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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DE NOVOS CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS EM MODELOS EXPERIMENTAL DE

NEUROTOXICIDADE

HIASMIN FRANCIELY DA SILVA NERI

Goiânia 2017

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS


NEUROTOXICIDADE


Goiânia 2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção do título de mestres em Ciências Biológicas. Área de concentração: Farmacologia e Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Paulo César Ghedini Co-Orientador: Prof. Dr. Ricardo Menegatti

ii



NEUROTOXICIDADE

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Prof. Dr. Paulo César Ghedini Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________

Prof. Dr. Elson Alves Costa Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________

Profa. Dra. Adriane da Silveira Gomes Instituto federal Goiano / Campus Ipora

Aprovada em: ____/____/________

iii

Dedicatória

Dedico este trabalho aos meus pais Ailton e Maria Alice, e a minha irmã Hiorrana, pessoas que me dão o suporte necessário para continuar a estudar. E gostaria de agradecê-los pela compreensão, incentivo e amor que sempre me dedicam.

iv

Agradecimentos

Aos meus pais, Ailton e Maria Alice, e irmã Hiorrana por todo carinho, apoio.

Obrigada por sempre estarem disponíveis para me aconselhar ou

simplesmente ouvir meus problemas.

A minha avó Zadi, aos meus tios e primos pelo carinho e pela motivação.

Ao meu Namorado Luís Fernando pela amizade, companheirismo e por fazer

meus dias mais felizes.

A Adriane pelo incentivo, e por abrir as portas da ciência.

Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo César Ghedini, pelo exemplo, de ética e

paciência. Muito obrigada pela confiança e pelos ensinamentos.

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Ricardo Menegatti, pela confiança e incentivo.

Ao Prof. Dr. Elson Alves Costas pelos ensinamentos e incentivos.

Aos meus amigos e colegas do LQFM e do LFPN/UFG, pelo convívio durante

a realização deste trabalho, e por me acolherem calorosamente durante o decorrer do

mestrado, além da amizade.

Aos amigos e colegas do LFBM/UFG, que além da amizade, incentivo, apoio,

companheirismo e “diversão”, foram meu suporte durante esse percurso. Em especial

ao Hericles, Thiago, Christielly, Rodrigo, Lis e Guilherme.

Á todos aqueles, que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste

trabalho.

v

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas

lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que

deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era

antes”. (Marthin Luther King)

SUMÁRIO

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..................................................................... ix

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xii

LISTA DE TABELAS ................................................................................................ xiii

LISTA DE ESPECTROS .......................................................................................... xiv

RESUMO................................................................................................................... xv

ABSTRACT .............................................................................................................. xvi

1.Introdução ................................................................................................................ 1

1.1. Mercado Farmacêutico Global ............................................................................. 2

1.2. Doenças Neurodegenerativas .............................................................................. 4

1.3 Estresse oxidativo ................................................................................................. 6

1.3.1. Radicais Livres ................................................................................................. 7

1.3.2. Defesas Antioxidantes ....................................................................................... 8

1.4. Alumínio e Doenças Neurodegenerativas ............................................................ 9

2. Objetivos ............................................................................................................... 13

2.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 14

2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 14

3. Material e Método .................................................................................................. 15

3.1. Planejamento Estrutural dos Compostos (5 e 6) ................................................ 16

3.2. Elucidação estrutural .......................................................................................... 17

3.3. Análise Retrossintética ....................................................................................... 17

3.4. Metodologia Sintética ......................................................................................... 18

3.4.1. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol LQFM181 (5) .. 19

3.4.2. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol LQFM183 (6) .............................................................................................................................. 20

3.5. Drogas e Reagentes .......................................................................................... 20

3.6. Avaliação do Perfil Antioxidante in vitro ............................................................. 21

3.6.1. Determinação do Potencial Antioxidante pela técnica do DPPH ..................... 21

3.6.2. Quantificação da Peroxidação Lipídica ........................................................... 21

3.7. Avaliação Farmacológica ................................................................................... 22

3.7.1. Animais ............................................................................................................ 22

3.7.3 Avaliação do efeito protetor dos compostos sobre a neurotoxicidade induzida pelo cloreto de alumínio ............................................................................................ 22

3.8.1. Testes Comportamentais ................................................................................ 22

3.8.1.1. Esquiva passiva (ou inibitória) step-down .................................................... 23

3.8.1.2. Chaminé ....................................................................................................... 23

vii

3.8.1.3. Campo Aberto .............................................................................................. 23

3.9. Dosagens Bioquímicas ....................................................................................... 23

3.9.1. Processamento dos tecidos ............................................................................ 24

3.9.3. Determinação da Atividade da Colinesterase .................................................. 24

3.9.4. Determinação da Atividade da Catalase - CAT ............................................... 25

3.9.5. Determinação da peroxidação lipídica (TBARS) ............................................. 25

3.9.6. Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase – SOD ........................ 25

3.10. Análise Estatística ............................................................................................ 26

4. Resultados ............................................................................................................ 27

4.1.Determinação do Potencial Antioxidante pelo método DPPH ............................. 27

4.1.2. Quantificação das substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) ...... 28

4.2. Tratamento crônico ............................................................................................ 29

4.2.1. Peso Corporal ................................................................................................. 29

4.2.3. Testes comportamentais ................................................................................. 31

4.2.3.1. Esquiva passiva ........................................................................................... 31

4.3. Dosagens bioquímicas ....................................................................................... 33

4.3.1. Avaliação da Atividade da Acetilcolinesterase (AChE) .................................... 33

4.3.2. Dosagem das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS ................... 35

4.3.3. Dosagem da atividade da CAT ........................................................................ 36

4.3.4. Dosagem da atividade da SOD ....................................................................... 38

5.Discussão ............................................................................................................... 40

6. Conclusões ............................................................................................................ 45

7.Bibliografia .............................................................................................................. 47

8.Apêndice ................................................................................................................ 56

8.1. APÊNDICE 1: Mecanismo da reação de Síntese dos compostos LQFM181 (5), LQFM183 (6). ............................................................................................................ 57

8.1.1. MECANISMO 1: Rota da síntese dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6). .................................................................................................................................. 57

8.2. APÊNDICE 2: Espectros de infravermelho, de RMN 1H, HSQC e HMBC dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6). ................................................................ 58

8.3. APÊNDICE 3: Testes Complementares ............................................................. 63

8.3.1.2. Teste do Campo Aberto ............................................................................... 63

8.3.1.3. Chaminé ....................................................................................................... 63

8.3.1.4. Teste do Sono Induzido por Pentobarbital Sódico ....................................... 63

8.3.1.5. Índice de Lesão Gástrica .............................................................................. 63

8.3.2. Resultados ...................................................................................................... 64

viii

8.3.2.1. Teste Do Campo Aberto ............................................................................... 64

8.3.2.2. Teste Da Chaminé........................................................................................ 66

8.3.2.3. Teste Do Sono Induzido Por Pentobarbital Sódico ...................................... 66

8.3.2.4. Índice de Lesão gástrica ............................................................................... 67

9.Anexos ................................................................................................................... 69

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Graus Celsius

µL Microlitro

µmol Micromol

Abs. Absorbância

ACh Acetilcolina

AChE Acetilcolinesterase

AcOEt Acetato de Etila

AcOH Ácido Acético

ANOVA Análise de Variância

ASCh Acetiltiocolina

ATP Adenosina Trifosfato

BHT ButilHidroxitolueno

BSA Albumina de Soro Bovino (do inglês "bovine serum albumin")

CAT Enzima Catalse

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

cm Centímetros

D2 Receptor de Dopamina do tipo 2

D3 Receptor de Dopamina do tipo 3

DA Doença de Alzheimer

dd Duplo dubleto

ddd Duplo duplo dubleto

DM Distrofia Muscular

DN Doenças Neurodegenerativas

DP Doença de Parkinson

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

DTNB 5:5-ditiobis-2-nitrobenzoato

ELA Esclerose Lateral Amiotrófica

ERN Espécies Reativas de Nitrogênio

ERO Espécies Reativas de Oxigênio

EUA Estados Unidos da América

g Gramas

GPx Glutationa Peroxidase

GSH Glutationa

GSSG Glutationa Oxidada

HMBC Do inglês “Heteronuclear Multiple Bond Correlation”

x

HN Doença de Huntington

HSQC Do inglês “Heteronuclear Single Quantum Coherence”

IV Infravermelho

kg Quilogramas

L Litro

LQFM Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal

LQFM181 Código do composto

LQFM183 Código do composto

LRMN Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear

M Molaridade

mA Miliamperes

MDA Malondialdeído

mg Miligramas

MHz Megahertz

min Minutos

mL Mililitros

mM Milimolar

mmol Milimol

NADP+

fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida, do inglês “Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate”

NADPH NADP+ reduzida

NIMH “National Institute of Mental Health”

nmol Nanomol

OMS Organização Mundial da Saúde

p/v Peso por Volume

PA Pró-analise, e indica que o reagente tem grau de pureza suficientemente alto para uso em análise química

PF Ponto de Fusão

pH - log [H+]

PHRMA “Pharmaceutical Research and Manufacturers of America”

R Velocidade em nmoles de ASCh hidrolizado por minuto por miligrama de proteína

Rf CCD retention factor

RMN Ressonância Magnética Nuclear

rpm Rotações por minuto

S Segundos

SNC Sistema Nervoso Central

SOD Enzima Superóxido Dismutase

TAU Proteína que estabilizam os microtúbulos

TBA Ácido Tiobarbitúrico

xi

TBARS

Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (do inglês "Thiobarbituric acid reactive substances")

TCA Ácido Tricloroacético

TMS Tetrametilsilano

UV Ultravioleta

v.o. Via de administração oral (Gavage)

α-2 Receptores do tipo alfa 2

Δ Temperatura de refluxo

ΔA Variação da Absorbância

xii

LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2007-2014, adaptado de Global 2015(2). ........................................................................................ 2 Figura 2 – Padrões moleculares da pregabalina, aripiprazol e acetato de glatirâmer. .................................................................................................................................... 3 Figura 3 – Números de fármacos em testes clínicos para o tratamento de diferentes transtornos neurológicos ............................................................................................. 4 Figura 4 – Alterações conformacionais de proteínas que podem levar à neurotoxicidade. Adaptado de RANG et al., 2007(15). .................................................. 5 Figura 5 – Reações de formação de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria. . 7 Figura 6 – Sistemas de defesa antioxidante do tipo enzimático(27). ............................ 8 Figura 7 – Alterações nas funções metabólicas promovidas pelo alumínio no sistema biológico. Adaptado de KAWAHARA & KATO-NEGISHI, 2011(61). ........................... 11 Figura 8 – Padrão molecular do piribendil utilizado como precursor dos compostos (5 e 6) ............................................................................................................................ 16 Figura 9 – Análise Retrossintética da reação de formação dos compostos (5 e 6) .. 18 Figura 10 – Reação de formação do composto LQFM181 (5).................................. 19 Figura 11 – Reação de formação do composto LQFM183 (6).................................. 20 Figura 12 – Curva concentração-efeito (3x10-1 à 3x103 µg/mL) dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 sobre a inibição do radical DPPH (0,3 mM). Os símbolos representam as médias ± e.p.m. de três determinações. .......................................... 28 Figura 13 – Níveis de MDA (nmol/mg de proteínas) obtidos pela metodologia TBARs em amostras de cérebro total de ratos na presença dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 (10-5, 10-4, 10-3 M). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM de três determinações em triplicata. *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao controle lesado (CL), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. CN= controle normal; ......................................................................................................... 29 Figura 14 – Variações do peso dos animais (em gramas) determinados semanalmente a partir do início (semana 0) até o final dos tratamentos (semana 5) nos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. Cada linha representa um grupo e cada símbolo a média ± EPM (n= 9 a 10) do peso corporal semanal do grupo. ....................................................................................... 30 Figura 15 – Latência de retenção para o treino, memória de curta duração (MCD) e de longa duração (MLD) para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, quando comparado a sessão treino do mesmo grupo utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................................................................................................. 31 Figura 16 - Números de cruzamentos totais no teste do campo aberto para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................................. 32 Figura 17 – Tempo de escalada de camundongos submetidos ao teste chaminé para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). ***p<0,001 quando comparado ao grupo Veículo e # p<0,05; ## p<0,01 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ... 32 Figura 18 - Atividade da AChE (nmol/min/mg de proteínas) determinada no córtex (A) e no hipocampo (B) de camundongos dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181,

xiii

LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=5 a 7). *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 quando comparado ao grupo veículo. ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. ................................................................ 34 Figura 19 – Níveis de malondialdeído (MDA; nmol/mg de proteínas) determinados no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 4 a 7). *p<0,05 quando comparado ao grupo Veículo. #p<0,05 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. .... 36 Figura 20 – Valores obtidos na atividade da catalase (nmol/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4 a 6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo veículo; #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. .............................................................................. 37 Figura 21 - Valores obtidos na atividade da SOD (U/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=3 a 7). *p<0,05 e **p<0,01quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. ................................................................................................................ 39 Figura 22 – Desempenho dos animais no teste da chaminé, medido em latência de escalada (s). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 6). Não apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ....................... 66 Figura 23 - Latência ao sono barbitúrico, em segundos (A), e duração do sono, em min (B). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................... 67 Figura 24 – Índice de lesões gástricas em camundongos. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo Veículo (Tween 80 2%) e #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ............. 68

LISTA DE TABELAS

xiv

Tabela 1: Avaliação do ganho de peso corporal dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3 obtido pela diferença entre o peso final dos animais (Pf; determinado ao final dos tratamentos) e o peso inicial dos animais (Pi; determinado ao início dos tratamentos). Resultados são expressos como média ± EPM (n=9 a 10). .......................................................................................... 30 Tabela 2: Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto .... 65

LISTA DE ESPECTROS Espectro 1: Espectro de IV do Composto LQFM181 (5) .......................................... 58

xv

Espectro 2 – Espectro Ampliado de RMN 1H do Composto LQFM181 (5). .............. 59 Espectro 3 – Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM181 (5) ............. 59 Espectro 4 – Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HSQC. ....................................................................................................................... 60 Espectro 5 - Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HMBC. ....................................................................................................................... 60 Espectro 6: Espectro de IV do Composto LQFM183 (6) .......................................... 61 Espectro 7: Espectro ampliado de RMN 1H do Composto LQFM183 (6) ................. 62 Espectro 8: Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM183 (6) ............... 62

RESUMO

As doenças neurodegenerativas (DN) estão entre as principais causas de

mortalidade e incapacidade na população senil, sendo descritas mais de 600 tipos

xvi

com manifestações clínicas e patológicas distintas. Entre as causas envolvidas no

acometimento das DN está o estresse oxidativo, que leva à desestruturação das

membranas neuronais e, consequentemente, à morte celular. Um dos modelos

experimentais associados ao estresse oxidativo e que mimetiza as alterações

celulares que ocorrem nas DN, tais como a Doença de Alzheimer, é o da

neurotoxicidade induzida pelo cloreto de alumínio (AlCl3). Considerando o

envelhecimento populacional e, com isso, o aumento na incidência das DN, há a

necessidade eminente pela pesquisa de novos fármacos eficazes no tratamento

dessas doenças. Este estudo teve como objetivos planejar e sintetizar os compostos

LQFM181(5) e LQFM183 (6) com propriedades antioxidantes e avaliar o efeito protetor

dos mesmos em modelo de neurotoxicidade induzida por AlCl3 em camundongos. A

etapa do planejamento ocorreu pela metodologia de simplificação molecular, partindo

da substância com atividade central conhecida (piribendil), onde houve a contração

da subunidade benzodioxol pela subunidade com atividade antioxidante

butilhidrotolueno (BHT). Todas as sínteses dos compostos foram confirmadas pelas

metodologias de infravermelho (IV) e de ressonância magnética nuclear (RMN). As

atividades antioxidantes dos compostos foram comprovadas pelos testes in vitro que

avaliaram a capacidade dos compostos em reduzir o radical DPPH, e também na

inibição de formação do malondialdeído (MDA), produto da peroxidação lipídica das

membranas celulares. Posteriormente, foi avaliado o efeito dessas moléculas sobre

processos mnemônicos, utilizando o teste de esquiva passiva. Os animais foram

tratados por 40 dias com veículo (Tween 80 2%, 10 mL/kg, v.o.), LQFM181 e

LQFM183 (200 µmol/kg, v.o.) e AlCl3 (750 µmol/kg, v.o.), sendo que ambos os

compostos foram capazes de reduzir os efeitos deletérios promovidos pelo AlCl3 na

memória de curta duração (MCD) e na memória de longa duração (MLD), sugerindo

a ação dos compostos nas regiões do córtex e hipocampo, respectivamente. Não foi

observado alterações na atividade locomotora dos animais com a administração dos

compostos nos testes da chaminé e do campo aberto. Após a realização dos testes

comportamentais, os animais foram eutanasiados, o encéfalo dissecado e separados

o córtex e hipocampo para a realização da avaliação da lipoperoxidação lipídica das

membranas neuronais, assim como para as dosagens da atividade das enzimas

colinesterase, catalase e superóxido dismutase. Os resultados mostraram efeito

inibitório dos compostos sobre a colinesterase no hipocampo, reestabelecimento das

atividades da enzima catalase no hipocampo e da enzima superóxido dismutase

(SOD) no córtex de camundongos. Os compostos também promoveram a diminuição

dos níveis de peroxidação lipídica das membranas neuronais. Sendo assim, LQFM181

e LQFM183 possuem atividade protetora sobre a neurotoxicidade promovida pelo

AlCl3, sugerindo-se o efeito benéfico dessas moléculas sobre o dano tecidual em

patologias que envolvem o estresse oxidativo, tais como as doenças

neurodegenerativas.

ABSTRACT

Neurodegenerative diseases (NDs) are one of the main causes of mortality and disability in elder population, being described more than 600 types of ND with

xvii

distinct clinical and pathological manifestations. Among the causes involved in the onset of NDs is the oxidative stress, that promotes structural damage of neuronal membranes and, consequently, cell death. One of the experimental models associated with oxidative stress for studies that resemble the cellular damage present in the NDs, such as Alzheimer's disease, is the model of neurotoxicity induced by aluminum chloride (AlCl3). Considering the aging population and, therefore, the increase in the incidence of NDs, it is necessary more research for discovery of new effective drugs to treatment of these diseases. This study aimed to design and synthesize the LQFM181 (5) LQFM183 (6) compounds with antioxidant properties evaluating the protective effect of them in the model of neurotoxicity induced by AlCl3 in mice. The planning stage was performed using the molecular simplification methodology, based in a molecule with central activity (piribendil), where it was contracted the benzodioxole subunit with the 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) antioxidant subunit. All syntheses of the compounds were confirmed by infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR) methods. The antioxidant activity of the compounds were confirmed by DPPH, inhibition of malondialdehyde (MDA) formation and inhibition of brain cells lipid peroxidation tests. Subsequently, the effects of these molecules on mnemonic processes were evaluated using the passive avoidance test. The animals were treated for 40 days with either vehicle (Tween 80 2%, 10 ml / kg, po), LQFM181 and LQFM183 (200 µmol / kg, po) and AlCl3 (750 µmol / kg, po). The LQFM 181 and 183 were able to reduce the deleterious effects promoted by AlCl3 in the short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), suggesting the action of these compounds in the regions of cortex and hippocampus brain regions, respectively. The locomotor activity of animals was not influenced by administration of the compounds, evaluated by the chimney test and open field tests. In the next step of the study, the animals were sacrificed and the cortex and hippocampus were isolated with the aim to determine the lipid peroxidation levels of neuronal membranes and for evaluation of cholinesterase, catalase and superoxide dismutase enzymes. The results obtained showed the inhibitory effect of the compounds on the cholinesterasic activity in the hippocampus, reestablishment of the catalase activity in the hippocampus and of the superoxide dismutase (SOD) activity in cortex of the mice receiving AlCl3 750 µmol/kg. The compounds also promoted the reduction of lipid peroxidation levels of neuronal and membranes in both hippocampus and cortex brain regions. In conclusion, LQFM181 and LQFM183 present protective activity against neurotoxicity promoted by AlCl3, suggesting a beneficial effect of these molecules against the tissue damage that occurs in pathologies involving the oxidative stress, such as neurodegenerative diseases.

1

1.Introdução

2

1.1. Mercado Farmacêutico Global

Em lista publicada no ano de 2015 pelo IMSHEALTH, pode-se observar que

o mercado farmacêutico mundial vem apresentando um significativo crescimento,

além de desempenhar um papel de destaque na economia mundial. Segundo esses

dados, no ano de 2007 foram movimentados 739,5 bilhões de dólares e, em 2014,

ultrapassaram a marca de 1 trilhão de dólares (Figura 1), representando um

crescimento de quase 43%, sendo a América do Norte responsável por 36,2% deste

montante, correspondendo a 348,7 bilhões de dólares (1; 2).

Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2007-2014,

adaptado de Global 2015(2).

Entre o grupo das vinte classes farmacêuticas que mais faturaram em 2015,

totalizando um montante de 954,116 milhões de dólares do total, estão os fármacos

que atuam sobre o sistema nervoso central (SNC) e que arrecadaram mais de 74

milhões de dólares, o que corresponde a cerca de 8% desse total(3). Já entre os grupos

dos vinte fármacos que mais lucraram no ano de 2015(4), três deles possuem atividade

no sistema nervoso central (Figura 2), como a pregabalina (1), um análogo do GABA,

com ação anticonvulsivante, antiepilética, ansiolítica(5) e é capaz de reduzir a dor

neuropática central e periférica(6). Outro fármaco que se encontra nessa lista é o

Aripiprazol (2), um antipsicótico utilizado no tratamento da esquizofrenia(7). Por sua

vez, o acetato de glatirâmer (3) é um conjunto de aminoácidos utilizado no tratamento

da esclerose múltipla(8).

739,5

786,7

842,6

889,4

936,9

959

993,3

1057,1

2 0 0 7 2 0 0 8 2 0 0 9 2 0 1 0 2 0 1 1 2 0 1 2 2 0 1 3 2 0 1 4

3

Figura 2 – Padrões moleculares da pregabalina, aripiprazol e acetato de glatirâmer.

Além disso, a “Pharmaceutical Research and Manufacturers of America”

(PHRMA) identificou em 2016 mais de 400 candidatos (Figura 3) a protótipos de

fármacos para o tratamento de doenças que acometem o SNC. Deste total, 170 foram

destinados ao tratamento de doenças neurodegenerativas que poderão vir a auxiliar

no tratamento de cerca de 50 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos. Estes

medicamentos encontram-se na fase de pesquisa clínica ou aguardando aprovação

para a comercialização(9).

4

Figura 3 –Números de fármacos em testes clínicos para o tratamento de diferentes

transtornos neurológicos. Adaptado de 2015 REPORT, 2015(9).

Estão sendo pesquisados em estudo de fase clínica 59 fármacos para o

tratamento de Alzheimer (DA), 12 para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica

(ELA), 8 que se destinam ao tratamento da doença de Huntington (HN), 19 para

Distrofia Muscular (DM) e 31 para o tratamento da doença de Parkinson (DP). Este

dado sugere que fármacos para o tratamento de doenças neurodegenerativas (DN)

foi um dos grupos mais pesquisados no ano de 2015. Porém, apesar desse grande

volume, menos de 12% destes serão aprovados pelos órgãos competentes para a

comercialização(9). A busca de fármacos mais eficazes e com menores efeitos

adversos para o tratamento de DN torna importante a pesquisa para o

desenvolvimento de novos fármacos para essas enfermidades, visando a cura ou a

melhoria na qualidade de vida desses pacientes.

1.2. Doenças Neurodegenerativas

Existem mais de 600 tipos de DN, com manifestações clínicas e patológicas

distintas e, em muitos casos, o diagnóstico só é possível após a morte dos

pacientes(17). Dentre as DN, a mais comum é a DA, que atinge 70% dos indivíduos

acometidos por alguma neurodegeneração(10). Em decorrência do prolongamento da

expectativa de vida da população, há também uma multiplicação na incidência de

doenças crônicas associadas ao envelhecimento, sendo as DN a principal causa de

mortalidade e incapacidade na população senil (11,12,13).

4

6

6

8

8

1219

20

20

21

22

31

32

33

58

59

94

0 20 40 60 80 100

Lesão cerebral

Epasticidade

Lesão da Medula Espinal

Huntington

Turette

ELA

Distrofia Muscular

Cefaléia

Acidente Vascular Encefálico

Disordens Genéticas

Epilepsia

Parkinson

Outras

Esclerose Multipla

Tumor cerebral

Alzheimer

Dor

5

Apesar da etiologia das DN ainda não ser totalmente compreendida, sabe-se

que elas ocorrem devido a uma perturbação em diferentes células neuronais, tendo

idade e início variados, sintomas clínicos e características patológicas distintas(14).

Apesar do grande progresso na compreensão da etiologia desses transtornos, os

mecanismos subjacentes permanecem em grande parte obscuros. O consenso é que

mudanças conformacionais de algumas proteínas resultam em uma agregação

atípica, formando aglomerados insolúveis e, consequentemente, em acúmulo intra e

extracelular (Figura 4). Esse acúmulo leva a uma progressiva degeneração de

neurônios e, assim sendo, à morte neuronal(15).

Durante o processo de formação da proteína funcional, faz-se necessário que

ela seja dobrada corretamente, de forma compacta e específica, sendo que alterações

nesse processo pode formar variantes deformadas que incapacitam de adquirir a

conformação nativa. Essas variantes não possuem funcionalidade e podem formar

aglomerados insolúveis. Alterações na função das chaperonas podem levar a um

dobramento incorreto dessas proteínas e a mutações. As deformações podem ser

geradas espontaneamente a uma taxa baixa ao longo da vida, de modo que os

agregados se acumulam gradualmente com a idade. No sistema nervoso, os

agregados frequentemente formam estruturas distintas, geralmente conhecidos como

depósitos amiloides (Alzheimer), que são visíveis ao microscópio e são característicos

de DN. Embora os mecanismos não sejam claros, tais agregados, ou os precursores

de proteína mal dobradas levam à morte neuronal(16).

Figura 4 – Alterações conformacionais de proteínas que podem levar à neurotoxicidade. Adaptado de RANG et al., 2007(15).

6

Cada transtorno neurodegenerativo é originado por mudanças estruturais de

determinadas proteínas, como a β-amiloide (Alzheimer - DA), α-sinucleína (Parkinson

- DP), TAU (DA e DP), Huntingtina (HN) e SOD (ELA)(15). Outro fator que contribui

para o processo de degeneração neuronal são as espécies reativas de oxigênio

(EROs)(16). As EROs não são a causa direta das DN, mas desempenham um papel

essencial, pois o estresse oxidativo pode causar a neurodegeneração por alterar o

potencial redox neuronal, o que leva a um aumento da excitotoxicidade, danos no

DNA e modificação estrutural da proteína(18,19,20,21,22,23,24).

Estimativas do “National Institute of Mental Health (NIMH) ” indicam que 1 em

cada 4 indivíduos adultos nos Estados Unidos da América (EUA) sofrerão de algum

transtorno que acomete o SNC, o que corresponde a 61,5 milhões de pessoas(25). Os

custos gerados por essas pessoas ao sistema de saúde são de cerca de 317 bilhões

de dólares por ano e estudos reportam que até 2050 esse valor ultrapasse os 700

bilhões de dólares, sendo que o tratamento farmacológico eficaz seria capaz de

reduzir em até 220 bilhões de dólares ao ano os custos com esses indivíduos(26,9).

1.3 Estresse oxidativo

Durante o metabolismo celular ocorre a formação de radicais livres que atuam

como reguladores de reações bioquímicas, mediando a transferência de elétrons(27) e

promovendo diversas funções metabólicas tais como a geração de ATP, ativação

gênica e mecanismo de defesa em processos infecciosos. Porém, sua produção em

excesso pode causar danos às células(28). Além disso, como resposta do organismo

ao envelhecimento, para compensar processos metabólicos, há um maior consumo

de oxigênio e, consequentemente, uma maior produção de EROs(19,18,20,21).

Para compensar a formação das EROs, o organismo saudável possui defesas

que inibem a produção excessiva desses radicais livres, mantendo um equilíbrio entre

a produção e a eliminação das EROs. O processo de estresse oxidativo ocorre quando

essas defesas encontram-se em desequilíbrio, ou seja, um aumento de fatores pró-

oxidantes em detrimentos às defesas antioxidantes. Isso resulta em oxidação de

alguns bioconstituintes, como a membrana plasmática das células, que levará à perda

de função e ao desequilíbrio homeostático(29,27).

Quando não há compensação desse aumento das substâncias oxidantes,

ocorrem danos celulares que podem culminar em transtornos neurodegenerativos,

diabetes, câncer, entre outros(30). No caso das DN, ocorre a morte progressiva dos

7

neurônios no SNC, que pode levar, entre outras consequências, a déficits cognitivos

e prejuízos na memória(18,23).

1.3.1. Radicais Livres

As mitocôndrias durante os processos metabólicos normais, promovem a

formação de radicais livres. Esse processo é facilitado por alguns metais (ferro e

cobre) na forma iônica(36,37). Durante o processo de respiração celular, as mitocôndrias

metabolizam entre 85% a 90% do O2 consumido, essa reação é realizada por meio de

uma cadeia de elétrons, a qual é predominantemente a maior formadora de radicais

livres(30). Os outros 10 a 15% são utilizados em outras reações de oxidação direta ou

indireta.

A reação de cadeia de elétrons é catalisada pela citocromo oxidase. Esta atua

na parte final da cadeia, oxidando o citocromo c, removendo seus elétrons que,

posteriormente, serão adicionados à uma molécula de O2 para a formação de H2O

(Figura 5; reação 1). A ação da citocromo oxigenase modula a produção de radicais

livres e o O2 metabolizado (univalente ou singlet) na mitocôndria (cerca de 2% a 5%)

é desviado para outras vias, originando radicais livres(31).

Figura 5 – Reações de formação de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria.

Além disso, a partir do O2 univalente são formados os radicais superóxido (O2•-

- Figura 5; reação 2), hidroxila (OH•) e o peróxido de hidrogênio (H2O2 – Figura 4;

reação 3). Também pode-se gerar radicais por reações catalisadas por enzimas e com

a participação de íons metálicos (Figura 5; reações 4 e 5). O H2O2 apesar de não

possuir elétrons desemparelhados, possui alta capacidade reativa, levando a

alterações nas estruturas celulares e na geração de outros radicais livres como OH•,

que também é capaz de transpor as membranas celulares. O O2•-, além de participar

8

de reações de geração de OH•, pode ainda interagir com o óxido nítrico (NO•),

gerando espécies reativas de nitrogênio (ERNs), tais como o peroxinitrito (ONOO-)

(Figura 5; reação 6)(27).

Figura 6 – Sistemas de defesa antioxidante do tipo enzimático(27).

Os íons ferro e cobre são potentes catalizadores das reações de formação de

radicais livres, por meio de reações de óxido-redução. Essa interação ocorre

principalmente por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss(32,33,34). A primeira diz

respeito à geração de radical OH• por meio da reação do H2O2 com os íons em

questão, ao passo que, na segunda, estes íons catalisam a reação entre o H2O2 e o

radical O2• a fim de gerar, da mesma forma, o radical OH• (Figura 6).

1.3.2. Defesas Antioxidantes

O organismo possui meios para inibir ou reduzir os efeitos deletérios

provocados pelos radicais livres, eles são conhecidos como sistemas de defesas

antioxidantes. Esse sistema atua por diferentes mecanismos de ação: prevenção

(impedindo a formação dos radicais livres), varredores (impedem a ação dos radicais

livres) ou reparo (favorecendo a reconstituição das estruturas biológicas lesadas).

Frequentemente, esse sistema é separado em dois grupos: os enzimáticos e os não-

enzimáticos. Esse último é constituído por uma multiplicidade de substâncias, que

podem ter origem endógena ou dietética(35).

9

O sistema de defesa enzimático é constituído pelas enzimas superóxido

dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) (Figura 6). Elas

atuam como mecanismos de defesa preventivo, ou seja, impedindo e controlando a

formação de radicais livres. A SOD tem como objetivo impedir o acúmulo do radical

superóxido e a CAT e GPx previnem o acúmulo de H2O2, agente que, por meio das

reações de Fenton e Haber-Weiss, resulta na formação do radical OH• com alto

potencial reativo, sendo o principal indicador dos processos de peroxidação lipídica,

mudanças conformacionais de proteínas e mutações do DNA(27;34).

Já o sistema de defesa não-enzimático inclui, principalmente, compostos

antioxidantes de origem dietética, entre os quais vitaminas, minerais e compostos

fenólicos. O ácido ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol e β-caroteno, precursores das

vitaminas E e A, respectivamente, são compostos vitamínicos potencialmente

antioxidantes. Entre os minerais destacam-se o zinco, cobre, selênio e

magnésio(32,33,27).

1.4. Alumínio e Doenças Neurodegenerativas

O alumínio é um elemento da tabela periódica de número atômico 13 (13

prótons e 13 elétrons) com massa atômica 27 u, é mais frequentemente encontrado

na forma iônica de Al3+. Os isótopos de ocorrência natural são o 27Al e 26Al, sendo o

primeiro mais frequente, porém o segundo é mais estável(38,39). Esse metal apresenta

leveza, resistência, condutividade elétrica e baixo ponto de fusão(40).

O alumínio é um dos metais mais abundantes em nosso planeta(41,42,43), o que

torna quase impossível a não exposição a esse metal, estimando-se que o ser humano

ingere entre 3 e 12 mg/kg diariamente(44), tornando-se o elemento não essencial ao

qual o homem é mais frequentemente exposto.

Por muito tempo se desconheciam os efeitos nocivos para os seres vivos

desse metal, porém um crescente número de relatos demonstra que o alumínio possui

efeitos tóxicos observados nas mais diferentes formas de vida, como algas marinhas,

microorganismos, células, tecidos, plantas e animais e, obviamente, no

homem(45,46,47,48,49,50,51,52).

Os seres humanos são expostos ao alumínio de inúmeras formas: através de

nanopartículas inaladas que entram no corpo e se aderem a vários tecidos; oralmente,

pela água ou alimentos contaminados e através da nutrição parenteral, medicamentos

10

e soluções de diálise(53). Altas concentrações de alumínio no cérebro tem sido

associadas a condições neuropatológicas, como as DN(54,49,55,56).

Na década de 60, surgiram os primeiros relatos de degeneração neurofibrilar

em coelhos após a intoxicação com AlPO4(57). Desde então, trabalhos

complementares trazem informações sobre o acúmulo do alumínio em tecidos de

plantas, animais e seres humanos(45,46,47,58).

Animais submetidos a uma dieta rica em alumínio desenvolvem perda de

apetite e redução do ganho de peso(38,54,58). Esse metal pode acumular-se nos ossos,

fígado, rins, coração, sangue e encéfalo nos seres humanos(59,60,43). No encéfalo pode

levar a encefalopatia, déficits de memória, enfraquecimento da coordenação motora,

convulsões, entre outros sintomas(47,43).

A neurotoxicidade surge pelo fato desse metal conseguir transpor facilmente

a barreira hematoencefálica, através dos receptores que fazem endocitose das

proteínas carreadoras de ferro, causando alterações no fluxo desse íon através da

membrana(39). Sabe-se que o alumínio é capaz de alterar diversas funções biológicas

(Figura 7), como mudanças conformacionais no DNA; disfunção mitocondrial e

diminuição de ATP; alteração da fosforilação e defosforilação de proteínas; inibição

da liberação de neurotransmissores (glutamato, acetilcolina, 5-HT, NA); aceleração da

lipoperoxidação das membranas que alteram a sua fluidez; inibição da atividade

enzimática (CAT, SOD, ChAT, tirosina hidroxilase, dopamina β-hidroxilase) causando

assim, entre outros danos, prejuízos aos processos cognitivos e a formação da

memória(61,50). A memória é a base do conhecimento, estando envolvida com a

orientação no tempo e no espaço e com as habilidades intelectuais e mecânicas.

Aprendizagem e memória são o suporte para todo o nosso saber, habilidades e

planejamento, fazendo considerarmos o passado e nos situarmos no presente,

prevendo o futuro(62,63).

11

Figura 7 – Alterações nas funções metabólicas promovidas pelo alumínio no sistema

biológico.Adaptado de KAWAHARA & KATO-NEGISHI, 2011(61).

Uma das estruturas primordiais para o processo de aprendizado e formação

da memória é o hipocampo, localizado medialmente ao ventrículo lateral(64), sendo

que a estrutura denominada giro denteado está envolvida com os aspectos

emocionais de aprendizado e memória. Essa estrutura é relacionada com a memória

espacial e a memória emocional dos indivíduos(50). A memória espacial está

relacionada a atividades básicas, como encontrar alimento e abrigo para animais. Já

a memória emocional atua como um sistema de alerta, sinalizando para riscos à

integridade física(65,66).

No que diz respeito ao papel do alumínio em desordens neurológicas e

cognitivas, estudos sugerem que este elemento seja um fator causador de danos aos

processos de aprendizagem e memória(46,43). Estudos bioquímicos mostram

alterações em estruturas límbicas do encéfalo, prejudicando o sistema de

neurotransmissão colinérgica principalmente no hipocampo(67,68,69). Evidências

indicam que esse sistema tem participação crucial nos processos de memória e

aprendizagem(70,71).

12

Sabendo do papel desempenhado pelo estresse oxidativo no surgimento dos

transtornos neurodegenerativos(24), da ausência de tratamentos farmacológicos

eficazes, com baixos efeitos colaterais e ainda, com o panorama de crescimento do

mercado farmacêutico, esse estudo buscou planejar e sintetizar compostos com

características antioxidantes tendo como foco o tratamento de distúrbios cognitivos

oriundos de doenças neurodegenerativas. Para a obtenção desses protótipos, foram

utilizados como moléculas precursoras o piribendil, utilizado para o tratamento de

déficits cognitivos e de memória(72), e o butilato de hidroxitolueno (BHT) que apresenta

propriedades antioxidantes(73). Nesse estudo serão apresentados o planejamento, a

síntese e os efeitos biológicos dos protótipos LQFM181(5) e LQFM183 (6).

13

2. Objetivos

14

2.1. Objetivo geral

Planejar e sintetizar compostos (5 e 6) com possíveis propriedades

antioxidantes e avaliar o efeito protetor dos compostos em modelo de neurotoxicidade

induzida por cloreto de alumínio (AlCl3) em camundongos.

2.2. Objetivos Específicos

Planejar, sintetizar e caracterizar a estrutura dos compostos propostos,

através das metodologias de infravermelho, ressonância magnética nuclear, massas

e ultravioleta.

Caracterizar o perfil antioxidante dos compostos.

Determinar o efeito protetor dos compostos sobre o prejuízo da memória

induzida pelo cloreto de alumínio.

Avaliar o efeito dos compostos sobre o sistema de defesa antioxidante no

córtex e hipocampo.

15

3. Material e Método

16

3.1. Planejamento Estrutural dos Compostos (5 e 6)

No planejamento estrutural, substituiu-se a subunidade 1,3-benzodioxole (A)

e (B) presente em (4), pela subunidade (A+B) presentes em (5 e 6), a qual apresenta

atividade antioxidante, i.e. composto butilhidroxitolueno (BHT), um antioxidante

sintético amplamente empregado na indústria de alimentos(74). Com isso visou-se

obter compostos que sejam efetivos no tratamento das transtornos cognitivos

observadas nas DN, além de apresentar efeito antioxidante, uma vez que várias

doenças que acometem o SNC apresentam níveis elevados de espécies reativas de

oxigênio (ROS)(26), como ilustrado na Figura 8.

Figura 8 – Padrão molecular do piribendil utilizado como precursor dos compostos (5 e 6)

Segundo o banco de dados do Scifinder, as novas estruturas propostas (5 e

6), são inéditas. Apresentam as subunidades farmacofóricas presentes nos protótipos

(4) i.e. subunidades N-fenilpiperazínica C e D presentes em (4). Ademais, os novos

compostos (5 e 6) contemplam os filtros farmacocinéticos preconizados por

Lipinski(75). Segundo as regras de Lipinski ou dos cinco, candidatos a protótipos de

fármacos devem apresentar número de unidades de massa atômica menor ou igual a

quinhentos, número de sítios aceptores de ligação de hidrogênio menor ou igual a

dez, número de sítios doadores de ligação de hidrogênio menor ou igual a cinco, além

de coeficiente de partição entre 2-3.

17

3.2. Elucidação estrutural

Em parceria com o Instituto de Química da Universidade Federal de

Goiás/Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear (LRMN/UFG), foram obtidos os

espectros de RMN 1H, de HSQC e de HMBC em aparelho Bruker Avance III a 125 e

500 MHz; as amostras foram dissolvidas em CDCl3, utilizando como padrão interno o

TMS (Tetrametilsilano).

Os espectros na região do Infravermelho (I.V.) foram obtidos em um aparelho

Perkin-Elmer Spectrum Bx-II FT-IR System em colaboração com o Laboratório de

Controle de Qualidade de Medicamentos da Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal de Goiás (LCQM/UFG); as amostras foram prensadas em KBr (brometo de

potássio).

Os pontos de fusão das moléculas foram determinados com o aparelho

Gehaka Modelo PF1500, no Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal da

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás.

Para o monitoramento das reações, foi realizada a cromatografia em camada

delgada (CCD) utilizando placas de alumínio Merck, 0,2 mm de espessura como fase

estacionária, e fase móvel n-hexano: AcOEt (70:30). A visualização dos compostos

através de CCD deu-se em Câmara Escura de UV por lâmpada ultravioleta (254 e 365

nm).

A purificação dos compostos foi realizada por cromatografia de adsorção em

coluna, com sílica-gel de 100-13 200 mesh (Merck) como fase estacionária, e n-

hexano: AcOEt como fase móvel. Da fase orgânica, o excesso de água foi extraído

com emprego do sulfato de sódio anidro (Na2SO4), posteriormente filtrada com papel

de filtro e o solvente foi evaporado à pressão reduzida.

3.3. Análise Retrossintética

O planejamento da rota sintética ocorreu utilizando-se de uma análise

retrossintética (Figura 9), cujo objetivo é trabalhar a reação em sentido inverso, a partir

da molécula alvo, onde são realizadas desconexões que correspondam a reações

conhecidas de maneira que o plano sintetico seja o inverso da análise. Os compostos

(5 e 6) podem ser obtidos por meio da desconexão da ligação C-N, obtida pela

redução do nitrogênio da piperazina.

18

Figura 9 – Análise Retrossintética da reação de formação dos compostos (5 e 6)

3.4. Metodologia Sintética

19

3.4.1. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol LQFM181 (5)

As metodologias sintéticas a serem empregadas na obtenção dos compostos

LQFMs (5 e 6), objetos de estudo deste trabalho, encontram-se ilustradas nas Figuras

8, 9, 10 e 11, e foram produzidas em escala de 1mmol.

Em um balão de 50 mL foi adicionado, em banho de gelo, 1,0 mmol da n-

fenilpiperazina (9), o catalizador formaldeído (CH2O) 0,9 mL e 1 mL de ácido acético

(AcOH). Em seguida, adicionou-se 1,0 mmol do 2,6-di-tert-butilfenol (8), o meio

reacional foi aquecido à temperatura de refluxo por cerca de 2 horas (Figura 10),

logrando na formação do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol (5)(76,77).

Figura 10 – Reação de formação do composto LQFM181 (5)

Em seguida, a solução foi resfriada à temperatura ambiente e neutralizada

com uma solução de NaHCO3 10% extraída com três alíquotas de 30 mL de CH2Cl2.

A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e evaporada à pressão reduzida. O

produto obtido foi purificado em cromatografia de adsorção em coluna. Foi obtido um

rendimento de 19% (5) na forma de um sólido escuro com P.F.= 105 °C, Rf=0,76 (n-

hexano : AcOEt 70:30).

RMN de 1H (500,13 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 7,26 (2H, dd, J= 7,47 e 1,47 Hz; H-

10’ e 12’); 7,13 (2H, sl, H-2 e 6); 6,92 (2H, dd, J= 8,87 e 1,08 Hz; H-9’ e 13’); 6,85 (1H,

td, J= 7,05 e 0,65 Hz; H-11’); 5,15 (1H, sl; OH); 3,52 (2H, sl, H-1’); 3,23 (3H, sl; H-4’ e

6’); 2,63 (4H, sl, H-3’ e 7’); 1,44 (18H, s, H7 e 8)

RMN de 13C (HSQC/HMBC - 125,76 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 62,9 (C-1’); 52,72

(C-3’ e 7’); 48,7 (C-4’ e 6’); 126,1 (C-1); 125,9 (C-2 e 6); 135,3 (C-3 e 5); 152,9 (C-4);

30,5 (C-7 e 8); 34,9 (C-9 e10); 151,1 (C-8’); 115,7 (C-9’ e13’); 129,2 (C-10’ e 12’);

119,4 (C-11’).

IV máx. (KBr) cm-1: 3620 (υ O-H), 3055 (υ C-H de aromático), 1254 (υ C-N),

1134 (C-O).

20

3.4.2. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol

LQFM183 (6)

Em um balão de 50 mL foi adicionado, em banho de gelo 1,0 mmol da n-

piridinapiperazina (10), o catalizador formaldeído (CH2O) 0,9 mL e 2 mL de ácido

acético (AcOH). Em seguida, adicionou-se 1,0 mmol do 2,6-di-tert-butilfenol (8), o

meio reacional foi aquecido à temperatura de refluxo por cerca de 2 horas (Figura 11),

logrando na formação do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol

(6)(76,77).

Figura 11 – Reação de formação do composto LQFM183 (6)

Em seguida, a solução foi resfriada à temperatura ambiente e neutralizada

com uma solução de NaHCO3 10% extraída com três alíquotas de 30 mL de CH2Cl2.

A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e evaporada à pressão reduzida. O

produto obtido foi purificado em cromatografia de adsorção em coluna. Foi obtido um

rendimento de 85% (6), na forma de um sólido marrom com P.F.=103-104 °C, Rf=

0,38 (n-hexano : AcOEt 70:30).

RMN de 1H (500,13 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 8,18 (1H, ddd, J=6,98, 4,91 e 2,07

Hz; H-10’); 7,48 (1H, ddd, J= 7,84, 2,21 e 1,84 Hz; H-12’); 7,15 (2H, s, H-2 e 6); 6,64

(1H, dt, J= 8,60 e 0,76 Hz; H-11’); 6,62 (1H, dd, J= 5,96 e 3,70 Hz; H-13’); 5,20 (1H,

sl; OH); 3,62 (4H, sl; H-4’ e 6’); 2,65 (4H, sl; H-3’ e 7’); 1,44 (18H, s; H-7 e 8).

IV máx. (KBr) cm-1: 3614 (υ O-H), 2956 (υ C-H de aromático), 1247 (υ C-N),

1146 (C-O).

3.5. Drogas e Reagentes

21

Albumina de soro bovino (Sigma), cloreto de alumínio (sigma), 5:5-ditiobis-2-

nitrobenzoato – DTNB (sigma), acetiltiocolina (sigma), peróxido de hidrogênio - H2O2

(CRQ), ácido tricloroacético – TCA (Vetec), ácido tiobarbitúrico – TBA (TediaBrasil),

álcool n-butílico (Synth), glicina (Vetec), Fosfato monossódico - NaH2PO4 (Cromoline),

Fosfato dissódico - Na2HPO4 (Synth), coomassie brillant blue (Amresco).

3.6. Avaliação do Perfil Antioxidante in vitro

3.6.1. Determinação do Potencial Antioxidante pela técnica do DPPH

A atividade de eliminação de radicais de DPPH foi determinada conforme

descrito por Asaduzzaman et al. (2014)(59), com pequenas modificações: foram feitas

soluções dos compostos (5 e 6) em etanol PA em diferentes concentrações (3x10-3 a

3x103 M) e, como padrão, foi utilizado o BHT nas mesmas concentrações. Foi

adicionado solução de DPPH (0,3 mM) e as amostras foram incubadas à temperatura

ambiente, em local com ausência de iluminação, por 30 minutos. Após o término da

reação, a absorbância foi determinada em espectrofotômetro a 510 nm e foi calculada

a capacidade (%) dos compostos em inibirem o DPPH utilizando a fórmula:

(%) = (𝐴𝑏𝑠. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑠. 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜)

(𝐴𝑏𝑠. 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒) 𝑥 100

Onde:

Abs. branco= absorbância na ausência de DPPH

Abs. controle= absorbância na ausência dos compostos

Abs. amostra= absorbância na presença do DPPH e dos compostos

3.6.2. Quantificação da Peroxidação Lipídica

Os níveis de peroxidação lipídica de células de cérebro de ratos obtidos na

presença dos compostos foram determinados pelo método das substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Homogenatos do tecido foram incubados por 1 hora

em banho de gelo, em concentrações crescentes (10-5, 10-4 e 10-3 M) das substâncias

BHT (8), LQFM181 (5) e LQFM183 (6). A seguir, foram incubados por 30 minutos a

37 °C na presença de H2O2 (0,23 M). Após esse período, foi adicionado às amostras

o ácido tiobarbitúrico - TBA (10% p/v) em meio ácido (ácido tricloroacético – TCA -

0,67% p/v) e estas foram submetidas à nova incubação por 15 minutos a 100 ºC.

22

Transcorrido esse período e, após o resfriamento das amostras, foram adicionados

150 µL de n-butanol e em seguida foram homogeneizadas e centrifugadas (4000 rpm,

2 °C, 20 minutos). O sobrenadante obtido foi submetido à leitura em espectrofotômetro

a 535 nm. Os resultados foram expressos em nmol de MDA/mg de proteína(78,79,59).

3.7. Avaliação Farmacológica

3.7.1. Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos adultos pesando

aproximadamente 47 g, fornecidos pelo biotério central da UFG e mantidos em

condições controladas de temperatura (23 ± 2 ˚C) e iluminação (ciclo claro/escuro de

12 horas), com água e ração ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram

realizados seguindo os princípios de ética e cuidado com animais de laboratório e

aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de

Goiás (protocolo CEUA/UFG nº 053/16).

3.7.3 Avaliação do efeito protetor dos compostos sobre a neurotoxicidade

induzida pelo cloreto de alumínio

Camundongos foram divididos em 6 grupos (n=10 animais/grupo) tratados por

40 dias, 1 vez ao dia. Inicialmente os animais foram pré-tratados com veículo Tween

80 2,0%, 10 mL/kg, v.o. (Grupos 1 e 2), LQFM181 200 µmol/kg v.o. (Grupos 3 e 4), e

LQFM183 200 µmol/kg v.o. (Grupos 5 e 6). Uma hora após, os grupos 1, 3 e 5

receberam água destilada (10 mL/kg, v.o.) e os grupos 2, 4 e 6 cloreto de alumínio

(AlCl3) (750µmol/kg, v.o.)(80,44).

Transcorrido o período dos tratamentos, os animais foram submetidos aos

testes comportamentais (esquiva passiva, campo aberto e chaminé) e, em seguida,

eutanasiados por decapitação cervical, sendo dissecado o encéfalo e reservadas as

regiões do córtex e hipocampo para os testes de avaliação da atividade antioxidante

e da acetilcolinesterase.

3.8.1. Testes Comportamentais

23

3.8.1.1. Esquiva passiva (ou inibitória) step-down

O comportamento de esquiva passiva é baseado no reforço negativo e é

usado para avaliar as memórias de curta (MCD) e longa duração (MLD). O aparelho

consiste em uma caixa (30 x 20 x 20 cm) composta por três paredes de aço e uma de

acrílico, com uma base contendo duas plataformas: uma de 8,0 x 1,5 x 20 cm na

extremidade direita (plataforma de segurança), e a outra (22 x 20 cm) consistindo em

uma série de barras de aço inoxidável, separadas 1 cm em 1 cm, e conectadas a um

gerador. Durante o treinamento, cada camundongo foi colocado na plataforma de

segurança, registrando-se o período de latência para que ele colocasse as quatro

patas na grade, quando então foi aplicado um choque (0,4 mA: 5 s). Em seguida, o

animal foi removido do aparato. Nas sessões teste (retenção), os animais foram

novamente colocados na plataforma e o tempo de latência para a descida (em

segundos) foi registrado, não sendo, porém, submetidos ao choque. Para a avaliação

das MCD e MLD, os animais foram submetidos à sessão teste aos 90 min e 24 h após

a sessão treino, respectivamente(81,82,85).

3.8.1.2. Chaminé

Os animais foram introduzidos dentro de um tubo cilíndrico transparente (3 cm

de diâmetro e 30 cm de comprimento) e quando estes atingiram a extremidade oposta,

o tubo foi posicionado verticalmente em relação a bancada. Foi avaliado o tempo que

os animais levaram para se locomover em marcha ré até atingir uma linha previamente

demarcada, em um tempo máximo de 30 s(83,84).

3.8.1.3. Campo Aberto

Os animais foram colocados individualmente no centro do campo aberto

dividido em oito quadrantes de área igual e que formam três círculos concêntricos,

sendo que o campo possui diâmetro de 37 cm. A atividade exploratória foi observada

por 5 minutos e foi avaliado o número total de cruzamentos(85,86).

3.9. Dosagens Bioquímicas

24

3.9.1. Processamento dos tecidos

Após a avaliação comportamental, os animais foram eutanasiados e os

cérebros foram dissecados reservando-se o córtex e o hipocampo. Logo após, tais

estruturas encefálicas foram adicionadas em nitrogênio líquido para preservar sua

integridade até o processamento de todos os grupos. Em seguida, os tecidos foram

imersos em tampão fosfato (pH 7,4), na proporção de 1:5 (p/v) e homogeneizados em

homogeneizador (Homo mix). As amostras foram então centrifugadas a 4000 rpm por

20 mim a 4ºC, o sobrenadante foi separado e armazenado em freezer a -80ºC até a

realização das dosagens bioquímicas. As proteínas presentes nas amostras foram

dosadas pela metodologia proposta por BRADFORD (1976)(87), sendo utilizado como

padrão a albumina de soro bovino (BSA).

3.9.3. Determinação da Atividade da Colinesterase

A acetilcolinesterase (AChE) é uma proteína presente nas junções

neurosinápticas, responsável por catalisar a hidrólise da acetilcolina em acetato e

colina. A determinação da sua atividade foi realizada com a utilização do reagente de

ELLMAN (1969)(89). Essa metodologia constitui-se de uma avaliação colorimétrica da

taxa de produção de um ânion amarelo (5-tio-2-nitrobenzóico), que é formado

proporcionalmente à concentração de acetiltiocolina (ASCh), análogo da acetilcolina

(ACh), hidrolisada por esta enzima presente no tecido.

A AChE irá quebrar a molécula de ASCh em acetato e tiocolina. A tiocolina

reagirá com o reagente de ELLMAN (1969)(89), o 5:5-ditiobis-2-nitrobenzoato (DTNB),

resultando na produção do 5-tio-2-nitrobenzoato, formando um complexo de cor

amarela.

Para a realização do teste, homogenatos de córtex e hipocampo foram

suspendidos em tampão fosfato (pH 7,4), na proporção de 1:100. Logo após, foram

adicionados 1,8 µL de DTNB (75 mM) e 1,5 µL de ASCh (10 mM) a 200 µL do

suspendido. As leituras das absorbâncias foram detectadas no comprimento de onda

a 412nm durante um período de 10 min com leituras em intervalos de 1 min, utilizando

a fórmula abaixo. Dados foram expressos em nmoles de AChE/min/mg de proteínas.

𝑅 = 7,35𝑥10−4 × ∆𝐴/𝐶𝑜

Onde:

25

R = Velocidade em nmoles de substrato hidrolisado por minuto por miligrama de proteína.

ΔA= Variação da absorbância por minutos.

Co = Concentração de proteína (mg).

3.9.4. Determinação da Atividade da Catalase - CAT

Para determinar a atividade da CAT, foram adicionados a 191 µL de tampão

fosfato (pH 7,0), 2 µL da amostra (homogenato de córtex ou hipocampo), e 7µL de

H2O2 (0,3 M). A decomposição do H2O2 é diretamente proporcional à atividade

enzimática a qual é mensurada em espectrofotômetro em intervalos de 15 em 15 s,

por 2 min no comprimento de onda de 240 nm. Os resultados foram expressos em

mmol/mg de proteína(90), utilizando a seguinte fórmula:

[𝐶𝐴𝑇] = 𝑖𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑎 / 4,6𝑥107 × µ𝐿 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 × 𝐶𝑜

Onde:

(CAT) = Concentração de catalase em mmoles por miligrama de proteína.


3.9.5. Determinação da peroxidação lipídica (TBARS)

Os níveis de peroxidação lipídica nos homogenatos de córtex ou hipocampo

dos camundongos foram determinados pela metodologia do TBARS. Esse método

consiste na determinação dos níveis do malondialdeído (MDA), substância resultante

da lipoperoxidação dos ácidos graxos das membranas fosfolipídicas. Foram

adicionados 12,5 µL do homogenato dos tecidos a 25 µL de TBA 10% (p/v), 37,5 µL

de TCA (0,67% p/v) e 12,5 µL de H2O. A mistura foi aquecida a 100 °C por 15 minutos.

Após o resfriamento da solução, foram adicionados 75 µL de n-butanol, e as amostras

foram homogeneizadas e centrifugadas (4.000 rpm, 20 min a 4 °C). Posteriormente, a

fase superior foi reservada para leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda

de 535 nm. O resultado obtido foi expresso em nmol de MDA/mg de proteína(78,79),

utilizando o seguinte cálculo:

𝐶 = ∆𝐴 𝑥 38,43/𝐶𝑜

Onde:

ΔA = Absorbância.

C = Concentração de malondialdeído (MDA) em nmoles por miligrama de proteína.


3.9.6. Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase – SOD

A técnica é baseada na formação do adenocromo, proveniente da inibição da

26

reação do radical superóxido com a adrenalina. A SOD presente na amostra compete

pelo radical superóxido com o sistema de detecção. A atividade da SOD foi

determinada em tampão glicina – NaOH (pH 10,0) ao qual foram adicionados 1; 2,5 e

5 µL dos homogenatos de córtex ou hipocampo para um volume final de 100 µL. A

esta solução foram adicionados 1,7 µL de bitartarato de adrenalina (60 mM, pH 2,0)

procedendo-se a leitura em espectrofotômetro a 480 nm por 10 min e com leituras em

intervalos de 1 min. O resultado foi calculado utilizando-se a fórmula seguinte e

expresso em unidades de SOD por mg de proteínas(91).

[𝑆𝑂𝐷] =100

µ𝐿 1 𝑈 𝑆𝑂𝐷 × 𝐶𝑜

Onde:

(SOD) = Concentração de Unidade de SOD por miligrama de proteína.

1 U SOD = Uma unidade de SOD


3.10. Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM), com

exceção dos valores de CI50 que foram expressos como médias geométricas e

correspondentes limites de confiança. Os resultados foram submetidos à análise de

variância (ANOVA) de uma via, seguidos pelos pós-testes de Newman-Keuls ou de

Dunnett, para comparação entre 3 grupos ou mais. Para comparação entre dois

grupos foi utilizado o teste “t” de Student não pareado. As diferenças foram

consideradas significativas quando p < 0,05. A análise estatística foi realizada

utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, versão

5.0).

27

4. Resultados 4.1.Determinação do Potencial Antioxidante pelo método DPPH

Para avaliar a capacidade dos compostos em inibir a oxidação do DPPH,

foram construídas curvas de concentração (Log) x efeito (% de inibição) e

determinadas as concentrações que promovem a inibição em 50% da formação do

radical DPPH (CI50). Nestas condições, LQFM181 e LQFM183 inibiram a formação do

28

radical instável com valores de CI50 de 31,7 (27,9 - 35,9) e 4,8 (4,3 – 5,3) µmol/mL,

respectivamente. O composto padrão (BHT), inibiu a oxidação do DPPH com valor de

CI50 de 118,9 (94,6 – 149,3) µmol/mL. Comparativamente, LQFM183 foi 6,6 vezes

mais potente em relação ao composto LQFM181 em inibir a radical DPPH. Em relação

ao padrão BHT, LQFM181 e LQFM183 foram 3,75 e 24,8 vezes mais potentes em

inibirem a oxidação do radical DPPH (Figura 12).

L o g [S u b s tâ n c ia ] (M )

Inib

içã

o d

o D

PP

H (

%)

-6 -5 -4 -3 -2 -1

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

BH T

L Q F M 1 81

L Q F M 1 83

Figura 12 – Curva concentração-efeito (3x10-1 à 3x103 µg/mL) dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 sobre a inibição do radical DPPH (0,3 mM). Os símbolos representam as médias ± e.p.m. de três determinações em duplicata.

4.1.2. Quantificação das substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

Para avaliar a proteção promovida pelos compostos sobre a peroxidação

lipídica das membranas celulares neuronais promovida por um agente agressor

(H2O2), amostras de tecido cerebral de ratos foram incubadas com concentrações

crescentes (10-5, 10-4 e 10-3) de BHT, LQFM181 e LQFM183 e em seguida incubadas

novamente com o agente lesivo (H2O2 0,23 M).

A peroxidação lipídica das membranas celulares de cérebro total de ratos

(nmol MDA/mg de proteínas) foi reduzida pelo BHT nas concentrações 10-5 M

(0,002217 ± 0,00008258), 10-4 M (0,0005226 ± 0,0001261) e 10-3 M (0,006650 ±

0,0002721), quando comparada com o grupo que recebeu somente o agente lesivo

H2O2 (CL: 0,005532 ± 0,0002721 nmol MDA/mg de proteínas). Resultado semelhante

foi obtido com o composto LQFM183 (10-5 M: 0,005334 ± 0,0003776, 10-4 M: 0,002090

± 0,00009010, 10-3 M: 0,0006848 ± 0,00006497). Por sua vez, o composto LQFM181

29

foi capaz de reduzir os níveis de MDA nas concentrações de 10-4 M (0,0008290 ±

0,0004192) e 10-3 M (0,0005586 ± 0,00001802) (Figura 13).

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

Log concentração [M]

LQFM 181BHT

CN CL -5 -4 -3 -5 -4 -3 -5 -4 -3

LQFM 183

***

*

***

******

***

*

***

***

MD

A

(nm

ol/m

g d

e P

rote

ína)

Figura 13 – Níveis de MDA (nmol/mg de proteínas) obtidos pela metodologia TBARs em amostras de cérebro total de ratos na presença dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 (10-5, 10-4, 10-3 M). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM de três determinações em triplicata. *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao controle lesado (CL), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. CN= controle normal;

4.2. Tratamento crônico

4.2.1. Peso Corporal

Ao final do tratamento (40º dia), os grupos veículo, LQFM181 e LFQFM183,

mostraram ganho de peso corporal. Por sua vez, os grupos AlCl3, LQFM181+AlCl3 e

LQFM183+AlCl3 mostraram uma diminuição do ganho de peso dos animais (Tabela

1). A progressão semanal do peso corporal dos animais pode ser visualizada na Figura

14.

30

Tabela 1: Avaliação do ganho de peso corporal dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3 obtido pela diferença entre o peso final dos animais (Pf; determinado ao final dos tratamentos) e o peso inicial dos animais (Pi; determinado ao início dos tratamentos). Resultados são expressos como média ± EPM (n=9 a 10).

Veículo AlCl3 LQFM181 LQFM181 + AlCl3 LQFM183 LQFM183 + AlCl3

Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N

Ganho de Peso (Pf-Pi)

2,3 1,44 10 -1,9* 0,73 9 1,8 1,02 9 -1,9* 1,20 10 2,2 1,07 10 -2,4** 0,37 9

*p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo veículo utilizando teste “t” de Student.

0 1 2 3 4 5

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

V e íc u lo

A lC l3

L Q F M 1 8 1

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 8 3

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

S e m a n a s

Pe

so

(g

)

Figura 14 – Peso dos animais (em gramas) determinados semanalmente a partir do início (semana 0) até o final dos tratamentos

(semana 5) nos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. Cada linha representa um grupo

e cada símbolo a média ± EPM (n= 9 a 10) do peso corporal semanal do grupo.

31

4.2.3. Testes comportamentais

4.2.3.1. Esquiva passiva

As latências de retenção para o grupo veículo, nos testes treino, memória de

curta (MCD) e de longa duração (MLD) foram 3,693 ± 0,3485 s, 10,71 ± 0,5745 s e

10,37 ± 1,598 s, respectivamente, indicando a formação e a consolidação da memória

(Figura 15). Os animais que receberam somente o agente lesivo (AlCl3), não

apresentaram diferenças entre os testes (4,895 ± 1,062 s, 4,635 ± 1,045 s, 5,288 ±

1,072; respectivamente). O grupo LQFM181 aumentou significativamente os tempos

de latência na MCD (85,12 ± 6,967 s; p<0,001) e MLD (77,23 ± 14,44 s; <0,001)

quando comparados ao treino (5,14 ± 0,74 s); bem como o grupo que recebeu

LQFM183 na MCD (200,2 ± 46,04 s; p<0,001) e MLD (187 ± 41,03 s; p<0,001) quando

comparado ao treino (3,013 ± 0,3441). O pré-tratamento com LQFM181 (MCD:7,353

± 1,73 s, p<0,001; MLD: 14,7 ± 2,302 s, p<0,001) e LQFM183 (MCD: 7,22 ± 0,911 s,

p<0,05; MLD: 16,71 ± 1,87 s, p<0,001) foi capaz de proteger a perda de memória dos

animais, quando comparado a sessão treino (LQFM181: 2,861 ± 0,415; LQFM183:

4,261 ± 0,672).

0

1 0

2 0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

A lC l3

V e íc u lo L Q F M 1 81

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

T re in o M C D M L D

L Q F M 1 83

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

La

tên

cia

(s

)

* * *

* * *

* *

* * *

*

* * *

* * *

* * *

* * *

* * *

Figura 15 – Latência de retenção para o treino, memória de curta duração (MCD) e de longa duração (MLD) para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, quando comparado a sessão treino do mesmo grupo utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

32

No teste de avaliação da atividade locomotora (Figura 16), o número de

quadrantes percorridos foi medido por 5 min e não observou-se diferença significativa

entre os grupos veículo (120,9 ± 11,00), AlCl3 (113,7 ± 7,32), LQFM181 (123,9 ± 7,66),

LQFM181 + AlCl3 (115,0 ± 14,36; p=0,885), LQFM183 (105,8 ± 8,30) e LQFM181+

AlCl3 (118,0 ±7,93; p=0,659).

0

5 0

1 0 0

1 5 0

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

L Q F M 1 83

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 81

A lC l3

V e íc u lo

Cru

za

me

nto

s T

ota

is

Figura 16–Número total de cruzamentos no teste do campo aberto para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

O tempo de escalada (Figura 17) não foi diferente entre os animais que

receberam veículo (11,67 ± 1,43 s), AlCl3 (9,40 ± 0,67 s) e LQFM181 (9,50 ± 0,88 s).

Já os animais que receberam LQFM181 + AlCl3 (5,28 ± 0,71 s), LQFM183 (5,41 ± 0,88

s) e LQFM183 + AlCl3 (5,20 ± 0,48), foi observada uma redução significativa no tempo

de escalada quando comparado ao grupo veículo (p<0,001) e ao grupo AlCl3 (p<0,05).

0

5

10

15

***##

LQFM 181Veículo

AlCl3 LQFM 181 + AlCl3

LQFM 183

LQFM 183 + AlCl3

*** ***# #

Tem

po

de e

scala

da (

s)

Figura 17 – Tempo de escalada de camundongos submetidos ao teste chaminé para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3.

33

As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). ***p<0,001 quando comparado ao grupo Veículo e # p<0,05; ## p<0,01 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

4.3. Dosagens bioquímicas

4.3.1. Avaliação da Atividade da Acetilcolinesterase (AChE)

Em homogenatos de córtex, a atividade da AChE obtida para o grupo veículo

foi de 0,2639 ± 0,007535 nmol/min/mg de proteínas. Resultados semelhantes foram

obtidos para os grupos AlCl3 (0,268 ± 0,013; p<0,83) e LQFM181 + AlCl3 (0,292 ±

0,0089; p<0,087). Por sua vez, a atividade enzimática foi significativamente maior nos

grupos LQFM 181 (0,3203 ± 0,01150; p<0,05), LQFM 183 (0,3669 ± 0,01034; p<0,001)

e LQFM 183 + AlCl3 (0,3947 ± 0,04257; p<0,05) em relação ao grupo veículo (Figura

18 A).

Nas amostras de hipocampo, a atividade da AChE obtida para o grupo veículo

foi de 38,41 ± 1,523 nmol/min/mg de proteínas. A atividade da enzima mostrou-se

reduzida no grupo AlCl3 (33,24 ± 1,523), LQFM181 (33,31 ± 1,775) e LQFM181+ AlCl3

(32,05 ± 0,8669) quando comparada ao grupo veículo (p<0,05). Já os grupos

LQFM183 (23,51 ± 0,9577) e LQFM183+AlCl3 (21,71 ± 1,632) apresentaram redução

significativa da atividade da acetilcolinesterase quando comparada aos grupos

veículos e AlCl3 (p<0,01), respectivamente (Figura 18 B).

34

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

(A )

***# #

# # #

#

AC

hE

(nm

ole

s/m

in/m

g d

e P

ro

teín

a)

**A

Ch

E

(nm

ole

s/m

in/m

g d

e P

ro

teín

a)

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

(B )

* ***

*** ***

# # ## # #

V e íc u lo

A lC l3

L Q F M 1 81

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 83

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

Figura 18 - Atividade da AChE (nmol/min/mg de proteínas) determinada no córtex (A) e no hipocampo (B) de camundongos dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=5 a 7). *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 quando comparado ao grupo veículo. ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.

35

4.3.2. Dosagem das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS

Em amostras de córtex de camundongos, a concentração de MDA encontrada

para o grupo veículo foi de 0,0252 ± 0,001140 nmol/mg de proteínas. O grupo AlCl3

apresentou níveis de MDA significativamente maiores do que os do grupo veículo

(0,02740 ± 0,002727, p<0,05). Os grupos LQFM181 (0,019 ± 0,037) e

LQFM181+AlCl3 (0,022 ± 0,0031) não foram diferentes quando comparados ao grupo

AlCl3. Os níveis de MDA, no entanto, foram significativamente reduzidos tanto no

grupo LQFM183 (0,1853 ± 0,001859, p<0,01) como no LQFM 183+AlCl3 (0,01565 ±

0,001146, p<0,001) quando comparados ao grupo AlCl3, sendo que o grupo

LQFM183+AlCl3 também foi diferente ao veículo (p<0,05) (Figura 19 A).

Em amostras de hipocampo de camundongos, a concentração de MDA

encontrada para o grupo veículo foi de 0,047 ± 0,0044 nmol/mg de proteínas. O grupo

AlCl3 apresentou níveis de MDA semelhantes ao veículo (0,055 ± 0,0079, p>0,05). O

grupo LQFM181 (0,036 ± 0,0069) não foi diferente dos grupos veículo (p=0,31) e AlCl3

(p=0,12), respectivamente. O grupo LQFM181+AlCl3 (0,033 ± 0,0032) apresentou

concentração de MDA significativamente menor do que os grupos veículo e AlCl3

(p<0,05). Os grupos LQFM183 (0,033 ± 0,0039) e LQFM183+AlCl3 (0,036 ± 0,0028)

apresentaram níveis menores de MDA em relação ao grupo AlCl3 (p<0,05) (Figura 19

B).

36

0 .0 0

0 .0 2

0 .0 4

0 .0 6

0 .0 8(A )

*# #

*# # #

MD

A

(nm

ol/

mg

de

Pro

teín

a)

MD

A

(nm

ol/

mg

de

Pro

teín

a)

0 .0 0

0 .0 2

0 .0 4

0 .0 6

0 .0 8

*#

##

(B )

V e íc u lo

A lC l3

L Q F M 1 81

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 83

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

Figura 19– Níveis de malondialdeído (MDA; nmol/mg de proteínas) determinados no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4a 7). *p<0,05 quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.

4.3.3. Dosagem da atividade da CAT

37

A atividade da CAT (nmol/mg de proteínas) determinada para o grupo veículo

em amostras de córtex foi de 0,5029 ± 0,02639. Redução significativa dessa atividade

foi encontrada nos grupos AlCl3 (0,3690 ± ,03213, p<0,01), LQFM181 (0,3920 ±

0,03383, p<0,05), LQFM181+AlCl3 (0,3718 ± 0,01687, p<0,01), LQFM183 (0,2876 ±

0,01431, p<0,001) e LQFM183+AlCl3 (0,3180 ± 0,003558, p<0,001) (Figura 20 A).

No hipocampo a atividade da CAT foi significativamente reduzida no grupo

AlCl3 (0,09781 ± 0,01664) em relação ao grupo veículo (0,1761 ± 0,01057) (p<0,05).

Esses valores, no entanto, foram restabelecidos nos grupos LQFM181 (0,1662 ±

0,01926), LQFM181+AlCl3 (0,2114 ± 0,02204), LQFM183 (0,3315 ± 0,02783) e

LQFM183+AlCl3 (0,1734 ± 0,01354) (p<0,05) (Figura 20 B).

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6 (A )(A )

** ***

*** ***#

CA

T

(mm

ol/

mg

Pro

teín

a)

CA

T

(mm

ol/

mg

Pro

teín

a)

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6 (B )

*

***

#

# #

# # #

#

V e íc u lo

A L C l3

L Q F M 1 81

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 8 3

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

Figura 20–Valores obtidos na atividade da catalase (nmol/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4 a 6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo veículo, #p<0,05,##p<0,01 e ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.

38

4.3.4. Dosagem da atividade da SOD

A atividade da SOD (U/mg de proteínas) determinada para o grupo veículo

em amostras de córtex foi de 0,1050 ± 0,01129. Resultado semelhante foi obtido para

o grupo AlCl3 (0,073 ± 0,009) (p>0,11). No entanto, a atividade da SOD foi

significativamente aumentada nos grupos LQFM 181 (0,1718 ± 0,02427, p<0,05),

LQFM181+AlCl3 (0,1764 ± 0,01047, p<0,01), LQFM183 (0,2248 ± 0,04195, p<0,05) e

LQFM183+AlCl3 (0,4713 ± 0,1502, p<0,01) quando comparado ao grupo veículo.

(Figura 21 A).

No hipocampo, a atividade da SOD (U/mg de proteínas) foi significativamente

reduzida nos grupos LQFM181+AlCl3 (0,1839 ± 0,01584; p<0,05) e LQFM183 (0,1097

± 0,01949; p<0,01) em relação ao grupo veículo (0,3079 ± 0,03244). Os grupos

LQFM181 (0,223±0,048) e LQFM183+AlCl3 (0,265±0,042) não apresentaram

diferenças na atividade da SOD em relação ao veículo (p>0,05) (Figura 21 B).

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8(A )

* **

*

**

# # # #

#

# #

SO

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U/m

g p

ro

teín

a)

SO

D (

U/m

g p

ro

teín

a)

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8(B )

***

V e íc u lo

A lC l3

L Q F M 1 81

L Q F M 1 8 1 + A lC l3

L Q F M 1 83

L Q F M 1 8 3 + A lC l3

# #

# # #

39

Figura 21 - Valores obtidos na atividade da SOD (U/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=3 a 7). *p<0,05 e **p<0,01quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.

40

5.Discussão

41

Visando a obtenção de novos padrões moleculares e com perfil antioxidante

para o tratamento de doenças neurodegenerativas, foi realizado o planejamento, a

síntese e a caracterização dos compostos LQFM181 e LQFM183. Após confirmada a

obtenção dos compostos pelas metodologias de RMN e IV, buscou-se investigar se

estes apresentavam atividade antioxidante. Para tal, a primeira metodologia

empregada foi avaliar se os compostos eram capazes de inibir o radical DPPH,

utilizando como controle positivo o BHT, que é composto precursor das moléculas e

com atividade antioxidante(92). Posteriormente, utilizou-se do modelo que avaliou a

capacidade dos compostos em inibir a peroxidação lipídica de membranas celulares.

Nos dois testes, os compostos confirmaram a característica antioxidante. Esses

resultados serviram como base para dar continuidade aos demais testes delineados

para a pesquisa, ou seja, para os estudos em modelo experimental de

neurodegeneração que envolve o estresse oxidativo.

Anteriormente à avaliação dos efeitos dos compostos em modelo de

neurodegeneração, foram realizados testes para a triagem dos efeitos dos compostos

no SNC. Com o objetivo de diminuir o número de animais utilizados no estudo, foram

selecionadas doses para os compostos com base naquelas utilizadas em outro estudo

com derivado piperazínico de ação central, o LQFM008(93). Após o estabelecimento

das doses (100, 200 e 400 µmol/kg), foi realizado o teste geral de atividade no SNC

(resultados descritos no Apêndice 3). Os testes do campo aberto, chaminé e de sono

induzido por barbitúrico permitem indicar, por meio de alterações comportamentais

dos animais, se as substâncias atuam no SNC com características do tipo

estimulantes ou do tipo depressoras, além de avaliar a atividade motora e a

movimentação espontânea dos animais(94,95). A partir destes resultados e ainda com

o objetivo de otimizar os testes seguintes, minimizando a quantidade de animais e de

drogas e reagentes, foi selecionada a dose de 200 µmol/kg para o prosseguimento do

estudo, tendo em vista que esta dose apresentou efeitos nos experimentos realizados.

Uma vez estabelecido que os compostos apresentam perfil como

antioxidantes e que promovem efeitos centrais, procedeu-se ao desenvolvimento dos

testes com os compostos em modelo experimental que mimetiza alterações centrais

encontradas em indivíduos acometidos por DN, tais como a Doença de Alzheimer. O

modelo de neurotoxicidade induzida por AlCl3 foi utilizado, pois este metal é

conhecidamente uma neurotoxina capaz de prejudicar a atividade enzimática,

aumentar a geração de EROs, promover déficit cognitivo e a morte neuronal, entre

42

outros(61). Sabendo que o estresse oxidativo é um fator envolvido na gênese e

evolução de algumas das mais frequentes DN, tais como a DA(96); DP (24)e ELA(97), o

modelo de neurotoxicidade induzida pelo AlCl3 torna-se um teste experimental

indicativo para pesquisas que envolvem estresse oxidativo e DN(98).

O AlCl3 é descrito por promover redução na massa corporal em animais

submetidos ao contato crônico com o alumínio, possivelmente por causar redução na

ingestão de alimentos e água(99). Embora neste estudo não tenha sido avaliado o

consumo de ração e água dos animais, foi observada a redução do peso corporal dos

animais tratados com o AlCl3 ao final do período de tratamento, corroborando com

estudo anterior. Semelhantemente, os grupos LQFM181 + AlCl3 e LQFM183 + AlCl3

apresentaram redução de peso corporal ao 40º dia do tratamento, demonstrando que

os compostos não foram capazes de inibir a perda de peso promovida pelo AlCl3.

Diferentemente, porém, os grupos veículo, LQFM181 e LQFM183 mostraram ganho

de peso corporal ao final do tratamento mostrando que, isoladamente, os compostos

não são capazes de influenciar o peso dos animais. Este resultado também pode ser

indicativo que os compostos não apresentam toxicidade significativa ou que, pelo

menos, não interferem no peso dos animais. No entanto, a realização de estudos de

toxicidade que indicarão o perfil toxicológico dos mesmos.

Os resultados obtidos no teste da esquiva passiva mostraram que os animais

que receberam AlCl3 apresentaram comprometimento cognitivo, confirmando os

dados da literatura que mostram que o alumínio prejudica os processos de memória

e aprendizado(61,100,98). Por sua vez, o tratamento com LQFM181 e LQFM183 foi capaz

de inibir os efeitos prejudiciais promovidos pelo AlCl3, tanto na avaliação da MCD

quanto na MLD, ou seja, os animais foram capazes de evocar a memória, refletida em

um aumento da latência de descida da plataforma. Sendo assim, é possível sugerir

que os compostos atuam tanto no córtex como no hipocampo, uma vez que a

aquisição da informação (memória de curta duração) envolve a região cortical e a

consolidação da memória (memória de longa duração) envolve a região

hipocampal(70,75). O aumento dos tempos de latência, tanto na avaliação da MCD

como na MLD, promovida pelos compostos isoladamente, pode refletir a ação dessas

moléculas em outros sistemas que vão além dos propósitos do presente estudo. Por

sua vez, os testes que avaliaram o desempenho motor mostraram que LQFM181 e

LQFM183 não prejudica a atividade locomotora dos animais, descartando-se assim

resultado falso-positivo na avaliação dos testes de memória.

43

Um dos principais sistemas neurais envolvidos no processo de formação da

memória é o sistema colinérgico, o qual desempenha função neuromoduladora nos

processos de memória e aprendizado(71). O aumento na atividade da AChE pode

provocar deficiência colinérgica, por diminuir a disponibilidade de ACh no terminal

sináptico e, assim sendo, interferir nos processos cognitivos(101). Por esta razão, foi

avaliada a atividade colinesterásica, levando em consideração também o fato de que

o alumínio é capaz de interferir na atividade dessa enzima. Os resultados, no entanto,

mostraram que o AlCl3 não interferiu na atividade colinesterásica do córtex, enquanto

que no hipocampo LQFM183 mostrou efeito inibitório. Sabe-se que o alumínio exerce

efeito bifásico sobre a atividade da acetilcolinesterase, sendo descrito que baixas

concentrações teciduais promovem efeito inibitório e, em concentrações mais

elevadas, efeito estimulatório(102,103). Apesar da hipótese de que os efeitos

encontrados podem estar associados a diferentes concentrações do metal no córtex

e hipocampo, isso somente poderia ser confirmado com a realização das dosagens

teciduais. Por outro lado, outros modelos experimentais mais específicos para o

estudo do efeito dos compostos sobre o sistema colinérgico, como o teste de prejuízo

da memória promovido pela escopolamina, são indicados.

Por ser um agente ionizável, o alumínio em contato com os tecidos biológicos

é capaz de promover estresse oxidativo e, por consequência, a instabilidade das

membranas celulares devido à peroxidação dos ácidos graxos. Essas alterações

interferem na fluidez e na conformação estrutural, prejudicando a permeabilidade e as

funções celulares, ocasionando a morte celular(61,71,104,105). Como resultado da

lipoperoxidação das membranas, ocorre a formação de produtos como o MDA,

possibilitando assim mensurar o nível de peroxidação lipídica pela dosagem desse

agente. Desse modo, foi possível verificar que o AlCl3 aumentou a formação de MDA

no córtex, confirmando o estresse oxidativo promovido pelo alumínio nessa região

cerebral. O composto LQFM183 mostrou-se capaz de inibir o efeito prejudicial do

alumínio, corroborando com resultados iniciais deste estudo que indicaram ser este

composto capaz de inibir a peroxidação lipídica.

Além de poder inibir diretamente a ação radicalar que leva ao dano celular,

outra forma de inibir o estresse oxidativo é promover a ação das defesas

antioxidantes, como as enzimas catalase e superóxido dismutase(106). Nesse contexto,

os compostos inibiram o efeito prejudicial do AlCl3 sobre a catalase no hipocampo,

sem interferir na região cortical. Esse resultado sugere que os compostos teriam uma

44

ação benéfica preferencial sobre esta enzima no hipocampo. No entanto, essa

hipótese é meramente especulativa, sendo primordial a confirmação desses

resultados obtidos para, posteriormente, conduzir outros testes complementares,

como os de quantificação protéica tecidual da enzima. Por outro lado, de forma

contraditória, o efeito dos compostos parece ter favorecido a ação da SOD no córtex,

em detrimento ao hipocampo. Porém, como os resultados não permitiram identificar o

efeito prejudicial do alumínio sobre esta enzima, não se pode sugerir ou especular

qualquer explicação.

45

6. Conclusões

46

O composto LQFM181 foi obtido com rendimento de 19%, as estruturas foram

confirmadas pelas metodologias de RMN (1H e 13C) e IV. E LQFM183 com

rendimento de 85%, confirmado por RMN (1H) e IV.

No teste de esquiva passiva, os compostos LQFM181 e LQFM183 foram

capazes de aumentar a latência de descida da plataforma de segurança,

mostrando que esses compostos possuem atividade modulatória da memória

e do aprendizado, bem como protegeu dos danos provocados pelo AlCl3;

Ambos os compostos foram capazes de reduzir a atividade da enzima

acetilcolinesterase no hipocampo;

LQFM181 e LQFM183 favoreceram a atividade da enzima superóxido

dismutase (SOD) no córtex;

Os compostos LQFM181 e LQFM183 mostram efeito protetor, sob os efeitos

promovidos pelo AlCl3,na atividade da enzima catalase no hipocampo;

LQFM183 foi capaz proteger contra a peroxidação lipídica das membranas,

promovida pelo AlCl3, no córtex.

Em resumo, os compostos LQFM181 e LQFM183 são compostos derivados

piperazínicos inéditos que mostram atividade protetora sobre a neurotoxicidade

promovida pelo AlCl3, sugerindo-se o efeito benéfico dessas moléculas sobre o dano

tecidual promovido pelo estresse oxidativo em patologias como as doenças

neurodegenerativas.

47

7.Bibliografia

48

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56

8.Apêndice

57

8.1. APÊNDICE 1: Mecanismo da reação de Síntese dos compostos LQFM181 (5), LQFM183 (6). 8.1.1. MECANISMO 1: Rota da síntese dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6).

58

8.2. APÊNDICE 2: Espectros de infravermelho, de RMN 1H, HSQC e HMBC dos

compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6).

Espectro 1: Espectro de IV do Composto LQFM181 (5)

59

Espectro 2 – Espectro Ampliado de RMN 1H do Composto LQFM181 (5).

Espectro 3 – Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM181 (5)

60

Espectro 4– Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HSQC.

Espectro 5 - Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HMBC.

61

Espectro 6: Espectro de IV do Composto LQFM183 (6)

62

Espectro 7: Espectro ampliado de RMN 1H do Composto LQFM183 (6)

Espectro 8: Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM183 (6)

63

8.3. APÊNDICE 3: Testes Complementares 8.3.1. Metodologia 8.3.1.2. Teste do Campo Aberto

Os animais foram tratados (n=8, por grupo) com veículo (Tween 80 2%, 10

mL/kg, v.o.), LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 ou 400 µmol/kg v.o. Após

sessenta minutos da administração, foram colocados individualmente no centro do

campo aberto dividido em oito quadrados de área igual e que formam três círculos

concêntricos, sendo que o campo possui diâmetro de 37 cm. A atividade exploratória

foi observada por 5 minutos e foram avaliados o número de cruzamentos totais,

levantadas e tempo de imobilidade. Além disse também foram considerados o tempo

despendido e o número de cruzamentos no centro do campo como parâmetro de

ansiedade, bem como autolimpeza e bolos fecais(85,86).

8.3.1.3. Chaminé

Os animais foram introduzidos dentro de um tubo cilíndrico transparente (3 cm

de diâmetro e 30 cm de comprimento). Quando estes atingiram a extremidade oposta

de onde foram introduzidos, o tubo era então posicionado verticalmente em relação a

bancada. Foi avaliada a capacidade destes de se locomover em marcha-ré até atingir

uma linha previamente demarcada, num tempo máximo de 30 s. Este teste tem como

finalidade estimar se existe ou não um comprometimento motor, resultante da

administração dos compostos, e que poderiam influenciar nos resultados(83,84).

8.3.1.4. Teste do Sono Induzido por Pentobarbital Sódico

Os animais foram pré-tratados com veículo (Tween 80 2,0%, 10 mL/kg, v.o.),

LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 ou 400 µmol/kg v.o. Após o intervalo de

sessenta minutos, foi administrado pentobarbital sódico 200 µmol/kg i.p., e foi

contabilizado o tempo entre a administração e a perda do reflexo postural e

considerado como o tempo de latência ao sono barbitúrico (s), e o tempo entre a perda

e a recuperação do reflexo postural foi avaliado como o tempo de duração do sono

barbitúrico (min). Após o termino da execução dos testes os animais foram

eutanasiados segundo protocolos previamente estabelecidos no laboratório(107).

8.3.1.5. Índice de Lesão Gástrica

Para determinação do índice de lesão gástrica, foi adaptada a tabela (Anexo

A)proposta por Macaúbas et al. (1988)(108). Onde é avaliado a coloração do tecido, se

houve ou não perda de pregas, são contabilizados o número de petequeias. Para a

64

presença de edemas, hemorragias e muco, é pontuado de acordo com a intensidade

da presença desses parâmetros, onde 1 é atribuído para leve, 2 para moderado e 3

para intenso. Posteriormente é feita a contagem de áreas ulceradas, se a lesão for de

até 1mm esse valor é multiplicado por 2 pontos, se a lesão for maior que 1 mm o

número é multiplicado por 3 pontos, e se a lesão estiver perfurada esse valor é

multiplicado por 4 pontos, soma-se então esses pontos atribuídos obtendo-se o índice

de lesão(108).

8.3.2. Resultados 8.3.2.1. Teste Do Campo Aberto

No teste do campo aberto, somente na dose de 400 µmol/kg de LQFM181

aumentou o número de bolos fecais (p<0,05) quando comparado ao grupo controle

(veículo), nas doses de 200 e 400 µmol/kg de LQFM183 aumentou o número de

autolimpeza (p<0,05), e as doses de 100 (p<0,01) e 400 (p<0,05) µmol/kg de

LQFM183 diminuiu o número de levantadas. Já o tempo de imobilidade foram

aumentados quando tratados com LQFM181 nas doses de 100 (p<0,05) e 200

(p<0,01) µmol/kg e diminuídos quando tratados com LQFM183 na dose de 100

(p<0,01) µmol/kg. Nos cruzamentos totais somente as doses de 200 (p<0,05) e 400

(p<0,001) µmol/kg de LQFM183 diminuiu o número de cruzamentos totais (Tabela 2).

Ambos os compostos diminuíram o tempo de permanecia no centro LQFM181 nas

doses de 100 e 400 µmol/kg e LQFM 183 nas doses de 200 e 400 µmol/kg (p<0,05).

65

Tabela 2: Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto

Teste do Campo Aberto

Veículo LQFM 181 LQFM 183

10 mL/kg 100 µmol/kg 200 µmol/kg 400 µmol/kg 100 µmol/kg 200 µmol/kg 400 µmol/kg

Bolos Fecais (nº) 1,75±0,31 1,60±0,24 2,00±0,45 3,40±0,81* 0,83±0,31 2,40±0,40 0,86±0,26

Auto Limpeza (nº) 0,78±0,28 1,33±0,21 0,86±0,14 1,40±0,24 1,60±0,40 1,67±0,21* 1,86±0,34*

Levantadas (nº) 70,43±2,03 74,50±3,75 62,50±4,35 74,00±4,49 53,60±2,54** 64,20±5,70 59,33±1,12*

Imobilidade (s) 11,50±1,26 18,83±2,41* 25,60±4,20** 19,75±7,55 6,40±0,75** 9,17±2,76 18,00±3,59

Cruzamentos Totais 118,50±4,31 113,00±3,94 117,80±9,14 128,00±7,80 109,40±3,06 98,75±6,22* 84,5±4,06***

Tempo no Centro 86,83±2,414 66,00±3,291* 71,88±7,539 76,80±2,653* 101,3±7,465 65,75±4,956* 72,00±6,137*

Resultados expressos como média ± EPM (n=5 e 7); *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo)

utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

66

8.3.2.2. Teste Da Chaminé

No teste da Chaminé (Figura 22), foi analisado a mobilidade dos animais

tratados com LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 e 400 µmol/kg, aferindo o

tempo que ele despende para escalar de ré a chaminé e não houve diferença

significativa entre os grupos, 8,167 ± 0,4014 (Controle), 7,667 ± 0,8028, 6,833 ±

0,8333, 7,250 ± 0,8539 (LQFM181), 10,20 ± 2,177, 8,833 ± 0,9098, 8,750 ±

1,601(LQFM183).

0

5

10

15

Tween 80 2% LQFM 181 LQFM 183

100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg 100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg

Ch

am

iné (

s)

Figura 22–Desempenho dos animais no teste da chaminé, medido em latência de escalada (s). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 6). Não apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

8.3.2.3. Teste Do Sono Induzido Por Pentobarbital Sódico Nos animais que receberam LQFM181, somente na dose de 200 alterou a

latência ao sono de quando comparado ao controle (170,7 ± 5,379 s;187,2 ± 2,956 s,

p<0,05), e quanto a duração, aumentou de forma dose dependente de (52,50 ± 3,149

(Controle); 61,43 ± 3,176; 66,67 ± 2,431, p<0,05 e 80,50 ± 4,291, p<0,001). Já animais

que receberam LQFM183houve um aumento na latência ao sono na menor dosee

diminuição dose dependente nas demais concentrações(170,7 ± 5,379 s (Controle);

190,3 ± 5,232 s, p<0,05; 179,3 ± 3,650 s e 156,6 ± 3,027 s, p<0,05 respectivamente),

além de aumentar a duração do sono também de forma dose dependente de (52,50 ±

3,149 (Controle); 64,00 ± 2,483, p<0,05; 75,00 ± 3,488, p<0,001 e 85,40 ± 3,723

p<0,001) (Figura 23, A e B).

67

0

50

100

150

200

250


* *

*

(A)


So

no

Latê

ncia

(s)

0

20

40

60

80

100


***

* *

***

***


(B)

Du

ração

do

So

no

(m

in)

Figura 23 - Latência ao sono barbitúrico, em segundos (A), e duração do sono, em min (B). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

8.3.2.4. Índice de Lesão gástrica

Quando comparado ao grupo que recebeu somente Veículo (8,333 ± 1,022),

os animais que receberam o tratamento semente de AlCl3 (12,17 ± 1,006, p<0,01)

observamos um aumento o índice de lesão da mucosa gástrica, e os animais que

receberam somente LQFM183 reduziram mostraram uma redução desse índice

(5,167 ± 0,4773, p<0,05). Quando os animais foram pré-tratados com LQFM181(9,0

± 0,730, p<0,05) e LQFM183 (9,33 ± 0,42, p< 0,05), e foram posteriormente tratados

com AlCl3 (12,17 ± 1,006), pode-se observar uma redução do índice de lesão da

mucosa gástrica desses animais quando comparamos com os animais que receberam

somente o AlCl3 (Figura 24).

68

0

5

10

15**

# #

Veículo

AlCl3LQFM 181

LQFM 181 + AlCl3LQFM 183

LQFM183 + AlCl3

*

Índ

ice

de

le

sã

o

Figura 24 – Índice de lesões gástricas em camundongos. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo Veículo (Tween 80 2%) e #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.

69

9.Anexos

70

ANEXO A – Tabela do índice de lesões gástricas propostas por macaúbas(108).

universidade federal de goiás instituto de ão_ · pdf fileprograma de...

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