UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA
RODOLFO SANTOS DUARTE
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE CATEQUINAS E CARACTERIZAÇÃO
DE EXTRATOS DE FOLHAS DE MAYTENUS SSP UTILIZANDO UHPLCMS
CAMPINAS 2019
RODOLFO SANTOS DUARTE
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE CATEQUINAS E CARACTERIZAÇÃO DE
EXTRATOS DE FOLHAS DE MAYTENUS SSP UTILIZANDO UHPLCMS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: PROFª. DRª. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA
CAMPINAS 2019
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO RODOLFO SANTOS DUARTE E ORIENTADO PELA PROFª. DRª. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA.
Campinas, 31/07/2019.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya
Prof. Dr. Paulo Cesar Pires Rosa
Profa. Dra. Márcia Ortiz Mayo Marques Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por me permitir encerrar mais um ciclo de aprendizado com muita luta e dedicação e aos meus pais que sempre me incentivaram a estudar.
A minha orientadora Profª. Drª. Alexandra Christine Helena Frankland
Sawaya, por acreditar em mim e pela confiança depositada. Além de ter o privilégio de trabalhar ao lado de uma pessoa com muita sabedoria e que ama transmitir seus conhecimentos.
A todos que fazem parte do labmetamass principalmente a Elisa que ajudou
com o desenvolvimento deste projeto e a minha noiva Aline que me apoiou desde o início desta empreitada.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
À todos vocês, o meu sincero agradecimento.
RESUMO Devido à larga utilização popular de Maytenus ilicifolia no tratamento de úlceras
gástricas, a maior parte dos estudos farmacológicos não clínicos desenvolvidos
encontra-se nessa área. São encontrados na literatura, estudos que obtiveram efeito
antiulcerogênico relevante, comparável à cimetidina. Também há relatados de
significante aumento no volume de secreção e pH gástrico com os extratos testados
em relação ao controle, provavelmente devido aos polifenóis presentes, flavonoides
e taninos predominantemente nos extratos aquosos e esteroides e triterpenos nos
extratos acetônicos e acetato de etila. Neste projeto utilizou-se a técnica de
cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
(UHPLC-MS) com ionização por eletrospray, para desenvolvimento de método
analítico e sua validação. O método desenvolvido foi capaz de diferenciar e
quantificar a catequina e a epicatequina que são isômeros (trans-catequina e cis-
epicatequina) no modo de ion selecionado (SIM), e simultaneamente analisar o
extrato em modo full–scan. Deste modo, foi possível identificar a espécie do
material analisado com base na composição avaliada, verificando diferentes
compostos entre Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium no extrato aquoso. A
validação do método foi conduzida conforme a RDC 166/2017 apresentando
resultados satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, sendo seletivo, linear,
preciso, exato e robusto. Foram utilizados o guia estatístico n° 10 de 2017 (ANVISA)
e o software Action Stat principalmente para avaliação dos resultados da
lineariadade. Foi aplicado o método validado em 18 amostras comercializadas como
sendo da especie de M. ilicifolia e apenas 72% (13 amostras) foram identificadas
sendo a mesma. Quando avaliou-se a concentração de epicatequina conforme a
especificação da monografia descrita na farmacopeia brasileira 5ª edição (superior a
2,8 mg/g de folha) apenas 50% das amostras estavam de acordo com a
especificação. Portanto é de suma importância uma fiscalização mais eficiente pelos
órgãos reguladores afim de garantir a eficácia das plantas medicinais.
Palavras-chaves: Validação, Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, Catequina, Epicatequina.
ABSTRACT Due to the widespread use of Maytenus ilicifolia in the treatment of gastric ulcers,
most of the non-clinical pharmacological studies developed are in this area. Studies
that have obtained a relevant antiulcerogenic effect, comparable to cimetidine, are
found in the literature. A significant increase in the volume and pH of the gastric
secretion after treatment with these extracts was reportes, possibly due to the
presence poliphenolic compounds (flavonoids and tannins) in the aqueous etracts
and the steroids and triterpenes in the acetone and ethyl acetate extracts. In this
project we used ultra-high performace liquid chromatography coupled to mass
spectrometry (UHPLC-MS) with electrospray ionization, for the development of an
analytical method and its validation. The method was able to differentiate and
quantify catechin and epicatechin which are isomers (trans-catechin and cis-
epicatechin) in the selected ion monitoring (SIM) mode, and simultaneously analyze
the extract in full-scan mode. In this way, it was possible to identify the species of the
analyzed material based on the evaluated composition, verifying different compounds
between Maytenus ilicifolia and Maytenus aquifolium in the aqueous extract. The
validation of the method was conducted according to RDC 166/2017, presenting
satisfactory results for all evaluated parameters, being selective, linear, precise,
accurate and robust. Statistical guide No. 10 of 2017 (ANVISA) and the Action Stat
software were used mainly to evaluate linearity results. The validated method was
applied to 18 samples commercialized as being M. ilicifolia but only 72% (13
samples) were identified as such. When the epicatechin concentration was
evaluated according to the specification of the monograph described in the Brazilian
Pharmacopoeia 5th edition (greater than 2.8 mg / g of leaf), only 50% of the samples
were in agreement with specifications., Therefore a more efficient inspection by the
regulatory organs is of paramount importance in order to ensure the effectiveness of
medicinal plants.
Keywords: Validation, Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, Catechin, Epicatechin.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Imagem da espécie Maytenus ilicifolia (ROSSATO et al., 2013). .................. 19
Figura 2: Imagem de ramo da espécie Maytenus aquifolium (LOPES 2012). ............... 19
Figura 3: Estrutura química de um flavonoide. .............................................................. 20
Figura 4: Estrutura química de um tanino condensado. ................................................ 21
Figura 5: Estrutura química de catequina (A) e epicatequina (B). ................................. 21
Figura 6: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da
ANVISA (ANVISA, 2017a). ............................................................................................ 29
Figura 7: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da
ANVISA (ANVISA, 2017a). ............................................................................................ 42
Figura 8: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo durante o
desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme
apresentado na tabela. .................................................................................................. 42
Figura 9: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo na condição no final do
desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme
apresentado na tabela. (A) Pico cromatográfico referente a catequina e (B) Pico
cromatográfico referente a epicatequina. ...................................................................... 43
Figura 10: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. Ilicifolia sendo A- íon
extraído de m/z 755, B - íon extraído de m/z 289, C- íon extraído de m/z 305, D.
Cromatograma de íons totais (TIC). .............................................................................. 45
Figura 11: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. aquifolium sendo A: íon
extraído de m/z 901, B: íon extraído de m/z 917, C: íon extraído de m/z 289, D:
Cromatograma de íons totais (TIC). .............................................................................. 45
Figura 12: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de Maytenus ssp (híbrida) sendo
A: íon extraído de m/z 917, B: íon extraído de m/z 289, C: Cromatograma de íons
totais (TIC). .................................................................................................................... 46
Figura 13: (A): Cromatograma dos extratos aquoso e (B) hidroalcoólico. ..................... 47
Figura 14: (A) Cromatograma UHPLC-MS em modo SCAN e (B) em modo SIM
selecionado o íon m/z 289 da amostra M. ilicifolia. ....................................................... 48
Figura 15: Verificação de inexistência de interferente m/z 289 no solvente. ................. 49
Figura 16: Comparação das curvas analíticas para a catequina no solvente e na
matriz. ........................................................................................................................... 50
Figura 17: Comparação das curvas analíticas para a epicatequina no solvente e na
matriz. ........................................................................................................................... 50
Figura 18: Análise gráfica da regressão linear dos componentes catequina e
epicatequina realizados em solvente. ........................................................................... 51
Figura 19: Análise gráfica dos resíduos para a catequina. ............................................ 55
Figura 20: Análise gráfica dos resíduos para a epicatequina. ....................................... 56
Figura 21: Analise gráfica da independência dos resíduos de catequina. ..................... 58
Figura 22: Análise gráfica da independência dos resíduos de epicatequina. ................ 59
Figura 23: Cromatograma referentes a amostra 2 (controle) de M. aquifolium e
amostra 4 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN. ........... 66
Figura 24: Cromatograma referentes as amostras 1 (controle) de M. ilicifolia e
amostras, 3, 5, 10, 11, 13, 17, 18, 19 e 20 utilizando o método analítico validado e
adquirido em modo SCAN. ............................................................................................ 66
Figura 25: Cromatograma referentes as amostras 6, 12, 14 e 15 utilizando o método
analítico validado e adquirido em modo SCAN. ............................................................ 66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Preparo da infusão do extrato aquoso conforme farmacopeia Brasileira da
espécie M. Ilicifolia. ....................................................................................................... 22
Tabela 2: Exemplos de trabalhos identificando flavonoides ou taninos nas folhas de
espécies de Maytenus ssp. ........................................................................................... 25
Tabela 3: Recuperação esperada como função da concentração analítica. ................. 32
Tabela 4: Condições para a avaliação da robustez do método. .................................... 34
Tabela 5 - Amostras adquiridas em farmácia de manipulação e feiras para
verificação da espécie e teor de epicatequina............................................................... 37
Tabela 6: Preparo da curva analítica para o efeito de matriz. ....................................... 39
Tabela 7: Preparo da curva analítica para o teste de linearidade. ................................ 39
Tabela 8: Gradiente de eluição do método desenvolvido. ............................................. 40
Tabela 9: Informações sobre m/z (ionização modo negativo), dos prováveis
compostos encontradas nas amostras. ......................................................................... 44
Tabela 10: Resultados das diferentes extrações e pesagens para M. ilicifolia. ............ 47
Tabela 11: Cálculo de efeito de matriz utilizando a equação 1. .................................... 49
Tabela 12: Resultado do teste de paralelismo para a catequina e a epicatequina
utilizando o programa estatístico Action Stat................................................................. 49
Tabela 13: Resultados das respostas analíticas em função da concentração e desvio
padrão relativo (DPR) correspondente. ......................................................................... 51
Tabela 14: Resultado a avaliação da semelhança entre as retas. ................................ 52
Tabela 15: Resultados do teste de Cochran. ................................................................ 53
Tabela 16: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente
angular. ......................................................................................................................... 53
Tabela 17: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente linear. . 54
Tabela 18: Resultados do desvio padrão dos resíduos, coeficiente de determinação
e correlação. .................................................................................................................. 54
Tabela 19: Resultados do teste de normalidade - Shapiro-Wilk. ................................... 56
Tabela 20: Resumo da Análise dos Resíduos para catequina. ..................................... 57
Tabela 21: Resumo da Análise dos Resíduos para epicatequina. ................................ 58
Tabela 22: Resultados do teste de Independência - Durbin- Watson. .......................... 59
Tabela 23: Resumo dos resultados estatísticos obtidos no parâmetro linearidade da
validação. ...................................................................................................................... 60
Tabela 24: Resultado da repetibilidade realizada dia no 05/05/18. ............................... 60
Tabela 25: Resultado da precisão intermediaria realizada dia no 19/05/18. ................. 61
Tabela 26: Resultados da avaliação da precisão intermediária entre dias
empregando ANOVA. .................................................................................................... 61
Tabela 27: Resultados a variação da forma de quantificação. ...................................... 61
Tabela 28: Resultado da recuperação da catequina. .................................................... 62
Tabela 29: Resultado da recuperação da epicatequina. ............................................... 62
Tabela 30: Resultados do limite de detecção e quantificação. ...................................... 63
Tabela 31: Resultados da recuperação do teste de robustez. ...................................... 64
Tabela 32: Resultado do teste de filtro. ......................................................................... 64
Tabela 33: Resultado do teste de tempo de extração. .................................................. 65
Tabela 34: Resultado do teste de estabilidade de soluções. ........................................ 65
Tabela 35: Resultado da análise das amostras controle M. aquifolium e M. ilicifolia
além das amostras das folhas e cápsulas comercializadas como de M. Ilicifolia. ......... 67
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA = Analysis of Variance ou análise da variância
ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC = Association Of Analytical Communities
CA = concentração experimental do analito
CEME = Central de Medicamentos
CG = cromatografia gasosa
CLAE = cromatografia liquida de alta eficiência
CMD = concentração média determinada
CTA = concentração teórica do analito adicionado
CV = coeficiente de variação
DAD = detector Diode Array
DP = desvio padrão
DPR = desvio padrão relativo
ESI = Electrospray Ionization
G.L.= grau de liberdade
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
ICH = International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human Use
INMETRO = Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
LC-MS = liquid chromatography/mass spectrometry
LD = limite de detecção
LQ = limite de quantificação
m/z = massa/carga
MMQ = método dos mínimos quadrados
MMQO = método dos mínimos quadrados ordinários
MMQP = método dos mínimos quadrados ponderados
MS = espectrometria de massas
pH = potencial hidrogeniônico
PI = precisão intermediaria
PTFE = politetrafluoretileno
RDC = resolução da diretoria colegiada
REP = repetibilidade
RMN = ressonância magnética nuclear
RP = reversed phase
s = desvio padrão
SIM = selected ion monitoring
SUS = sistema único de saude
TIC = Cromatograma de íons totais
TQD = analisador do tipo Triplo Quadrupolo
UHPLC-MS = cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria
de massas
UV = ultravioleta
VIS = visível
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17
1.1 HISTÓRICO DOS PRODUTOS NATURAIS ............................. 17
1.2 ESPINHEIRA SANTA ................................................................ 18
1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA ......................................................... 20
1.4 PREPARO DO EXTRATO ......................................................... 22
1.5 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO .............. 23
1.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ................................... 25
1.6.1 Seletividade ............................................................................. 26
1.6.2 Efeito de Matriz ........................................................................ 26
1.6.3 Linearidade .............................................................................. 27
1.6.4 Faixa de trabalho ..................................................................... 30
1.6.5 Precisão ................................................................................... 30
1.6.6 Exatidão ................................................................................... 31
1.6.7 Limite de Detecção .................................................................. 32
1.6.8 Limite de quantificação ........................................................... 33
1.6.9 Robustez .................................................................................. 33
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 35
2.1 OBJETIVOS GERAIS ................................................................ 35
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................... 35
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 36
3.1 REAGENTES, GASES E SOLVENTES .................................... 36
3.2 MATERIAIS ............................................................................... 36
3.3 EQUIPAMENTOS ..................................................................... 36
3.4 AMOSTRA DE PLANTAS PREVIAMENTE IDENTIFICADAS ... 36
3.5 AMOSTRA DE FOLHAS E FITOTERÁPICOS ADQUIRIDAS NO
MERCADO ................................................................................................ 37
3.6 PADRÃO ANALÍTICO ............................................................... 38
3.7 PREPAROS DAS SOLUÇÕES ................................................. 38
3.7.1 Preparo das soluções e fases móveis ................................... 38
3.7.2 Preparo da fase móvel ............................................................ 38
3.7.3 Preparo da solução padrão .................................................... 38
3.7.4 Preparo da solução amostra .................................................. 38
3.7.5 Preparo da amostra para o teste de efeito de matriz ........... 39
3.7.6 Preparo da amostra para o teste linearidade ........................ 39
3.8 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPONENTES ............................ 40
3.9 DADOS ESTATÍSTICOS ........................................................... 40
3.10 CONDIÇÕES ANALÍTICAS ....................................................... 40
3.10.1 Condições cromatográficas ................................................... 40
3.10.2 Condições espectrométricas ................................................. 40
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 41
4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO .................... 41
4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES ................................. 44
4.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA ...................................................... 46
4.4 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO ................................... 47
4.4.1 Seletividade ............................................................................. 47
4.4.2 Efeito de matriz ........................................................................ 49
4.4.3 Linearidade .............................................................................. 51
4.4.3.1 Avaliação da semelhança das curvas analíticas ....................... 51
4.4.3.2 Avaliação da homocedasticidade .............................................. 52
4.4.3.3 Avaliação dos coeficientes ........................................................ 53
4.4.3.4 Análise dos resíduos ................................................................. 54
4.4.3.5 Avaliação de valores extremos ou aberrantes (outliers) ............ 57
4.4.3.6 Avaliação da independência ...................................................... 58
4.4.4 Precisão ................................................................................... 60
4.4.5 Exatidão ................................................................................... 62
4.4.6 Limite de Detecção e Quantificação ...................................... 63
4.4.7 Faixa de trabalho ..................................................................... 63
4.4.8 Robustez .................................................................................. 63
4.4.8.1 Variação de fluxo, temperatura da coluna, proporção da fase
móvel, lote de coluna. ................................................................................ 63
4.4.8.2 Teste de Filtro ........................................................................... 64
4.4.8.3 Tempo de extração ................................................................... 64
4.4.8.4 Estabilidade de soluções ........................................................... 65
4.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO E VALIDADO .............. 65
5 CONCLUSÃO ............................................................................................ 69
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 70
7 ANEXOS......................................................................................................75
ANEXO A - Declaração de bioética/biossegurança………………..........75
ANEXO B - Declaração de direitos autorais...........................................76
17
1. INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO DOS PRODUTOS NATURAIS
A utilização de produtos naturais, principalmente da flora para fins medicinais,
nasceu com a humanidade. Indícios do uso de plantas medicinais e tóxicas foram
encontrados nas civilizações mais antigas, sendo considerada uma das práticas
mais remotas utilizadas pelo homem para cura, prevenção e tratamento de doenças,
servindo como importante fonte de compostos biologicamente ativos (ANDRADE et
al., 2007).
Nas últimas décadas, tem-se verificado uma tendência mundial de aumento
na demanda por fitoterápicos, sendo influenciada por fatores econômicos, sociais e
culturais. A maior industrialização e comercialização de medicamentos naturais
tornaram seu uso um problema de saúde pública. O aumento da demanda,
associado à falta de fiscalização efetiva, que garanta desde a exploração racional
dos recursos naturais empregados como matéria prima, até chegar ao produto
acabado, contribui para a disponibilidade e acesso a produtos, muitas vezes sem
condições adequadas ao uso, sem garantia da qualidade, segurança e eficiência
fundamentais para recuperação e manutenção da saúde do paciente (BUGNO et al.,
2005).
No Brasil, a fitoterapia é uma opção medicamentosa que se adequa às
necessidades de vários municípios no atendimento primário à saúde (SOUZA-
MOREIRA et al., 2010). De forma geral, os fatores da expansão da fitoterapia
devem-se aos efeitos adversos de fármacos sintéticos, à preferência dos
consumidores por tratamentos "naturais", crescente validação científica das
propriedades farmacológicas de espécies vegetais, desenvolvimento de novos
métodos analíticos para o controle de qualidade, desenvolvimento de novas formas
de preparações e administração dos produtos e relativo baixo custo (CANIGUERAL
et al., 2003; MELO et al., 2007).
No Brasil, técnicos do Ministério da Saúde elaboraram, em 1981, as
"Diretrizes e Prioridades para Investigação em Saúde" este documento incluiu o
estudo de plantas medicinais. Os técnicos da Central de Medicamentos (CEME)
coordenaram, de 1983 a 1996, o Programa de Pesquisa em Plantas Medicinais, que
envolveu 61 espécies em fase de pesquisa. Dentre essas, oito tiveram sua eficácia
18
terapêutica comprovada, inclusive a espinheira-santa, para tratamento de gastrite e
úlcera gástrica (SCHEFFER, 2001).
Desde 2007, o sistema único de saude (SUS) financia medicamentos
fitoterápicos como a espinheira santa e guaco, por exemplo, em apresentações
como cápsula, comprimido e xarope, entre outras. Os produtos integram as listas de
distribuição de medicamentos em 13 Estados (BRANDÃO, 2009).
1.2 ESPINHEIRA SANTA
Espinheira-santa é o nome popular de duas espécies, Maytenus ilicifolia
Martius ex Reissek e Maytenus aquifolium Mart, também conhecidas como
cancorosa, cancerosa, salva-vidas, espinho de Deus e outros. São espécies
medicinais nativas do Brasil, com maior ocorrência no Paraná, Santa Catarina e Rio
Grande do Sul e o seu uso medicinal há registros da década de 20 (SANTOS-
OLIVEIRA et al., 2009; HAIDA et al., 2012).
A M. ilicifolia é encontrada principalmente na região sul do Brasil, no interior
de matas nativas e em matas ciliares, preferindo os solos argilosos, mas bem
drenados e ricos em matéria orgânica. O clima de ideal é subtropical e temperado
(DE MAGALHÃES, 2002).
Várias espécies da família Celastraceae têm sido estudados com respeito à
presença de compostos com atividades biológicas e farmacológicas significativas,
sendo as atividades antitumoral e anti-úlcera consideradas mais promissoras
(ITOKAWA et al., 1991).
M. ilicifolia é descrita como subarbusto ou árvore, ramificado desde a base,
podendo atingir estatura de, no máximo, 5 m de altura. Possuem folhas coriáceas e
brilhantes, com margens providas de espinhos pouco rígidos, limbo com 2,2 a 8,9
cm de comprimento e 1,1 a 3,0 cm de largura, nervuras proeminentes na face
abaxial, de forma elíptica, conforme Figura 1. As suas flores são pequenas e de cor
amarelada, possuem sépalas semicirculares e ciliadas, com pétalas ovais e inteiras,
estames com filetes achatados na base. Os frutos são cápsulas bivalvares,
deiscentes de cor vermelha, contendo 1-4 sementes de cor castanha ou preta
(MARIOT e BARBIERI, 2007; ROSSATO et al., 2013).
19
Figura 1: Imagem da espécie Maytenus ilicifolia (ROSSATO et al., 2013).
Maytenus aquifolium é um arbusto ou árvore podendo atingir estatura de, no
máximo, 12 m de altura. Os ramos novos são glabros, cilíndricos e achatados e as
folhas são cartáceas, glabras, possuindo limbo com 6,0 a 19,0 cm de comprimento e
2,0 a 6,0 cm de largura, forma elíptica ou oblongo-elíptica e margens com muitos
espinhos, como na Figura 2. A inflorescência é em fascículos múltiplos, o fruto é
uma cápsula bivalvar e o pericarpo maduro apresenta cor castanha avermelhada
(CARVALHO-OKANO, 1992; LOPES, 2012).
Figura 2: Imagem de ramo da espécie Maytenus aquifolium (LOPES 2012).
20
1.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Vários metabólitos com potenciais propriedades biológicas estão presentes
nos chás de folhas de Maytenus spp, incluindo flavonoides, triterpenos e
sesquiterpenos. Investigações anteriores demonstraram a presença de vários tipos
de flavonol-3-O-glicósidos nas folhas de Maytenus spp, tais como a rutina,
hiperosídeo, e isoquercitrina, e outras estruturas foram caracterizadas como canferol
e quercetina di-, tri, e tetra-glicosídeos (SANNOMIYA et al., 1998; VILEGAS et al.,
1999; LEITE et al., 2001; TIBERTI et al., 2007).
Os flavonoides (Figura 3) são uma classe de compostos amplamente
encontrada em plantas superiores, com uma estrutura baseada em de três anéis (A,
B e C) (JUSTESEN, 2000; STOBIECKI, 2000; ES-SAFI et al., 2005).
Figura 3: Estrutura química de um flavonoide.
Os taninos condensados (Figura 4), que são formados por unidades de
catequina ou epicatequina (Figura 5) unidas entre si por ligações entre o carbono 4
de uma unidade e o carbono 8 de outra unidade, são apontados como constituintes
químicos majoritários em extratos aquosos de M. Ilicifolia (BATTESTIN, 2007).
21
Figura 4: Estrutura química de um tanino condensado.
Figura 5: Estrutura química de catequina (A) e epicatequina (B).
Segundo Leite e colaboradores, em 2010, com a investigação fotoquímica de
um extrato etanólico de folhas de M. ilicifolia foram isolados constituintes que seriam
usados como marcadores químicos para monitorar o fracionamento de um extrato
aquoso liofilizado de folhas de M. ilicifolia. Foram isolados quatro flavonoides,
compreendendo o triglicosídeo flavônico mauritianina, trifolina, hiperina, e
epicatequina (LEITE et al., 2010). Já o fracionamento do extrato aquoso levou a 5
frações, fornecendo um derivado tetra glicosilado de canferol, além do galactitol
(LEITE et al., 2001; BAGGIO et al., 2012).
Em 2007, Baggio e colaboradores relataram as potentes propriedades
gastroprotetoras in vivo de uma fração contendo flavonoides separada das folhas de
22
M. ilicifolia, contendo galactitol (25,0%), epicatequina (3,1%) e catequina (2,0%)
como constituintes principais (BAGGIO et al., 2012).
1.4 PREPARO DO EXTRATO
Um extrato nada mais é que a preparação de consistência líquida, sólida ou
intermediária, obtida a partir de material animal ou vegetal. O material utilizado na
preparação de extratos pode sofrer tratamento preliminar, tais como, inativação de
enzimas, moagem ou desengorduramento (ANVISA, 2011b).
Este pode ser preparado por percolação, maceração ou outro método
adequado e validado, utilizando como solvente álcool etílico, água ou outro solvente
adequado. Após a extração, materiais indesejáveis podem ser eliminados (ANVISA,
2011b).
O processo de infusão é a preparação que consiste em verter água fervente
sobre a droga vegetal e, em seguida, tampar ou abafar o recipiente por tempo
determinado. Método indicado para partes de drogas vegetais de consistência
menos rígida tais como folhas, flores, inflorescências e frutos, ou que contenham
substâncias ativas voláteis (ANVISA, 2011b).
A tintura é a preparação alcoólica ou hidroalcoólica resultante da extração de
drogas vegetais ou animais ou da diluição dos respectivos extratos. É classificada
em simples e composta, conforme preparada com uma ou mais matérias-primas. A
menos que indicado de maneira diferente na monografia individual, 10 mL de tintura
simples correspondem a 1 g de droga seca (ANVISA, 2011b).
O formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira 1ª edição (2011)
preconiza o preparo da infusão conforme Tabela 1 (Extrato aquoso).
Tabela 1: Preparo da infusão do extrato aquoso conforme farmacopeia Brasileira da espécie M. Ilicifolia.
Componentes Quantidade
Folhas secas 3 g Água q.s.p. 150 mL
A Farmacopeia Homeopática Brasileira 3ª edição (2011), descreve o preparo
dos extratos hidroalcoólicos de acordo com a especificação em monografias, caso
não haja monografia deve-se iniciar com o teor alcoólico da extração de 60% (v/v) e
23
ao final da extração deverá ser de 55% (v/v) a 65% (v/v), é preparado da seguinte
forma (ANVISA, 2011a):
Folha, em pó............................................................................100 g
Solução hidroalcoólica..............................................................q.s.p
Para obter............................................................................1000 mL
1.5 MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
O acoplamento de técnicas cromatográficas com espectrométricas que funcionam
para detecção, ou técnicas cromatográficas hifenadas, vem sendo mais uma
importante ferramenta para a identificação dos constituintes das plantas e análise de
sua qualidade. No acoplamento destas técnicas, faz-se uso de métodos eficientes
de separação, como cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC do
Inglês High Performance Liquid Chromatography) e cromatografia gasosa (CG), e as
técnicas espectrométricas mais usadas são: espectrofotometria de UV-Visível
(DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e ressonância magnética nuclear
(RMN), fornecendo informações adicionais sobre a estrutura química dos
componentes da amostra (SOUZA-MOREIRA et al., 2010).
A espectrometria de massas (MS) tem sido aplicada com sucesso na
elucidação das estruturas de vários flavonoides glicosilados (SHAHAT et al., 2005;
PARK et al., 2007; TIBERTI et al., 2007). Os melhores resultados são geralmente
obtidos em combinação com técnicas cromatográficas, superando as dificuldades
em identificar isômeros em matrizes complexas. (DOMON e COSTELLO, 1988).
Outra vantagem do acoplamento com espectrometria de massas é que
apresenta alta seletividade (permitindo até a quantificação de picos sobrepostos),
baixo limite de detecção, avaliação da pureza de pico, confirmação da presença de
analitos mediante as informações de massa molar e de estrutura química, sendo
esta uma característica importante para o objetivo de avaliação dos componentes
das espécies de Maytenus ssp (JARDIM et al., 2006).
A técnica de MS-MS, ao invés de utilizar apenas um analisador de massas
para separar os íons de mesma razão massa/carga (m/z) gerados na fonte de
ionização, usa dois estágios de espectrometria de massas (MS1 e MS2), em que um
deles isola o íon de interesse, que é dissociado em uma cela de colisão (CID), e o
24
outro MS estabelece uma relação entre este íon de interesse isolado (precursor) e
outros íons que foram gerados a partir do CID (produtos). Esta técnica é
amplamente empregada na detecção de compostos presentes em baixas
concentrações em matrizes complexas, acoplada à cromatografia, uma vez que
possibilita um aumento na detecção e reduz a interferência espectral de compostos
presentes na matriz, além de aumentar a quantidade de informação estrutural
(CHIARADIA et al., 2008).
O MS-MS pode ser utilizado em várias técnicas de varredura para se realizar
a análise, tais como a varredura dos íons produtos (product-ion scan), varredura dos
íons precursores (precursor-ion scan), varredura da constante da perda de íons
neutros (constant-neutral-loss scan) e o monitoramento seletivo de reação (selected-
reaction monitoring) (KITTERINGHAM et al., 2009).
Devido às características estruturais dos compostos polifenólicos encontrados
em extratos de espécies de Maytenus ssp, a maioria dos procedimentos descritos na
literatura para a sua análise baseiam-se em CLAE-FR (cromatografia líquida de alta
eficiência de fase reversa). Recentemente, no entanto, um procedimento de
cromatografia líquida (CL) bidimensional (por exclusão de tamanho de fase reversa)
acoplado à MS foi empregado para a análise de flavonoides glicosilados de folhas
de M. ilicifolia (DE SOUZA et al., 2009).
Na Farmacopeia Brasileira 5° edição volume II consta a quantificação de
epicatequina em extrato hidroalcoólico através de CLAE, utilizando um detector
ultravioleta com comprimento de onda fixo em 210 nm, coluna de 250 mm de
comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, empacotada com C18 (5 µm); vazão da
fase móvel de 0,8 mL/minuto e o modo de eluição gradiente. Na Tabela 2
apresentam-se os métodos cromatográficos encontrados na literatura para
identificação/quantificação dos componentes das folhas de espécies de Maytenus
ssp (ANVISA, 2010).
25
Tabela 2: Exemplos de trabalhos identificando flavonoides ou taninos nas folhas de espécies de Maytenus ssp.
Objetivos Extração Coluna
cromatográfica Modo de eluição
Tempo de corrida
Detecção Referência
Análise de isômero de
Flavonol glicosilado
Aquoso* Supelco LC18,
250mm×4.6m (4µm)
Gradiente 25 MS
(DE SOUZA, CIPRIANI,
SERRATO, et al., 2008)
Validação de Catequina e Epicatequina
Aquoso ANova-Pak C18
150mm × 3,9mm
Gradiente 30 UV (SOARES et
al., 2004)
Análise de Flavonóides e Taninos
Aquoso*
Synergy Fusion C18,
250mm×4.6 mm
Isocrático 23 MS
(DE SOUZA, CIPRIANI,
IACOMINI, et al., 2008)
Identificação de
Flavonóides Hidroalcoólico
Symmetry C18 250nm x 4,6mm
(5µm) Gradiente 30 UV
(TIBERTI et al., 2007)
Identificação de
Flavonóides Hidroalcoólico
Supelcosil C18 e C8 250nm x
4,6mm (5µm) Gradiente 20/50 MS
(DIAGONE et al., 2012)
Identificação de
Flavonóides Hidroalcoólico
Supelco C8 250nm x 4,6mm
(5µm) Gradiente 20 UV
(YARIWAKE et al., 2005)
* Após a extração aquosa houve outras extrações para a limpeza das amostras, antes de injetar no HPLC
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) aprovou o uso e venda
de medicamentos fitoterápicos de M. ilicifolia, que são padronizadas pelo seu
conteúdo de tanino para o tratamento de distúrbios gástricos. Muitas empresas
farmacêuticas brasileiras produzem fitofármacos que contêm esta substancia. A
disponibilidade de métodos de ensaio validado é importante para o controle de
qualidade deste produto, e tais ensaios de qualidade são solicitados pelas as
autoridades de saúde brasileiras para o registro de medicamentos fitoterápicos
(LOPES et al., 2010).
1.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
Para permitir a avaliação qualitativa ou quantitativa de matérias-primas, do
produto em etapas do processo produtivo ou do produto acabado, é necessário o
desenvolvimento de métodos analíticos, bem como sua validação. A validação de
metodologia é a etapa final do processo de desenvolvimento de um método
analítico, neste momento ele é desafiado. O resultado final é a demonstração de que
o método é adequado para o uso pretendido, seja para a determinação qualitativa,
26
semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em insumos
farmacêuticos (BITTENCOURT, 2015).
Atualmente existe uma resolução da diretoria colegiada (RDC) nº 166, de 24
de julho de 2017, da ANVISA, que define a validação como: “a avaliação sistemática
de um procedimento por meio de estudos experimentais de modo a confirmar e
fornecer evidências objetivas de que os requisitos específicos para seu uso
pretendido são atendidos. A validação deve demonstrar que o método analítico
produz resultados confiáveis e é adequado à finalidade a que se destina, de forma
documentada e mediante critérios objetivos” (ANVISA, 2017b).
Conforme parâmetros e critérios de aceitação estabelecidos pela ANVISA na
RDC nº 166, de 24 de junho de 2017, foram utilizados os parâmetros para método
bioanalítico e na validação serão analisados: seletividade, linearidade, precisão,
precisão intermediária, exatidão e robustez. Além dos parâmetros acima, também
foram realizados as determinações dos valores de limite de detecção e limite de
quantificação (ANVISA, 2017b).
1.6.1 Seletividade
A seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio da sua
capacidade de identificar ou quantificar o analito de interesse, inequivocamente, na
presença de componentes que podem estar presentes na amostra, como impurezas,
diluentes e componentes da matriz (ANVISA, 2017b).
1.6.2 Efeito de Matriz
Efeito de matriz é um estudo de seletividade que objetiva averiguar possíveis
interferências causadas pelas substâncias que compõem a matriz amostral gerando,
basicamente, fenômenos de diminuição ou aumento do sinal ou resposta
instrumental (FENG et al., 2015).
O efeito matriz pode ser mensurado por meio da Equação 1:
Equação 1
27
O paralelismo das retas é outro indicativo de ausência de interferência dos
constituintes da matriz e a sua demonstração deve ser realizada por meio de
avaliação estatística adequada, conforme RDC 166/17.
1.6.3 Linearidade
A linearidade compreende a correlação entre a resposta do método e a
concentração ou quantidade de analito, cujo comportamento deve ser descrito por
uma equação linear. É citada como a habilidade do método analítico de produzir
resultados que são diretamente, ou por uma transformação matemática bem
definida, proporcionais à concentração do analito dentro de uma faixa especificada
(INMETRO, 2010).
Existem diferentes cálculos para os coeficientes podendo ser empregando o
método dos mínimos quadrados o qual estabelece a reta de regressão que permite
obter os coeficientes linear (a) e angular (b). Também é possível calcular, a partir
dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação (r) ou de determinação (r2), os
quais permitem uma estimativa da qualidade do ajuste da curva obtida, pois quanto
mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e a
incerteza dos coeficientes de regressão estimados (ANVISA, 2003; BITTENCOURT,
2015).
Outro critério para testar a linearidade do método, é que o valor de b deve
estar próximo de zero (HARRIS, 2001) e, caso haja um valor significativamente
diferente de zero, deve ser demonstrado que não há nenhum efeito sobre a exatidão
do método (DUTRA, 2013).
Outro fator importante é o cálculo do teste F de significância da regressão
linear, sendo que, o valor do F crítico deve ser menor que o de F calculado, o que
indica a significância da regressão. Já a análise do gráfico dos resíduos permite
detectar problemas no ajuste da curva como, por exemplo, desvios de linearidade,
heterocedasticidade, pontos anômalos, parâmetros utilizados para investigar a
adequabilidade de um modelo de regressão linear, onde as suposições do modelo
ajustado precisam ser validadas para que os resultados sejam confiáveis (RIBEIRO
et al., 2008).
28
A homocedasticidade é, na maioria das vezes, um requisito necessário para a
análise de variância (ANOVA). Sob heterogeneidade de variância, o método dos
mínimos quadrados ordinários não produz os melhores estimadores e o teste F, as
comparações múltiplas, os contrastes ortogonais, ou a estimação dos componentes
de variância poderão ser fortemente afetados. Isto é, dependendo do grau de
severidade da heterogeneidade das variâncias, a análise de variância pode ter sua
significância estatística comprometida (RIBOLDI et al., 2014).
Para resumir todas as etapas estatísticas o guia de estatística n°10 de 2017
apresenta o fluxograma, mostrado na Figura 6.
29
Figura 6: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da ANVISA (ANVISA, 2017a).
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
INÍCIO
Avaliação Visual
É VISIVELMENTE
LINEAR?
Tratamento
matemático dos
dados para adaptação
do modelo
Avaliação das
Variâncias (teste de
hipóteses)
É HOMOCEDÁSTICO?
Heterocedástico
(MMQP)
Homorocedástico
(MMQO)
Anova e correlação
(MMQP) Anova e correlação
(MMQO)
Valor de r e teste F
Análise de resíduos
Os requisitos da
resolução foram
atendidos?
Linearidade Não
comprovada – Método não pode ser
aceito
Linearidade
comprovada
FIM FIM
30
1.6.4 Faixa de trabalho
A faixa de trabalho deve ser estabelecida a partir dos estudos de linearidade,
juntamente com os resultados de precisão e exatidão, sendo dependente da
aplicação pretendida (ANVISA, 2017b).
1.6.5 Precisão
A precisão deve avaliar a proximidade entre os resultados obtidos por meio de
ensaios com amostras preparadas conforme descrito no método analítico a ser
validado. A precisão deve ser expressa por meio da repetibilidade, da precisão
intermediária ou da reprodutibilidade. A precisão deve ser demonstrada pela
dispersão dos resultados, o valor do DPR não deve ser superior a 5% para
metodologias analíticas e 15% para bioanalíticas (INMETRO, 2010; ANVISA,
2017b). Calculando-se o desvio padrão relativo (DPR) da série de medições
conforme a Equação 2:
Equação 2
Onde que DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.
Segundo Ribani e colaboradores, para a repetibilidade, o INMETRO
recomenda sete ou mais repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão
(RIBANI et al., 2004). O guia ICH3 e a ANVISA sugerem utilizar, no mínimo, 9 (nove)
determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3 (três)
concentrações: baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas em cada nível ou 6 (seis)
réplicas a 100% (cem por cento) da concentração do teste individualmente
preparadas (ICH, 2005).
Os três modos mais comuns de representar a precisão são repetibilidade,
precisão intermediária e reprodutibilidade, onde a repetibilidade é a concordância
entre os resultados de um curto período de tempo com o mesmo analista e a mesma
instrumentação e cada análise é independente, de modo que a repetibilidade do
ensaio revela o quão reprodutível o método pode ser. Já a precisão intermediária é a
31
concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias, com
analistas e/ou equipamentos diferentes (INMETRO, 2010).
A determinação da precisão intermediária é recomendada um mínimo de dois
dias diferentes, com analistas diferentes. Reprodutibilidade é a concordância entre
os resultados obtidos em laboratórios e por analistas diferentes como em estudos
colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica,
embora a reprodutibilidade não seja um componente de validação de método
executado por um único laboratório, é considerada importante quando busca-se a
verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação
obtidos através de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2010; ANVISA, 2017b).
1.6.6 Exatidão
A exatidão de um método analítico deve ser medida por meio do grau de
concordância entre os resultados individuais do método em estudo em relação a um
valor aceito como verdadeiro. A exatidão deve ser verificada a partir de, no mínimo,
9 (nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou
seja, 3 (três) concentrações: baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas em cada nível
(ANVISA, 2017b).
A exatidão deve ser expressa pela relação percentual de recuperação do
analito de concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a
concentração média, determinada experimentalmente, e a concentração teórica
correspondente, dada pelas Equações 3 e 4, conforme RDC 166/17:
Equação 3
Equação 4
Onde: CA é a concentração experimental do analito e CTA é a concentração
teórica do analito adicionado.
32
A especificação pode variar conforme a concentração do analito na amostra,
conforme a Tabela 3 transcrita do guia da AOAC (Association of Analytical
Communities) (AOAC, 2016).
Tabela 3: Recuperação esperada como função da concentração analítica.
1.6.7 Limite de Detecção
O limite de detecção é a menor quantidade da substância presente em uma
amostra que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas (ICH, 2005).
A determinação do limite de detecção pode ser realizada por meio de método
visual, da razão sinal-ruído, baseado na determinação do branco ou em parâmetros
da curva de calibração, considerando-se as particularidades do método analítico
utilizado (ANVISA, 2017b).
O limite de detecção é calculado com base na regressão da curva de
calibração segundo o descrito no guia do ICH Q2 (R1) e RDC 166/17 utilizando a
Equação 5:
Equação 5
LD é o limite de detecção, s é o desvio padrão do intercepto e S é o
coeficiente angular da curva, onde a partir do desvio padrão do intercepto com o
eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações
do analito próximas ao suposto limite de detecção (ICH, 2005; ANVISA, 2017b).
33
1.6.8 Limite de quantificação
O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra
que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas. Devem ser testadas precisão e exatidão nas
concentrações correspondentes ao limite de quantificação (ANVISA, 2017b).
O limite de quantificação é calculado com base na regressão da curva de
calibração segundo o descrito no guia do ICH Q2 (R1) e RDC 166/17 utilizando a
seguinte Equação 6:
Equação 6
LQ é o limite de quantificação, s é o desvio padrão do intercepto e S é o
coeficiente angular da curva, onde a partir do desvio padrão do intercepto com o
eixo Y de, no mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo concentrações
do analito próximas ao suposto limite de detecção (ICH, 2005; ANVISA, 2017b).
1.6.9 Robustez
A robustez é um parâmetro que indica a capacidade do método em resistir a
pequenas e deliberadas variações das condições analíticas (ANVISA, 2017b). Tal
capacidade deve ser investigada na etapa de desenvolvimento. Com os dados
obtidos dos efeitos destes parâmetros nos resultados, pode-se delimitar a faixa
aceitável de valores a ser incluída no método final (HARRIS, 2001; INMETRO, 2010;
ANVISA, 2017b).
No caso de análises realizadas por CLAE, alguns dos itens avaliados são a
variação do pH da fase móvel, variação da composição da fase móvel, variação da
temperatura, do fluxo, temperatura da coluna, volume de injeção, variação dos
fabricantes de equipamentos e colunas cromatográficas (HARRIS, 2001).
Demais parâmetros estão descritos na Tabela 4, conforme a RDC 166/17.
34
Tabela 4: Condições para a avaliação da robustez do método.
Parâmetros a serem modificados
Preparo das Amostras Estabilidade das soluções analíticas Tempo de extração Compatibilidade de filtros
Espectrofotometria Variação do pH da solução Diferentes lotes ou fabricantes de solventes
Cromatografia Líquida Variação do pH da fase móvel Variação na composição da fase móvel Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Fluxo da fase móvel
Cromatografia Gasosa Diferentes lotes ou fabricantes de colunas Temperatura Velocidade do gás de arraste
Outras técnicas analíticas As variações a serem testadas deverão ser avaliadas criticamente e seus resultados deverão ser apresentados
35
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico por
UHPLC-MS para quantificar catequina e epicatequina encontrados nos extratos de
M. ilicifolia e M. aquifolium, diferenciar a composição química das duas espécies e
aplica-lo a amostras comerciais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver um método analítico utilizando cromatografia líquida de ultra-alta
eficiência acoplada a espectrometria de massas adequado para avaliar os principais
componentes encontrados nos extratos das folhas de Maytenus ssp, a fim de
identificar marcadores químicos para diferenciação de cada espécie.
Avaliar os extratos aquosos e hidroalcoólicos e verificar os componentes e a
recuperação dos mesmos, para definir o melhor método de extração.
Acompanhar o perfil cromatográfico dos extratos, procurando identificar os
principais compostos por comparação dos seus espectros de massas com padrões
ou dados de literatura.
Validar o método analítico para quantificação de catequina e epicatequina das
folhas Maytenus ssp, conforme os parâmetros conforme RDC 166/17.
Analisar amostras comerciais com o objetivo de verificar se correspondem ao
padrão esperado de M. ilicifolia ou M. aquifolium, e determinar sua concentração de
catequina e epicatequina aplicando o critério de aceitação de teor de epicatequina
descrito na monografia da planta.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 REAGENTES, GASES E SOLVENTES
Acetonitrila – Merck®;
Metanol – Merck®;
Ácido fórmico – Labsynth®;
Hidróxido de amônia – Labsynth®;
Água ultrapura – MilliPore®;
Gás nitrogênio – Peak®.
3.2 MATERIAIS
Vidrarias de laboratório;
Frascos de vidro âmbar de 5 mL;
Filtros de seringa de 22 µm em PTFE;
Micropipetas com capacidades de 10 μL, 200 μL, 1000 μL;
Balão volumétrico de 5 mL e 10 mL.
3.3 EQUIPAMENTOS
UHPLC-MS (TQD) Acquity - Waters Corporation®;
Balança analítica – Marte;
Centrifuga – Thermo Scientic®;
Ultrassom - MaxLabor®;
Freezer- Thermo Scientic®.
3.4 AMOSTRA DE PLANTAS PREVIAMENTE IDENTIFICADAS
Foram utilizadas folhas de Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss, Maytenus
aquifolium Mart. e indivíduos híbridos derivados do cruzamento de ambas as
espécies, localizadas no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em Paulínia
(SP).
37
Logo após a coleta as folhas foram congeladas e mantidas em freezer a -80ºC
e depois liofilizadas.
3.5 AMOSTRA DE FOLHAS E FITOTERÁPICOS ADQUIRIDAS NO MERCADO
Foram adquiridas amostras em farmácia de manipulação e em feiras, sendo
também compradas em forma de folhas secas e cápsulas para a verificação da
espécie e teor de epicatequina. Na Tabela 5 constam a origem, marca, cidade e
validade dessas amostras, todas analisadas em 2018.
Tabela 5 - Amostras adquiridas em farmácia de manipulação e feiras para verificação da espécie e teor de epicatequina.
Amostra Origem Marca Cidade Validade
1 – M. ilicifolia (Controle) CPQBA - Campinas -
2 – M. aquifolium (Controle) CPQBA - Campinas - 3 – Folha Feira em granel Mercado municipal Lindóia -
4 – Folha Feira em granel Mercado municipal Jacareí - 5 – Folha Feira em granel Mercado municipal Jacareí - 6 – Folha Feira em granel Mercado municipal Araraquara - 7 – Folha Feira em granel Mercado municipal Itapira - 8 – Folha Feira em granel Mercado municipal Itapira -
9 – Folha Farmácia de manipulação
Botica São José do Rio
Pardo 02/2019
10 – Folha Farmácia de manipulação
Natural florien Itapira 02/2019
11– Folha Farmácia de manipulação
Flor do Campo Itapira 04/2019
12 – Folha Farmácia de manipulação
Kodilan Itapira 04/2019
13 – Folha Farmácia de manipulação
Chamomilla Itapira 02/2019
14 – Folha Farmácia de manipulação
Hibisco São José do Rio
Pardo 03/2019
15 – Folha Farmácia de manipulação
Casa das ervas São Francisco
Araraquara 11/2020
16 – Folha Farmácia de manipulação
Natural fórmula São José do Rio
Pardo 03/2019
17 – Folha Farmácia de manipulação
Produtos da roça Araraquara 05/2019
18 – Cápsula Farmácia de manipulação
Chamomilla Itapira 03/2019
19 – Cápsula Farmácia de manipulação
Bioform Nsa Atibaia 07/2019
20 – Cápsula Fitoterápico
industrial Apis Flora Ribeirão Preto 06/2020
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3.6 PADRÃO ANALÍTICO
(+/-) Catequina – Sigma-Aldrich®;
(-) Epicatequina - Sigma-Aldrich®.
3.7 PREPAROS DAS SOLUÇÕES
3.7.1 Preparo das soluções e fases móveis
As soluções amostra, soluções padrão e fases móveis foram preparadas
conforme procedimentos compatíveis com a técnica de UHPLC-MS.
3.7.2 Preparo da fase móvel
Transferiu-se 1 mL de ácido fórmico em 1000 mL de água ultrapura Fase (A)
e solventes grau HPLC (Acetonitrila).
3.7.3 Preparo da solução padrão
Foram preparadas soluções estoques de catequina e epicatequina nas
concentrações de 1 mg/mL em metanol. Logo após foram transferidas 10 µL destas
soluções e diluídas com água para um balão 10 mL contendo concentração final de
1µg/mL.
3.7.4 Preparo da solução amostra
Solução amostra (folhas): foram pesados 20 mg de folhas liofilizadas para 10
mL de água ultrapura, com maceração assistida por ultrassom por 15 minutos. Após
o término foi filtrada e transferida 5 mL da amostra para um balão de 10 mL e
completado com água ultrapura.
Solução amostra (cápsulas): foi realizado o peso médio com 10 cápsulas,
calculado e pesado a quantidade equivalente a 20 mg de folhas liofilizadas para 10
mL de água ultrapura, com maceração assistida por ultrassom por 15 minutos. Após
o término foi filtrada e transferida 5 mL da amostra para um balão de 10 mL e
completado com água ultrapura.
39
3.7.5 Preparo da amostra para o teste de efeito de matriz
A técnica de adição de padrão na amostra foi utilizada para a determinação
do efeito de matriz, onde foram preparados sete concentrações diferentes dentro da
faixa de trabalho de 0,1 µg/mL até 2,0 µg/mL de duas soluções-estoque, solução
estoque (1) de 50 µg/mL de catequina e epicatequina e solução estoque (2)
contendo ambos analitos na concentração de 2,5 µg/mL. A solução amostra foi
preparada conforme descrito no item 3.7.4 e o volume final foi completado com água
ultrapura. A Tabela 6 demonstra as diluições realizadas na construção da curva
analítica.
Tabela 6: Preparo da curva analítica para o efeito de matriz.
Concentração (µg/mL)
Solução utilizada (padrão)
Aliquota (µL)
Solução Amostra
(µL)
Volume final (µL)
2,0 Estoque 1 40 500 1000 1,5 Estoque 1 30 500 1000 1,0 Estoque 1 20 500 1000 0,5 Estoque 1 10 500 1000 0,25 Estoque 2 100 500 1000 0,10 Estoque 2 40 500 1000 0,00 0 0 500 1000
3.7.6 Preparo da amostra para o teste linearidade
O teste de linearidade foi preparado utilizando seis concentrações diferentes
dentro da faixa de trabalho de 0,1 µg/mL até 2,0 µg/mL de duas soluções estoques,
solução estoque (1) de 50 µg/mL de catequina e epicatequina e solução estoque (2)
contendo ambos analitos na concentração de 2,5 µg/mL. A Tabela 7 demonstra as
diluições realizadas na construção da curva analítica utilizando água como solvente:
Tabela 7: Preparo da curva analítica para o teste de linearidade.
Concentração (µg/mL)
Solução utilizada Alíquota (µL) Volume final (µL)
2,0 Estoque 1 40 1000 1,5 Estoque 1 30 1000 1,0 Estoque 1 20 1000 0,5 Estoque 1 10 1000 0,25 Estoque 2 100 1000 0,10 Estoque 2 40 1000
40
3.8 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPONENTES
Os componentes do extrato das folhas de Maytenus ssp foram caracterizados
através do perfil cromatográfico dos extratos e da comparação dos seus espectros
de massas com padrões ou dados da literatura.
3.9 DADOS ESTATÍSTICOS
Foram utilizados o suplemento de ferramentas de análise do Excel e Action
Stat versão 3.
3.10 CONDIÇÕES ANALÍTICAS
3.10.1 Condições cromatográficas
As condições definidas foram: temperatura do forno em 30°C, temperatura do
amostrador 10°C, coluna C18 BEH Acquity Waters® (1,7 µm x 2,1 mm x 50 mm),
fluxo de 0,2 mL/min e o gradiente de eluição conforme Tabela 8.
Tabela 8: Gradiente de eluição do método desenvolvido.
Tempo (min) Fluxo
(mL/min) Fase Móvel A
água acidificada (%) Fase Móvel B
acetonitrila (%)
Inicial 0,2 95 05 4,00 0,2 75 25 6,10 0,2 50 50 6,20 0,2 05 95 8,50 0,2 05 95 8,51 0,2 95 05
10,00 0,2 95 05
3.10.2 Condições espectrométricas
A aquisição dos espectros em modo full scan (m/z 100 a 1500) e SIM (m/z
289), com ionização por eletrospray modo negativo (ESI-) e analisador do tipo Triplo
Quadrupolo (TQD), com temperatura do capilar mantido à 150°C e do gás de
secagem a 250°C, voltagem do capilar a 4,00 kV e voltagem do cone a 25 V.
41
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO
Foram preparados inicialmente extratos de folhas de M. aquifolium, M. ilicifolia
e plantas híbridas usando as proporções indicadas na Farmacopeia Brasileira de
Fitoterápicos: 200 mg de folha em 10 mL de água em temperatura ambiente e 30
minutos no ultrassom. Os extratos foram injetados no espectrômetro de massas
diretamente através da técnica de fingerprint, com o objetivo de um conhecimento
prévio da composição dos mesmos.
O principal modo para separação de compostos orgânicos por LC-MS é a
fase reversa com ou sem o uso de par iônico. Devido à robustez e facilidade no
desenvolvimento do método, a cromatografia líquida em fase reversa cobre mais de
95% das aplicações (MALIK et al., 2010). Portanto, o ponto inicial para o
desenvolvimento do método analítico foi a decisão pelo uso do modo fase reversa
no UHPLC-MS, onde foi utilizada uma coluna C18. Os solventes mais comumente
empregados como fase móvel em LC-MS no modo fase reversa são água, metanol e
acetonitrila, com eluição por gradiente. Os tampões utilizados como fase móvel
devem ser voláteis para evitar problemas na interface com o espectrômetro de
massas, sendo assim, os mais comuns são: ácido acético, ácido fórmico, acetato de
amônio, formiato de amônio e amônia.
A composição da fase móvel é de suma importância para obter uma boa
separação, além de influenciar na ionização dos analitos e na detectabilidade do
espectrômetro de massas. A quantidade do modificador orgânico pode ou não
favorecer a eficiência de ionização, dependendo da interface utilizada (MALIK et al.,
2010).
Inicialmente foi utilizada água acidificada (0,1% de ácido fórmico) e
acetonitrila com eluição por gradiente, onde a proporção inicial foi de 90% aquoso
até 8 minutos com 100% orgânico, porém não houve separação dos isômeros:
catequina e epicatequina (Figura 7). Foram avaliados diversos gradientes, a fim de
melhorar a separação da catequina e epicatequina. Estes isômeros de posição
possuem a mesma massa carga (m/z), sendo assim necessária a separação
cromatográfica destes componentes antes da espectrometria de massas.
42
Uma boa resolução entre os picos é de suma importância para uma boa
integração dos picos, além disso, a simetria é outro parâmetro importante para a
quantificação dos componentes. Nas Figuras 7, 8 e 9 apresentam-se alguns
exemplos das corridas cromatográficas obtidas durante o desenvolvimento do
método analítico.
Na Figura 9 é demonstrado o cromatograma na condição desenvolvida, com
uma boa resolução entre os picos de interesse, sendo que catequina possui um
tempo de retenção de 2,77 minutos e a epicatequina 3,29 minutos.
Figura 7: Fluxograma para avaliação estatística seguindo guia n° 10 de 2017 da ANVISA (ANVISA, 2017a).
Figura 8: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo durante o desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme apresentado na tabela.
43
Figura 9: Cromatograma do íon m/z 289 em modo negativo na condição no final do desenvolvimento do método analítico utilizando o gradiente de eluição conforme apresentado na tabela. (A) Pico cromatográfico referente a catequina e (B) Pico cromatográfico referente a epicatequina.
A eficiência do processo de ionização por eletrospray (ESI do inglês,
Electrospray Ionization) depende da condutividade e da tensão superficial do líquido
a ser nebulizado. Devido a tensão superficial da água ser maior que a do metanol ou
da acetonitrila, a detecção é reduzida quando se utiliza quantidades superiores a 70-
80% de água na fase móvel. A relação entre a quantidade de solvente orgânico e
água é mais significante quando se trabalha em vazões maiores, pois maior
quantidade de solvente deve ser nebulizada e evaporada. A adição de modificadores
de pH, como ácido acético, ácido fórmico ou hidróxido de amônio exerce grande
influência na separação e ionização dos analitos. (MALIK et al., 2010).
A ionização por ESI pode ser feita pelo modo positivo ou negativo, foram
avaliados ambos os modos, porém o modo negativo apresentou melhores
resultados, ou seja, com maior ionização dos componentes e resultados mais
reprodutivos. Niero e Andrade (2010) descreveram que a gênero Maytenus é
composta por flavonoides e compostos fenólicos que são mais ionizados em modo
negativo (NIERO et al., 2011).
Após a definição da eluição do gradiente, foram avaliados os solventes
acetonitrila e metanol para fase orgânica, água acidificada (0,1% ac. fórmico) e água
basificada (0,1% de hidróxido de amônio) para fase aquosa. Os resultados obtidos
mostraram que o uso de água basificada diminuiu a resolução dos picos
cromatográficos. Em relação ao solvente orgânico não houve diferença, sendo
assim escolheu-se a utilização da acetonitrila, pois segundo Brito (2014), acetonitrila
apresenta menor viscosidade em relação ao metanol e isso reduz a pressão do
sistema e aumenta a vida útil da coluna (BRITO, 2014), sendo assim a corrida
cromatográfica ficou definida com a eluição do gradiente conforme Tabela 8.
44
4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES
Na Tabela 9 constam os valores de m/z de sete compostos sendo que cinco
foram identificados de acordo com dados encontrados na literatura e dois foram
confirmados em comparação com padrões que são os íons de m/z 289.
Tabela 9: Informações sobre m/z (ionização modo negativo), dos prováveis compostos encontradas nas amostras.
Substância (m/z) M. ilicifolia M. aquifolium Híbrido
Catequina (289) X - X Epicatequina (289) X X X
Epigalocatequina (305) X X X Isoquercitina (463) X - X Quercitrina (477) X - X
Quercitrina-di-(ramnohexosídeo) (917) - X X Canferol-di-(ramnohexosídeo) (901) - X X
Existem componentes que diferem entre as espécies, como por exemplo,
catequina, isoquercitina e quercetina que não estão presentes na M. aquifolium, ou
abaixo do limite de detecção. Além da diferença apresentada em relação à
catequinas e epicatequina, existem outros íons detectados, porém não identificados.
Os componentes encontrados nas duas espécies e seus híbridos apresentam
concentrações diferentes entre si. Tal fato é de suma importante uma vez que se
preconiza o uso de M. ilicifolia no Formulário de Fitoterápicos (2011).
Alguns exemplos de cromatogramas duas espécies e seus híbridos (Figuras
10, 11 e 12) demonstrando alguns íons que se diferem entre o extrato de amostras
botanicamente identificadas de M. ilicifolia e M. aquifolium e a híbrida possuindo
ambos componentes.
45
Figura 10: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. Ilicifolia sendo A- íon extraído de m/z 755, B - íon extraído de m/z 289, C- íon extraído de m/z 305, D. Cromatograma de íons totais (TIC).
Figura 11: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de M. aquifolium sendo A: íon extraído de m/z 901, B: íon extraído de m/z 917, C: íon extraído de m/z 289, D: Cromatograma de íons totais (TIC).
46
Figura 12: Cromatogramas UHPLC-MS de extrato de Maytenus ssp (híbrida) sendo A: íon extraído de m/z 917, B: íon extraído de m/z 289, C: Cromatograma de íons totais (TIC).
AM Hibrida CPQ-BA
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
Amostra 10_1 2: Scan ES- 917
1.25e6
3.49
3.272.780.63 2.37
3.789.974.13
Amostra 10_1 2: Scan ES- 289
7.43e6
3.30
2.790.890.59
3.37
Amostra 10_1 2: Scan ES- BPI
7.50e6
0.68
0.63
3.300.85
0.97
1.00
3.002.822.09
1.71
9.058.87
7.677.573.72
7.21
3.78
6.655.093.906.26
7.97
9.32
9.45
9.62
4.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA
Inicialmente foram preparados extratos aquosos (temperatura ambiente e
37°C) e hidroalcoólicos (50% e 70%) na proporção estabelecida no Formulário de
Fitoterápicos, onde foram pesados 200 mg das folhas de Maytenus ssp em 10 mL
de líquido extrator. Porém foi verificado que os extratos ficaram muito concentrados,
saturando o solvente extrator e havendo a necessidade de várias extrações
subsequentes por causa da dificuldade de recuperação dos componentes do extrato.
Como a concentração dos componentes eram desconhecidos foram utilizados
cálculos a partir das áreas de cada substância por extração e dividida pela somatória
de suas áreas até esgotamento da mesma do extrato, com isso houve possibilidade
de calcular a eficiência da extração em relação a recuperação das áreas.
Após vários ensaios foi determinada a proporção de 20 mg das folhas secas
das plantas para 10 mL de líquido extrator e 30 minutos no ultrassom, havendo a
necessidade somente de 1 extração, resultando em uma recuperação média
superior à 95%, tanto para extratos aquosos como hidroalcoólicos.
C
A
B
47
A Tabela 10 resume os testes realizados para a adequação da extração para
alguns componentes:
Tabela 10: Resultados das diferentes extrações e pesagens para M. ilicifolia.
Maytenus ilicifolia
Preparação da amostra
200 mg/10 mL 30 mg/10 mL 20 mg/10 mL
Aquoso 2
5°C
Aquoso 3
7°C
hid
roalc
óolic
o
50%
hid
roalc
óolic
o
70%
Aquoso 2
5°C
Aquoso 3
7°C
hid
roalc
óolic
o
50%
hid
roalc
óolic
o
70%
Aquoso 2
5°C
Aquoso 3
7°C
hid
roalc
óolic
o
50%
hid
roalc
óolic
o
70%
Recuperação Extração 1(%)
50,7 52,1 53,2 55,8 79,8 78,1 80,4 82,1 97,8 97,2 98,8 97,0
Recuperação Extração 2(%)
80,7 80,9 75,6 78,9 94,6 95,3 95,9 94,7 99,4 99,2 99,1 98,9
Recuperação Extração 3(%)
90,1 92,0 92,5 92,7 98,1 98,2 99,4 97,8 - - - -
Os extratos aquosos (temperatura ambiente e 37°C) e hidroalcoólicos (50% e
70%) apresentaram semelhança no perfil de componentes no extrato, portanto foi
definida como o líquido extrator a água em temperatura ambiente, pois além de ser
um preparo mais simples apresentou melhora na simetria e resolução dos picos dos
isômeros (catequina e epicatequina) em relação aos hidroalcoólicos, conforme
Figura 13.
Figura 13: (A): Cromatograma dos extratos aquoso e (B) hidroalcoólico.
4.4 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
4.4.1 Seletividade
A
B
48
Conforme mencionado existem quatro maneiras de aquisição de dados com
LC-MS/MS. Neste trabalho foi conduzido com apenas o modo MS, pois a catequina
e a epicatequina não apresentaram uma fragmentação que possibilitasse a
utilização do monitoramento seletivo de reação (selected-reaction monitoring). Foi
utilizado o modo SCAN (100 – 1500 m/z) e o modo SIM, onde na mesma corrida
tem-se o perfil completo do extrato e também a extração do íon m/z 289 onde são
eliminadas quaisquer interferências da matriz (Figura 14).
Figura 14: (A) Cromatograma UHPLC-MS em modo SCAN e (B) em modo SIM selecionado o íon m/z 289 da amostra M. ilicifolia. AM - Lindoia
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
Amostra 3_1 2: Scan ES- TIC
7.43e7
9.50
7.670.70
7.223.82
3.302.83 6.67
8.717.849.17
Amostra 3_1 1: SIR of 1 Channel ES- TIC (cat)
1.39e6
3.27
2.78
0.89
0.60
9.587.01
O solvente foi injetado conforme condição nominal e mostrando que não há
interferência na matriz (Figura 15), sendo comprovado no item 4.3.2.
A
B
49
Figura 15: Verificação de inexistência de interferente m/z 289 no solvente.
4.4.2 Efeito de matriz
O efeito de matriz foi avaliado conforme descrito no item 3.7.5. Segundo a
RDC 166/17, a comprovação do paralelismo das retas deve ser realizada por meio
de avaliação estatística adequada e a confirmação que as retas são paralelas é
indicativa de ausência de interferência dos constituintes da matriz, portanto foi
utilizado a equação 1, citada anteriormente e o programa estatístico Action Stat.
Tabela 11: Cálculo de efeito de matriz utilizando a equação 1.
Catequina Epicatequina Interferência
Coeficiente angular com matriz
286031 290625 1,72
Coeficiente angular sem matriz
291025 298079 2,50
Tabela 12: Resultado do teste de paralelismo para a catequina e a epicatequina utilizando o
programa estatístico Action Stat.
G.L. Estat. F P-valor
Catequina 1 1,1623 0,2878 Epicatequina 1 1,0788 0,3055
50
Como o P-valor 0,2878 e 0,3055 para catequina e epicatequina
respectivamente do teste de paralelismo são maiores que 0,05, não rejeitamos a
hipótese de que os coeficientes angulares são iguais ao nível de significância de 5%.
Neste caso, dizemos que as retas são paralelas.
É possível verificar visualmente que não houve de efeito de matriz, uma vez
que a curva construída com apenas solvente possui inclinação semelhante a curva
construída com adição de padrão na amostra e as curvas são paralelas entre si,
tanto para catequina quanto para a epicatequina (Figuras 16 e 17).
Figura 16: Comparação das curvas analíticas para a catequina no solvente e na matriz.
Figura 17: Comparação das curvas analíticas para a epicatequina no solvente e na matriz.
51
4.4.3 Linearidade
As soluções foram preparadas conforme item 3.7.6 e em triplicata, na Tabela
13 encontram-se os resultados obtidos para catequina e epicatequina. Obteve-se o
gráfico das áreas em função da concentração do analito e a equação da reta de
regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos quadrados.
Tabela 13: Resultados das respostas analíticas em função da concentração e desvio padrão relativo (DPR) correspondente.
Concentração (µg/mL)
Catequina Epicatequina
Área (média) DPR (%) Área (média) DPR (%)
0,10 37.091 7,15 35.374 9,80 0,25 84.939 4,97 84.052 8,76 0,50 160.969 0,67 155.490 9,38 1,00 289.216 4,30 287.657 1,30 1,50 437.683 1,95 423.325 2,80 2,00 599.487 2,95 607.628 3,06
Conforme o guia da ANVISA n°10 de 2017, antes de qualquer avaliação
estatística propriamente dita, é importante fazer uma análise visual para observar se
os pontos, quando dispostos no gráfico, têm relação linear aparente (Figura 18).
Figura 18: Análise gráfica da regressão linear dos componentes catequina e epicatequina realizados em solvente.
4.4.3.1 Avaliação da semelhança das curvas analíticas
52
Conforme demonstrado visualmente no teste de linearidade, as curvas da
catequina e epicatequina são semelhantes, portanto, para a comprovação foi
realizado o cálculo estatístico para verificar a semelhança das curvas.
Para que as curvas analíticas sejam consideradas semelhantes elas devem
ser aprovadas no teste de igualdade do intercepto teste de paralelismo e teste de
coincidência e os resultados estão apresentados na Tabela 14.
Tabela 14: Resultado a avaliação da semelhança entre as retas.
G.L. Estat. F P-valor
Igualdade do Intercepto 1 1,1158 0,2987 Paralelismo 1 0,9004 0,3498 Coincidência 2 0,5744 0,5687
Como o P-valor (0,2987, 0,3498 e 0,5687) são maiores que 0,05, podemos
considerar que os interceptos das retas são paralelas e coincidentes ao nível de
significância de 5%. Neste caso, dizemos que as retas são semelhantes.
4.4.3.2 Avaliação da homocedasticidade
O método mínimos quadrados (MMQ) é recomendado para a estimativa da
equação da reta. Este método pode ter um fator de ponderação, sendo então
denominado método dos mínimos quadrados ponderados (MMQP) ou pode ser
aplicado diretamente, sem fator de ponderação, sendo então denominado método
dos mínimos quadrados ordinários (MMQO). O MMQO também pode ser entendido
como um caso particular do MMQP no qual o fator de ponderação é igual a 1. Para a
escolha do método a ser utilizado, deve se considerar a variância dos resultados de
y para cada valor de x. Se a variância de y for constante (situação denominada
homocedasticidade), pode-se utilizar o MMQO. Caso sejam observadas alterações
de variância de y (situação denominada heterocedasticidade) é recomendável que
se utilize o MMQP, pois a utilização do MMQO poderá gerar resultados tendenciosos
(ANVISA, 2017a).
Para avaliação da homocedasticidade foi utilizado o Teste de Cochran, o
seguinte teste de hipóteses:
H0: Variâncias dos níveis são iguais;
H1: Pelo menos uma variância diferente.
53
Tabela 15: Resultados do teste de Cochran.
Estatística GL P-valor
Catequina 0,553 3 0,107 Epicatequina 0,427 3 0,3704
O resultado pode ser visto na Tabela 15, como o P-valor (0,107 e 0,3704) da
catequina e epicatequina são maiores que 0,05 e os valores estatísticos (0,553 e
0,427) são menores do que 0,616 (valor C tabelado) não rejeitamos a hipótese de
igualdade das variâncias ao nível de significância de 5%. Logo, os dados são
homocedástico.
4.4.3.3 Avaliação dos coeficientes
Para avaliar a significância do coeficiente angular do modelo utilizamos o teste
F da ANOVA. Neste caso, testamos as seguintes hipóteses:
H0: coeficiente angular igual a zero;
H1: coeficiente angular diferente de zero.
Tabela 16: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente angular.
G.L. Estat. F P-valor
Catequina Concentração
(µg/mL) 1 5534,48 9,38x10-22
Epicatequina Concentração (µg/mL)
1 2223,76 1,34x10-18
Os resultados estão na Tabela 16, como o P-valor (9,38x10-22 e 1,34x10-18) do
teste F da ANOVA é menor que 0,05 e os valores estatísticos são maiores do que
6,12 (valor F tabelado) considera-se o coeficiente angular diferente de zero ao nível
de significância de 5%.
Para avaliar o intercepto (coeficiente linear) utiliza-se o teste t de Student.
Neste caso, as seguintes hipóteses são:
H0: intercepto (coeficiente linear) igual a zero;
H1: intercepto diferente de zero.
54
Tabela 17: Resultados da ANOVA – Avaliação da significância do coeficiente linear.
Estat.t P-valor
Catequina Intercepto 1,9998 0,0628 Epicatequina Intercepto 0,0046 0,9964
Os valores mostrados na Tabela 17, como o P-valor (0,0628 e 0,9964) da
catequina e epicatequina respectivamente do teste t são maiores que 0,05 e os
valores estatísticos de T são menores que 4,30 (valor tabelado) o intercepto é
considerado igual a zero ao nível de significância de 5%.
O coeficiente de correlação de Pearson mede o grau de dependência linear de
uma variável explicativa e a variável resposta e os valores podem ser conferidos na
Tabela 18.
Tabela 18: Resultados do desvio padrão dos resíduos, coeficiente de determinação e correlação.
Graus de Liberdade
R2 Coeficiente de Correlação
Catequina 16 0,9971 0,9986 Epicatequina 16 0,9929 0,9964
Como o coeficiente de correlação para a catequina é 0,9986 e para
epicatequina é 0,9964, sendo maiores que 0,99, concluímos que existe uma relação
linear.
4.4.3.4 Análise dos resíduos
Os gráficos para avaliação visual devem incluir a distribuição de todos os
resíduos em função da concentração e da resposta.
Os resultados podem ser observados através das Figuras 19 e 20:
55
Figura 19: Análise gráfica dos resíduos para a catequina.
56
Figura 20: Análise gráfica dos resíduos para a epicatequina.
Para a verificação da normalidade foi utilizado o teste de Shapiro-Wilk
conforme as hipóteses abaixo e os valores estão apresentados na Tabela 19:
H0: a distribuição dos resíduos é Normal;
H1: a distribuição dos resíduos não é Normal.
Tabela 19: Resultados do teste de normalidade - Shapiro-Wilk.
Estatística P-valor
Catequina 0,9373 0,2606 Epicatequina 0,9623 0,6457
Como o P-valor (0,2606 e 0,6457) da catequina e epicatequina
respectivamente no teste de Shapiro-Wilk são maiores que 0,05 e os resultados
baseados na estatística W são maiores do que 0,908 (valor tabelado), conclui-se
que os resíduos possuem normalidade ao nível de significância de 5%.
57
4.4.3.5 Avaliação de valores extremos ou aberrantes (outliers)
Para a detecção de outliers foram avaliados os resíduos padronizados. Para
estimar os valores fora da faixa esperada são considerados outliers (valores
aberrantes), podem-se utilizar como exemplo o teste de Grubbs. Valores fora da
faixa esperada são considerados outliers (valores aberrantes). Neste caso, é
importante investigar se existe alguma causa analítica para esses valores aberrantes
e se, mesmo com esses valores, os dados ainda podem ser utilizados (ANVISA,
2017a). Como pode ser observado nas Tabelas 20 e 21. Como critério, foram
considerados valores extremos na resposta, as observações com resíduos
padronizados maiores que 3. Não houve outliers.
Tabela 20: Resumo da Análise dos Resíduos para catequina.
N.Obs Concentração (µg/mL) Resíduos Resíduos Padronizados
1 0,1 2077,8451 0,1964 2 0,1 -3142,1549 -0,297 3 0,1 -1337,1549 -0,1264 4 0,25 8134,0429 0,7579 5 0,25 2015,0429 0,1877 6 0,25 32,0429 0,003 7 0,5 6621,7058 0,6066 8 0,5 5606,7058 0,5136 9 0,5 7774,7058 0,7123 10 1 -1661,9683 -0,1509 11 1 -24814,9683 -2,253 12 1 -5315,9683 -0,4826 13 1,5 2064,3576 0,1918 14 1,5 -11161,6424 -1,0371 15 1,5 -13834,6424 -1,2854 16 2 6170,6835 0,6089 17 2 -7157,3165 -0,7063 18 2 27928,6835 2,7559
58
Tabela 21: Resumo da Análise dos Resíduos para epicatequina.
N.Obs Concentração (µg/mL) Resíduos Resíduos Padronizados
1 0,1 3375,0451 0,1975 2 0,1 1764,0451 0,1032 3 0,1 1658,0451 0,097 4 0,25 15442,1629 0,8904 5 0,25 1307,1629 0,0754 6 0,25 11947,1629 0,6889 7 0,5 5080,3592 0,288 8 0,5 -17352,6408 -0,9838 9 0,5 14723,3592 0,8348 10 1 -6363,2483 -0,3575 11 1 -13719,2483 -0,7709 12 1 -11086,2483 -0,6229 13 1,5 -17424,8557 -1,002 14 1,5 -37443,8557 -2,1531 15 1,5 -16413,8557 -0,9438 16 2 42277,5369 2,5819 17 2 5241,5369 0,3201 18 2 16987,5369 1,0374
4.4.3.6 Avaliação da independência
A avaliação da independência das observações através do seguinte teste de
hipóteses Durbin-Watson e os resultados podem ser observados nas Figuras 21e 22
e na Tabela 22:
H0: Observações são independentes;
H1: Observações não são independentes.
Figura 21: Analise gráfica da independência dos resíduos de catequina.
59
Figura 22: Análise gráfica da independência dos resíduos de epicatequina.
Tabela 22: Resultados do teste de Independência - Durbin- Watson.
Estatística P-valor
Catequina 1,5846 0,11 Epicatequina 1,5683 0,11
Como o P-valor (0,11) do teste de Durbin-Watson é maior que 0,05 e os
valores estatísticos de DW são maiores do que 1,5 (valor tabelado), logo, o resíduo
possui independência das observações ao nível de significância de 5%.
A Tabela 23 apresenta um resumo dos resultados dos testes estatísticos e é
possível ver que ambas os dados apresentaram homocedasticidade através do
método de Cochram, ou seja, os dados regredidos apresentam variância constante.
O modelo obtido por mínimos quadrados utilizado foi considerado linear, pois
apresentou coeficiente de correlação ˃ 0,990, o y intercepto se apresentou
estatisticamente igual de 0, ou seja, pode ser utilizado calibração de ponto único
para quantificação.
A avaliação da significância do coeficiente angular foi feita através do teste F,
a avaliação da independência dos resíduos foi realizada pelo teste Durbin Watson e
avaliação da normalidade dos resíduos através de Shapiro Wilk e avaliação de
outliers dos resíduos por Grubbs. Concluindo-se que os resíduos apresentaram
distribuição normal e independência.
60
Tabela 23: Resumo dos resultados estatísticos obtidos no parâmetro linearidade da validação.
Parâmetro Valores
tabelados
Valores calculados (Catequina)
Valores calculados
(Epicatequina)
Homocedasticidade 0,616 0,553 0,427
Coeficiente de correlação (r) 0,99 0,9971 0,9929
Coeficiente de determinação (r2)
- 0,9986 0,9964
Significância do coeficiente angular
6,12 5534 2223
Avaliação do coeficiente linear (intercepto)
4,30 2,00 0,00
Independência dos resíduos 1,5 1,58 1,57
Normalidade dos resíduos 0,908 0,937 0,962
Avaliação de outliers 3,00 Não há outliers Não há outliers
4.4.4 Precisão
O teste de precisão foi realizado em dias diferentes, ou seja, repetibilidade e
precisão intermediária e foram preparadas as amostras em sextuplicata, onde a
amostra foi quantificada através de uma curva de calibração utilizando os pontos
0,25, 0,50, 1,00, 1,50 e 2,00 µg/mL e também a quantificação em ponto único a fim
de saber se haveria diferença entre as duas metodologias. Os resultados estão nas
Tabelas 24 e 25.
Tabela 24: Resultado da repetibilidade realizada dia no 05/05/18.
REP
Catequina Epicatequina Catequina Epicatequina
[µg/mL] [µg/mL] [µg/mL] [µg/mL]
Quantificação pela curva Quantificação ponto único
1 4,22 8,94 4,26 8,92
2 4,62 8,38 4,64 8,38
3 4,30 8,67 4,33 8,65
4 4,36 9,33 4,38 9,30
5 3,78 9,25 3,83 9,23
6 4,31 8,90 4,34 8,88
Média 4,26 8,91 4,30 8,89
DP (σ) 0,28 0,36 0,26 0,35
DPR% 6,5 4,0 6,2 3,9
61
Tabela 25: Resultado da precisão intermediaria realizada dia no 19/05/18.
PI
Catequina Epicatequina Catequina Epicatequina
[µg/mL] [µg/mL] [µg/mL] [µg/mL]
Quantificação pela curva Quantificação ponto único
1 4,31 9,05 4,30 9,02
2 4,96 9,83 4,85 9,78
3 4,10 8,75 4,04 8,72
4 4,31 9,64 4,24 9,59
5 4,65 8,84 4,56 8,81
6 4,31 8,66 4,24 8,64
Média 4,44 9,13 4,37 9,09
DP (σ) 0,31 0,49 0,29 0,48
DPR% 7,0 5,4 6,6 5,3
Sendo que a RDC 166/17 não estabelece os valores dos critérios de
aceitação e define que os mesmos devem ser justificados, portanto foi adotado o
critério conforme resolução da ANVISA n° 899 de 2003 que é de DPR <15% e os
resultados da repetibilidade e precisão intermediária estão satisfatórios. A avaliação
da precisão intermediária foi realizada através do programa Action Stat.
A análise de variância (ANOVA) é um método estatístico que testa a hipótese
de que as médias de duas ou mais populações são iguais. A hipótese nula afirma
que todas as médias de população são iguais, enquanto a hipótese alternativa
afirma que pelo menos uma é diferente.
Tabela 26: Resultados da avaliação da precisão intermediária entre dias empregando ANOVA.
G.L. Estatística F P-Valor
Catequina 1 1,0706 0,3252 Epicatequina 1 0,7758 0,3991
Os resultados do teste da ANOVA da catequina e epicatequina podem ser
vistos na Tabela 26. O P-valor de ambas (0,3252 e 0,3991) são maiores que 0,05,
não rejeitamos a hipótese de que o efeito do fator dia seja nulo ao nível de
significância de 5%, ou seja não houve diferença entre os dias.
Além disso, foi avaliada a semelhança entre a quantificação pela curva
analítica versus ponto único (Tabela 27).
Tabela 27: Resultados a variação da forma de quantificação.
G.L. Estatística F P-Valor
Catequina 1 0,0435 0,839 Epicatequina 1 0,008 0,9306
62
Como o P-valor (0,839 e 0,9306) do teste da ANOVA é maior que 0,05, não
rejeitamos a hipótese de que o efeito do fator quantificação (curva analítica ou ponto
único) é nulo ao nível de significância de 5%.
Em resumo, o método apresentou resultados de repetibilidade e precisão
intermediaria satisfatórios e não houve diferença ao quantificar os analitos
comparando com a curva de calibração ou com o ponto único.
4.4.5 Exatidão
A avaliação da exatidão foi realizada em 3 (três) concentrações diferentes:
0,1, 1,0 e 2,0 µg/mL. O preparo foi idêntico ao teste de efeito de matriz descrito no
item 3.6.5. Para a quantificação foi utilizado a equação da reta da linearidade, pois
ambos testes foram realizados no mesmo dia, ou seja, utilizou-se a equação y=
291025x + 8788,6 para catequina e y= 298079x + 32,967 para epicatequina. A
equação 2 descrita no item 1.6.6 foi utilizada para o cálculo da recuperação.
Os valores de recuperação podem ser observados nas Tabelas 28 e 29.
Tabela 28: Resultado da recuperação da catequina.
Concentração Teórica (µg/mL)
Concentração prática (µg/mL)
DPR Recuperação
0,1 0,11 13,89% 109,33% 1,0 0,98 3,84% 98,50% 2,0 2,00 3,98% 100,12%
Tabela 29: Resultado da recuperação da epicatequina.
Concentração Teórica (µg/mL)
Concentração prática (µg/mL)
DPR Recuperação
0,1 0,10 14,12% 103,12% 1,0 0,98 3,50% 97,90% 2,0 2,03 2,06% 101,4%
Conforme a RDC 166/17 não estabelece os valores dos critérios de aceitação
e define que os mesmos devem ser justificados, portanto foi utilizado os critérios de
aceitação estabelecidos segundo guia da AOAC de 2016 onde essa faixa é de 80 –
110%, uma vez que tal critério é baseado na concentração do analito. Sendo assim
63
o método analítico em questão é considerado exato, pois apresenta DPR (%) e
recuperação dentro da especificação.
4.4.6 Limite de Detecção e Quantificação
Os limites de detecção e quantificação foram calculados conforme as
Equações 4 e 5 a partir do desvio padrão do y intercepto da reta que foi realizada
em triplicata conforme item 1.6.8 e os resultados estão na Tabela 30.
Tabela 30: Resultados do limite de detecção e quantificação.
Equação da reta LD (µg/mL) LQ (µg/mL)
Catequina Y=289428x + 4732,4 Y=288962x + 3771,8 Y=283573x + 6011,1
0,03 0,1
Epicatequina Y=303439x + 3808,7 Y=298011x – 1998,4 Y=297270x + 4165,5
0,03 0,1
Portanto o limite de detecção foi de 0,03 µg/mL e o limite de quantificação foi
de 0,1 µg/mL para ambos os componentes.
4.4.7 Faixa de trabalho
A faixa de trabalho definida pelos testes de linearidade, exatidão e precisão
para o método de teor de catequina e epicatequina foi de 0,10 µg/mL à 2,0 µg/mL.
4.4.8 Robustez
4.4.8.1 Variação de fluxo, temperatura da coluna, proporção da fase móvel, lote
de coluna.
O teste foi realizado através da injeção do padrão (concentração de 1 µg/mL)
e amostra com variações do método de forma univariada, ou seja, variando um
parâmetro por vez. Após a injeções foram calculados a recuperação nas condições
testadas os resultados encontram-se na Tabela 31.
64
Tabela 31: Resultados da recuperação do teste de robustez.
Condição Catequina (%) Epicatequina (%)
Nominal 100,0 100,0 Fluxo 0,19 mL/min 97,8 95,7 Fluxo 0,21 mL/min 100,7 97,4 Temperatura 25°C 100,9 97,1 Temperatura 35°C 97,7 98,0
FM 0,5% ácido fórmico 95,5 95,1 FM 1,5% ácido fórmico 101,2 96,7
Coluna SN:021933149157 99,9 96,9
É possível verificar que houve recuperação atendeu o critério de aceitação
que é a faixa de 95% – 105% em todas as condições testadas, ou seja, o método é
robusto para as condições acima nas faixas estudadas.
4.4.8.2 Teste de Filtro
Foi realizado o teste de filtro (Tabela 32) adotando a amostra centrifugada
como 100% e foi calculada a recuperação da amostra filtrada com PDVF 0,22 µm,
pois o tamanho de partícula é compatível com a técnica de UHPLC.
Tabela 32: Resultado do teste de filtro.
Condição Catequina (%) Epicatequina (%)
Centrifugado 100,0 100,0 PVDF 0,22 µm 97,8 103,4
Conforme o resultado da Tabela 32 o filtro PVDF 0,22 µm não causa
interferência para a quantificação de catequina e epicatequina na solução amostra,
pois a recuperação atendeu o critério de aceitação que é a faixa de 95% – 105%.
4.4.8.3 Tempo de extração
Foram preparadas 12 amostras em triplicata as quais foram colocadas no
ultrassom e em seguida retiradas nos tempos 0, 15, 30 e 60 minutos. Foram
avaliados os DPR (%) das áreas obtidas conforme mostrado na Tabela 33:
65
Tabela 33: Resultado do teste de tempo de extração.
Tempo (minutos) Catequina DPR (%) Epicatequina DPR (%)
0 15,20 18,49 15 2,39 3,02 30 2,89 3,50 60 3,48 2,79
Conforme os resultados mostrados na Tabela 33 o tempo mínimo para uma
extração adequada é de 15 minutos.
4.4.8.4 Estabilidade de soluções
A solução padrão foi injetada nos tempos 0, 6, 12, 24 e 36 horas, conforme
Tabela 34:
Tabela 34: Resultado do teste de estabilidade de soluções.
Tempo (horas) Catequina (%) Epicatequina (%)
0 100,0 100,0 6 99,3 98,8 12 98,4 96,3 24 96,5 95,2 36 89,7 88,4
Conforme os resultados demonstrados na Tabela 34 tanto a catequina quanto
a epicatequina degradam em 36 horas e a recuperação apresentou-se fora da faixa
de 95% – 105%, portanto é importante utilizar amostras recentemente preparadas e
no máximo em 24 horas.
4.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO E VALIDADO
Após a validação do método analítico, o mesmo foi aplicado em amostras de
folhas e cápsulas de espinheira santa adquiridas em cinco cidades da região de
Campinas a fim de avaliar as concentrações de catequina e epicatequina, e
indiretamente, verificar a autenticidade / qualidade das amostras comercializadas.
Foram preparadas 18 amostras conforme o descrito no item 3.7.4. Os
cromatogramas (UHPLC-MS) em SCAN apresentaram três diferentes perfis de
característicos. Na Figura 23 observa-se que não foi detectada a catequina, que é
característico da espécie M. aquifolium. Já na Figura 24 observam-se a catequina e
epicatequina, corroborando para confirmação da espécie M. lificifolia. Finalmente, na
66
Figura 25, não foi detectada a catequina nem a epicatequina, bem como outros
marcadores, concluindo-se que a amostra não é proveniente destas espécies de
Maytenus ssp.
A Tabela 35 apresenta as concentrações encontradas de catequina e
epicatequina das folhas e cápsulas comercializadas como M. ilicifolia também a
concentração de epicatequina conforme especificação farmacopéica. Na
Farmacopeia Brasiliera 5ª edição (2010) é descrito que a concentração mínima de
epicatequina para M. ilicifolia é de 2,8 mg de epicatequina para 1 grama da folha.
Figura 23: Cromatograma referentes a amostra 2 (controle) de M. aquifolium e amostra 4 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.
Figura 24: Cromatograma referentes as amostras 1 (controle) de M. ilicifolia e amostras, 3, 5, 10, 11, 13, 17, 18, 19 e 20 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.
AM - Lindoia
Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
Amostra 3_1 2: Scan ES- BPI
1.02e7
0.70
0.18 0.44
8.717.68
7.650.82
7.527.22
3.813.27
1.40 3.161.75 3.56 6.675.675.014.12 4.55 5.396.50
6.34
8.398.00 9.508.91 9.42
9.62
Amostra 2_1 2: Scan ES- BPI
6.62e6
8.897.67
0.96
0.81
0.680.38
7.63
7.537.30
6.653.772.201.89
1.751.34 2.932.70
3.643.19 4.27
3.895.484.65 5.13
5.615.78 6.57 6.75
7.758.058.728.64
9.309.34
9.56
9.67
Amostra 1_1 2: Scan ES- BPI
2.09e7
9.50
0.680.813.83
3.300.972.79
2.48 3.55
7.657.617.22
7.054.13
9.387.79 9.19
8.378.04 8.978.73
Figura 25: Cromatograma referentes as amostras 6, 12, 14 e 15 utilizando o método analítico validado e adquirido em modo SCAN.
AM - Lindoia
Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
%
0
100
Amostra 3_1 2: Scan ES- BPI
1.02e7
0.70
0.18 0.44
8.717.68
7.650.82
7.527.22
3.813.27
1.40 3.161.75 3.56 6.675.675.014.12 4.55 5.396.50
6.34
8.398.00 9.508.91 9.42
9.62
Amostra 2_1 2: Scan ES- BPI
6.62e6
8.897.67
0.96
0.81
0.680.38
7.63
7.537.30
6.653.772.201.89
1.751.34 2.932.70
3.643.19 4.27
3.895.484.65 5.13
5.615.78 6.57 6.75
7.758.058.728.64
9.309.34
9.56
9.67
Amostra 1_1 2: Scan ES- BPI
2.09e7
9.50
0.680.813.83
3.300.972.79
2.48 3.55
7.657.617.22
7.054.13
9.387.79 9.19
8.378.04 8.978.73
67
Tabela 35: Resultado da análise das amostras controle M. aquifolium e M. ilicifolia além das amostras das folhas e cápsulas comercializadas como de M. Ilicifolia.
Amostras Concentração de
Catequina (ug/mL)
Concentração de Epicatequina
(ug/mL)
Concentração de Epicatequina
(mg/g)
1 – M. ilicifolia (Controle) 4,04 8,84 4,42
2 – M. aquifolium (Controle) 0,00 11,08 5,54 3 – Folha 0,82 1,87 0,94
4 – Folha 0,00 3,91 1,96 5 – Folha 2,65 3,83 1,92 6 – Folha 0,00 0,00 0,00 7 – Folha 2,97 12,50 6,25 8 – Folha 4,29 6,95 3,48 9 – Folha 2,14 5,62 2,81 10 – Folha 1,98 4,52 2,26 11 – Folha 0,67 2,15 1,08 12 – Folha 0,00 0,00 0,00
13 – Folha 1,32 10,37 5,19 14 – Folha 0,00 0,00 0,00 15 – Folha 0,00 0,00 0,00 16 – Folha 3,53 5,69 2,85 17 – Folha 2,16 10,79 5,40
18 – Cápsula 1,07 6,03 3,02 19 – Cápsula 3,10 6,22 3,11 20 – Cápsula 2,79 5,92 2,96
Conforme pôde ser observado nas Figuras 23, 24 e 25 e na Tabela 35,
algumas amostras foram identificadas como sendo M. Ilicifolia ou M. aquiolium e
quatro amostras não eram destas espécies, ou estavam degradadas. Estes
resultados corroboram um estudo de PEREIRA e ESMERINO (2008), que
constataram que, das amostras comercializadas como M. Ilicifolia, nenhuma cumpriu
plenamente as exigências dos testes, demonstrando que estas apresentam algum
tipo de desvio de qualidade.
Na Tabela 35 são apresentadas as concentrações de epicatequina nestas
amostras, conforme descrito na Farmacopeia Brasiliera 5ª edição (2010), das 2
amostras controles e das 18 amostras adquiridas, onde 13 amostras apresentaram o
padrão característico de M. ilicifolia, mas apenas 9 amostras apresentaram
concentração de epicatequina superior a 2,8 mg/g; que é o mínimo aceitável.
A média de epicatequina foi calculada a partir das amostras que foram
identificadas pertencentes M. Ilicifolia, apresentando um concentração de 3,1mg por
grama de folha seca. Resultados na literatura demonstraram que o mesmo valor foi
determinado por De Souza e colaboradores em 2009.
68
Das 15 amostras de folhas, apenas seis estavam com a concentração
adequada de epicatequina. Isto foi observado tanto para as folhas provenientes de
farmácias de manipulação quanto de feiras livres. Em contrapartida foram
analisadas três amostras em cápsulas, provenientes de indústrias e de farmácias de
manipulação, e todas foram aprovadas.
69
5 CONCLUSÃO
O método analítico desenvolvido utilizando UHPLC-MS foi capaz de identificar
padrões de composição diferentes entre as espécies de Maytenus ssp com base nos
marcadores químicos catequina e epicatequina nas amostras.
As extrações utilizando água e soluções hidroalcoólicas não apresentaram
diferenças significativas em relação à composição e recuperação dos componentes,
porém o uso de água como solvente resultou em melhor simetria e resolução dos
picos, com recuperação superior a 95% em 15 minutos, portanto foi rápido e
eficiente.
Após o desenvolvimento do método analítico foi realizado a validação
conforme RDC 166/17, sendo satisfatória em todos os parâmetros testados, sendo
seletivo, linear, preciso, exato e robusto, logo esse método pode ser aplicado para o
uso pretendido.
O método validado foi aplicado em 18 amostras (folhas e cápsulas) adquiridas
do comercio; sendo apenas 50% identificadas como M. ilicifolia e aprovadas
conforme os critérios da Farmacopeia Brasileira 5° edição. Quando analisamos
apenas as folhas, ou seja, 15 amostras esse valor diminui 40%.
Os resultados apresentados nesse trabalho evidenciam que há necessidade
de maior fiscalização pelos órgãos reguladores a fim de garantir a qualidade das
plantas medicinais encontradas no comércio, verificando a sua autenticidade,
concentração dos componentes de interesse e evitando fraudes.
70
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7 ANEXOS
Anexo A: Declaração de bioética/biossegurança
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Anexo B - Declaração de direitos autorais