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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

RODOLFO SANTOS DUARTE

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE CATEQUINAS E CARACTERIZAÇÃO

DE EXTRATOS DE FOLHAS DE MAYTENUS SSP UTILIZANDO UHPLCMS

CAMPINAS 2019

RODOLFO SANTOS DUARTE

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE CATEQUINAS E CARACTERIZAÇÃO DE

EXTRATOS DE FOLHAS DE MAYTENUS SSP UTILIZANDO UHPLCMS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.

Orientadora: PROFª. DRª. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA

CAMPINAS 2019

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RODOLFO SANTOS DUARTE E ORIENTADO PELA PROFª. DRª. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA.

Campinas, 31/07/2019.

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya

Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa

Profa. Dra. Márcia Ortiz Mayo Marques Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por me permitir encerrar mais um ciclo de aprendizado com muita luta e dedicação e aos meus pais que sempre me incentivaram a estudar.

A minha orientadora Profª. Drª. Alexandra Christine Helena Frankland

Sawaya, por acreditar em mim e pela confiança depositada. Além de ter o privilégio de trabalhar ao lado de uma pessoa com muita sabedoria e que ama transmitir seus conhecimentos.

A todos que fazem parte do labmetamass principalmente a Elisa que ajudou

com o desenvolvimento deste projeto e a minha noiva Aline que me apoiou desde o início desta empreitada.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

À todos vocês, o meu sincero agradecimento.

RESUMO Devido à larga utilização popular de Maytenus ilicifolia no tratamento de úlceras

gástricas, a maior parte dos estudos farmacológicos não clínicos desenvolvidos

encontra-se nessa área. São encontrados na literatura, estudos que obtiveram efeito

antiulcerogênico relevante, comparável à cimetidina. Também há relatados de

significante aumento no volume de secreção e pH gástrico com os extratos testados

em relação ao controle, provavelmente devido aos polifenóis presentes, flavonoides

e taninos predominantemente nos extratos aquosos e esteroides e triterpenos nos

extratos acetônicos e acetato de etila. Neste projeto utilizou-se a técnica de

cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas

(UHPLC-MS) com ionização por eletrospray, para desenvolvimento de método

analítico e sua validação. O método desenvolvido foi capaz de diferenciar e

quantificar a catequina e a epicatequina que são isômeros (trans-catequina e cis-

epicatequina) no modo de ion selecionado (SIM), e simultaneamente analisar o

extrato em modo full–scan. Deste modo, foi possível identificar a espécie do

material analisado com base na composição avaliada, verificando diferentes

compostos entre Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium no extrato aquoso. A

validação do método foi conduzida conforme a RDC 166/2017 apresentando

resultados satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, sendo seletivo, linear,

preciso, exato e robusto. Foram utilizados o guia estatístico n° 10 de 2017 (ANVISA)

e o software Action Stat principalmente para avaliação dos resultados da

lineariadade. Foi aplicado o método validado em 18 amostras comercializadas como

sendo da especie de M. ilicifolia e apenas 72% (13 amostras) foram identificadas

sendo a mesma. Quando avaliou-se a concentração de epicatequina conforme a

especificação da monografia descrita na farmacopeia brasileira 5ª edição (superior a

2,8 mg/g de folha) apenas 50% das amostras estavam de acordo com a

especificação. Portanto é de suma importância uma fiscalização mais eficiente pelos

órgãos reguladores afim de garantir a eficácia das plantas medicinais.

Palavras-chaves: Validação, Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, Catequina, Epicatequina.

ABSTRACT Due to the widespread use of Maytenus ilicifolia in the treatment of gastric ulcers,

most of the non-clinical pharmacological studies developed are in this area. Studies

that have obtained a relevant antiulcerogenic effect, comparable to cimetidine, are

found in the literature. A significant increase in the volume and pH of the gastric

secretion after treatment with these extracts was reportes, possibly due to the

presence poliphenolic compounds (flavonoids and tannins) in the aqueous etracts

and the steroids and triterpenes in the acetone and ethyl acetate extracts. In this

project we used ultra-high performace liquid chromatography coupled to mass

spectrometry (UHPLC-MS) with electrospray ionization, for the development of an

analytical method and its validation. The method was able to differentiate and

quantify catechin and epicatechin which are isomers (trans-catechin and cis-

epicatechin) in the selected ion monitoring (SIM) mode, and simultaneously analyze

the extract in full-scan mode. In this way, it was possible to identify the species of the

analyzed material based on the evaluated composition, verifying different compounds

between Maytenus ilicifolia and Maytenus aquifolium in the aqueous extract. The

validation of the method was conducted according to RDC 166/2017, presenting

satisfactory results for all evaluated parameters, being selective, linear, precise,

accurate and robust. Statistical guide No. 10 of 2017 (ANVISA) and the Action Stat

software were used mainly to evaluate linearity results. The validated method was

applied to 18 samples commercialized as being M. ilicifolia but only 72% (13

samples) were identified as such. When the epicatechin concentration was

evaluated according to the specification of the monograph described in the Brazilian

Pharmacopoeia 5th edition (greater than 2.8 mg / g of leaf), only 50% of the samples

were in agreement with specifications., Therefore a more efficient inspection by the

regulatory organs is of paramount importance in order to ensure the effectiveness of

medicinal plants.

Keywords: Validation, Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, Catechin, Epicatechin.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Imagem da espécie Maytenus ilicifolia (ROSSATO et al., 2013). .................. 19

Figura 2: Imagem de ramo da espécie Maytenus aquifolium (LOPES 2012). ............... 19

Figura 3: Estrutura química de um flavonoide. .............................................................. 20

Figura 4: Estrutura química de um tanino condensado. ................................................ 21

Figura 5: Estrutura química de catequina (A) e epicatequina (B). ................................. 21

Figura 6: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da

ANVISA (ANVISA, 2017a). ............................................................................................ 29

Figura 7: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da

ANVISA (ANVISA, 2017a). ............................................................................................ 42

Figura 8: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo durante o

desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme

apresentado na tabela. .................................................................................................. 42

Figura 9: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo na condição no final do

desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme

apresentado na tabela. (A) Pico cromatográfico referente a catequina e (B) Pico

cromatográfico referente a epicatequina. ...................................................................... 43

Figura 10: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. Ilicifolia sendo A- íon

extraído de m/z 755, B - íon extraído de m/z 289, C- íon extraído de m/z 305, D.

Cromatograma de íons totais (TIC). .............................................................................. 45

Figura 11: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. aquifolium sendo A: íon

extraído de m/z 901, B: íon extraído de m/z 917, C: íon extraído de m/z 289, D:

Cromatograma de íons totais (TIC). .............................................................................. 45

Figura 12: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de Maytenus ssp (híbrida) sendo

A: íon extraído de m/z 917, B: íon extraído de m/z 289, C: Cromatograma de íons

totais (TIC). .................................................................................................................... 46

Figura 13: (A): Cromatograma dos extratos aquoso e (B) hidroalcoólico. ..................... 47

Figura 14: (A) Cromatograma UHPLC-MS em modo SCAN e (B) em modo SIM

selecionado o íon m/z 289 da amostra M. ilicifolia. ....................................................... 48

Figura 15: Verificação de inexistência de interferente m/z 289 no solvente. ................. 49

Figura 16: Comparação das curvas analíticas para a catequina no solvente e na

matriz. ........................................................................................................................... 50

Figura 17: Comparação das curvas analíticas para a epicatequina no solvente e na

matriz. ........................................................................................................................... 50

Figura 18: Análise gráfica da regressão linear dos componentes catequina e

epicatequina realizados em solvente. ........................................................................... 51

Figura 19: Análise gráfica dos resíduos para a catequina. ............................................ 55

Figura 20: Análise gráfica dos resíduos para a epicatequina. ....................................... 56

Figura 21: Analise gráfica da independência dos resíduos de catequina. ..................... 58

Figura 22: Análise gráfica da independência dos resíduos de epicatequina. ................ 59

Figura 23: Cromatograma referentes a amostra 2 (controle) de M. aquifolium e

amostra 4 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN. ........... 66

Figura 24: Cromatograma referentes as amostras 1 (controle) de M. ilicifolia e

amostras, 3, 5, 10, 11, 13, 17, 18, 19 e 20 utilizando o método analítico validado e

adquirido em modo SCAN. ............................................................................................ 66

Figura 25: Cromatograma referentes as amostras 6, 12, 14 e 15 utilizando o método

analítico validado e adquirido em modo SCAN. ............................................................ 66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Preparo da infusão do extrato aquoso conforme farmacopeia Brasileira da

espécie M. Ilicifolia. ....................................................................................................... 22

Tabela 2: Exemplos de trabalhos identificando flavonoides ou taninos nas folhas de

espécies de Maytenus ssp. ........................................................................................... 25

Tabela 3: Recuperação esperada como função da concentração analítica. ................. 32

Tabela 4: Condições para a avaliação da robustez do método. .................................... 34

Tabela 5 - Amostras adquiridas em farmácia de manipulação e feiras para

verificação da espécie e teor de epicatequina............................................................... 37

Tabela 6: Preparo da curva analítica para o efeito de matriz. ....................................... 39

Tabela 7: Preparo da curva analítica para o teste de linearidade. ................................ 39

Tabela 8: Gradiente de eluição do método desenvolvido. ............................................. 40

Tabela 9: Informações sobre m/z (ionização modo negativo), dos prováveis

compostos encontradas nas amostras. ......................................................................... 44

Tabela 10: Resultados das diferentes extrações e pesagens para M. ilicifolia. ............ 47

Tabela 11: Cálculo de efeito de matriz utilizando a equação 1. .................................... 49

Tabela 12: Resultado do teste de paralelismo para a catequina e a epicatequina

utilizando o programa estatístico Action Stat................................................................. 49

Tabela 13: Resultados das respostas analíticas em função da concentração e desvio

padrão relativo (DPR) correspondente. ......................................................................... 51

Tabela 14: Resultado a avaliação da semelhança entre as retas. ................................ 52

Tabela 15: Resultados do teste de Cochran. ................................................................ 53

Tabela 16: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente

angular. ......................................................................................................................... 53

Tabela 17: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente linear. . 54

Tabela 18: Resultados do desvio padrão dos resíduos, coeficiente de determinação

e correlação. .................................................................................................................. 54

Tabela 19: Resultados do teste de normalidade - Shapiro-Wilk. ................................... 56

Tabela 20: Resumo da Análise dos Resíduos para catequina. ..................................... 57

Tabela 21: Resumo da Análise dos Resíduos para epicatequina. ................................ 58

Tabela 22: Resultados do teste de Independência - Durbin- Watson. .......................... 59

Tabela 23: Resumo dos resultados estatísticos obtidos no parâmetro linearidade da

validação. ...................................................................................................................... 60

Tabela 24: Resultado da repetibilidade realizada dia no 05/05/18. ............................... 60

Tabela 25: Resultado da precisão intermediaria realizada dia no 19/05/18. ................. 61

Tabela 26: Resultados da avaliação da precisão intermediária entre dias

empregando ANOVA. .................................................................................................... 61

Tabela 27: Resultados a variação da forma de quantificação. ...................................... 61

Tabela 28: Resultado da recuperação da catequina. .................................................... 62

Tabela 29: Resultado da recuperação da epicatequina. ............................................... 62

Tabela 30: Resultados do limite de detecção e quantificação. ...................................... 63

Tabela 31: Resultados da recuperação do teste de robustez. ...................................... 64

Tabela 32: Resultado do teste de filtro. ......................................................................... 64

Tabela 33: Resultado do teste de tempo de extração. .................................................. 65

Tabela 34: Resultado do teste de estabilidade de soluções. ........................................ 65

Tabela 35: Resultado da análise das amostras controle M. aquifolium e M. ilicifolia

além das amostras das folhas e cápsulas comercializadas como de M. Ilicifolia. ......... 67

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA = Analysis of Variance ou análise da variância

ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC = Association Of Analytical Communities

CA = concentração experimental do analito

CEME = Central de Medicamentos

CG = cromatografia gasosa

CLAE = cromatografia liquida de alta eficiência

CMD = concentração média determinada

CTA = concentração teórica do analito adicionado

CV = coeficiente de variação

DAD = detector Diode Array

DP = desvio padrão

DPR = desvio padrão relativo

ESI = Electrospray Ionization

G.L.= grau de liberdade

HPLC = High Performance Liquid Chromatography

ICH = International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use

INMETRO = Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia

LC-MS = liquid chromatography/mass spectrometry

LD = limite de detecção

LQ = limite de quantificação

m/z = massa/carga

MMQ = método dos mínimos quadrados

MMQO = método dos mínimos quadrados ordinários

MMQP = método dos mínimos quadrados ponderados

MS = espectrometria de massas

pH = potencial hidrogeniônico

PI = precisão intermediaria

PTFE = politetrafluoretileno

RDC = resolução da diretoria colegiada

REP = repetibilidade

RMN = ressonância magnética nuclear

RP = reversed phase

s = desvio padrão

SIM = selected ion monitoring

SUS = sistema único de saude

TIC = Cromatograma de íons totais

TQD = analisador do tipo Triplo Quadrupolo

UHPLC-MS = cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria

de massas

UV = ultravioleta

VIS = visível

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17

1.1 HISTÓRICO DOS PRODUTOS NATURAIS ............................. 17

1.2 ESPINHEIRA SANTA ................................................................ 18

1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA ......................................................... 20

1.4 PREPARO DO EXTRATO ......................................................... 22

1.5 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO .............. 23

1.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ................................... 25

1.6.1 Seletividade ............................................................................. 26

1.6.2 Efeito de Matriz ........................................................................ 26

1.6.3 Linearidade .............................................................................. 27

1.6.4 Faixa de trabalho ..................................................................... 30

1.6.5 Precisão ................................................................................... 30

1.6.6 Exatidão ................................................................................... 31

1.6.7 Limite de Detecção .................................................................. 32

1.6.8 Limite de quantificação ........................................................... 33

1.6.9 Robustez .................................................................................. 33

2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 35

2.1 OBJETIVOS GERAIS ................................................................ 35

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................... 35

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 36

3.1 REAGENTES, GASES E SOLVENTES .................................... 36

3.2 MATERIAIS ............................................................................... 36

3.3 EQUIPAMENTOS ..................................................................... 36

3.4 AMOSTRA DE PLANTAS PREVIAMENTE IDENTIFICADAS ... 36

3.5 AMOSTRA DE FOLHAS E FITOTERÁPICOS ADQUIRIDAS NO

MERCADO ................................................................................................ 37

3.6 PADRÃO ANALÍTICO ............................................................... 38

3.7 PREPAROS DAS SOLUÇÕES ................................................. 38

3.7.1 Preparo das soluções e fases móveis ................................... 38

3.7.2 Preparo da fase móvel ............................................................ 38

3.7.3 Preparo da solução padrão .................................................... 38

3.7.4 Preparo da solução amostra .................................................. 38

3.7.5 Preparo da amostra para o teste de efeito de matriz ........... 39

3.7.6 Preparo da amostra para o teste linearidade ........................ 39

3.8 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPONENTES ............................ 40

3.9 DADOS ESTATÍSTICOS ........................................................... 40

3.10 CONDIÇÕES ANALÍTICAS ....................................................... 40

3.10.1 Condições cromatográficas ................................................... 40

3.10.2 Condições espectrométricas ................................................. 40

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 41

4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO .................... 41

4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES ................................. 44

4.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA ...................................................... 46

4.4 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ................................... 47

4.4.1 Seletividade ............................................................................. 47

4.4.2 Efeito de matriz ........................................................................ 49

4.4.3 Linearidade .............................................................................. 51

4.4.3.1 Avaliação da semelhança das curvas analíticas ....................... 51

4.4.3.2 Avaliação da homocedasticidade .............................................. 52

4.4.3.3 Avaliação dos coeficientes ........................................................ 53

4.4.3.4 Análise dos resíduos ................................................................. 54

4.4.3.5 Avaliação de valores extremos ou aberrantes (outliers) ............ 57

4.4.3.6 Avaliação da independência ...................................................... 58

4.4.4 Precisão ................................................................................... 60

4.4.5 Exatidão ................................................................................... 62

4.4.6 Limite de Detecção e Quantificação ...................................... 63

4.4.7 Faixa de trabalho ..................................................................... 63

4.4.8 Robustez .................................................................................. 63

4.4.8.1 Variação de fluxo, temperatura da coluna, proporção da fase

móvel, lote de coluna. ................................................................................ 63

4.4.8.2 Teste de Filtro ........................................................................... 64

4.4.8.3 Tempo de extração ................................................................... 64

4.4.8.4 Estabilidade de soluções ........................................................... 65

4.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO E VALIDADO .............. 65

5 CONCLUSÃO ............................................................................................ 69

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 70

7 ANEXOS......................................................................................................75

ANEXO A - Declaração de bioética/biossegurança………………..........75

ANEXO B - Declaração de direitos autorais...........................................76

17

1. INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO DOS PRODUTOS NATURAIS

A utilização de produtos naturais, principalmente da flora para fins medicinais,

nasceu com a humanidade. Indícios do uso de plantas medicinais e tóxicas foram

encontrados nas civilizações mais antigas, sendo considerada uma das práticas

mais remotas utilizadas pelo homem para cura, prevenção e tratamento de doenças,

servindo como importante fonte de compostos biologicamente ativos (ANDRADE et

al., 2007).

Nas últimas décadas, tem-se verificado uma tendência mundial de aumento

na demanda por fitoterápicos, sendo influenciada por fatores econômicos, sociais e

culturais. A maior industrialização e comercialização de medicamentos naturais

tornaram seu uso um problema de saúde pública. O aumento da demanda,

associado à falta de fiscalização efetiva, que garanta desde a exploração racional

dos recursos naturais empregados como matéria prima, até chegar ao produto

acabado, contribui para a disponibilidade e acesso a produtos, muitas vezes sem

condições adequadas ao uso, sem garantia da qualidade, segurança e eficiência

fundamentais para recuperação e manutenção da saúde do paciente (BUGNO et al.,

2005).

No Brasil, a fitoterapia é uma opção medicamentosa que se adequa às

necessidades de vários municípios no atendimento primário à saúde (SOUZA-

MOREIRA et al., 2010). De forma geral, os fatores da expansão da fitoterapia

devem-se aos efeitos adversos de fármacos sintéticos, à preferência dos

consumidores por tratamentos "naturais", crescente validação científica das

propriedades farmacológicas de espécies vegetais, desenvolvimento de novos

métodos analíticos para o controle de qualidade, desenvolvimento de novas formas

de preparações e administração dos produtos e relativo baixo custo (CANIGUERAL

et al., 2003; MELO et al., 2007).

No Brasil, técnicos do Ministério da Saúde elaboraram, em 1981, as

"Diretrizes e Prioridades para Investigação em Saúde" este documento incluiu o

estudo de plantas medicinais. Os técnicos da Central de Medicamentos (CEME)

coordenaram, de 1983 a 1996, o Programa de Pesquisa em Plantas Medicinais, que

envolveu 61 espécies em fase de pesquisa. Dentre essas, oito tiveram sua eficácia

18

terapêutica comprovada, inclusive a espinheira-santa, para tratamento de gastrite e

úlcera gástrica (SCHEFFER, 2001).

Desde 2007, o sistema único de saude (SUS) financia medicamentos

fitoterápicos como a espinheira santa e guaco, por exemplo, em apresentações

como cápsula, comprimido e xarope, entre outras. Os produtos integram as listas de

distribuição de medicamentos em 13 Estados (BRANDÃO, 2009).

1.2 ESPINHEIRA SANTA

Espinheira-santa é o nome popular de duas espécies, Maytenus ilicifolia

Martius ex Reissek e Maytenus aquifolium Mart, também conhecidas como

cancorosa, cancerosa, salva-vidas, espinho de Deus e outros. São espécies

medicinais nativas do Brasil, com maior ocorrência no Paraná, Santa Catarina e Rio

Grande do Sul e o seu uso medicinal há registros da década de 20 (SANTOS-

OLIVEIRA et al., 2009; HAIDA et al., 2012).

A M. ilicifolia é encontrada principalmente na região sul do Brasil, no interior

de matas nativas e em matas ciliares, preferindo os solos argilosos, mas bem

drenados e ricos em matéria orgânica. O clima de ideal é subtropical e temperado

(DE MAGALHÃES, 2002).

Várias espécies da família Celastraceae têm sido estudados com respeito à

presença de compostos com atividades biológicas e farmacológicas significativas,

sendo as atividades antitumoral e anti-úlcera consideradas mais promissoras

(ITOKAWA et al., 1991).

M. ilicifolia é descrita como subarbusto ou árvore, ramificado desde a base,

podendo atingir estatura de, no máximo, 5 m de altura. Possuem folhas coriáceas e

brilhantes, com margens providas de espinhos pouco rígidos, limbo com 2,2 a 8,9

cm de comprimento e 1,1 a 3,0 cm de largura, nervuras proeminentes na face

abaxial, de forma elíptica, conforme Figura 1. As suas flores são pequenas e de cor

amarelada, possuem sépalas semicirculares e ciliadas, com pétalas ovais e inteiras,

estames com filetes achatados na base. Os frutos são cápsulas bivalvares,

deiscentes de cor vermelha, contendo 1-4 sementes de cor castanha ou preta

(MARIOT e BARBIERI, 2007; ROSSATO et al., 2013).

19

Figura 1: Imagem da espécie Maytenus ilicifolia (ROSSATO et al., 2013).

Maytenus aquifolium é um arbusto ou árvore podendo atingir estatura de, no

máximo, 12 m de altura. Os ramos novos são glabros, cilíndricos e achatados e as

folhas são cartáceas, glabras, possuindo limbo com 6,0 a 19,0 cm de comprimento e

2,0 a 6,0 cm de largura, forma elíptica ou oblongo-elíptica e margens com muitos

espinhos, como na Figura 2. A inflorescência é em fascículos múltiplos, o fruto é

uma cápsula bivalvar e o pericarpo maduro apresenta cor castanha avermelhada

(CARVALHO-OKANO, 1992; LOPES, 2012).

Figura 2: Imagem de ramo da espécie Maytenus aquifolium (LOPES 2012).

20

1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Vários metabólitos com potenciais propriedades biológicas estão presentes

nos chás de folhas de Maytenus spp, incluindo flavonoides, triterpenos e

sesquiterpenos. Investigações anteriores demonstraram a presença de vários tipos

de flavonol-3-O-glicósidos nas folhas de Maytenus spp, tais como a rutina,

hiperosídeo, e isoquercitrina, e outras estruturas foram caracterizadas como canferol

e quercetina di-, tri, e tetra-glicosídeos (SANNOMIYA et al., 1998; VILEGAS et al.,

1999; LEITE et al., 2001; TIBERTI et al., 2007).

Os flavonoides (Figura 3) são uma classe de compostos amplamente

encontrada em plantas superiores, com uma estrutura baseada em de três anéis (A,

B e C) (JUSTESEN, 2000; STOBIECKI, 2000; ES-SAFI et al., 2005).

Figura 3: Estrutura química de um flavonoide.

Os taninos condensados (Figura 4), que são formados por unidades de

catequina ou epicatequina (Figura 5) unidas entre si por ligações entre o carbono 4

de uma unidade e o carbono 8 de outra unidade, são apontados como constituintes

químicos majoritários em extratos aquosos de M. Ilicifolia (BATTESTIN, 2007).

21

Figura 4: Estrutura química de um tanino condensado.

Figura 5: Estrutura química de catequina (A) e epicatequina (B).

Segundo Leite e colaboradores, em 2010, com a investigação fotoquímica de

um extrato etanólico de folhas de M. ilicifolia foram isolados constituintes que seriam

usados como marcadores químicos para monitorar o fracionamento de um extrato

aquoso liofilizado de folhas de M. ilicifolia. Foram isolados quatro flavonoides,

compreendendo o triglicosídeo flavônico mauritianina, trifolina, hiperina, e

epicatequina (LEITE et al., 2010). Já o fracionamento do extrato aquoso levou a 5

frações, fornecendo um derivado tetra glicosilado de canferol, além do galactitol

(LEITE et al., 2001; BAGGIO et al., 2012).

Em 2007, Baggio e colaboradores relataram as potentes propriedades

gastroprotetoras in vivo de uma fração contendo flavonoides separada das folhas de

22

M. ilicifolia, contendo galactitol (25,0%), epicatequina (3,1%) e catequina (2,0%)

como constituintes principais (BAGGIO et al., 2012).

1.4 PREPARO DO EXTRATO

Um extrato nada mais é que a preparação de consistência líquida, sólida ou

intermediária, obtida a partir de material animal ou vegetal. O material utilizado na

preparação de extratos pode sofrer tratamento preliminar, tais como, inativação de

enzimas, moagem ou desengorduramento (ANVISA, 2011b).

Este pode ser preparado por percolação, maceração ou outro método

adequado e validado, utilizando como solvente álcool etílico, água ou outro solvente

adequado. Após a extração, materiais indesejáveis podem ser eliminados (ANVISA,

2011b).

O processo de infusão é a preparação que consiste em verter água fervente

sobre a droga vegetal e, em seguida, tampar ou abafar o recipiente por tempo

determinado. Método indicado para partes de drogas vegetais de consistência

menos rígida tais como folhas, flores, inflorescências e frutos, ou que contenham

substâncias ativas voláteis (ANVISA, 2011b).

A tintura é a preparação alcoólica ou hidroalcoólica resultante da extração de

drogas vegetais ou animais ou da diluição dos respectivos extratos. É classificada

em simples e composta, conforme preparada com uma ou mais matérias-primas. A

menos que indicado de maneira diferente na monografia individual, 10 mL de tintura

simples correspondem a 1 g de droga seca (ANVISA, 2011b).

O formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira 1ª edição (2011)

preconiza o preparo da infusão conforme Tabela 1 (Extrato aquoso).

Tabela 1: Preparo da infusão do extrato aquoso conforme farmacopeia Brasileira da espécie M. Ilicifolia.

Componentes Quantidade

Folhas secas 3 g Água q.s.p. 150 mL

A Farmacopeia Homeopática Brasileira 3ª edição (2011), descreve o preparo

dos extratos hidroalcoólicos de acordo com a especificação em monografias, caso

não haja monografia deve-se iniciar com o teor alcoólico da extração de 60% (v/v) e

23

ao final da extração deverá ser de 55% (v/v) a 65% (v/v), é preparado da seguinte

forma (ANVISA, 2011a):

Folha, em pó............................................................................100 g

Solução hidroalcoólica..............................................................q.s.p

Para obter............................................................................1000 mL

1.5 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

O acoplamento de técnicas cromatográficas com espectrométricas que funcionam

para detecção, ou técnicas cromatográficas hifenadas, vem sendo mais uma

importante ferramenta para a identificação dos constituintes das plantas e análise de

sua qualidade. No acoplamento destas técnicas, faz-se uso de métodos eficientes

de separação, como cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC do

Inglês High Performance Liquid Chromatography) e cromatografia gasosa (CG), e as

técnicas espectrométricas mais usadas são: espectrofotometria de UV-Visível

(DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e ressonância magnética nuclear

(RMN), fornecendo informações adicionais sobre a estrutura química dos

componentes da amostra (SOUZA-MOREIRA et al., 2010).

A espectrometria de massas (MS) tem sido aplicada com sucesso na

elucidação das estruturas de vários flavonoides glicosilados (SHAHAT et al., 2005;

PARK et al., 2007; TIBERTI et al., 2007). Os melhores resultados são geralmente

obtidos em combinação com técnicas cromatográficas, superando as dificuldades

em identificar isômeros em matrizes complexas. (DOMON e COSTELLO, 1988).

Outra vantagem do acoplamento com espectrometria de massas é que

apresenta alta seletividade (permitindo até a quantificação de picos sobrepostos),

baixo limite de detecção, avaliação da pureza de pico, confirmação da presença de

analitos mediante as informações de massa molar e de estrutura química, sendo

esta uma característica importante para o objetivo de avaliação dos componentes

das espécies de Maytenus ssp (JARDIM et al., 2006).

A técnica de MS-MS, ao invés de utilizar apenas um analisador de massas

para separar os íons de mesma razão massa/carga (m/z) gerados na fonte de

ionização, usa dois estágios de espectrometria de massas (MS1 e MS2), em que um

deles isola o íon de interesse, que é dissociado em uma cela de colisão (CID), e o

24

outro MS estabelece uma relação entre este íon de interesse isolado (precursor) e

outros íons que foram gerados a partir do CID (produtos). Esta técnica é

amplamente empregada na detecção de compostos presentes em baixas

concentrações em matrizes complexas, acoplada à cromatografia, uma vez que

possibilita um aumento na detecção e reduz a interferência espectral de compostos

presentes na matriz, além de aumentar a quantidade de informação estrutural

(CHIARADIA et al., 2008).

O MS-MS pode ser utilizado em várias técnicas de varredura para se realizar

a análise, tais como a varredura dos íons produtos (product-ion scan), varredura dos

íons precursores (precursor-ion scan), varredura da constante da perda de íons

neutros (constant-neutral-loss scan) e o monitoramento seletivo de reação (selected-

reaction monitoring) (KITTERINGHAM et al., 2009).

Devido às características estruturais dos compostos polifenólicos encontrados

em extratos de espécies de Maytenus ssp, a maioria dos procedimentos descritos na

literatura para a sua análise baseiam-se em CLAE-FR (cromatografia líquida de alta

eficiência de fase reversa). Recentemente, no entanto, um procedimento de

cromatografia líquida (CL) bidimensional (por exclusão de tamanho de fase reversa)

acoplado à MS foi empregado para a análise de flavonoides glicosilados de folhas

de M. ilicifolia (DE SOUZA et al., 2009).

Na Farmacopeia Brasileira 5° edição volume II consta a quantificação de

epicatequina em extrato hidroalcoólico através de CLAE, utilizando um detector

ultravioleta com comprimento de onda fixo em 210 nm, coluna de 250 mm de

comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, empacotada com C18 (5 µm); vazão da

fase móvel de 0,8 mL/minuto e o modo de eluição gradiente. Na Tabela 2

apresentam-se os métodos cromatográficos encontrados na literatura para

identificação/quantificação dos componentes das folhas de espécies de Maytenus

ssp (ANVISA, 2010).

25

Tabela 2: Exemplos de trabalhos identificando flavonoides ou taninos nas folhas de espécies de Maytenus ssp.

Objetivos Extração Coluna

cromatográfica Modo de eluição

Tempo de corrida

Detecção Referência

Análise de isômero de

Flavonol glicosilado

Aquoso* Supelco LC18,

250mm×4.6m (4µm)

Gradiente 25 MS

(DE SOUZA, CIPRIANI,

SERRATO, et al., 2008)

Validação de Catequina e Epicatequina

Aquoso ANova-Pak C18

150mm × 3,9mm

Gradiente 30 UV (SOARES et

al., 2004)

Análise de Flavonóides e Taninos

Aquoso*

Synergy Fusion C18,

250mm×4.6 mm

Isocrático 23 MS

(DE SOUZA, CIPRIANI,

IACOMINI, et al., 2008)

Identificação de

Flavonóides Hidroalcoólico

Symmetry C18 250nm x 4,6mm

(5µm) Gradiente 30 UV

(TIBERTI et al., 2007)

Identificação de


Supelcosil C18 e C8 250nm x

4,6mm (5µm) Gradiente 20/50 MS

(DIAGONE et al., 2012)

Identificação de


Supelco C8 250nm x 4,6mm

(5µm) Gradiente 20 UV

(YARIWAKE et al., 2005)

* Após a extração aquosa houve outras extrações para a limpeza das amostras, antes de injetar no HPLC

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) aprovou o uso e venda

de medicamentos fitoterápicos de M. ilicifolia, que são padronizadas pelo seu

conteúdo de tanino para o tratamento de distúrbios gástricos. Muitas empresas

farmacêuticas brasileiras produzem fitofármacos que contêm esta substancia. A

disponibilidade de métodos de ensaio validado é importante para o controle de

qualidade deste produto, e tais ensaios de qualidade são solicitados pelas as

autoridades de saúde brasileiras para o registro de medicamentos fitoterápicos

(LOPES et al., 2010).

1.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

Para permitir a avaliação qualitativa ou quantitativa de matérias-primas, do

produto em etapas do processo produtivo ou do produto acabado, é necessário o

desenvolvimento de métodos analíticos, bem como sua validação. A validação de

metodologia é a etapa final do processo de desenvolvimento de um método

analítico, neste momento ele é desafiado. O resultado final é a demonstração de que

o método é adequado para o uso pretendido, seja para a determinação qualitativa,

26

semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em insumos

farmacêuticos (BITTENCOURT, 2015).

Atualmente existe uma resolução da diretoria colegiada (RDC) nº 166, de 24

de julho de 2017, da ANVISA, que define a validação como: “a avaliação sistemática

de um procedimento por meio de estudos experimentais de modo a confirmar e

fornecer evidências objetivas de que os requisitos específicos para seu uso

pretendido são atendidos. A validação deve demonstrar que o método analítico

produz resultados confiáveis e é adequado à finalidade a que se destina, de forma

documentada e mediante critérios objetivos” (ANVISA, 2017b).

Conforme parâmetros e critérios de aceitação estabelecidos pela ANVISA na

RDC nº 166, de 24 de junho de 2017, foram utilizados os parâmetros para método

bioanalítico e na validação serão analisados: seletividade, linearidade, precisão,

precisão intermediária, exatidão e robustez. Além dos parâmetros acima, também

foram realizados as determinações dos valores de limite de detecção e limite de

quantificação (ANVISA, 2017b).

1.6.1 Seletividade

A seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio da sua

capacidade de identificar ou quantificar o analito de interesse, inequivocamente, na

presença de componentes que podem estar presentes na amostra, como impurezas,

diluentes e componentes da matriz (ANVISA, 2017b).

1.6.2 Efeito de Matriz

Efeito de matriz é um estudo de seletividade que objetiva averiguar possíveis

interferências causadas pelas substâncias que compõem a matriz amostral gerando,

basicamente, fenômenos de diminuição ou aumento do sinal ou resposta

instrumental (FENG et al., 2015).

O efeito matriz pode ser mensurado por meio da Equação 1:

Equação 1

27

O paralelismo das retas é outro indicativo de ausência de interferência dos

constituintes da matriz e a sua demonstração deve ser realizada por meio de

avaliação estatística adequada, conforme RDC 166/17.

1.6.3 Linearidade

A linearidade compreende a correlação entre a resposta do método e a

concentração ou quantidade de analito, cujo comportamento deve ser descrito por

uma equação linear. É citada como a habilidade do método analítico de produzir

resultados que são diretamente, ou por uma transformação matemática bem

definida, proporcionais à concentração do analito dentro de uma faixa especificada

(INMETRO, 2010).

Existem diferentes cálculos para os coeficientes podendo ser empregando o

método dos mínimos quadrados o qual estabelece a reta de regressão que permite

obter os coeficientes linear (a) e angular (b). Também é possível calcular, a partir

dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação (r) ou de determinação (r2), os

quais permitem uma estimativa da qualidade do ajuste da curva obtida, pois quanto

mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e a

incerteza dos coeficientes de regressão estimados (ANVISA, 2003; BITTENCOURT,

2015).

Outro critério para testar a linearidade do método, é que o valor de b deve

estar próximo de zero (HARRIS, 2001) e, caso haja um valor significativamente

diferente de zero, deve ser demonstrado que não há nenhum efeito sobre a exatidão

do método (DUTRA, 2013).

Outro fator importante é o cálculo do teste F de significância da regressão

linear, sendo que, o valor do F crítico deve ser menor que o de F calculado, o que

indica a significância da regressão. Já a análise do gráfico dos resíduos permite

detectar problemas no ajuste da curva como, por exemplo, desvios de linearidade,

heterocedasticidade, pontos anômalos, parâmetros utilizados para investigar a

adequabilidade de um modelo de regressão linear, onde as suposições do modelo

ajustado precisam ser validadas para que os resultados sejam confiáveis (RIBEIRO

et al., 2008).

28

A homocedasticidade é, na maioria das vezes, um requisito necessário para a

análise de variância (ANOVA). Sob heterogeneidade de variância, o método dos

mínimos quadrados ordinários não produz os melhores estimadores e o teste F, as

comparações múltiplas, os contrastes ortogonais, ou a estimação dos componentes

de variância poderão ser fortemente afetados. Isto é, dependendo do grau de

severidade da heterogeneidade das variâncias, a análise de variância pode ter sua

significância estatística comprometida (RIBOLDI et al., 2014).

Para resumir todas as etapas estatísticas o guia de estatística n°10 de 2017

apresenta o fluxograma, mostrado na Figura 6.

29

Figura 6: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da ANVISA (ANVISA, 2017a).

Não

Não

Não

Sim

Sim

Sim

INÍCIO

Avaliação Visual

É VISIVELMENTE

LINEAR?

Tratamento

matemático dos

dados para adaptação

do modelo

Avaliação das

Variâncias (teste de

hipóteses)

É HOMOCEDÁSTICO?

Heterocedástico

(MMQP)

Homorocedástico

(MMQO)

Anova e correlação

(MMQP) Anova e correlação

(MMQO)

Valor de r e teste F

Análise de resíduos

Os requisitos da

resolução foram

atendidos?

Linearidade Não

comprovada – Método não pode ser

aceito

Linearidade

comprovada

FIM FIM

30

1.6.4 Faixa de trabalho

A faixa de trabalho deve ser estabelecida a partir dos estudos de linearidade,

juntamente com os resultados de precisão e exatidão, sendo dependente da

aplicação pretendida (ANVISA, 2017b).

1.6.5 Precisão

A precisão deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos por meio de

ensaios com amostras preparadas conforme descrito no método analítico a ser

validado. A precisão deve ser expressa por meio da repetibilidade, da precisão

intermediária ou da reprodutibilidade. A precisão deve ser demonstrada pela

dispersão dos resultados, o valor do DPR não deve ser superior a 5% para

metodologias analíticas e 15% para bioanalíticas (INMETRO, 2010; ANVISA,

2017b). Calculando-se o desvio padrão relativo (DPR) da série de medições

conforme a Equação 2:

Equação 2

Onde que DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

Segundo Ribani e colaboradores, para a repetibilidade, o INMETRO

recomenda sete ou mais repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão

(RIBANI et al., 2004). O guia ICH3 e a ANVISA sugerem utilizar, no mínimo, 9 (nove)

determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3 (três)

concentrações: baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas em cada nível ou 6 (seis)

réplicas a 100% (cem por cento) da concentração do teste individualmente

preparadas (ICH, 2005).

Os três modos mais comuns de representar a precisão são repetibilidade,

precisão intermediária e reprodutibilidade, onde a repetibilidade é a concordância

entre os resultados de um curto período de tempo com o mesmo analista e a mesma

instrumentação e cada análise é independente, de modo que a repetibilidade do

ensaio revela o quão reprodutível o método pode ser. Já a precisão intermediária é a

31

concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias, com

analistas e/ou equipamentos diferentes (INMETRO, 2010).

A determinação da precisão intermediária é recomendada um mínimo de dois

dias diferentes, com analistas diferentes. Reprodutibilidade é a concordância entre

os resultados obtidos em laboratórios e por analistas diferentes como em estudos

colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica,

embora a reprodutibilidade não seja um componente de validação de método

executado por um único laboratório, é considerada importante quando busca-se a

verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação

obtidos através de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2010; ANVISA, 2017b).

1.6.6 Exatidão

A exatidão de um método analítico deve ser medida por meio do grau de

concordância entre os resultados individuais do método em estudo em relação a um

valor aceito como verdadeiro. A exatidão deve ser verificada a partir de, no mínimo,

9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou

seja, 3 (três) concentrações: baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas em cada nível

(ANVISA, 2017b).

A exatidão deve ser expressa pela relação percentual de recuperação do

analito de concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a

concentração média, determinada experimentalmente, e a concentração teórica

correspondente, dada pelas Equações 3 e 4, conforme RDC 166/17:

Equação 3

Equação 4

Onde: CA é a concentração experimental do analito e CTA é a concentração

teórica do analito adicionado.

32

A especificação pode variar conforme a concentração do analito na amostra,

conforme a Tabela 3 transcrita do guia da AOAC (Association of Analytical

Communities) (AOAC, 2016).

Tabela 3: Recuperação esperada como função da concentração analítica.

1.6.7 Limite de Detecção

O limite de detecção é a menor quantidade da substância presente em uma

amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificado, sob as

condições experimentais estabelecidas (ICH, 2005).

A determinação do limite de detecção pode ser realizada por meio de método

visual, da razão sinal-ruído, baseado na determinação do branco ou em parâmetros

da curva de calibração, considerando-se as particularidades do método analítico

utilizado (ANVISA, 2017b).

O limite de detecção é calculado com base na regressão da curva de

calibração segundo o descrito no guia do ICH Q2 (R1) e RDC 166/17 utilizando a

Equação 5:

Equação 5

LD é o limite de detecção, s é o desvio padrão do intercepto e S é o

coeficiente angular da curva, onde a partir do desvio padrão do intercepto com o

eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações

do analito próximas ao suposto limite de detecção (ICH, 2005; ANVISA, 2017b).

33

1.6.8 Limite de quantificação

O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra

que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições

experimentais estabelecidas. Devem ser testadas precisão e exatidão nas

concentrações correspondentes ao limite de quantificação (ANVISA, 2017b).

O limite de quantificação é calculado com base na regressão da curva de

calibração segundo o descrito no guia do ICH Q2 (R1) e RDC 166/17 utilizando a

seguinte Equação 6:

Equação 6

LQ é o limite de quantificação, s é o desvio padrão do intercepto e S é o

coeficiente angular da curva, onde a partir do desvio padrão do intercepto com o

eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações

do analito próximas ao suposto limite de detecção (ICH, 2005; ANVISA, 2017b).

1.6.9 Robustez

A robustez é um parâmetro que indica a capacidade do método em resistir a

pequenas e deliberadas variações das condições analíticas (ANVISA, 2017b). Tal

capacidade deve ser investigada na etapa de desenvolvimento. Com os dados

obtidos dos efeitos destes parâmetros nos resultados, pode-se delimitar a faixa

aceitável de valores a ser incluída no método final (HARRIS, 2001; INMETRO, 2010;

ANVISA, 2017b).

No caso de análises realizadas por CLAE, alguns dos itens avaliados são a

variação do pH da fase móvel, variação da composição da fase móvel, variação da

temperatura, do fluxo, temperatura da coluna, volume de injeção, variação dos

fabricantes de equipamentos e colunas cromatográficas (HARRIS, 2001).

Demais parâmetros estão descritos na Tabela 4, conforme a RDC 166/17.

34

Tabela 4: Condições para a avaliação da robustez do método.

Parâmetros a serem modificados

Preparo das Amostras Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Compatibilidade de filtros

Espectrofotometria Variação do pH da solução Diferentes lotes ou fabricantes de solventes

Cromatografia Líquida Variação do pH da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel

Cromatografia Gasosa Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Velocidade do gás de arraste

Outras técnicas analíticas As variações a serem testadas deverão ser avaliadas criticamente e seus resultados deverão ser apresentados

35

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico por

UHPLC-MS para quantificar catequina e epicatequina encontrados nos extratos de

M. ilicifolia e M. aquifolium, diferenciar a composição química das duas espécies e

aplica-lo a amostras comerciais.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver um método analítico utilizando cromatografia líquida de ultra-alta

eficiência acoplada a espectrometria de massas adequado para avaliar os principais

componentes encontrados nos extratos das folhas de Maytenus ssp, a fim de

identificar marcadores químicos para diferenciação de cada espécie.

Avaliar os extratos aquosos e hidroalcoólicos e verificar os componentes e a

recuperação dos mesmos, para definir o melhor método de extração.

Acompanhar o perfil cromatográfico dos extratos, procurando identificar os

principais compostos por comparação dos seus espectros de massas com padrões

ou dados de literatura.

Validar o método analítico para quantificação de catequina e epicatequina das

folhas Maytenus ssp, conforme os parâmetros conforme RDC 166/17.

Analisar amostras comerciais com o objetivo de verificar se correspondem ao

padrão esperado de M. ilicifolia ou M. aquifolium, e determinar sua concentração de

catequina e epicatequina aplicando o critério de aceitação de teor de epicatequina

descrito na monografia da planta.

36

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 REAGENTES, GASES E SOLVENTES

Acetonitrila – Merck®;

Metanol – Merck®;

Ácido fórmico – Labsynth®;

Hidróxido de amônia – Labsynth®;

Água ultrapura – MilliPore®;

Gás nitrogênio – Peak®.

3.2 MATERIAIS

Vidrarias de laboratório;

Frascos de vidro âmbar de 5 mL;

Filtros de seringa de 22 µm em PTFE;

Micropipetas com capacidades de 10 μL, 200 μL, 1000 μL;

Balão volumétrico de 5 mL e 10 mL.

3.3 EQUIPAMENTOS

UHPLC-MS (TQD) Acquity - Waters Corporation®;

Balança analítica – Marte;

Centrifuga – Thermo Scientic®;

Ultrassom - MaxLabor®;

Freezer- Thermo Scientic®.

3.4 AMOSTRA DE PLANTAS PREVIAMENTE IDENTIFICADAS

Foram utilizadas folhas de Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss, Maytenus

aquifolium Mart. e indivíduos híbridos derivados do cruzamento de ambas as

espécies, localizadas no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e

Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em Paulínia

(SP).

37

Logo após a coleta as folhas foram congeladas e mantidas em freezer a -80ºC

e depois liofilizadas.

3.5 AMOSTRA DE FOLHAS E FITOTERÁPICOS ADQUIRIDAS NO MERCADO

Foram adquiridas amostras em farmácia de manipulação e em feiras, sendo

também compradas em forma de folhas secas e cápsulas para a verificação da

espécie e teor de epicatequina. Na Tabela 5 constam a origem, marca, cidade e

validade dessas amostras, todas analisadas em 2018.

Tabela 5 - Amostras adquiridas em farmácia de manipulação e feiras para verificação da espécie e teor de epicatequina.

Amostra Origem Marca Cidade Validade

1 – M. ilicifolia (Controle) CPQBA - Campinas -

2 – M. aquifolium (Controle) CPQBA - Campinas - 3 – Folha Feira em granel Mercado municipal Lindóia -

4 – Folha Feira em granel Mercado municipal Jacareí - 5 – Folha Feira em granel Mercado municipal Jacareí - 6 – Folha Feira em granel Mercado municipal Araraquara - 7 – Folha Feira em granel Mercado municipal Itapira - 8 – Folha Feira em granel Mercado municipal Itapira -

9 – Folha Farmácia de manipulação

Botica São José do Rio

Pardo 02/2019


Natural florien Itapira 02/2019

11– Folha Farmácia de manipulação

Flor do Campo Itapira 04/2019


Kodilan Itapira 04/2019


Chamomilla Itapira 02/2019


Hibisco São José do Rio

Pardo 03/2019


Casa das ervas São Francisco

Araraquara 11/2020


Natural fórmula São José do Rio

Pardo 03/2019


Produtos da roça Araraquara 05/2019

18 – Cápsula Farmácia de manipulação

Chamomilla Itapira 03/2019

19 – Cápsula Farmácia de manipulação

Bioform Nsa Atibaia 07/2019

20 – Cápsula Fitoterápico

industrial Apis Flora Ribeirão Preto 06/2020

38

3.6 PADRÃO ANALÍTICO

(+/-) Catequina – Sigma-Aldrich®;

(-) Epicatequina - Sigma-Aldrich®.

3.7 PREPAROS DAS SOLUÇÕES

3.7.1 Preparo das soluções e fases móveis

As soluções amostra, soluções padrão e fases móveis foram preparadas

conforme procedimentos compatíveis com a técnica de UHPLC-MS.

3.7.2 Preparo da fase móvel

Transferiu-se 1 mL de ácido fórmico em 1000 mL de água ultrapura Fase (A)

e solventes grau HPLC (Acetonitrila).

3.7.3 Preparo da solução padrão

Foram preparadas soluções estoques de catequina e epicatequina nas

concentrações de 1 mg/mL em metanol. Logo após foram transferidas 10 µL destas

soluções e diluídas com água para um balão 10 mL contendo concentração final de

1µg/mL.

3.7.4 Preparo da solução amostra

Solução amostra (folhas): foram pesados 20 mg de folhas liofilizadas para 10

mL de água ultrapura, com maceração assistida por ultrassom por 15 minutos. Após

o término foi filtrada e transferida 5 mL da amostra para um balão de 10 mL e

completado com água ultrapura.

Solução amostra (cápsulas): foi realizado o peso médio com 10 cápsulas,

calculado e pesado a quantidade equivalente a 20 mg de folhas liofilizadas para 10

mL de água ultrapura, com maceração assistida por ultrassom por 15 minutos. Após

o término foi filtrada e transferida 5 mL da amostra para um balão de 10 mL e

completado com água ultrapura.

39

3.7.5 Preparo da amostra para o teste de efeito de matriz

A técnica de adição de padrão na amostra foi utilizada para a determinação

do efeito de matriz, onde foram preparados sete concentrações diferentes dentro da

faixa de trabalho de 0,1 µg/mL até 2,0 µg/mL de duas soluções-estoque, solução

estoque (1) de 50 µg/mL de catequina e epicatequina e solução estoque (2)

contendo ambos analitos na concentração de 2,5 µg/mL. A solução amostra foi

preparada conforme descrito no item 3.7.4 e o volume final foi completado com água

ultrapura. A Tabela 6 demonstra as diluições realizadas na construção da curva

analítica.

Tabela 6: Preparo da curva analítica para o efeito de matriz.

Concentração (µg/mL)

Solução utilizada (padrão)

Aliquota (µL)

Solução Amostra

(µL)

Volume final (µL)

2,0 Estoque 1 40 500 1000 1,5 Estoque 1 30 500 1000 1,0 Estoque 1 20 500 1000 0,5 Estoque 1 10 500 1000 0,25 Estoque 2 100 500 1000 0,10 Estoque 2 40 500 1000 0,00 0 0 500 1000

3.7.6 Preparo da amostra para o teste linearidade

O teste de linearidade foi preparado utilizando seis concentrações diferentes

dentro da faixa de trabalho de 0,1 µg/mL até 2,0 µg/mL de duas soluções estoques,

solução estoque (1) de 50 µg/mL de catequina e epicatequina e solução estoque (2)

contendo ambos analitos na concentração de 2,5 µg/mL. A Tabela 7 demonstra as

diluições realizadas na construção da curva analítica utilizando água como solvente:

Tabela 7: Preparo da curva analítica para o teste de linearidade.


Solução utilizada Alíquota (µL) Volume final (µL)

2,0 Estoque 1 40 1000 1,5 Estoque 1 30 1000 1,0 Estoque 1 20 1000 0,5 Estoque 1 10 1000 0,25 Estoque 2 100 1000 0,10 Estoque 2 40 1000

40

3.8 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPONENTES

Os componentes do extrato das folhas de Maytenus ssp foram caracterizados

através do perfil cromatográfico dos extratos e da comparação dos seus espectros

de massas com padrões ou dados da literatura.

3.9 DADOS ESTATÍSTICOS

Foram utilizados o suplemento de ferramentas de análise do Excel e Action

Stat versão 3.

3.10 CONDIÇÕES ANALÍTICAS

3.10.1 Condições cromatográficas

As condições definidas foram: temperatura do forno em 30°C, temperatura do

amostrador 10°C, coluna C18 BEH Acquity Waters® (1,7 µm x 2,1 mm x 50 mm),

fluxo de 0,2 mL/min e o gradiente de eluição conforme Tabela 8.

Tabela 8: Gradiente de eluição do método desenvolvido.

Tempo (min) Fluxo

(mL/min) Fase Móvel A

água acidificada (%) Fase Móvel B

acetonitrila (%)

Inicial 0,2 95 05 4,00 0,2 75 25 6,10 0,2 50 50 6,20 0,2 05 95 8,50 0,2 05 95 8,51 0,2 95 05

10,00 0,2 95 05

3.10.2 Condições espectrométricas

A aquisição dos espectros em modo full scan (m/z 100 a 1500) e SIM (m/z

289), com ionização por eletrospray modo negativo (ESI-) e analisador do tipo Triplo

Quadrupolo (TQD), com temperatura do capilar mantido à 150°C e do gás de

secagem a 250°C, voltagem do capilar a 4,00 kV e voltagem do cone a 25 V.

41

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO

Foram preparados inicialmente extratos de folhas de M. aquifolium, M. ilicifolia

e plantas híbridas usando as proporções indicadas na Farmacopeia Brasileira de

Fitoterápicos: 200 mg de folha em 10 mL de água em temperatura ambiente e 30

minutos no ultrassom. Os extratos foram injetados no espectrômetro de massas

diretamente através da técnica de fingerprint, com o objetivo de um conhecimento

prévio da composição dos mesmos.

O principal modo para separação de compostos orgânicos por LC-MS é a

fase reversa com ou sem o uso de par iônico. Devido à robustez e facilidade no

desenvolvimento do método, a cromatografia líquida em fase reversa cobre mais de

95% das aplicações (MALIK et al., 2010). Portanto, o ponto inicial para o

desenvolvimento do método analítico foi a decisão pelo uso do modo fase reversa

no UHPLC-MS, onde foi utilizada uma coluna C18. Os solventes mais comumente

empregados como fase móvel em LC-MS no modo fase reversa são água, metanol e

acetonitrila, com eluição por gradiente. Os tampões utilizados como fase móvel

devem ser voláteis para evitar problemas na interface com o espectrômetro de

massas, sendo assim, os mais comuns são: ácido acético, ácido fórmico, acetato de

amônio, formiato de amônio e amônia.

A composição da fase móvel é de suma importância para obter uma boa

separação, além de influenciar na ionização dos analitos e na detectabilidade do

espectrômetro de massas. A quantidade do modificador orgânico pode ou não

favorecer a eficiência de ionização, dependendo da interface utilizada (MALIK et al.,

2010).

Inicialmente foi utilizada água acidificada (0,1% de ácido fórmico) e

acetonitrila com eluição por gradiente, onde a proporção inicial foi de 90% aquoso

até 8 minutos com 100% orgânico, porém não houve separação dos isômeros:

catequina e epicatequina (Figura 7). Foram avaliados diversos gradientes, a fim de

melhorar a separação da catequina e epicatequina. Estes isômeros de posição

possuem a mesma massa carga (m/z), sendo assim necessária a separação

cromatográfica destes componentes antes da espectrometria de massas.

42

Uma boa resolução entre os picos é de suma importância para uma boa

integração dos picos, além disso, a simetria é outro parâmetro importante para a

quantificação dos componentes. Nas Figuras 7, 8 e 9 apresentam-se alguns

exemplos das corridas cromatográficas obtidas durante o desenvolvimento do

método analítico.

Na Figura 9 é demonstrado o cromatograma na condição desenvolvida, com

uma boa resolução entre os picos de interesse, sendo que catequina possui um

tempo de retenção de 2,77 minutos e a epicatequina 3,29 minutos.

Figura 7: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da ANVISA (ANVISA, 2017a).

Figura 8: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo durante o desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme apresentado na tabela.

43

Figura 9: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo na condição no final do desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme apresentado na tabela. (A) Pico cromatográfico referente a catequina e (B) Pico cromatográfico referente a epicatequina.

A eficiência do processo de ionização por eletrospray (ESI do inglês,

Electrospray Ionization) depende da condutividade e da tensão superficial do líquido

a ser nebulizado. Devido a tensão superficial da água ser maior que a do metanol ou

da acetonitrila, a detecção é reduzida quando se utiliza quantidades superiores a 70-

80% de água na fase móvel. A relação entre a quantidade de solvente orgânico e

água é mais significante quando se trabalha em vazões maiores, pois maior

quantidade de solvente deve ser nebulizada e evaporada. A adição de modificadores

de pH, como ácido acético, ácido fórmico ou hidróxido de amônio exerce grande

influência na separação e ionização dos analitos. (MALIK et al., 2010).

A ionização por ESI pode ser feita pelo modo positivo ou negativo, foram

avaliados ambos os modos, porém o modo negativo apresentou melhores

resultados, ou seja, com maior ionização dos componentes e resultados mais

reprodutivos. Niero e Andrade (2010) descreveram que a gênero Maytenus é

composta por flavonoides e compostos fenólicos que são mais ionizados em modo

negativo (NIERO et al., 2011).

Após a definição da eluição do gradiente, foram avaliados os solventes

acetonitrila e metanol para fase orgânica, água acidificada (0,1% ac. fórmico) e água

basificada (0,1% de hidróxido de amônio) para fase aquosa. Os resultados obtidos

mostraram que o uso de água basificada diminuiu a resolução dos picos

cromatográficos. Em relação ao solvente orgânico não houve diferença, sendo

assim escolheu-se a utilização da acetonitrila, pois segundo Brito (2014), acetonitrila

apresenta menor viscosidade em relação ao metanol e isso reduz a pressão do

sistema e aumenta a vida útil da coluna (BRITO, 2014), sendo assim a corrida

cromatográfica ficou definida com a eluição do gradiente conforme Tabela 8.

44

4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES

Na Tabela 9 constam os valores de m/z de sete compostos sendo que cinco

foram identificados de acordo com dados encontrados na literatura e dois foram

confirmados em comparação com padrões que são os íons de m/z 289.

Tabela 9: Informações sobre m/z (ionização modo negativo), dos prováveis compostos encontradas nas amostras.

Substância (m/z) M. ilicifolia M. aquifolium Híbrido

Catequina (289) X - X Epicatequina (289) X X X

Epigalocatequina (305) X X X Isoquercitina (463) X - X Quercitrina (477) X - X

Quercitrina-di-(ramnohexosídeo) (917) - X X Canferol-di-(ramnohexosídeo) (901) - X X

Existem componentes que diferem entre as espécies, como por exemplo,

catequina, isoquercitina e quercetina que não estão presentes na M. aquifolium, ou

abaixo do limite de detecção. Além da diferença apresentada em relação à

catequinas e epicatequina, existem outros íons detectados, porém não identificados.

Os componentes encontrados nas duas espécies e seus híbridos apresentam

concentrações diferentes entre si. Tal fato é de suma importante uma vez que se

preconiza o uso de M. ilicifolia no Formulário de Fitoterápicos (2011).

Alguns exemplos de cromatogramas duas espécies e seus híbridos (Figuras

10, 11 e 12) demonstrando alguns íons que se diferem entre o extrato de amostras

botanicamente identificadas de M. ilicifolia e M. aquifolium e a híbrida possuindo

ambos componentes.

45

Figura 10: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. Ilicifolia sendo A- íon extraído de m/z 755, B - íon extraído de m/z 289, C- íon extraído de m/z 305, D. Cromatograma de íons totais (TIC).

Figura 11: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. aquifolium sendo A: íon extraído de m/z 901, B: íon extraído de m/z 917, C: íon extraído de m/z 289, D: Cromatograma de íons totais (TIC).

46

Figura 12: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de Maytenus ssp (híbrida) sendo A: íon extraído de m/z 917, B: íon extraído de m/z 289, C: Cromatograma de íons totais (TIC).

AM Hibrida CPQ-BA

Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

Amostra 10_1 2: Scan ES- 917

1.25e6

3.49

3.272.780.63 2.37

3.789.974.13

Amostra 10_1 2: Scan ES- 289

7.43e6

3.30

2.790.890.59

3.37

Amostra 10_1 2: Scan ES- BPI

7.50e6

0.68

0.63

3.300.85

0.97

1.00

3.002.822.09

1.71

9.058.87

7.677.573.72

7.21

3.78

6.655.093.906.26

7.97

9.32

9.45

9.62

4.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA

Inicialmente foram preparados extratos aquosos (temperatura ambiente e

37°C) e hidroalcoólicos (50% e 70%) na proporção estabelecida no Formulário de

Fitoterápicos, onde foram pesados 200 mg das folhas de Maytenus ssp em 10 mL

de líquido extrator. Porém foi verificado que os extratos ficaram muito concentrados,

saturando o solvente extrator e havendo a necessidade de várias extrações

subsequentes por causa da dificuldade de recuperação dos componentes do extrato.

Como a concentração dos componentes eram desconhecidos foram utilizados

cálculos a partir das áreas de cada substância por extração e dividida pela somatória

de suas áreas até esgotamento da mesma do extrato, com isso houve possibilidade

de calcular a eficiência da extração em relação a recuperação das áreas.

Após vários ensaios foi determinada a proporção de 20 mg das folhas secas

das plantas para 10 mL de líquido extrator e 30 minutos no ultrassom, havendo a

necessidade somente de 1 extração, resultando em uma recuperação média

superior à 95%, tanto para extratos aquosos como hidroalcoólicos.

C

A

B

47

A Tabela 10 resume os testes realizados para a adequação da extração para

alguns componentes:

Tabela 10: Resultados das diferentes extrações e pesagens para M. ilicifolia.

Maytenus ilicifolia

Preparação da amostra

200 mg/10 mL 30 mg/10 mL 20 mg/10 mL

Aquoso 2

5°C

Aquoso 3

7°C

hid

roalc

óolic

o

50%

hid

roalc

óolic

o

70%

Aquoso 2

5°C

Aquoso 3

7°C

hid

roalc

óolic

o

50%

hid

roalc

óolic

o

70%

Aquoso 2

5°C

Aquoso 3

7°C

hid

roalc

óolic

o

50%

hid

roalc

óolic

o

70%

Recuperação Extração 1(%)

50,7 52,1 53,2 55,8 79,8 78,1 80,4 82,1 97,8 97,2 98,8 97,0


80,7 80,9 75,6 78,9 94,6 95,3 95,9 94,7 99,4 99,2 99,1 98,9


90,1 92,0 92,5 92,7 98,1 98,2 99,4 97,8 - - - -

Os extratos aquosos (temperatura ambiente e 37°C) e hidroalcoólicos (50% e

70%) apresentaram semelhança no perfil de componentes no extrato, portanto foi

definida como o líquido extrator a água em temperatura ambiente, pois além de ser

um preparo mais simples apresentou melhora na simetria e resolução dos picos dos

isômeros (catequina e epicatequina) em relação aos hidroalcoólicos, conforme

Figura 13.

Figura 13: (A): Cromatograma dos extratos aquoso e (B) hidroalcoólico.

4.4 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

4.4.1 Seletividade

A

B

48

Conforme mencionado existem quatro maneiras de aquisição de dados com

LC-MS/MS. Neste trabalho foi conduzido com apenas o modo MS, pois a catequina

e a epicatequina não apresentaram uma fragmentação que possibilitasse a

utilização do monitoramento seletivo de reação (selected-reaction monitoring). Foi

utilizado o modo SCAN (100 – 1500 m/z) e o modo SIM, onde na mesma corrida

tem-se o perfil completo do extrato e também a extração do íon m/z 289 onde são

eliminadas quaisquer interferências da matriz (Figura 14).

Figura 14: (A) Cromatograma UHPLC-MS em modo SCAN e (B) em modo SIM selecionado o íon m/z 289 da amostra M. ilicifolia. AM - Lindoia

Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

0

100

Amostra 3_1 2: Scan ES- TIC

7.43e7

9.50

7.670.70

7.223.82

3.302.83 6.67

8.717.849.17

Amostra 3_1 1: SIR of 1 Channel ES- TIC (cat)

1.39e6

3.27

2.78

0.89

0.60

9.587.01

O solvente foi injetado conforme condição nominal e mostrando que não há

interferência na matriz (Figura 15), sendo comprovado no item 4.3.2.

A

B

49

Figura 15: Verificação de inexistência de interferente m/z 289 no solvente.

4.4.2 Efeito de matriz

O efeito de matriz foi avaliado conforme descrito no item 3.7.5. Segundo a

RDC 166/17, a comprovação do paralelismo das retas deve ser realizada por meio

de avaliação estatística adequada e a confirmação que as retas são paralelas é

indicativa de ausência de interferência dos constituintes da matriz, portanto foi

utilizado a equação 1, citada anteriormente e o programa estatístico Action Stat.

Tabela 11: Cálculo de efeito de matriz utilizando a equação 1.

Catequina Epicatequina Interferência

Coeficiente angular com matriz

286031 290625 1,72

Coeficiente angular sem matriz

291025 298079 2,50

Tabela 12: Resultado do teste de paralelismo para a catequina e a epicatequina utilizando o

programa estatístico Action Stat.

G.L. Estat. F P-valor

Catequina 1 1,1623 0,2878 Epicatequina 1 1,0788 0,3055

50

Como o P-valor 0,2878 e 0,3055 para catequina e epicatequina

respectivamente do teste de paralelismo são maiores que 0,05, não rejeitamos a

hipótese de que os coeficientes angulares são iguais ao nível de significância de 5%.

Neste caso, dizemos que as retas são paralelas.

É possível verificar visualmente que não houve de efeito de matriz, uma vez

que a curva construída com apenas solvente possui inclinação semelhante a curva

construída com adição de padrão na amostra e as curvas são paralelas entre si,

tanto para catequina quanto para a epicatequina (Figuras 16 e 17).

Figura 16: Comparação das curvas analíticas para a catequina no solvente e na matriz.

Figura 17: Comparação das curvas analíticas para a epicatequina no solvente e na matriz.

51

4.4.3 Linearidade

As soluções foram preparadas conforme item 3.7.6 e em triplicata, na Tabela

13 encontram-se os resultados obtidos para catequina e epicatequina. Obteve-se o

gráfico das áreas em função da concentração do analito e a equação da reta de

regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos quadrados.

Tabela 13: Resultados das respostas analíticas em função da concentração e desvio padrão relativo (DPR) correspondente.


Catequina Epicatequina

Área (média) DPR (%) Área (média) DPR (%)

0,10 37.091 7,15 35.374 9,80 0,25 84.939 4,97 84.052 8,76 0,50 160.969 0,67 155.490 9,38 1,00 289.216 4,30 287.657 1,30 1,50 437.683 1,95 423.325 2,80 2,00 599.487 2,95 607.628 3,06

Conforme o guia da ANVISA n°10 de 2017, antes de qualquer avaliação

estatística propriamente dita, é importante fazer uma análise visual para observar se

os pontos, quando dispostos no gráfico, têm relação linear aparente (Figura 18).

Figura 18: Análise gráfica da regressão linear dos componentes catequina e epicatequina realizados em solvente.

4.4.3.1 Avaliação da semelhança das curvas analíticas

52

Conforme demonstrado visualmente no teste de linearidade, as curvas da

catequina e epicatequina são semelhantes, portanto, para a comprovação foi

realizado o cálculo estatístico para verificar a semelhança das curvas.

Para que as curvas analíticas sejam consideradas semelhantes elas devem

ser aprovadas no teste de igualdade do intercepto teste de paralelismo e teste de

coincidência e os resultados estão apresentados na Tabela 14.

Tabela 14: Resultado a avaliação da semelhança entre as retas.


Igualdade do Intercepto 1 1,1158 0,2987 Paralelismo 1 0,9004 0,3498 Coincidência 2 0,5744 0,5687

Como o P-valor (0,2987, 0,3498 e 0,5687) são maiores que 0,05, podemos

considerar que os interceptos das retas são paralelas e coincidentes ao nível de

significância de 5%. Neste caso, dizemos que as retas são semelhantes.

4.4.3.2 Avaliação da homocedasticidade

O método mínimos quadrados (MMQ) é recomendado para a estimativa da

equação da reta. Este método pode ter um fator de ponderação, sendo então

denominado método dos mínimos quadrados ponderados (MMQP) ou pode ser

aplicado diretamente, sem fator de ponderação, sendo então denominado método

dos mínimos quadrados ordinários (MMQO). O MMQO também pode ser entendido

como um caso particular do MMQP no qual o fator de ponderação é igual a 1. Para a

escolha do método a ser utilizado, deve se considerar a variância dos resultados de

y para cada valor de x. Se a variância de y for constante (situação denominada

homocedasticidade), pode-se utilizar o MMQO. Caso sejam observadas alterações

de variância de y (situação denominada heterocedasticidade) é recomendável que

se utilize o MMQP, pois a utilização do MMQO poderá gerar resultados tendenciosos

(ANVISA, 2017a).

Para avaliação da homocedasticidade foi utilizado o Teste de Cochran, o

seguinte teste de hipóteses:

H0: Variâncias dos níveis são iguais;

H1: Pelo menos uma variância diferente.

53

Tabela 15: Resultados do teste de Cochran.

Estatística GL P-valor

Catequina 0,553 3 0,107 Epicatequina 0,427 3 0,3704

O resultado pode ser visto na Tabela 15, como o P-valor (0,107 e 0,3704) da

catequina e epicatequina são maiores que 0,05 e os valores estatísticos (0,553 e

0,427) são menores do que 0,616 (valor C tabelado) não rejeitamos a hipótese de

igualdade das variâncias ao nível de significância de 5%. Logo, os dados são

homocedástico.

4.4.3.3 Avaliação dos coeficientes

Para avaliar a significância do coeficiente angular do modelo utilizamos o teste

F da ANOVA. Neste caso, testamos as seguintes hipóteses:

H0: coeficiente angular igual a zero;

H1: coeficiente angular diferente de zero.

Tabela 16: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente angular.


Catequina Concentração

(µg/mL) 1 5534,48 9,38x10-22

Epicatequina Concentração (µg/mL)

1 2223,76 1,34x10-18

Os resultados estão na Tabela 16, como o P-valor (9,38x10-22 e 1,34x10-18) do

teste F da ANOVA é menor que 0,05 e os valores estatísticos são maiores do que

6,12 (valor F tabelado) considera-se o coeficiente angular diferente de zero ao nível

de significância de 5%.

Para avaliar o intercepto (coeficiente linear) utiliza-se o teste t de Student.

Neste caso, as seguintes hipóteses são:

H0: intercepto (coeficiente linear) igual a zero;

H1: intercepto diferente de zero.

54

Tabela 17: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente linear.

Estat.t P-valor

Catequina Intercepto 1,9998 0,0628 Epicatequina Intercepto 0,0046 0,9964

Os valores mostrados na Tabela 17, como o P-valor (0,0628 e 0,9964) da

catequina e epicatequina respectivamente do teste t são maiores que 0,05 e os

valores estatísticos de T são menores que 4,30 (valor tabelado) o intercepto é

considerado igual a zero ao nível de significância de 5%.

O coeficiente de correlação de Pearson mede o grau de dependência linear de

uma variável explicativa e a variável resposta e os valores podem ser conferidos na

Tabela 18.

Tabela 18: Resultados do desvio padrão dos resíduos, coeficiente de determinação e correlação.

Graus de Liberdade

R2 Coeficiente de Correlação


Como o coeficiente de correlação para a catequina é 0,9986 e para

epicatequina é 0,9964, sendo maiores que 0,99, concluímos que existe uma relação

linear.

4.4.3.4 Análise dos resíduos

Os gráficos para avaliação visual devem incluir a distribuição de todos os

resíduos em função da concentração e da resposta.

Os resultados podem ser observados através das Figuras 19 e 20:

55

Figura 19: Análise gráfica dos resíduos para a catequina.

56

Figura 20: Análise gráfica dos resíduos para a epicatequina.

Para a verificação da normalidade foi utilizado o teste de Shapiro-Wilk

conforme as hipóteses abaixo e os valores estão apresentados na Tabela 19:

H0: a distribuição dos resíduos é Normal;

H1: a distribuição dos resíduos não é Normal.

Tabela 19: Resultados do teste de normalidade - Shapiro-Wilk.

Estatística P-valor

Catequina 0,9373 0,2606 Epicatequina 0,9623 0,6457

Como o P-valor (0,2606 e 0,6457) da catequina e epicatequina

respectivamente no teste de Shapiro-Wilk são maiores que 0,05 e os resultados

baseados na estatística W são maiores do que 0,908 (valor tabelado), conclui-se

que os resíduos possuem normalidade ao nível de significância de 5%.

57

4.4.3.5 Avaliação de valores extremos ou aberrantes (outliers)

Para a detecção de outliers foram avaliados os resíduos padronizados. Para

estimar os valores fora da faixa esperada são considerados outliers (valores

aberrantes), podem-se utilizar como exemplo o teste de Grubbs. Valores fora da

faixa esperada são considerados outliers (valores aberrantes). Neste caso, é

importante investigar se existe alguma causa analítica para esses valores aberrantes

e se, mesmo com esses valores, os dados ainda podem ser utilizados (ANVISA,

2017a). Como pode ser observado nas Tabelas 20 e 21. Como critério, foram

considerados valores extremos na resposta, as observações com resíduos

padronizados maiores que 3. Não houve outliers.

Tabela 20: Resumo da Análise dos Resíduos para catequina.

N.Obs Concentração (µg/mL) Resíduos Resíduos Padronizados

1 0,1 2077,8451 0,1964 2 0,1 -3142,1549 -0,297 3 0,1 -1337,1549 -0,1264 4 0,25 8134,0429 0,7579 5 0,25 2015,0429 0,1877 6 0,25 32,0429 0,003 7 0,5 6621,7058 0,6066 8 0,5 5606,7058 0,5136 9 0,5 7774,7058 0,7123 10 1 -1661,9683 -0,1509 11 1 -24814,9683 -2,253 12 1 -5315,9683 -0,4826 13 1,5 2064,3576 0,1918 14 1,5 -11161,6424 -1,0371 15 1,5 -13834,6424 -1,2854 16 2 6170,6835 0,6089 17 2 -7157,3165 -0,7063 18 2 27928,6835 2,7559

58

Tabela 21: Resumo da Análise dos Resíduos para epicatequina.

N.Obs Concentração (µg/mL) Resíduos Resíduos Padronizados

1 0,1 3375,0451 0,1975 2 0,1 1764,0451 0,1032 3 0,1 1658,0451 0,097 4 0,25 15442,1629 0,8904 5 0,25 1307,1629 0,0754 6 0,25 11947,1629 0,6889 7 0,5 5080,3592 0,288 8 0,5 -17352,6408 -0,9838 9 0,5 14723,3592 0,8348 10 1 -6363,2483 -0,3575 11 1 -13719,2483 -0,7709 12 1 -11086,2483 -0,6229 13 1,5 -17424,8557 -1,002 14 1,5 -37443,8557 -2,1531 15 1,5 -16413,8557 -0,9438 16 2 42277,5369 2,5819 17 2 5241,5369 0,3201 18 2 16987,5369 1,0374

4.4.3.6 Avaliação da independência

A avaliação da independência das observações através do seguinte teste de

hipóteses Durbin-Watson e os resultados podem ser observados nas Figuras 21e 22

e na Tabela 22:

H0: Observações são independentes;

H1: Observações não são independentes.

Figura 21: Analise gráfica da independência dos resíduos de catequina.

59

Figura 22: Análise gráfica da independência dos resíduos de epicatequina.

Tabela 22: Resultados do teste de Independência - Durbin- Watson.

Estatística P-valor

Catequina 1,5846 0,11 Epicatequina 1,5683 0,11

Como o P-valor (0,11) do teste de Durbin-Watson é maior que 0,05 e os

valores estatísticos de DW são maiores do que 1,5 (valor tabelado), logo, o resíduo

possui independência das observações ao nível de significância de 5%.

A Tabela 23 apresenta um resumo dos resultados dos testes estatísticos e é

possível ver que ambas os dados apresentaram homocedasticidade através do

método de Cochram, ou seja, os dados regredidos apresentam variância constante.

O modelo obtido por mínimos quadrados utilizado foi considerado linear, pois

apresentou coeficiente de correlação ˃ 0,990, o y intercepto se apresentou

estatisticamente igual de 0, ou seja, pode ser utilizado calibração de ponto único

para quantificação.

A avaliação da significância do coeficiente angular foi feita através do teste F,

a avaliação da independência dos resíduos foi realizada pelo teste Durbin Watson e

avaliação da normalidade dos resíduos através de Shapiro Wilk e avaliação de

outliers dos resíduos por Grubbs. Concluindo-se que os resíduos apresentaram

distribuição normal e independência.

60

Tabela 23: Resumo dos resultados estatísticos obtidos no parâmetro linearidade da validação.

Parâmetro Valores

tabelados

Valores calculados (Catequina)

Valores calculados

(Epicatequina)

Homocedasticidade 0,616 0,553 0,427

Coeficiente de correlação (r) 0,99 0,9971 0,9929

Coeficiente de determinação (r2)

- 0,9986 0,9964

Significância do coeficiente angular

6,12 5534 2223

Avaliação do coeficiente linear (intercepto)

4,30 2,00 0,00

Independência dos resíduos 1,5 1,58 1,57

Normalidade dos resíduos 0,908 0,937 0,962

Avaliação de outliers 3,00 Não há outliers Não há outliers

4.4.4 Precisão

O teste de precisão foi realizado em dias diferentes, ou seja, repetibilidade e

precisão intermediária e foram preparadas as amostras em sextuplicata, onde a

amostra foi quantificada através de uma curva de calibração utilizando os pontos

0,25, 0,50, 1,00, 1,50 e 2,00 µg/mL e também a quantificação em ponto único a fim

de saber se haveria diferença entre as duas metodologias. Os resultados estão nas

Tabelas 24 e 25.

Tabela 24: Resultado da repetibilidade realizada dia no 05/05/18.

REP

Catequina Epicatequina Catequina Epicatequina

[µg/mL] [µg/mL] [µg/mL] [µg/mL]

Quantificação pela curva Quantificação ponto único

1 4,22 8,94 4,26 8,92

2 4,62 8,38 4,64 8,38

3 4,30 8,67 4,33 8,65

4 4,36 9,33 4,38 9,30

5 3,78 9,25 3,83 9,23

6 4,31 8,90 4,34 8,88

Média 4,26 8,91 4,30 8,89

DP (σ) 0,28 0,36 0,26 0,35

DPR% 6,5 4,0 6,2 3,9

61

Tabela 25: Resultado da precisão intermediaria realizada dia no 19/05/18.

PI

Catequina Epicatequina Catequina Epicatequina

[µg/mL] [µg/mL] [µg/mL] [µg/mL]

Quantificação pela curva Quantificação ponto único

1 4,31 9,05 4,30 9,02

2 4,96 9,83 4,85 9,78

3 4,10 8,75 4,04 8,72

4 4,31 9,64 4,24 9,59

5 4,65 8,84 4,56 8,81

6 4,31 8,66 4,24 8,64

Média 4,44 9,13 4,37 9,09

DP (σ) 0,31 0,49 0,29 0,48

DPR% 7,0 5,4 6,6 5,3

Sendo que a RDC 166/17 não estabelece os valores dos critérios de

aceitação e define que os mesmos devem ser justificados, portanto foi adotado o

critério conforme resolução da ANVISA n° 899 de 2003 que é de DPR <15% e os

resultados da repetibilidade e precisão intermediária estão satisfatórios. A avaliação

da precisão intermediária foi realizada através do programa Action Stat.

A análise de variância (ANOVA) é um método estatístico que testa a hipótese

de que as médias de duas ou mais populações são iguais. A hipótese nula afirma

que todas as médias de população são iguais, enquanto a hipótese alternativa

afirma que pelo menos uma é diferente.

Tabela 26: Resultados da avaliação da precisão intermediária entre dias empregando ANOVA.

G.L. Estatística F P-Valor


Os resultados do teste da ANOVA da catequina e epicatequina podem ser

vistos na Tabela 26. O P-valor de ambas (0,3252 e 0,3991) são maiores que 0,05,

não rejeitamos a hipótese de que o efeito do fator dia seja nulo ao nível de

significância de 5%, ou seja não houve diferença entre os dias.

Além disso, foi avaliada a semelhança entre a quantificação pela curva

analítica versus ponto único (Tabela 27).

Tabela 27: Resultados a variação da forma de quantificação.

G.L. Estatística F P-Valor


62

Como o P-valor (0,839 e 0,9306) do teste da ANOVA é maior que 0,05, não

rejeitamos a hipótese de que o efeito do fator quantificação (curva analítica ou ponto

único) é nulo ao nível de significância de 5%.

Em resumo, o método apresentou resultados de repetibilidade e precisão

intermediaria satisfatórios e não houve diferença ao quantificar os analitos

comparando com a curva de calibração ou com o ponto único.

4.4.5 Exatidão

A avaliação da exatidão foi realizada em 3 (três) concentrações diferentes:

0,1, 1,0 e 2,0 µg/mL. O preparo foi idêntico ao teste de efeito de matriz descrito no

item 3.6.5. Para a quantificação foi utilizado a equação da reta da linearidade, pois

ambos testes foram realizados no mesmo dia, ou seja, utilizou-se a equação y=

291025x + 8788,6 para catequina e y= 298079x + 32,967 para epicatequina. A

equação 2 descrita no item 1.6.6 foi utilizada para o cálculo da recuperação.

Os valores de recuperação podem ser observados nas Tabelas 28 e 29.

Tabela 28: Resultado da recuperação da catequina.

Concentração Teórica (µg/mL)

Concentração prática (µg/mL)

DPR Recuperação

0,1 0,11 13,89% 109,33% 1,0 0,98 3,84% 98,50% 2,0 2,00 3,98% 100,12%

Tabela 29: Resultado da recuperação da epicatequina.

Concentração Teórica (µg/mL)

Concentração prática (µg/mL)

DPR Recuperação

0,1 0,10 14,12% 103,12% 1,0 0,98 3,50% 97,90% 2,0 2,03 2,06% 101,4%

Conforme a RDC 166/17 não estabelece os valores dos critérios de aceitação

e define que os mesmos devem ser justificados, portanto foi utilizado os critérios de

aceitação estabelecidos segundo guia da AOAC de 2016 onde essa faixa é de 80 –

110%, uma vez que tal critério é baseado na concentração do analito. Sendo assim

63

o método analítico em questão é considerado exato, pois apresenta DPR (%) e

recuperação dentro da especificação.

4.4.6 Limite de Detecção e Quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram calculados conforme as

Equações 4 e 5 a partir do desvio padrão do y intercepto da reta que foi realizada

em triplicata conforme item 1.6.8 e os resultados estão na Tabela 30.

Tabela 30: Resultados do limite de detecção e quantificação.

Equação da reta LD (µg/mL) LQ (µg/mL)

Catequina Y=289428x + 4732,4 Y=288962x + 3771,8 Y=283573x + 6011,1

0,03 0,1

Epicatequina Y=303439x + 3808,7 Y=298011x – 1998,4 Y=297270x + 4165,5

0,03 0,1

Portanto o limite de detecção foi de 0,03 µg/mL e o limite de quantificação foi

de 0,1 µg/mL para ambos os componentes.

4.4.7 Faixa de trabalho

A faixa de trabalho definida pelos testes de linearidade, exatidão e precisão

para o método de teor de catequina e epicatequina foi de 0,10 µg/mL à 2,0 µg/mL.

4.4.8 Robustez

4.4.8.1 Variação de fluxo, temperatura da coluna, proporção da fase móvel, lote

de coluna.

O teste foi realizado através da injeção do padrão (concentração de 1 µg/mL)

e amostra com variações do método de forma univariada, ou seja, variando um

parâmetro por vez. Após a injeções foram calculados a recuperação nas condições

testadas os resultados encontram-se na Tabela 31.

64

Tabela 31: Resultados da recuperação do teste de robustez.

Condição Catequina (%) Epicatequina (%)

Nominal 100,0 100,0 Fluxo 0,19 mL/min 97,8 95,7 Fluxo 0,21 mL/min 100,7 97,4 Temperatura 25°C 100,9 97,1 Temperatura 35°C 97,7 98,0

FM 0,5% ácido fórmico 95,5 95,1 FM 1,5% ácido fórmico 101,2 96,7

Coluna SN:021933149157 99,9 96,9

É possível verificar que houve recuperação atendeu o critério de aceitação

que é a faixa de 95% – 105% em todas as condições testadas, ou seja, o método é

robusto para as condições acima nas faixas estudadas.

4.4.8.2 Teste de Filtro

Foi realizado o teste de filtro (Tabela 32) adotando a amostra centrifugada

como 100% e foi calculada a recuperação da amostra filtrada com PDVF 0,22 µm,

pois o tamanho de partícula é compatível com a técnica de UHPLC.

Tabela 32: Resultado do teste de filtro.

Condição Catequina (%) Epicatequina (%)

Centrifugado 100,0 100,0 PVDF 0,22 µm 97,8 103,4

Conforme o resultado da Tabela 32 o filtro PVDF 0,22 µm não causa

interferência para a quantificação de catequina e epicatequina na solução amostra,

pois a recuperação atendeu o critério de aceitação que é a faixa de 95% – 105%.

4.4.8.3 Tempo de extração

Foram preparadas 12 amostras em triplicata as quais foram colocadas no

ultrassom e em seguida retiradas nos tempos 0, 15, 30 e 60 minutos. Foram

avaliados os DPR (%) das áreas obtidas conforme mostrado na Tabela 33:

65

Tabela 33: Resultado do teste de tempo de extração.

Tempo (minutos) Catequina DPR (%) Epicatequina DPR (%)

0 15,20 18,49 15 2,39 3,02 30 2,89 3,50 60 3,48 2,79

Conforme os resultados mostrados na Tabela 33 o tempo mínimo para uma

extração adequada é de 15 minutos.

4.4.8.4 Estabilidade de soluções

A solução padrão foi injetada nos tempos 0, 6, 12, 24 e 36 horas, conforme

Tabela 34:

Tabela 34: Resultado do teste de estabilidade de soluções.

Tempo (horas) Catequina (%) Epicatequina (%)

0 100,0 100,0 6 99,3 98,8 12 98,4 96,3 24 96,5 95,2 36 89,7 88,4

Conforme os resultados demonstrados na Tabela 34 tanto a catequina quanto

a epicatequina degradam em 36 horas e a recuperação apresentou-se fora da faixa

de 95% – 105%, portanto é importante utilizar amostras recentemente preparadas e

no máximo em 24 horas.

4.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO E VALIDADO

Após a validação do método analítico, o mesmo foi aplicado em amostras de

folhas e cápsulas de espinheira santa adquiridas em cinco cidades da região de

Campinas a fim de avaliar as concentrações de catequina e epicatequina, e

indiretamente, verificar a autenticidade / qualidade das amostras comercializadas.

Foram preparadas 18 amostras conforme o descrito no item 3.7.4. Os

cromatogramas (UHPLC-MS) em SCAN apresentaram três diferentes perfis de

característicos. Na Figura 23 observa-se que não foi detectada a catequina, que é

característico da espécie M. aquifolium. Já na Figura 24 observam-se a catequina e

epicatequina, corroborando para confirmação da espécie M. lificifolia. Finalmente, na

66

Figura 25, não foi detectada a catequina nem a epicatequina, bem como outros

marcadores, concluindo-se que a amostra não é proveniente destas espécies de

Maytenus ssp.

A Tabela 35 apresenta as concentrações encontradas de catequina e

epicatequina das folhas e cápsulas comercializadas como M. ilicifolia também a

concentração de epicatequina conforme especificação farmacopéica. Na

Farmacopeia Brasiliera 5ª edição (2010) é descrito que a concentração mínima de

epicatequina para M. ilicifolia é de 2,8 mg de epicatequina para 1 grama da folha.

Figura 23: Cromatograma referentes a amostra 2 (controle) de M. aquifolium e amostra 4 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.

Figura 24: Cromatograma referentes as amostras 1 (controle) de M. ilicifolia e amostras, 3, 5, 10, 11, 13, 17, 18, 19 e 20 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.

AM - Lindoia

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100


1.02e7

0.70

0.18 0.44

8.717.68

7.650.82

7.527.22

3.813.27

1.40 3.161.75 3.56 6.675.675.014.12 4.55 5.396.50

6.34

8.398.00 9.508.91 9.42

9.62


6.62e6

8.897.67

0.96

0.81

0.680.38

7.63

7.537.30

6.653.772.201.89

1.751.34 2.932.70

3.643.19 4.27

3.895.484.65 5.13

5.615.78 6.57 6.75

7.758.058.728.64

9.309.34

9.56

9.67


2.09e7

9.50

0.680.813.83

3.300.972.79

2.48 3.55

7.657.617.22

7.054.13

9.387.79 9.19

8.378.04 8.978.73

Figura 25: Cromatograma referentes as amostras 6, 12, 14 e 15 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.

AM - Lindoia

Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50

%

0

100


1.02e7

0.70

0.18 0.44

8.717.68

7.650.82

7.527.22

3.813.27

1.40 3.161.75 3.56 6.675.675.014.12 4.55 5.396.50

6.34

8.398.00 9.508.91 9.42

9.62


6.62e6

8.897.67

0.96

0.81

0.680.38

7.63

7.537.30

6.653.772.201.89

1.751.34 2.932.70

3.643.19 4.27

3.895.484.65 5.13

5.615.78 6.57 6.75

7.758.058.728.64

9.309.34

9.56

9.67


2.09e7

9.50

0.680.813.83

3.300.972.79

2.48 3.55

7.657.617.22

7.054.13

9.387.79 9.19

8.378.04 8.978.73

67

Tabela 35: Resultado da análise das amostras controle M. aquifolium e M. ilicifolia além das amostras das folhas e cápsulas comercializadas como de M. Ilicifolia.

Amostras Concentração de

Catequina (ug/mL)

Concentração de Epicatequina

(ug/mL)

Concentração de Epicatequina

(mg/g)

1 – M. ilicifolia (Controle) 4,04 8,84 4,42

2 – M. aquifolium (Controle) 0,00 11,08 5,54 3 – Folha 0,82 1,87 0,94

4 – Folha 0,00 3,91 1,96 5 – Folha 2,65 3,83 1,92 6 – Folha 0,00 0,00 0,00 7 – Folha 2,97 12,50 6,25 8 – Folha 4,29 6,95 3,48 9 – Folha 2,14 5,62 2,81 10 – Folha 1,98 4,52 2,26 11 – Folha 0,67 2,15 1,08 12 – Folha 0,00 0,00 0,00

13 – Folha 1,32 10,37 5,19 14 – Folha 0,00 0,00 0,00 15 – Folha 0,00 0,00 0,00 16 – Folha 3,53 5,69 2,85 17 – Folha 2,16 10,79 5,40

18 – Cápsula 1,07 6,03 3,02 19 – Cápsula 3,10 6,22 3,11 20 – Cápsula 2,79 5,92 2,96

Conforme pôde ser observado nas Figuras 23, 24 e 25 e na Tabela 35,

algumas amostras foram identificadas como sendo M. Ilicifolia ou M. aquiolium e

quatro amostras não eram destas espécies, ou estavam degradadas. Estes

resultados corroboram um estudo de PEREIRA e ESMERINO (2008), que

constataram que, das amostras comercializadas como M. Ilicifolia, nenhuma cumpriu

plenamente as exigências dos testes, demonstrando que estas apresentam algum

tipo de desvio de qualidade.

Na Tabela 35 são apresentadas as concentrações de epicatequina nestas

amostras, conforme descrito na Farmacopeia Brasiliera 5ª edição (2010), das 2

amostras controles e das 18 amostras adquiridas, onde 13 amostras apresentaram o

padrão característico de M. ilicifolia, mas apenas 9 amostras apresentaram

concentração de epicatequina superior a 2,8 mg/g; que é o mínimo aceitável.

A média de epicatequina foi calculada a partir das amostras que foram

identificadas pertencentes M. Ilicifolia, apresentando um concentração de 3,1mg por

grama de folha seca. Resultados na literatura demonstraram que o mesmo valor foi

determinado por De Souza e colaboradores em 2009.

68

Das 15 amostras de folhas, apenas seis estavam com a concentração

adequada de epicatequina. Isto foi observado tanto para as folhas provenientes de

farmácias de manipulação quanto de feiras livres. Em contrapartida foram

analisadas três amostras em cápsulas, provenientes de indústrias e de farmácias de

manipulação, e todas foram aprovadas.

69

5 CONCLUSÃO

O método analítico desenvolvido utilizando UHPLC-MS foi capaz de identificar

padrões de composição diferentes entre as espécies de Maytenus ssp com base nos

marcadores químicos catequina e epicatequina nas amostras.

As extrações utilizando água e soluções hidroalcoólicas não apresentaram

diferenças significativas em relação à composição e recuperação dos componentes,

porém o uso de água como solvente resultou em melhor simetria e resolução dos

picos, com recuperação superior a 95% em 15 minutos, portanto foi rápido e

eficiente.

Após o desenvolvimento do método analítico foi realizado a validação

conforme RDC 166/17, sendo satisfatória em todos os parâmetros testados, sendo

seletivo, linear, preciso, exato e robusto, logo esse método pode ser aplicado para o

uso pretendido.

O método validado foi aplicado em 18 amostras (folhas e cápsulas) adquiridas

do comercio; sendo apenas 50% identificadas como M. ilicifolia e aprovadas

conforme os critérios da Farmacopeia Brasileira 5° edição. Quando analisamos

apenas as folhas, ou seja, 15 amostras esse valor diminui 40%.

Os resultados apresentados nesse trabalho evidenciam que há necessidade

de maior fiscalização pelos órgãos reguladores a fim de garantir a qualidade das

plantas medicinais encontradas no comércio, verificando a sua autenticidade,

concentração dos componentes de interesse e evitando fraudes.

70

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7 ANEXOS

Anexo A: Declaração de bioética/biossegurança

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Anexo B - Declaração de direitos autorais

universidade estadual de campinasrepositorio.unicamp.br/bitstream/reposip/335472/1/duarte...com o...

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