UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DE NOVOS CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS EM MODELOS EXPERIMENTAL DE
NEUROTOXICIDADE
HIASMIN FRANCIELY DA SILVA NERI
Goiânia 2017
ii
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DE NOVOS CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS EM MODELOS EXPERIMENTAL DE
NEUROTOXICIDADE
HIASMIN FRANCIELY DA SILVA NERI
Goiânia 2017
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção do título de mestres em Ciências Biológicas. Área de concentração: Farmacologia e Fisiologia
Orientador: Prof. Dr. Paulo César Ghedini Co-Orientador: Prof. Dr. Ricardo Menegatti
ii
HIASMIN FRANCIELY DA SILVA NERI
AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DE NOVOS CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS EM MODELOS EXPERIMENTAL DE
NEUROTOXICIDADE
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Paulo César Ghedini Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________
Prof. Dr. Elson Alves Costa Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________
Profa. Dra. Adriane da Silveira Gomes Instituto federal Goiano / Campus Ipora
Aprovada em: ____/____/________
iii
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais Ailton e Maria Alice, e a minha irmã Hiorrana, pessoas que me dão o suporte necessário para continuar a estudar. E gostaria de agradecê-los pela compreensão, incentivo e amor que sempre me dedicam.
iv
Agradecimentos
Aos meus pais, Ailton e Maria Alice, e irmã Hiorrana por todo carinho, apoio.
Obrigada por sempre estarem disponíveis para me aconselhar ou
simplesmente ouvir meus problemas.
A minha avó Zadi, aos meus tios e primos pelo carinho e pela motivação.
Ao meu Namorado Luís Fernando pela amizade, companheirismo e por fazer
meus dias mais felizes.
A Adriane pelo incentivo, e por abrir as portas da ciência.
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo César Ghedini, pelo exemplo, de ética e
paciência. Muito obrigada pela confiança e pelos ensinamentos.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Ricardo Menegatti, pela confiança e incentivo.
Ao Prof. Dr. Elson Alves Costas pelos ensinamentos e incentivos.
Aos meus amigos e colegas do LQFM e do LFPN/UFG, pelo convívio durante
a realização deste trabalho, e por me acolherem calorosamente durante o decorrer do
mestrado, além da amizade.
Aos amigos e colegas do LFBM/UFG, que além da amizade, incentivo, apoio,
companheirismo e “diversão”, foram meu suporte durante esse percurso. Em especial
ao Hericles, Thiago, Christielly, Rodrigo, Lis e Guilherme.
Á todos aqueles, que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho.
v
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas
lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que
deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era
antes”. (Marthin Luther King)
SUMÁRIO
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xii
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ xiii
LISTA DE ESPECTROS .......................................................................................... xiv
RESUMO................................................................................................................... xv
ABSTRACT .............................................................................................................. xvi
1.Introdução ................................................................................................................ 1
1.1. Mercado Farmacêutico Global ............................................................................. 2
1.2. Doenças Neurodegenerativas .............................................................................. 4
1.3 Estresse oxidativo ................................................................................................. 6
1.3.1. Radicais Livres ................................................................................................. 7
1.3.2. Defesas Antioxidantes ....................................................................................... 8
1.4. Alumínio e Doenças Neurodegenerativas ............................................................ 9
2. Objetivos ............................................................................................................... 13
2.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 14
2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 14
3. Material e Método .................................................................................................. 15
3.1. Planejamento Estrutural dos Compostos (5 e 6) ................................................ 16
3.2. Elucidação estrutural .......................................................................................... 17
3.3. Análise Retrossintética ....................................................................................... 17
3.4. Metodologia Sintética ......................................................................................... 18
3.4.1. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol LQFM181 (5) .. 19
3.4.2. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol LQFM183 (6) .............................................................................................................................. 20
3.5. Drogas e Reagentes .......................................................................................... 20
3.6. Avaliação do Perfil Antioxidante in vitro ............................................................. 21
3.6.1. Determinação do Potencial Antioxidante pela técnica do DPPH ..................... 21
3.6.2. Quantificação da Peroxidação Lipídica ........................................................... 21
3.7. Avaliação Farmacológica ................................................................................... 22
3.7.1. Animais ............................................................................................................ 22
3.7.3 Avaliação do efeito protetor dos compostos sobre a neurotoxicidade induzida pelo cloreto de alumínio ............................................................................................ 22
3.8.1. Testes Comportamentais ................................................................................ 22
3.8.1.1. Esquiva passiva (ou inibitória) step-down .................................................... 23
3.8.1.2. Chaminé ....................................................................................................... 23
vii
3.8.1.3. Campo Aberto .............................................................................................. 23
3.9. Dosagens Bioquímicas ....................................................................................... 23
3.9.1. Processamento dos tecidos ............................................................................ 24
3.9.3. Determinação da Atividade da Colinesterase .................................................. 24
3.9.4. Determinação da Atividade da Catalase - CAT ............................................... 25
3.9.5. Determinação da peroxidação lipídica (TBARS) ............................................. 25
3.9.6. Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase – SOD ........................ 25
3.10. Análise Estatística ............................................................................................ 26
4. Resultados ............................................................................................................ 27
4.1.Determinação do Potencial Antioxidante pelo método DPPH ............................. 27
4.1.2. Quantificação das substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) ...... 28
4.2. Tratamento crônico ............................................................................................ 29
4.2.1. Peso Corporal ................................................................................................. 29
4.2.3. Testes comportamentais ................................................................................. 31
4.2.3.1. Esquiva passiva ........................................................................................... 31
4.3. Dosagens bioquímicas ....................................................................................... 33
4.3.1. Avaliação da Atividade da Acetilcolinesterase (AChE) .................................... 33
4.3.2. Dosagem das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS ................... 35
4.3.3. Dosagem da atividade da CAT ........................................................................ 36
4.3.4. Dosagem da atividade da SOD ....................................................................... 38
5.Discussão ............................................................................................................... 40
6. Conclusões ............................................................................................................ 45
7.Bibliografia .............................................................................................................. 47
8.Apêndice ................................................................................................................ 56
8.1. APÊNDICE 1: Mecanismo da reação de Síntese dos compostos LQFM181 (5), LQFM183 (6). ............................................................................................................ 57
8.1.1. MECANISMO 1: Rota da síntese dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6). .................................................................................................................................. 57
8.2. APÊNDICE 2: Espectros de infravermelho, de RMN 1H, HSQC e HMBC dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6). ................................................................ 58
8.3. APÊNDICE 3: Testes Complementares ............................................................. 63
8.3.1.2. Teste do Campo Aberto ............................................................................... 63
8.3.1.3. Chaminé ....................................................................................................... 63
8.3.1.4. Teste do Sono Induzido por Pentobarbital Sódico ....................................... 63
8.3.1.5. Índice de Lesão Gástrica .............................................................................. 63
8.3.2. Resultados ...................................................................................................... 64
viii
8.3.2.1. Teste Do Campo Aberto ............................................................................... 64
8.3.2.2. Teste Da Chaminé........................................................................................ 66
8.3.2.3. Teste Do Sono Induzido Por Pentobarbital Sódico ...................................... 66
8.3.2.4. Índice de Lesão gástrica ............................................................................... 67
9.Anexos ................................................................................................................... 69
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus Celsius
µL Microlitro
µmol Micromol
Abs. Absorbância
ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
AcOEt Acetato de Etila
AcOH Ácido Acético
ANOVA Análise de Variância
ASCh Acetiltiocolina
ATP Adenosina Trifosfato
BHT ButilHidroxitolueno
BSA Albumina de Soro Bovino (do inglês "bovine serum albumin")
CAT Enzima Catalse
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
cm Centímetros
D2 Receptor de Dopamina do tipo 2
D3 Receptor de Dopamina do tipo 3
DA Doença de Alzheimer
dd Duplo dubleto
ddd Duplo duplo dubleto
DM Distrofia Muscular
DN Doenças Neurodegenerativas
DP Doença de Parkinson
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
DTNB 5:5-ditiobis-2-nitrobenzoato
ELA Esclerose Lateral Amiotrófica
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
EUA Estados Unidos da América
g Gramas
GPx Glutationa Peroxidase
GSH Glutationa
GSSG Glutationa Oxidada
HMBC Do inglês “Heteronuclear Multiple Bond Correlation”
x
HN Doença de Huntington
HSQC Do inglês “Heteronuclear Single Quantum Coherence”
IV Infravermelho
kg Quilogramas
L Litro
LQFM Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal
LQFM181 Código do composto
LQFM183 Código do composto
LRMN Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear
M Molaridade
mA Miliamperes
MDA Malondialdeído
mg Miligramas
MHz Megahertz
min Minutos
mL Mililitros
mM Milimolar
mmol Milimol
NADP+
fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida, do inglês “Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate”
NADPH NADP+ reduzida
NIMH “National Institute of Mental Health”
nmol Nanomol
OMS Organização Mundial da Saúde
p/v Peso por Volume
PA Pró-analise, e indica que o reagente tem grau de pureza suficientemente alto para uso em análise química
PF Ponto de Fusão
pH - log [H+]
PHRMA “Pharmaceutical Research and Manufacturers of America”
R Velocidade em nmoles de ASCh hidrolizado por minuto por miligrama de proteína
Rf CCD retention factor
RMN Ressonância Magnética Nuclear
rpm Rotações por minuto
S Segundos
SNC Sistema Nervoso Central
SOD Enzima Superóxido Dismutase
TAU Proteína que estabilizam os microtúbulos
TBA Ácido Tiobarbitúrico
xi
TBARS
Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (do inglês "Thiobarbituric acid reactive substances")
TCA Ácido Tricloroacético
TMS Tetrametilsilano
UV Ultravioleta
v.o. Via de administração oral (Gavage)
α-2 Receptores do tipo alfa 2
Δ Temperatura de refluxo
ΔA Variação da Absorbância
xii
LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2007-2014, adaptado de Global 2015(2). ........................................................................................ 2 Figura 2 – Padrões moleculares da pregabalina, aripiprazol e acetato de glatirâmer. .................................................................................................................................... 3 Figura 3 – Números de fármacos em testes clínicos para o tratamento de diferentes transtornos neurológicos ............................................................................................. 4 Figura 4 – Alterações conformacionais de proteínas que podem levar à neurotoxicidade. Adaptado de RANG et al., 2007(15). .................................................. 5 Figura 5 – Reações de formação de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria. . 7 Figura 6 – Sistemas de defesa antioxidante do tipo enzimático(27). ............................ 8 Figura 7 – Alterações nas funções metabólicas promovidas pelo alumínio no sistema biológico. Adaptado de KAWAHARA & KATO-NEGISHI, 2011(61). ........................... 11 Figura 8 – Padrão molecular do piribendil utilizado como precursor dos compostos (5 e 6) ............................................................................................................................ 16 Figura 9 – Análise Retrossintética da reação de formação dos compostos (5 e 6) .. 18 Figura 10 – Reação de formação do composto LQFM181 (5).................................. 19 Figura 11 – Reação de formação do composto LQFM183 (6).................................. 20 Figura 12 – Curva concentração-efeito (3x10-1 à 3x103 µg/mL) dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 sobre a inibição do radical DPPH (0,3 mM). Os símbolos representam as médias ± e.p.m. de três determinações. .......................................... 28 Figura 13 – Níveis de MDA (nmol/mg de proteínas) obtidos pela metodologia TBARs em amostras de cérebro total de ratos na presença dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 (10-5, 10-4, 10-3 M). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM de três determinações em triplicata. *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao controle lesado (CL), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. CN= controle normal; ......................................................................................................... 29 Figura 14 – Variações do peso dos animais (em gramas) determinados semanalmente a partir do início (semana 0) até o final dos tratamentos (semana 5) nos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. Cada linha representa um grupo e cada símbolo a média ± EPM (n= 9 a 10) do peso corporal semanal do grupo. ....................................................................................... 30 Figura 15 – Latência de retenção para o treino, memória de curta duração (MCD) e de longa duração (MLD) para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, quando comparado a sessão treino do mesmo grupo utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................................................................................................. 31 Figura 16 - Números de cruzamentos totais no teste do campo aberto para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................................. 32 Figura 17 – Tempo de escalada de camundongos submetidos ao teste chaminé para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). ***p<0,001 quando comparado ao grupo Veículo e # p<0,05; ## p<0,01 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ... 32 Figura 18 - Atividade da AChE (nmol/min/mg de proteínas) determinada no córtex (A) e no hipocampo (B) de camundongos dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181,
xiii
LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=5 a 7). *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 quando comparado ao grupo veículo. ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. ................................................................ 34 Figura 19 – Níveis de malondialdeído (MDA; nmol/mg de proteínas) determinados no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 4 a 7). *p<0,05 quando comparado ao grupo Veículo. #p<0,05 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. .... 36 Figura 20 – Valores obtidos na atividade da catalase (nmol/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4 a 6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo veículo; #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. .............................................................................. 37 Figura 21 - Valores obtidos na atividade da SOD (U/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=3 a 7). *p<0,05 e **p<0,01quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. ................................................................................................................ 39 Figura 22 – Desempenho dos animais no teste da chaminé, medido em latência de escalada (s). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 6). Não apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ....................... 66 Figura 23 - Latência ao sono barbitúrico, em segundos (A), e duração do sono, em min (B). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. .................................................... 67 Figura 24 – Índice de lesões gástricas em camundongos. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo Veículo (Tween 80 2%) e #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls. ............. 68
LISTA DE TABELAS
xiv
Tabela 1: Avaliação do ganho de peso corporal dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3 obtido pela diferença entre o peso final dos animais (Pf; determinado ao final dos tratamentos) e o peso inicial dos animais (Pi; determinado ao início dos tratamentos). Resultados são expressos como média ± EPM (n=9 a 10). .......................................................................................... 30 Tabela 2: Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto .... 65
LISTA DE ESPECTROS Espectro 1: Espectro de IV do Composto LQFM181 (5) .......................................... 58
xv
Espectro 2 – Espectro Ampliado de RMN 1H do Composto LQFM181 (5). .............. 59 Espectro 3 – Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM181 (5) ............. 59 Espectro 4 – Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HSQC. ....................................................................................................................... 60 Espectro 5 - Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HMBC. ....................................................................................................................... 60 Espectro 6: Espectro de IV do Composto LQFM183 (6) .......................................... 61 Espectro 7: Espectro ampliado de RMN 1H do Composto LQFM183 (6) ................. 62 Espectro 8: Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM183 (6) ............... 62
RESUMO
As doenças neurodegenerativas (DN) estão entre as principais causas de
mortalidade e incapacidade na população senil, sendo descritas mais de 600 tipos
xvi
com manifestações clínicas e patológicas distintas. Entre as causas envolvidas no
acometimento das DN está o estresse oxidativo, que leva à desestruturação das
membranas neuronais e, consequentemente, à morte celular. Um dos modelos
experimentais associados ao estresse oxidativo e que mimetiza as alterações
celulares que ocorrem nas DN, tais como a Doença de Alzheimer, é o da
neurotoxicidade induzida pelo cloreto de alumínio (AlCl3). Considerando o
envelhecimento populacional e, com isso, o aumento na incidência das DN, há a
necessidade eminente pela pesquisa de novos fármacos eficazes no tratamento
dessas doenças. Este estudo teve como objetivos planejar e sintetizar os compostos
LQFM181(5) e LQFM183 (6) com propriedades antioxidantes e avaliar o efeito protetor
dos mesmos em modelo de neurotoxicidade induzida por AlCl3 em camundongos. A
etapa do planejamento ocorreu pela metodologia de simplificação molecular, partindo
da substância com atividade central conhecida (piribendil), onde houve a contração
da subunidade benzodioxol pela subunidade com atividade antioxidante
butilhidrotolueno (BHT). Todas as sínteses dos compostos foram confirmadas pelas
metodologias de infravermelho (IV) e de ressonância magnética nuclear (RMN). As
atividades antioxidantes dos compostos foram comprovadas pelos testes in vitro que
avaliaram a capacidade dos compostos em reduzir o radical DPPH, e também na
inibição de formação do malondialdeído (MDA), produto da peroxidação lipídica das
membranas celulares. Posteriormente, foi avaliado o efeito dessas moléculas sobre
processos mnemônicos, utilizando o teste de esquiva passiva. Os animais foram
tratados por 40 dias com veículo (Tween 80 2%, 10 mL/kg, v.o.), LQFM181 e
LQFM183 (200 µmol/kg, v.o.) e AlCl3 (750 µmol/kg, v.o.), sendo que ambos os
compostos foram capazes de reduzir os efeitos deletérios promovidos pelo AlCl3 na
memória de curta duração (MCD) e na memória de longa duração (MLD), sugerindo
a ação dos compostos nas regiões do córtex e hipocampo, respectivamente. Não foi
observado alterações na atividade locomotora dos animais com a administração dos
compostos nos testes da chaminé e do campo aberto. Após a realização dos testes
comportamentais, os animais foram eutanasiados, o encéfalo dissecado e separados
o córtex e hipocampo para a realização da avaliação da lipoperoxidação lipídica das
membranas neuronais, assim como para as dosagens da atividade das enzimas
colinesterase, catalase e superóxido dismutase. Os resultados mostraram efeito
inibitório dos compostos sobre a colinesterase no hipocampo, reestabelecimento das
atividades da enzima catalase no hipocampo e da enzima superóxido dismutase
(SOD) no córtex de camundongos. Os compostos também promoveram a diminuição
dos níveis de peroxidação lipídica das membranas neuronais. Sendo assim, LQFM181
e LQFM183 possuem atividade protetora sobre a neurotoxicidade promovida pelo
AlCl3, sugerindo-se o efeito benéfico dessas moléculas sobre o dano tecidual em
patologias que envolvem o estresse oxidativo, tais como as doenças
neurodegenerativas.
ABSTRACT
Neurodegenerative diseases (NDs) are one of the main causes of mortality and disability in elder population, being described more than 600 types of ND with
xvii
distinct clinical and pathological manifestations. Among the causes involved in the onset of NDs is the oxidative stress, that promotes structural damage of neuronal membranes and, consequently, cell death. One of the experimental models associated with oxidative stress for studies that resemble the cellular damage present in the NDs, such as Alzheimer's disease, is the model of neurotoxicity induced by aluminum chloride (AlCl3). Considering the aging population and, therefore, the increase in the incidence of NDs, it is necessary more research for discovery of new effective drugs to treatment of these diseases. This study aimed to design and synthesize the LQFM181 (5) LQFM183 (6) compounds with antioxidant properties evaluating the protective effect of them in the model of neurotoxicity induced by AlCl3 in mice. The planning stage was performed using the molecular simplification methodology, based in a molecule with central activity (piribendil), where it was contracted the benzodioxole subunit with the 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) antioxidant subunit. All syntheses of the compounds were confirmed by infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR) methods. The antioxidant activity of the compounds were confirmed by DPPH, inhibition of malondialdehyde (MDA) formation and inhibition of brain cells lipid peroxidation tests. Subsequently, the effects of these molecules on mnemonic processes were evaluated using the passive avoidance test. The animals were treated for 40 days with either vehicle (Tween 80 2%, 10 ml / kg, po), LQFM181 and LQFM183 (200 µmol / kg, po) and AlCl3 (750 µmol / kg, po). The LQFM 181 and 183 were able to reduce the deleterious effects promoted by AlCl3 in the short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), suggesting the action of these compounds in the regions of cortex and hippocampus brain regions, respectively. The locomotor activity of animals was not influenced by administration of the compounds, evaluated by the chimney test and open field tests. In the next step of the study, the animals were sacrificed and the cortex and hippocampus were isolated with the aim to determine the lipid peroxidation levels of neuronal membranes and for evaluation of cholinesterase, catalase and superoxide dismutase enzymes. The results obtained showed the inhibitory effect of the compounds on the cholinesterasic activity in the hippocampus, reestablishment of the catalase activity in the hippocampus and of the superoxide dismutase (SOD) activity in cortex of the mice receiving AlCl3 750 µmol/kg. The compounds also promoted the reduction of lipid peroxidation levels of neuronal and membranes in both hippocampus and cortex brain regions. In conclusion, LQFM181 and LQFM183 present protective activity against neurotoxicity promoted by AlCl3, suggesting a beneficial effect of these molecules against the tissue damage that occurs in pathologies involving the oxidative stress, such as neurodegenerative diseases.
1
1.Introdução
2
1.1. Mercado Farmacêutico Global
Em lista publicada no ano de 2015 pelo IMSHEALTH, pode-se observar que
o mercado farmacêutico mundial vem apresentando um significativo crescimento,
além de desempenhar um papel de destaque na economia mundial. Segundo esses
dados, no ano de 2007 foram movimentados 739,5 bilhões de dólares e, em 2014,
ultrapassaram a marca de 1 trilhão de dólares (Figura 1), representando um
crescimento de quase 43%, sendo a América do Norte responsável por 36,2% deste
montante, correspondendo a 348,7 bilhões de dólares (1; 2).
Figura 1 – Evolução do mercado farmacêutico global no período de 2007-2014,
adaptado de Global 2015(2).
Entre o grupo das vinte classes farmacêuticas que mais faturaram em 2015,
totalizando um montante de 954,116 milhões de dólares do total, estão os fármacos
que atuam sobre o sistema nervoso central (SNC) e que arrecadaram mais de 74
milhões de dólares, o que corresponde a cerca de 8% desse total(3). Já entre os grupos
dos vinte fármacos que mais lucraram no ano de 2015(4), três deles possuem atividade
no sistema nervoso central (Figura 2), como a pregabalina (1), um análogo do GABA,
com ação anticonvulsivante, antiepilética, ansiolítica(5) e é capaz de reduzir a dor
neuropática central e periférica(6). Outro fármaco que se encontra nessa lista é o
Aripiprazol (2), um antipsicótico utilizado no tratamento da esquizofrenia(7). Por sua
vez, o acetato de glatirâmer (3) é um conjunto de aminoácidos utilizado no tratamento
da esclerose múltipla(8).
739,5
786,7
842,6
889,4
936,9
959
993,3
1057,1
2 0 0 7 2 0 0 8 2 0 0 9 2 0 1 0 2 0 1 1 2 0 1 2 2 0 1 3 2 0 1 4
3
Figura 2 – Padrões moleculares da pregabalina, aripiprazol e acetato de glatirâmer.
Além disso, a “Pharmaceutical Research and Manufacturers of America”
(PHRMA) identificou em 2016 mais de 400 candidatos (Figura 3) a protótipos de
fármacos para o tratamento de doenças que acometem o SNC. Deste total, 170 foram
destinados ao tratamento de doenças neurodegenerativas que poderão vir a auxiliar
no tratamento de cerca de 50 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos. Estes
medicamentos encontram-se na fase de pesquisa clínica ou aguardando aprovação
para a comercialização(9).
4
Figura 3 –Números de fármacos em testes clínicos para o tratamento de diferentes
transtornos neurológicos. Adaptado de 2015 REPORT, 2015(9).
Estão sendo pesquisados em estudo de fase clínica 59 fármacos para o
tratamento de Alzheimer (DA), 12 para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica
(ELA), 8 que se destinam ao tratamento da doença de Huntington (HN), 19 para
Distrofia Muscular (DM) e 31 para o tratamento da doença de Parkinson (DP). Este
dado sugere que fármacos para o tratamento de doenças neurodegenerativas (DN)
foi um dos grupos mais pesquisados no ano de 2015. Porém, apesar desse grande
volume, menos de 12% destes serão aprovados pelos órgãos competentes para a
comercialização(9). A busca de fármacos mais eficazes e com menores efeitos
adversos para o tratamento de DN torna importante a pesquisa para o
desenvolvimento de novos fármacos para essas enfermidades, visando a cura ou a
melhoria na qualidade de vida desses pacientes.
1.2. Doenças Neurodegenerativas
Existem mais de 600 tipos de DN, com manifestações clínicas e patológicas
distintas e, em muitos casos, o diagnóstico só é possível após a morte dos
pacientes(17). Dentre as DN, a mais comum é a DA, que atinge 70% dos indivíduos
acometidos por alguma neurodegeneração(10). Em decorrência do prolongamento da
expectativa de vida da população, há também uma multiplicação na incidência de
doenças crônicas associadas ao envelhecimento, sendo as DN a principal causa de
mortalidade e incapacidade na população senil (11,12,13).
4
6
6
8
8
1219
20
20
21
22
31
32
33
58
59
94
0 20 40 60 80 100
Lesão cerebral
Epasticidade
Lesão da Medula Espinal
Huntington
Turette
ELA
Distrofia Muscular
Cefaléia
Acidente Vascular Encefálico
Disordens Genéticas
Epilepsia
Parkinson
Outras
Esclerose Multipla
Tumor cerebral
Alzheimer
Dor
5
Apesar da etiologia das DN ainda não ser totalmente compreendida, sabe-se
que elas ocorrem devido a uma perturbação em diferentes células neuronais, tendo
idade e início variados, sintomas clínicos e características patológicas distintas(14).
Apesar do grande progresso na compreensão da etiologia desses transtornos, os
mecanismos subjacentes permanecem em grande parte obscuros. O consenso é que
mudanças conformacionais de algumas proteínas resultam em uma agregação
atípica, formando aglomerados insolúveis e, consequentemente, em acúmulo intra e
extracelular (Figura 4). Esse acúmulo leva a uma progressiva degeneração de
neurônios e, assim sendo, à morte neuronal(15).
Durante o processo de formação da proteína funcional, faz-se necessário que
ela seja dobrada corretamente, de forma compacta e específica, sendo que alterações
nesse processo pode formar variantes deformadas que incapacitam de adquirir a
conformação nativa. Essas variantes não possuem funcionalidade e podem formar
aglomerados insolúveis. Alterações na função das chaperonas podem levar a um
dobramento incorreto dessas proteínas e a mutações. As deformações podem ser
geradas espontaneamente a uma taxa baixa ao longo da vida, de modo que os
agregados se acumulam gradualmente com a idade. No sistema nervoso, os
agregados frequentemente formam estruturas distintas, geralmente conhecidos como
depósitos amiloides (Alzheimer), que são visíveis ao microscópio e são característicos
de DN. Embora os mecanismos não sejam claros, tais agregados, ou os precursores
de proteína mal dobradas levam à morte neuronal(16).
Figura 4 – Alterações conformacionais de proteínas que podem levar à neurotoxicidade. Adaptado de RANG et al., 2007(15).
6
Cada transtorno neurodegenerativo é originado por mudanças estruturais de
determinadas proteínas, como a β-amiloide (Alzheimer - DA), α-sinucleína (Parkinson
- DP), TAU (DA e DP), Huntingtina (HN) e SOD (ELA)(15). Outro fator que contribui
para o processo de degeneração neuronal são as espécies reativas de oxigênio
(EROs)(16). As EROs não são a causa direta das DN, mas desempenham um papel
essencial, pois o estresse oxidativo pode causar a neurodegeneração por alterar o
potencial redox neuronal, o que leva a um aumento da excitotoxicidade, danos no
DNA e modificação estrutural da proteína(18,19,20,21,22,23,24).
Estimativas do “National Institute of Mental Health (NIMH) ” indicam que 1 em
cada 4 indivíduos adultos nos Estados Unidos da América (EUA) sofrerão de algum
transtorno que acomete o SNC, o que corresponde a 61,5 milhões de pessoas(25). Os
custos gerados por essas pessoas ao sistema de saúde são de cerca de 317 bilhões
de dólares por ano e estudos reportam que até 2050 esse valor ultrapasse os 700
bilhões de dólares, sendo que o tratamento farmacológico eficaz seria capaz de
reduzir em até 220 bilhões de dólares ao ano os custos com esses indivíduos(26,9).
1.3 Estresse oxidativo
Durante o metabolismo celular ocorre a formação de radicais livres que atuam
como reguladores de reações bioquímicas, mediando a transferência de elétrons(27) e
promovendo diversas funções metabólicas tais como a geração de ATP, ativação
gênica e mecanismo de defesa em processos infecciosos. Porém, sua produção em
excesso pode causar danos às células(28). Além disso, como resposta do organismo
ao envelhecimento, para compensar processos metabólicos, há um maior consumo
de oxigênio e, consequentemente, uma maior produção de EROs(19,18,20,21).
Para compensar a formação das EROs, o organismo saudável possui defesas
que inibem a produção excessiva desses radicais livres, mantendo um equilíbrio entre
a produção e a eliminação das EROs. O processo de estresse oxidativo ocorre quando
essas defesas encontram-se em desequilíbrio, ou seja, um aumento de fatores pró-
oxidantes em detrimentos às defesas antioxidantes. Isso resulta em oxidação de
alguns bioconstituintes, como a membrana plasmática das células, que levará à perda
de função e ao desequilíbrio homeostático(29,27).
Quando não há compensação desse aumento das substâncias oxidantes,
ocorrem danos celulares que podem culminar em transtornos neurodegenerativos,
diabetes, câncer, entre outros(30). No caso das DN, ocorre a morte progressiva dos
7
neurônios no SNC, que pode levar, entre outras consequências, a déficits cognitivos
e prejuízos na memória(18,23).
1.3.1. Radicais Livres
As mitocôndrias durante os processos metabólicos normais, promovem a
formação de radicais livres. Esse processo é facilitado por alguns metais (ferro e
cobre) na forma iônica(36,37). Durante o processo de respiração celular, as mitocôndrias
metabolizam entre 85% a 90% do O2 consumido, essa reação é realizada por meio de
uma cadeia de elétrons, a qual é predominantemente a maior formadora de radicais
livres(30). Os outros 10 a 15% são utilizados em outras reações de oxidação direta ou
indireta.
A reação de cadeia de elétrons é catalisada pela citocromo oxidase. Esta atua
na parte final da cadeia, oxidando o citocromo c, removendo seus elétrons que,
posteriormente, serão adicionados à uma molécula de O2 para a formação de H2O
(Figura 5; reação 1). A ação da citocromo oxigenase modula a produção de radicais
livres e o O2 metabolizado (univalente ou singlet) na mitocôndria (cerca de 2% a 5%)
é desviado para outras vias, originando radicais livres(31).
Figura 5 – Reações de formação de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria.
Além disso, a partir do O2 univalente são formados os radicais superóxido (O2•-
- Figura 5; reação 2), hidroxila (OH•) e o peróxido de hidrogênio (H2O2 – Figura 4;
reação 3). Também pode-se gerar radicais por reações catalisadas por enzimas e com
a participação de íons metálicos (Figura 5; reações 4 e 5). O H2O2 apesar de não
possuir elétrons desemparelhados, possui alta capacidade reativa, levando a
alterações nas estruturas celulares e na geração de outros radicais livres como OH•,
que também é capaz de transpor as membranas celulares. O O2•-, além de participar
8
de reações de geração de OH•, pode ainda interagir com o óxido nítrico (NO•),
gerando espécies reativas de nitrogênio (ERNs), tais como o peroxinitrito (ONOO-)
(Figura 5; reação 6)(27).
Figura 6 – Sistemas de defesa antioxidante do tipo enzimático(27).
Os íons ferro e cobre são potentes catalizadores das reações de formação de
radicais livres, por meio de reações de óxido-redução. Essa interação ocorre
principalmente por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss(32,33,34). A primeira diz
respeito à geração de radical OH• por meio da reação do H2O2 com os íons em
questão, ao passo que, na segunda, estes íons catalisam a reação entre o H2O2 e o
radical O2• a fim de gerar, da mesma forma, o radical OH• (Figura 6).
1.3.2. Defesas Antioxidantes
O organismo possui meios para inibir ou reduzir os efeitos deletérios
provocados pelos radicais livres, eles são conhecidos como sistemas de defesas
antioxidantes. Esse sistema atua por diferentes mecanismos de ação: prevenção
(impedindo a formação dos radicais livres), varredores (impedem a ação dos radicais
livres) ou reparo (favorecendo a reconstituição das estruturas biológicas lesadas).
Frequentemente, esse sistema é separado em dois grupos: os enzimáticos e os não-
enzimáticos. Esse último é constituído por uma multiplicidade de substâncias, que
podem ter origem endógena ou dietética(35).
9
O sistema de defesa enzimático é constituído pelas enzimas superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) (Figura 6). Elas
atuam como mecanismos de defesa preventivo, ou seja, impedindo e controlando a
formação de radicais livres. A SOD tem como objetivo impedir o acúmulo do radical
superóxido e a CAT e GPx previnem o acúmulo de H2O2, agente que, por meio das
reações de Fenton e Haber-Weiss, resulta na formação do radical OH• com alto
potencial reativo, sendo o principal indicador dos processos de peroxidação lipídica,
mudanças conformacionais de proteínas e mutações do DNA(27;34).
Já o sistema de defesa não-enzimático inclui, principalmente, compostos
antioxidantes de origem dietética, entre os quais vitaminas, minerais e compostos
fenólicos. O ácido ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol e β-caroteno, precursores das
vitaminas E e A, respectivamente, são compostos vitamínicos potencialmente
antioxidantes. Entre os minerais destacam-se o zinco, cobre, selênio e
magnésio(32,33,27).
1.4. Alumínio e Doenças Neurodegenerativas
O alumínio é um elemento da tabela periódica de número atômico 13 (13
prótons e 13 elétrons) com massa atômica 27 u, é mais frequentemente encontrado
na forma iônica de Al3+. Os isótopos de ocorrência natural são o 27Al e 26Al, sendo o
primeiro mais frequente, porém o segundo é mais estável(38,39). Esse metal apresenta
leveza, resistência, condutividade elétrica e baixo ponto de fusão(40).
O alumínio é um dos metais mais abundantes em nosso planeta(41,42,43), o que
torna quase impossível a não exposição a esse metal, estimando-se que o ser humano
ingere entre 3 e 12 mg/kg diariamente(44), tornando-se o elemento não essencial ao
qual o homem é mais frequentemente exposto.
Por muito tempo se desconheciam os efeitos nocivos para os seres vivos
desse metal, porém um crescente número de relatos demonstra que o alumínio possui
efeitos tóxicos observados nas mais diferentes formas de vida, como algas marinhas,
microorganismos, células, tecidos, plantas e animais e, obviamente, no
homem(45,46,47,48,49,50,51,52).
Os seres humanos são expostos ao alumínio de inúmeras formas: através de
nanopartículas inaladas que entram no corpo e se aderem a vários tecidos; oralmente,
pela água ou alimentos contaminados e através da nutrição parenteral, medicamentos
10
e soluções de diálise(53). Altas concentrações de alumínio no cérebro tem sido
associadas a condições neuropatológicas, como as DN(54,49,55,56).
Na década de 60, surgiram os primeiros relatos de degeneração neurofibrilar
em coelhos após a intoxicação com AlPO4(57). Desde então, trabalhos
complementares trazem informações sobre o acúmulo do alumínio em tecidos de
plantas, animais e seres humanos(45,46,47,58).
Animais submetidos a uma dieta rica em alumínio desenvolvem perda de
apetite e redução do ganho de peso(38,54,58). Esse metal pode acumular-se nos ossos,
fígado, rins, coração, sangue e encéfalo nos seres humanos(59,60,43). No encéfalo pode
levar a encefalopatia, déficits de memória, enfraquecimento da coordenação motora,
convulsões, entre outros sintomas(47,43).
A neurotoxicidade surge pelo fato desse metal conseguir transpor facilmente
a barreira hematoencefálica, através dos receptores que fazem endocitose das
proteínas carreadoras de ferro, causando alterações no fluxo desse íon através da
membrana(39). Sabe-se que o alumínio é capaz de alterar diversas funções biológicas
(Figura 7), como mudanças conformacionais no DNA; disfunção mitocondrial e
diminuição de ATP; alteração da fosforilação e defosforilação de proteínas; inibição
da liberação de neurotransmissores (glutamato, acetilcolina, 5-HT, NA); aceleração da
lipoperoxidação das membranas que alteram a sua fluidez; inibição da atividade
enzimática (CAT, SOD, ChAT, tirosina hidroxilase, dopamina β-hidroxilase) causando
assim, entre outros danos, prejuízos aos processos cognitivos e a formação da
memória(61,50). A memória é a base do conhecimento, estando envolvida com a
orientação no tempo e no espaço e com as habilidades intelectuais e mecânicas.
Aprendizagem e memória são o suporte para todo o nosso saber, habilidades e
planejamento, fazendo considerarmos o passado e nos situarmos no presente,
prevendo o futuro(62,63).
11
Figura 7 – Alterações nas funções metabólicas promovidas pelo alumínio no sistema
biológico.Adaptado de KAWAHARA & KATO-NEGISHI, 2011(61).
Uma das estruturas primordiais para o processo de aprendizado e formação
da memória é o hipocampo, localizado medialmente ao ventrículo lateral(64), sendo
que a estrutura denominada giro denteado está envolvida com os aspectos
emocionais de aprendizado e memória. Essa estrutura é relacionada com a memória
espacial e a memória emocional dos indivíduos(50). A memória espacial está
relacionada a atividades básicas, como encontrar alimento e abrigo para animais. Já
a memória emocional atua como um sistema de alerta, sinalizando para riscos à
integridade física(65,66).
No que diz respeito ao papel do alumínio em desordens neurológicas e
cognitivas, estudos sugerem que este elemento seja um fator causador de danos aos
processos de aprendizagem e memória(46,43). Estudos bioquímicos mostram
alterações em estruturas límbicas do encéfalo, prejudicando o sistema de
neurotransmissão colinérgica principalmente no hipocampo(67,68,69). Evidências
indicam que esse sistema tem participação crucial nos processos de memória e
aprendizagem(70,71).
12
Sabendo do papel desempenhado pelo estresse oxidativo no surgimento dos
transtornos neurodegenerativos(24), da ausência de tratamentos farmacológicos
eficazes, com baixos efeitos colaterais e ainda, com o panorama de crescimento do
mercado farmacêutico, esse estudo buscou planejar e sintetizar compostos com
características antioxidantes tendo como foco o tratamento de distúrbios cognitivos
oriundos de doenças neurodegenerativas. Para a obtenção desses protótipos, foram
utilizados como moléculas precursoras o piribendil, utilizado para o tratamento de
déficits cognitivos e de memória(72), e o butilato de hidroxitolueno (BHT) que apresenta
propriedades antioxidantes(73). Nesse estudo serão apresentados o planejamento, a
síntese e os efeitos biológicos dos protótipos LQFM181(5) e LQFM183 (6).
13
2. Objetivos
14
2.1. Objetivo geral
Planejar e sintetizar compostos (5 e 6) com possíveis propriedades
antioxidantes e avaliar o efeito protetor dos compostos em modelo de neurotoxicidade
induzida por cloreto de alumínio (AlCl3) em camundongos.
2.2. Objetivos Específicos
Planejar, sintetizar e caracterizar a estrutura dos compostos propostos,
através das metodologias de infravermelho, ressonância magnética nuclear, massas
e ultravioleta.
Caracterizar o perfil antioxidante dos compostos.
Determinar o efeito protetor dos compostos sobre o prejuízo da memória
induzida pelo cloreto de alumínio.
Avaliar o efeito dos compostos sobre o sistema de defesa antioxidante no
córtex e hipocampo.
15
3. Material e Método
16
3.1. Planejamento Estrutural dos Compostos (5 e 6)
No planejamento estrutural, substituiu-se a subunidade 1,3-benzodioxole (A)
e (B) presente em (4), pela subunidade (A+B) presentes em (5 e 6), a qual apresenta
atividade antioxidante, i.e. composto butilhidroxitolueno (BHT), um antioxidante
sintético amplamente empregado na indústria de alimentos(74). Com isso visou-se
obter compostos que sejam efetivos no tratamento das transtornos cognitivos
observadas nas DN, além de apresentar efeito antioxidante, uma vez que várias
doenças que acometem o SNC apresentam níveis elevados de espécies reativas de
oxigênio (ROS)(26), como ilustrado na Figura 8.
Figura 8 – Padrão molecular do piribendil utilizado como precursor dos compostos (5 e 6)
Segundo o banco de dados do Scifinder, as novas estruturas propostas (5 e
6), são inéditas. Apresentam as subunidades farmacofóricas presentes nos protótipos
(4) i.e. subunidades N-fenilpiperazínica C e D presentes em (4). Ademais, os novos
compostos (5 e 6) contemplam os filtros farmacocinéticos preconizados por
Lipinski(75). Segundo as regras de Lipinski ou dos cinco, candidatos a protótipos de
fármacos devem apresentar número de unidades de massa atômica menor ou igual a
quinhentos, número de sítios aceptores de ligação de hidrogênio menor ou igual a
dez, número de sítios doadores de ligação de hidrogênio menor ou igual a cinco, além
de coeficiente de partição entre 2-3.
17
3.2. Elucidação estrutural
Em parceria com o Instituto de Química da Universidade Federal de
Goiás/Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear (LRMN/UFG), foram obtidos os
espectros de RMN 1H, de HSQC e de HMBC em aparelho Bruker Avance III a 125 e
500 MHz; as amostras foram dissolvidas em CDCl3, utilizando como padrão interno o
TMS (Tetrametilsilano).
Os espectros na região do Infravermelho (I.V.) foram obtidos em um aparelho
Perkin-Elmer Spectrum Bx-II FT-IR System em colaboração com o Laboratório de
Controle de Qualidade de Medicamentos da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de Goiás (LCQM/UFG); as amostras foram prensadas em KBr (brometo de
potássio).
Os pontos de fusão das moléculas foram determinados com o aparelho
Gehaka Modelo PF1500, no Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás.
Para o monitoramento das reações, foi realizada a cromatografia em camada
delgada (CCD) utilizando placas de alumínio Merck, 0,2 mm de espessura como fase
estacionária, e fase móvel n-hexano: AcOEt (70:30). A visualização dos compostos
através de CCD deu-se em Câmara Escura de UV por lâmpada ultravioleta (254 e 365
nm).
A purificação dos compostos foi realizada por cromatografia de adsorção em
coluna, com sílica-gel de 100-13 200 mesh (Merck) como fase estacionária, e n-
hexano: AcOEt como fase móvel. Da fase orgânica, o excesso de água foi extraído
com emprego do sulfato de sódio anidro (Na2SO4), posteriormente filtrada com papel
de filtro e o solvente foi evaporado à pressão reduzida.
3.3. Análise Retrossintética
O planejamento da rota sintética ocorreu utilizando-se de uma análise
retrossintética (Figura 9), cujo objetivo é trabalhar a reação em sentido inverso, a partir
da molécula alvo, onde são realizadas desconexões que correspondam a reações
conhecidas de maneira que o plano sintetico seja o inverso da análise. Os compostos
(5 e 6) podem ser obtidos por meio da desconexão da ligação C-N, obtida pela
redução do nitrogênio da piperazina.
18
Figura 9 – Análise Retrossintética da reação de formação dos compostos (5 e 6)
3.4. Metodologia Sintética
19
3.4.1. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol LQFM181 (5)
As metodologias sintéticas a serem empregadas na obtenção dos compostos
LQFMs (5 e 6), objetos de estudo deste trabalho, encontram-se ilustradas nas Figuras
8, 9, 10 e 11, e foram produzidas em escala de 1mmol.
Em um balão de 50 mL foi adicionado, em banho de gelo, 1,0 mmol da n-
fenilpiperazina (9), o catalizador formaldeído (CH2O) 0,9 mL e 1 mL de ácido acético
(AcOH). Em seguida, adicionou-se 1,0 mmol do 2,6-di-tert-butilfenol (8), o meio
reacional foi aquecido à temperatura de refluxo por cerca de 2 horas (Figura 10),
logrando na formação do 2,6-di-tert-butil-4-((4-fenilpiperazin-1-a)metil)fenol (5)(76,77).
Figura 10 – Reação de formação do composto LQFM181 (5)
Em seguida, a solução foi resfriada à temperatura ambiente e neutralizada
com uma solução de NaHCO3 10% extraída com três alíquotas de 30 mL de CH2Cl2.
A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e evaporada à pressão reduzida. O
produto obtido foi purificado em cromatografia de adsorção em coluna. Foi obtido um
rendimento de 19% (5) na forma de um sólido escuro com P.F.= 105 °C, Rf=0,76 (n-
hexano : AcOEt 70:30).
RMN de 1H (500,13 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 7,26 (2H, dd, J= 7,47 e 1,47 Hz; H-
10’ e 12’); 7,13 (2H, sl, H-2 e 6); 6,92 (2H, dd, J= 8,87 e 1,08 Hz; H-9’ e 13’); 6,85 (1H,
td, J= 7,05 e 0,65 Hz; H-11’); 5,15 (1H, sl; OH); 3,52 (2H, sl, H-1’); 3,23 (3H, sl; H-4’ e
6’); 2,63 (4H, sl, H-3’ e 7’); 1,44 (18H, s, H7 e 8)
RMN de 13C (HSQC/HMBC - 125,76 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 62,9 (C-1’); 52,72
(C-3’ e 7’); 48,7 (C-4’ e 6’); 126,1 (C-1); 125,9 (C-2 e 6); 135,3 (C-3 e 5); 152,9 (C-4);
30,5 (C-7 e 8); 34,9 (C-9 e10); 151,1 (C-8’); 115,7 (C-9’ e13’); 129,2 (C-10’ e 12’);
119,4 (C-11’).
IV máx. (KBr) cm-1: 3620 (υ O-H), 3055 (υ C-H de aromático), 1254 (υ C-N),
1134 (C-O).
20
3.4.2. Síntese do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol
LQFM183 (6)
Em um balão de 50 mL foi adicionado, em banho de gelo 1,0 mmol da n-
piridinapiperazina (10), o catalizador formaldeído (CH2O) 0,9 mL e 2 mL de ácido
acético (AcOH). Em seguida, adicionou-se 1,0 mmol do 2,6-di-tert-butilfenol (8), o
meio reacional foi aquecido à temperatura de refluxo por cerca de 2 horas (Figura 11),
logrando na formação do 2,6-di-tert-butil-4-((4-(piridin-2-a)piperazin-1-a)metil)fenol
(6)(76,77).
Figura 11 – Reação de formação do composto LQFM183 (6)
Em seguida, a solução foi resfriada à temperatura ambiente e neutralizada
com uma solução de NaHCO3 10% extraída com três alíquotas de 30 mL de CH2Cl2.
A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e evaporada à pressão reduzida. O
produto obtido foi purificado em cromatografia de adsorção em coluna. Foi obtido um
rendimento de 85% (6), na forma de um sólido marrom com P.F.=103-104 °C, Rf=
0,38 (n-hexano : AcOEt 70:30).
RMN de 1H (500,13 MHz) CDCl3 / TMS (δ): 8,18 (1H, ddd, J=6,98, 4,91 e 2,07
Hz; H-10’); 7,48 (1H, ddd, J= 7,84, 2,21 e 1,84 Hz; H-12’); 7,15 (2H, s, H-2 e 6); 6,64
(1H, dt, J= 8,60 e 0,76 Hz; H-11’); 6,62 (1H, dd, J= 5,96 e 3,70 Hz; H-13’); 5,20 (1H,
sl; OH); 3,62 (4H, sl; H-4’ e 6’); 2,65 (4H, sl; H-3’ e 7’); 1,44 (18H, s; H-7 e 8).
IV máx. (KBr) cm-1: 3614 (υ O-H), 2956 (υ C-H de aromático), 1247 (υ C-N),
1146 (C-O).
3.5. Drogas e Reagentes
21
Albumina de soro bovino (Sigma), cloreto de alumínio (sigma), 5:5-ditiobis-2-
nitrobenzoato – DTNB (sigma), acetiltiocolina (sigma), peróxido de hidrogênio - H2O2
(CRQ), ácido tricloroacético – TCA (Vetec), ácido tiobarbitúrico – TBA (TediaBrasil),
álcool n-butílico (Synth), glicina (Vetec), Fosfato monossódico - NaH2PO4 (Cromoline),
Fosfato dissódico - Na2HPO4 (Synth), coomassie brillant blue (Amresco).
3.6. Avaliação do Perfil Antioxidante in vitro
3.6.1. Determinação do Potencial Antioxidante pela técnica do DPPH
A atividade de eliminação de radicais de DPPH foi determinada conforme
descrito por Asaduzzaman et al. (2014)(59), com pequenas modificações: foram feitas
soluções dos compostos (5 e 6) em etanol PA em diferentes concentrações (3x10-3 a
3x103 M) e, como padrão, foi utilizado o BHT nas mesmas concentrações. Foi
adicionado solução de DPPH (0,3 mM) e as amostras foram incubadas à temperatura
ambiente, em local com ausência de iluminação, por 30 minutos. Após o término da
reação, a absorbância foi determinada em espectrofotômetro a 510 nm e foi calculada
a capacidade (%) dos compostos em inibirem o DPPH utilizando a fórmula:
(%) = (𝐴𝑏𝑠. 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑠. 𝑏𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜)
(𝐴𝑏𝑠. 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒) 𝑥 100
Onde:
Abs. branco= absorbância na ausência de DPPH
Abs. controle= absorbância na ausência dos compostos
Abs. amostra= absorbância na presença do DPPH e dos compostos
3.6.2. Quantificação da Peroxidação Lipídica
Os níveis de peroxidação lipídica de células de cérebro de ratos obtidos na
presença dos compostos foram determinados pelo método das substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Homogenatos do tecido foram incubados por 1 hora
em banho de gelo, em concentrações crescentes (10-5, 10-4 e 10-3 M) das substâncias
BHT (8), LQFM181 (5) e LQFM183 (6). A seguir, foram incubados por 30 minutos a
37 °C na presença de H2O2 (0,23 M). Após esse período, foi adicionado às amostras
o ácido tiobarbitúrico - TBA (10% p/v) em meio ácido (ácido tricloroacético – TCA -
0,67% p/v) e estas foram submetidas à nova incubação por 15 minutos a 100 ºC.
22
Transcorrido esse período e, após o resfriamento das amostras, foram adicionados
150 µL de n-butanol e em seguida foram homogeneizadas e centrifugadas (4000 rpm,
2 °C, 20 minutos). O sobrenadante obtido foi submetido à leitura em espectrofotômetro
a 535 nm. Os resultados foram expressos em nmol de MDA/mg de proteína(78,79,59).
3.7. Avaliação Farmacológica
3.7.1. Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos adultos pesando
aproximadamente 47 g, fornecidos pelo biotério central da UFG e mantidos em
condições controladas de temperatura (23 ± 2 ˚C) e iluminação (ciclo claro/escuro de
12 horas), com água e ração ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram
realizados seguindo os princípios de ética e cuidado com animais de laboratório e
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de
Goiás (protocolo CEUA/UFG nº 053/16).
3.7.3 Avaliação do efeito protetor dos compostos sobre a neurotoxicidade
induzida pelo cloreto de alumínio
Camundongos foram divididos em 6 grupos (n=10 animais/grupo) tratados por
40 dias, 1 vez ao dia. Inicialmente os animais foram pré-tratados com veículo Tween
80 2,0%, 10 mL/kg, v.o. (Grupos 1 e 2), LQFM181 200 µmol/kg v.o. (Grupos 3 e 4), e
LQFM183 200 µmol/kg v.o. (Grupos 5 e 6). Uma hora após, os grupos 1, 3 e 5
receberam água destilada (10 mL/kg, v.o.) e os grupos 2, 4 e 6 cloreto de alumínio
(AlCl3) (750µmol/kg, v.o.)(80,44).
Transcorrido o período dos tratamentos, os animais foram submetidos aos
testes comportamentais (esquiva passiva, campo aberto e chaminé) e, em seguida,
eutanasiados por decapitação cervical, sendo dissecado o encéfalo e reservadas as
regiões do córtex e hipocampo para os testes de avaliação da atividade antioxidante
e da acetilcolinesterase.
3.8.1. Testes Comportamentais
23
3.8.1.1. Esquiva passiva (ou inibitória) step-down
O comportamento de esquiva passiva é baseado no reforço negativo e é
usado para avaliar as memórias de curta (MCD) e longa duração (MLD). O aparelho
consiste em uma caixa (30 x 20 x 20 cm) composta por três paredes de aço e uma de
acrílico, com uma base contendo duas plataformas: uma de 8,0 x 1,5 x 20 cm na
extremidade direita (plataforma de segurança), e a outra (22 x 20 cm) consistindo em
uma série de barras de aço inoxidável, separadas 1 cm em 1 cm, e conectadas a um
gerador. Durante o treinamento, cada camundongo foi colocado na plataforma de
segurança, registrando-se o período de latência para que ele colocasse as quatro
patas na grade, quando então foi aplicado um choque (0,4 mA: 5 s). Em seguida, o
animal foi removido do aparato. Nas sessões teste (retenção), os animais foram
novamente colocados na plataforma e o tempo de latência para a descida (em
segundos) foi registrado, não sendo, porém, submetidos ao choque. Para a avaliação
das MCD e MLD, os animais foram submetidos à sessão teste aos 90 min e 24 h após
a sessão treino, respectivamente(81,82,85).
3.8.1.2. Chaminé
Os animais foram introduzidos dentro de um tubo cilíndrico transparente (3 cm
de diâmetro e 30 cm de comprimento) e quando estes atingiram a extremidade oposta,
o tubo foi posicionado verticalmente em relação a bancada. Foi avaliado o tempo que
os animais levaram para se locomover em marcha ré até atingir uma linha previamente
demarcada, em um tempo máximo de 30 s(83,84).
3.8.1.3. Campo Aberto
Os animais foram colocados individualmente no centro do campo aberto
dividido em oito quadrantes de área igual e que formam três círculos concêntricos,
sendo que o campo possui diâmetro de 37 cm. A atividade exploratória foi observada
por 5 minutos e foi avaliado o número total de cruzamentos(85,86).
3.9. Dosagens Bioquímicas
24
3.9.1. Processamento dos tecidos
Após a avaliação comportamental, os animais foram eutanasiados e os
cérebros foram dissecados reservando-se o córtex e o hipocampo. Logo após, tais
estruturas encefálicas foram adicionadas em nitrogênio líquido para preservar sua
integridade até o processamento de todos os grupos. Em seguida, os tecidos foram
imersos em tampão fosfato (pH 7,4), na proporção de 1:5 (p/v) e homogeneizados em
homogeneizador (Homo mix). As amostras foram então centrifugadas a 4000 rpm por
20 mim a 4ºC, o sobrenadante foi separado e armazenado em freezer a -80ºC até a
realização das dosagens bioquímicas. As proteínas presentes nas amostras foram
dosadas pela metodologia proposta por BRADFORD (1976)(87), sendo utilizado como
padrão a albumina de soro bovino (BSA).
3.9.3. Determinação da Atividade da Colinesterase
A acetilcolinesterase (AChE) é uma proteína presente nas junções
neurosinápticas, responsável por catalisar a hidrólise da acetilcolina em acetato e
colina. A determinação da sua atividade foi realizada com a utilização do reagente de
ELLMAN (1969)(89). Essa metodologia constitui-se de uma avaliação colorimétrica da
taxa de produção de um ânion amarelo (5-tio-2-nitrobenzóico), que é formado
proporcionalmente à concentração de acetiltiocolina (ASCh), análogo da acetilcolina
(ACh), hidrolisada por esta enzima presente no tecido.
A AChE irá quebrar a molécula de ASCh em acetato e tiocolina. A tiocolina
reagirá com o reagente de ELLMAN (1969)(89), o 5:5-ditiobis-2-nitrobenzoato (DTNB),
resultando na produção do 5-tio-2-nitrobenzoato, formando um complexo de cor
amarela.
Para a realização do teste, homogenatos de córtex e hipocampo foram
suspendidos em tampão fosfato (pH 7,4), na proporção de 1:100. Logo após, foram
adicionados 1,8 µL de DTNB (75 mM) e 1,5 µL de ASCh (10 mM) a 200 µL do
suspendido. As leituras das absorbâncias foram detectadas no comprimento de onda
a 412nm durante um período de 10 min com leituras em intervalos de 1 min, utilizando
a fórmula abaixo. Dados foram expressos em nmoles de AChE/min/mg de proteínas.
𝑅 = 7,35𝑥10−4 × ∆𝐴/𝐶𝑜
Onde:
25
R = Velocidade em nmoles de substrato hidrolisado por minuto por miligrama de proteína.
ΔA= Variação da absorbância por minutos.
Co = Concentração de proteína (mg).
3.9.4. Determinação da Atividade da Catalase - CAT
Para determinar a atividade da CAT, foram adicionados a 191 µL de tampão
fosfato (pH 7,0), 2 µL da amostra (homogenato de córtex ou hipocampo), e 7µL de
H2O2 (0,3 M). A decomposição do H2O2 é diretamente proporcional à atividade
enzimática a qual é mensurada em espectrofotômetro em intervalos de 15 em 15 s,
por 2 min no comprimento de onda de 240 nm. Os resultados foram expressos em
mmol/mg de proteína(90), utilizando a seguinte fórmula:
[𝐶𝐴𝑇] = 𝑖𝑛𝑐𝑙𝑖𝑛𝑎çã𝑜 𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑎 / 4,6𝑥107 × µ𝐿 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 × 𝐶𝑜
Onde:
(CAT) = Concentração de catalase em mmoles por miligrama de proteína.
Co = Concentração de proteína (mg).
3.9.5. Determinação da peroxidação lipídica (TBARS)
Os níveis de peroxidação lipídica nos homogenatos de córtex ou hipocampo
dos camundongos foram determinados pela metodologia do TBARS. Esse método
consiste na determinação dos níveis do malondialdeído (MDA), substância resultante
da lipoperoxidação dos ácidos graxos das membranas fosfolipídicas. Foram
adicionados 12,5 µL do homogenato dos tecidos a 25 µL de TBA 10% (p/v), 37,5 µL
de TCA (0,67% p/v) e 12,5 µL de H2O. A mistura foi aquecida a 100 °C por 15 minutos.
Após o resfriamento da solução, foram adicionados 75 µL de n-butanol, e as amostras
foram homogeneizadas e centrifugadas (4.000 rpm, 20 min a 4 °C). Posteriormente, a
fase superior foi reservada para leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 535 nm. O resultado obtido foi expresso em nmol de MDA/mg de proteína(78,79),
utilizando o seguinte cálculo:
𝐶 = ∆𝐴 𝑥 38,43/𝐶𝑜
Onde:
ΔA = Absorbância.
C = Concentração de malondialdeído (MDA) em nmoles por miligrama de proteína.
Co = Concentração de proteína (mg).
3.9.6. Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase – SOD
A técnica é baseada na formação do adenocromo, proveniente da inibição da
26
reação do radical superóxido com a adrenalina. A SOD presente na amostra compete
pelo radical superóxido com o sistema de detecção. A atividade da SOD foi
determinada em tampão glicina – NaOH (pH 10,0) ao qual foram adicionados 1; 2,5 e
5 µL dos homogenatos de córtex ou hipocampo para um volume final de 100 µL. A
esta solução foram adicionados 1,7 µL de bitartarato de adrenalina (60 mM, pH 2,0)
procedendo-se a leitura em espectrofotômetro a 480 nm por 10 min e com leituras em
intervalos de 1 min. O resultado foi calculado utilizando-se a fórmula seguinte e
expresso em unidades de SOD por mg de proteínas(91).
[𝑆𝑂𝐷] =100
µ𝐿 1 𝑈 𝑆𝑂𝐷 × 𝐶𝑜
Onde:
(SOD) = Concentração de Unidade de SOD por miligrama de proteína.
1 U SOD = Uma unidade de SOD
Co = Concentração de proteína (mg).
3.10. Análise Estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM), com
exceção dos valores de CI50 que foram expressos como médias geométricas e
correspondentes limites de confiança. Os resultados foram submetidos à análise de
variância (ANOVA) de uma via, seguidos pelos pós-testes de Newman-Keuls ou de
Dunnett, para comparação entre 3 grupos ou mais. Para comparação entre dois
grupos foi utilizado o teste “t” de Student não pareado. As diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0,05. A análise estatística foi realizada
utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, versão
5.0).
27
4. Resultados 4.1.Determinação do Potencial Antioxidante pelo método DPPH
Para avaliar a capacidade dos compostos em inibir a oxidação do DPPH,
foram construídas curvas de concentração (Log) x efeito (% de inibição) e
determinadas as concentrações que promovem a inibição em 50% da formação do
radical DPPH (CI50). Nestas condições, LQFM181 e LQFM183 inibiram a formação do
28
radical instável com valores de CI50 de 31,7 (27,9 - 35,9) e 4,8 (4,3 – 5,3) µmol/mL,
respectivamente. O composto padrão (BHT), inibiu a oxidação do DPPH com valor de
CI50 de 118,9 (94,6 – 149,3) µmol/mL. Comparativamente, LQFM183 foi 6,6 vezes
mais potente em relação ao composto LQFM181 em inibir a radical DPPH. Em relação
ao padrão BHT, LQFM181 e LQFM183 foram 3,75 e 24,8 vezes mais potentes em
inibirem a oxidação do radical DPPH (Figura 12).
L o g [S u b s tâ n c ia ] (M )
Inib
içã
o d
o D
PP
H (
%)
-6 -5 -4 -3 -2 -1
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
BH T
L Q F M 1 81
L Q F M 1 83
Figura 12 – Curva concentração-efeito (3x10-1 à 3x103 µg/mL) dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 sobre a inibição do radical DPPH (0,3 mM). Os símbolos representam as médias ± e.p.m. de três determinações em duplicata.
4.1.2. Quantificação das substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
Para avaliar a proteção promovida pelos compostos sobre a peroxidação
lipídica das membranas celulares neuronais promovida por um agente agressor
(H2O2), amostras de tecido cerebral de ratos foram incubadas com concentrações
crescentes (10-5, 10-4 e 10-3) de BHT, LQFM181 e LQFM183 e em seguida incubadas
novamente com o agente lesivo (H2O2 0,23 M).
A peroxidação lipídica das membranas celulares de cérebro total de ratos
(nmol MDA/mg de proteínas) foi reduzida pelo BHT nas concentrações 10-5 M
(0,002217 ± 0,00008258), 10-4 M (0,0005226 ± 0,0001261) e 10-3 M (0,006650 ±
0,0002721), quando comparada com o grupo que recebeu somente o agente lesivo
H2O2 (CL: 0,005532 ± 0,0002721 nmol MDA/mg de proteínas). Resultado semelhante
foi obtido com o composto LQFM183 (10-5 M: 0,005334 ± 0,0003776, 10-4 M: 0,002090
± 0,00009010, 10-3 M: 0,0006848 ± 0,00006497). Por sua vez, o composto LQFM181
29
foi capaz de reduzir os níveis de MDA nas concentrações de 10-4 M (0,0008290 ±
0,0004192) e 10-3 M (0,0005586 ± 0,00001802) (Figura 13).
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
Log concentração [M]
LQFM 181BHT
CN CL -5 -4 -3 -5 -4 -3 -5 -4 -3
LQFM 183
***
*
***
******
***
*
***
***
MD
A
(nm
ol/m
g d
e P
rote
ína)
Figura 13 – Níveis de MDA (nmol/mg de proteínas) obtidos pela metodologia TBARs em amostras de cérebro total de ratos na presença dos compostos BHT, LQFM181 e LQFM183 (10-5, 10-4, 10-3 M). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM de três determinações em triplicata. *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao controle lesado (CL), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett. CN= controle normal;
4.2. Tratamento crônico
4.2.1. Peso Corporal
Ao final do tratamento (40º dia), os grupos veículo, LQFM181 e LFQFM183,
mostraram ganho de peso corporal. Por sua vez, os grupos AlCl3, LQFM181+AlCl3 e
LQFM183+AlCl3 mostraram uma diminuição do ganho de peso dos animais (Tabela
1). A progressão semanal do peso corporal dos animais pode ser visualizada na Figura
14.
30
Tabela 1: Avaliação do ganho de peso corporal dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3 obtido pela diferença entre o peso final dos animais (Pf; determinado ao final dos tratamentos) e o peso inicial dos animais (Pi; determinado ao início dos tratamentos). Resultados são expressos como média ± EPM (n=9 a 10).
Veículo AlCl3 LQFM181 LQFM181 + AlCl3 LQFM183 LQFM183 + AlCl3
Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N Média EPM N
Ganho de Peso (Pf-Pi)
2,3 1,44 10 -1,9* 0,73 9 1,8 1,02 9 -1,9* 1,20 10 2,2 1,07 10 -2,4** 0,37 9
*p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo veículo utilizando teste “t” de Student.
0 1 2 3 4 5
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
V e íc u lo
A lC l3
L Q F M 1 8 1
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 8 3
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
S e m a n a s
Pe
so
(g
)
Figura 14 – Peso dos animais (em gramas) determinados semanalmente a partir do início (semana 0) até o final dos tratamentos
(semana 5) nos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. Cada linha representa um grupo
e cada símbolo a média ± EPM (n= 9 a 10) do peso corporal semanal do grupo.
31
4.2.3. Testes comportamentais
4.2.3.1. Esquiva passiva
As latências de retenção para o grupo veículo, nos testes treino, memória de
curta (MCD) e de longa duração (MLD) foram 3,693 ± 0,3485 s, 10,71 ± 0,5745 s e
10,37 ± 1,598 s, respectivamente, indicando a formação e a consolidação da memória
(Figura 15). Os animais que receberam somente o agente lesivo (AlCl3), não
apresentaram diferenças entre os testes (4,895 ± 1,062 s, 4,635 ± 1,045 s, 5,288 ±
1,072; respectivamente). O grupo LQFM181 aumentou significativamente os tempos
de latência na MCD (85,12 ± 6,967 s; p<0,001) e MLD (77,23 ± 14,44 s; <0,001)
quando comparados ao treino (5,14 ± 0,74 s); bem como o grupo que recebeu
LQFM183 na MCD (200,2 ± 46,04 s; p<0,001) e MLD (187 ± 41,03 s; p<0,001) quando
comparado ao treino (3,013 ± 0,3441). O pré-tratamento com LQFM181 (MCD:7,353
± 1,73 s, p<0,001; MLD: 14,7 ± 2,302 s, p<0,001) e LQFM183 (MCD: 7,22 ± 0,911 s,
p<0,05; MLD: 16,71 ± 1,87 s, p<0,001) foi capaz de proteger a perda de memória dos
animais, quando comparado a sessão treino (LQFM181: 2,861 ± 0,415; LQFM183:
4,261 ± 0,672).
0
1 0
2 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
A lC l3
V e íc u lo L Q F M 1 81
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
T re in o M C D M L D
L Q F M 1 83
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
La
tên
cia
(s
)
* * *
* * *
* *
* * *
*
* * *
* * *
* * *
* * *
* * *
Figura 15 – Latência de retenção para o treino, memória de curta duração (MCD) e de longa duração (MLD) para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, quando comparado a sessão treino do mesmo grupo utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
32
No teste de avaliação da atividade locomotora (Figura 16), o número de
quadrantes percorridos foi medido por 5 min e não observou-se diferença significativa
entre os grupos veículo (120,9 ± 11,00), AlCl3 (113,7 ± 7,32), LQFM181 (123,9 ± 7,66),
LQFM181 + AlCl3 (115,0 ± 14,36; p=0,885), LQFM183 (105,8 ± 8,30) e LQFM181+
AlCl3 (118,0 ±7,93; p=0,659).
0
5 0
1 0 0
1 5 0
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
L Q F M 1 83
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 81
A lC l3
V e íc u lo
Cru
za
me
nto
s T
ota
is
Figura 16–Número total de cruzamentos no teste do campo aberto para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
O tempo de escalada (Figura 17) não foi diferente entre os animais que
receberam veículo (11,67 ± 1,43 s), AlCl3 (9,40 ± 0,67 s) e LQFM181 (9,50 ± 0,88 s).
Já os animais que receberam LQFM181 + AlCl3 (5,28 ± 0,71 s), LQFM183 (5,41 ± 0,88
s) e LQFM183 + AlCl3 (5,20 ± 0,48), foi observada uma redução significativa no tempo
de escalada quando comparado ao grupo veículo (p<0,001) e ao grupo AlCl3 (p<0,05).
0
5
10
15
***##
LQFM 181Veículo
AlCl3 LQFM 181 + AlCl3
LQFM 183
LQFM 183 + AlCl3
*** ***# #
Tem
po
de e
scala
da (
s)
Figura 17 – Tempo de escalada de camundongos submetidos ao teste chaminé para os grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3.
33
As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 9 a 10). ***p<0,001 quando comparado ao grupo Veículo e # p<0,05; ## p<0,01 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
4.3. Dosagens bioquímicas
4.3.1. Avaliação da Atividade da Acetilcolinesterase (AChE)
Em homogenatos de córtex, a atividade da AChE obtida para o grupo veículo
foi de 0,2639 ± 0,007535 nmol/min/mg de proteínas. Resultados semelhantes foram
obtidos para os grupos AlCl3 (0,268 ± 0,013; p<0,83) e LQFM181 + AlCl3 (0,292 ±
0,0089; p<0,087). Por sua vez, a atividade enzimática foi significativamente maior nos
grupos LQFM 181 (0,3203 ± 0,01150; p<0,05), LQFM 183 (0,3669 ± 0,01034; p<0,001)
e LQFM 183 + AlCl3 (0,3947 ± 0,04257; p<0,05) em relação ao grupo veículo (Figura
18 A).
Nas amostras de hipocampo, a atividade da AChE obtida para o grupo veículo
foi de 38,41 ± 1,523 nmol/min/mg de proteínas. A atividade da enzima mostrou-se
reduzida no grupo AlCl3 (33,24 ± 1,523), LQFM181 (33,31 ± 1,775) e LQFM181+ AlCl3
(32,05 ± 0,8669) quando comparada ao grupo veículo (p<0,05). Já os grupos
LQFM183 (23,51 ± 0,9577) e LQFM183+AlCl3 (21,71 ± 1,632) apresentaram redução
significativa da atividade da acetilcolinesterase quando comparada aos grupos
veículos e AlCl3 (p<0,01), respectivamente (Figura 18 B).
34
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
0 .5
(A )
***# #
# # #
#
AC
hE
(nm
ole
s/m
in/m
g d
e P
ro
teín
a)
**A
Ch
E
(nm
ole
s/m
in/m
g d
e P
ro
teín
a)
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
(B )
* ***
*** ***
# # ## # #
V e íc u lo
A lC l3
L Q F M 1 81
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 83
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
Figura 18 - Atividade da AChE (nmol/min/mg de proteínas) determinada no córtex (A) e no hipocampo (B) de camundongos dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=5 a 7). *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 quando comparado ao grupo veículo. ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.
35
4.3.2. Dosagem das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS
Em amostras de córtex de camundongos, a concentração de MDA encontrada
para o grupo veículo foi de 0,0252 ± 0,001140 nmol/mg de proteínas. O grupo AlCl3
apresentou níveis de MDA significativamente maiores do que os do grupo veículo
(0,02740 ± 0,002727, p<0,05). Os grupos LQFM181 (0,019 ± 0,037) e
LQFM181+AlCl3 (0,022 ± 0,0031) não foram diferentes quando comparados ao grupo
AlCl3. Os níveis de MDA, no entanto, foram significativamente reduzidos tanto no
grupo LQFM183 (0,1853 ± 0,001859, p<0,01) como no LQFM 183+AlCl3 (0,01565 ±
0,001146, p<0,001) quando comparados ao grupo AlCl3, sendo que o grupo
LQFM183+AlCl3 também foi diferente ao veículo (p<0,05) (Figura 19 A).
Em amostras de hipocampo de camundongos, a concentração de MDA
encontrada para o grupo veículo foi de 0,047 ± 0,0044 nmol/mg de proteínas. O grupo
AlCl3 apresentou níveis de MDA semelhantes ao veículo (0,055 ± 0,0079, p>0,05). O
grupo LQFM181 (0,036 ± 0,0069) não foi diferente dos grupos veículo (p=0,31) e AlCl3
(p=0,12), respectivamente. O grupo LQFM181+AlCl3 (0,033 ± 0,0032) apresentou
concentração de MDA significativamente menor do que os grupos veículo e AlCl3
(p<0,05). Os grupos LQFM183 (0,033 ± 0,0039) e LQFM183+AlCl3 (0,036 ± 0,0028)
apresentaram níveis menores de MDA em relação ao grupo AlCl3 (p<0,05) (Figura 19
B).
36
0 .0 0
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
0 .0 8(A )
*# #
*# # #
MD
A
(nm
ol/
mg
de
Pro
teín
a)
MD
A
(nm
ol/
mg
de
Pro
teín
a)
0 .0 0
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
0 .0 8
*#
##
(B )
V e íc u lo
A lC l3
L Q F M 1 81
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 83
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
Figura 19– Níveis de malondialdeído (MDA; nmol/mg de proteínas) determinados no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4a 7). *p<0,05 quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.
4.3.3. Dosagem da atividade da CAT
37
A atividade da CAT (nmol/mg de proteínas) determinada para o grupo veículo
em amostras de córtex foi de 0,5029 ± 0,02639. Redução significativa dessa atividade
foi encontrada nos grupos AlCl3 (0,3690 ± ,03213, p<0,01), LQFM181 (0,3920 ±
0,03383, p<0,05), LQFM181+AlCl3 (0,3718 ± 0,01687, p<0,01), LQFM183 (0,2876 ±
0,01431, p<0,001) e LQFM183+AlCl3 (0,3180 ± 0,003558, p<0,001) (Figura 20 A).
No hipocampo a atividade da CAT foi significativamente reduzida no grupo
AlCl3 (0,09781 ± 0,01664) em relação ao grupo veículo (0,1761 ± 0,01057) (p<0,05).
Esses valores, no entanto, foram restabelecidos nos grupos LQFM181 (0,1662 ±
0,01926), LQFM181+AlCl3 (0,2114 ± 0,02204), LQFM183 (0,3315 ± 0,02783) e
LQFM183+AlCl3 (0,1734 ± 0,01354) (p<0,05) (Figura 20 B).
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6 (A )(A )
** ***
*** ***#
CA
T
(mm
ol/
mg
Pro
teín
a)
CA
T
(mm
ol/
mg
Pro
teín
a)
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6 (B )
*
***
#
# #
# # #
#
V e íc u lo
A L C l3
L Q F M 1 81
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 8 3
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
Figura 20–Valores obtidos na atividade da catalase (nmol/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=4 a 6). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo veículo, #p<0,05,##p<0,01 e ###p<0,001 quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.
38
4.3.4. Dosagem da atividade da SOD
A atividade da SOD (U/mg de proteínas) determinada para o grupo veículo
em amostras de córtex foi de 0,1050 ± 0,01129. Resultado semelhante foi obtido para
o grupo AlCl3 (0,073 ± 0,009) (p>0,11). No entanto, a atividade da SOD foi
significativamente aumentada nos grupos LQFM 181 (0,1718 ± 0,02427, p<0,05),
LQFM181+AlCl3 (0,1764 ± 0,01047, p<0,01), LQFM183 (0,2248 ± 0,04195, p<0,05) e
LQFM183+AlCl3 (0,4713 ± 0,1502, p<0,01) quando comparado ao grupo veículo.
(Figura 21 A).
No hipocampo, a atividade da SOD (U/mg de proteínas) foi significativamente
reduzida nos grupos LQFM181+AlCl3 (0,1839 ± 0,01584; p<0,05) e LQFM183 (0,1097
± 0,01949; p<0,01) em relação ao grupo veículo (0,3079 ± 0,03244). Os grupos
LQFM181 (0,223±0,048) e LQFM183+AlCl3 (0,265±0,042) não apresentaram
diferenças na atividade da SOD em relação ao veículo (p>0,05) (Figura 21 B).
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8(A )
* **
*
**
# # # #
#
# #
SO
D (
U/m
g p
ro
teín
a)
SO
D (
U/m
g p
ro
teín
a)
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8(B )
***
V e íc u lo
A lC l3
L Q F M 1 81
L Q F M 1 8 1 + A lC l3
L Q F M 1 83
L Q F M 1 8 3 + A lC l3
# #
# # #
39
Figura 21 - Valores obtidos na atividade da SOD (U/mg de proteínas) no córtex (A) e no hipocampo (B) dos grupos veículo, AlCl3, LQFM181, LQFM181+AlCl3, LQFM183 e LQFM183 + AlCl3. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n=3 a 7). *p<0,05 e **p<0,01quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05, ##p<0,01 e ###p<0,001quando comparado ao grupo AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Dunnett.
40
5.Discussão
41
Visando a obtenção de novos padrões moleculares e com perfil antioxidante
para o tratamento de doenças neurodegenerativas, foi realizado o planejamento, a
síntese e a caracterização dos compostos LQFM181 e LQFM183. Após confirmada a
obtenção dos compostos pelas metodologias de RMN e IV, buscou-se investigar se
estes apresentavam atividade antioxidante. Para tal, a primeira metodologia
empregada foi avaliar se os compostos eram capazes de inibir o radical DPPH,
utilizando como controle positivo o BHT, que é composto precursor das moléculas e
com atividade antioxidante(92). Posteriormente, utilizou-se do modelo que avaliou a
capacidade dos compostos em inibir a peroxidação lipídica de membranas celulares.
Nos dois testes, os compostos confirmaram a característica antioxidante. Esses
resultados serviram como base para dar continuidade aos demais testes delineados
para a pesquisa, ou seja, para os estudos em modelo experimental de
neurodegeneração que envolve o estresse oxidativo.
Anteriormente à avaliação dos efeitos dos compostos em modelo de
neurodegeneração, foram realizados testes para a triagem dos efeitos dos compostos
no SNC. Com o objetivo de diminuir o número de animais utilizados no estudo, foram
selecionadas doses para os compostos com base naquelas utilizadas em outro estudo
com derivado piperazínico de ação central, o LQFM008(93). Após o estabelecimento
das doses (100, 200 e 400 µmol/kg), foi realizado o teste geral de atividade no SNC
(resultados descritos no Apêndice 3). Os testes do campo aberto, chaminé e de sono
induzido por barbitúrico permitem indicar, por meio de alterações comportamentais
dos animais, se as substâncias atuam no SNC com características do tipo
estimulantes ou do tipo depressoras, além de avaliar a atividade motora e a
movimentação espontânea dos animais(94,95). A partir destes resultados e ainda com
o objetivo de otimizar os testes seguintes, minimizando a quantidade de animais e de
drogas e reagentes, foi selecionada a dose de 200 µmol/kg para o prosseguimento do
estudo, tendo em vista que esta dose apresentou efeitos nos experimentos realizados.
Uma vez estabelecido que os compostos apresentam perfil como
antioxidantes e que promovem efeitos centrais, procedeu-se ao desenvolvimento dos
testes com os compostos em modelo experimental que mimetiza alterações centrais
encontradas em indivíduos acometidos por DN, tais como a Doença de Alzheimer. O
modelo de neurotoxicidade induzida por AlCl3 foi utilizado, pois este metal é
conhecidamente uma neurotoxina capaz de prejudicar a atividade enzimática,
aumentar a geração de EROs, promover déficit cognitivo e a morte neuronal, entre
42
outros(61). Sabendo que o estresse oxidativo é um fator envolvido na gênese e
evolução de algumas das mais frequentes DN, tais como a DA(96); DP (24)e ELA(97), o
modelo de neurotoxicidade induzida pelo AlCl3 torna-se um teste experimental
indicativo para pesquisas que envolvem estresse oxidativo e DN(98).
O AlCl3 é descrito por promover redução na massa corporal em animais
submetidos ao contato crônico com o alumínio, possivelmente por causar redução na
ingestão de alimentos e água(99). Embora neste estudo não tenha sido avaliado o
consumo de ração e água dos animais, foi observada a redução do peso corporal dos
animais tratados com o AlCl3 ao final do período de tratamento, corroborando com
estudo anterior. Semelhantemente, os grupos LQFM181 + AlCl3 e LQFM183 + AlCl3
apresentaram redução de peso corporal ao 40º dia do tratamento, demonstrando que
os compostos não foram capazes de inibir a perda de peso promovida pelo AlCl3.
Diferentemente, porém, os grupos veículo, LQFM181 e LQFM183 mostraram ganho
de peso corporal ao final do tratamento mostrando que, isoladamente, os compostos
não são capazes de influenciar o peso dos animais. Este resultado também pode ser
indicativo que os compostos não apresentam toxicidade significativa ou que, pelo
menos, não interferem no peso dos animais. No entanto, a realização de estudos de
toxicidade que indicarão o perfil toxicológico dos mesmos.
Os resultados obtidos no teste da esquiva passiva mostraram que os animais
que receberam AlCl3 apresentaram comprometimento cognitivo, confirmando os
dados da literatura que mostram que o alumínio prejudica os processos de memória
e aprendizado(61,100,98). Por sua vez, o tratamento com LQFM181 e LQFM183 foi capaz
de inibir os efeitos prejudiciais promovidos pelo AlCl3, tanto na avaliação da MCD
quanto na MLD, ou seja, os animais foram capazes de evocar a memória, refletida em
um aumento da latência de descida da plataforma. Sendo assim, é possível sugerir
que os compostos atuam tanto no córtex como no hipocampo, uma vez que a
aquisição da informação (memória de curta duração) envolve a região cortical e a
consolidação da memória (memória de longa duração) envolve a região
hipocampal(70,75). O aumento dos tempos de latência, tanto na avaliação da MCD
como na MLD, promovida pelos compostos isoladamente, pode refletir a ação dessas
moléculas em outros sistemas que vão além dos propósitos do presente estudo. Por
sua vez, os testes que avaliaram o desempenho motor mostraram que LQFM181 e
LQFM183 não prejudica a atividade locomotora dos animais, descartando-se assim
resultado falso-positivo na avaliação dos testes de memória.
43
Um dos principais sistemas neurais envolvidos no processo de formação da
memória é o sistema colinérgico, o qual desempenha função neuromoduladora nos
processos de memória e aprendizado(71). O aumento na atividade da AChE pode
provocar deficiência colinérgica, por diminuir a disponibilidade de ACh no terminal
sináptico e, assim sendo, interferir nos processos cognitivos(101). Por esta razão, foi
avaliada a atividade colinesterásica, levando em consideração também o fato de que
o alumínio é capaz de interferir na atividade dessa enzima. Os resultados, no entanto,
mostraram que o AlCl3 não interferiu na atividade colinesterásica do córtex, enquanto
que no hipocampo LQFM183 mostrou efeito inibitório. Sabe-se que o alumínio exerce
efeito bifásico sobre a atividade da acetilcolinesterase, sendo descrito que baixas
concentrações teciduais promovem efeito inibitório e, em concentrações mais
elevadas, efeito estimulatório(102,103). Apesar da hipótese de que os efeitos
encontrados podem estar associados a diferentes concentrações do metal no córtex
e hipocampo, isso somente poderia ser confirmado com a realização das dosagens
teciduais. Por outro lado, outros modelos experimentais mais específicos para o
estudo do efeito dos compostos sobre o sistema colinérgico, como o teste de prejuízo
da memória promovido pela escopolamina, são indicados.
Por ser um agente ionizável, o alumínio em contato com os tecidos biológicos
é capaz de promover estresse oxidativo e, por consequência, a instabilidade das
membranas celulares devido à peroxidação dos ácidos graxos. Essas alterações
interferem na fluidez e na conformação estrutural, prejudicando a permeabilidade e as
funções celulares, ocasionando a morte celular(61,71,104,105). Como resultado da
lipoperoxidação das membranas, ocorre a formação de produtos como o MDA,
possibilitando assim mensurar o nível de peroxidação lipídica pela dosagem desse
agente. Desse modo, foi possível verificar que o AlCl3 aumentou a formação de MDA
no córtex, confirmando o estresse oxidativo promovido pelo alumínio nessa região
cerebral. O composto LQFM183 mostrou-se capaz de inibir o efeito prejudicial do
alumínio, corroborando com resultados iniciais deste estudo que indicaram ser este
composto capaz de inibir a peroxidação lipídica.
Além de poder inibir diretamente a ação radicalar que leva ao dano celular,
outra forma de inibir o estresse oxidativo é promover a ação das defesas
antioxidantes, como as enzimas catalase e superóxido dismutase(106). Nesse contexto,
os compostos inibiram o efeito prejudicial do AlCl3 sobre a catalase no hipocampo,
sem interferir na região cortical. Esse resultado sugere que os compostos teriam uma
44
ação benéfica preferencial sobre esta enzima no hipocampo. No entanto, essa
hipótese é meramente especulativa, sendo primordial a confirmação desses
resultados obtidos para, posteriormente, conduzir outros testes complementares,
como os de quantificação protéica tecidual da enzima. Por outro lado, de forma
contraditória, o efeito dos compostos parece ter favorecido a ação da SOD no córtex,
em detrimento ao hipocampo. Porém, como os resultados não permitiram identificar o
efeito prejudicial do alumínio sobre esta enzima, não se pode sugerir ou especular
qualquer explicação.
45
6. Conclusões
46
O composto LQFM181 foi obtido com rendimento de 19%, as estruturas foram
confirmadas pelas metodologias de RMN (1H e 13C) e IV. E LQFM183 com
rendimento de 85%, confirmado por RMN (1H) e IV.
No teste de esquiva passiva, os compostos LQFM181 e LQFM183 foram
capazes de aumentar a latência de descida da plataforma de segurança,
mostrando que esses compostos possuem atividade modulatória da memória
e do aprendizado, bem como protegeu dos danos provocados pelo AlCl3;
Ambos os compostos foram capazes de reduzir a atividade da enzima
acetilcolinesterase no hipocampo;
LQFM181 e LQFM183 favoreceram a atividade da enzima superóxido
dismutase (SOD) no córtex;
Os compostos LQFM181 e LQFM183 mostram efeito protetor, sob os efeitos
promovidos pelo AlCl3,na atividade da enzima catalase no hipocampo;
LQFM183 foi capaz proteger contra a peroxidação lipídica das membranas,
promovida pelo AlCl3, no córtex.
Em resumo, os compostos LQFM181 e LQFM183 são compostos derivados
piperazínicos inéditos que mostram atividade protetora sobre a neurotoxicidade
promovida pelo AlCl3, sugerindo-se o efeito benéfico dessas moléculas sobre o dano
tecidual promovido pelo estresse oxidativo em patologias como as doenças
neurodegenerativas.
47
7.Bibliografia
48
(1)GLOBAL. Pharmaceutical Sales 2003-2012, 2013. Disponível <http://www.imshealth.com/deployedfiles/imshealth/Global/Content/Corporate/Press%20Room/Total_World_Pharma_Market_Topline_metrics_2012.pdf>. Acesso em: 19 jan. 2015.
(2) GLOBAL. Total Unaudited and Audited Global Pharmaceutical Market by Region 2014–2019, 2015 http://www.imshealth.com/files/web/Corporate/News/TopLine%20Market%20Data/Global%20Prescription%20Sales%20Information5%20World%20figures%20by%20Region%202015-2019.pdf>. Acesso em: 19 jan. 2015.
(3)Top 20 2015. GLOBAL THERAPY AREAS 2015. 2015 < http://www.imshealth.com/files/web/Corporate/News/Top-Line%20Market%20Data/Top_20_Global_Therapy_Areas_2015.pdf > Acesso em: 14 jun. 2016.
(4)Top 20 2015. GLOBAL PRODUCTS 2015b. <http://www.imshealth.com/files/web/Corporate/News/Top-Line%20Market%20Data/Top_20_Global_Products_2015.pdf> Acesso em: 14 jun. 2016
(5) KAZANCI, B. et al. Neuroprotective Effects of Pregabalin Against Spinal Cord Ischemia-Reperfusion Injury in Rats. Turk Neurosurg, DOI: 10.5137/1019-5149.JTN.17959-16.1, 2016.
(6) OGAWA, S.; ARAKAWA, A.; HAYAKAWA, K.; YOSHIYAMA, T. Pregabalin for neuropathic pain: why benefits could be expected for multiple pain conditions. Clin Drug Investig, DOI 10.1007/s40261-016-0423-x, 2016.
(7) LEE, S.; MIN, J.; LEE, I.G.; KIM, J.J. Clinical Usefulness of Aripiprazole and Lamotrigine in Schizoaffective Presentation of Tuberous Sclerosis. Clinical Psychopharmacology and Neuroscience 2016;14(3):305-310.
(8) JONGEN, P.J. et al. Persistence and adherence in multiple sclerosis patients starting glatiramer acetate treatment: assessment of relationship with care received from multiple disciplines. Patient Preference and Adherence, 10: 909–917, 2016.
(9) 2015 Report. Medicines in development for neurological disorders, 2015 <http://phrma.org/sites/default/files/pdf/meddevelopment_neurologicaldisorders.pdf >. Acesso em: 14 jun. 2016.
(10) OMS. Organização Mundial da Saúde. Dementia cases set to triple by 2050 bu still largely ignored: WHO, 2012.
(11) ABRAZ – Associação Brasileira do Alzheimer. Relatório Mundial sobre a Doença de Alzheimer, 2009.
(12) REPORT. Word Alzheimer Report. Na analysis of long-term care for dementia. Journey of Caring., 2013.
49
(13) NIEDZIELSKA, E. Oxidative stress in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol., 2015.
(14) SVETONI, F.; FRISONE, P.; PARONETTO, M.P. Role of FET proteins in neurodegenerative disorders, RNA Biology, DOI: 10.1080/15476286.2016.1211225, 2016.
(15) RANG, H.P. et al. Farmacologia. Rio de Janeiro: Elsevier, 6º edição, 2007.
(16) CARDEAL,I.C.M.A. Uso terapêutico de chaperones em doenças conformacionais. (mestrado em ciências da saúde). Porto,2013
(17) BOASQUIVIS, P.F. O extrato hidroalcoólico de guaraná (paullinia cupana) atenua fenótipos patológicos associados ao mal de alzheimer e à doença de huntington no organismo modelo caenorhabditis elegans. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Exatas e Biológicas – Universidade Federal de Ouro Preto, 2015.
(18) MARKESBERY, W.R. The role of oxidative stress in Alzheimer disease. Arch Nerurol., 56(12):1449-52, 1999.
(19) FERREIRA, A.L.A.; MATSUBARA, L.S. Radicais livres: conceito, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Rev. Assoc. Med. Bras., 43(1):61-8, 1997.
(20) GRUBER, J. et al. Mitochondrial changes in ageing Caenorhabditis elegans – what do we learn from superoxide dismutase knockouts? 6(5):e19444, 2011.
(21) KODYDKOVA, J. et al. Human catalase, its polymorphisms, regulation and changes of its activity in diferente diseases. Folia Biol (Praha), 60(4):153-67, 2014.
(22) AEBI, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol., 105:121-6, 1984.
(23) BAINS, J.S.; SHAW, C.A. Neurodegenerative disorders in humans: the role of glutathione in oxidative stress-mediated neuronal death. Brain Res Brain Res Ver. 25(3):335-58, 1997.
(24) ÇUBUKÇU, H.C. et al. Oxidative and nitrosative stress in serum of patients with Parkinson’s disease. Neurol Sci. DOI 10.1007/s10072-016-2663-1, 2016.
(25) 2014 REPORT Medicines in Development for Mental Health. Disponível em: <http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-mental-health-report.pdf>. Acesso em: 26 jan. 2015.
(26) POPA-WAGNER, A.; MITRAN, S.; SIVANESAN, S.; CHANG, E.; BUGA, A. ROS and brain diseases: the good, the bad, and the ugly. Oxid Med. Cell. 1-14, 2013.
(27) BARBOSA, K.B.F. et al. Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Rev. Nutr., Campinas, 23(4):629-643, jul./ago., 2010.
50
(28) SHAMI, N.J.I.E.; MOREIRA, E.A.M. Licopeno como agente antioxidante. Rev Nutr. 2004; 17(2):227-36. doi: 10.1590/S1415-52732004000200009.
(29) HALLIWELL, B.; WHITEMAN, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br J Pharmacol. 2004; 142(2): 231-55.
(30) GREEN, K.; BRAND, M.D.; MURPHY, M.P. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes. Diabetes. 2004; 53(Suppl 1): 110-8.
(31) EMERIT, J.; EDEAS, M.; BRICAIRE, F. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Biomedicine & Pharmacotherapy 58 (2004) 39–46.
(32) MENDES, J.F.R. Biomarcadores do estado nutricional de ferro e extresse oxidativo em adultos. Brasília. Dissertação (Mestrado em Nutrição Humana). Universidade de Brasília, 2008
(33) PODSEDEK, A Natural antioxidants and antioxidant capacity of brassica vegetables: A review. LWT-Food Sci. Technol., 40: 1-11, 2007.
(34) BIRBEN, E. et al. Oxidative stress and antioxidante defense. Word Allergy Organ J. 5(1):9-19, 2012.
(35) CLARKSON, P.M.; THOMPSON, H.S. Antioxidants: what role do they play in physical activity and health? Am J Clin Nutr. 2000; 72(2):637-46.
(36) KOURY, J.C.; DONANGELO, C.M. Zinco, estresse oxidativo e atividade física. Rev Nutr. 2003; 16(4):433-41. doi: 10.1590/S1415-52732003000400007.
(37) BARREIROS, A.L.B.S.; DAVID, J.M.; DAVID, J.P. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Quim. Nova, Vol. 29, No. 1, 113-123, 2006.
(38) AZEVEDO, F. A. CHASIN, A. A. M. Metais: Gerenciamento da toxicidade. São Paulo: Editora Atheneu, 2003.
(39) BONDY, S.C. The neurotoxicity of environmental aluminum is still an issue. Neurotoxicology. Sep;31(5):575-81, 2010.
(40) AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND DISEASE REGISTRY (ATSDR). Toxicologicalprofile for Aluminum (Draft for Public Comment). Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 2006.
(41) ZATTA, P., LUCCHINI, R., VAN RENSBURG, S.J. & TAYLOR, A. The role of metals in neurodegenerative processes: aluminum, manganese, and zinc. Brain Research Bulletin, v. 62, p. 15–28, 2003.
(42) KUMAR, A., PRAKASH, A., DOGRA, S. Neuroprotective effect of carvedilol against aluminium induced toxicity: possible behavioral and biochemical alterations in rats. Pharmacol Rep. v. 63(4):915-23, 2011.
51
(43) WU, Z., DU, Y., XUE, H., WU, Y., ZHOU, B. Aluminum induces neurodegeneration and itstoxicity arises from increased iron accumulation and reactive oxygen species (ROS) production. Neurobiol Aging. 2012 Jan;33(1):199.e1-12.
(44) AL-OLAYAN, E.M.; EL-KHADRAGY, M.F.; MONEIM, A.E.A. The protective properties of melatonin against aluminium-induced neuronal injury. Int. J. Exp. Path., 96: 196–202, 2015.
(45) KISS, T. Interaction of aluminum with biomolecules - any relevance to Alzheimer's disease? Archives of Gerontology and Geriatrics, v. 21, p. 99-112, 1995.
(46) TAPPARO, A., SOLDÀ, L., GIORGIO BOMBI, G., ZAMBENEDETTI, P., ZATTA, P.F., BERTANI, R. & CORAIN, B. Analytical Validation of a General Protocol for the Preparation of Dose-controlled Solutions in Aluminium Toxicology. Analyst, v. 120, p. 2425-2429, 1995.
(47) ZATTA, P., CERVELLIN, D. & ZAMBENEDETTI, P. Effects of the Aluminium Speciation on the Morphology of Rabbit Erythrocytes: a Toxicological Model. Toxicology in Vitro, v. 12, p. 287-293, 1998.
(48) RONDON-BARRAGÁN, I.S., RAMÍREZ DUARTE, W.F., BARATO, P. & ESLAVA MOCHA, P.R. Importancia del ciclo biogeoquímico del Aluminio (Al) con relación con la acidez de los suelos en la producción piscícola y la salud pública ¿Cual seria el caso de la Orinoquia? Revista Orinoquia, v. 11, p. 81-94, 2007.
(49) CHENG, D., ZHU, C., CAO, J., JIANG, W. The protective effects of polyphenols from jujube peel (Ziziphus Jujube Mill) on isoproterenol-induced myocardial ischemia and aluminuminduced oxidative damage in rats. Brain Research, v. 50(5):1302-8, 2012.
(50)SILVA JÚNIOR, A. F. Efeitos neurocomportamentais da intoxicação experimental com citrato de alumínio em ratos adultos. 2009. Dissertação (Mestrado em Neurociências e Biologia Celular) - Universidade Federal do Pará, Belém/PA, 2009.
(51) EXLEY, C. The toxicity of aluminium in humansMorphologie (2016) 100, 51-55 DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.morpho.2015.12.003
(52) CHAPPARD, D. Effects of aluminum on cells and tissues. Morphologie (2016) 100, 49—50.
(53) NOREMBERG, S. M.S. Influência da formação de hidroxialuminosilicatos na biodisponibilidade do alumínio. 2010. Dissertação (Mestrado em Química Analítica) – Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria/RS, 2010.
(54) KUMAR, V., BAL, A., GILL, K.D. Susceptibility of mitochondrial superoxide dismutase to aluminium induced oxidative damage. Toxicology. v. 31;255(3):117-23, 2009.
(55)BONDY, S.C. Low levels of aluminum can lead to behavioral and morphological changes associated with Alzheimer's disease and age-related neurodegeneration. NeuroToxicology 52 (2016) 222–229.
52
(56) WANG, Z. et al. Chronic exposure to aluminum and risk of Alzheimer’s disease: A meta-analysis. Neuroscience Letters 610 (2016) 200–206.
(57) KLATZO, I., WISNIEWSKI, H., STREICHER, E. Experimental production of neurofibrillary degeneration: light microscopic observations. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, v. 24, p. 187-199, 1965.
(58) ABU-TAWEEL, G. M., AJAREM, J.S., AHMAD, M. Neurobehavioral toxic effects of perinatal oral exposure to aluminum on the developmental motor reflexes, learning, memory and brain neurotransmitters of mice offspring. Pharmacol Biochem Behav. v.101(1):49-56, 2012.
(59) ASADUZZAMAN, et al. In vitro acetylcholinesterase inhibitory activity and the antioxidant properties of Aegle marmelos leaf extract: implications for the treatment of Alzheimer’s disease. Psychogeriatrics; 14: 1–10, 2014.
(60) KAIZER, R. R. Sistemas purinérgico e colinérgico e perfil oxidativo no encéfalo deroedores: influência do Alumínio e de diferentes dietas. Centro de Ciências Naturais e Exatas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica. Universidade Federal de Santa Maria, 2008.
(61) KAWAHARA, M.; KATO-NEGISHI,M. Link between aluminum and the pathogenesis of Alzheimer’s disease: the integration of the aluminum and amyloid cascade hypotheses. International Jornal of Alzheimer’s Disease. 2011:276393, 2011.
(62) PINTO, A. C. O impacto das emoções na memória: Alguns temas em análise. Psicologia ,Educação e Cultura, v. 2(2), p. 215-240, 1998.
(63) QUEVEDO, J.; FEIER, G.; AGOSTINHO, F. R.; MARTINS, M. R.; ROESLER, R. Consolidação da memória e estresse pós-traumático. Rev Bras Psiquiatria, v. 25 (Supl I):25-30, 2003.
(64) SCORZA, F. A., ARIDA, R. M., CYSNEIROS, R. M., SCORZA, C. A., ALBUQUERQUE, M., CAVALHEIRO, E. A. Estudo qualitativo da formação hipocampal de animais hipertensos com epilepsia. Arq Neuropsiquiatr, 63(2-A):283-288, 2005.
(65) VIANA, M. B; TOMAZ, C.; GRAEFF, F. G. The Elevated T-Maze: a new animal modelo ofanxiety and memory. Pharmacology Biochemistry and Behaviour, v. 49, p. 549-554,1994.
(66) ZANGROSSI JR, H. & GRAEFF, F. G. Behavioral validation of the Elevated T-Maze, a New Animal Model of Anxiety. Brain Research Bulletin, v, 44, p.15, 1997.
(67) BUSH, A. Metals and neuroscience. Current Opinion in Chemical Biology, v. 4, p. 184-191, 2000.
(68) VEER BALA GUPTA, ANITHA, S., HEDGE, M.L., ZECCA, L., GARRUTO, R.M., RAVID, R., SHANKAR, S.K., STEIN, R., SHANMUGAVELO, P. & JAGANNATHA RAO, K.S. Aluminium in Alzheimer’s disease: are we still at a crossroad? Cellular and Molecular Life Sciences, v. 62, p. 143-158, 2005.
53
(69) SETHI, P., JYOTI, A., SINGH, R., HUSSAIN, E., SHARMA, D. Aluminium-induced electrofhysical, biochemical and cognitive modifications in the hippocampus of aging rats. NeuroToxicology, v. 29, p. 1069-1079, 2008.
(70) IZQUIERDO, I. Memória. 2. ed. rev. e ampl. – Porto Alegre : Artmed, 2011.
(71) PARK, H.R. et al. Fermented Sipjeondaebo-tang Alleviates Memory Deficits and Loss of Hippocampal Neurogenesis in Scopolamine-induced Amnesia in Mice. Scientific RepoRts. 6:22405, 2016.
(72)NAGARAJA, D.; JAYASHREE, S. Randomized Study of the Dopamine Receptor Agonist Piribedilin the Treatment of Mild Cognitive Impairment. Am J Psychiatry.158:1517–1519, 2001.
(73)KESHAVARZ, P., MALEKI, M., BABAEI, P. Effect of Butylated Hydroxytoluene (BHT) antioxidant on BDNF gene methylation, learning and memory in male wistar rats. 2nd international & 14th Iranian Genetics Congress, 21-23 may, 2016.
(74)SEO, H.W.; SEO, J.K.; YANG, H.S. Supplementation of Pork Patties with Bovine Plasma Protein Hydrolysates Augments Antioxidant Properties and Improves Quality. Korean J. Food Sci. An. Vol. 36, No. 2, pp. 198~205 (2016).
(75) 75 LIPINSKI, C. A. Drug Discov. Today: Technol. 2004, 1, 337.
(76)ELIEL, E.L.; FISK, M.K. 5- methylfurfuryldimethylamine. Organic Syntheses, Cill vol.4 p.626 (1963).
(77) 77 JIN, Y.; XIN, R.; AI, P.; CHEN, D. Intern. J. Pharmac.2008, 350, 330.
(78) DRAPER, H.H.; HADLEY, M. Malondialdehyde determination as an index of lipid peroxidation. Meth Enzymol 186:421– 431, 1990.
(79) FREITAS, R.L.M. et al. Oxidative stress in rat hippocampus caused by pilocarpine-induced seizures is reversed by buspirone. Brain Res Bull 81:505–509, 2010.
(80) LIN, WT. et al. Protective effects of low-intensity pulsed ultrasound on aluminum-induced cerebral damage in Alzheimer’s disease rat model. SCIENTIFIC REPORTs, 1-7, 2015.
(81) AREMU, D. A., MESHITSUKA, S. Some aspects of astroglial functions and aluminium implications for neurodegenaration. Brain Res Rev. v.52, p.193-200, 2006.
(82) SHARMA, A.C.; KULKARNI, S.K. Evidence for GABA-BZ receptor modulation in short-term memory passive avoidance task paradigma in mice. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 12(30):175-80, 1990.
(83) GROTICKE, I; HOFFMAN, K; LOSCHER, W. Behavioral alterations in the pilocarpine modelo of temporal lobe epilepsy in mice. Exp Neuronal, 207(2):329-49, 2007.
54
(84) COLETA, M. et al. Neuropharmacological evaluation of the putative anxiolytic effects of passiflora edulis sims, its subfractions and flavonoid constituents. Phytother res, 20(12):1067-73,2006.
(85) ARCHER, J. Tests for emotionality in rats and mice: a review. Animal Behavior, v.21, n.2, p.205-35, 1973.
(86) SIEGEL, P.S. A simple electronic device for the measurement of gross bodily activity of small animals. Journal of Psychology, v.21, p.227-36. 1946.
(87) BRADFORD, M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254, 1976.
(89) ELLMAN, G.L. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem pharmacol, 7:88-95, 1961.
(90) BOVERIS, A.; CHANCE, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem. J., 134: 707–716, 1973.
(91) BOVERIS, A.; FRAGA, C.G.; VARSAVSKY, A.I.; KOCH, O.R. Increased chemiluminescence and superoxide production in the liver of chronically ethanol-treated rats. Arch Biochem Biophys., 227(2):534–541, 1983.
(92) XU, K. et al.Physicochemical Properties and Antioxidant Activities of Luteolin-Phospholipid Complex.Molecules 2009, 14, 3486-349.
(93) BRITO, A.F. et al. Central pharmacological activity of a new piperazine derivative: 4-(1-Phenyl-1h-pyrazol-4-ylmethyl)-piperazine-1-carboxylic acid ethyl ester. Life Sciences. Volume 90, Issues 23–24, 14 June 2012, Pages 910–916
(94) GORENSTEIN, C.; SCAVONE, C. Avanços em psicofarmacologia – mecanismos de ação de psicofármacos hoje. Revista Brasileira de Psiquiatria, v.21, n.1, 1999
(95) CARLINI, E.A.; MENDES, F.R. Protocolos em psicofarmacologia comportamental: um guia para pesquisa de drogas com ação sobre o SNC, com ênfase nas plantas medicinais, São Paulo: Editora – Fap-UNESP, 2011.
(96) BARBAGALLO, M; MAROTTA, F; RODRIGUE, LJ. Oxidative stress in patients with Alzheimer’s disease: effect of extracts of fermented papaya powder. Mediators Inflamm. 2015:624801, 2015.
(97) CARRÌ, M.T.; D’AMBROSI, N.; COZZOLINO, M. Pathways to mitochondrial dysfunction in ALS pathogenesis, Biochemical and Biophysical Research Communications (2016), http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2016.07.055.
(98) YANG, W.N. et al. The effects of varsartan on cognitive déficits induced by aluminum trichloride and d-galactose in mice. Neurol Res. 36 (7): 651-8, 2014.
55
(99) NAIDU, N.R; BHAT, S; DSOUZA, U. Effect of long term administration of aluminium chloride on oxidative stress and acetylcholinesterase activity in rat brains. Res Art Bio Scienc. 3 (1):616-22, 2013.
(100) ABDEL-AAL, R.A.; ASSI, A.A.; KOSTANDY, B.B. Rivastigmine reverses aluminium-induced behavioural changes in rats. Eur J Pharmacol. 659 (2-3):169-76, 2011.
(101) SRIRAKSA, N. et al. Cognitive-enhancing effect of quercetin in a rat modelo of Parkson’s disease induced by 6-hidroxydopamine. Evid Based Complement Alternat Med. 2012:823206, 2012.
(102) KUMAR, S. Aluminium-induced bifphasic effect. Med Hypotheses. 52(6):557-9, 1999.
(103)KUMAR, S. Biphasiceffectof aluminium on cholinergic enzyme of rat brain.Neurosci Lett. May 29;248(2):121-3, 1998.
(104) REED, T.T. Lipid peroxidation and neurodegenerative disease. Free radical Biology & Medicine. 51:1302-1319, 2011.
(105) ROMANUCCI, M.; SALDA, L.D. Oxidative stress and protein quality control systems in the aged canine brain as a model for human neurodegenerative disorders. Oxid Med Cell Longev. 2015:940131, 2015.
(106) CHATURVEDI, R.K.; BEAL, M.F. Mitochondrial diseases of the brain. Free radical Biology & Medicine. 63:1-29, 2013.
(107)CARLINI, E.A.; BURGOS, V.; Screening farmacológico de ansiolíticos: Metodologia laboratorial e comparação entre diazepam e clorobenzepam. Revista da Associação Brasileira de Psiquiatria, v.1, n.3, p. 25-31, 1979.
(108)MACAÚBAS, C.I.P.; OLIVEIRA, M.G.M.; FORMIGONI, M.L.O.S.; SILVEIRA-FILHO, N.G. & CARLINI, E.A. Estudo da eventual ação antiúlcera gástrica do bálsamo (Sedum sp.); folha-da-fortuna (Bryophyllum calycinum), couve (Brassica oleraceae) e da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia) em ratos. In: Estudo de ação antiúlcera gástrica de plantas brasileiras (Maytenus ilicifolia “Espinheira-santa” e outras), Central de Medicamentos CEME, Ministério da Saúde, p. 05-20, 1988.
56
8.Apêndice
57
8.1. APÊNDICE 1: Mecanismo da reação de Síntese dos compostos LQFM181 (5), LQFM183 (6). 8.1.1. MECANISMO 1: Rota da síntese dos compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6).
58
8.2. APÊNDICE 2: Espectros de infravermelho, de RMN 1H, HSQC e HMBC dos
compostos LQFM181 (5) e LQFM183 (6).
Espectro 1: Espectro de IV do Composto LQFM181 (5)
59
Espectro 2 – Espectro Ampliado de RMN 1H do Composto LQFM181 (5).
Espectro 3 – Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM181 (5)
60
Espectro 4– Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HSQC.
Espectro 5 - Espetro expandido de RMN 13C do composto LQFM181(5), obtido por HMBC.
61
Espectro 6: Espectro de IV do Composto LQFM183 (6)
62
Espectro 7: Espectro ampliado de RMN 1H do Composto LQFM183 (6)
Espectro 8: Espectro expandido de RMN 1H do Composto LQFM183 (6)
63
8.3. APÊNDICE 3: Testes Complementares 8.3.1. Metodologia 8.3.1.2. Teste do Campo Aberto
Os animais foram tratados (n=8, por grupo) com veículo (Tween 80 2%, 10
mL/kg, v.o.), LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 ou 400 µmol/kg v.o. Após
sessenta minutos da administração, foram colocados individualmente no centro do
campo aberto dividido em oito quadrados de área igual e que formam três círculos
concêntricos, sendo que o campo possui diâmetro de 37 cm. A atividade exploratória
foi observada por 5 minutos e foram avaliados o número de cruzamentos totais,
levantadas e tempo de imobilidade. Além disse também foram considerados o tempo
despendido e o número de cruzamentos no centro do campo como parâmetro de
ansiedade, bem como autolimpeza e bolos fecais(85,86).
8.3.1.3. Chaminé
Os animais foram introduzidos dentro de um tubo cilíndrico transparente (3 cm
de diâmetro e 30 cm de comprimento). Quando estes atingiram a extremidade oposta
de onde foram introduzidos, o tubo era então posicionado verticalmente em relação a
bancada. Foi avaliada a capacidade destes de se locomover em marcha-ré até atingir
uma linha previamente demarcada, num tempo máximo de 30 s. Este teste tem como
finalidade estimar se existe ou não um comprometimento motor, resultante da
administração dos compostos, e que poderiam influenciar nos resultados(83,84).
8.3.1.4. Teste do Sono Induzido por Pentobarbital Sódico
Os animais foram pré-tratados com veículo (Tween 80 2,0%, 10 mL/kg, v.o.),
LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 ou 400 µmol/kg v.o. Após o intervalo de
sessenta minutos, foi administrado pentobarbital sódico 200 µmol/kg i.p., e foi
contabilizado o tempo entre a administração e a perda do reflexo postural e
considerado como o tempo de latência ao sono barbitúrico (s), e o tempo entre a perda
e a recuperação do reflexo postural foi avaliado como o tempo de duração do sono
barbitúrico (min). Após o termino da execução dos testes os animais foram
eutanasiados segundo protocolos previamente estabelecidos no laboratório(107).
8.3.1.5. Índice de Lesão Gástrica
Para determinação do índice de lesão gástrica, foi adaptada a tabela (Anexo
A)proposta por Macaúbas et al. (1988)(108). Onde é avaliado a coloração do tecido, se
houve ou não perda de pregas, são contabilizados o número de petequeias. Para a
64
presença de edemas, hemorragias e muco, é pontuado de acordo com a intensidade
da presença desses parâmetros, onde 1 é atribuído para leve, 2 para moderado e 3
para intenso. Posteriormente é feita a contagem de áreas ulceradas, se a lesão for de
até 1mm esse valor é multiplicado por 2 pontos, se a lesão for maior que 1 mm o
número é multiplicado por 3 pontos, e se a lesão estiver perfurada esse valor é
multiplicado por 4 pontos, soma-se então esses pontos atribuídos obtendo-se o índice
de lesão(108).
8.3.2. Resultados 8.3.2.1. Teste Do Campo Aberto
No teste do campo aberto, somente na dose de 400 µmol/kg de LQFM181
aumentou o número de bolos fecais (p<0,05) quando comparado ao grupo controle
(veículo), nas doses de 200 e 400 µmol/kg de LQFM183 aumentou o número de
autolimpeza (p<0,05), e as doses de 100 (p<0,01) e 400 (p<0,05) µmol/kg de
LQFM183 diminuiu o número de levantadas. Já o tempo de imobilidade foram
aumentados quando tratados com LQFM181 nas doses de 100 (p<0,05) e 200
(p<0,01) µmol/kg e diminuídos quando tratados com LQFM183 na dose de 100
(p<0,01) µmol/kg. Nos cruzamentos totais somente as doses de 200 (p<0,05) e 400
(p<0,001) µmol/kg de LQFM183 diminuiu o número de cruzamentos totais (Tabela 2).
Ambos os compostos diminuíram o tempo de permanecia no centro LQFM181 nas
doses de 100 e 400 µmol/kg e LQFM 183 nas doses de 200 e 400 µmol/kg (p<0,05).
65
Tabela 2: Alterações comportamentais observadas nos testes do campo aberto
Teste do Campo Aberto
Veículo LQFM 181 LQFM 183
10 mL/kg 100 µmol/kg 200 µmol/kg 400 µmol/kg 100 µmol/kg 200 µmol/kg 400 µmol/kg
Bolos Fecais (nº) 1,75±0,31 1,60±0,24 2,00±0,45 3,40±0,81* 0,83±0,31 2,40±0,40 0,86±0,26
Auto Limpeza (nº) 0,78±0,28 1,33±0,21 0,86±0,14 1,40±0,24 1,60±0,40 1,67±0,21* 1,86±0,34*
Levantadas (nº) 70,43±2,03 74,50±3,75 62,50±4,35 74,00±4,49 53,60±2,54** 64,20±5,70 59,33±1,12*
Imobilidade (s) 11,50±1,26 18,83±2,41* 25,60±4,20** 19,75±7,55 6,40±0,75** 9,17±2,76 18,00±3,59
Cruzamentos Totais 118,50±4,31 113,00±3,94 117,80±9,14 128,00±7,80 109,40±3,06 98,75±6,22* 84,5±4,06***
Tempo no Centro 86,83±2,414 66,00±3,291* 71,88±7,539 76,80±2,653* 101,3±7,465 65,75±4,956* 72,00±6,137*
Resultados expressos como média ± EPM (n=5 e 7); *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo)
utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
66
8.3.2.2. Teste Da Chaminé
No teste da Chaminé (Figura 22), foi analisado a mobilidade dos animais
tratados com LQFM181 e LQFM183 nas doses de 100, 200 e 400 µmol/kg, aferindo o
tempo que ele despende para escalar de ré a chaminé e não houve diferença
significativa entre os grupos, 8,167 ± 0,4014 (Controle), 7,667 ± 0,8028, 6,833 ±
0,8333, 7,250 ± 0,8539 (LQFM181), 10,20 ± 2,177, 8,833 ± 0,9098, 8,750 ±
1,601(LQFM183).
0
5
10
15
Tween 80 2% LQFM 181 LQFM 183
100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg 100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg
Ch
am
iné (
s)
Figura 22–Desempenho dos animais no teste da chaminé, medido em latência de escalada (s). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 6). Não apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
8.3.2.3. Teste Do Sono Induzido Por Pentobarbital Sódico Nos animais que receberam LQFM181, somente na dose de 200 alterou a
latência ao sono de quando comparado ao controle (170,7 ± 5,379 s;187,2 ± 2,956 s,
p<0,05), e quanto a duração, aumentou de forma dose dependente de (52,50 ± 3,149
(Controle); 61,43 ± 3,176; 66,67 ± 2,431, p<0,05 e 80,50 ± 4,291, p<0,001). Já animais
que receberam LQFM183houve um aumento na latência ao sono na menor dosee
diminuição dose dependente nas demais concentrações(170,7 ± 5,379 s (Controle);
190,3 ± 5,232 s, p<0,05; 179,3 ± 3,650 s e 156,6 ± 3,027 s, p<0,05 respectivamente),
além de aumentar a duração do sono também de forma dose dependente de (52,50 ±
3,149 (Controle); 64,00 ± 2,483, p<0,05; 75,00 ± 3,488, p<0,001 e 85,40 ± 3,723
p<0,001) (Figura 23, A e B).
67
0
50
100
150
200
250
Tween 80 2% LQFM 181 LQFM 183
* *
*
(A)
100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg 100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg
So
no
Latê
ncia
(s)
0
20
40
60
80
100
Tween 80 2% LQFM 181 LQFM 183
***
* *
***
***
100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg 100 mol/kg 200 mol/kg 400 mol/kg
(B)
Du
ração
do
So
no
(m
in)
Figura 23 - Latência ao sono barbitúrico, em segundos (A), e duração do sono, em min (B). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado ao grupo controle (veículo), utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
8.3.2.4. Índice de Lesão gástrica
Quando comparado ao grupo que recebeu somente Veículo (8,333 ± 1,022),
os animais que receberam o tratamento semente de AlCl3 (12,17 ± 1,006, p<0,01)
observamos um aumento o índice de lesão da mucosa gástrica, e os animais que
receberam somente LQFM183 reduziram mostraram uma redução desse índice
(5,167 ± 0,4773, p<0,05). Quando os animais foram pré-tratados com LQFM181(9,0
± 0,730, p<0,05) e LQFM183 (9,33 ± 0,42, p< 0,05), e foram posteriormente tratados
com AlCl3 (12,17 ± 1,006), pode-se observar uma redução do índice de lesão da
mucosa gástrica desses animais quando comparamos com os animais que receberam
somente o AlCl3 (Figura 24).
68
0
5
10
15**
# #
Veículo
AlCl3LQFM 181
LQFM 181 + AlCl3LQFM 183
LQFM183 + AlCl3
*
Índ
ice
de
le
sã
o
Figura 24 – Índice de lesões gástricas em camundongos. As colunas e barras verticais representam a média ± EPM (n= 5 a 7). *p<0,05 e **p<0,01 quando comparado ao grupo Veículo (Tween 80 2%) e #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado com AlCl3, utilizando ANOVA seguida do pós-teste de Student-Newman-Keuls.
69
9.Anexos
70
ANEXO A – Tabela do índice de lesões gástricas propostas por macaúbas(108).