined by measuring the Pi releasedaccording to a colorimetric method described previously.27,28
2.10. Immunoblotting
The cell membrane homogenate was used for immunoblottingexperiments. The protein content of the cell lysate was measuredby Hartree method and prepared for SDS–polyacrylamide gel elec-trophoresis (PAGE) by boiling in sample buffer. The resolved pro-teins were electrotransferred to a nitrocellulose membrane(Ultracruz, Santa Cruz Biotechnology, CA). The proteins of interestwere then detected with the specific polyclonal or monoclonalantibodies indicated in each case, followed by species-appropriateperoxidase-conjugated antibodies (Santa Cruz Biotechnology, CA)and chemiluminescent detection. Following detection of bandsby chemiluminescence, images were scanned and were quantifiedfor band intensity using ImageJ software29 and values wereexpressed as density units relative to the untreated controls.
2.11. Statistical analysis
The parameter IC50 (the concentration of an inhibitory drug thatreduces a response by 50% of the maximal inhibition) was esti-mated by nonlinear regression analysis of the data (Prism�,GraphPad Software Inc., version 5), assuming a sigmoidal dose–re-sponse curve model.28 In order to evaluate a putative correlationbetween Na,K-ATPase inhibition and cytotoxicity, a Pearson corre-lation test was used considering the logIC50 values since the con-centrations of drugs that produce half-maximal responses areonly normally distributed when expressed as logarithms.30
3. Results and discussion
3.1. Chemistry
CS have arisen as an important pharmacological class with anti-cancer properties31 and the synthesis of new compounds is a grow-ing matter of interest.14,32 The requirement of a lactone ring forinhibition of Na,K-ATPase is a strategy for the development ofnew CS.33,34 However, a critical disadvantage of CS is the narrowtherapeutic index and the resultant risk of toxicity that can leadto life-threatening heart arrhythmias and is a drawback for thedevelopment of new anticancer compounds.34 Therefore, the goalof our chemical modifications was to introduce an aromatic groupin the lactone ring of digoxin to promote a steric hindrance in thebinding site of the Na,K-ATPase (Fig. 1A). Moreover, this chemicalmodification in the lactone ring of digoxin has been performed tobe easy and with high yield.
Preparation of digoxin derivatives was carried out by a stereos-elective vinylogous aldol reaction described by Xu et al.11 (Fig. 1B).All compounds were characterized on the basis of extensive anal-yses of 1H, 13C{1H}34 and DEPT-135 NMR, HR-MS and IR data(Supplementary data).
The HPLC and NMR analysis indicated the presence of stereose-lectivity in the synthesis of the compounds BD-1, -4 and -5,
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whereas a mixture of geometric isomers (E and Z compounds) weredetected with BD-2, -3 and -6. For the synthesis of compound BD-4we used THF as solvent at room temperature to afford a stereose-lective product. According to Xu et al.11 the thermodynamic prefer-ence for the double bond configuration is the Z configuration.
3.2. Biological activity
3.2.1. Cytotoxic effectMTT assay in cancer cell lines gave IC50 values between 0.26 and
65 lM for HeLa cells, 0.48–79 lM for RKO cells and 0.65–78 lM forWI-26 VA4 cells (Table 1). As a whole, the BD compounds pre-sented similar IC50 values, in the micromolar range, with theremarkable exception of BD-4 that was about 100 times morepotent with IC50 values ranging from 260 to 480 nM. The com-pounds have no significant selectivity for the cancer cells, as indi-cated by the selective index (SI) ranging from 0.36 to 2.5 (Table 1).
3.2.2. Effect on Na,K-ATPase activity and expressionTable 2 and Figures 2 and 3 show that our digoxin derivatives
have different capacities to inhibit the Na,K-ATPase activity ofhuman kidney and rat brain Na,K-ATPase. Indeed, BD-1 and -3 havesimilar potencies as digoxin whereas BD-2, -4 and -5 are lesspotent (higher IC50 values) and BD-6 has no significant effect (lessthan 20% inhibition at 10 lM).
When HeLa cells were treated for 24 h, 150 nM digoxin caused a�60% decrease of Na,K-ATPase activity as also observed with150 nM BD-4. At 10 lM, BD-4 caused a total loss of Na,K-ATPaseactivity (Fig. 4A) and the other compounds failed to produce anysignificant inhibition of the activity, even at 10 lM. Moreover,the levels of a1-Na,K-ATPase were not changed on membranepreparations (Fig. 4B) and this open the possibility of the modula-tion of Na,K-ATPase activity instead of changes of Na+ pumpexpression on the cell membrane by activation of signalingpathways.
CS are toxic to the cells due to inhibition of the Na-pump, con-sidered as the main mechanism for digoxin toxicity.4 The cytotoxiceffect of digoxin in RKO cells (0.42 lM, Table 1) occurred at con-centrations similar to the ones inhibiting the Na,K-ATPase activityof human kidney and rat brain preparations (IC50 = 0.22 and0.37 lM, Table 2). Surprisingly, BD-4 was the most cytotoxic com-pound among our derivatives, being almost 100-fold more potentthan the other derivatives with the three types of cells used(Table 1), despite its 30–40 fold lower potency for Na,K-ATPaseinhibition, when compared to the most potent derivatives, BD-1and BD-3 (Table 2). Moreover, the compounds demonstrated sim-ilar affinity for all isoforms of Na,K-ATPase.
Such lack of relation between these two effects in the presentstudy was further supported by the absence of significant correla-tion between the log IC50 for cytotoxicity and Na,K-ATPase
Figure 1. Synthesis of digoxin derivatives. (A) Digoxin derivatives proposed in this work. (B) Synthesis of BD-1 to -6.
Table 1In vitro cytotoxic potency of digoxin and its derivatives BD-1 to -6 against HeLa, RKO and WI-38 cell lines
Compound R IC50 ± SD (lM) Selectivity index
HeLa RKO WI-26 VA4 HeLa RKO
BD-1 4-OCH3 Z 61.4 ± 16.8 79.0 ± 15.1 78.3 ± 8.1 1.27 0.99BD-2 2,3-Cl Z/E 42.5 ± 15.1 19.0 ± 8.1 15.5 ± 1.7 0.36 0.81BD-3 4-F Z/E 60.9 ± 18.5 41.4 ± 9.9 54.1 ± 6.1 0.89 1.31BD-4 4-N(CH3)2 Z 0.26 ± 0.06 0.48 ± 0.16 0.65 ± 0.11 2.5 1.35BD-5 3-NO2 Z 65.2 ± 8.5 41.3 ± 20.0 44.1 ± 2.6 0.68 1.07BD-6 4-Cl Z/E 40.1 ± 5.5 23.8 ± 1.1 28.7 ± 3.4 0.72 1.21Digoxin — — 2.2 ± 0.8 0.42 ± 0.1 ND — —
Table 2Inhibitory concentration of digoxin and its derivatives BD-1 to -6 for Na,K-ATPase inhibition of human kidney or rat brain preparation
Na,K-ATPase inhibition IC50 ± SEM (lM)
Digoxin BD-1 BD-2 BD-3 BD-4 BD-5 BD-6
Human kidney (a1) 0.29 ± 0.02 0.57 ± 0.10 N.D. 0.34 ± 0.09 9.8 ± 2.4 11 ± 3 N.I.Rat brain (a2a3) 0.22 ± 0.04 0.46 ± 0.10 18 ± 10 0.66 ± 0.20 20 ± 7 4 ± 1 N.I.
IC50 were obtained by non-linear regression analysis of average curves from 3 to 9 independent experiments performed in triplicate. SEM represents here the goodness of fitfor such parameter.N.I., no inhibition (less than 20% inhibition at 10 lM).N.D. not determined.
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inhibition observed when testing digoxin and BD-1 to -6, for thethree kinds of cells (HeLa, correlation coefficient r2 = 0.363,p = 0.282; RKO, correlation coefficient r2 = 0.528, p = 0.164; andWI-26 VA4 cells, correlation coefficient r2 = 0.602, p = 0.123).These results suggest that cytotoxicity in these cells is not depen-dent on inhibition of the Na+ pump and can be modulated by othermechanisms, such as the signaling pathways that were described
to be mediated by Na,K-ATPase. In fact, different CS have beenshown to induce Na,K-ATPase endocytosis at concentrations thatdo not inhibit the enzyme activity35–37 and permanent depletionof plasma membrane Na,K-ATPase stimulates the cell cycle inhibi-tor p21cyp and triggers cell arrest and death.37
3.3. Molecular modeling
The search for a suitable template showed that the crystallo-graphic structure of Na,K-ATPase of Squalus acanthias complexedwith ouabain, PDB ID: 3A3Y with 2.80 Å of resolution, shared 89%of identity with human ATPase.38 This high value of identity
Figure 2. Inhibition of Na,K-ATPase from human kidney preparation. Averagecurves were obtained by non-linear regression analysis. Each point represents theIC50 ± SEM of 2–8 independent experiments performed in triplicate.
Figure 3. Inhibition of Na,K-ATPase from rat brain preparation. Average curveswere obtained by non-linear regression analysis. Each point represents theIC50 ± SEM of 3–9 independent experiments performed in triplicate.
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implies in low root-mean-square deviation (RMSD) value, whichwas 0.06 Å for a-carbons (Fig. 5). The model and 3A3Y has thesame active site as well, which is composed for Glu319, Ile322,Phe323, Gly326, Ile327, Ile328, Val329, Ala330, Phe790, Phe793,Leu800, Thr804, Arg887 (Fig. 6).
Finally, the Ramachandran plot was used to check stereochem-ical accuracy of the model (Fig. 6). As can be seen, both model andtemplate (Fig. 7A and B, respectively) had a similar plot, in which88% and 12% of residues are in the most favorable region and inadditional allowed region, respectively. Only Glu314 and Pro501residues of the model are in generously allowed region and disal-lowed region, respectively. However, these residues are not pre-sent in the active site. In other words, the model was evaluatedin relation to identity, RMSD value and the stereochemical quality,which the limits values are 30%, 1.2 Å and 90%. These results moti-vated to subsequent docking studies.
Initially, a re-dock was carried out in order to validate themethod. As a result, the RMSD value for the superposition of crys-tallographic and docked ouabain was 1.59 Å (Fig. 8) in good accor-dance with values considered as satisfactory for re-docking(around 2.0). Next, all compounds were docked in the same confor-mation in the active site (Fig. 9). However, the lactone moiety ofcompound BD-3 changes the conformation in relation to theothers. Table 3 shows the binding energy of all compounds studied.As can be seen, in general, all BD’s can bind to the active site with afavorable binding energy and all of them have more affinity thanouabain and digoxin. Figure 9 illustrates the main intermolecularinteraction between compounds BD-4 and BD-5 against humanmodel, chosen as example due to experimental results. Dockingresults show that the aromatic moiety of all compounds reaches
Figure 4. Na,K-ATPase activity in cancer cells. HeLa cells were incubated with digoxin and its derivatives for 24 h with 150 nM and 10 lM and membrane preparation wasperformed. Na,K-ATPase activity (A) or a1-Na,K-ATPase expression (B) were obtained. Each bar represents the mean ± SEM of 3–5 independent experiments (* = p < 0.05;*** = p < 0.001).
Figure 5. Crystallographic structure of Na,K-ATPase. (A) The superposition betweenthe crystallographic structure 3A3Y (red) and the human model (yellow). (B) A closeview of active site of human model (ribbons representation) complexed withouabain (tube representation).
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a hydrophobic pocket of Na,K-ATPase carrying out a strong van derWaals interaction with Phe790. Note that the nitro polar moiety ofBD-5 decreases the number of hydrophobic interactions so that itcannot assume a suitable fit in the active site.
4. Conclusion
In conclusion, we performed the synthesis of 6 butenolidederivatives of digoxin and showed that the dimethylamine
benzylidene butenolide derivative (BD-4) is as potent as digoxinagainst cancer cells. In contrast to digoxin, however, BD-4 is a poorNa,K-ATPase inhibitor but after 24-h incubation downregulatesNa,K-ATPase activity without altering its cellular expression, sug-gesting that the classical molecular mechanism of CS is notinvolved in the cytotoxic effect of this compound. The recently dis-covered Na,K-ATPase-mediated mechanisms, such as signal trans-duction by protein-protein interactions, is a matter that deservesfurther investigation.
Figure 6. Active site of ATPases complexed with ouabain. (A) Human model; (B) 3A3Y. The dashed lines represent hydrogen bonds.
Figure 7. Ramachandran plot of Na,K-ATPase. (A) ATPase human model; (B) Crystallographic structure PDB code 3A3Y.
Figure 8. Re-docking of BD-1 to 6 on Na,K-ATPase. (A) Re-docking of ouabain in the human ATPase model. Red: crystallographic; Yellow: docked structure. (B) Cluster of E-BD’s in the active site. (C) Cluster of Z-BD’s in the active site.
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Acknowledgments
We are grateful for the financial support from FAPEMIG(Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais)APQ-01114-12 and APQ-02596-12, FAPERJ (Fundação de Amparoa Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), CNPq (Conselho Nacionalde Desenvolvimento Científico e Tecnológico) 472394/2012-6and 476493/2013-7 and CAPES (fellowship to S.L.G.A. and N.P.).The authors are grateful for the financial and structural supportoffered by the University of São Paulo through the NAP-CatSinQ(Research Core in Catalysis and Chemical Synthesis) and RedeMineira de Química (RQ-MG).
Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, inthe online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2015.06.028.
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Figure 9. Pharmacophoric conformations of selected BD’s. (A) BD-4; (B) BD-5. The dashed lines represent hydrogen bonds.
Table 3Binding energy of BD’s compounds on Na,K-ATPase
Compound Binding energy (kcal/mol)
BD-1 (E/Z) �8.6/�10.2BD-2 (E/Z) �9.6/�9.6BD-3 (E/Z) �9.0/�9.8BD-4 (E/Z) �9.5/�9.5BD-5 (E/Z) �9.3/�9.5BD-6 (E/Z) �8.8/�8.9Ouabain �8.5Digoxin �9.0
4404 S. L. G. Alves et al. / Bioorg. Med. Chem. 23 (2015) 4397–4404