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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA E ECOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO (LATO SENSU)
Curso de Especialização em Microbiologia
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE ESPÉCIES DE
LEVEDURAS DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS ISOLADAS DE
AMOSTRAS DA POEIRA DE BIBLIOTECAS DE CUIABÁ E VÁRZEA
GRANDE E SUA RELAÇÃO COM ÁRVORES HOSPEDEIRAS
DINIZ PEREIRA LEITE JÚNIOR
Cuiabá/MT – 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA E ECOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO (LATO SENSU)
Curso de Especialização em Microbiologia
DISCENTE:
DINIZ PEREIRA LEITE JÚNIOR
ORIENTADOR:
PROF. DR. LUCIANO NAKAZATO
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE ESPÉCIES DE
LEVEDURAS DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS ISOLADAS DE
AMOSTRAS DA POEIRA DE BIBLIOTECAS DE CUIABÁ E VÁRZEA
GRANDE E SUA RELAÇÃO COM ÁRVORES HOSPEDEIRAS
Monografia apresentado ao Depto. de
Botânica e Ecologia do Instituto de Biociências
da Universidade Federal de Mato Grosso,
como requisito parcial para obtenção do Grau
de Especialista em Microbiologia.
Cuiabá/MT – 2016
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L533c LEITE-JR., DINIZ PEREIRA
“CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA DE
LEVEDURAS DO COMPLEXO CRYPTOCOCCUS ISOLADAS DA
POEIRA DE BIBLIOTECAS DE CUIABÁ E VÁRZEA GRANDE E SUA
RELAÇÃO COM ÁRVORES HOSPEDEIRAS - 2016”
DINIZ PEREIRA LEITE JÚNIOR – 2016.
47 f. : il. Color. ; 30 cm.
Orientador: LUCIANO NAKAZATO.
TCC (Especialização em Microbiologia) – Universidade Federal de
Mato Grosso.
Instituto de Biociências, Programa de pós-graduação “Latu Sensu”
Cuiabá. 2016.
Inclui bibliografia.
1. Cryptococcus. 2. Poeira. 3. Bibliotecas. 4. Ar. 5. Habitat. I.
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor (a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
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RESUMO
O complexo Cryptococcus spp é constituído por leveduras capsuladas de distribuição
cosmopolita, incluindo agentes etiológicos da criptococose. No meio ambiente o fungo
é encontrado principalmente em substratos de origens animal e vegetal. A infecção
humana ocorre através da inalação de propágulos de origem sexual presentes no
ambiente. Neste trabalho foram realizadas 42 coletas com o auxílio de swab, exposição
gravitacional e amostrador de Andersen em poeira encontrada nos livros pertencentes ao
acervo de sete bibliotecas da cidade de Cuiabá e Várzea Grande/Mato Grosso. O
material coletado foi semeado em ágar Sabouraud, e após observação das características
compatíveis com colônias de aspecto cremoso a mucóide, as mesmas foram isoladas em
ágar niger e cultivadas a temperaturas de 27º e 37oC C por 5-7 dias. A identificação das
amostras isoladas foi realizada através da observação microscópica em preparações a
fresco coradas pela tinta da China, testes adicionais em meio CGB (L-Canavanina-
glicina-azul de bromotimol), caldo uréia e testes para assimilação de carboidratos
(auxanograma) e posterior identificação molecular foi realizada em laboratório
especializado. Das 42 amostras coletadas da poeira de livros, foram isoladas 1.306
(70%) de colônias em bibliotecas em Cuiabá e 559 (30%) nas bibliotecas em Várzea
Grande, de amostras positivas totalizando 1.865 UFC’s. A espécie mais frequentemente
isolada foi C. gattii 46 (2,5%); seguido de C. neoformans 28 (1,5%, C. terreus 15
(0,8%), C. luteolus 12 (0,6%) e C. unigutullatus (0,5%) os demais 94% encontram-se
em identificação. A alta biodiversidade de leveduras do gênero Cryptococcus spp,
isoladas de diversas fontes ambientais nas áreas urbanas do Brasil, sugere a
possibilidade de indivíduos imunocomprometidos e até mesmo hígidos entrarem em
contato com múltiplas fontes de contágio diariamente ao longo de suas vidas. Este
estudo aponta a possível aquisição do fungo isolado da poeira em acervos de
bibliotecas, devido à exposição contínua dos funcionários que trabalham nestes
ambientes e indivíduos visitantes a estes locais ao micronicho presente no ambiente
bibliotecário.
Palavras-chave: Cryptococcus, poeira, bibliotecas, ar, habitat.
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ABSTRACT
The Cryptococcus spp complex is composed of cosmopolitan distribution capped
yeasts, including etiological agents of cryptococcosis. In the environment the fungus is
found mainly in substrates of animal and vegetal origins. Human infection occurs
through the inhalation of sexually propagated propagules present in the environment. In
this work 42 samples were collected with the help of swab, gravitational exposure and
Andersen sampler in dust found in the books belonging to the collection of seven
libraries in the city of Cuiabá and Várzea Grande / Mato Grosso. The collected material
was sown on Sabouraud agar, and after observing the characteristics compatible with
colonies of creamy to mucoid aspect, they were isolated in Niger agar and cultured at
temperatures of 27º and 37oC for 5-7 days. Identification of the isolated samples was
performed by microscopic observation on fresh preparations stained by China ink,
additional tests on CGB (L-Canavanine-Bromothymol blue-glycine), urea broth and
carbohydrate assimilation tests (auxanogram) and Posterior molecular identification was
performed in a specialized laboratory. Of the 42 samples collected from the dust of
books, 1,306 (70%) of colonies were registered in libraries in Cuiabá and 559 (30%) in
the libraries in Várzea Grande, of positive samples totaling 1,865 CFUs. The most
frequently isolated species was C. gattii 46 (2.5%); Followed by C. neoformans 28
(1.5%, C. terreus 15 (0.8%), C. luteolus 12 (0.6%) and C. unigutullatus (0.5%), the
remaining 94% are identified. The high biodiversity of yeasts of the genus
Cryptococcus spp, isolated from several environmental sources in urban areas of Brazil,
suggests the possibility of immunocompromised and even healthy individuals coming
into contact with multiple sources of contagion daily throughout their lives This study
points to the possible acquisition of the isolated dust fungus in library collections, due
to the continuous exposure of the employees working in these environments and
individuals visiting these places to the microniche present in the librarian environment.
Key words: Cryptococcus, dust, libraries, air, habitat.
6
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................7
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA..........................................................................9
3. OBJETIVOS...............................................................................................................10
3.1. Objetivo geral...............................................................................................10
3.2. Objetivo específico.......................................................................................10
4. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................11
5. PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS...............................................................15
5.1. Locais de coleta............................................................................................15
5.2. Coletas..........................................................................................................15
5.3. Técnica de Exposição...................................................................................15
5.4. Técnica de Swab...........................................................................................15
5.5. Técnica de Amostrador.................................................................................15
6. SEMEADURA DO MATERIAL BIOLÓGICO.......................................................18
7. IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS LEVEDURIFORMES........................................19
8. EXAME DIRETO.......................................................................................................19
8.1. Técnica da Tinta da China............................................................................19
9. PROVAS BIOQUÍMICAS.........................................................................................20
10. IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS EM MEIO CROMOGÊNICO.................20
11. PRODUÇÃO DE FENOL-OXIDASE EM MEIOÁGAR NÍGER........................20
12. TESTE DE CGB (Canavanina Glicina Azul de Bromotimol)..................................21
13. TESTE DE UREASE................................................................................................22
14. AUXANOGRAMA – Assimilação de Carboidratos................................................23
15. ZIMOGRAMA – Fermentação de Carboidratos.......................................................23
16. TÉCNICA DE RIDDELL (microcultivo).................................................................24
17. TIPAGEM MOLECULAR.......................................................................................24
18. RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................26
19. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................34
7
1. INTRODUÇÃO
Os fungos são um dos mais diversos grupos de microrganismos no planeta.
Como um dos megadiversos grupos, esses estão entre os menos conhecidos (CANNON,
1997).
São importantes, tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico;
ecologicamente, são considerados os “lixeiros” do mundo, pois degradam todo tipo de
restos orgânicos, independente da origem, transformando-os em elementos assimiláveis
pelas plantas. Já, economicamente, têm implicações em várias áreas: medicina humana
e veterinária, farmácia, nutrição, fitopatologia, agricultura, biotecnologia, entre outras
(MORAES et al, 2010).
Os fungos constituem um reino diferenciado de plantas e animais por várias
características, entre as quais a mais marcante é o modo de nutrição absortiva. Entre os
demais caracteres incluem-se a formação de estruturas vegetativas filamentosas, as
hifas, que constituem o micélio, e estruturas especializadas para reprodução sexuada e
assexuada, próprias de cada grupo taxonômico, a partir das quais se formam os esporos.
Embora a maioria dos fungos forme micélio bem desenvolvido, alguns, como as
leveduras, são unicelulares (ALEXOPOULOS et al., 1996).
Geralmente são onipresentes no interior de ambientes humanos, onde a maioria
do contato entre seres humanos e os microrganismos acontece. A maioria destes
microrganismos, aparentemente, desempenha um papel neutro, mas alguns são
prejudiciais para a saúde e estilos de vida humana (AMEND et al, 2010).
Os contaminantes biológicos ou bioaerossóis, como fungos, bactérias, algas,
ácaros, amebas utilizam-se de matéria particulada (pólen, fragmentos de insetos,
escamas de pele humana e pêlos) como substrato, onde se multiplicam, dobrando a
população a cada 20 segundos, pois dependem do parasitismo celular para reprodução
(DANTAS, 1998).
Algumas espécies podem causar processos alérgicos intensos, toxicoses e até
infecções disseminadas fatais em indivíduos susceptíveis (LACAZ et al, 2002). Seus
elementos fúngicos encontrados no ar chamados esporos (forma sexuada) ou conídios
(forma assexuada) (SIDRIM & ROCHA, 2004); são aeroalérgenos e quando inalados,
podem ser responsáveis por manifestações respiratórias alérgicas, como asma e rinite
(MENEZES et al, 2006). Os fungos e bactérias se reproduzem em qualquer ambiente
que apresente meios favoráveis à nutrição e reprodução destes microrganismos.
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A matéria particulada (pó) funciona num primeiro momento como um substrato
ideal para a multiplicação microbiana, que em condições favoráveis (umidade relativa)
permite sua rápida multiplicação, aumentando assim a concentração de agentes
biológicos nos ambientes (DANTAS, 1998).
O conhecimento dos fungos anemófilos em determinada cidade ou região é
importante para o diagnóstico etiológico e o tratamento específico das manifestações
alérgicas respiratórias. Várias técnicas quantitativas e qualitativas são preconizadas para
a coleta e identificação desses fungos na dependência do local estudado (MEZZARI,
2003).
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2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A grande diversidade biológica das regiões brasileiras faz do Brasil um país com
alta biodiversidade, aliado ao endemismo de algumas espécies. Essa riqueza está
distribuída no território nacional em seis biomas continentais: mata Atlântica, pantanal,
Amazônia, caatinga, cerrado e pampa, os quais são caracterizados por apresentarem
certa uniformidade em suas regiões ambientais como clima, temperatura, solo e
fisionomia característica.
Os fungos são considerados uns dos principais agentes deteriorantes dos acervos
bibliográficos, por se tratar de um ambiente com grande concentração de matéria
orgânica. Este fato é favorecido muitas vezes pela ausência de ventilação adequada
nestes ambientes.
A relação entre a má conservação e o odor de “mofo” frequentemente
encontrada em bibliotecas e arquivos é bem conhecida por todas as pessoas que
trabalham com livros e documentos antigos e consequentemente envolvidos na etiologia
de doenças respiratórias, como oportunistas responsáveis por diferentes quadros clínicos
de infecções, alergias e até quadros mais graves de doenças sistêmicas, provocadas por
estas entidades fúngicas.
É indiscutível a importância de estudos taxonômicos e epidemiológicos, visto
que, eles relatam a real incidência das espécies isoladas em cada região do globo, bem
como podem apontar o aparecimento de novas espécies que anteriormente não haviam
sido isoladas em nosso meio.
Considerando ainda o pouco conhecimento relativo à micota encontrada em
determinados ambientes, principalmente às relacionadas à região Centro Oeste do país,
está justificada a importância de estudos que venham contribuir para ampliação de
informações sobre a diversidade de fungos, onde se encontra um dos principais biomas
da região centro oeste do país: o cerrado.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Identificar e caracterizar a frequência e a concentração de esporos da micobiota
anemofílica nas bibliotecas públicas e privadas das cidades de Cuiabá e Várzea Grande
- Mato Grosso; avaliando as espécies fúngicas leveduriformes isoladas do complexo
Cryptococcus e sua relação com árvores hospedeiras, verificando seu impacto na saúde
ocupacional.
3.2. Objetivos específicos
Isolar e identificar espécies fúngicas leveduriformes provenientes dos acervos
bibliográficos de arquivos e bibliotecas avaliadas.
Realizar o estudo eco-epidemiológico dos fungos leveduriformes isolados
Avaliar a frequência de fungos leveduriformes presentes na micobiota ambiental
das bibliotecas pesquisadas.
Verificar as espécies fúngicas leveduriformes mais prevalentes nos ambientes
literários.
Correlacionar o isolamento do gênero fúngico lignolítico Cryptococcus e
possível associação com infecções.
Realizar caracterização bioquímica e molecular dos isolados fúngicos
leveduriformes.
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4. REVISÃO DE LITERATURA
O reino Fungi (Eumycota) é dividido atualmente em sete filos: Chytridiomycota,
Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota,
Ascomycota e Basidiomycota, e um grupo, os fungos anamórficos (SIDRIM &
ROCHA, 2004; HIBBETT et al, 2007; MORAES et al,2010); sendo ainda que os dois
últimos (Ascomycota e Basidiomycota) encontram-se incluídos no sub-reino Dikarya,
de acordo com Hibbett et al, (2007).
Existem muitos tipos de partículas suspensas no ar do ambiente onde o homem
vive, porém algumas são peculiares no ambiente de trabalho. A variedade de poeiras às
quais os trabalhadores estão expostos, na forma de substância pura ou em misturas, é
muito grande. A inalação é a forma mais comum de entrada dessas partículas no
organismo. Os efeitos do pó inalados dependem das espécies químicas que as
compõem, da sua concentração no ar, do local de deposição no sistema respiratório e do
tempo de exposição do trabalhador a essas poeiras (ANJOS-SANTOS, 2001).
As partículas suspensas podem se depositar nos espaços mais profundos do
pulmão humano. Elas podem ser removidas pelos processos fisiológicos de proteção e
limpeza ou podem ser retidas no corpo por longos períodos. A combinação desses
diversos processos governa o potencial de risco das poeiras (ANJOS-SANTOS, 2001).
O armazenamento de livros e materiais de arquivo no interior de edifícios
dedicados à sua preservação criaram ambientes únicos para fungos celulolíticos e
habitats para espécies microbianas (REIS-MENEZES et al, 2011; FLORIAN, 2002;
ZYSKA, 1997; NYUKSHA, 1994; GALLO, 1992, 1993, 1994; GALLO et al, 1999),
como é o caso de algumas espécies de bactérias que utilizam a celulose para produzirem
biofilmes (ROMEO, 2008).
Deterioração microbiana ocorre inevitavelmente em papéis de diferentes idades
e de fabricação, como parte de um processo natural que os esforços humanos só podem
atrasar (PINZARI et al, 2010). Bactérias, fungos, pólen, vírus, fezes de rato, ácaros,
exuvias de insetos, escamas de pele do corpo ou excrementos de pássaros podem ser
fontes de contaminação biológica (NEVALAINEN & SEURI, 2005; KHAN &
KARUPPAYIL, 2010).
A conjunção de vários fatores de natureza climática (temperatura, luz, umidade);
aliados ao uso de ingredientes proporcionados pelo homem (tapetes, carpetes, cortinas)
e as ações que ocorrem no meio como infiltrações, vazamentos, desumidificadores,
12
umidificadores e excesso de calor fornecem ao ambiente condições ideais para a
proliferação e a manutenção de microrganismos (FARLEY & FRANKLIN, 1992;
CUNNINGHAM et al., 2004; YAMASHITA et al, 2005; MC KERNAN et al, 2008; LI
et al, 2010; KHAN & KARUPPAYIL, 2011).
Os fungos tiveram seu grupo reconhecido como um reino a partir da descrição
de cinco reinos por Whittaker em 1969. Esses microrganismos foram alocados em
reinos com base na morfologia e no modo de nutrição dos seres vivos, sendo criado,
então, o reino fungi. Em 1990, Carl Woese propôs o agrupamento dos cinco reinos
estabelecidos por Whittaker em três domínios: Archaea, Eubacteria e Eukaria, onde o
reino fungi faz parte do domínio Eukaria, que reúne todos os eucariontes (MORAES et
al, 2010).
Quanto à morfologia, os fungos podem ser classificados como leveduriformes e
filamentosos, sendo a maioria desses microrganismos dispersos na natureza na forma
filamentosa, se desenvolvendo com sua estrutura básica chamada hifas. As hifas
agrupam-se formando o micélio. O crescimento da hifa ocorre de forma apical e lateral,
resultando na formação de colônias que são observadas macroscopicamente (LACAZ et
al, 1988, 2002; SIDRIM & ROCHA, 2004).
Algumas espécies fúngicas, apresentam melanina na parede celular, observando-
se uma coloração de aspecto acastanhado ao enegrecido, sendo conhecidos como
demácios ou dematiáceos; na ausência dessa pigmentação, são chamados hialinos. O
grupo dimórfico, pode apresentar-se na forma filamentosa ou leveduriforme,
dependendo da temperatura ao qual são expostos (LACAZ et al, 1988, 2002; SIDRIM
& ROCHA, 2004).
Os fungos e seus metabólitos interessam a biologia e a medicina sob vários
aspectos, entre os quais: produção de substâncias de ampla utilização médica e
comercial (LUBERTOZZI & KEASLING, 2009) e agentes etiológicos bem definidos
de infecções (ZAITS et al., 2010). Esses microrganismos; não obstante, também são
responsáveis por causar patologias de grande amplitude e gravidade, podendo provocar
lesões cutâneas superficiais à doença invasiva ou sistêmica, culminando não raramente
em morte do hospedeiro (MIKULSKA et al., 2011).
Desde que Cryptococcus spp foi isolado pela primeira vez, há mais de 113 anos,
muitos trabalhos foram realizados (BOEKHOUT et al. 2001, KWON-CHUNG et al,
2002; FILIÚ et al, 2002, GAMS, 2005; KWON-CHUNG & VARMA, 2006, BARONE
13
et al, 2006, ; KIDD et al, 2003; KIDD et al, 2007; KURTZMAN et al, 2011; LI et al,
2012, LEITE-JR et al, 2012).
Quanto à epidemiologia do agente, ocorre grande heterogeneidade de
distribuição das espécies em diferentes países e regiões de um mesmo país
(NISHIKAWA et al, 2003) e ainda existem muitas áreas a serem pesquisadas que
envolvem a interação do agente com o hospedeiro humano (PAPPALARDO &
MELHEM, 2003).
A levedura possui uma peculiar distribuição geográfica considerando suas
espécies. É observada elevada incidência de Cryptococcus neoformans em países na
Europa bem como na América do Norte; enquanto em zonas tropicais e subtropicais
Cryptococcus gattii, é predominante. Essa peculiar distribuição geográfica é importante
no estudo do seu habitat natural, como possível fonte de contágio para indivíduos
susceptíveis (VALIENTE et al, 1997).
Atualmente são reconhecidos cinco sorotipos para este fungo, o sorotipo A
(variação grubii), D (var. neoformans) e AD (híbrida entre var. neoformans e C. gattii),
e a segunda os sorotipos B e C (var. gattii) (NISHIKAWA et al, 2003; RIBAS et al,
2011). A distinção entre os diferentes sorotipos é baseada na reação imunológica com
anti-soro produzido contra diferentes composições polissacarídicas que constituem a
cápsula da levedura. Estudos realizados recentemente utilizando de polimorfismo de
DNA por AFLP (amplified fragment lenght polimorphism) mostraram que as diferenças
genéticas entre as variedades foram suficientes para classificá-las em duas espécies
distintas: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii (BOEKHOUT et al. 2001,
KWON-CHUNG et al, 2002; GAMS, 2005; KWON-CHUNG & VARMA, 2006;
KIDD et al, 2007; KURTZMAN et al, 2011; LI et al, 2012, LEITE-JR et al, 2012).
Em muitas situações, os relatos de criptococose têm sido associados a fezes de
pombos como fonte de infecção No entanto, análises epidemiológicas mostraram que
pacientes em contato com pombos, estão expostos à risco elevado de aquisição da
infecção. O grande problema é que C. neoformans permanece viável em fezes de
pombos secas, por muitos anos, sendo um reservatório de partículas infectantes
inaladas, que podem persistir em forma de pequena cápsula acumulados por deposição
alveolar. Atualmente estes fragmentos infectantes estão presentes em focos urbanos,
associados às aves urbanas e seus habitats adaptados às construções humanas, como
pombos, aves em parques, lojas comerciais e domicílios, como periquitos e canários
14
(SILVA & PAULA, 1963; HUBALE, 1975, PASSONI et al, 1998; FILIÚ et al, 2002,
BARONE et al, 2006).
O complexo Cryptococcus spp é composto por aproximadamente 70 espécies de
leveduras (KURTZMAN et al, 2011) que se reproduzem assexuadamente por
brotamento e podem ser identificadas por: hidrólise de amido, assimilação de inositol,
produção de urease, não fermentação de açúcares e sensibilidade à cicloheximida
(MITCHELL e PERFECT, 1995; IKEDA et al, 2002). Porém, para fins práticos, devem
ser considerados patogênicos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, os quais
destacam-se como os agentes etiológicos mais comuns da criptococose humana e animal,
A distribuição das leveduras do gênero Cryptococcus na natureza é muito vasta
e está associada especialmente aos vegetais em decomposição, a frutos e a fezes de aves
e especialmente às dos pombos (NIGRO et al, 1987). A espécie C. neoformans, é
comumente isolada de excretas de aves, sendo pombos urbanos (Columba livia)
considerados a principal fonte desta espécie (FILIÚ et al, 2002; BARONI et al, 2006,
CICHON et al, 2011); C. gattii tem sido isolada principalmente de amostras vegetais
de eucaliptos (Eucalyptus camaldulensis, E. tereticornis e E. gomphocephala) (ELLIS,
1987; PFEIFFER & ELLIS, 1992; SORREL & ELLIS, 1997; BERNARDO et al, 2001)
e outras árvores no Brasil (LAZÉRA et al, 1993, 1996, 1998, 2000).
Estudos realizados objetivando identificar, isolar e monitorar a freqüência de
determinadas espécies fúngicas em habitats diversos, fazem-se necessários; uma vez
que dados na literatura relatam fontes ambientais urbanas e substratos vegetais como
principais ambientes que albergam leveduras do complexo Cryptococcus, dando ênfase
àquelas associadas à exposição aos pombos e a ocos de árvores em centros urbanos nos
dias atuais. No estudo da criptococcose, e seus agentes etiológicos, é importante o
conhecimento e a vigilância extensiva dos reservatórios e fontes de infecção (NIGRO et
al, 1987).
Estes parâmetros ajudam e fornecem assim, dados epidemiológicos para a
implantação de programa de prevenção e terapia efetivas (HORTA et al, 2002). Este
trabalho registra o primeiro relato brasileiro sobre associação deste fungo à poeira em
acervos de bibliotecas e sua respectiva associação com este biótopo.
15
5. PROCEDIMENTO METODOLÓGICO
5.1. Locais da coleta
As áreas estudadas foram salas de periódicos, salas de estudos, arquivos, sala de
coleções das bibliotecas públicas e privadas regionais das cidades de Cuiabá e Várzea
Grande no Estado de Mato Grosso.
Foram realizadas 42 amostras das salas e ambientes literários das bibliotecas das
cidades citadas. As coletas foram realizadas de acordo com a disposição e
disponibilidade das áreas existentes em cada biblioteca selecionada.
A temperatura (T) e umidade relativa (UR) foram avaliadas no interior desses
repositórios em cada ponto de amostragem no momento em que a coleta microbiológica
estava sendo realizada utilizando-se para isso um termohigrômetro digital com
capacidadede leitura -10
+60
oC (Modelo 7429.02.0.00 Marca Incoterm).
5.2. METODOLOGIA DE COLETA APLICADA
Com propósito de coletar e avaliar a condição do ar interno das dependências
das bibliotecas foram realizadas quatro coletas, em metodologias distintas dentro de
cada sala nas instituições literárias.
5.2.1. COLETAS
5.2.1.a. Técnica de Exposição (método de sedimentação passiva)
Esta técnica consiste em expor uma placa de petri, contendo ágar Sabouraud
dextrose ou ágar batata acrescido de cloranfenicol (100 mg/mL).
O método de sedimentação é a coleta passiva de contaminação viável no ar por
ocorrência fall out ou estabelecimento em uma placa de petri aberta.
Este método baseia-se na sedimentação de esporos dos fungos anemófilos,
sobre a placa, colocados em posição horizontal. As placas de petri foram abertas dentro
das salas escolhidas, por aproximadamente 30 minutos, a uma altura de 1m e 20 cm de
altura de acordo com Gambale et al, (1993).
Esta metodologia aplicada nesse estudo foi realizada ainda conforme
especificações da Resolução 09 de 16 de janeiro de 2003, da ANVISA, que regulamenta
a Norma Técnica 001 (NT 001), a qual descreve sobre a coleta de fungos em ambientes
internos (BRASIL, 2003). Desta forma, o tempo preconizado para a coleta seguirá a
recomendação especificada pela Resolução 09 utilizando o tempo de 15 minutos.
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A NT 001 estabelece que para a coleta de fungos em um ambiente interno, deve-
se coletar em meio de cultura ágar Sabourad Dextrose, ágar batata dextrose ou ágar
extrato de malte distribuído em uma placa de petri previamente esterilizada, que deve
ficar aberta e exposta durante um intervalo de tempo que pode variar entre 5 a 15
minutos.
O número mínimo de amostras para uma área de 1000m2 construídos é de uma
amostra, segundo a NT 001. Após esse procedimento, as amostras devem permanecer
em temperatura ambiente durante sete dias para favorecer o crescimento das colônias
(BRASIL, 2003).
Para aplicação desta técnica, as placas de petri foram acondicionadas
principalmente sobre superfícies paralelas ao chão como balcões, armários e estantes.
Os locais escolhidos para exposição foram padronizados para que cada uma das placas
esteja exposta de forma exatamente semelhante nas duas coletas estabelecidas em cada
biblioteca das cidades escolhidas nos dois períodos sazonais estabelecidos: seco/quente
(inverno) e úmido/chuvoso (verão).
5.2.1.b. Técnica de Swab (Zaragatoa) (método de captura partículas
sedimentadas).
Enquanto as placas de petri estavam expostas, utilizando um cotonete estéril
(swab) umedecido com solução salina estéril 20% para cada ponto de coleta; os swabs
foram friccionado sobre a superfície de livros, periódicos e documentos que estavam
disponíveis no momento da coleta. Para a realização da coleta em superfícies planas
(capas dos livros), a embalagem que contém o swab estéril foi aberta no momento da
coleta, assepticamente, pelo lado da haste, tomando cuidado para não tocar na ponta.
Para a realização da coleta o swab foi umedecido em solução salina 20% com
cloranfenicol, comprimindo-o contra as paredes do frasco de salina, para remover o
excesso de líquido. A área de coleta foi delimitada utilizando um molde estéril, com
dimensões de 10 cm x 10 cm (100 cm2).
O swab foi friccionado com pressão, formando um ângulo de 30º com a
superfície teste, vinte vezes na forma “zigue-zague”, nos sentidos das diagonais, na área
de coleta da superfície, no espaço delimitado pelo molde. O swab foi girado
continuamente para que toda a superfície do algodão entrasse em contato com a
amostra. Outras seções dos livros e documentos que se encontram dispostos sobre as
estantes também foram friccionadas para a coleta do substrato.
17
Em seguida, o swab foi transferido para tubo de ensaio contendo 10 mL de
solução salina e a parte manuseada da haste foi quebrada na borda do tubo com salina,
para não ter contato com o material amostrado. Esta técnica preconizada de acordo com
a APHA - Associação Americana de Saúde Pública (1998); Oliveira (1999); Andrade
(2008).
5.2.1.c. Técnica de Amostrador de Ar (método de captura de partículas por
impactação direta).
Amostrador de Andersen (ANDERSEN, 1958) foi utilizado para análise de
fungos, leveduras e bactérias em ambientes fechados (indoor). É reconhecido
internacionalmente como o amostrador de ar mais eficiente na quantificação dos
microrganismos e na determinação de sua capacidade de penetrabilidade no trato
respiratório.
O amostrador de ar Andersen é um instrumento de alumínio, que simula o trato
respiratório dos indivíduos, sendo constituído de uma entrada cônica, de amostragem
com 400 orifícios (tamanho variável em cada estágio) e uma placa de base, fixada por
três ganchos de pressão, com aspiração de ar feita por uma bomba a vácuo operando em
torno de 28,3 L/min, constantemente. O ar com as partículas viáveis entra no
impactador e acelera através dos orifícios de jateamento. As partículas viáveis são
separadas conforme seu diâmetro aerodinâmico (definido pelo tamanho, forma e
massa), viabilizando a impactação sobre a superfície de um meio de cultura em placas
de petri. As partículas maiores são inicialmente impactadas e retidas nas placas
superiores, enquanto que as partículas menores escapam para os estágios inferiores
através da saída na base do impactador. O tamanho das partículas pode ser coletado em
todos os estágios de 0,3 µm a 15 µm. Os impactadores tem limitação em ambientes nos
quais a concentração de microrganismos viáveis excede 10.000 UFC/m3 (BIOAERO,
2006).
Estes procedimentos foram realizados em quatro coletas distintas, em dois
períodos sazonais: uma realizada em cada biblioteca da cidade escolhida no período
seco (estiagem) e outra realizada em cada cidade escolhida, no período úmido (chuvoso)
respectivamente.
Foi coletada uma amostra de ar interior por andar ou de cada área (ambiente)
servida por um equipamento condicionador de ar dos ambientes escolhidos, conforme
18
preconiza a NT 001 contida na Resolução n° 9, estabelecida pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (BRASIL, 2003).
Dessa forma poder-se-á fazer uma avaliação da atividade da microbiota fúngica
em movimento (ar) técnica 1 (gravitacional), imóvel (pó) técnica 2 (swab) e 3
(impactação) sobre as superfícies inertes dos livros.
6. SEMEADURA DO MATERIAL BIOLÓGICO
Depois de transcorrido o período de exposição por meio de três técnicas, o
material colhido foi levado ao laboratório de micologia localizado nas dependências do
laboratório de investigação, da faculdade de medicina na Universidade Federal de Mato
Grosso na cidade de Cuiabá.
As placas de petri onde foram aplicadas as técnicas 1 (Exposição) e 3
(Impactação) foram diretamente acondicionadas e incubadas em estufa B.O.D
(ELETROLAB) 25º a 27º C (+/- 2º C) por 5-7 dias até a formação de Unidades
Formadoras de Colônias (UFC).
Para a técnica 2 (Swab), as zaragatoas utilizadas para a coleta de superfície de
livros e estantes das bibliotecas foram semeadas em placas de petri (150 mm x 20 mm)
contendo ágar Sabouraud (DIFCOTM
) adicionado de cloranfenicol (100 mg/mL). Foi
adotada uma semeadura diferenciada com intuito de facilitar o posterior isolamento das
colônias em crescimento ao transcorrer do terceiro dia de incubação.
Para a semeadura, ao invés de estriar o swab sobre a placa em direção vertical
e/ou horizontal, como é adotada para a técnica de semeaduras para bactérias; o swab foi
retirado do frasco com salina, retirado e excesso de água na parede interna do frasco e
em seguida foram realizados leves movimentos sobre o ágar em forma de espiral no
sentido horário.
Depois de transcorrido o período de incubação e crescimento das colônias
fúngicas, foi analisado os aspectos macromorfológicos tais como: coloração da colônia,
verso e reverso (FREY et al, 1985; LACAZ, 1988; WATANABE, 2002; De HOOG et
al, 2007). Os estudos da micromorfologia dos cultivos e identificações foram realizados
tendo como base livros clássicos para identificação de gêneros e espécies e ainda, testes
bioquímicos e de temperatura quando necessários no auxílio das identificações.
19
7. IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS LEVEDURIFORMES
A aparência das leveduras da cultura primária é primordial sempre que se tratar
deste grupo fúngico. O procedimento pode ser em estrias e por esgotamento da alça, em
meio e temperatura idênticos aos usados para o cultivo primário.
Foi utilizado o método de Gram (1884) para diferenciação de colônias fúngicas
e bacterianas.
7. EXAME DIRETO
7.1. TÉCNICA DA TINTA DA CHINA (TINTA NANQUIM)
A tinta da China foi utilizada na pesquisa de leveduras do gênero Cryptococcus,
quando observadas as características de suas colônias crescidas nas placas primárias
com aspectos mucóide de coloração branco a bege.
Está técnica foi utilizada com intuito de permitir identificar as leveduras deste
gênero onde se destaca a cápsula deste fungo contra um fundo negro da tinta quando
observados ao microscópio.
A colônia do meio primário é suspensa em uma gota de tinta da China, fazendo-
se um filme bem delgado entre a lâmina e a lamínula e observando-se com objetivas de
10X e 40X. Nos casos em que o material estivesse muito espesso, foi adicionada uma
gota de salina ou água destilado estéril na suspensão, para facilitar a observação. A
diferenciação será realizada pela observação do núcleo refringente e gemulação do
fungo.
Figura 01. Aspecto micromorfológicos de leveduras do gênero Cryptococcus em técnica de tinta da
China (nanquim) isoladas das bibliotecas das cidades de Cuiabá e Várzea Grande. Técnica utilizada
como subsídio para confirmação do gênero fúngico, onde se pode observar a cápsula, característica
especifica para identificação do gênero. Imagem: Leite-Jr, D. P.
20
8. PROVAS BIOQUÍMICAS
Para execução dos testes fisiológicos, para confirmação de gênero e
identificação de espécie, deve-se assegurar a pureza da colônia, analisando-se esfregaço
corado segundo Gram. Os testes incluem métodos de assimilação de fontes de carbono e
nitrogênio e fermentação de carboidratos. Os testes de assimilação indicam a habilidade
do organismo de usar determinado composto na presença de oxigênio sendo que cada
espécie tem o seu próprio padrão de assimilação o qual é utilizado para sua
identificação. A fermentação avalia a capacidade do organismo de usar determinado
composto anaerobicamente.
Este teste envolve a inoculação de vários tubos contendo o meio basal. O poder
discriminatório é grande nos testes de assimilação (auxanograma) e é potencializado
quando provas de fermentação (zimograma) são associadas (FERREIRA & ÁVILA,
2001).
8.1. IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS EM MEIO CROMOGÊNICO
Após isolamento, as colônias foram testadas quanto sua pureza através de
plaqueamento em meio cromogênico CHROMagarTM
Candida (BBL). Este
procedimento será utilizado para isolar e identificar presuntivamente. O fundamento
deste método preconiza a utilização do substrato ß-glicosaminidase (COOKE et al,
2002, QUINDÓS et al, 2001) e a diferenciação das leveduras de acordo com a
morfologia e a cor das colônias (GARCIA-MARTOS, 1998, CARRILLO MUNÕZ et
al, 2001.
8.2. PRODUÇÃO DE FENOL-OXIDASE EM MEIO ÁGAR NIGER
A análise macroscópica das colônias sugestivas do complexo Cryptococcus foi
realizada observando-se aspecto superficial brilhante, liso, com consistência cremosa a
mucóide, coloração branca a bege.
A produção de melanina é uma característica amplamente utilizada para a
identificação de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii em laboratório
consideradas espécies patogênicas mais estudadas atualmente (FILIÚ et al, 2002;
HAGEN et al, 2015). Este pigmento é revelado pela cor escura que varia do marrom-
café ao preto nas colônias, quando o fungo cresce em meios que contêm compostos
fenólicos ou difenólicos na sua composição meios tais como: ágar semente de girassol
21
(Helianthus annus); sementes de níger (Guizotia abyssinica) e sementes de alpiste
(Phalaris canariensis) sendo estas espécies fúngicas capazes de sintetizar melanina
através da conversão desses substratos pela atividade fenol-oxidase (KWON-CHUNG
& BENNETT, 1992; LACAZ et al, 2002; HERNÁNDEZ et al, 2003).
A enzima fenol-oxidase ou lacase presente na levedura atua sobre esses
substratos, gerando quinonas como produtos, que sofrem um processo de
autopolimerização, transformando-se em melanina. Esta fica retida na parede celular do
fungo, sendo responsável pela expressão do pigmento escuro mostrado pelas colônias.
Outras espécies de leveduras do gênero Cryptococcus podem apresentar produção de
melanina, porém, de forma menos pronunciada que Cryptococcus neoformans e
Cryptococcus gattii (LACAZ et al, 2002; HERNÁNDEZ et al, 2003).
8.3. TESTE DE CGB (L-Canavanina Glicina Azul de Bromotimol)
Os organismos leveduriformes confirmados em ágar niger foram repicados em
ágar Sabouraud dextrose obtidos em laboratório. Tubos contendo meio CGB (L-
Canavanina Glicina Azul de Bromotimol) foram preparados como previamente descrito
(KWON-CHUNG et al, 1982; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992) e foram
inoculadas no centro do tubo, em seguida os tubos inoculados foram acondicionados em
estufa B.O.D (ELETROLAB) e incubados 25º a 27º C, durante 72 horas e avaliados
para a reação de agar CGB, que revelaram reações após 48 horas.
Figura 02. Teste em ágar niger, utilizado como subsídio para identificação da
fenoloxidase, característico das espécies de Cryptococcus neoformans e C. gatti.
Imagem: Leite-Jr, D.P.
22
Para diferenciar as espécies C. neoformans e C. gatti, o teste de CGB é o mais
empregado. A grande maioria dos isolados de C. neoformans são sensíveis a L-
canavanina, não assimilando a glicina como única fonte de carbono e nitrogênio, desse
modo, não alteram o meio CGB, não alteram o pH e consequentemente, a cor do meio
se mantém original, na tonalidade esverdeada (KWON-CHUNG et al, 1982; MIN &
KWON-CHUNG, 1986; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
A espécie C. gatti é naturalmente resistente a L-canavanina, sendo então, capaz
de crescer no meio utilizando a glicina, elevando o pH do meio e modificando a cor do
indicador de pH, o azul de bromotimol (KWON-CHUNG et al, 1982; MIN & KWON-
CHUNG, 1986; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Reações em ágar CGB foram
consideradas positivas quando houver mudança de coloração do meio para cor azul
cobalto (C. gatii) e negativo quando a cor do meio de CGB permanecer verde-
amarelado (C. neoformans).
8.4. TESTE DA UREASE
Esta prova bioquímica é processada em meio de Christensen, e detecta a
presença ou ausência da enzima urease produzida pelo fungo. Este meio é rico em uréia,
assim, quando em contato com a enzima urease, produzida por algumas espécies de
fungos é hidrolisado com liberação de amônia, acarretando mudanças de pH, que altera
para um pH alcalino e, ocorrendo posteriormente há mudança do indicador para róseo
intenso. A metodologia é simples e consiste em semear fragmentos da colônia no meio
Figura 03. Teste em CGB (L-Canavanina Glicina
Azul de Bromotimol) utilizado como subsídio para
identificação das espécies Cryptococcus neoformans e
C. gatti. Imagem: Leite-Jr, D. P.
23
Figura 04. Teste de Urease, utilizado como subsídio
adicional para diferenciação das leveduras do gênero
Cryptococcus). A mudança do meio indica o gênero.
Urease não produzida: coloração amarelo (negativo).
Urease produzida: coloração rosa (positivo).
Imagem: Leite-Jr, D. P.
de Christensen e incubar a temperatura ambiente (25 °C) por 24 a 96 horas. O resultado
é considerado positivo quando houver a mudança do meio de amarelo para rosa intenso
e é considerado negativo quando o meio se mantiver amarelo a amarelo opaco.
8.5. AUXANOGRAMA – ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS
O teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar um
composto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de
assimilação. Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras.
Estão condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam a
degradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução do
nitrato (GODOY, 2004).
Este teste foi realizado visando observar o padrão de assimilação de dez
carboidratos (glicose, galactose, maltose, sacarose, lactose, trealose, xilose, melibiose,
rafinose e celibiose) como única fonte de carbono.
8.6. ZIMOGRAMA – FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS
A habilidade de uma levedura para fermentar um determinado açúcar dependerá
da presença ou ausência de um sistema de transporte que permitirá a absorção do açúcar
a baixas tensões de O2 e da presença de um sistema enzimático que atuará na
degradação hidrólise do açúcar com a formação de etanol e anidrido carbônico. A
24
fermentação positiva ou negativa de um determinado açúcar é um dado complementar
para diferenciar as espécies (GODOY, 2004).
8.7. TÉCNICA DE RIDDELL (MICROCULTIVO) PARA LEVEDURAS:
Esta técnica igualmente utilizada para a identificação de fungos micelianos,
porém aqui há uma diferença na implantação do fungo sobre o meio. O microcultivo ou
técnica de Riddell (RIDDELL, 1950; LACAZ et al., 2002) foi realizado com o objetivo
de visualizar as estruturas micromorfológicas típicas de cada espécie do gênero. Ágar
fubá, acrescido de Tween 80, com pH ajustado entre 5,8 e 6,2, foi distribuído, com
auxílio de pipeta estéril, em camada fina sobre lâminas previamente preparadas em
câmara de microcultivo. Após solidificação do meio, cada amostra foi semeada em 03
linhas finas, horizontais e paralelas na superfície do ágar e coberta com lamínula. Após
a adição de água destilada estéril ao algodão presente na placa, para obtenção de câmara
úmida, o sistema fechado foi incubado a 25º a 27º C em estufa B.O.D (ELETROLAB),
durante 72 horas.
9. TIPAGEM MOLECULAR
A tipagem molecular foi realizada pela técnica de URA5-RFLP. Para
amplificação parcial do gene URA5, por meio da PCR, foram utilizados os
oligonucleotídeos URA5F (5’ ATGTCCTCCCAAGCCCTCGAC 3’) e URA5R (5’
TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3’) (MEYER et al., 2009). As reações de PCR
foram realizadas em um volume final de 50 μL [50 ng de DNA genômico; 0,8 pmol de
cada oligonucleotídeo; 1,5 mM de MgCl2; 1x Tampão PCR 10x (200mM Tris-HCl pH
8.4, 500 mM KCl); 0,1 mM de dNTPs; 1U de Taq DNA polymerase (Recombinant,
Invitrogen), em termociclador ProFlex™ PCR System (Life technologies) sob as
seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 3 minutos seguida por 35 ciclos de
45 segundos a 94°C, anelamento a 63°C por 1 minuto, extensão por 2 minutos à 72°C; e
uma extensão final de 5 minutos a 72°C. Os produtos da PCR (15 μL) foram
duplamente digeridos com Sau96I (10 U/μl, Thermo Scientific) e HhaI (20 U/μl,
Thermo Scientific) por 16h a 37°C e os fragmentos, corados com GelRedTM
(Nucleic
Acid gel stain, Biotium), foram fracionados por eletroforese em gel de agarose (3%) a
100V por 3h e analisados em sistema de fotodocumentação ChemiDocTM
XRS+ (Bio-
Rad) com auxílio do software Image LabTM
(Bio-Rad). O marcador de massa molecular
25
utilizado foi Ladder 100bp (GeneRuler 100bp DNA Ladder, Thermo Scientific). As
bandas de RFLP foram avaliadas visualmente pela comparacão com os padrões obtidos
a partir de cepas padrão, WM 148 (VNI), WM 626 (VNII), WM 628 (VNIII), 629
(VNIV), WM 179 (VGI), WM 178 (VGII), WM 161 (VGIII) e WM 779 (VGIV)
cedidas pelo laboratório de micologia do Instituto Evandro Chagas – Fiocruz, Rio De
Janeiro.
26
10. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A literatura brasileira sobre a criptococose vem contribuindo significativamente
para direcionamento e elucidação dos fatos relacionados a respeito do agente e da
doença. As leveduras do gênero Cryptococcus, em especial C. neoformans, apresentam
seu habitat no ambiente e em sua grande maioria o solo, realizando decomposição de
restos vegetais, bem como fezes de aves e morcegos, que são encontrados tanto em
áreas urbanas como em áreas rurais do Brasil (SILVA et al, 1963; MELO et al, 1987;
PASSONI et al, 1998; MACHADO et al, 1993; NISHIKAWA et al, 1996; FILIU et al,
2002; MONTENEGRO et al, 2000; NISHIKAWA et al, 2003; BARONI et al, 2006).
Porém, outros estudos permitiram novos dimensionamentos referentes à
ecologia do agente da criptococose no Brasil, demonstrando que a levedura está
associada não somente aos pombos ou às árvores do gênero Eucalyptus spp, mas
também em outras espécies de árvores, como os estudos realizados por Lazéra e seus
colaboradores (1993, 1996, 1998, 2000), Fortes et al (2001) e Baltazar Ribeiro (2008).
De acordo com pesquisas mais recentes, as leveduras tem se mostrado cada vez
mais albergadas em diversos tipos de ambientes e substratos, contribuindo e realizando
seu papel na microbiota destes; como comensais, decompositores e patógenos. Neste
estudo a identificação de cinco diferentes espécies de leveduras do gênero Cryptococcus
spp. fenotipicamente, isoladas do substrato da poeira em unidades literárias, apontam
um dos biótopos possíveis de isolamento deste tipo de microrganismo. Foram isoladas
1.865 colônias distribuídas em sete bibliotecas pesquisadas; 4 na cidade de Cuiabá
(70%) e 3 na cidade de Várzea Grande (30%), em todas as unidades literárias foram
detectadas e identificadas a presença da levedura capsulada albergada nestes ambientes.
O percentual (5,9%) de amostras positivas identificadas fenotipicamente neste
estudo (Gráfico 01) realizado na cidade de Cuiabá e Várzea Grande merece destaque
quando comparado com estudos de outros autores, realizados em outras cidades
brasileiras, quando estes em suas pesquisas isolaram o agente lignolítico em substrato
de excrementos de aves.
Os resultados iniciais realizados fenotipicamente mostram que espécie
Cryptococcus gattii foi a mais frequente isolada totalizando 46 (2,5%) dos isolados;
seguida de Cryptococcus neformanss 28 (1,5%), Cryptococcus terreus 15 (0,8%),
Cryptococcus luteolus 12 (0,6%) e Cryptococcus unigutullatus 10 (0,5%), e que
27
posteriormente passarão pelo processo de identificação molecular para confirmação. Os
94% das amostras serão identificadas diretamente por métodos moleculares por não
apresentarem características fenotípicas para identificação.
Gráfico 01. Espécies isoladas e identificadas fenotipicamente de Cryptococcus spp. de
amostras da poeira de bibliotecas das cidades de Cuiabá e Várzea Grande – Mato
Grosso/2015.
Soares e colaboradores (2006), em estudo realizado na cidade de Santos,
obtiveram uma frequência de 13,9% das amostras de excretas de pombos positivas para
C. neoformans. Na cidade de Goiânia, Kobayashi e seus colaboradores (2005),
encontraram uma freqüência de 23,2%; Baroni e colaboradores (2006) pesquisando
torres de igrejas no Rio de Janeiro, observaram um percentual de 37,8% das amostras
coletadas para a presença de levedura capsulada e ainda Abegg e colaboradores (2006)
no Rio Grande do Sul, isolaram C. neoformans var. grubii em 87% das amostras de
excretas de psitacídeos.
As demais espécies confirmadas por fenotipagem encontram-se em fase de
identificação e totalizam 1.754 (94%) das amostras isoladas. Os resultados preliminares
da identificação genotípica mostram que das 1.754 (94%), 6 amostras passaram pelo
processo genotípico e foram identificadas como sento 3 amostras de C. difflluens, 2
amostras de C. grubii e 1 amostra de Cryptococcus surugaensis (Tabela 01).
28
Tabela 01. Resultados de BLAST no site do NCBI (National Center for Biotechnology
Information) de amostras de fontes ambientais para o complexo Cryptococcus isolados
de amostras da poeira de bibliotecas das cidades de Cuiabá e Várzea Grande/2015.
No.
Cod.
No.
LEMI
Id. Molecular Max
Score
Total
Score
Query
Cover
E-
Value
Ident. No. Acesso Primers/
Amplif.
001 973/2016 Cryptococcus diffluens 1018 1018 100% 0,0 99% KP131902.1 ITS1/ITS4
002 974/2016 Cryptoccus surugaensis 525 525 99% 0,0 99% AB100440.1 ITS1/ITS4
003 975/2016 Crypcotoccus neoformans var. grubii
– ATCC 208821
922 922 100% 0,0 99% KU729082.1 ITS1/ITS4
005 976/2016 Cryptococcus diffluens 963 963 100% 0,0 100% KJ816912.1 ITS1/ITS4
006 977/2016 Crypcotoccus diffluens 1101 1101 100% 0,0 99% KP131901.1 ITS1/ITS4
008 978/2016 Cryptococcus neoformans var. grubii 911 911 99% 0,0 99% KU729082.1 ITS1/ITS4
Fonte: NCBI (National Center for Biotechnology Information)
No Brasil, esta levedura capsulada vem sendo isolada em diversos locais
geográficos: Na Bahia (SILVA & PAULA, 1963, SANTANA et al, 2007); São Paulo
(SILVA & CAPUANO, 2008; REZENDE et al, 2008), Mato Grosso do Sul (FILIÚ et
al, 2002), Goiás (KOBAYASHI et al, 2005); Rio de Janeiro (LAZERA et al, 1993;
PASSONI et al, 1998; BARONI et al, 2006) e Rio Grande do Sul (MACHADO et al,
1993; REOLON et al, 2004; ABEGG et al, 2006; FARIA et al, 2010). Em Mato
Grosso, a primeira descrição da atividade deste microrganismo em pacientes HIV
positivos foi caracterizada em estudo realizado por Favalessa et al, (2009); estes autores
detectaram 37 isolados de C. neoformans e C. gattii em distintos materiais clínicos
provenientes de pacientes soropositivos e soronegativos. E posteriormente, em 2012,
Leite-Jr e seus colaboradores encontrou vestígios da levedura capsulada em amostras de
poeira na Cidade de Cuiabá/MT.
O percentual de isolamentos dos espécimens fúngicos leveduriformes (70%) em
4 bibliotecas da cidade de Cuiabá e (30%) em 3 bibliotecas da cidade de Várzea
Grande, apresentado neste estudo, realizado em ambiente considerado fechado, coloca
em evidência as informações do estudo realizado por Kobayashi et al (2005) os quais
demonstraram que a presença do fungo em amostras ambientais, é mais representativa
quando as mesmas encontram-se protegidas das condições metereológicas.
Ishaq e colaboradores (1968) fizeram um alerta a esta situação, quando
relataram que as altas temperaturas e a incidência solar direta podem agir como agentes
29
que interfiram e prejudiquem o crescimento, agindo de forma negativa no
desenvolvimento de algumas espécies de leveduras.
Em relação à ecologia do complexo Cryptococcus vários estudos vêm
mostrando uma variedade de nichos, incluindo substratos orgânicos e habitats
relacionados como porões, cavernas, torres de igrejas, praças, parques, jardins
zoológicos, excrementos de aves e morcegos, estábulos, tocas de tatus, solo, vegetais
em decomposição, poeira e ocos de várias espécies de árvores, em ambientes urbano,
florestal e rural (NIGRO et al, 1987; LAZÉRA et al, 1993; 1996, 2000; PASSONI et al,
1998; PAPPALARDO & MELHEM, 2002; TRILLES et al, 2003; KOBAYASHI et al,
2005; ESCANDON et al, 2005; BARONI et al, 2006; GROVER et al, 2009, GIRISH
et al, 2010; FIRACATIVE et al, 2011, LEITE-JR et al, 2012).
No Brasil relato sobre a ecologia desta espécie foi identificada na presença de
poeira em 2015, por Brito-Santos e seus colaboradores no Amazonas e principalmente a
existência em locais de grande fluxo e atividade de pessoas, como bibliotecas por Leite-
Jr et al, (2012) em Cuiabá, isolamento de 41 colônias compreendendo sete espécies de
Cryptococcus spp. identificadas no microhabitat da poeira, mostrando a importância do
conhecimento de fontes saprobióticas que abriguem as leveduras do complexo
Cryptococcus; responsáveis por quadros importantes e fatais de meningite
criptococcócica em imunodeprimidos e imunocompetentes (QUINTERO et al, 2005;
PUKKILA-WORLEY & MYLONAKIS, 2008; VELAGAPUDI et al, 2009).
Além de locais públicos, o próprio ambiente pode conter o fungo em alta
densidade como mostrou o trabalho realizado por Criseo et al (1995), o qual registrou
um percentual igual a 26,6% em excretas de aves alojados em pet shops e domicílios.
Swinne et al (1992) isolaram C. neoformans da poeira doméstica, em Bujumbura
(África do Sul) em amostras oriundas das residências dos pacientes com criptococose
associada a AIDS fazendo uma correlação significativa entre a existência de pombos
próximos ao ambiente domiciliar e a probabilidade de contaminação dessas residências.
Soogarum e colaboradores (2006) em pesquisa realizada em diferentes regiões
de Bangkok isolaram a presença de C. neoformans em 14 amostras de fezes de pombos.
Hanasha et al, (2004) analisando 509 amostras de excretas de columbiformes coletadas
de várias cidades da Jordânia, 336 foram positivas para Cryptococcus spp; porem estes
pesquisadores não identificaram a presença de C. neoformans ou de C. gattii.
Ainda Passoni e colaboradores (1998), realizaram o isolamento do
basidiomiceto em excretas de aves mantidas em cativeiro em comparação à poeira
30
domiciliar e peridomiciliar. Das 79 amostras de excretas de aves coletadas por estes
pesquisadores, 12,7% foram positivas. Esses autores concluíram que a freqüência de
isolados positivos em residências que comportavam aves em cativeiro foi o principal
fator apontado como sendo responsável pela contaminação domiciliar. Neste estudo, o
percentual de isolamento de espécies de Cryptococcus spp em 42 placas contendo
amostras de poeira coletadas com auxílio de swab, exposição e auxílio de amostrador,
resultou em 1.865 UFC’s de amostras positivas (Gráfico 01).
A fonte ambiental do Cryptococcus gattii está associada a eucaliptos e material
vegetal em decomposição. Atualmente, esta espécie tem sido encontrada em diferentes
árvores e regiões geográficas no Brasil, tendo sido isolada em espécimes vegetais
nativas ou introduzidas no Brasil como em Cassia amarela (Senna multijuga), Cassia
rosa (Cassia grandis), Ficus (Ficus microcarpa), Cabori (Miroxylum peruiferum),
Sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides), Oiti (Moquilea tomentosa) evidenciando
outros habitats naturais para essa espécie (LAZERÁ et al, 1993, 1996, 2000;
RESTREPO et al, 2000; MONTENEGRO et al, 2000; REIMÃO et al, 2007;
BALTAZAR & RIBEIRO, 2008). Neste trabalho, através da identificação molecular
dos 1.865 isolados de Cryptococcus spp. de poeira de bibliotecas e de espécime vegetal
do gênero Ficus spp. procurando traçar a rota epidemiológica desta entidade fúngica
com seus hospedeiros vegetais; identificando o primeiro isolado da poeira 975/2016 e o
isolado do espécime vegetal 978/2016 (Tabela 01).
Fortes et al (2001) pesquisando árvores da Amazônia brasileira, reforçou esta
evidência, de que C. gattii não está associado a uma espécie particular de árvore, mas
sim a um nicho específico formado pela degradação natural da madeira. Pesquisas
atuais comprovam esta hipótese, como nos relatos de Randhawa et al (2008) mostrando
a prevalência de C. gattii (24%) e C. neoformans (26%) no solo em torno da base de
algumas árvores hospedeiras indicando que o solo é outro nicho ecológico importante
para estas duas espécies de Cryptococcus.
Mais recentemente, Girish et al (2010) confirmou esta hipótese isolando de
amostras ambientais Cryptococcus neoformans de 40 árvores selecionadas a partir de
madeira em decomposição e restos de casca de árvores vivas no Guindy National Park,
em Chennai, sul da Índia, sendo registrado o primeiro isolamento de C. gatti em espécie
de Jambolão (Syzygium cumini). Neste estudo, os primeiros resultados confirmam a rota
epidemiológica da espécie Cryptococcus neoformans var. grubii, isolado de amostras de
árvore e de uma das sete bibliotecas isolada da Capital de Cuiabá, onde podemos
31
confirmar a identidade gênica das duas amostras: uma coletada do interior da biblioteca
e outra isolada de árvore hospedeira, do gênero Ficus spp. Ainda destacamos a
identificação molecular de Cryptococcus surugaensis, descrito pela 1ª. vez por
Nagahama et al, (2003), isolado do sedimento do fundo da baía Suruga no Japão
(Tabela 1).
Estudos registrados em vários países incluindo amostras de espécies vegetais
revelaram a presença e a abundância de C. gattii, em uma gama de espécies nativas: na
Austrália (ELLIS, 1987; ELLIS & PFEIFFER, 1990); México (LICEA et al, 1996);
Egito (MAHMOUD, 1999); Portugal (BERNARDO et al, 2001); Argentina (DAVEL
et al, 2003); Colômbia (CALLEJAS et al, 1998; ESCANDÓN et al, 2006;
FIRACATIVE et al, 2011); Índia (RANDHAWA et al, 2006; GROVER et al, 2007;
RANDHAWA et al, 2008; GIRISH et al, 2010); Canadá (KIDD et al, 2004; KIDD et
al, 2007; SPRINGER & CHATURVEDI, 2010).
Atualmente, Loperena-Alvares et al, (2010) investigando espécies vegetais em
uma ilha do Caribe em Porto Rico; detectaram a presença de C. gatti em lesões de
plantas suculentas da família Cactaceae (Cephalocereus royenii), um tipo de cactus
muito comum naquela região. Mais recentemente, Firacative e seus colaboradores
(2011) processaram, na Colômbia, amostras de 3.634 árvores que circundavam as casas
de pacientes com criptococcosis causada por C. gatti; isolando uma amostra de C. gatti
sorotipo B; dois isolados de C. gatti sorotipo C e três isolados de C. neoformans var.
grubii sorotipo A. Em Mato Grosso, Anzai e colaboradores (2014) isolou amostra de
Cryptococcus gattii em Plathymenia reticulata (Leguminoseae).
A levedura basidiomicetica, Cryptococcus neoformans encontra-se bem
adaptada à excretas de aves, principalmente pombos. A população crescente destas aves
está tornando-se um problema ambiental e de saúde pública no Brasil e no mundo. Esta
espécie columbiforme tem o hábito de viver em grupos, abrigando-se e construindo seus
ninhos em locais altos como prédios, torres, sótãos, beirais de janelas, entre outros;
alimentando-se de grãos, e aproveitando os restos de alimentos e lixo encontrados em
locais públicos (ROSARIO et al, 2008).
Neste trabalho foi observada a grande concentração de pombos (Columba livia
domestica) permanente no ambiente urbano nas proximidades dos locais estudados
sendo que, estas aves conseguem ter acesso aos forros de telhados e beirais que não
apresentam vedações. Foi observado que as excretas dos pombos permaneciam alojadas
nos telhados e frestas de ar condicionado propiciando uma possível contaminação e
32
dispersão de partículas secas contendo propágulos fúngicos para o interior dos
estabelecimentos literários avaliados.
Os fatores climáticos de cada região, como temperatura, umidade e exposição à
luz, influenciam e podem contribuir para a obtenção de resultados (GRANADOS &
CASTAÑEDA, 2005; 2006; QUINTERO et al, 2005). Granados e Castañeda (2006)
demonstrou a prevalência de espécies de Cryptococcus, sugerindo que condições
climáticas influenciam a presença desta levedura, e que C. neoformans é mais
frequentemente isolado nas estações mais úmidas e de fezes secas. Já, Quintero et al,
(2005) demonstra que a presença de C. neoformans e C. gattii em amostras de fezes e
substratos vegetais, apresentam uma maior incidência de isolamento quando coletadas
no clima frio. As condições macroclimáticas da cidade de Cuiabá no Brasil, com
temperatura máxima média atingindo 34º a 35º C, apresentando um inverno seco e um
verão chuvoso, favorecem condições para o desenvolvimento e dispersão dos fungos
nos ambientes.
Os microclimas (temperatura e umidade) identificados nestes ambientes são
considerados como fatores para instalação da presença destes microrganismos nos
locais avaliados. Além da relação destes basiodiomicetos considerados lignolíticos
degradantes de celulose e outras substâncias vegetais, a maior freqüência de
Cryptococcus gattii (46; 2,5%) em relação a C. neoformans (28; 1,5%) pode estar
diretamente sendo influenciada pela temperatura, pois segundo relata Ishaq e
colaboradores (1968) C. neoformans não cresce a temperaturas acima de 40º C bem
como é sensível à luz solar direta.
Entretanto, em trabalho realizado por Kobayashi et al (2005), os autores
afirmam que outro fator que parece também influenciar a viabilidade de C. neoformans,
nas coletas e possivelmente nas amostras de swab colhidas, sendo representado pela
umidade, a qual tende a influenciar a decomposição bacteriana, modificando o pH e
provavelmente inibindo a proliferação da levedura.
A criptococcose está relacionada geralmente à infecção por C. neformans e C.
gattii, sendo raramente causada por outras espécies, incluindo C. albidus, C. laurentii,
C. curvatus, C. uniguttulatus (MITCHELL & PERFECT, 1995). De acordo com
Khawcharoenporn e seus colaboradores (2007), as demais espécies do gênero
Cryptococcus spp, geralmente são consideradas saprófitas. No entanto, nas últimas
décadas foram realizados registros na literatura mundial sobre infecções causadas por
outras espécies sendo que C. albidus e C. laurentii foram considerados responsáveis por
33
80% dos casos de criptococcose causada por Cryptococcus não-neoformans e não–
gattii. Com o aumento do número de pacientes imunocomprometidos e o amplo uso de
agentes imunossupressores, as incidências de infecções fúngicas têm aumentado em
todo o mundo, e entre elas, aquelas causadas por espécies de Cryptococcus emergentes,
como C. albidus e C. laurentii (PEDROSO et al, 2010).
Neste trabalho o isolamento de 46 (2,5%) de Cryptococcus gattii; 28 (1,5%) de
Cryptococcus neoformans, além de 15 (0,8%%) de Cryptococcus terreus, 12 (0,6%)
Cryptococcus luteolus e 10 (0,5%) de Cryptoccus unigutullatus (Gráfico 01),
demonstram que a presença de espécies consideradas patogênicas em potencial e
espécies emergentes pode refletir possibilidade dos mesmos presentes nos mais variados
substratos, constituírem agentes de infecção criptococcócica.
Durante o processo de isolamento das colônias sugestivas de leveduras do
gênero Cryptococcus spp, foi verificada dificuldade técnica devido à presença de fungos
contaminantes, os quais cresciam com maior velocidade e abundância do que as
leveduras de interesse. Pal (1997) realizando o isolamento de Cryptococcus
neoformans em excretas em Kathmandu, no Nepal; afirmou que essa dificuldade é
proveniente das próprias amostras, pois os substratos utilizados para coleta são
naturalmente contaminados por diversos outros fungos e leva em consideração ainda
que os meios utilizados para isolamento sejam ricos em nutrientes. Este fato possibilita
o crescimento tanto do fungo de interesse como de outros fungos presentes no substrato,
dificultando sobremaneira o isolamento de leveduras.
A alta biodiversidade de leveduras do gênero Cryptococcus isolados de diversas
fontes ambientais urbanas e rurais no Brasil e no mundo, demonstram a dificuldade de
determinar o habitat natural dessa levedura capsulada. Os resultados deste estudo
apontam a evidência da diversidade das origens ambientais de Cryptococcus spp
chamando atenção para os substratos favoráveis ao respectivo desenvolvimento no meio
ambiente. A análise da micobiota da poeira de locais onde a presença humana é
constante, se faz necessária objetivando estabelecer programas de vigilância e
prevenção de possíveis fontes de aquisição de organismos infecciosos que provocam
doenças, dentre estas a criptococose.
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