universidade federal de ouro preto nÚcleo de …

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EFEITOS DO TRATAMENTO COM SUSPENSÃO DE EXTRATO DE FOLHAS DE

Psidium guajava L. (GOIABEIRA) SOB A PRESSÃO ARTERIAL E BALANÇO

HIDROELETROLÍTICO DE RATOS WISTAR SOB DIETA COM SOBRECARGA DE

SÓDIO

Daiane Cristina de Assis Braga

Ouro Preto

2019

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EFEITOS DO TRATAMENTO COM SUSPENSÃO DE EXTRATO DE FOLHAS DE

Psidium guajava L. (GOIABEIRA) SOB A PRESSÃO ARTERIAL E BALANÇO

HIDROELETROLÍTICO DE RATOS WISTAR SOB DIETA COM SOBRECARGA DE

SÓDIO

Autora: Daiane Cristina de Assis Braga

Orientador: Prof. Dr. Leonardo Máximo Cardoso

Co-orientadora: Dra. Rosana Gonçalves Rodrigues das Dores

Dissertação apresentada ao programa de

Pós Graduação do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título de Mestre

em Ciências Biológicas, Área de

concentração: Bioquímica Metabólica e

Fisiológica.

Ouro Preto

2019

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

B813e Braga, Daiane Cristina de Assis. Efeitos do tratamento com suspensão de extrato de folhas de Psidiumguajava L. (goiabeira) sob a pressão arterial e balanço hidroeletrolítico de ratosWistar sob dieta com sobrecarga de sódio [manuscrito] / Daiane Cristina deAssis Braga. - 2019. 96f.: il.: color; grafs; tabs.

Orientador: Prof. Dr. Leonardo Máximo Cardoso. Coorientadora: Profª. Drª. Rosana Gonçalves Rodrigues das Dores.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Pró-Reitoria dePesquisa e Pós-Graduação. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.

1. Hipertensão. 2. Plantas medicinais. 3. Sódio - Metabolismo. I. Cardoso,Leonardo Máximo. II. Dores, Rosana Gonçalves Rodrigues das . III.Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.

CDU: 616.12-008.33

iv

Esse trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Fisiologia Endócrina e

Cardiovascular do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Ouro Preto, com auxílio da FAPEMIG, UFOP e recursos particulares dos

coordenadores do laboratório.

v

“Não há nada melhor do que despertar o prazer

e o amor pelo estudo, caso contrário só se

formam bons carregadores de livros”.

Michel Eyquem de Montaigne

vi

Dedico este trabalho a Deus, meus pais, meus

irmãos e meu namorado.

vii

AGRADECIMENTOS

Meus agradecimentos são direcionados a DEUS, pela sabedoria, paciência e

discernimento durante todas as etapas do mestrado, desde o processo de seleção até

a finalização.

Aos meus pais Evanildo e Ana Darque por todo amor, pela compreensão nos

momentos de ausência e por todo apoio.

Aos meus irmãos Poliane e Paulo pela amizade e por apoiarem as minhas escolhas

no decorrer do caminho.

Ao meu namorado Pedro, por sempre estar ao meu lado e não me deixar titubear nos

momentos mais difíceis e que pensei em desistir.

A universidade Federal de Ouro Preto por todos estes anos de aprendizado, a

FAPEMIG pelo apoio financeiro durante o mestrado e ao NUPEB pela oportunidade

de inserção na pós graduação.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Leonardo Máximo Cardoso, por ter me aceitado para

orientação, pela paciência e ensinamentos teóricos e práticos que contribuíram para

execução e finalização deste trabalho.

A minha co-orientadora, Dr Rosana, pela ajuda com a produção do extrato, todo

ensinamento teórico e toda paciência durante este percurso.

A Profa. Dra. Lisandra Brandino de Oliveira, pelo apoio, orientação de estágio,

fornecimento de materiais e troca de conhecimentos.

A Juliana pelo auxilio com o extrato desde a produção até as análises.

Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Endócrina e Cardiovascular, pelas colegas

Jaqueline e Paula e as alunas de iniciação cientifica, por todo companheirismo e ajuda

nos experimentos e nos momentos difíceis. Também aos alunos da professora

Lisandra.

Aos colegas do Laboratório de hipertensão, professora Andréia Alzamora por toda

contribuição durante este período.

Ao professor Gustavo do Laboratório de Fitotecnologia e aos alunos integrantes pelo

auxilio na preparação do extrato.

Ao Centro de Ciência Animal CCA/UFOP pelo fornecimento dos animais utilizados

nesse trabalho. Ao Laboratório de Nutrição Experimental ENUT/UFOP, em especial o

Clodoaldo pela disponibilidade com a trituração da ração.

A Dra. Andrea Haibara e Dr. Wanderson por aceitarem compor a banca.

viii

RESUMO

A hipertensão arterial (HA) é uma doença crônica multifatorial que tem grande

prevalência na população mundial atualmente. Um dos fatores de risco é a

alimentação com alto teor de sódio. Algumas classes de medicamentos já são

destinados ao tratamento da hipertensão. Contudo, em decorrência de efeitos

colaterais, falta de eficiência na redução dos níveis pressóricos e intolerância a estes

medicamentos, tem aumentado a necessidade de descoberta para novos

medicamentos. Estudos etnofarmacológicas têm apontado várias plantas como

potenciais agentes anti-hipertensivos, dentre eles Psidium guajava L. (goiabeira). O

objetivo desse trabalho foi investigar o potencial anti-hipertensivo da suspensão obtida

a partir do extrato etanólico de folhas de Psidium guajava L. (SPs) em um modelo de

hipertensão sódio-dependente e avaliar possíveis mecanismos correlacionados à

ação hipotensora. Para tanto, ratos Wistar foram submetidos a uma dieta contendo

0,9% de Na+ - grupo High salt (HS) ou 0,27% de Na+ grupo controle do desmame até

a 16ª semana. Nas últimas 4 semanas, com hipertensão já estabelecida no grupo HS,

animais de ambos os grupos foram subdivididos para diferentes tratamentos.

Consumo de ração, sódio, ingestão de água e medida de volume urinário foram feitos

em gaiolas metabólicas na 12ª e 16ª semanas por 24 horas. A partir da 13ª semana

pós desmame, os animais começaram a receber, via gavagem, suspensão de extrato

de folhas de goiabeira (SPs, 100 mg.kg-1 ou 200 mg.kg-1), furosemida (20 mg.kg-1) ou

1 mL de água destilada (placebo) por 4 semanas. Ao final do tratamento, pressão

arterial foi medida por método direto em animais com livre movimentação na gaiola

(não-anestesiados) e um teste farmacológico para se avaliar “drive” simpático foi feito

com hexametônio (20 mg.kg-1). SPs foi caracterizado quantitativamente por dosagens

de compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante e qualitativamente por

CLAE-UV. Os resultados mostram que o processo de extração preserva vários

fitoquímicos com ação potencial no sistema cardiovascular. O tratamento com SPs foi

efetivo em reverter o quadro de hipertensão nos animais HS sem produzir hipotensão

em ratos controle. A dose efetiva para esse efeito foi a da 200 mg.kg-1 reduzindo os

níveis pressóricos basais dos animais do grupo HS SPs 200 em 10% em relação ao

grupo HS placebo. Os dados de balanço hidroeletrolítico sugerem que o SPs não

produziu efeito diurético. Por outro lado, os experimentos com hexametônio sugerem

um efeito sobre a atividade simpática que pode ser responsável por pelo menos parte

ix

dos efeitos anti-hipertensivos do SPs. Portanto, conclui-se que o SPs pode ser um

agente anti-hipertensivo com uso potencial no tratamento da hipertensão arterial, em

especial a origem sódio-dependente.

x

ABSTRACT

Hypertension (HA) is a chronic multifactorial disease that has a high prevalence in the

world population today. One of the risk factors is high sodium diet. Some classes of

medications are already intended for the treatment of hypertension. However, as a

result of side effects, lack of efficiency in reducing blood pressure levels and

intolerance to these drugs, the need for new drug discovery has increased.

Ethnopharmacological studies have pointed to several plants as potential

antihypertensive agents, among them Psidium guajava L. (guava). The objective of

this study was to investigate the antihypertensive potential of the suspension obtained

from the ethanolic extract of Psidium guajava L. (SPs) in a model of sodium-dependent

hypertension and to evaluate possible mechanisms correlated to the hypotensive

action. For this, Wistar rats were submitted to a diet containing 0.9% Na + - High salt

group (HS) or 0.27% Na + wean control group until the 16th week. In the last 4 weeks,

with hypertension already established in the HS group, animals from both groups were

subdivided for different treatments. Feed intake, sodium, water intake, and urinary

volume were measured in metabolic cages at 12 and 16 weeks for 24 hours. From the

13th week after weaning, the animals started receiving guava leaves suspension (SPs,

100 mg.kg-1 or 200 mg.kg-1), furosemide (20 mg.kg-1) ) or 1 mL of distilled water

(placebo) for 4 weeks. At the end of treatment, blood pressure was measured by direct

method in animals with free movement in the cage (non-anesthetized) and a

pharmacological test to evaluate sympathetic drive was done with hexamethonium (20

mg.kg-1). SPs was characterized quantitatively by dosages of phenolic compounds,

flavonoids, and antioxidant activity and qualitatively by HPLC-UV. The results show

that the extraction process preserves several phytochemicals with potential action in

the cardiovascular system. Treatment with SPs was effective in reversing the

hypertension in HS animals without producing hypotension in control mice. The

effective dose for this effect was 200 mg.kg-1 reducing basal blood pressure levels of

the HS SPs 200 group by 10% compared to the HS placebo group. Hydroelectrolyte

balance data suggest that SPs did not produce a diuretic effect. On the other hand,

hexamethonium experiments suggest an effect on sympathetic activity that may be

responsible for at least part of the antihypertensive effects of SPs. Therefore, it is

concluded that SPs may be an antihypertensive agent with potential use in the

treatment of arterial hypertension, especially sodium-dependent origin.

xi

SUMÁRIO

RESUMO.................................................................................................................. viii

ABSTRACT ................................................................................................................. x

LISTA DE ABREVIAÇÃO ......................................................................................... xiii

LISTA DE TABELAS E QUADROS .......................................................................... xiv

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................ xv

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1

2. REFERENCIAL TEORICO ................................................................................... 4

2.1. Compostos bioativos em extrato etanólico de folhas de Psidium guajava L. . 4

2.1.1. Compostos fenólicos ............................................................................... 5

2.1.2. Atividade antioxidante ............................................................................ 10

2.2. Hipertensão arterial e sua relação com o sódio ........................................... 11

2.3. Hipertensão arterial e sua terapia ................................................................ 15

3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 19

4. METODOLOGIA ................................................................................................. 20

4.1. Obtenção de extrato etanólico de folhas de goiabeira ................................. 20

4.2. Caracterização do extrato etanólico de folhas de P. guajava ....................... 21

4.2.1. Doseamento de compostos fenólicos .................................................... 21

4.2.2. Determinação dos teores de flavonoides ............................................... 22

4.2.3. Determinação da atividade de antioxidante ........................................... 22

4.2.4. Identificação de compostos presentes no EBFG por CLAE-UV ............ 23

4.3. Avaliação dos efeitos biológicos do SPs ..................................................... 24

4.3.1. Animais e grupos experimentais ............................................................ 24

4.3.2. Medidas de ingestão de água, consumo alimentar e volume urinário ... 27

4.3.3. Tratamento com extrato etanólico de folhas de goiabeira ..................... 27

4.3.4. Registro de pressão arterial ................................................................... 28

xii

4.3.5. Avaliação farmacológica do “drive” simpático ........................................ 29

4.4. Ética no uso animal ...................................................................................... 30

4.5. Análises dos dados ...................................................................................... 30

4.5.1. Análise de consumo de ração, água e excreção urinária ...................... 30

4.5.2. Analise de dados cardiovasculares ....................................................... 30

4.5.3. Análises estatísticas .............................................................................. 31

5. RESULTADOS ................................................................................................... 32

5.1. Rendimento do extrato, caracterização organoléptica e física ..................... 32

5.2. Doseamento dos compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante.

32

5.3. Caracterização de compostos fitoquímicos presente do SPs por CLAE-UV

35

5.4. Peso corporal e parâmetros hidrominerais ................................................... 37

5.4.1. Peso corporal......................................................................................... 37

5.4.2. Ingestão de ração e de sódio ................................................................ 40

5.4.3. Ingestão de água e volume urinário ....................................................... 44

5.5. Pressão arterial média e frequência cardíaca .............................................. 48

5.6. Avaliação farmacológica do “drive” simpático .............................................. 50

5.6.1. Resposta da pessão arteria à injeção de hexametônio ......................... 50

5.6.2. Resposta da frequência cardíaca à injeção de hexametônio ................ 52

6. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 54

7. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 61

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 62

ANEXOS ................................................................................................................... 76

xiii

LISTA DE ABREVIAÇÃO

AAT – Atividade antioxidante

BHA – 2,3-terc-butil-4-hidroxianisol

CLAE – Cromatografia liquida de alta eficiência

DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

BPM – Batimentos por minuto

EBPs – Extrato bruto de Psidium guajava L.

FC – Frequência Cardíaca

GA – Ácido gálico

GAE – Equivalente de ácido gálico

HR – Heart Rate

HS – High salt

LCE – Líquido cérebro-espinhal

MAP – Mean Arterial Pressure

Na+ – Sódio

NaCl – Cloreto de sódio

OVLT – Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal

PVN – Núcleo Paraventricular do Hipotálamo

PA – Pressão arterial

PAM – Pressão arterial média

RVLM – Núcleo rostro-ventrolateral do bulbo

SFO – Órgão Subfornical

SHR – Ratos espontaneamente hipertensos

SNS – Sistema nervoso central

SPs – Suspensão aquosa de extrato de Psidium guajava L.

xiv

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1 - Análise da qualidade organoléptica e física dos extratos bruto (EBPs) e

suspensão de extrato (SPs) de folhas de goiaba. .............................................. 32

Quadro 1 - Compostos identificados por CLAE-UV no EBPs. Ouro Preto, 2019...... 36

xv

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Esquema de divisão dos compostos fenólicos. Adaptação (Paredes-Lópes,

Cervantes-Ceja et al. 2003) .................................................................................. 5

Figura 2 - Fórmula estrutural do ácido gálico. Fonte: Sigma Aldrich, 2018. ............... 6

Figura 3 - Fórmula estrutural dos flavonoides. Fonte: Sigma Aldrich, 2018 ............... 7

Figura 4 - Fórmula estrutural da rutina. Fonte: Sigma Aldrich, 2018 .......................... 7

Figura 5 - Fórmula estrutural da quercetina. Fonte: Sigma Aldrich, 2018 .................. 8

Figura 6 - Formação de rutina a partir de quercetina (Pedriali 2005). ........................ 9

Figura 7 - Formação de radicais livres e atuação dos antioxidantes ........................ 11

Figura 8 - Produção do EBPs. Painel A: Psidium guajava L. B. Folhas de Psidium

guajava L. C. Pós-colheita de folhas. D. Maceração. E. Extração total de

compostos bioativos. F. Processo evaporativo em rotavapor. G. Processo

evaporativo em banho maria. H. EBPs. .............................................................. 21

Figura 9. Delineamento experimental do estudo ...................................................... 26

Figura 10 - Esquema de gaiolas metabólicas utilizadas no experimento. A. Consumo

de ração, no painel B, a ingestão de água e no painel C a coleta de fezes e urina

............................................................................................................................ 27

Figura 11 - Sistema utilizado para aferição de pressão arterial a partir do PowerLab.

............................................................................................................................ 29

Figura 12 - Doseamento de compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante

do EBPs. Painel A: Doseamento dos compostos fenólicos para o extrato alcoólico

seco de folhas de P. guajava (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de

P. guajava L. (SPs). Cada círculo representa valores individuais de uma

quadruplicata. Painel B: Dosagem de flavonoides para extrato alcoólico seco de

folhas de P. guajava (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de P.

guajava L. (SPs). Cada círculo ou quadrado representa valores individuais de uma

quintuplicata. Painel C: Atividade antioxidante para extrato alcoólico seco de

folhas de P. guajava L. (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de P.

guajava L. (SPs) e butilhidroxianisol (BHA). Cada círculo representa valores

individuais de uma quadruplicata. As barras representam valores médios de EBPs

e SPs com seu respectivo erro padrão da média. N=4 e 5. * diferente do EBPs; #

diferente de EBPs e SPs (ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni;

p<0,05). .............................................................................................................. 34

xvi

Figura 13 - Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e detector ultravioleta (UV)

do EBPs. Compostos majoritários encontrados foram rutina (5), quercetina (9) e

galocatequina (10). Coluna C18 DAD-UV Waters 2996, 200 mm x 4,6 mm, 5µm;

fluxo da fase móvel: 1 mL.min-1.Gradiente fase móvel ácido fórmico 2% em água

(solvente A) e acetonitrila (solvente B). 0 a 20 min (5% de A e 95% de B); 20,1 a

40 min (15% de A e 85% de B); 40,1 a 43 min (30% de a e 70% de B); 43,1 min

em diante (5% de A e 95% de B); e 70% de B); 43,1 min em diante (5% de A e

95% de B). Comprimento de onda 365nm. ......................................................... 35

Figura 14 - Peso corporal (Body Weight) de ratos Wistar Cont e HS que receberam

os tratamentos com SPs por 4 semanas. Painel A: peso corporal de ratos que

receberam SPs na dose de 100 mg.kg-1. Painel B: peso corporal de ratos que

receberam SPs na dose de 200 mg.kg-1. Painel C: peso corporal de ratos que

receberam furosemida na dose de 20 mg.kg-1. Área sombreada em verde nos

painéis A, B e C representam o período de tratamento após as 12 semanas sob

dietas normais (0,27% de Na+) ou com sobrecarga de sódio (0,90% Na+).

*diferente de controle placebo. O painel D (Δ Body Weight) representa a variação

de peso corporal entre a 12ª (ao início) e a 16ª (ao final do tratamento) semanas.

Letras diferentes indicam diferença entre os pares de médias. (ANOVA de 2 vias,

seguida por Bonferroni; p<0,05). Cada círculo ou quadrado representa valores

individuais. N=7. A barras representam valores médios de animais Cont e HS com

seu respectivo erro padrão da média.................................................................. 39

Figura 15 - Ingestão de ração e ingestão de Na+ de ratos Wistar sob dieta controle

(0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio (0,90% de Na+) na 12ª semana (antes

do tratamento) e 16ª semana (ao final do tratamento). Painel A: ingestão de ração

de animais HS e controle placebo. Painel B: ingestão de ração de animais HS e

controle SPs 100 mg.kg-1. Painel C: ingestão de ração de animais HS e controle

SPs 200 mg.kg-1. Painel D: ingestão de ração de animais HS e controle

furosemida 20 mg.kg-1. Painel E: ingestão de Na+ de animais HS e controle

Placebo. Painel F: ingestão de Na+ de animais HS e controle 100 mg.kg-1. Painel

G: Ingestão de Na+ de animais HS e controle 200 mg.kg-1. Painel H: ingestão de

Na+ de animais HS e controle furosemida 20 mg.kg-1. Círculos cinzas (grupos que

receberam dieta controle) e quadrados pretos (grupos que receberam dietas com

alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais de cada animal dos

xvii

seus respectivos grupos. As barras representam valores médios e seus

respectivos erros padrão da média. N=7. * diferente de controle. # diferente de HS

(ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni; p<0,05). ................... 43

Figura 16 - Ingestão de água e Volume urinário de ratos Wistar sob dieta controle

(0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio (0,90% de Na+) na 12ª semana (antes

do tratamento) e 16ª semana (ao final do tratamento). Painel A: ingestão de água

de animais HS e controle placebo. Painel B: ingestão de água de animais HS e

controle SPs 100 mg.kg-1. Painel C: ingestão de água de animais HS e controle

200 SPs mg.kg-1. Painel D: ingestão de água de animais HS e controle furosemida

20 mg.kg-1. Painel E: volume urinário de animais HS e controle placebo. Painel F:

volume urinário de animais HS e controle SPs 100 mg.kg-1. Painel G: volume

urinário de animais HS e controle SPs 200 mg.kg-1. Painel H: volume urinário de

animais HS e controle furosemida 20 mg.kg-1. Círculos cinzas (grupos que



seus respectivos grupos. As barras representam valores médios com seus

respectivos erros padrão da média. N=7. * diferente de controle. # diferente de HS

e controle (ANOVA de 2 vias, seguida por Bonferroni; p<0,05). ......................... 47

Figura 17 – Pressão arterial média (MAP, painel A) e frequência cardíaca (HR, painel

B) de ratos Wistar sob dieta controle (0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio

(0,90% de Na+) ao final dos tratamentos com placebo, SPs 100 mg.kg-1, SPs 200

mg.kg-1 e furosemida 20 mg.kg-1 na 16ª semana pós-desmame. Círculos cinzas

(grupos que receberam dieta controle) e quadrados pretos (grupos que receberam

dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais de cada

animal dos seus respectivos grupos. As barras representam valores médios da

PAM ou FC com seus respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes

indicam diferenças entre pares de médias (ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-

teste de Bonferroni; p<0,05). .............................................................................. 49

Figura 18 – Pressão arterial média (PAM) de ratos Wistar Cont e HS sob os diferentes

tratamentos (painéis A, C e E) antes e após a administração endovenosa de

hexametônio (20 mg.kg-1). A linha tracejada cinza marca o momento da injeção

de hexametônio. Os painéis B, D e F mostram a variação máxima de pressão

arterial em decorrência da administração de hexametônio em animais Cont e HS

xviii

sob os diferentes tratamentos. Círculos cinzas (grupos que receberam dieta

controle) e quadrados pretos (grupos que receberam dietas com alto teor de

sódio) dispersos representam valores individuais de cada animal dos seus

respectivos grupos. As barras representam valores médios da PAM ou FC com

seus respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes indicam diferença

significativa entre pares de médias. * diferente de controle placebo; ANOVA de 2

vias, seguida pelo pós-teste de Tukey; p<0,05. .................................................. 51

Figura 19 – Frequência cardíaca (HR) de ratos Wistar Cont e HS sob os diferentes

tratamentos (painéis A, C e E) antes e após a administração endovenosa de

hexametônio (20 mg.kg-1). A linha tracejada cinza marca o momento da injeção

de hexametônio. Os painéis B, D e F mostram as variações máximas de

frequência cardíaca em decorrência da administração de hexametônio em

animais Cont e HS sob os diferentes tratamentos. Círculos cinzas (grupos que



seus respectivos grupos. As barras representam valores médios da PAM ou FC

com seus respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes indicam

diferença significativa entre pares de médias. * diferente de controle placebo;

ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Tukey; p<0,05. ............................ 53

1

1. INTRODUÇÃO

Hipertensão arterial (HA) é uma doença crônica degenerativa multifatorial, na

maioria das vezes assintomática e de evolução lenta e progressiva (Boing e Boing,

2007). Pode ser definida como elevação crônica da pressão arterial, sendo uma das

doenças que mais afetam a saúde e a qualidade de vida (Gauer et al., 2014) com

prevalência estimada de 15%. No Brasil, atinge cerca de 30% da população (Who,

2019).

Dentre os fatores que podem acarretar a HA, além do envelhecimento

populacional, da predisposição genética, do sedentarismo, tabagismo e etilismo,

incluem-se os hábitos alimentares como a alta ingestão de sal (NaCl) na dieta (Vasan

et al., 2002). A adição de sal aos alimentos é um hábito que, de acordo com a história,

se inicia na China, por volta de 6.000 a.C. (Ha, 2014). Cerca de 5.000 anos a.C.,

quando o sal começou a ser usado para conservar e condimentar alimentos, seu

consumo por humanos vem crescendo, atingindo a média diária de 12 g.dia-1 no

século XIX (Ha, 2014) e se mantendo na ordem de 10 a 11 g.dia-1 ainda hoje

(Rodrigues et al., 2015). Esses índices de consumo de sal estão cerca de 10 a 12

vezes maior do que aquilo que era estimado para populações humanas que

antecedem o início do processamento de alimentos com sal (cerca de 1 g.dia-1) (Ha,

2014) e, portanto, significativamente acima do consumo médio para o qual nossos

sistemas homeostáticos de balanço hidroeletrolítico foram “programados” para

administrar num decurso maior de nossa evolução. Os impactos que essas mudanças

de hábitos alimentares tiveram em nossa fisiologia ainda é objeto de muitos estudos

e pode representar, de fato, um fator importante no desenvolvimento de hipertensão

arterial no homem moderno.

No tratamento da HA, associam-se as terapêuticas farmacológicas e não

farmacológicas (controle nutricional e inserção de atividade física diária). Na

farmacológica, as classes de medicações anti-hipertensivas (tratamento

farmacológico) incluem os diuréticos, betabloqueadores adrenérgicos, antagonistas

alfa-adrenérgicos, inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA),

bloqueadores do receptor AT1 da angiotensina II (BRA II) e antagonistas dos canais

de cálcio (Longo et al., 2011). Contudo, nem todos os hipertensos toleram bem o

tratamento com utilização de fármacos, podendo ter efeitos colaterais importantes

(Olaleye et al., 2013). Além disso, constatou-se nos últimos anos um crescimento no

2

número de pacientes hipertensos que são refratários ao repertório farmacológico

disponível hoje para o tratamento da HA. Portanto, é mister que se busque novos

medicamentos que aumentem o gama das opções terapêuticas disponíveis. No que

tange a conjuntura atual em pesquisa de novos medicamentos, uma das opções em

voga são os medicamentos fitoterápicos.

Por fitoterápicos, entende-se medicamentos que são obtidos com emprego

exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, sendo caracterizados pelo

conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade

e constância de sua qualidade. A eficácia e a segurança devem ser validadas por

estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos e clínicos. O controle de qualidade

de fitoterápicos abrange avaliações da matéria-prima vegetal, tanto a droga como

derivado e do produto final (Brasil, 2019a).

O Sistema Único de Saúde (SUS) tem indicado a utilização de plantas

medicinais no cuidado de saúde da população para direcionar pesquisas com plantas

medicinais, cujo objetivo é a produção de medicamentos fitoterápicos por

laboratórios públicos e/ou privados e produção de publicações técnico-científicas

com plantas nativas brasileiras. E ainda, contribuir com a assistência farmacêutica,

atuando na promoção da segurança e eficácia de plantas medicinais e fitoterápicos,

usados na atenção básica em saúde (Brasil, 2019b). Já existem doze medicamentos

fitoterápicos com patentes registradas pelo SUS para diversas indicações como para

uso ginecológico, tratamento de queimaduras, auxiliares terapêuticos de gastrite e

úlcera, além de medicamentos com indicação para artrite e osteoartrite. (Brasil,

2019a).

Em 2013/2014, Psidium guajava L (goiabeira) foi incluída na relação de

Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (Renisus), principalmente pelo seu uso

etnofarmacológico como antidiarreico e desordens gastrointestinais.

Estudos etnobotânicos e etnofarmacológicos e experimentais reportaram

algumas propriedades do uso dos frutos “in natura”, dos infusos e extratos de folhas,

cascas e frutos da goiabeira como a ação antioxidante (Nair e Chanda, 2007; Díaz-

De-Cerio et al., 2016), anti-inflamatório (Ojewole, 2006), antitussígeno (Joseph e

Priya, 2011), antidiarreico, antiparasitário (Begum et al., 2004), hepatoprotetor (Roy et

al., 2006), antimicrobiano (Growther e K, 2018), como analgésico e protetor de

doenças cardiovasculares (Barbalho et al., 2012; Mehta et al., 2018) e ainda no

3

controle obesidade, Diabetes mellitus (Begum et al., 2004), na redução dos níveis

glicêmicos e controle da HA (Ojewole, J. a. O., 2005).

Grande parte da população acredita que por ser natural, a Fitoterapia, ou uso

de plantas medicinais, droga vegetal ou medicamentos fitoterápicos são isentos de

contraindicações, não ocasionando nenhum dano à saúde. Em contrapartida, as

pesquisas clínicas têm comprovado a necessidade de se estabelecer doses

terapêuticas para cada indicação popular, isentando-as de toxicidade e/ou efeitos

colaterais que inviabilizem seu uso.

Baseado na literatura técnico-científica, os estudos sobre aplicabilidade do

extrato de folhas de P. guajava L. no tratamento da hipertensão ainda são insipientes.

Não há, ao melhor de nosso conhecimento, registro de medicamentos fitoterápico

disponível para atuar como coadjuvante no tratamento da hipertensão sódio

dependente desenvolvidos a partir de P. guajava L. Sendo assim, esse trabalho

buscou avaliar, experimentalmente, o potencial anti-hipertensivo do tratamento

crônico, por via oral, de ratos hipertensos com doses regulares da SPs e caracterizar

o perfil fitoquímico do (EBPs) e da SPs à base de extrato usada como fármaco quanto

a seus teores de flavonoides, compostos fenólicos e atividade antioxidante. Objetivou-

se também avaliar possíveis mecanismos de ação para os efeitos do extrato como

efeito sistema controle autonômico cardiovascular ou efeito diurético. Assim, a

hipótese foi de que o tratamento crônico regular com suspensão obtida a partir do

extrato etanólico de folhas de P. guajava L. (SPs) fosse efetiva em reverter o quadro

de hipertensão estabelecido pelo consumo excessivo de sal por ratos da linhagem

Wistar.

4

2. REFERENCIAL TEORICO

2.1. Compostos bioativos em extrato etanólico de folhas de Psidium guajava

L.

Goiabeira (Psidium guajava L.) é um arbusto originário da África e se

distribuiu por diversos países do mundo. Suas folhas são simples, podendo ser

elípticas ou ovais, com nervuras proeminentes (Van Wyk et al., 2002; Zieremann e

Roberto, 2007). O arbusto pertence à família Myrtaceae e ao gênero Psidium,

possuindo aproximadamente 70 gêneros e 2.800 espécies (Poll et al., 2011). Pode

atingir cerca de seis a oito metros de altura (Haida et al., 2015). O fruto pode ser

utilizado para preparo de doces, geleias, xaropes e sucos (Lozoya et al., 2002). Podem

ser utilizadas folhas e cascas para diversas finalidades, dentre elas, para consumo

medicamentoso (Amaral et al., 2006).

Levantamento etnobotânicos aponta os usos tradicionais de folhas, cascas e

frutos de goiabeira como antidiarréico, no tratamento de vertigem, dores de garganta,

distúrbios menstruais, tosse, gastroenterite, inchaço, feridas na boca, dores de dente,

dor no estomago e conjuntivite (Dakappa et al., 2013). Estudos farmacológicos

reportam a eficácia dos extrato de folhas de goiabeira como antidiabético,

antidiarreico, anticancerígeno, antiinflamatorio, antimicrobiano, antioxidante,

hepatoprotetor, antipirético, espasmolítico, imunomodulador, antitussígeno e

anticariogênico (Bijauliya et al., 2017). Extratos preparados a partir de folhas e de

frutos também mostraram efeito hipotensor, hipglicemiante anti-úlceras, melhora da

bronquite e reumatismo (Ojewole, J. a. O., 2005; Ojewole, 2006; Ayub et al., 2010;

Bijauliya et al., 2017).

Das partes aéreas de Psidium guajava L., já foram isolados ácido gálico,

flavonoides, ácido galacturônico, ácido elágico, óleos essenciais, ácido glutâmico,

ácido guavacumarico guajavarina, guajiverina, ácido guajivólico, guajavolide, ácido

guavenóico, ácido guajavanóico, hiperina, ácido isoneriucumarico, isoquercetina,

limoneno, ácido linoléico, ácido linolênico, miricetina, ácido mirístico, nerolidiol,

obtusinina, ácido oleanólico, ácido oleico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido

palmitoleico, polifenóis, ácido psidiólico, quercetina, quercitrina, sesquiguaveno,

taninos, terpenos e ácido ursólico (Bijauliya et al., 2017). Evidências experimentais

sugerem que alguns desses compostos extraídos de P. guajava L. atuam como

agentes redutores de pressão arterial. A exemplo, quercetina, administrada por via

5

oral, reduziu níveis pressóricos de ratos Dahl-Salt (Mackraj et al., 2008) e preveniu

também o infarto no miocárdio em ratos Wistar com redução dos níveis pressóricos

(Jaliah, 2017). Além de seus efeitos protetores contra infarto (Annapurna et al., 2009),

a rutina também demonstra efeitos anti-hipertensivos em ratos Wistar com

hipertensão induzida por L-NAME. (Da Rocha Lapa et al., 2011). Rutina e quercetina

também mostraram ser efetivas contra a hipertensão em ratos Dahl Salt (Olaleye et

al., 2013), o que reforça a hipótese de que produtos vegetais que contenham estes

compostos em grande quantidade são bons candidatos a medicamentos anti-

hipertensivos.

2.1.1. Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são resultantes do metabolismo de vegetais, sendo

esses formados por um anel aromático ligado a hidroxila, são solúveis em água e

podem estar combinados com um açúcar (Rockenbach et al., 2018 ). O esquema da

Figura 1 demonstra a alguns dos compostos fenólicos.

Figura 1 - Esquema de divisão dos compostos fenólicos. Adaptação (Paredes-Lópes, Cervantes-Ceja

et al. 2003)

Uns dos compostos fenólicos presentes no extrato de folha de goiabeira é o ácido

gálico (HO)3C6H2CO2H cuja arranjo é mostrado na Figura 2.

6

Figura 2 - Fórmula estrutural do ácido gálico. Fonte: Sigma Aldrich, 2018.

O ácido gálico é precursor de outros fenólicos. A produção de ácido gálico pela

planta é essencial ao seu crescimento, desenvolvimento e desempenha função na

defesa contra fatores externos (Ramirez-Estrada et al., 2016). Taninos são polímeros

de ácido gálico esterificados com açúcares. Esses fenólicos precipitam proteínas

transformando-as em derivados insolúveis e essa propriedade é muito importante na

proteção contra herbivoria, pois faz com que o material vegetal torne-se pouco

palatável e com menor valor nutricional (De Rezende et al., 2016 ).

Em mamíferos, os efeitos biológicos do ácido gálico são ação anti-inflamatória,

antimicrobiana, hipolipidêmica, anticarcinogênica, atividade antioxidante, efeito

anticancerígeno, melhora nos níveis glicêmicos, atenua remodelação e fibrose

cardíaca (Wang et al., 2014; Jin et al., 2017; Jina Li et al., 2017; Doan et al., 2015).

Dentro do grupo dos fenólicos, encontram-se os flavonoides. Os flavonoides

estão presentes em diversos alimentos como frutos, raízes e grãos (Panche et al.,

2016). Esse composto tem ações biológicas importantes para o tratamento de

doenças como câncer e doenças cardiovasculares (Castañeda-Ovando et al., 2009).

Os flavonoides agem na proteção contra raios ultravioleta e insetos além de

proporcionarem atração de animais polinizadores (Dos Santos e Rodrigues, 2017).

A estrutura química dos flavonoides consiste em dois anéis aromáticos que

podem lhe conferir a característica antioxidante e suas demais funções. Isso se dá por

sua reatividade, capaz de sequestrar radicais livres e quelar íons, impedindo ou

revertendo processos oxidativos (Henrique e Lopes, 2018).

Os flavonoides, pertencente aos compostos fenólicos, (Figura 3) são derivados

de dois compostos, o ácido chiquímico e acetil-CoA. O ácido chiquímico dá origem a

fenilalanina que, posteriormente forma o ácido cinâmico, estrutura formadora do anel

aromático B e três átomos de carbono. O acetil CoA forma três moléculas de malonil-

7

CoA, formando os anéis A e C. As diversas reações químicas decorrentes do processo

de formação, permitem que haja diversidade de compostos fenólicos formados

(Pereira et al., 2016).

Figura 3 - Fórmula estrutural dos flavonoides. Fonte: Sigma Aldrich, 2018

A rutina (Figura 4) é um flavonoide, cuja estrutura é derivada da quercetina

(Figura 6), diferenciando-se da quercetina pela presença de uma ligação glicosídica

na posição 3 do anel central e que tem sido utilizada pela indústria pelo seu poder

antioxidante (Chua, 2014). A rutina previne insuficiência venosa e permeabilidade

capilar (Velasco et al., 2008). Sua ação também está relacionada a propriedade anti-

hipertensiva. A rutina e a quercetina são flavonoides que também estão presentes no

extrato de folhas de goiabeira e mostraram ser eficazes na melhora de desequilíbrio

redox e na redução de pressão arterial (Olaleye et al., 2013).

Figura 4 - Fórmula estrutural da rutina. Fonte: Sigma Aldrich, 2018

A quercetina (Figura 5) é outro flavonoide com ação anti-hipertensiva já

reportada na literatura e capaz de reduz a hipertrofia no coração em ratos por

8

mecanismos que parecem envolver aumento na produção de óxido nítrico e o sistema

renina angiotensina (Choi et al., 2016). A sua ação hipotensora também parece

envolver redução da tonicidade vascular, reduzir volume circulante e aumento da

sensibilidade do “drive” parassimpático (Lozoya et al., 2002).

Figura 5 - Fórmula estrutural da quercetina. Fonte: Sigma Aldrich, 2018

9

Figura 6 - Formação de rutina a partir de quercetina (Pedriali 2005).

10

2.1.2. Atividade antioxidante

Os radicais livres têm sido relacionados à origem de diversas complicações na

saúde humana que incluem o desenvolvimento de carcinomas e de doenças

cardiovasculares. Quando ocorre um desiquilíbrio entre a produção e eliminação de

espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio associado a detrimento celular, ocorre o

evento denominado estresse oxidativo, que pode ser produtor de lesões e até mesmo

morte das células (Pisoschi e Pop, 2015). Dentre as espécies reativas de oxigênio, há

os radicais livres, espécies reativas que contêm um ou mais elétrons

desemparelhados (Oliveira, 2016).

O metabolismo oxidativo é uma fonte contínua e importante de produção de

espécies reativas de oxigênio endogenamente. O principal protagonista deste

processo é a mitocôndria, onde os processos bioquímicos de produção do ATP

acabam por permitir a formação de ânion superóxido. Outros processos endógenos

de produção de espécies reativas de oxigênio incluem reações enzimáticas como as

catalisadas pela xantina oxidase (XO), flavina oxidase nos peroxissomos, citocromo

P450 no retículo endoplasmático (Song e Zou, 2015) e NADPH oxidase em diversas

células (Hussain et al., 2003). Fatores externos como ingestão de álcool, tabaco,

dietas contendo alto teor de gordura, açúcar, baixo consumo de fibras, atividade física

praticada de forma inadequada, fármacos e radiação levam ao aumento excessivo na

produção de espécies reativas (Grzesik et al., 2018).

Os antioxidantes são elementos que podem inibir o estresse oxidativo

(Vasconcelos et al., 2014) com atuação enzimáticos ou não-enzimáticos. As enzimas

antioxidantes são superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase (Oliveira,

2016). A enzima superóxido dismutase catalisa a dismutação do ânion superóxido em

peróxido de hidrogênio. A glutationa peroxidase degrada peróxido de hidrogênio

utilizando a glutationa com co-fator doador de elétrons e a catalase catalisa a

dismutação do peróxido de hidrogênio a água e oxigênio molecular. Tanto glutationa

peroxidase, quanto a glutationa oxidase utilizam glutationa reduzida nas suas reações,

permitindo sua oxidação e formação de glutationa oxidada. Para que o sistema

funcione adequadamente é necessária à redução da glutationa oxidada em glutationa

reduzida, catalisada pela glutationa redutase (Huber e Almeida, 2008). Os elementos

antioxidantes não enzimáticos podem ser os carotenoides, vitamina E e os

flavonoides. Os flavonoides inibem a peroxidação lipídica, a enzima oxidase da

11

xantina, oxidação das LDL, sendo fatores relacionados com diminuição do risco de

doenças cardiovasculares (Conceição et al., 2017).

De uma forma geral, extratos vegetais possuem elevada atividade antioxidante

por conter elevados teores de compostos fenólicos e flavonoides (Mercadante et al.,

1999; Melo et al., 2009; Manikandan e Vijaya-Anand, 2015). Assim, seus efeitos

biológicos podem ser atribuídos, pelo menos em parte, a seus efeitos antioxidantes,

em especial quando utilizados no tratamento de doenças que sabidamente envolvem

desequilíbrios no estado redox. Contudo, resta saber ainda se os efeitos biológicos de

extratos vegetais podem ser atribuídos a efeitos antioxidantes indiscriminados ou se

moléculas específicas como flavonoides e compostos fenólicos possuem

propriedades físico-químicas que direciona seus efeitos antioxidantes a alvos chave

em mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelo desenvolvimento de doenças

como as cardiovasculares e hipertensão arterial. A Figura 7 representa o mecanismo

de ação de antioxidantes.

Figura 7 - Formação de radicais livres e atuação dos antioxidantes

Fonte: http://rspress.com.br/health4life - apud (Vasconcelos, Cardoso et al. 2014)

2.2. Hipertensão arterial e sua relação com o sódio

A HA é uma condição caracterizada pelo aumento expressivo dos níveis de

pressão sanguínea, podendo não apresentar sintomas. É, atualmente um problema

12

de saúde pública com prevalência estimada de 15%. No Brasil, atinge cerca de 30%

da população (Who, 2019).

Dentre as causas mais comuns da hipertensão, pode-se destacar o avanço da

idade, principalmente em indivíduos com mais de 50 anos, excesso de calorias na

dieta, consumo exacerbado de álcool, fatores genéticos e a ingestão de alto teor de

sódio na alimentação (Harrington et al., 2010; Ibraim e Damasceno, 2012; Chulvi

Medrano et al., 2016). Como consequência, a hipertensão pode levar ao

desenvolvimento de doenças cardiovasculares como acidente vascular cerebral e

doenças coronárias (Weber et al., 2004).

Nesse trabalho, é de particular interesse os fatores associados a hábitos

alimentares, em especial o consumo elevado de sódio na dieta. Em 2015, Averina e

colaboradores estabeleceram que a sensibilidade da pressão arterial ao sal pode ser

definida por elevação sustentada de 10 mmHg na pressão arterial média para

aumento de 5 vezes o normal na ingestão de sódio (Averina et al., 2015). Em 2017,

Gomes e colaboradores mostraram que o aumento de mais de 10 mmHg na pressão

arterial média já ocorria em ratos Wistar sob dieta com cerca de 3,3 vezes a

quantidade normal de sódio (Gomes et al., 2017). Estima-se que cerca de 25% da

população normotensa seja propensa a desenvolver hipertensão devido ao aumento

no consumo de sal (sal-sensível) e que 50% a 75% dos pacientes hipertensos

manifeste resposta pressora exagerada ao aumento no consumo de sal (Weinberger,

1996). A relevância clínica desse achado reside na hipótese de que a sensibilidade

ao sal da pressão arterial é um preditor mais eficaz de morbidade e mortalidade

causadas por doenças cardiovasculares do que os níveis de pressão arterial em si

(Weinberger, 1996).

A vida cotidiana moderna tem imposto hábitos alimentares e estilo de vida que

aumentaram expressivamente o consumo de alimentos industrializados que possuem

alta concentração de sódio na composição (Molina, 2003). A ingestão diária de sal

preconizada pela Organização Mundial de Saúde é de 5 g por dia o que equivalente

a 2 g de sódio por dia, pouco menos que uma colher de chá (Who, 2012). No entanto,

observa-se que a ingestão de sódio tem sido de aproximadamente o dobro do

recomendado, e ainda cerca de dez vezes maior que a consumida há tempos remotos

(Ha, 2014; Baldo et al., 2015).

13

Para melhor entender as causas da hipertensão sal-dependente, duas teorias

foram propostas, baseada em observações experimentais e clínicas. Uma tem como

base a necessidade de natriurese por pressão como consequência do consumo

elevado de sódio. Essa teoria fora proposta por Guyton e colaboradores em 1972

(Guyton et al., 1972) e ainda é um dos pilares que sustenta a hipótese de que os

rins têm papel central na hipertensão arterial. Envolve retenção de sódio e água nos

fluidos extracelulares, alterações no volume sanguíneo e resistência periférica. A

outra, tem como base mecanismos neurogênicos que levam a respostas

simpatoexcitatórias ocasionando aumento de pressão arterial e vem sendo

defendida por vários grupos (Leenen et al., 2002; Guyenet, 2006; Stocker et al.,

2010; Titze e Machnik, 2010; Toney e Stocker, 2010; Averina et al., 2012; Hamlyn

e Blaustein, 2013; Titze, 2014; Bie e Evans, 2017).

Assim, a hipertensão de origem sal-dependente parece envolver complexos

mecanismos e o entendimento de como eles se relacionam e como levam às

alterações fisiopatológicas que resultam em hipertensão, ainda não são bem

compreendidos.

Alguns modelos experimentais foram desenvolvidos no intuito de induzir

hipertensão nos animais e desvendar os possíveis mecanismos pelas quais a

hipertensão ocorre. Ratos Sprague-Dawley submetidos a dieta contendo 4% de NaCl

(cloreto de sódio) por três semanas tiveram seus níveis de pressão arterial

aumentados em 10 ± 2 mmHg em relação a seus controles (Osborn e Hornfeldt, 1998).

Outros estudos com Ratos Sprague-Dawley recebendo dietas contendo 8% de NaCl

por 10 dias levaram ao aumento significativo na pressão arterial cerca de 50 mmHg

(Zhang et al., 2015). Estudo de Moreira e colaboradores 2014, demonstraram que

quando a água de beber foi substituída por solução salina (0,3 mol.L-1), ratos Wistar

tiveram elevações nos seus níveis pressóricos. Além disso, os autores também

mostraram que estes ratos tiveram hipernatremia, diminuição da resistência periférica

e natriurese (Moreira et al., 2014). A oferta de solução salina 2% substituindo água de

beber para ratos Wistar por 4 dias levou a aumentos nos níveis pressóricos destes

animais em 26 ± 2 mmHg (Ribeiro et al., 2015). Outro modelo experimental já

estudado, mostrou que após a infusão de Angiotensina II em ratos Sprague-Dawley

ingerindo dieta com 2% de NaCl, houve aumento de pressão arterial nestes animais

(King et al., 2007; Yoshimoto et al., 2010; Osborn et al., 2011; Osborn et al., 2014). O

14

modelo de hipertensão Dahl Salt mostrou que os animais Dahl Sal-sensíveis tiveram

aumentos nos níveis pressóricos quando submetidos a dieta contendo 4 a 8% de NaCl

durante três semanas (Dahl, 1972; Wang e Wang, 2005). Estudo de Itaya e

colaboradores 1986, mostrou que a infusão de acetato de dexicorticosterona

associado a uni-nefrectomia em ratos submetidos a dieta contendo 2% de NaCl elevou

os níveis pressóricos destes animais (Itaya et al., 1986), mostrando, juntamente com

os achados de Osborn e colaboradores 2011, que a combinação de dietas contendo

altos teores de sal e cofatores externos (infusão de angiotensina II ou

mineralocorticoides) resulta em hipertensão.

Com a finalidade de desenvolver um modelo com a ingestão de sódio mais

condizente com a realidade humana, Gomes e colaboradores desenvolveram um

modelo de hipertensão sódio-dependente no qual os animais foram submetidos a uma

dieta contendo 2% de cloreto de sódio desde o desmame por 12 semanas. Esta

quantidade corresponde a aproximadamente 3,3 vezes o recomendado para ratos,

sendo próximo ao consumo humano atual face ao recomendado pela OMS. Como

esta dieta fora ofertada a ratos desde o desmame, período de maturação de vários

sistemas homeostáticos neuro-humorais, observou-se aumento sustentado da

pressão arterial na 12ª semana após o início da dieta, com quantidades de sódio na

dieta que não produziriam aumento na pressão arterial e de sódio no LCE (Líquido

cérebro-espinhal) em ratos adultos sem a adição de cofatores como AngII ou

mineralocorticoides. Além disso, verificou-se que a ativação dos receptores AT1

contribuem para a elevação da pressão arterial, sugerindo que os mecanismos

centrais ativados pela angiotensina II ao nível cerebral, também desempenham um

papel importante na hipertensão (Gomes et al., 2017).

Em vários dos modelos de hipertensão sódio-dependente, há evidências

contundentes de que a hipertensão depende de mecanismos associados a alterações

neurais de controle da atividade simpática (Toney et al., 2003; Stocker et al., 2010).

As causas dessas alterações neurais ainda não são totalmente compreendidas.

Entretanto, achados recentes sugerem que a hipertensão pode estar associada ao

aumento de sódio no (LCE). Huang e colaboradores realizaram estudo onde animais

submetidos a dieta com sobrecarga de sódio (8%) tiveram aumento significativo na

concentração de Na+ no LCE que precede o aumento da pressão arterial (Huang et

al., 2004). Ratos Dahl Salt sensível e Sprague-Dawley também tiveram aumento na

15

concentração de sódio no LCE quando submetidos a dieta com teores de sódio entre

4 e 8%. (Nakamura e Cowley, 1989). Estudo de Gomes e colaboradores 2017,

mostrou que os ratos submetidos a dieta contendo 2% de NaCl do desmame a 12ª

semana pós desmame também apresentaram aumento na concentração de sódio no

LCE em relação a seus controles (Gomes et al., 2017).

Dados experimentais mostraram que a infusão de soluções contendo altas

concentrações de sódio no ventrículo lateral é capaz de elevar a pressão arterial,

desencadear resposta simpática lombar e diminuir a atividade simpática renal

(Simmonds e Stocker, 2013; Stocker et al., 2015). Pequenas alterações na

concentração de sódio extracelular são capazes de ser detectadas pelo OVLT (órgão

vascular da lamina terminal) e órgão subfornical (SFO) por mecanismos específicos,

até recentemente pouco compreendidos em termos de moleculares (Kinsman,

Browning, et al., 2017; Kinsman, Simmonds, et al., 2017). As vias ativadas a partir do

OVLT e SFO passam por núcleos hipotalâmicos com o núcleo paraventricular do

hipotálamo (PVN) e descendem até o bulbo, especialmente o núcleo rostro-

ventrolateral do bulbo (RVLM), o qual possui a maioria dos neurônios pré-motores

simpáticos do sistema nervoso central (Mckinley et al., 1999; Mckinley et al., 2001;

Guyenet, 2006; Toney e Stocker, 2010; Gabor e Leenen, 2012; Kinsman, Browning,

et al., 2017; Kinsman, Simmonds, et al., 2017; Stocker et al., 2017). Por ser o RVLM

uma importante fonte de tônus simpático, vias neurais que afetam sua atividade

tornam-se importante no contexto da modulação simpática periférica e, portanto,

controle da pressão arterial. Logo, a via hipotálamo-RVLM regulada por sódio no LCE

parece ter importante papel no desenvolvimento da hipertensão sódio-dependente,

como como vem sendo mostrado na literatura (Stocker et al., 2004; Stocker et al.,

2010; Noda, M. e Hiyama, T. Y., 2015; Noda, Masaharu e Hiyama, Takeshi Y., 2015;

Stocker et al., 2015; Gomes et al., 2017; Nomura et al., 2018).

2.3. Hipertensão arterial e sua terapia

No tratamento da hipertensão já existem diversas classes de anti-hipertensivos

disponíveis. Medicamentos diuréticos atuam na redução do volume extracelular e,

consequentemente, na diminuição da resistência vascular periférica, levando ao

aumento de volume urinário (Golan et al., 2014). Os diuréticos podem ainda ser

subdivididos em diuréticos de alça que auxiliam na diminuição da reabsorção ativa da

16

alça de Henle, bloqueando o co-transportador NKCC (sódio, potássio, 2 cloretos), que

é uma proteína responsável pela troca de íons sódio, potássio e dois cloretos através

de membranas biológicas (Orlov et al., 2015), aumentando a excreção de água e

eletrólitos (Nigro e Fortes, 2008). Os diuréticos tiazídicos atuam nos túbulos

contorcidos distais, bloqueando o co-transportador sódio-cloreto, podendo também

agirem como vasodilatadores (Rang et al., 2007).

Os diuréticos inibidores competitivos de aldosterona, também conhecidos como

diuréticos poupadores de potássio, são competidores dos mesmos sítios receptores

nas células de túbulos coletores, permitindo a redução da secreção do potássio (por

isso a designação) e inibindo a reabsorção de sódio, aumentando a excreção de sódio

e água (Moreira et al., 2013).

Diuréticos inibidores da anidrase carbônica aumentam a concentração de

bicarbonato no néfron e posteriormente a excreção, pela inibição da anidrase

carbônica. Assim com a excreção do bicarbonato, há redução do volume plasmático

(Golan et al., 2014; Almeida et al., 2017). Outra classe de anti-hipertensivo são os

bloqueadores dos canais de cálcio, que atuam na redução da resistência vascular

periférica por interromperem o transporte de cálcio através dos canais de cálcio e

aumentando o diâmetro arterial (Wu e Wen, 2016). Os mecanismos anti-hipertensivos

betabloqueadores são caracterizados pela redução do débito cardíaco, da secreção

da renina e catecolaminas nas sinapses nervosas (Netto, 2017). Os inibidores da

enzima conversora de angiotensina atuam como vasodilatadores e reduzem a

resistência periférica. Seu mecanismo de ação baseia-se na inibição da enzima

conversora de Angiotensina, inibindo a formação de angiotensina I em II no organismo

(Girgih et al., 2015). Existe também a classe dos bloqueadores do receptor AT1. Esses

fármacos agem bloqueando os receptores AT1 da angiotensina (Bao et al., 2015).

Mesmo com crescente número de agentes anti-hipertensivos disponíveis,

segundo estudos populacionais mostraram que cerca de 14% dos pacientes

hipertensos com mais de 16 anos que estão utilizando mais de três tipos de

medicamentos anti-hipertensivos ainda possuem os níveis de PA elevada (Borghi et

al., 2016).

Além disso, deparam-se com efeitos colaterais produzidos pelas diferentes

classes de drogas. Os diuréticos podem causar arritmas cardíacas e infarto agudo do

miocárdio. Os bloqueadores dos canais de cálcio podem levar a queda subida nos

17

níveis de pressão, taquicardia e cefaleia. Os inibidores da enzima conversora de

angiotensina (ECA) podem levar a angiogênese. Os betabloqueadores podem levar a

vasoconstrição periférica no músculo esquelético levando a fadiga mais rápida,

membros frios e depressão (Loga-Zec et al., 2014).

Sendo assim, um incremento no repertório terapêutico pode representar

alternativa importante no tratamento da hipertensão em casos onde a terapia usual

não é efetiva ou o paciente é refratário aos medicamentos disponíveis. Os fitoterápicos

representam fonte importante moléculas bioativas cuja efetividade vem sendo

estudada e, em muitos casos, comprovada no tratamento de doenças como a

hipertensão (Farias et al., 2016; Meira et al., 2017). Extratos vegetais que contêm

compostos fenólicos e flavonoides já foram descritos como efetivos como adjuvantes

na redução da pressão arterial (Braga et al., 2014). Dados experimentais mostraram

que o extrato aquoso de folhas de Psidium guajava L. mostrou propriedades anti-

hipertensivas em ratos Dahl-salt sensíveis anestesiados quando administrado

intravenosamente (Ojewole, J. A., 2005). Os autores mostraram que doses de 100 a

800 mg.kg-1 foram efetivas em reduzir, de forma dose-dependente, a pressão arterial

nesses animais anestesiados. (Ojewole, J. A., 2005). Concluiu-se que o efeito anti-

hipertensivo parece não envolver atividade cronotrópica negativa do extrato, uma vez

que, o pré-tratamento com atropina não alterou seus efeitos anti-hipertensivos

(Ojewole, J. A., 2005). Outro achado importante descrito pelos autores foi que o

tratamento com extrato foi capaz de atenuar ou mesmo inibir o efeito pressor

produzido pela injeção endovenosa de noradrenalina, o que sugere um efeito

simpatolítico.

Ainda são escassos na literatura estudos que aprofundem o entendimento dos

mecanismos pelos quais o extrato de folhas de goiabeira atua no tratamento da

hipertensão. Uma delas é se um tratamento crônico com extrato de folhas de goiabeira

é efetivo em reduzir a pressão arterial em animais não anestesiados e por quais

mecanismos esse extrato produz seus efeitos anti-hipertensivos. Sabendo que a

hipertensão em ratos sob dieta com sobrecarga de sódio por 12 semanas parece

envolver mecanismos neurogênicos, em especial aqueles simpatoexcitatórios

(Gomes et al., 2017), esse modelo torna-se apropriado para o estudo da efetividade

do tratamento crônico e mecanismos pelos quais o extrato de folhas de goiabeira atua

com anti-hipertensivo, principalmente quando Ojewole reporta que seu extrato

18

consegue atenuar respostas pressoras desencadeadas por noradrenalina (Ojewole,

J. A., 2005).

19

3. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Determinar se o tratamento crônico com suspensão aquosa de extrato de

Psidium guajava L. (SPs) por 4 semanas reduz a pressão arterial em ratos Wistar sob

dieta com sobrecarga de sódio por 12 semanas.

Objetivos específicos e estratégias experimentais

Avaliar se os níveis pressóricos dos animais serão alterados após serem

submetidos a dieta com sobrecarga de sódio, assim como na 12ª semana;

Verificar se haverá alterações antes e após o tratamento com SPs na

quantidade de água ingerida, volume urinário, ingestão de comida e sódio;

Caracterizar o EBPs (Extrato bruto de Psidium guajava L.) quanto a sua

composição utilizando técnica de CLAE e determinação do conteúdo de

compostos fenólicos, flavonoides e do potencial antioxidante.

20

4. METODOLOGIA

4.1. Obtenção de extrato etanólico de folhas de goiabeira (EBPs)

Folhas totalmente expandidas de goiabeira (Psidium guajava L.) foram

coletadas no município de São Bartolomeu, distrito de Ouro Preto, Minas Gerais,

Brasil (Latitude: 20º 17' 15" S e Longitude: 43º 30' 29" O), no período de Janeiro, nas

proximidades do rio São Bartolomeu, área de baixada, remanescente de Mata

Atlântica, cuja produção de frutos é nativa, sem domesticação. Exsicata de material

propagativo foi encaminhada a identificação no Herbário José Badini da Universidade

Federal de Ouro Preto (HOP) e registrada sob o número OUPR27242.

Na pós-colheita, as folhas íntegras, totalmente expandidas, providas de pecíolo,

foram selecionadas, lavadas rapidamente com água corrente e secas em papel

absorvente. Após esse processo, pesou-se em balança semi-analítica e transferiu-se

as folhas para vaso sifonado onde foram imersas em etanol 95° INPM (Chemicals) na

proporção 2:3, as quais foram foram extraídas por maceração sucessiva. O extrato

obtido foi sifonado, filtrado em papel de filtro quantitativo e evaporado em evaporador

rotativo (Fisatom) em pressão reduzida (80 mBar) e temperatura aproximada de 40°C.

O extrato residual obtido foi mantido em banho-maria a 40°C por aproximadamente

10 dias, obtendo-se assim o extrato bruto seco (EBPs) (Figura 8). O rendimento foi

calculado e fez-se as caracterizações organolépticas e físicas do extrato (pH, cor, odor

e sabor) (Brasil, 2010).

21

Figura 8 - Produção do EBPs. Painel A: Psidium guajava L. B. Folhas de Psidium guajava L. C. Pós-

colheita de folhas. D. Maceração. E. Extração total de compostos bioativos. F. Processo evaporativo

em rotavapor. G. Processo evaporativo em banho maria. H. EBPs.

4.2. Caracterização do extrato etanólico de folhas de P. guajava

4.2.1. Doseamento de compostos fenólicos

A determinação de compostos fenólicos foi realizada por método de Folin-

Ciocalteu, adaptado de Brito e colaboradores (Brito et al., 2018). 5 mg de EBPs foram

pesados e dissolvidos em 5 mL de etanol PA. Alíquotas de 10 µL foram adicionadas

a 500 µL de solução reagente de Folin-Ciocalteu (1:10) e 800 µL de Solução de

Na2CO3 7,5%, homogeneizados e deixados ao abrigo da luz e do calor por 30 minutos.

No preparo da suspensão aquosa (SPs), foram pesados 200 mg do extrato seco, que

foram diluídos em 1mL de água destilada. Dessa solução, foram tomadas alíquotas

de 5 µL e diluídas em 10 mL de etanol PA, que foram adicionadas a 500 µL de solução

reagente de Folin-Ciocalteu (1:10) e 800 µL de solução de Na2CO3 7,5%,

homogeneizados e deixados ao abrigo da luz e do calor por 30 minutos. As leituras

de absorvância foram feitas em espectrofotômetro a 720 nm, usando metanol como

branco. As concentrações foram expressas em mg.g-1 de ácido gálico (GA).

Na curva padrão, em balança analítica (Shimadzu), 10 mg de ácido gálico (GA)

que foi dissolvido em 10 mL de etanol PA, constituindo a solução padrão. Dessa

solução, alíquotas de 10 a 500 µL (concentrações 0,01 mg a 0,5 mg) foram medidas

22

e adicionadas à solução reagente de Folin-Ciocalteu (1:10) e solução de Na2CO3

7,5%, homogeneizados e deixados ao abrigo da luz e do calor por 30 minutos. As

leituras foram feitas por espectrofotometria a 720 nm, usando metanol como branco.

Os resultados foram expressos com equivalente de ácido gálico (GAE).

4.2.2. Determinação dos teores de flavonoides

A dosagem de flavonoides foi feito usando o reagente de AlCl3 metanólico,

adaptado de Bezerra e colaboradores (Bezerra et al., 2018)

No preparo das soluções analíticas, 5 mg de EBPs foram pesados e dissolvido

em 5 mL de etanol PA. Alíquotas de 1000 µL foram adicionadas a 1000 µL de solução

reagente de cloreto de alumínio metanólico (0,1%) homogeneizados e deixados ao

abrigo da luz e do calor por 30 minutos. Para preparo da suspensão aquosa utilizada

para veicular o extrato aos animais, denominada aqui “extrato suspenso” (SPs), foram

pesados 200 mg do extrato seco, o qual foi diluído em e diluídos em 1mL de água

destilada. Dessa solução, foram tomadas alíquotas de 50 µL e diluídas em 1 mL de

etanol PA, o qual foi adicionado a 1000 µL de solução reagente de cloreto de alumínio

metanólico (0,1%), homogeneizados e deixados ao abrigo da luz e do calor por 30

minutos. As leituras de absorvância foram feitas em espectrofotômetro a 460 nm,

usando metanol como branco. As concentrações foram expressas em mg.g-1 de

quercetina.

Na curva padrão, pesou-se, em balança analítica (Shimadzu), 10 mg de

quercetina que foi dissolvida em 10 mL de etanol PA, constituindo a solução padrão.

Dessa solução, alíquotas de 10 a 500 µL (concentrações 0,01 mg a 0,1 mg) foram

medidas e adicionadas à solução reagente de cloreto de alumínio metanólico (0,1%),

homogeneizados e deixados ao abrigo da luz e do calor por 30 minutos. As leituras

foram feitas por espectrofotometria a 460 nm, usando metanol como branco. Os

resultados foram expressos como equivalente de quercetina (QE).

4.3.2. Determinação da atividade de antioxidante

A atividade antioxidante foi adaptada de Santos e colaboradores (Santos, Sena

et al. 2018), utilizando DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila, C18H12N5O6).

Para tanto, 100 mg de EBPs e 200 mg de SPs foram pesados e dissolvidos em

1000 µL de metanol PA. Dessas soluções, 1000 µL de EBPs e 500 µL de SPs foram

23

pipetados em cubetas de quartzo e adicionados de 1000 µL de solução reagente de

DPPH 4 mM, e fez-se a mensuração em espectrofotômetro a 520 nm nos tempos zero

e trinta minutos (t0 e t30). Os controles foram BHA (positivo), DPPH (negativo) e

Metanol PA (branco). A atividade antioxidante foi calculada pela seguinte equação:

𝐴𝐴𝑇(%) = (𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻 − 𝐴𝑏𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠

𝐴𝑏𝑠 𝐷𝑃𝑃𝐻) × 100

onde,

ATT = atividade antioxidante

Abs DPPH = absorvância do DPPH sem adição de nenhuma solução

Abs tratamento = absorvância do DPPH adicionado das soluções teste (extrato ou

BHA).

4.2.3. Triagem fitoquímica de compostos presentes no EBFG por CLAE-UV

A caracterização do EBPs foi feita de forma qualitativa por técnica de CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência) associada a um detector de ultravioleta

(CLAE-UV). Este método permite a separação de compostos presentes, no caso deste

trabalho em especifico, no EBPs. O equipamento utilizado foi o da marca Waters

Alliance 2695 composto por degaseificador a vácuo, bomba quaternária, injetor

automático, forno para coluna e conjunto detector DAD-UV Waters 2996 fotodiodo. A

fase estacionária constituiu-se de coluna Shim-pack ODSH C18 (200 mm x 4,6 mm,

5µm). Fase móvel de mistura de solventes composta por ácido fórmico 2% em água

(solvente A) e acetonitrila (solvente B) as quais foram degaseificadas em banho de

ultrassom e filtradas em membrana filtrante com poros de 0,45 µm. O fluxo da fase

móvel foi mantido em 1 mL/min. A eluição dos componentes do extrato foi feita por

gradientes: (0 a 20 min 5% de A e 95% de B); 20,1 a 40 min (15% de A e 85% de B);

40,1 a 43 min (30% de a e 70% de B); 43,1 min em diante (5% de A e 95% de B). O

comprimento de onda utilizado para detecção de componentes do extrato foi 356 nm,

a temperatura da coluna foi 35°C e o volume de preparo da solução de gavagem

(extrato dissolvido em fase móvel à concentração de 10 mg.mL-1) injetado foi 10 µL.

24

4.3. Avaliação dos efeitos biológicos da SPs

4.3.1. Animais e grupos experimentais

Na realização desse estudo foram utilizados 56 ratos recém-desmamados da

linhagem Wistar que foram amamentados por 21 dias após o nascimento e divididos

em grupos que, a partir daí, começaram a receber dietas com teores de sal

controlados e os respectivos tratamentos para cada protocolo. Os animais foram

alojados no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto

desde o nascimento até a 16ª semana de pós-desmame, sob temperatura (~24ºC) e

umidade (~60%) controladas e ciclo claro/escuro de 12h/12h (ciclo claro iniciando-se

às 7:00 da manhã).

A alimentação utilizada para os ratos de todos os grupos foi a ração

industrializada da marca Nuvilab (Quimtia®) triturada e oferecida em pó. Os grupos

controles receberam a dieta com o teor de sódio (0,27%) estabelecida pelo fabricante

(grupo Cont). Para os animais dos grupos que receberam dieta contendo teor de sódio

de 0,90% (grupo HS), cloreto de sódio (Synth® Ltda) foi acrescido à ração comercial

até atingir o teor de sódio desejado. Para tal o cloreto de sódio foi micronizado, pesado

e adicionado à ração moída pelo método de quarteamento, o que garante dispersão

homogênea do sal na mesma.

Os animais permaneceram em suas respectivas dietas (0,27% de Na+ ou

0,90% de Na+) por 12 semanas após o desmame e com livre acesso à ração e água

de torneira. A partir da 13ª semana pós desmame, subgrupos foram formados de

forma aleatória para que pudessem receber tratamentos diferenciados conforme

protocolo estabelecido e descrito adiante na Figura 9. Delineamento experimental do

estudo

Cont SPs 100: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,27% de sódio

durante o período de 12 semanas após o desmame. Posteriormente a estas 12

semanas, os animais foram submetidos ao tratamento com SPs na dose de 100

mg.kg-1 por meio de gavagens diárias, sempre no mesmo horário, por quatro

semanas.

Cont SPs 200: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,27% de sódio



25


semanas.

Cont furosemida: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,27% de

sal durante o período de 12 semanas após o desmame. Posteriormente a estas 12

semanas, os animais foram submetidos ao tratamento com furosemida na dose de 20


semanas.

Controle placebo: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,27% de

sal durante o período de 12 semanas após o desmame. Posteriormente a estas 12

semanas, os animais foram submetidos ao tratamento com 1mL de água destilada por

meio de gavagens diárias, sempre no mesmo horário, por quatro semanas.

HS SPs 100: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,90% de sal




semanas.

HS SPs 200: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,90% de sal




semanas.

HS furosemida: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,90% de sal


semanas, os animais foram submetidos ao tratamento com furosemida na dose de 20


semanas.

HS placebo: composto por 7 animais que receberam dieta contendo 0,90% de sal


semanas, os animais foram submetidos ao tratamento com 1 mL de água destilada

por meio de gavagens diárias, sempre no mesmo horário, por quatro semanas.

26

Figura 9. Delineamento experimental do estudo

27

4.3.2. Medidas de ingestão de água, consumo alimentar e volume urinário

Na 12ª e 16ª semanas após o desmame, os animais foram alojados em gaiolas

metabólicas da marca Tecnoplast®. Para adaptação, os ratos foram colocados nas

gaiolas 24 horas antes do início das medidas. Após esse período de adaptação, foram

aferidas as quantidades de água e comida ingeridas. Para isso, foram feitas as

diferenças entre os tempos 0 e 24 horas durante o período de aferição. Foram

medidos também o volume urinário e o peso das fezes. Esquema utilizado nas gaiolas

metabólicas utilizadas está ilustrado na Figura 10. Após estas medidas, amostras de

fezes e urina foram recolhidas e armazenadas a -20ºC para posteriores análises

bioquímicas de sódio e potássio.

Figura 10 - Esquema de gaiolas metabólicas utilizadas no experimento. A. Consumo de ração, no

painel B, a ingestão de água e no painel C a coleta de fezes e urina

4.3.3. Preparo da solução do tratamento com extrato etanólico de folhas de

goiabeira

Ao final das 12 semanas após o desmame e depois de serem retirados das

gaiolas metabólicas, animais dos grupos Cont e HS passaram a receber os

tratamentos com placebo (água destilada), SPs (100 mg.kg-1 ou 200 mg.kg-1) ou

furosemida (20 mg.kg-1). Os tratamentos foram feitos por gavagem orogástrica,

sempre no volume de 1 mL e com as concentrações das soluções/suspensões

administradas corrigidas diariamente pelo peso corporal dos animais de forma a

manter-se a dosagem constante ao longo do tratamento. Os animais permaneceram

sob suas respectivas dietas (0,27% de Na+ para o grupo Cont e 0,90% de Na+ para o

grupo HS) durante todo o período de tratamento. A duração total do tratamento foi de

4 semanas. Para gavagem, foi utilizada uma agulha de aço inox curva 18GA (diâmetro

A B C

28

1,2 mm) e esfera na ponta distal de 2,25 mm, comprimento da cânula 39 mm e ângulo

da agulha 9 graus.

4.3.4. Registro de pressão arterial

A medida de pressão arterial foi realizada por método direto (canulação) nos 2

primeiros dias de início da 17ª semana pós-desmame. Durante esse período, os

animais também permaneceram sob suas respectivas dietas (0,27% de Na+ para o

grupo Cont e 0,90% de Na+ para o grupo HS) e tratamentos até o momento da

eutanásia. Cânulas foram produzidas a partir da soldagem de polietileno PE-10 e PE

20, sendo o tamanho das mesmas ajustados aos tamanhos dos animais utilizados.

Na canulação da artéria e veia femorais, os animais foram submetidos a

procedimentos cirúrgico para implante dos cateteres sendo que inicialmente foram

inicialmente submetidos a procedimento analgésico com injeção subcutânea de

tramadol (Tramal – 40 mg.kg-1), sendo administrada uma dose suplementar de 7

mg.kg-1 24 horas após o procedimento cirúrgico. Cerca de 20 minutos depois, os

animais foram anestesiados com mistura de quetamina (105 mg.kg-1) e xilasina (7

mg.kg-1) administrada intraperitonealmente. Após a injeção desses medicamentos, os

animais foram colocados em posição de decúbito dorsal e tricotomizados na região

da pata traseira direita, sendo expostas e dissecadas a veia e a artéria femorais. As

cânulas foram preenchidas com solução isotônica de cloreto de sódio e fosfatos (PBS)

e a extremidade do PE-20 foi fechada com pino de aço níquel. A parte de PE-10 foi

introduzida no interior dos vasos e a parte de PE-20 foi transpassada

subcutaneamente sob o dorso do animal, sendo exteriorizada na região entre as

escapulas. Depois de suturados, os animais receberam penicilina 30.000Ul.kg-1

subcutaneamente.

Para recuperação, cada animal foi alojado em gaiolas individuais com água e

as respectivas dietas recebidas previamente em regime ad libitum por 48 horas. Os

experimentos foram conduzidos ao final dessas 48 horas.

No registro de pressão, foram retiradas das caixas dos animais a água e a dieta.

Os animais receberam heparina sódica (~100 UI.kg-1) na cânula arterial para evitar

formação de coágulos durante o registro de pressão arterial. A partir desse momento,

os ratos foram conectados a um transdutor de pressão (MLT0699) ligado a um pré-

29

amplificador (BridgeAmp) e a um conversor analógico para digital PowerLab 4 da série

35. O registro foi feito em ratos não-anestesiados, com livre movimentação na gaiola.

Para obtenção dos dados foi utilizado software LabChart 8.1 for Windows que

criou os registros de pressão arterial pulsátil, pressão arterial média e frequência

cardíaca. Os dados de pressão arterial pulsátil foram registrados na frequência

amostral de 1.000 Hz com janela de digitalização ajustada para 20 mV de amplitude.

Pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) foram derivadas em tempo

real a partir dos dados de pressão arterial pulsátil.

4.3.5. Avaliação farmacológica do tônus simpático

Uma vez estabilizados e adaptados ao ambiente, os parâmetros

cardiovasculares dos animais foram registrados continuamente por aproximadamente

20 a 30 minutos. Ao final desse período, foi feita uma injeção endovenosa do

bloqueador ganglionar hexametônio (20 mg.kg-1), um antagonista dos receptores

colinérgicos nicotínicos, para avaliação da queda na pressão arterial produzida após

o bloqueio ganglionar simpático. A pressão arterial continuou a ser registrada por mais

15 minutos e o experimento fora finalizado. A utilização de hexametônio como

ferramenta farmacológica para inferir tônus simpático já fora previamente utilizada e

estudada (Santajuliana et al., 1996). A Figura 11 representa o sistema utilizado para

registro de PAM (pressão arterial média) e FC (Frequência cardíaca).

Figura 11 - Sistema utilizado para aferição de pressão arterial a partir do PowerLab.

30

4.4. Ética no uso animal

Para realização dos procedimentos, foram seguidas as regras determinadas

pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e foram

aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de

Ouro Preto no protocolo número 2017/20.

4.5. Análises dos dados

4.5.1. Análise de consumo de ração, água e excreção urinária

As análises do consumo de ração, água e excreção urinária foram realizadas

no em período de 24h durante o qual os animais permaneceram alocados em gaiolas

metabólicas. Os cálculos foram feitos pela diferença entre a quantidade de ração e

água no tempo 0 e a quantidade de ração e água no tempo 24 horas, considerando-

se as perdas. O volume urinário foi medido utilizando-se a escala graduada no

recipiente onde a urina era recolhida.

4.5.2. Analise de dados cardiovasculares

Os dados cardiovasculares foram analisados no software LabChart 8.1.5 para

Windows. Para determinação da PAM e FC de repouso, período de 10 minutos de

registro contínuo e estável (antes da administração de hexametônio, com pressão de

pulso superior a 30 mmHg e de preferência quando o animal estivesse dormindo) foi

selecionado e os valores médios de PAM e FC computados.

No acompanhamento da evolução temporal das respostas cardiovasculares à

administração intravenosa de hexametônio, foram marcados no registro um tempo de

5 minutos, sendo analisados nesse tempo alterações a cada 30 segundos. Depois dos

5 minutos as análises foram feitas a cada minuto, até 10 minutos. As variações na

PAM e FC resultantes da administração de hexametônio foram calculadas com base

nos valores de PAM e FC antes (média de 3 minutos de registro) e depois (média de

10 segundo de registro no pico da resposta) da injeção endovenosa de hexametônio

e expressos como ΔPAM e ΔFC.

31

4.5.3. Análises estatísticas

As análises estatísticas desse estudo foram feitas no software GraphPad Prism

7.0 para Windows. Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média

(EPM). Para comparações entre grupos foi feita por análise de variância de duas vias

(ANOVA Two Way) seguida pelos pós-testes de Tukey ou Bonferroni para

comparação entre pares de média. A diferença significativa foi definida quando a

probabilidade de se cometer erro Tipo II foi menor que 5% (p<0,05).

32

5. RESULTADOS

5.1. Rendimento do extrato, caracterização organoléptica e física

A caracterização da qualidade de extratos vegetais deve ser feita a fim de

manter procedimentos e lotes validados. Para tal, algumas características sensoriais

como cor, odor e sabor devem ser testadas por experimentadores diferentes. Os

dados referentes a qualidade organoléptica e física dos tratamentos estão dispostos

na Tabela 1.

Tabela 1 - Análise da qualidade organoléptica e física dos extratos bruto (EBPs) e suspensão de extrato

(SPs) de folhas de goiaba.

Caracteres EBPs SPs

Cor

Odor

Sabor

pH

Verde escuro

Sui generis

Adstringente, ligeiramente

ácido

5,5 – 6

Verde ligeiramente pardo

Sui generis

Ligeiramente amargo, pouco

tanante, com fundo residual

6

O rendimento do EBPs foi de 2 a 5%, o que corresponde ao demonstrado em

pré-testes no laboratório, sendo classificado como excelente rendimento.

5.2. Doseamento dos compostos fenólicos, flavonoides e atividade

antioxidante.

Os teores médios de compostos fenólicos encontrados no extrato etanólico de

folhas de P. guajava L. foram 82,0213 ± 8,6851 mg.g-1 expressos em equivalente de

ácido gálico (GAE). O EBPs e o SPs tiveram os níveis de compostos fenólicos

diferentes, sendo 90,7065 ± 3,3776 mg.g-1 e 73,3362 ± 3,0211 (Figura 12, painel A).

Esses teores correspondem a 9,07% e 7,04% da massa total do extrato

respectivamente.

Os teores médios de flavonoides encontrados no extrato etanólico de folhas de

P. guajava L. foram 7,2174 ± 0,0546 mg.g-1 expressos em equivalente de quercetina

(QE). O EBPs e o SPs tiveram níveis equiparáveis, sendo 7,2720 ± 0,0171 e 7,1628

33

± 0,0255 mg.g-1 respectivamente (Figura 12, painel B). Esses teores correspondem a

0,73% e 0,72% da massa total do extrato respectivamente.

A Atividade antioxidante, expressa como % de DPPH consumido, foi avaliada

nos tempos 0 e 30 minutos. Para o EBPs e para o SPs a atividade antioxidante foi

respectivamente 65 ± 1,37% e 89 ± 0,43% no tempo zero minuto, equivalendo ao

controle positivo ou diferenciando do controle positivo, o mais potente antioxidante, o

BHA (butilhidroxianisol). (Figura 12, painéis C e D).

34

E B P s S P s

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Co

mp

os

tos

fe

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lic

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ido

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4

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*

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ida

nte

-

Te

mp

o 3

0

(%

de

DH

PP

)

**

#

A B

C D

Figura 12 - Doseamento de compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante do EBPs. Painel A: Doseamento dos compostos fenólicos para o extrato

alcoólico seco de folhas de P. guajava (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de P. guajava L. (SPs). Cada círculo representa valores individuais de

uma quadruplicata. Painel B: Dosagem de flavonoides para extrato alcoólico seco de folhas de P. guajava (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de

P. guajava L. (SPs). Cada círculo ou quadrado representa valores individuais de uma quintuplicata. Painel C: Atividade antioxidante para extrato alcoólico seco

de folhas de P. guajava L. (EBPs) e suspensão aquosa de extrato de folhas de P. guajava L. (SPs) e butilhidroxianisol (BHA). Cada círculo representa valores

individuais de uma quadruplicata. As barras representam valores médios de EBPs e SPs com seu respectivo erro padrão da média. N=4 e 5. *diferente do

EBPs; # diferente de EBPs e SPs (ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni; p<0,05).

35

5.3. Caracterização de compostos fitoquímicos presente do EBPs por CLAE-

UV

O perfil cromatográfico do EBPs é mostrado na Figura 13. Foram identificados

15 compostos, sendo os três compostos majoritários rutina, quercetina e

galocatequina (flavanol, derivado da catequina) detectados nos tempos de retenção

(Rt) 24,8; 29,5; 30,6 minutos. Demais compostos estão identificados no Quadro 1.

Figura 13 - Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e detector ultravioleta (UV) do EBPs.

Compostos majoritários encontrados foram rutina (5), quercetina (9) e galocatequina (10). Coluna C18

DAD-UV Waters 2996, 200 mm x 4,6 mm, 5µm; fluxo da fase móvel: 1 mL.min-1.Gradiente fase móvel

ácido fórmico 2% em água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). 0 a 20 min (5% de A e 95% de B);

20,1 a 40 min (15% de A e 85% de B); 40,1 a 43 min (30% de a e 70% de B); 43,1 min em diante (5%

de A e 95% de B); e 70% de B); 43,1 min em diante (5% de A e 95% de B). Comprimento de onda

365nm. Ouro Preto, 2019.

36

Número do

composto

Rt (Min)

Composto identificado

Classificação

1 3 Ácido gálico Composto fenólico

2 15,3 Derivados da Miricetina Flavonoide

3 18,9 Derivados do Ácido clorogênico Composto fenólico

4 21,2 Derivados do Guavinosideos Composto fenólico

5 24,8 Rutina Flavonoide

6 25,8 Derivados de Rutina Flavonoide

7 26,9 Narigenina Flavonoide

8 28,7 Isoquercetina Flavonoide

9 29,5 Quercetina Flavonoide

10 30,6 Gallocatechin-(4α-8)-catechin Flavonoide

11 31,6 Derivados do Kaempherol Flavonoide

12 34,4 Ácido Guavenoico Composto fenólico

13 37,8 Derivados de Quercetina-3-O-(coumaroil)-rutinosideo Flavonoide

14 39,2 Derivados da Rutina-O-pentosideo Flavonoide

15 41 Ácido ferrúlico Composto fenólico

Quadro 1 - Compostos identificados por CLAE-UV no EBPs. Ouro Preto, 2019.

37

5.4. Peso corporal e parâmetros hidrominerais

5.4.1. Massa corporal

A Figura 14 mostram painéis A, B e C, com a evolução temporal da massa

corporal de ratos controle (cont) e High salt (HS) sob os diferentes tratamentos do

desmame (semana 0) à 16ª semana pós-desmame (final do tratamento) e a variação

de peso antes e após o tratamento. A massa corporal dos animais foi aferida

semanalmente a partir do desmame até a 16ª semana pós desmame.

No painel A, estão demonstradas as massas corporais médias dos animais

controle placebo, HS placebo, controle SPs 100 mg.kg-1 e HS SPs 100 mg.kg-1. As

médias e erros padrão das massas corporais no desmame dos ratos foram, para

controle placebo: 49,59 ± 1,25g, HS placebo: 50,9 ± 1,76g, controle SPs 100 mg.kg-1:

58,8 ± 3,05g e HS SPs 100 mg.kg-1: 57,6 ± 2,51g.

No painel B estão mostradas as massas corporais de animais médios controle

placebo, HS placebo, controle SPs 200 mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1. As médias e

erros padrão de massa no desmame foram: controle placebo: 49,59 ± 1,25g, HS

placebo: 50,9 ± 1,76g, controle SPs 200 mg.kg-1: 57,0 ± 2,03g e HS SPs 200 mg.kg-1:

57,2 ± 3,29g. Os animais do grupo HS SPs 200 mg.kg-1 tiveram aumento na massa

corporal na 5ª e 6ª semana em relação ao grupo controle placebo e controle SPs 200

mg.kg-1. Posteriormente o grupo HS SPs 200 mg.kg-1 teve redução na massa corporal

a partir do tratamento (da 14ª a 16ª semana pós desmame).

No painel C, estão mostradas as massas corporais dos animais controle

placebo, HS placebo, controle furosemida e HS furosemida. As médias e erros padrão

do desmame do grupo controle placebo: 49,59 ± 1,25g, HS placebo: 50,9 ± 1,76g,

controle furosemida foram: 53,5 ± 1,09g e HS furosemida: 56,6 ± 1,57g. Os animais

do grupo HS furosemida tiveram maior ganho de massa corporal da 4ª a 6ª semana

pós desmame.

No painel D estão demonstradas as variações de massa corporal entre a 12ª

(ao início do tratamento) e a 16ª (ao final do tratamento) semanas pós-desmame,

compreendendo o período de tratamento. Os deltas de peso foram os seguintes

controle placebo (∆ 46,70 ± 4,82 g), HS placebo (∆ 42,45 ± 6,09 g), controle SPs 100

mg.kg-1 (∆ -6,61 ± 11,07 g), HS SPs 100 mg.kg-1 (∆ -5,07 ± 6,19 g), controle SPs 200

mg.kg-1 (∆ -15,44 ± 11,66 g), HS SPs 200 mg.kg-1 (∆ -7,83 ± 7,55g), controle

furosemida (∆ 19,85 ± 8,90 g) e HS furosemida (∆ 5,37 ± 7,52 g). Os animais do grupo

38

placebo controle e HS não tiveram diferenças de variações de massa corporal. Os

animais dos grupos SPs 100 mg.kg-1e SPs 200 mg.kg-1 tiveram redução de massa do

período antes do tratamento e depois do tratamento (12 e 16 semanas). O grupo HS

furosemida teve maior ganho de massa corporal para os ratos furosemida controle.

39

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T e m p o (s e m a n a s )

Ma

ss

a c

orp

ora

l (g

)

C o n t V e íc u lo (n = 7 )

C o n t S P s 1 0 0 (n = 7 )

H S V e íc u lo (n = 7 )

H S S P s 1 0 0 (n = 7 )

T ra ta m e n to

***

*

* ** *

**

** *

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0


Ma

ss

a c

orp

ora

l(g

)


C o n t S P s 2 0 0 (n = 7 )


H S S P s 2 0 0 (n = 7 )

T ra ta m e n to

* * *

*

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0


Ma

ss

a c

orp

ora

l (g

)


C o n t F u ro s e m id a (n = 7 )


H S F u ro s e m id a (n = 7 )

T ra ta m e n to

* * **

V e íc u lo S P s 1 0 0 S P s 2 0 0 F u ro s e m id a

-1 0 0

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

M

as

sa

co

rp

ora

l (g

)

a a

b b b ba a

C o n t

H S

A B

DC

Figura 14 - Massa corporal de ratos Wistar Cont e HS que receberam os tratamentos com SPs por 4 semanas. Painel A: massa corporal de ratos que receberam

SPs na dose de 100 mg.kg-1. Painel B: massa corporal de ratos que receberam SPs na dose de 200 mg.kg-1. Painel C: massa corporal de ratos que receberam

furosemida na dose de 20 mg.kg-1. Área sombreada em verde nos painéis A, B e C representam o período de tratamento após as 12 semanas sob dietas

normais (0,27% de Na+) ou com sobrecarga de sódio (0,90% Na+). *diferente de controle placebo. O painel D (Δ Massa corporal) representa a variação de

massa corporal entre a 12ª (ao início) e a 16ª (ao final do tratamento) semanas. Letras diferentes indicam diferença entre os pares de médias. (ANOVA de 2

vias, seguida por Bonferroni; p<0,05). Cada círculo ou quadrado representa valores individuais. N=7. A barras representam valores médios de animais Cont e

HS com seu respectivo erro padrão da média.

40

5.4.2. Ingestão de ração e de sódio

Na figura 15 estão expressos os valores do consumo de ração em 24 horas de

animais dos grupos controle e HS na 12ª e 16ª semana (antes e depois dos

tratamentos), quando os animais foram alocados em gaiolas metabólicas. As médias

e erros padrão foram calculados em gramas de ração consumida por 100g de peso

corporal dos ratos.

O consumo de ração para o grupo HS placebo foi maior antes do tratamento

(12ª semana) que depois do tratamento (16ª semana). A média e erro padrão antes

do tratamento foram de 4,57 ± 0,18 g.100g-1 de peso corporal e depois do tratamento

3,98 ± 0,14 g.100g-1 de peso corporal. Do grupo controle placebo a média e erro

padrão antes do tratamento (12ª semana) foram de 3,98 ± 0,62 g.100-1 de peso

corporal e depois do tratamento (16ª semana) de 3,68 ± 0,22 g por 100-1 de peso

corporal (Painel A).

No painel B está expresso o consumo de ração para o grupo controle e HS SPs

100 mg.kg-1. Não houve diferença no consumo de ração entre os grupos HS e controle

e antes e depois do tratamento. As médias e erros padrão para o grupo HS SPs 100

mg.kg-1 antes do tratamento (12ª semana) foram de 4,38 ± 0,28 por 100g de peso

corporal e depois do tratamento (16ª semana) 3,92 ±0,30 por 100g de peso corporal.

As médias e erros padrão do grupo controle SPs 100 mg.kg-1 antes do tratamento (12ª

semana) foram de 4,35 ± 0,38 por 100g de peso corporal e depois dos tratamentos

(16ª semana) 3,95 ± 0,36 por 100g de peso corporal.

Está expresso no painel C, o consumo de ração de animais HS e controle SPs

200 mg.kg-1 antes e após o tratamento. O consumo de ração foi maior para os animais

do grupo HS SPs 200 mg.kg-1 antes do tratamento (12ª semana), sendo os valores de

médias e erros padrão de 4,18 ± 0,19 por 100g de peso corporal antes do tratamento

(12ª semana) e 3,22 ± 0,26 por 100g de peso corporal depois do tratamento (16ª

semana). No grupo controle SPs 200 mg.kg-1 a média e o erro padrão antes do

tratamento (12ª semana) foram de 3,77 ± 0,34 por 100g de peso corporal e depois do

tratamento (16ª semana) 3,42 ± 0,29 por 100g de peso corporal.

Não houve diferença entre o consumo de ração entre os grupos HS e controle

furosemida e antes e depois do tratamento. No grupo HS furosemida a média e erro

padrão foram de 4,18 ± 0,19 por 100g de peso corporal antes do tratamento (12ª

semana) e 3,22 ± 0,26 por 100g de peso corporal depois do tratamento (16ª semana).

41

O consumo do grupo controle furosemida antes do tratamento (12ª semana) foi de

3,77 ± 0,34 por 100g de peso corporal e depois do tratamento (16ª semana) 3,42 ±

0,29 por 100g de peso corporal.

Ainda na figura 15, estão expressos os valores do consumo de sódio baseado

no consumo de ração no período de 24 horas de animais dos grupos controle e HS

na 12ª e 16ª semana (antes e depois dos tratamentos), quando os animais foram

alocados em gaiolas metabólicas. As médias e erros padrão foram calculados em

gramas de ração consumida por 100g de peso corporal dos ratos.

A quantidade de sódio foi mensurada a partir da quantidade de ração ingerida.

Os valores foram calculados em mmol de Na+ por 100g de peso corporal dos animais.

O teor de Na+ na ração controle é de 0,27% e na ração HS foi ajustado para 0,90%.

Nos painéis E, F e G estão expressos o consumo de Na+ de ratos dos grupos

HS placebo, controle placebo, HS SPs 100 mg.kg-1, controle SPs 100 mg.kg-1, HS SPs

200 mg.kg-1 e controle SPs 200 mg.kg-1. A ingestão de Na+ foi maior nos animais HS

placebo, HS SPs 100 mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1 em relação aos animais controle

placebo, controle SPs 100 mg.kg-1 e controle SPs 200 mg.kg-1 depois do tratamento

(16ª semana). A ingestão de ração foi maior para os animais HS placebo, HS SPs

100 mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1 na 12ª semana quando comparado com os

controles destes mesmos animais na 16ª semana. Para o grupo HS placebo, as

médias e erros padrão foram de 1,79 ± 0,07 mmol por 100g de peso corporal antes

do tratamento (12ª semana) e 1,56 ± 0,05 mmol por 100g de peso corporal depois do

tratamento (16ª semana). A média e o erro padrão para o grupo controle placebo,

foram de 0,46 ± 0,03 mmol por 100g de peso corporal antes do tratamento (12ª

semana) e 0,43 ± 0,02 mmol por 100g de peso corporal depois do tratamento (16ª

semana). A média e o erro padrão do grupo controle antes do tratamento (12ª semana)

com SPs 100 mg.kg-1 foram 0,51 ± 0,04 mmol por 100g de peso corporal e do grupo

SPs HS 100 mg.kg-1 foram 1,71 ± 0,11 mmol por 100g de peso corporal. Ao fim do

tratamento (16ª semana), a média do grupo controle SPs 100mg foi de 0,48 ± 0,03

mmol por 100g de peso corporal e do grupo HS SPs 100 mg.kg-1 1,53 ± 0,11 mmol

por 100g de peso corporal. O grupo controle SPs 200 mg.kg-1 teve média e erro padrão

de 0,44 ± 0,04 mmol por 100g de peso corporal e o grupo HS SPs 200 mg.kg-1 teve

média e erro padrão de 1,63 ± 0,07 mmol por 100g de peso corporal antes do

tratamento (12ª semana). Por outro lado, ao fim do tratamento (16ª semana), as

42

médias e erro padrão foram de 0,40 ± 0,03 mmol por 100g de peso corporal para o

grupo controle SPs 200 mg.kg-1 e 1,26 ± 0,10 mmol por 100g de peso corporal para

o grupo HS SPs 200 mg.kg-1.

No painel H está expresso a ingestão de Na+ dos grupos HS e controle

furosemida. O grupo HS furosemida ingeriu mais Na+ que o grupo controle furosemida

na 12ª e na 16ª semana pós desmame. A ingestão de Na+ antes do tratamento (12ª

semana) do grupo controle furosemida teve média e erro padrão de 0,53 ± 0,05 mmol

por 100g de peso corporal e o grupo HS furosemida de 1,42 ± 0,12 mmol por 100g de

peso corporal. Após o tratamento, (16ª semana) a média e erro para controle

furosemida foram de 0,38 ± 0,06 mmol por 100g de peso corporal e para HS

furosemida 1,16 ± 0,07 mmol por 100g de peso corporal.

43

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

2 .0

4 .0

6 .0

8 .0

F u ro s e m id a 2 0 m g .k g-1

Ing

es

tão

de

ra

çã

o

(g.1

00

g p

.c.-1

)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

1 .0

2 .0

3 .0

Ing

es

tão

de

Na

+

(mm

ol.

10

0g

p.c

.-1)

*

*

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

2 .0

4 .0

6 .0

8 .0

P la c e b o

Ing

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tão

de

ra

çã

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00

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.c.-1

)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

2 .0

4 .0

6 .0

8 .0

S P s 1 0 0 m g .k g-1

Ing

es

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çã

o

(g.1

00

g p

.c.-1

)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

2 .0

4 .0

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8 .0

S P s 2 0 0 m g .k g-1

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00

g p

.c.-1

)

#

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

1 2a

s e m a n a 1 6a

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es

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Na

+

(mm

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10

0g

p.c

.-1)

* * #

A B C D

E F G H

Figura 15 - Ingestão de ração e ingestão de Na+ de ratos Wistar sob dieta controle (0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio (0,90% de Na+) na 12ª semana (antes do

tratamento) e 16ª semana (ao final do tratamento). Painel A: ingestão de ração de animais HS e controle placebo. Painel B: ingestão de ração de animais HS e controle

SPs 100 mg.kg-1. Painel C: ingestão de ração de animais HS e controle SPs 200 mg.kg-1. Painel D: ingestão de ração de animais HS e controle furosemida 20 mg.kg-1.

Painel E: ingestão de Na+ de animais HS e controle Placebo. Painel F: ingestão de Na+ de animais HS e controle 100 mg.kg-1. Painel G: Ingestão de Na+ de animais HS

e controle 200 mg.kg-1. Painel H: ingestão de Na+ de animais HS e controle furosemida 20 mg.kg-1. Círculos azuis (grupos que receberam dieta controle) e quadrados

vermelhos (grupos que receberam dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais de cada animal dos seus respectivos grupos. As barras

representam valores médios e seus respectivos erros padrão da média. N=7. * diferente de controle. # diferente de HS (ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de

Bonferroni; p<0,05).

44

5.4.3. Ingestão de água e volume urinário

Na Figura 16 estão expressos os valores de ingestão de água em 24 horas

de animais dos grupos controle e HS na 12ª e 16ª semana (antes e depois dos

tratamentos), quando os animais foram alocados em gaiolas metabólicas. As

médias e erros padrão foram calculados em mililitros de água ingerida por 100g

de peso corporal dos ratos.

Nos painéis A, B e C, como esperado, os animais placebo, HS SPs 100

mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1 que consumiram ração com sobrecarga de sódio,

ingeriram mais água que seus respectivos controles na 12ª e 16ª semana. Esses

animais também consumiram mais água antes (12ª semana) que depois (na 16ª

semana). A média e erro padrão foram de 6,97 ± 0,73 mL por 100g de peso

corporal para o grupo controle placebo antes do período de tratamento (12ª

semana) e 4,96 ± 0,27 mL por 100g de peso corporal depois do tratamento (16ª

semana). No grupo HS placebo antes do tratamento a média e erro foram 11,32

± 0,56 mL por 100g de peso corporal e depois do tratamento 8,86 ± 0,31 mL por

100g de peso corporal. O grupo controle SPs 100 mg.kg-1 teve média e erro

padrão de 5,68 ± 0,51 mL por 100g de peso corporal antes do tratamento (12ª

semana) e 5,47 ± 0,55 mL por 100g de peso corporal depois do tratamento (16ª

semana). O grupo HS SPs 100 mg.kg-1 teve médias e erros padrão de 9,85 ±

0,05 mL por 100g de peso corporal e 7,78 ± 0,59 mL por 100g de peso corporal

correspondendo antes e depois do tratamento, 12 e 16 semanas,

respectivamente. A média e erros padrão mostrados pelo grupo controle SPs

200 mg.kg-1 foram de 5,62 ± 0,43 mL por 100g de peso corporal antes do

tratamento e 4,53 ± 0,43 mL por 100g de peso corporal depois do tratamento. O

grupo HS SPs 200 mg.kg-1 mostrou, antes do tratamento, média e erros padrão

de 11,21 ± 0,62 mL por 100g de peso corporal e depois do tratamento 7,03 ±

0,34 mL por 100g de peso corporal (Painel A, B e C).

Foram observadas diferenças entre a ingestão de água para os animais

controle furosemida e HS furosemida antes do tratamento. O grupo controle

furosemida teve média e erro padrão de 6,85 ± 0,49 mL por 100g de peso

corporal antes do tratamento (12ª semana) e 7,92 ± 0,79 mL por 100g de peso

corporal depois do tratamento (16ª semana). Já as médias e erros padrão para

o grupo HS furosemida antes e depois do tratamento, foram de 10,45 ± 0,69 e

8,23 ± 0,63, respectivamente. Foram observadas diferenças entre o grupo

45

controle furosemida e HS furosemida antes do tratamento (12ª semana) (Painel

D).

Estão expressos, ainda na Figura 16, os valores de volume urinário em 24

horas de animais dos grupos controle e HS na 12ª e 16ª semana (antes e depois

dos tratamentos), para HS e controle, quando os animais foram alocados em

gaiolas metabólicas. As médias e erros padrão foram calculados em mililitros de

urina excretada por 100g de peso corporal dos ratos.

No painel E, o volume urinário dos animais HS placebo foi maior que nos

animais controle placebo na 12ª e 16ª semana. Além disso, o volume urinário

dos animais controle placebo foi maior na 16ª semana em relação a 12ª semana.

A média e erro padrão antes do tratamento (12ª semana) para o grupo controle

placebo foram de 4,52 ± 0,26 mL por 100g de peso corporal e depois do

tratamento (16ª semana) foram de 3,43 ± 0,13 mL por 100g de peso corporal.

Para o grupo HS placebo foram de 7,01 ± 0,27 mL por 100g de peso corporal

antes do tratamento (12ª semana) e 5,52 ± 0,18 mL por 100g de peso corporal

depois do tratamento (16ª semana).

No painel F, está expresso o volume urinário dos animais HS SPs 100

mg.kg-1 foi maior que nos animais controle SPs 100 mg.kg-1 na 12ª e 16ª semana.

O grupo controle SPs 100 mg.kg-1 teve média e erro padrão de 4,49 ± 0,20 mL

por 100g de peso corporal antes do tratamento e 4,14 ± 0,31 mL por 100g de

peso corporal depois do tratamento. O grupo HS SPs 100 mg.kg-1 teve média de

7,35 ± 0,39 mL por 100g de peso corporal antes do tratamento e 7,03 ± 0,55 mL

por 100g de peso corporal depois do tratamento. Houveram diferenças entre o

grupo controle SPs 100 mg.kg-1 e HS SPs 100 mg.kg-1, além de diferenças entre

antes e depois do tratamento.

No painel G, o volume urinário dos animais HS SPs 200 mg.kg-1 foi maior

que nos animais controle SPs 200 mg.kg-1 na 12ª e 16ª semana. Além disso, o

volume urinário dos animais controle SPs 200 mg.kg-1 foi maior na 16ª semana

em relação a 12ª semana. As médias e erros padrão entre controle SPs 200

mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1 antes do tratamento foram de 4,77 ± 0,43 mL por

100g de peso corporal e 6,20 ± 0,62 mL por 100g de peso corporal. Depois do

tratamento foram 7,68 ± 0,26 mL por 100g de peso corporal e 8,44 ± 0,86 mL por

100g de peso corporal. Os grupos controle SPs 200 mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-

1 mostraram diferenças entre si e entre o período antes e após o tratamento.

46

No painel H, o volume urinário dos grupos furosemida controle e

furosemida HS na 16ª semana foi maior que na 12ª semana. A média e erro

padrão do grupo controle furosemida foram de 4,77 ± 0,43 mL por 100g de peso

corporal e HS furosemida 6,20 ± 0,62 mL por 100g de peso corporal antes do

tratamento. Depois do tratamento as médias e erros padrão foram de 7,68 ± 0,42

mL por 100g de peso corporal para o grupo controle furosemida e 8,14 ± 0,86

mL por 100g de peso corporal para o grupo HS furosemida (Painel H).

47

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

2 0 .0

P la c e b o

Ing

es

tão

de

ág

ua

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

*

*#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

2 0 .0

S P s 1 0 0 m g .k g-1

Ing

es

tão

de

ág

ua

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

* *#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

2 0 .0

S P s 2 0 0 m g .k g-1

Ing

es

tão

de

ág

ua

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

*

*#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

2 0 .0

F u ro s e m id a 2 0 m g .k g-1

Ing

es

tão

de

ág

ua

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

C o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

*

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

Vo

lum

e u

rin

ário

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

*

#

*#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

Vo

lum

e u

rin

ário

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

* *

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

Vo

lum

e u

rin

ário

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

*

*#

1 2a

s e m a n a 1 6a

s e m a n a

0 .0

5 .0

1 0 .0

1 5 .0

Vo

lum

e u

rin

ário

(mL

.10

0g

p.c

.-1)

#

#

A B C D

E F G H

Figura 16 - Ingestão de água e Volume urinário de ratos Wistar sob dieta controle (0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio (0,90% de Na+) na 12ª semana

(antes do tratamento) e 16ª semana (ao final do tratamento). Painel A: ingestão de água de animais HS e controle placebo. Painel B: ingestão de água de

animais HS e controle SPs 100 mg.kg-1. Painel C: ingestão de água de animais HS e controle 200 SPs mg.kg-1. Painel D: ingestão de água de animais HS e

controle furosemida 20 mg.kg-1. Painel E: volume urinário de animais HS e controle placebo. Painel F: volume urinário de animais HS e controle SPs 100 mg.kg-

1. Painel G: volume urinário de animais HS e controle SPs 200 mg.kg-1. Painel H: volume urinário de animais HS e controle furosemida 20 mg.kg-1. Círculos

azuis (grupos que receberam dieta controle) e quadrados vermelhos (grupos que receberam dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores

individuais de cada animal dos seus respectivos grupos. As barras representam valores médios com seus respectivos erros padrão da média. N=7. * diferente

de controle. # diferente de HS e controle (ANOVA de 2 vias, seguida por Bonferroni; p<0,05).

48

5.5. Pressão arterial média e frequência cardíaca

Na Figura 17, estão demonstrados os valores de pressão arterial média e

frequência cardíaca de repouso para ratos Wistar Controle e HS que receberam

tratamentos com água destilada, SPs 100 mg.kg-1, SPs 200 mg.kg-1 e furosemida por

4 semanas a partir da 12ª semana pós-desmame.

Os animais do grupo HS placebo e SPs 100 mg.kg-1 tiveram níveis de pressão

arterial maiores que dos seus respectivos controles, controle placebo e controle SPs

100 mg.kg-1. De acordo com os resultados, as médias e erros padrão de PAM foram

controle placebo 114,28 ± 1,58mmHg, HS placebo 127,42 ± 1,81 mmHg, controle SPs

100 mg.kg-1 115,14mmHg, HS SPs 100 mg.kg-1 126,28 ± 3,88mmHg, controle SPs

200 mg.kg-1 117,28 ± 2,04mmHg, HS SPs 200 mg.kg-1 116,71 ± 1,22 mmHg, controle

furosemida 114,0 ± 2,21 mmHg e HS furosemida 114,0 ± 1,44 mmHg. Sendo assim,

verifica-se que a SPs na dose de 100 mg.kg-1 não foi eficaz na redução dos níveis de

pressão arterial em ratos HS. Por outro lado, a dose de 200 mg.kg-1 foi capaz de

reverter a hipertensão em ratos HS, reduzindo seus valores de pressão arterial a

níveis equiparáveis aos de ratos controle. Os resultados também mostraram que o

tratamento com o SPs não reduziu a pressão arterial em ratos controle, conforme pode

ser visto na Figura 17.

As frequências cardíacas não foram diferentes entre os grupos. As médias e

erros padrão de frequência cardíaca foram: controle placebo 393,14 ± 14,92 bpm, HS

placebo 390,85 ± 11,90 bpm, controle SPs 100 mg.kg-1 371,55 ± 17,12 bpm, HS SPs

100 mg.kg-1 392,42 ± 9,24, controle SPs 200 mg.kg-1 369,85± 16,21, HS SPs 200

mg.kg-1 372,85 ± 14,00, controle furosemida 394,28 ± 12,80 e HS furosemida 386,71±

11,79.

49

P la c e b o S P s 1 0 0 S P s 2 0 0 F u ro s e m id a

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

PA

M b

as

al

(mm

Hg

)

c o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

aa

a a aa

b

b

P la c e b o S P s 1 0 0 S P s 2 0 0 F u ro s e m id a

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

FC

ba

sa

l (b

pm

) a

a

a

aa

aa

a

c o n t (n = 7 )

H S (n = 7 )

Figura 17 – Pressão arterial média (PAM, painel A) e frequência cardíaca (FC, painel B) de ratos Wistar

sob dieta controle (0,27% de Na+) e com sobrecarga de sódio (0,90% de Na+) ao final dos tratamentos

com placebo, SPs 100 mg.kg-1, SPs 200 mg.kg-1 e furosemida 20 mg.kg-1 na 16ª semana pós-

desmame. Círculos azuis (grupos que receberam dieta controle) e quadrados vermelhos (grupos que

receberam dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais de cada animal

dos seus respectivos grupos. As barras representam valores médios da PAM ou FC com seus

respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes indicam diferenças entre pares de médias

(ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni; p<0,05).

50

5.6. Avaliação farmacológica do “drive” simpático

5.6.1. Resposta da pessão arteria à injeção de hexametônio

Os dados demonstrados na Figura 18 mostram diminuição nos níveis de

pressão arterial após a injeção intravenosa do bloqueador ganglionar hexametônio

(20 mg.kg-1). No painel A, o grupo HS SPs 100 mg.kg-1 teve queda menor em relação

aos grupos controle SPs 100 mg.kg-1, controle placebo e HS placebo. No painel B

estão mostrados os valores referentes às variações máximas de pressão arterial dos

grupos controle placebo, HS placebo, controle SPs 100 mg.kg-1 e HS SPs 100 mg.kg-

1. Os animais do grupo HS placebo tiveram queda maior nos seus níveis pressóricos

(∆ -53,42 ± 2,08 mmHg) em relação a grupo controle placebo (∆ -46,00 ± 1,70 mmHg).

Já os grupos HS SPs 100 mg.kg-1 (∆ -44,57 ± 1,83 mmHg) e controle SPs 100 mg.kg-

1 (∆ -43,42 ± 1,27 mmHg) não tiveram os níveis de queda diferentes.

No painel C, o grupo HS SPs 200 mg.kg-1 mostrou queda similar aos níveis

pressóricos dos animais do grupo controle SPs 200 mg.kg-1, controle placebo e HS

placebo. No painel D estão demonstrados os valores referentes aos deltas de pressão

arterial dos grupos controle placebo, HS placebo, controle SPs 200 mg.kg-1 e HS SPs

200 mg.kg-1. Os animais do grupo HS placebo tiveram uma queda maior nos seus

níveis pressóricos (∆ -53,42 ± 2,08 mmHg) em relação a grupo controle placebo (∆ -

46,00 ± 1,70 mmHg). Os animais do grupo SPs 200 mg.kg-1 (∆ -44,57 ± 1,83 mmHg)

e controle SPs 200 mg.kg-1 (∆ -43,42 ± 1,27 mmHg) não tiveram os níveis de queda

diferentes.

No painel E, não houve diferença na queda após a injeção de hexametônio

nos grupos HS placebo, controle placebo, HS furosemida e controle furosemida. No

painel F estão demonstrados valores referentes a deltas de queda de pressão dos

grupos controle placebo, HS placebo, controle furosemida e HS furosemida. Os

animais HS furosemida (∆ -46,57 ± 2,74 mmHg) tiveram queda maior nos níveis

pressóricos em relação ao grupo controle furosemida (∆ -41,29 ± 2,35mmHg). Os

animais do grupo HS placebo (∆ -53,42 ± 2,08 mmHg) tiveram queda nos níveis

pressóricos maiores que os observados em animais controle placebo (∆ -46,00 ± 1,70

mmHg).

51

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

T e m p o (m in )

PA

M (

mm

Hg

)C o n t v e íc u lo (n = 7 )

C o n t S P s 1 0 0 (n = 7 )

H S v e íc u lo (n = 7 )

H S S P s 1 0 0 (n = 7 )

He

x

* * * *

*

# # # #

* * * *

V e íc u lo S P s 1 0 0

-8 0

-6 0

-4 0

-2 0

0

P

AM

(m

mH

g)

aa

a

b

C o n t

H S

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

T e m p o (m in )

PA

M (

mm

Hg

)

C o n t v e íc u lo (n = 7 )

C o n t S P s 2 0 0 (n = 7 )


H S S P s 2 0 0 (n = 7 )

* * * *

He

x


-8 0

-6 0

-4 0

-2 0

0

P

AM

(m

mH

g)

a c

b

ab c

C o n t

H S

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

T e m p o (m in )

PA

M (

mm

Hg

)


C o n t fu ro s e m id a (n = 7 )


H S fu ro s e m id a (n = 7 )

He

x

* * * *

V e íc u lo F u ro s e m id a

-8 0

-6 0

-4 0

-2 0

0

P

AM

(m

mH

g)

ab

bab

a

C o n t

H S

AB

CD

EF

Figura 18 – Pressão arterial média (PAM) de ratos Wistar Cont e HS sob os diferentes tratamentos

(painéis A, C e E) antes e após a administração endovenosa de hexametônio (20 mg.kg-1). A linha

tracejada cinza marca o momento da injeção de hexametônio. Os painéis B, D e F mostram a variação

máxima de pressão arterial em decorrência da administração de hexametônio em animais Cont e HS

sob os diferentes tratamentos. Círculos cinzas (grupos que receberam dieta controle) e quadrados

pretos (grupos que receberam dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais

de cada animal dos seus respectivos grupos. As barras representam valores médios da PAM com seus

respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes indicam diferença significativa entre pares

de médias. * diferente de controle placebo; ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Tukey; p<0,05.

52

5.6.2. Resposta da frequência cardíaca à injeção de hexametônio

Na figura 19, estão expressas alterações nos níveis de frequência cardíaca

após a injeção intravenosa de hexametônio em ratos controle placebo, controle SPs

100 mg.kg-1, controle SPs 200 mg.kg-1, controle furosemida, HS placebo, HS SPs 100

mg.kg-1, HS SPs 200 mg.kg-1 e HS furosemida.

No painel A estão demonstrados os dados de grupos de animais controle

placebo, HS placebo, controle SPs 100 mg.kg-1 e HS SPs 100 mg.kg-1. Não tiveram

diferenças nas frequências cardíacas entre estes grupos. No painel B estão expressos

os valores de delta para estes mesmos grupos, sendo eles: 46,42 ± 4,08 bpm, 48,57

± 2,80 bpm, 48,00 ± 2,22 bpm e 46,42 ± 4,08 bpm, respectivamente. Os valores de

delta de frequência não mostraram diferenças entre os grupos.

Estão demonstrados no painel C os valores de frequência cardíaca antes e

após a injeção de hexametônio para os grupos: controle placebo, HS placebo, controle

SPs 200 mg.kg-1 e HS SPs 200 mg.kg-1. Não houveram diferenças entre o aumento

de frequência após o hexametônio entre os grupos. No painel D estão mostraram os

valores de delta para os grupos controle placebo (∆46,42 ± 4,08 bpm) HS placebo (∆

48 ± 2,20 bpm), controle SPs 200 mg.kg-1 (∆ 39,28 ± 2,47) e HS SPs 200 mg.kg-1 (∆

50,85 ± 3,46). Os valores de delta de frequência não tiveram diferenças entre os

grupos.

No painel E estão demonstrados valores de frequência cardíaca antes e após

a queda pela injeção de hexametônio para os grupos controle placebo, HS placebo,

controle furosemida e HS furosemida. Não houveram diferenças entre o aumento de

frequência após o hexametônio entre os grupos. No painel F estão os dados

correspondentes ao delta para os grupos: controle placebo (∆46,42 ± 4,08 bpm), e HS

placebo (∆ 48 ± 2,20 bpm), controle furosemida (∆ 39,42 ± 2,60 bpm) e HS furosemida

(∆ 53,57 ± 2,19 mmHg). Os valores de delta não tiveram diferenças entre os grupos.

53

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

T e m p o (m in )

FC

(b

pm

)C o n t v e íc u lo (n = 7 )

C o n t S P s 1 0 0 (n = 7 )


H S S P s 1 0 0 (n = 7 )

He

x


0

2 0

4 0

6 0

8 0

F

C (

bp

m)

a

a a

a

C o n t

H S

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

T e m p o (m in )

FC

(b

pm

)


C o n t S P s 2 0 0 (n = 7 )


H S S P s 2 0 0 (n = 7 )

He

x


0

2 0

4 0

6 0

8 0

FC

(b

pm

)

a

a a

a

C o n t

H S

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

T e m p o (m in )

FC

(b

pm

)


C o n t fu ro s e m id a (n = 7 )


H S fu ro s e m id a (n = 7 )

He

x

P la c e b o F u ro s e m id a

0

2 0

4 0

6 0

8 0

F

C (

bp

m)

a b

a ba

b

C o n t

H S

A B

C D

E F

Figura 19 – Frequência cardíaca (FC) de ratos Wistar Cont e HS sob os diferentes tratamentos (painéis

A, C e E) antes e após a administração endovenosa de hexametônio (20 mg.kg-1). A linha tracejada

cinza marca o momento da injeção de hexametônio. Os painéis B, D e F mostram as variações máximas

de frequência cardíaca em decorrência da administração de hexametônio em animais Cont e HS sob

os diferentes tratamentos. Círculos cinzas (grupos que receberam dieta controle) e quadrados pretos

(grupos que receberam dietas com alto teor de sódio) dispersos representam valores individuais de

cada animal dos seus respectivos grupos. As barras representam valores médios da FC com seus

respectivos erros padrão da média. N=7. Letras diferentes indicam diferença significativa entre pares

de médias. * diferente de controle placebo; ANOVA de 2 vias, seguida pelo pós-teste de Tukey; p<0,05.

54

6. DISCUSSÃO

Esse trabalho, avaliou o potencial anti-hipertensivo do extrato etanólico de

folhas de P. guajava L. num esquema de tratamento crônico, com doses únicas diárias

e por via oral. Os resultados mostraram que a SPs 200 mg.kg-1 foi efetivo em reverter

o quadro de hipertensivo estabelecido em ratos Wistar sob dieta com sobrecarga de

sódio. Foi investigado possíveis mecanismos pelos quais a SPs produziria seus

efeitos biológicos avaliando seu efeito diurético ou sua ação como agente

simpatolítico. Os resultados comprovaram que a dose anti-hipertensiva não alterou o

volume urinário ou ingestão de água. Nos ensaios envolvendo bloqueio ganglionar

com hexametônio também mostrou que a dose anti-hipertensiva não alterou a queda

de pressão arterial produzida pela injeção de hexametônio, sugerindo que o “drive”

global simpático em ratos hipertensos tratados com SPs é semelhante ao de ratos

tratados com placebo. Esses achados sugerem que o método de obtenção e esquema

de tratamento propostos nesse estudo para a SPs podem ter resultado em diferenças

nos mecanismos de ação do SPs quando comparados aos propostos e trabalhos

prévios na literatura (Ojewole, J. A., 2005).

O processo de obtenção do extrato de folhas de goiabeira por macerações

sucessivas (remaceração) visou o esgotamento do material vegetal, para obter de

maior quantidade de extrato e maiores teores de compostos bioativos. A opção pelo

uso do etanol em detrimento de outros solventes como a água se deu por razões

técnicas, ambientais e toxicológica. O etanol um solvente “verde”, com menor

toxicidade a outros solventes orgânicos. Outro aspecto técnico importante para

escolha do etanol e a relativa facilidade para sua remoção, o que permite o uso de

temperatura relativamente baixa, diminuindo-se, assim, a probabilidade de

degradação de fitoquímicos durante o processamento para obtenção do extrato seco.

Dessa forma, o resultado esperado foi alcançado obtendo-se o EBPs com cor, odor e

sabor similar ao dos frutos de goiaba verde, conforme descrito no Quadro 1.

A análise de pH está ligada ao caráter ácido ou alcalino do extrato, diretamente

associada à sua palatabilidade. O pH ligeiramente ácido pode ser atribuído aos

compostos como ácidos clorogênico e guavenóico, fenólicos e flavonoides (Khoddami

et al., 2013), indicando correto processamento de obtenção do extrato seco.

O rendimento do EBPs permitirá, para futuros experimentos ou

desenvolvimento de formulações, a premissa de reprodutibilidade para colheitas e

55

processamento pós-colheita das folhas, lembrando que as perdas estimadas na etapa

de pós-colheita foram superiores a 20%, para folhas íntegras, portanto, baixa.

Outro aspecto importante na reprodutibilidade de resultados e padronização de

drogas vegetais é a caracterização da matéria prima, no caso o EBPs. As

propriedades farmacológicas de um extrato vegetal são diretamente proporcionais aos

teores de compostos secundários preservados durante o processo de obtenção do

mesmo. Salienta-se que a maioria desses compostos são termolábeis e que as

variações dos teores podem ocorrer, ainda, em função dos fatores edáficos-climáticos

(Silva et al., 2013).

Os resultados obtidos nesse estudo foram menores que os reportados por

Chen e colaboradores, que obtiveram teores na ordem 145,36 ± 2,97mg por

equivalente de ácido gálico (GAE.g-1) de extrato aquoso de folhas de goiabeira (Chen

e Yen, 2007) e também menor que o teor obtido por He que foi de 575,3mg GAE.g-1

de amostra no extrato aquoso de folha de goiabeira (He e Venant, 2004). Isso sugere

que diferenças nos métodos de extração e/ou origem do material vegetal podem

influenciar os teores de compostos fenólicos no extrato final.

Quanto aos teores de flavonoides em EBPs e SPs, estudos de Venkatachalam

utilizando extrato metanólico e aquoso das folhas de goiabeira mostraram que a

constituição de flavonoides no extrato metanólico foi de 5,03 ± 0,149 mg/g de extrato

e para extrato aquoso 4,53 ± 0,050 mg/g de extrato, sendo menores que o obtido por

este estudo. (Venkatachalam et al., 2012).

A atividade antioxidante com oxidação dos radicais DPPH para o EBPs foi de

65% e SPs de 89,26%, em 30 minutos. Estudo de Santhoshkumar e colaboradores

mostraram atividade antioxidante de 85% em relação ao DPPH em 30 minutos no

extrato aquoso em 517nm (Santhoshkumar et al., 2014). Kuber e colaboradores

mostraram que a atividade antioxidante em extrato alcoólico foi 75,6% em 30 minutos

a 517 nm (Kuber et al., 2013). Atividade antioxidante de extrato bruto metanólico de

folha de goiabeira foi de 87% em 30 minutos a 515 nm (Begum et al., 2014). Silva e

colaboradores obtiveram como atividade antioxidante 72,25% no extrato

hidroalcoólico de folha de goiaba (Silva et al., 2013).

Para uma caracterização qualitativa do perfil fitoquímico do extrato etanólico

com o qual trabalhou-se nesse estudo, utilizou-se a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) como ferramenta analítica. Ao analisar-se a intensidade de

56

absorção no UV dos picos referentes a compostos eluídos e, principalmente, os

tempos de retenção, identificou-se os principais compostos presentes no SPs. Os

compostos que tiveram maiores picos de absorção no UV. Dados na literatura já

reportaram a ação da quercetina no sistema cardiovascular. O tratamento de 21 dias

com quercetina preveniu infarto em ratos Wistar com tratamento, reduzindo também

os níveis de pressão arterial (Jaliah, 2017). A quercetina e a rutina reduziram

significativamente o tamanho do infarto em animais. A rutina ofereceu cardioproteção

completa por previnir o infarto (Annapurna et al., 2009). Da Rocha e colaboradores

utilizaram rutina isolada de extrato de Polygala paniculata L. e verificaram que esta

induz efeitos hipotensivos e vasorelaxante potente em ratos Wistar machos com

hipertensão induzida por N ω -nitro- L -arginina-metil-éster (L-NAME) (Da Rocha Lapa

et al., 2011). A rutina e a quercetina, em estudo com ratos Dahl Sal, mostraram ser

eficazes na melhora de desiquilíbrio redox e metabólicos, reduzindo os níveis pressão

arterial (Olaleye et al., 2013).

Estudos prévios que avaliaram as galocatequinas mostraram que a mesma

atua no sistema renina angiotensina-aldosterona, principalmente inibindo renina, o

que contribui para redução da pressão arterial (Li et al., 2013).

Assim, sugere-se que a ação hipotensora do EBPs nos animais deste estudo

pode ser resultado de uma ação conjunta de compostos fenólicos, flavonoides e

atividade antioxidante. Contudo, se há um mecanismo principal, qual seria e quais

seriam a contribuições dos diversos compostos secundários bioativos da SPs sobre

outros mecanismos de controle da pressão arterial são questões ainda permanecem

obscuras e necessitam de maiores estudos.

Para verificar se os efeitos anti-hipertensivos do SPs envolveriam mecanismos

de diurese, avaliou-se o volume de água ingerida e o volume urinário além de

parâmetros de crescimento dos animais e quantidade de ração ingerida. Coerente

com reportado por Gomes e colaboradores (Gomes et al., 2017), esse experimento

mostrou que a concentração de sódio na dieta não comprometeu o crescimento e

ganho de peso dos animais ao longo das 12 semanas pós-desmame iniciais. Contudo,

animais tanto Cont quanto HS e que foram tratados com SPs tiveram uma estagnação

no ganho e peso corporal quando comparados com animais Cont e HS que foram

tratados com placebo. Apesar disso, os consumos de ração foram equivalentes, com

pequenas alterações para menos no grupo HS tratados com placebo e SPs na dose

57

de 200 mg.kg-1 ao final do tratamento quando comparados com o início do tratamento.

Este resultado pode corroborar com dados da literatura que mostram que os

compostos fenólicos, catequina, epigalocatequina e quercetina (que são também

encontrados no SPs) podem atuar na redução de peso por possuírem efeito

termogênico, capacidade de oxidar gorduras, inibir enzimas digestivas envolvidas na

absorção de carboidratos e lipídios e regular os níveis de hormônios relacionados à

obesidade (Rains, Agarwal et al. 2011). Além disso, esses mesmos compostos

podem atuar no controle do apetite. Os autores desse estudo sugerem que as

catequinas influenciam a atividade do sistema nervoso simpático (SNS), levando a um

aumento no gasto energético e a oxidação da gordura (Rains et al., 2011). Caso esse

seja um mecanismo em voga nos animais tratados com SPs, é possível que o efeito

diferenciado em vias regionalizadas de controle da atividade simpática possa ser o

responsável pela estagnação no ganho de peso e, ao mesmo tempo, redução de

pressão arterial em ratos tratados com o SPs.

Como pressuposto, animais que consumiram dieta com alto teor de sódio

ingeriram mais água que os animais submetidos a dieta controle. Esses achados

coincidem com dados da literatura, pois, o estímulo a sede permitiria a diluição da

sobrecarga de sódio ingerida, mantendo relativamente constante a concentração do

sódio no líquido extracelular (Kawano et al., 1991). Além disso, estes animais

excretaram uma maior quantidade de urina em relação a seus controles, o que pode

representar a excreção do sódio ingerido em excesso.

Para avaliar os efeitos anti-hipertensivos do SPs, duas doses, 100 mg.kg-1 e

200 mg.kg-1 foram selecionadas com base em dados da literatura (Ojewole, J. A.,

2005). Os dados da literatura, nenhum estudo testou os efeitos anti-hipertensivos e

um tratamento crônico com extrato etanólico de folhas de P. guajava. Os resultados

mostraram que o tratamento com a dose de 100 mg.kg-1 não foi eficaz na redução da

pressão arterial de ratos submetidos a dieta com sobrecarga de sódio. Já o tratamento

com a dose de 200 mg.kg-1 reverteu a hipertensão arterial em ratos HS ao passo que

não produziu nenhum efeito sobre os níveis de pressão de ratos Cont quando

comparados a animais dos respectivos grupos tratados com placebo. Estudo realizado

por Ojewole mostrou que injeções intravenosas agudas do extrato aquoso de Psidium

guajava L. nas doses de 50-800 mg.kg-1 foram capazes de reduzir os níveis de

pressões arterial e frequência cardíaca de ratos Dahl Sal sensíveis hipertensos. Ainda

58

não sabe ao certo por quais motivos o extrato de folhas de goiabeira é capaz de

reduzir os níveis pressóricos, mas o autor propôs que o extrato foi capaz de atenuar

respostas pressoras desencadeadas por noradrenalina injetada endovensamente

(Ojewole, J. a. O., 2005). Logo, presume-se que, para o extrato aquoso de P. guajava,

haja efeito simpatolítico associado ao efeito anti-hipertensivo. Ainda em ensaios in

vitro, utilizando homogenatos de tecidos de fígado de ratos, verificou-se que os ácidos

fenólicos e flavonoides presentes nas folhas de goiabeira eram capazes de inibir a

atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA), o que poderia conferir a esses

fitoquímicos propriedades anti-hipertensivas (Irondi et al., 2016).

A administração de quercetina por via oral em ratos espontaneamente

hipertensos (SHR) reduziu a pressão sanguínea, alterações vasculares e hipertrofia

cárdica observada em ratos SHR não tratados (Duarte et al., 2001). O tratamento com

rutina e quercetina por via oral em ratos Wistar submetidos a dieta com sobrecarga

de sódio diminuíram os níveis de pressão arterial e pressão de pulso desses animais

(Olaleye et al., 2013). Entretanto, deve-se considerar que as doses de compostos

isolados capazes de produzir efeito biológicos significativos precisam ser maiores que

aquelas calculadas para os mesmos compostos presentes no SPs utilizado neste

estudo. A exemplo, as doses eficazes na redução da pressão arterial e melhora de

parâmetros cardiovasculares para quercetina e rutina foram 150 mg.kg-1 e 100 mg.kg-

1 respectivamente (Olaleye et al., 2013). No SPs, determinamos que a contentração

de flavonóides, em equivalente de quercetina, é cerca de 7 mg.g -1 de extrato.

Considerando a dose anti-hipertensiva efetiva emprega nesse estudo (200 mg de

extrato para cada kg de peso corporal) estimamos que a dose de flavonóides (maior

parte quercetina, de acordo com CLAE-UV) como sendo 1,4 mg de equivalente

quercetina para cada kg de peso corporal. Isso equivale a cerca de 100 vezes menos

quercetina que a dose mínima necessária só de quercetina para produzir efeitos anti-

hipertensivos. Logo, nossos achados sugerem que seria que a combinação de

diversos composto bioativos presentes na SPs, que teriam o efeito anti-hipertensivo

em detrimento de um composto isolado majoritário no extrato.

Alguns dos estudos que mostram efeito anti-hipertensivo do extrato de P.

guajava em animais experimentais fazem uso de via endovenosas para administração

do extrato. Logo, utilizar uma via oral durante o tratamento poderia impor algumas

restrições quanto a efetividade e efeitos biológicos desejados por diminuir a

59

biodisponibilidade dos vários fitoquímicos da SPs na corrente sanguínea. Estudos de

Dong e colaboradores mostraram, contudo, que compostos como quercetina, luteolina

e apigenina presentes do extrato de Matricaria chamomilla L. (Camomila) mostraram

que concentrações mensuráveis no plasma de ratos Sprague-Dawley após a

administração por via oral. Quercetina é um dos compostos presentes na SPs, e,

segundo os resultados desse estudo, pode ser absorvida pelo trato gastrointestinal.

Tem pico de concentração no plasma em 47,4 minutos após a sua administração e

um tempo de meia vida de 13,6 horas (Dong et al., 2017). Os experimentos

envolvendo medida de pressão arterial em nosso estudo foram feitas entre 1 e 4 horas

a partir da administração por via oral da última dose de SPs, em animais ainda

submetidos a dieta contendo sobrecarga de sódio. Logo, com base nos estudos

farmacocinéticos de Dong e colaboradores, podemos inferir que os animais tratados

com o SPs no dia do experimento ainda tiveram algum nível de quercetina na corrente

sanguínea durante os experimentos. O fato de apenas o grupo HS tratado com a dose

de 200 mg.kg-1 ter mostrado reversão da hipertensão arterial sugere que uma

quantidade maior dos fitoquímicos presentes no SPs seria necessário para tal efeito.

Para avaliar o papel do “drive” simpático na hipertensão, várias metodologias

podem ser empregadas. Essas metodologias incluem o “spilover” de noradrenalina,

medida direta da atividade elétrica de nervos periféricos simpáticos e avaliação

farmacológica com bloqueadores ganglionares (Stocker e Muntzel, 2013). Para efeito

conclusivo, é preferível o uso de mais de uma técnica como forma de se assegurar a

robustez dos resultados. Contudo, Santajuliana e colaboradores sugerem, em seu

trabalho de 1996, que, para hexametônio e clorisondamina, o pico da resposta

depressora decorrente do bloqueio ganglionar é uma medida consistente de aumento

de pressão arterial por mecanismos neurogênicos no rato acordado (Santajuliana et

al., 1996). Sendo assim, decidimos por avaliar o “drive” simpático em ratos tratados e

não tratados com SPs utilizando a ferramenta farmacológica hexametônio. A injeção

endovenosa de hexametônio produziu queda na pressão arterial em todos os grupos

experimentais, conforme pode ser visto na Figura 18. Os níveis de queda de pressão

arterial foram de aproximadamente 40 mmHg, indicando um bloqueio de atividade

simpática, como já descrito previamente na literatura (Gomes et al., 2017)

Os resultados obtidos após a injeção de hexametônio mostraram que os

animais do grupo HS placebo tiveram maior queda nos níveis de pressão arterial em

60

relação ao grupo controle, sugerindo que os animais que ingeriram dieta com

sobrecarga de sódio têm maior tônus simpático que os animais controle. Esses dados

dos animais com 16 semanas pós desmame são coerentes com os dados da literatura,

mostrando que animais sob dieta com alto teor de sódio na 12ª semana pós desmame

tiveram maior tônus simpático em relação a seus respectivos controles (Gomes et al.,

2017). Isso sugere que ratos sob dieta com 0,9% de Na+ do desmame à 16ª semana

anda guarde características neurogênicas, embora sua integral dependência de

mecanismos neurogênicos já possa ser questionada quando avaliamos os resultados

do tratamento com SPs nas doses de 100 e 200 mg.kg-1. O grupo HS tratado com SPs

na dose de 100 mg.kg-1 teve queda dos níveis pressóricos similar ao grupo controle

SPs 100 mg.kg-1, indicando que o tônus simpático é similar entre HS e controle. Na

avaliação temporal verificou-se que os níveis pressóricos basais do grupo HS SPs 100

mg.kg-1 foram maiores que no grupo controle SPs 100 mg.kg-1. Os animais do grupo

HS SPs 200 mg.kg-1 tiveram delta na queda de pressão arterial maior que o controle

SPs 200 mg.kg-1 indicando maior bloqueio do tônus simpático dos animais HS em

relação ao controle.

Estes achados podem indicar que os níveis pressóricos na 16ª semana pós

desmame pode ser controlado não só por atividade simpática como demostrado com

teste de hexametônio, mas também por algum componente hormonal, como sistema

renina angiotensina ou vasopressina que ainda precisa ser estudado com mais

detalhes. Neste sentido, pode-se presumir, por exemplo, que os flavonoides presentes

no SPs poderiam inibir a ação da enzima conversora de angiotensina (Irondi et al.,

2016), permitindo assim que os níveis de angiotensina II circulante caiam levando a

diminuição de níveis pressóricos.

Como dito anteriormente, mais estudos são necessários para maior

entendimento do como o SPs age para reduzir a pressão arterial em ratos HS. Os

mecanismos podem envolver efeito diferenciado na regionalização do controle

simpático assim como ação em mecanismos hormonais.

61

7. CONCLUSÃO

Com esse trabalho foi possível concluir que o tratamento com a suspensão teve ação

anti-hipertensivo; Efeitos anti-hipertensivos da SPs não envolvem mecanismos

diuréticos; Os compostos presentes na suspensão, quando combinados, mesmo em

quantidades inferiores ao descrito na literatura, promoveram potencial anti-

hipertensivo nos animais; Os dados ainda não são conclusivos que os efeitos anti-

hipertensivos envolvam mecanismos de controle neural da pressão arterial.

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ANEXOS

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