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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA

INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

NATÁLIA MAZINI RIBEIRO

ESTUDOS DE UMA FTALOCIANINA CONJUGADA A BSA COMO AGENTE

ATIVO NA TERAPIA FOTODINÂMICA

São José dos Campos, SP 2009


ESTUDOS DE UMA FTALOCIANINA CONJUGADA A BSA COMO AGENTE

ATIVO NA TERAPIA FOTODINÂMICA

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para a obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas.

Orientadores: Prof. Dr. Milton Beltrame Junior

Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares

São José dos Campos, SP 2009

R37e

Ribeto. Natália MaziniEstudos de uma ftalocianina conjugada a BSA como agente ativo na Terapia.

Fotodinâmica/ Natiília Mazini Ribeiro; Orientâdores: Prof. Dr. Milton Beltame Junior,Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares. -- São José dos Campos, 2009.

ldisco laser: color.

Dissertagão apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas doInstituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2009.

1. Fotoquimioterapia 2. Macróíago 3. Agentes Fotossensibilizades I. Belframe JrÌnior,Milton, Odent. II. Pacheco-Soares, Cristin4 orient. III. TítuÌo

CDU:546

Autorizo exclusivamenle paÍa fms acadêmicos e científicos, a replodução total ou parcialdesta dissertação, por processos fotocopiadores ou tÍansmissão eletrônic4 desde quecitada à fonte.

aluno: Jfoláirq- ^y^,í\*õ"^ Jà{t""^E

mta: Oï toslTaoT


"ESTUDOSDEUMAF.TALoCIANINACONJUGADAABSAcoMoAGENTEATIvoNA TERAPIA FOTODINÂMICA."

Dissertação aprovada como requisito parcial à obtcnção do grau de Mestre em ciências

Biológicas, do Programa tle Pós-Cracluação em Ciências Biológicas, do lnstituto de Pesquisa e

Desenvolvimento da Universitlade do Vale do Palaíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte

banca examinadora:

Prof Dra.CLAUD IA BARBOSA LA D E I RA D E CANI POS (UNw xï -Z/4<<ztÀ--Z2zz-J

Prof Dr. MILTON BELTRAME.f UNIOR (UNIVAP

Prof Dra. CRISTINA PACHECO SOARES (UNIVAP)

PTOf. DTA. MARIA ANGÉLICA GARGIONE CARDOSO (UNIVAP)

Prof. Dra. ROSE Ì\{ARY ZUMS'IEIN GEORGDTTO NAAL (USP)

Prof. Dra. Sandra Maria Fttnseca da Costa

Diretor do lP&D - UniVaP

São José dos Carnpos. 04 dc maio cle 2009'

"Lo w

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus avós Joaquim Ribeiro Sobrinho e Maria José de Castro Ribeiro.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela oportunidade de estudar e de realizar este trabalho. Agradeço também aos professores; Milton Beltrame Junior Cristina Pacheco Soares Maria Angélica Gargione Cardoso Liu Yao Cho Newton Soares da Silva Airton Abrahao Martin Ana Maria do Espírito Santo Karen Cristiane Martinez de Moraes Claudia Barbosa Ladeira de Campos Maricília Silva Costa Stella Regina Zamuner Drauzio Eduardo Naretto Rangel Josane Mittimann Marco Antonio de Oliveira Paulo Renato de Morais Rose Mary Zumstein Georgetto Naal à diretora do IP&D Sandra Maria Fonseca da Costa; aos meus pais; Rubens Domínico Ribeiro Nádia Leite Mazini Ribeiro aos meus irmãos; Ana Paula Ribeiro Guerra Fernandes Paulo Rubens Mazini Ribeiro à parte nova da família; Rafael Guerra Fernandes Gabriel Ribeiro Guerra Fernandes aos meus tios; Diva Marli de Castro Ribeiro Marcelo Hugo Ribeiro Maria Aparecida Ribeiro Font aos meus amigos; Daniele Riera Paschotto Lucas de Carvalho Intrieri à Univap e Capes pelo espaço e pelo suporte financeiro;

às meninas da secretaria e da biblioteca do IP&D; Ivone Paranaíba Vilela Monteiro Neusa de Moraes Macias Delgado Rubia Gravito de Carvalho Gomes Valéria Maeda Vanessa Aparecida de Oliveira aos meus amigos dos laboratórios; Adriana Lima Alessandro Eustáquio Campos Granato Aline Helena Araujo Machado Amanda Borges Ferrari Ana Maria Barbosa Anderson de Oliveira Lobo Andreza Cristina de Siqueira Ane Carolina Basso Cabral Bianca Fogazza Palma Camila de Cássia Morais Pereira de Souza Cristiano de Cristo Gomes Daniel Sonnewend Davi Bernes Pereira Edson Aparecido Pereira dos Santos Emanoel Pedro de Oliveira Silva Erika Fonseca Ferrari Fernanda Roberta Marciano Juliana Guerra Pinto Juliana Mangolin Karina Teixeira Naves Maira Gaspar Tosato Maíra Maftoum Costa Maria do Carmo Lopes Mariana Bernardes da Silva Palma Milena Freitas de Souza Patrícia Elisa do Couto Chipoletti Esteves Quênia Yoko de Paula Matsui Renata Alves de Oliveira Borges Renata de Siqueira Mendes Ricardo Costa Brandão Sílvia Cerqueira Calabrez Tirado Susane Moreira Machado

e ao meu namorado João Paulo Penelupi Melo. São muitos os que ajudaram nessa conquista. A todos vocês, muito obrigada!

ESTUDOS DE UMA FTALOCIANINA CONJUGADA A BSA COMO AGENTE ATIVO NA TERAPIA FOTODINÂMICA

RESUMO

A Terapia Fotodinâmica (PDT – Photodyamic Therapy) envolve a administração de um fotossensibilizador seguida de ativação por luz em comprimento de onda específico. Esse procedimento resulta numa sequência de processos fotoquímicos e fotobiológicos que causam dano irreversível ao tecido tumoral. Foi demonstrado, nas últimas décadas, que células do estroma tumoral, como os Macrófagos Associados ao Tumor (TAMs), acumulam maior quantidade de fotossensibilizador que as células tumorais, além disso, a eliminação dos TAMs afeta rapidamente importantes funções metabólicas do tumor associadas às suas atividades pró-tumorais. Como TAMs são altamente capazes de captar albumina e, portanto, internalizar fotossensibilizadores conjugados a ela, este modelo de carreamento tem sido utilizado para a PDT tendo TAMs como alvo. O objetivo deste trabalho foi preparar uma ftalocianina conjugada a albumina e avaliar seu potencial como agente fotossensibilizador para PDT em macrófagos da linhagem J774. O conjugado (NzPcBSA) foi preparado pela agitação de uma solução de BSA em excesso de NzPc (1:2) em tampão Tris-HCl, seguida de cromatografia em Sephadex G-100. Na coluna de cromatografia foi possível observar duas frações azuis bem definidas e afastadas uma da outra, além disso, as amostras apresentaram espectros de absorção diferentes, confirmando que se trata de dois compostos distintos. Após a purificação, a solução de NzPcBSA foi dialisada e liofilizada para a remoção do NH4HCO3 e da água, respectivamente. Foram realizados ensaios de MTT para avaliação da atividade mitocondrial de células J774 após 24 e 48 h da incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM. A partir dos dados obtidos de atividade mitocondrial foi estimada a citotoxicidade no escuro, que é uma das características indesejáveis em fotossensibilizadores. Ambos fotossensibilizadores não apresentaram citotoxicidade no escuro. O fotossensibilizador conjugado (NzPcBSA) apresentou melhor desempenho citotóxico para PDT que NzPc. A variação da concentração de fotossensibilizador teve influência na eficiência fotodinâmica do tratamento, de maneira que a mais alta concentração utilizada (5 µM) promoveu maior porcentagem de morte celular em relação ao grupo controle. Essa concentração está dentro da faixa de 1 a 10 µM amplamente utilizada na PDT. A variação da densidade de energia teve influência na eficiência fotodinâmica do tratamento, de maneira que a mais alta densidade de energia utilizada (45 J/cm2) promoveu maior porcentagem de morte celular em relação ao grupo controle. A destruição completa do tumor depende da morte das células malignas, das células do estroma e de seus vasos sanguíneos. Para a avaliação in vitro dos efeitos do fotossensibilizador conjugado preparado neste trabalho, foram realizados ensaios com macrófagos que são as principais células do infiltrado leucocitário. Novos estudos são necessários, para verificar a eficiência de NzPcBSA como agente citotóxico em ensaios com células de linhagens cancerígenas. Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, Fotossensibilizadores, Sistemas de carreamento, Macrófagos Associados ao Tumor.

STUDIES OF A PHTHALOCYANINE CONJUGATED TO BSA AS ACTIVE AGENT IN THE PHOTODYAMIC THERAPY

ABSTRACT

Photodynamic Therapy (PDT) involves the administration of photosensitizers followed by activation by light at specific wavelength. This procedure results in a sequence of photochemical and photobiologic processes causing irreversible damage to tumor tissue. It has been shown in recent decades that cells of the tumor stroma, such as the Tumor Associated Macrophages (TAMs), accumulate higher amount of photosensitizer than tumor cells; in addition, the elimination of the TAMs rapidly affects important metabolic functions of the tumor which are associated with pro-tumor activities. Since TAMs are highly capable of capturing albumin, they can internalize photosensitizers coupled to it, this carrier system model has been used for PDT and TAMs as targeted. The objective of this work was to prepare a phthalocyanine conjugated albumin and evaluate its potential as a photosensitizing agent for PDT in the macrophage line J774. The conjugated photosensitizer with BSA (NzPcBSA) was prepared by stirring a solution of BSA in excess of NzPc (1:2) in Tris-HCl, followed by chromatography in Sephadex G-100. In the column chromatography it was possible to observe two well defined and blue fractions apart from each other, in addition, the samples showed different spectra of absorption, and therefore, confirmed two different compounds. After purification the solution NzPcBSA was dialyzed and lyophilized to remove NH4HCO3 and water, respectively. MTT assays were performed to evaluate the mitochondrial activity of J774 cells after 24 and 48 h of incubation with NzPc and NzPcBSA at concentrations of 1 µM, 2.5 µM and 5 µM. From the data obtained mitochondrial activity was estimated to cytotoxicity in the dark, which is one of the undesirable characteristics in photosensitizers. Both photosensitizers had no cytotoxicity in the dark. The conjugate photosensitizer (NzPcBSA) showed better performance for cytotoxic PDT that NzPc. The variation of the concentration of photosensitizers had an influence on the efficiency of photodynamic therapy, so that the highest concentration used (5 µM) promoted a greater percentage of cell death in relation to the control group. This concentration is within the range 1 to 10 µM widely used in PDT. The variation of the fluence has an influence on the efficiency of photodynamic therapy, so that the highest fluence used (45 J/cm2) promoted higher percentage of cell death in relation to the control group. The complete destruction of the tumor depends of the death of malignant cells, of the stromal cells and its blood vessels. For in vitro evaluation of the effects of photosensitizing conjugate prepared in this work, assays were performed with macrophages which are the main cells of the leukocytic infiltrate. Further studies are needed to verify the efficiency of NzPcBSA as a cytotoxic agent in experiments with cancer cells lines. Keywords: Photodynamic Therapy, Photosensitizers, Carrier systems, Tumor Associated Macrophages.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Ilustração do processo envolvido na Terapia Fotodinâmica.....................................22 Figura 2: Diagrama de Jablonski. .............................................................................................23 Figura 3: Fórmula estrutural da porfirina (a); Fórmula estrutural de uma metaloporfirina, a letra M no centro de coordenação representa o íon metálico (b)..............................................25 Figura 4: Fórmula estrutural da ftalocianina (a); Fórmula estrutural de uma metaloftalocianina, a letra M no centro de coordenação representa o íon metálico (b). ..........26 Figura 5: Fórmula estrutural da NzPc. .....................................................................................26 Figura 6: Estrutura da albumina sérica bovina (BSA)..............................................................27 Figura 7: Preparação e purificação da NzPcBSA.....................................................................31 Figura 8: Grupos experimentais submetidos a tratamento com NzPc......................................34 Figura 9: Grupos experimentais submetidos a tratamento com NzPcBSA. .............................34 Figura 10: Grupos experimentais submetidos a irradiação com laser. .....................................34 Figura 11: Espectro de absorção da primeira fração azul obtida após purificação em coluna de Sephadex...................................................................................................................................37 Figura 12: Espectro de absorção da segunda fração azul obtida após purificação em coluna de Sephadex...................................................................................................................................37 Figura 13: Espectro de absorção da NzPcBSA após purificação em coluna de Sephadex. .....38 Figura 14: Espectro de absorção da NzPc em diferentes concentrações..................................39 Figura 15: Curva padrão obtida a partir dos valores de absorbâncias na banda Q de concentrações conhecidas de NzPc. .........................................................................................39 Figura 16: Espectro de absorção da NzPcBSA após purificação em coluna de Sephadex, diálise e liofilização. .................................................................................................................40 Figura 17: Representação gráfica da citotoxicidade no escuro após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM. .............................................41 Figura 18: Representação gráfica da citotoxicidade no escuro após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM. .............................................42 Figura 19: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2. ............................................................................................................43

Figura 20: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2. ............................................................................................................43 Figura 21: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 15 J/cm2. .............................................................................................................44 Figura 22: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 15 J/cm2. .............................................................................................................45 Figura 23: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 45 J/cm2. .............................................................................................................45 Figura 24: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 45 J/cm2. .............................................................................................................46 Figura 25: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2..................................................................................................47 Figura 26: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2..................................................................................................47

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

bFGF Fator básico de crescimento de fibroblastos

BSA Albumina sérica bovina

CC Cisteína-cisteína

CCL Cisteína-cisteína ligante

CSF-1/M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

EGF Fator de crescimento epidérmico

EMT Transição epitélio-mesenquimal

EMT-6 Células de carcinoma mamário murino

EPM Erro padrão da média

EROs Espécies reativas de oxigênio

HeLa Células de carcinoma humano de cérvice

HEp-2 Células de carcinoma humano de laringe

HepG2 Células de carcinoma hepatocelular humano

HIF Fator induzível por hipóxia

HSA Albumina sérica humana

IFN-γ Interferon gama

IL Interleucina

J774 Macrófagos murinos de retículo-sarcoma

LPS Lipopolissacarídeos

M1 Macrófagos ativados pela via clássica

M2 Macrófagos ativados pela via alternativa

MCP-1 Proteína-1 quimiotática de monócito

MIA PaCa-2 Células de carcinoma humano de pâncreas

MIF Fator inibitório de macrófago

MIP-1α Proteína inflamatória de macrófagos 1 – alfa

MMP Metaloproteinase de matriz

MR Receptor manose

MSR Receptor scavenger

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NIH-3T3 Fibroblastos embrionários murinos

NzPc Ftalocianinato [bis-(iodeto de trimetilaminoetanoxi)] de silício

NzPcBSA Fotossensibilizador NzPc conjugado com BSA

OVCAR-5 Células de carcinoma de ovário humano

PlGF Fator de crescimento derivado da placenta

PAR Receptor ativado por protease

PBS Solução salina tampão fosfato (Phosphate buffer solution)

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PDT Terapia Fotodinâmica (Photodyamic Therapy)

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RR 1022 Células epiteliais de bexiga rato

SFB Soro Fetal Bovino

SRA/MSR-I Receptor scavenger de classe A

SRB/MSR-II Receptor scavenger de classe B

TAMs Macrófagos Associados ao Tumor

TF Fator de tecido

TGF-β Fator de transformação do crescimento - beta

TNF-α Fator de necrose tumoral - alfa

TP Timidina fosforilase

tPA Ativador do plasminogênio tipo tecidual

Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-propano-1,3-diol

uPA Ativador do plasminogênio tipo uroquinase

VEGF Fator de crescimento vascular endotelial

AlPcS4 Cloro alumínio ftalocianina tetrasulfonada

ZnPcBr8 Zinco-ftalocianina octabromada

ZnPcS4 Zinco ftalocianina tetrasulfonada

ZnPcOCH3 2, 9, 16, 23 - tetrametoxi-ftalocianinato de zinco

LISTA DE SÍMBOLOS

S0 Estado singlete fundamental

Sn Estado singlete de mais alta energia

T1 Mais baixo estado triplete excitado

λ Comprimento de onda

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................13 1.1 Objetivo Geral ................................................................................................................14 1.2 Objetivos Específicos .....................................................................................................14

2 REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................................15 2.1 Inflamação e tumor.........................................................................................................15 2.2 Macrófagos Associados ao Tumor (TAMs) ...................................................................16 2.3 Recrutamento de TAMs para o interior da massa tumoral .............................................18 2.4 TAMs e progressão tumoral ...........................................................................................19

2.4.1 Invasão e metástase .................................................................................................19 2.4.2 Angiogênese ............................................................................................................20

2.5 Terapia Fotodinâmica .....................................................................................................22 2.5.1 Fotossensibilizadores...............................................................................................24 2.5.2 Ftalocianinas............................................................................................................25 2.5.3 Ftalocianinato [bis-(iodeto de trimetilaminoetanoxi)] de silício (NzPc).................26 2.5.4 Albumina sérica bovina (BSA) ...............................................................................27 2.5.5 Fotossensibilizadores conjugados com BSA..........................................................28

3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................29 3.1 Materiais e reagentes ......................................................................................................29 3.2 Fotossensibilizadores.....................................................................................................29 3.3 Preparação de solução salina tampão fosfato (PBS – Phosphate buffer solution) .........32 3.4 Preparação do meio de cultura........................................................................................32 3.5 Linhagem celular ............................................................................................................33 3.6 Manutenção da Cultura...................................................................................................33 3.7 Grupos experimentais .....................................................................................................33 3.8 Ensaio de atividade mitocondrial ...................................................................................35

3.8.1 Grupos citotoxicidade no escuro .............................................................................35 3.8.2 Grupos Laser e PDT ................................................................................................36

4 RESULTADOS ....................................................................................................................37 4.1 Preparação e Purificação da NzPcBSA ..........................................................................37 4.2 Dosagem de BSA em NzPcBSA ....................................................................................38 4.3 Dosagem de NzPc em NzPcBSA ...................................................................................38 4.4 Razão entre BSA e NzPc em NzPcBSA.........................................................................40 4.5 Ensaio de atividade mitocondrial ...................................................................................41

4.5.1 Grupos citotoxicidade no escuro .............................................................................41 4.5.2 Grupos Laser e PDT ................................................................................................42

5 DISCUSSÃO ........................................................................................................................48 6 CONCLUSÃO......................................................................................................................55 REFERÊNCIAS .....................................................................................................................56 ANEXO A - Diferenças estatísticas entre os grupos experimentais obtidas através dos testes ANOVA e Tukey-Kramer - grupos irradiados com as densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2, após 24 e 48 h de tratamento. Resultados obtidos após 24 e 48 h de tratamento. ................................................................................................................................64 ANEXO B - Diferenças estatísticas entre os grupos experimentais obtidas através dos testes ANOVA e Tukey-Kramer - grupos incubados com com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Resultados obtidos após 24 e 48 h de tratamento. ....................................................................65

13

1 INTRODUÇÃO

A Terapia Fotodinâmica (PDT – Photodyamic Therapy) envolve a administração de

um fotossensibilizador seguida de ativação por luz em comprimento de onda específico. Esse

procedimento resulta numa sequência de processos fotoquímicos e fotobiológicos que causam

dano irreversível ao tecido tumoral (DOUGHERTY et al., 1998).

Os tumores são formados por células malignas e estroma, que apesar de

independentes, influenciam-se mutuamente. O estroma tumoral é formado por vasos

sanguíneos, matriz extracelular e leucócitos inflamatórios, entre eles os Macrófagos

Associados ao Tumor (TAMs). Os TAMs são os principais componentes do infiltrado

leucocitário (BALKWILL; CHARLES; MANTOVANI, 2005) e têm duplo efeito sobre o

tumor: anti-tumoral e pró-tumoral. Eles exibem atividade tumoricida em contato inicial, mas

quando residem nas áreas de hipóxia, ativam um vasto leque de genes para a promoção da

invasão das células tumorais e angiogênese (DIRKX et al., 2006).

Foi demonstrado, em estudos nas últimas décadas, que células do estroma tumoral,

como os TAMs, acumulam maior quantidade de fotossensibilizador que as células tumorais

(KORBELIK et al., 1991; KORBELIK, 1992), além disso, a eliminação dos TAMs afeta

rapidamente importantes funções metabólicas do tumor associadas às suas atividades pró-

tumorais (ANATELLI et al., 2006). Por essa razão, muitos pesquisadores passaram a estudar

os efeitos da PDT em TAMs (BRASSEUR et al., 1999; HAMBLIN; MILLER; ORTEL,

2000; CHOI et al., 2004; LIU; HAMBLIN, 2005).

Várias estratégias têm sido propostas para melhorar a seletividade dos

fotossensibilizadores pelo tumor. Estas incluem o uso de sistemas de carreamento tais como

lipossomas, lipoproteínas, anticorpos monoclonais, nanopartículas e proteínas séricas

(LAVILLE et al., 2003; SHARMAN; VAN LIER; ALLEN, 2004). Como TAMs são

altamente capazes de captar albumina e, portanto, internalizar fotossensibilizadores

conjugados a ela (HAMBLIN; LIU, 2005), este modelo de carreamento têm sido utilizado

para a PDT tendo TAMs como alvo (BRASSEUR et al., 1999; HAMBLIN; MILLER;

ORTEL, 2000; HUANG et al., 2003; JIANG et al., 2006).

14

1.1 Objetivo Geral

O objetivo deste trabalho foi preparar uma ftalocianina conjugada a albumina e avaliar

seu potencial como agente fotossensibilizador para PDT em células da linhagem J774.

1.2 Objetivos Específicos

- Preparar um conjugado formado pelo fotossensibilizador ftalocianinato [bis-(iodeto

de trimetilaminoetanoxi)] de silício (NzPc) e albumina sérica bovina (BSA);

- verificar a citotoxicidade de NzPc e do conjugado (NzPcBSA) no escuro;

- comparar a eficiência fotodinâmica de NzPc e NzPcBSA em cultura de células J774;

- verificar a influência da variação da concentração de fotossensibilizador na eficiência

fotodinâmica do tratamento e

- verificar a influência da variação da densidade de energia na eficiência fotodinâmica

do tratamento.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Inflamação e tumor

A inflamação é uma função essencial do sistema imune inato que protege contra

patógenos e inicia a imunidade específica. A inflamação aguda é um processo rápido e auto-

limitado no qual mediadores químicos são induzidos numa sequência rigorosamente regulada

e células imunes movem-se para dentro e para fora da área afetada, destruindo agentes

infecciosos, reparando tecidos danificados e iniciando uma resposta de longo prazo, específica

ao patógeno (BALKWILL; CHARLES; MANTOVANI, 2005).

Na inflamação aguda, a rápida destruição dos leucócitos mobilizados é necessária para

o retorno do tecido à homeostase ou resolução completa. A resolução completa é o resultado

ideal para o tecido onde houve infiltração leucocitária, fagocitose de debris celulares, e/ou

destruição de organismos patogênicos. No caso de uma resposta não imediata aos invasores e

quadro de destruição de tecidos, pode ocorrer a progressão para a inflamação crônica.

(SERHAN, 2007).

Muitas neoplasias podem surgir a partir de áreas de infecção e inflamação como parte

da resposta do hospedeiro (SAVILL et al., 1989; MAIURI et al., 2004). Na inflamação

crônica, os focos inflamatórios são dominados por linfócitos, plasmócitos e macrófagos. As

espécies reativas de oxigênio e nitrogênio produzidas pelos macrófagos podem causar danos

ao DNA de células epiteliais do entorno e, consequentemente, o início de uma formação

neoplásica (MACARTHUR; HOLD; EL-OMAR, 2004; GOSWAMI et al., 2008).

Macrófagos são células efetoras do sistema imune, derivadas de progenitoras da

medula óssea, de atividade muito versátil. Essas células progenitoras continuamente se

multiplicam e liberam promonócitos na corrente sanguínea. Os promonócitos circulam

brevemente, diferenciam-se em monócitos e, em seguida, migram a partir do sangue para os

tecidos onde diferenciam-se em macrófagos. Eles protegem o corpo contra infecção por

bactérias, vírus e outros agentes patogênicos. O extenso extravasamento de monócitos é

também um evento do início do aparecimento da inflamação, cicatrização e de várias doenças

que envolvem uma gama de tecidos específicos e de funções que incluem fagocitose,

apresentação de antígenos às células T e liberação de uma grande variedade de citocinas,

quimiocinas, fatores de crescimento, enzimas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio,

16

componentes do complemento, fatores de coagulação e prostaglandinas (LEWIS;

MURDOCH, 2005).

Sob condições fisiológicas normais, leucócitos são recrutados em resposta a

inflamação local pela síntese de quimiocinas e citocinas e por outros produtos que estão

associados com a reparação de tecidos. Estes processos são parte de um complexo sistema de

sinalização, incluindo o reconhecimento do estado patológico. Na cicatrização, estes

processos incluem a proliferação e migração das células epiteliais, angiogênese, e

remodelação tecidual. Nos tumores, de forma semelhante, fatores quimiotáticos agem no

recrutamento leucocitário (DIRKX et al., 2006).

Os tumores são formados por células malignas e estroma, que apesar de

independentes, influenciam-se mutuamente. O estroma tumoral é formado por vasos

sanguíneos, matriz extracelular e leucócitos inflamatórios, entre eles os Macrófagos

Associados ao Tumor (TAMs) (LEWIS et al., 1995). Os TAMs são os principais

componentes do infiltrado leucocitário, acumulando-se nas áreas de hipóxia do tumor

(BALKWILL; CHARLES; MANTOVANI, 2005). O primeiro relato a respeito da infiltração

de leucócitos em tumores foi feito por Rudolf Virchow em 1863, sendo que macrófagos

infiltrados podem representar até metade da massa do tumor (BINGLE; BROWN; LEWIS,

2002; SICA; SACCANI; MANTOVANI, 2002).

2.2 Macrófagos Associados ao Tumor (TAMs)

Os TAMs têm duplo efeito sobre o tumor: anti-tumoral e pró-tumoral. Eles exibem

atividade tumoricida em contato inicial, mas quando residem nas áreas de hipóxia, ativam um

vasto leque de genes para a promoção da invasão das células tumorais e angiogênese (DIRKX

et al., 2006).

Com base no seu estado de ativação, macrófagos podem ser referidos como Tipo I (ou

M1 ou ativados pela via clássica) ou Tipo II (ou M2 ou ativados pela via alternativa). Há,

entre as duas populações, diferenças em termos de expressão de receptores e produção de

citocinas (LAMAGNA; AURRAND-LIONS; IMHO, 2006).

A ativação de macrófagos M1 ocorre em resposta a produtos microbianos (como

lipopolissacarídeos – LPS) ou IFN-γ e é caracterizada pela alta produção de interleucina 12

(IL-12) e IL-23 (VERRECK et al., 2004). Uma vez polarizado como M1, o macrófago é

caracterizado pela alta capacidade de apresentar antígenos e de produzir fatores que

17

promovem a proliferação e atividade de células T. Esta ativação também resulta em alta

produção de substâncias tóxicas, tais como intermediários de óxido nítrico (NO) e espécies

reativas de oxigênio (EROs). Assim, os macrófagos M1 podem servir como potentes células

efetoras que combatem microorganismos e células tumorais, apresentam antígenos e

produzem grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias (BISWAS et al., 2006;

GURUVAYOORAPPAN, 2008).

Já os TAMs localizados no microambiente do tumor exibem polarização M2. A

exposição a hormônios glicocorticóides e interleucinas como IL-4, IL-10 e IL-13 ativa os

macrófagos para o Tipo II. Estas células têm pouca capacidade de apresentar antígenos,

produzem fatores que suprimem a proliferação e atividade de células T e geralmente são mais

bem adaptadas à eliminação de restos celulares, promoção da angiogênese e também

reparação e remodelação de tecidos danificados (MANTOVANI; ALLAVENA; SICA, 2004;

SICA et al., 2008).

Macrófagos M1 expressam receptores opsonizadores quando expostos a sinais

clássicos de ativação como IFN-γ e LPS. Em contraste, macrófagos M2 expressam

preferencialmente receptores não opsonizadores como receptor manose (MR) e receptor

scavenger (MSR) (ALLAVENA et al., 2008).

Já foram identificadas duas isoformas de MSR. A única diferença entre eles é

encontrada em suas porções carboxi-terminal extracelulares. O receptor scavenger de classe A

(SRA) ou tipo I (MSR-I) é rico em resíduos de cisteína no seu domínio C-terminal, mas no

tipo II (SRB ou MSR-II), esse domínio é substituído por um curto peptídeo de 17

aminoácidos sem cisteínas (FREEMAN et al., 1990; DOI et al., 1993; EMI et al., 1993).

A expressão de MSR está associada com a fase de diferenciação do macrófago e é

modulada por citocinas. Monócitos circulantes expressam baixos ou indetectáveis níveis de

ambas as isoformas e a diferenciação em macrófagos está associada à regulação positiva de

MSR, em especial, do tipo I (GENG; KODAMA; HANSSON, 1994). Esta isoforma porém é

regulada negativamente por macrófagos ativados e IFN-γ (GENG; HANSSON, 1992). O fator

de necrose tumoral alfa (TNF-α) e endotoxinas, como LPS, também ativam macrófagos e,

consequentemente, também regulam negativamente a expressão de MSR. Portanto, parece

haver uma relação direta entre a diferenciação de macrófagos e a expressão de MSR, mas uma

relação inversa entre a ativação de macrófagos e a expressão de MSR (GENG et al., 1995).

Os sítios que promovem a interação das macromoléculas com o MSR ainda estão

sendo caracterizados. Goldstein e colaboradores (1979) propuseram que pode ser necessário

um aglomerado de cargas negativas para a ligação com o receptor. Dois anos depois, em novo

18

estudo, o mesmo grupo (GOLDSTEIN et al., 1981) observou que a albumina, na ausência de

grupos carregados negativamente, foi responsável por uma forte interação com o MSR. Este

dado foi reforçado por Haberland e Fogelman (1985) que examinaram a interação do receptor

scavenger com a proteína albumina após a adição e a remoção de cargas negativas. Embora os

ligantes reconhecidos pelo receptor scavenger normalmente sejam aniônicos, a adição de

novas cargas negativas, em vez de ser diretamente responsável pela ligação com o receptor,

induziu alterações conformacionais na albumina que persistiram após a remoção das cargas

negativas. Os autores concluíram que a sequência principal da albumina determina o

reconhecimento essencial para a interação com o receptor scavenger.

2.3 Recrutamento de TAMs para o interior da massa tumoral

Com o crescimento do tumor, a difusão do oxigênio e nutrientes aos tecidos torna-se

insuficiente e há aparecimento de múltiplas áreas de hipóxia. Isso ocorre geralmente quando o

tumor atinge 2 mm de diâmetro. Alguns fatores produzidos nestas áreas são potentes na

atração de monócitos que são continuamente recrutados em tumores, diferenciados em TAMs,

e em seguida acumulam-se nos domínios hipóxicos onde produzem os fatores de transcrição

HIF-1 e HIF-2 (fator induzível por hipóxia) (LEE; LIU; HUANG, 2006). Os fatores HIF-1 e

HIF-2 ativam um vasto conjunto de genes de promoção de células tumorais, invasão e

angiogênese (TALKS et al., 2000).

Os TAMs derivam principalmente de monócitos circulantes e a proliferação in situ

existe mas geralmente não é o mecanismo mais importante de sustentação da população de

macrófagos dentro da massa do tumor. Algumas quimiocinas e os fatores de crescimento

produzidos pelas células tumorais e do estroma têm papel fundamental no recrutamento de

monócitos e sua diferenciação em macrófagos (MANTOVANI et al., 2002).

A quimiocina CCL2 (cisteína-cisteína ligante – 2), também chamada de proteína-1

quimiotática de monócito (MCP-1) é provavelmente a citocina da família CC (cisteína-

cisteína) mais frequentemente encontrada em tumores desde sua descrição como fator

quimiotático. Sarcomas, gliomas, tumores de pulmão, carcinomas de mama, cérvice e ovário

e melanomas humanos expressam CCL2. Níveis baixos de secreção de CCL2, com acúmulo

fisiológico de TAMs, promovem a formação do tumor, enquanto a alta secreção de CCL2

resulta em massiva infiltração de macrófagos na massa do tumoral e na sua destruição

(MANTOVANI; ALLAVENA; SICA, 2004).

19

O fator estimulador de colônias de macrófagos (CSF-1 ou M-CSF) é produzido por

monócitos e macrófagos. Elevados níveis de CSF-1 também foram encontrados na circulação

de pacientes com carcinomas de mama, endométrio ou de ovário, onde tem sido utilizado

como marcador para a progressão da doença. Esta quimiocina pode também estimular a

diferenciação de monócitos em macrófagos e a atividade proliferativa de uma sub-população

de TAMs em tumores (BINGLE; BROWN; LEWIS, 2002).

O fator de crescimento derivado da placenta (PlGF) é uma molécula relacionada com

o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) em termos da sua estrutura e uso de

receptor, e tem sido relatada por promover a sobrevivência de TAMs. O fator PlGF é

amplamente expresso por tumores, mas não por tecidos normais adultos ou em

desenvolvimento, exceto pela placenta (ADINI et al., 2002).

Outras quimiocinas envolvidas no recrutamento de monócitos são CCL3, MIP-1α

(proteína inflamatória de macrófagos 1 – alfa), CCL4, CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3),

CCL8 (MCP-2), VEGF, e MIF (fator inibitório de macrófago) (SHIH et al., 2006; SICA et

al., 2006).

2.4 TAMs e progressão tumoral

Os macrófagos liberam citocinas e quimiocinas no estroma tumoral que podem

estimular diretamente o crescimento das células tumorais e/ou promover a angiogênese e a

invasão de células tumorais, causando a metástase (SICA; ALLAVENA; MANTOVANI,

2008).

2.4.1 Invasão e metástase

A transição epitélio-mesenquimal (EMT) é um processo que envolve a perda da

adesão célula-célula em tecidos epiteliais, permitindo que estas migrem para regiões distais

durante o desenvolvimento embrionário. A EMT confere propriedades invasivas e migratórias

para células epiteliais e também tem sido apontada como evento fundamental durante a

invasão e metástase em tumores. A perda da adesão celular associada às mudanças na

morfologia e à ativação de proteínas transmembranares capazes de se ligar a componentes da

matriz extracelular completam as alterações observadas durante esta transição (SHIH et al.,

2006).

20

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são enzimas extracelulares proteolíticas

(endopeptidases) capazes de digerir vários componentes estruturais da matriz extracelular. O

crescimento, a invasão e o potencial metastásico de tumores dependem da formação e

desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, evento que é dependente da degradação da

matriz extracelular (PAZOS; NADER, 2007). Os macrófagos são capazes de produzir MMP-

2, MMP-7, MMP-9, MMP-12, assim como proteases como ativador do plasminogênio tipo

uroquinase e tecidual (uPA, tPA) e o receptor para uPA (uPAR) (MANTOVANI;

ALLAVENA; SICA, 2004; LEE; LIU; HUANG, 2006).

Macrófagos hipóxicos são capazes de promover o comportamento invasor e/ou

metastático das células tumorais através da liberação de fatores pró-invasivos tais como o

MIF e o fator de tecido (TF). O MIF modula as atividades de uma série de tipos de células de

tumores, incluindo a estimulação da mobilidade das células tumorais, além de causar a

liberação de MMP-9, que por sua vez degrada componentes da matriz extracelular,

aumentando assim a mobilidade das células do tumor. O TF é uma proteína transmembranar

primariamente envolvida na cascata de coagulação que também desempenha um importante

papel na metástase de tumores. Dentro dos tumores o TF é expresso pelas células tumorais,

células endoteliais, fibroblastos e macrófagos e promove a geração de trombina. A trombina,

responsável por converter o fibrinogênio em fibrina, promove a atividade metastática das

células tumorais através dos receptores PAR-1 e/ou PAR-2 (receptor ativado por protease)

(LEWIS; MURDOCH, 2005).

2.4.2 Angiogênese

Segundo Zetter (1988), angiogênese é o processo pelo qual são formados novos vasos

sanguíneos. Esse processo ocorre em vias de desenvolvimento embrionário, desenvolvimento

e crescimento de tecidos, cicatrização, reparo e inflamação normais, além de uma variedade

de processos patológicos que são acompanhados pelo crescimento anormal de novos vasos

sanguíneos.

A angiogênese é necessária para o crescimento tumoral, progressão e metástase.

Muitos estudos têm demonstrado que a elevada vascularização está correlacionada com o

avanço do tumor, metástase e mau prognóstico em vários tipos de cânceres humanos. A

angiogênese envolve a degradação da membrana basal e invasão do estroma por células

endoteliais que, em seguida, proliferam, migram e se tornam organizadas numa estrutura

21

capilar. Estudos demonstraram que tanto células tumorais quanto células do estroma

produzem fatores angiogênicos (CHEN et al., 2003).

Os macrófagos podem exercer dupla influência sobre a formação e função dos vasos

sanguíneos. Por um lado, os macrófagos produzem moléculas pró-angiogênicas, por outro

lado, eles podem expressar moléculas anti-angiogênicas e causar danos à integridade dos

vasos sanguíneos (BINGLE; BROWN; LEWIS, 2002). Em cobaias tratadas com CSF, a

metaloelastase (MMP-12) produzida por TAMs gera angiostatina (DONG et al., 1998).

Angiostatina é uma molécula anti-angiogênica resultante da clivagem proteolítica do

plasminogênio por proteases, que são principalmente produzidas por TAMs (DONG, et al.,

1997).

Várias MMPs, incluindo MMP-2, MMP-7, MMP-9 e MMP-12, podem gerar

angiostatina. Outra molécula que possui propriedade angiogênica é endostatina, um fragmento

de 20 kDa proveniente da quebra do colágeno tipo XVIII em seu domínio NC1 localizado na

porção C-terminal. A endostatina é produzida pela clivagem do colágeno tipo XVIII por

MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13 e MMP-20 e atua retardando a proliferação de

células endoteliais (FINGLETON, 2006; TLSTY; COUSSENS, 2006; PASSOS-BUENO et

al., 2006).

No entanto, em geral, para a interação com células neoplásicas, as funções pró-

angiogênicas dos TAMs prevalecem. Em vários estudos em tumores humanos, o acúmulo de

TAMs tem sido associada à angiogênese (SICA et al., 2006).

Vários fatores de crescimento como VEGF, o fator básico de crescimento de

fibroblastos (bFGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de transformação do

crescimento β (TGF-β) e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) são

conhecidos por serem produzidos por TAMs (GURUVAYOORAPPAN, 2008; LEEK et al.,

1996; WAHL; KLEINMAN, 1998). Eles não são apenas fatores de crescimento de células

tumorais, como também são potentes agentes mitogênicos para promover a proliferação de

células endoteliais. Entre eles, o VEGF está bem documentado como fator angiogênico que

pode promover o crescimento, a maturação e a sobrevivência de células endoteliais. O VEGF

também funciona como um fator quimiotático de monócitos para atrair TAMs para áreas de

hipóxia do tumor. Além disso, o VEGF pode causar extravasamento de fibrina e fibronectina

e geração contínua de matriz extracelular (LEE; LIU; HUANG, 2006).

Os TAMs ainda participam do processo pró-angiogênico produzindo o fator

angiogênico timidina fosforilase (TP) que promove a migração de células endoteliais in vitro

22

e cujos níveis de expressão estão associados com a neovascularização de tumores (SICA et

al., 2006).

Citocinas também estão envolvidas no processo de angiogênese. As citocinas IL-8, IL-

6 e TNF-α são produzidos por TAMs. IL-8 e TNF-α estimulam a angiogênese, já IL-6

promove a ativação de MMPs (LEE; LIU; HUANG, 2006; GURUVAYOORAPPAN, 2008).

2.5 Terapia Fotodinâmica

A Terapia Fotodinâmica (PDT – Photodyamic Therapy) consiste na administração de

um fotossensibilizador, que é ativado por luz nos comprimentos de onda adequados,

produzindo espécies moleculares citotóxicas (KESSEL et al., 1995; LAPEŠ; PETERA;

JIRSA, 1996). A figura 1 ilustra a simplificadamente PDT.

Figura 1: Ilustração do processo envolvido na Terapia Fotodinâmica.

fotossensibilizador (PS)

laser

massa tumoral massa tumoral após a captação de PS pelas células tumorais e do

estroma

irradiação da área afetada

morte celular

23

Após a absorção de luz, o fotossensibilizador que se encontrava no estado singlete

fundamental (S0) é excitado a um estado singlete de mais alta energia (Sn). Quando se

encontra no estado Sn, este pode voltar ao seu estado fundamental por decaimento não

radioativo; por emissão de energia como, por exemplo fluorescência; ou pode passar para o

estado triplete por cruzamento intersistema (isc). No cruzamento intersistema, o

fotossensibilizador passa para o mais baixo estado triplete excitado (T1), de menor energia

que Sn, porém de tempo vida mais longo. Deste estado, ele pode voltar para seu estado

fundamental através da emissão de energia como, por exemplo fosforescência; ou

desencadear a ação fotodinâmica que pode ocorrer por dois mecanismos frequentemente

designados tipo I (transferência de elétron) e tipo II (transferência de energia) (FISHER;

MURPHREE; GOMER, 1995; NOWIS et al., 2005).

O Diagrama de Jablonski, ilustrado na figura 2, representa as transformações

energéticas que resultam da absorção de luz por um fotossensibilizador.

Figura 2: Diagrama de Jablonski.

No mecanismo tipo I, o fotossensibilizador no estado triplete interage diretamente com

os substratos biológicos, formando radicais livres. Estes reagem instantaneamente com o

oxigênio produzindo uma mistura de moléculas intermediárias chamadas de espécies reativas

de oxigênio (EROs) que amplificam o processo de degradação das estruturas celulares

(PIETTE et al., 2003).

No mecanismo tipo II as moléculas do fotossensibilizador no estado triplete

transferem energia para o oxigênio molecular, que está no estado triplete (3O2), gerando

oxigênio singlete (1O2) (NOWIS et al., 2005), uma forma de oxigênio não radicalar porém

24

altamente reativa (SIBATA et al., 2000). O 1O2, devido à sua instabilidade, pode gerar

reações em cadeia, que liberam grandes quantidades de energia, o que causa ruptura física das

membranas celulares, prejudica as funções de transporte das membranas, oxida as organelas

celulares, como a mitocôndria e em menor escala induz à ruptura das fitas de DNA (ácido

desoxirribonucléico) , causando a regressão do tumor (PARKER, 1984).

Ambos os mecanismos (tipo I e tipo II) podem ocorrer simultaneamente e a razão

entre elas é influenciada pelas características do fotossensibilizador, dos substratos

intracelulares e pela concentração de oxigênio do meio (SIBATA et al., 2000).

Os produtos das reações ocorridas pelos mecanismos tipo I e tipo II são altamente

reativos, com tempo de vida de 10 a 50 µs. Portanto, o dano causado por essas espécies ocorre

no local de sua formação ou apenas a 0,1 µm de distância, dessa forma o dano é restrito a área

irradiada (a penetração máxima de luz utilizada na PDT é de cerca de 1 cm) que contém uma

concentração suficiente de fotossensibilizador e oxigênio. Isso combinado com o uso de um

fotossensibilizador de retenção preferencial pelos tecidos tumorais é a base da seletividade da

PDT para o tratamento de câncer (STEWART; BAAS; STAR, 1998).

2.5.1 Fotossensibilizadores

O fotossensibilizador ideal deve possuir várias características: pureza química,

retenção preferencial pelo tumor, rápido acúmulo no tecido tumoral e rápida depuração,

ativação pela luz com uma boa penetração tecidual, alto coeficiente de absorção e ausência de

toxicidade no escuro (JORI, 1996).

Os fotossensibilizadores mais amplamente estudados são as porfirinas que foram

identificadas há mais de 150 anos (NOWIS et al., 2005).

As porfirinas são compostos cíclicos formados por quatro unidades pirrol ligadas por

átomos de carbono. Uma propriedade característica das porfirinas é a formação de complexos

com íons metálicos ligados aos átomos de nitrogênio das unidades pirrol. As duplas ligações

dos anéis pirrol nas porfirinas são responsáveis pela absorção e fluorescência características

desses compostos (MURRAY et al.,1998). Na figura 3 estão ilustradas as estruturas da

porfirina livre e de uma metaloporfirina.

25

NH N

N NH

a

N N

N N

M

b Figura 3: Fórmula estrutural da porfirina (a); Fórmula estrutural de uma metaloporfirina, a letra M no centro de coordenação representa o íon metálico (b). Fonte: Murray et al. (1998).

Por um longo período os estudos pré-clínicos foram dominados pela utilização de

derivados de hematoporfirina. A melhor experiência clínica foi obtida com o Photofrin, o

primeiro fotossensibilizador aprovado para uso clínico, que é uma mistura de monômeros,

dímeros e oligômeros derivados de hematoporfirina. O Photofrin consiste em mais de 60

compostos e é difícil de ser sintetizado. Além disso, o seu coeficiente de absorção molar é

relativamente baixo o que exige doses mais elevadas de fotossensibilizador e luz para

produzir efeitos semelhantes aos obtidos com a nova geração de fotossensibilizadores. O

Photofrin é também pouco seletivo para o tecido tumoral e por este motivo ele provoca longa

duração da fotossensibilidade por um período que pode variar entre 4 e 6 semanas. Estes

fatores têm estimulado a investigação para o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores

(ZEITOUNI; SHIEH; OSEROFF, 2001; NOWIS et al., 2005).

2.5.2 Ftalocianinas

Entre os novos fotossensibilizadores estudados atualmente estão as ftalocianinas

(MACHADO et al., 2007; MAFTOUM-COSTA et al., 2008; MILLA et al., 2009; SHEN et

al., 2009; MEDINA et al., 2009).

Esses compostos demonstram alta estabilidade térmica e química, como também alta

absorção de luz nos comprimentos de onda entre 600 e 750 nm, a chamada janela terapêutica

(CHAN et al., 1997; DECRÉAU; CHANON; JULLIARD, 1999).

As ftalocianinas são compostos cíclicos formados por quatro unidades indol ligadas

por átomos de nitrogênio na posição azo. Assim como as porfirinas, as ftalocianinas têm a

propriedade de formar complexos com íons metálicos ligados aos átomos de nitrogênio dos

26

anéis indol (COOK et al., 1994; JORI, 1996). Na figura 4 estão ilustradas as estruturas de

uma ftalocianina livre e de uma metaloftalocianina.

NH

N

N

N

N

N

NH

N

a

N

N

N

N

N

N

N

N

M

b Figura 4: Fórmula estrutural da ftalocianina (a); Fórmula estrutural de uma metaloftalocianina, a letra M no centro de coordenação representa o íon metálico (b). Fonte: Nunes; Sguilla; Tedesco (2004).

2.5.3 Ftalocianinato [bis-(iodeto de trimetilaminoetanoxi)] de silício (NzPc)

O fotossensibilizador NzPc tem seu pico de absorção de luz em 685 nm. A síntese

deste composto foi descrita por Ré e colaboradores (2006). A fórmula estrutural de NzPc,

C44H46I2N10O2Si (1000,6 g/mol), está ilustrada na figura 5.

I-

N

N

N

N

N

N

N

N

Si

O

O

N+

CH3

CH3

CH3

N+

CH3CH3

CH3I-

Figura 5: Fórmula estrutural da NzPc.

27

Duas características importantes de NzPc tornam seu estudo como fotossensibilizador

especialmente interessante. As ftalocianinas de silício com grupamentos amino e seus

derivados N-alquilados nas posições axiais, têm apresentado eficiência como

fotossensibilizadores (HUANG et al., 2003; LO et al., 2004; HUANG et al., 2006; JIANG et

al., 2006; RÉ et al., 2006). Além disso, fotossensibilizadores catiônicos são solúveis em

água, o que facilita sua manipulação, e têm afinidade com a mitocôndria, o que aumenta sua

capacidade de promover apoptose (HASAN et al, 2003).

2.5.4 Albumina sérica bovina (BSA)

A albumina é a proteína mais abundante no plasma de mamíferos e tem sido objeto de

muitas investigações devido a seu fácil isolamento em grandes quantidades, a sua alta

estabilidade e solubilidade. A albumina é a principal proteína que contribui para a pressão

colóide osmótica do sangue e também é carreadora de numerosos compostos endógenos e

exógenos. Essa molécula tem uma massa molecular de 66 kDa e é constituída por uma única

cadeia polipeptídica contendo aproximadamente 580 aminoácidos (NAKAMURA et al.,

1997). A estrutura da albumina está representada na figura 6.

Figura 6: Estrutura da albumina sérica bovina (BSA). Fonte: SWISS-MODEL Repository (2008).

28

A albumina sérica bovina (BSA) tem muitos resíduos de cisteína e suas estruturas

secundárias em grande parte são helicoidais. Técnicas como dispersão ótica rotatória,

espectroscopia infravermelha e espectroscopia Raman sugerem que a porcentagem de

estruturas em α-hélice na BSA em solução tampão é de 54 %, 55 % e 55-60 %

respectivamente. As partes helicoidais da BSA são uniformemente colocadas nos seis

subdomínios. Cada subdomínio ainda é constituído por três hélices. Isso significa que a

maioria dos resíduos nas grandes alças e nas seções que conectam os domínios estão

formando provavelmente α-hélices, enquanto as regiões de conexão intradomínio são

principalmente não helicoidais. A albumina sérica humana (HSA) e a BSA possuem cerca de

80% de homologia. Sendo que as diferenças observadas são principalmente de uma natureza

estruturalmente conservadora, por exemplo, aminoácidos hidrofóbicos são substituídos por

outros aminoácidos hidrofóbicos e não por polares (GRDADOLNIK, 2002).

2.5.5 Fotossensibilizadores conjugados com BSA

Várias estratégias têm sido propostas para melhorar a seletividade dos

fotossensibilizadores pelo tumor. Estas incluem o uso de sistemas de carreamento tais como

lipossomas, lipoproteínas, anticorpos monoclonais, nanopartículas e proteínas séricas

(LAVILLE et al., 2003; SHARMAN; VAN LIER; ALLEN, 2004).

Proteínas séricas são potenciais transportadoras de drogas antineoplásicas, devido à

sua acumulação no tecido tumoral. A internalização destas proteínas por tumores é mediada

por uma série de fatores, incluindo o aumento da atividade metabólica característico de

tumores e a permeabilidade vascular do tumor para circulação de macromoléculas, além da

falta de um sistema funcional de drenagem linfática no tecido tumoral (KRATZ et al., 2000).

Um acontecimento importante na distribuição sistêmica de um fotossensibilizador

para os tecidos através do sangue, e posterior internalização pelos tumores e tecidos normais,

é a sua ligação com os componentes do soro, incluindo as lipoproteínas e albumina.

Fotossensibilizadores ligados à albumina podem inserir-se em células epiteliais pela fase

líquida, bem como por endocitose mediada por receptor, e então se localizarem nos

lisossomos. Os TAMs, através do MSR (ALLAVENA et al., 2008), também são altamente

capazes de captar albumina e, portanto, internalizar fotossensibilizadores conjugados a ela

(LIU; HAMBLIN, 2005).

29

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Materiais e reagentes

Para a preparação e purificação do fotossensibilizador conjugado foram utilizados:

N,N-dimetilformamida (DMF) (Synth), ácido clorídrico (HCl) (Synth), cloreto de sódio

(NaCl) (Synth), bicarbonato de amônio (NH4HCO3) (Synth), albumina sérica bovina (BSA)

(Inlab), 2-amino-2-(hidroximetil)-propano-1,3-diol (Tris) (LGC Biotecnologia), Sephadex G-

100 (partículas de 10 - 40 µm) (Pharmacia), membrana de diálise (Union Carbide

Corporation) e Polietilenoglicol 8000 (PEG-8000) (Sigma-Aldrich).

Para a preparação da solução salina tampão fosfato (PBS) foram utilizados: fosfato

biácido de sódio (NaH2PO4) ( Fluka) e fosfato monoácido de sódio (Na2HPO4) ( Fluka).

Para a manutenção da cultura de células foram utilizados: meio de cultura RPMI

(Roswell Park Memorial Institute) (GIBCO), antibiótico e antimicótico (10.000 unidades de

penicilina, 10.000 µg de estreptomicina e 25 µg/mL de anfotericina B em salina a 0,85 %)

(GIBCO), soro fetal bovino (SFB) (GIBCO), bicarbonato de sódio (NaHCO3) (JTBaker) e

membrana de filtração com poro de 0,22 µm (Millipore).

Nos ensaios de atividade mitocondrial foram utilizados: brometo de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Sigma-Aldrich), dimetilsulfóxido (DMSO)

(Synth) e placa de 96 poços (TPP).

3.2 Fotossensibilizadores

O fotossensibilizador NzPc (figura 6) foi sintetizado no Laboratório de Síntese

Orgânica, IP&D - UNIVAP conforme descrito por Ré e colaboradores (2006).

O fotossensibilizador conjugado formado por NzPc e BSA (NzPcBSA) foi preparado

a partir de uma solução de NzPc (10 mg; 10 µmol) em 6,7 mL de DMF (1,5 mM) que foi

adicionada gota a gota a uma solução de BSA (330 mg; 5 µmol) em 71,2 mL de tampão Tris-

HCl (70 µM). A mistura foi agitada por 16 h em temperatura ambiente. A solução tampão

Tris-HCl foi preparada pela adição de Tris na concentração final de 50 mM e NaCl na

concentração final de 0,1 M em água ultrapura com pH ajustado para 7,4 com HCl a 1 M.

30

A mistura reacional foi purificada por cromatografia em coluna empacotada com

Sephadex G-100 utilizando-se solução aquosa de NH4HCO3 a 20 mM como eluente. As

frações foram monitoradas por espectroscopia de absorção (espectrofotômetro: Cary 50 BIO-

Varian Inc. Scientific Instruments, Austrália) utilizando-se células de quartzo tipo 111-QS

com 10 mm de caminho ótico (Hellma, Alemanha).

O conjugado foi dialisado a 4 ºC para a remoção do NH4HCO3 em membrana de

diálise (Union Carbide Corporation) contra solução tampão Tris-HCl (pH 7,4). A membrana

de diálise foi lavada em água destilada, imersa em tampão Tris-HCl por 12 h, lavada

novamente com água destilada antes da utilização.

Foram realizadas cinco trocas de 2 L de tampão, uma a cada 4 h. O volume do

conteúdo da membrana de diálise foi posteriormente reduzido com PEG-8000.

Após a diálise, a solução de NzPcBSA foi liofilizada (Concentrator 5301, Epperdorf,

Alemanha) para a remoção da água. Foi obtido um sólido que foi posteriormente

ressuspendido em PBS para dosagem de BSA e NzPc e para os ensaios in vitro.

A metodologia utilizada para a preparação e purificação de NzPcBSA está ilustrada na

figura 7.

31

I-

N

N

N

N

N

N

N

N

Si

O

O

N+

CH3

CH3

CH3

N+

CH3CH3

CH3I-

NzPc + BSA NzPcBSA

1ª fração azul

2ª fração azul

400 500 600 700 800 900 10000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda (nm)400 500 600 700 800 900 1000

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda (nm)

diálise

membrana de diálise com a amostra

espectrofotômetro

NzPc

NzPcBSA

liofilizaçãosolução tampão com baixa concentração de sal

I-

N

N

N

N

N

N

N

N

Si

O

O

N+

CH3

CH3

CH3

N+

CH3CH3

CH3I-

NzPc + BSA NzPcBSA

1ª fração azul

2ª fração azul

400 500 600 700 800 900 10000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

Abs

orbâ

ncia

comprimento de onda (nm)400 500 600 700 800 900 1000

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

Abs

orbâ

ncia


diálise

membrana de diálise com a amostra

espectrofotômetro

NzPc

NzPcBSA

liofilizaçãosolução tampão com baixa concentração de sal

Figura 7: Preparação e purificação da NzPcBSA.

32

A concentração de BSA no conjugado foi determinada com auxílio de um

espectrofotômetro (ND-1000, Nanodrop, Peqlab Biotechnologie GmbH, Alemanha), a leitura

no modo Protein A-280 fornece a concentração de BSA na solução em mg/mL.

Para o cálculo da concentração de ftalocianina na solução preparada de NzPcBSA foi

construída uma curva padrão a partir dos valores de absorbância na banda Q de concentrações

conhecidas de NzPc obtidas por leitura com auxílio de um espectrofotômetro (ND-1000,

Nanodrop, Peqlab Biotechnologie GmbH, Alemanha). Os resultados foram plotados no

programa Microcal Origin 6.0. Foi realizada a leitura da absorbância na banda Q do

conjugado e a concentração de ftalocianina foi calculada pela equação da reta.

As soluções estoque de NzPc e NzPcBSA em solução salina tampão fosfato (PBS)

(10 µM), foram protegidos da luz e armazenados a 4 ºC para posterior uso nos ensaios

biológicos.

3.3 Preparação de solução salina tampão fosfato (PBS – Phosphate buffer solution)

A solução salina tampão fosfato (PBS) foi preparada com água ultrapura, 140 mM de

NaCl; 2,6 mM de NaH2PO4 e 10 mM de Na2HPO4, com pH ajustado para 7,2 com HCl (1 M).

O tampão foi esterilizado por calor úmido (autoclave) e mantido a 4 °C até sua utilização.

3.4 Preparação do meio de cultura

O meio de cultura RPMI foi reconstituído em 1000 mL de água ultrapura em

temperatura ambiente e, sob agitação, foram adicionados 2,2 g de NaHCO3. O pH foi ajustado

para 7,2. A solução foi filtrada em membrana com poro de 0,22 µM de diâmetro no fluxo

laminar e armazenada em estufa a 37 °C por 24 h para o teste de esterilidade. Porteriormente

o meio de cultura foi armazenado a 4 °C até o momento do uso, quando foi suplementado

com 1 % (v/v) de solução de antibiótico e antimicótico e 10 % (v/v) de SFB.

33

3.5 Linhagem celular

Foram utilizados macrófagos de retículo-sarcoma da linhagem celular murina J774

(American Type Culture Collection - ATCC nº. TIB 67) gentilmente cedidas pela Profa. Dra.

Maria Angélica Gargione Cardoso do laboratório de Imunologia, IP&D – UNIVAP.

3.6 Manutenção da Cultura

As células foram rotineiramente cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm2 em meio

RPMI (suplementado com de 10 % SFB e de 1 % antibiótico e antimicótico) e mantidas a 37

°C em atmosfera umidificada contendo 5 % de CO2. A cultura foi subcultivada utilizando-se

cell scraper para soltar as células da garrafa em intervalos de 72 h, de forma a manter a fase

de crescimento exponencial da cultura. O crescimento celular foi acompanhado por meio de

observação em microscópio invertido Olympus CK40.

3.7 Grupos experimentais

Para a avaliação da resposta frente a PDT as células foram divididas em seis grupos:

1. Controle: grupo isento de qualquer tratamento.

2. Laser: grupo submetido apenas a irradiação

3. NzPc: grupo incubado com NzPc e mantido na ausência de luz.

4. NzPcBSA: grupo incubado com NzPcBSA e mantido na ausência de luz..

5. PDT – NzPc: grupo incubado com NzPc e posteriormente submetido a irradiação.

6. PDT – NzPcBSA: grupo incubado com NzPcBSA e posteriormente submetido a

irradiação.

As ftalocianinas NzPc e NzPcBSA foram incubadas nas concentrações de 1 µM,

2,5 µM e 5 µM. A irradiação foi feita nas densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e

45 J/cm2. Foram realizados ensaios de MTT para a avaliação de atividade mitocondrial após

24 e 48 h de tratamento. A divisão dos grupos experimentais submetidos a tratamento com

NzPc, com NzPcBSA e submetidos somente a irradiação com laser está ilustrada nas figura 8,

9 e 10, respectivamente.

34

Figura 8: Grupos experimentais submetidos a tratamento com NzPc. A NzPc foi incubada nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM nos grupos irradiados e no grupo citotoxicidade no escuro. A irradiação foi feita nas densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Foram realizados ensaios de MTT para a avaliação de atividade mitocondrial após 24 e 48 h de tratamento.

Figura 9: Grupos experimentais submetidos a tratamento com NzPcBSA. A NzPcBSA foi incubada nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM nos grupos irradiados e no grupo citotoxicidade no escuro. A irradiação foi feita nas densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Foram realizados ensaios de MTT para a avaliação de atividade mitocondrial após 24 e 48 h de tratamento.

Figura 10: Grupos experimentais submetidos a irradiação com laser. A irradiação foi feita nas densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Foram realizados ensaios de MTT para a avaliação de atividade mitocondrial após 24 e 48 h de tratamento.

35

3.8 Ensaio de atividade mitocondrial

3.8.1 Grupos citotoxicidade no escuro

A técnica de MTT é utilizada para avaliar a atividade mitocondrial. Para o ensaio de

MTT, as células foram plaqueadas a uma densidade de 105 células por poço em placas de 96

poços contendo 100 µL de meio RPMI (suplementado com de 10 % SFB e de 1 % antibiótico

e antimicótico). As células foram incubadas por 24 h para adesão a 37 °C em atmosfera

umidificada com 5 % de CO2. Foram então adicionadas soluções em diferentes concentrações

de ftalocianina (1 µM, 2,5 µM e 5 µM) nos grupos de ensaio de citotoxicidade no escuro e

PBS no grupo controle e as células foram protegidas da luz e novamente incubadas por 2 h

nas mesmas condições. Em seguida, as células foram lavadas com PBS, receberam

novamente o meio de cultura RPMI (suplementado com de 10 % SFB e de % antibiótico e

antimicótico) e foram incubadas por 24 e 48 h em condições de crescimento.

Após a incubação, a atividade mitocondrial foi avaliada pela análise baseada na

formação do precipitado de cor roxa 1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazana, produto

das desidrogenases mitocondriais presentes apenas em células metabolicamente ativas, a

partir da redução do sal MTT. Os poços foram lavados com PBS, em seguida foi adicionado o

MTT diluído em PBS na concentração de 0,5 mg/mL. As células foram incubadas por 1 h a

37 °C em atmosfera umidificada com 5 % de CO2. Em seguida foram adicionados 100 µL de

DMSO por poço e as placas foram agitadas por 30 minutos para diluição dos cristais de 1-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazana.

A leitura da absorbância das placas foi feita em leitor de ELISA (Elisa Spectracount,

Packard, EUA) utilizando-se filtro de 570 nm. Os valores de absorbância obtidos foram

transformados em porcentagem de atividade mitocondrial em relação ao controle através da

fórmula:

Os resultados foram plotados no programa GraphPad Prism 4.01 como média e erro

padrão da média (EPM) de um experimento em sextuplicata. Os testes estatísticos realizados

foram o teste de variância ANOVA seguido de teste de Tukey-Kramer para comparação

% viabilidade = (absorbância das células tratadas - absorbância do branco) x 100

(absorbância das células controle - absorbância do branco)

36

múltipla. Foram considerados valores significativos quando p < 0,05, muito significativos

quando p < 0,01 e extremamente significativos quando p < 0,001.

3.8.2 Grupos Laser e PDT

Para o ensaio de MTT, as células foram divididas nos grupos: controle, laser e Terapia

Fotodinâmica (nas concentrações 1 µM, 2,5 µM e 5 µM). As células foram plaqueadas a uma

densidade de 105 células por poço em placas de 96 poços contendo 100 µL de meio RPMI

(suplementado com de 10 % SFB e de 1 % antibiótico e antimicótico). As células foram

incubadas por 24 h para adesão a 37 °C em atmosfera umidificada com 5 % de CO2. Foram

então adicionadas soluções em diferentes concentrações de ftalocianina nos grupos PDT e

PBS nos grupos laser e controle. Em seguida as células foram protegidas da luz e novamente

incubadas por 2 h nas mesmas condições.

Após o tempo de incubação, as células dos grupos laser e PDT foram lavadas com

PBS, receberam novamente PBS e foram irradiadas em sala escura com aparelho clínico

portátil de laser semicondutor (Thera Lase, DMC, Brasil) com meio ativo fosfeto de índio,

gálio e alumínio (InGaAlP), operando com onda contínua. Os parâmetros utilizados estão na

tabela a seguir:

Tabela 1: Parâmetros utilizados para irradiação. Parâmetros Valores

Comprimento de onda (λ) 685 nm

Densidade de energia 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 ou 45 J/cm2

Potência 35 mW

Área 0,5 cm2

Tempo 1 min 05 s (4,5 J/cm2)

3 min 35 s (15 J/cm2)

10 min 43 s (45 J/cm2)

Distância entre a fibra e a placa 1,5 cm

Após a irradiação, as células receberam novamente o meio de cultura RPMI (com de

10 % SFB e de 1 % antibiótico e antimicótico) e foram incubadas por 24 e 48 h em condições

de crescimento.

A atividade mitocondrial foi avaliada por ensaio de MTT e os dados foram tratados

como descrito anteriormente (item 3.8.1).

37

4 RESULTADOS

4.1 Preparação e Purificação da NzPcBSA

O fotossensibilizador conjugado com BSA (NzPcBSA) foi preparado pela agitação de

uma solução de BSA em excesso de NzPc (1:2) em tampão Tris-HCl, seguida de

cromatografia em Sephadex G-100. Na coluna de cromatografia, foi possível observar duas

frações azuis bem definidas e afastadas uma da outra. A figura 11 mostra o espectro de

absorção da amostra obtida na primeira fração azul coletada na cromatografia. A figura 12

mostra o espectro de absorção da amostra obtida na segunda fração azul coletada na

cromatografia.

400 500 600 700 800 900 10000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

683 nm

Abs

orbâ

ncia


Figura 11: Espectro de absorção da primeira fração azul obtida após purificação em coluna de Sephadex.

400 500 600 700 800 900 10000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

685 nm

Abs

orbâ

ncia


Figura 12: Espectro de absorção da segunda fração azul obtida após purificação em coluna de Sephadex.

38

Além de se separarem em duas frações na cromatografia, as amostras apresentaram

espectros de absorção diferentes, confirmando que se trata de dois compostos distintos. A

absorção máxima dos dois compostos permaneceu próxima: em 683 nm na primeira fração

azul e em 685 nm na segunda fração azul.

Após a purificação em coluna de Sephadex G-100, a solução de NzPcBSA, coletada

na primeira fração azul, foi dialisada e liofilizada para a remoção do NH4HCO3 e da água,

respectivamente. Foi obtido um sólido com massa igual a 203 mg, de coloração azul clara,

pouco solúvel em água e em PBS.

4.2 Dosagem de BSA em NzPcBSA

O sólido foi ressuspendido em 50 mL de PBS para dosagem de BSA e NzPc. A

concentração de BSA no conjugado foi determinada com o auxílio de um espectrofotômetro.

O equipamento fornece o espectro de absorção da amostra (de 220 nm a 350 nm) e a

concentração de BSA na solução em mg/mL, como demonstrado na figura 13.

250 300 35002468

101214161820

NzPcBSA 2,97 mg/mL

Abs

orbâ

ncia


Figura 13: Espectro de absorção da NzPcBSA após purificação em coluna de Sephadex.

4.3 Dosagem de NzPc em NzPcBSA

Uma solução de NzPc na concentração de 100 µM foi diluída para as concentrações de

90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 e 10 µM. Os espectros de absorção obtidos dessas amostras

estão ilustrados na figura 14.

39

300 400 500 600 7000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

685 nm

100 µM 90 µM 80 µM 70 µM 60 µM 50 µM 40 µM 30 µM 20 µM 10 µM

Abs

orbâ

ncia


Figura 14: Espectro de absorção da NzPc em diferentes concentrações. A partir dos valores de absorbância na banda Q de concentrações conhecidas de NzPc

foi construída uma curva padrão, representada na figura 15.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

equação da reta:y = 0,00844 . x - 0,04867

Abs

orbâ

ncia

concentração (µM)

Absorbância na banda Q Reta padrão

R = 0,99907

Figura 15: Curva padrão obtida a partir dos valores de absorbâncias na banda Q de concentrações conhecidas de NzPc.

40

A concentração de NzPc em NzPcBSA foi calculada pela relação entre concentração e

absorbância estabelecida na equação da reta padrão. Foi realizada a leitura do espectro de

absorção da amostra e o valor da absorbância na banda Q forneceu a concentração em µM que

foi de 15,13 µM. A figura 16 mostra o espectro obtido.

300 400 500 600 7000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

A = 0,079

Abs

orbâ

ncia


Figura 16: Espectro de absorção da NzPcBSA após purificação em coluna de Sephadex, diálise e liofilização.

Com a concentração de 15,13 µM e o volume de 50 mL, foi calculado que se obteve

0,75 µmol de NzPc na solução de NzPcBSA após a purificação. Portanto, o rendimento da

reação foi de 7,5 % (partiu-se de 10 µmol de NzPc).

4.4 Razão entre BSA e NzPc em NzPcBSA

A partir da concentração em mg/mL de BSA (66.000 g/mol) na solução de NzPcBSA,

foi calculada a concentração de 45 µM. Portanto, obteve-se uma razão de aproximadamente

3:1 (três moléculas de BSA para uma molécula NzPc).

41

4.5 Ensaio de atividade mitocondrial

4.5.1 Grupos citotoxicidade no escuro

Foram realizados ensaios de MTT para avaliação da atividade mitocondrial de células

J774 após 24 e 48 h da incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM

e 5 µM. A partir dos dados obtidos de atividade mitocondrial foi estimada a citotoxicidade no

escuro, que é uma das características indesejáveis em fotossensibilizadores.

A leitura das placas foi feita em leitor de ELISA utilizando-se filtro de 570 nm. Os

valores de absorbância obtidos no grupo controle foram considerados 100 % para comparação

com todos os outros grupos.

Os resultados ilustrados na figura 17 demonstram que após 24 h da incubação com

NzPc e NzPcBSA, nas três concentrações utilizadas, as células permaneceram com atividade

mitocondrial próxima ao controle. A porcentagem em relação ao controle ficou, para os

grupos NzPc, em cerca de 105 % para 1 µM e 2,5 µM e 110 % para 5 µM e, nos grupos

NzPcBSA, em cerca de 110 % para 1 µM e 100 % para 2,5 µM e 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

5 µM2,5 µM1 µM5 µM2,5 µM1 µM

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 17: Representação gráfica da citotoxicidade no escuro após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. Os valores das médias e EPM não apresentaram diferenças estatisticamente significativas.

Da mesma forma, os resultados ilustrados na figura 18 demonstram que após 48 h da

incubação com NzPc e NzPcBSA, nas três concentrações utilizadas, as células permaneceram

com atividade mitocondrial próxima ao controle. A porcentagem em relação ao controle

42

ficou, para os grupos NzPc, em cerca de 100 % para 1 µM, 105 % para 2,5 µM e 115 % para

5 µM e, nos grupos NzPcBSA, em cerca de 90 % para 1 µM e 95 % para 2,5 µM e 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

5 µM2,5 µM1 µM5 µM2,5 µM1 µM

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 18: Representação gráfica da citotoxicidade no escuro após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. Os valores das médias e EPM não apresentaram diferenças estatisticamente significativas.

4.5.2 Grupos Laser e PDT

Foram realizados ensaios de MTT para avaliação da atividade mitocondrial de células

J774 24 e 48 h após irradiação com laser nas densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e

45 J/cm2; e 24 e 48 h após a PDT com NzPc e NzPcBSA, nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM

e 5 µM. A partir dos dados de atividade mitocondrial foi estimada a citotoxicidade após

irradiação (grupos laser) e incubação de NzPc e NzPcBSA, seguida de irradiação (grupos

PDT). Os valores obtidos no grupo controle foram considerados 100 % para comparação com

todos os outros grupos.

Os resultados ilustrados na figura 19 demonstram que após 24 h da exposição à

irradiação na densidade de energia de 4,5 J/cm2, as células do grupo laser permaneceram com

atividade mitocondrial próxima ao grupo controle, ficando em cerca de 110 %. A

porcentagem em relação ao controle ficou, para os grupos NzPc - 4,5 J/cm2, em cerca de

105 % para 1 µM, 100 % para 2,5 µM e 90 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 4,5 J/cm2,

em cerca de 80 % para 1 µM, 75 % para 2,5 µM e 70 % para 5 µM.

43

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

* #•

laser 5 µM2,5 µM1 µMlaser 5 µM2,5 µM1 µM

°

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 19: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,01 em relação ao grupo laser, ○ p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,01 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ● p < 0,01 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, □ p < 0,01 em relação ao grupo 5 µM de NzPc. .


exposição à irradiação na densidade de energia de 4,5 J/cm2, as células do grupo laser

permaneceram com atividade mitocondrial próxima ao controle, ficando em cerca de 105 %.

A porcentagem em relação ao controle ficou, para os grupos NzPc - 4,5 J/cm2, em cerca de

110 % para 1 µM, 105 % para 2,5 µM e 90 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 4,5 J/cm2,

em cerca de 85 % para 1 µM, 75 % para 2,5 µM e 65 % para 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

*#° #•

≠


*°

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 20: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ○ p < 0,001 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, ● p < 0,001 em relação ao grupo 5 µM de NzPc, □ p < 0,01 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA, ■ p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA, ≠ p < 0,01 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPcBSA.

44


irradiação na densidade de energia de 15 J/cm2, as células do grupo laser permaneceram com

atividade mitocondrial próxima ao controle, ficando em cerca de 110 %. A porcentagem em

relação ao controle ficou, para os grupos NzPc - 15 J/cm2, em cerca de 100 % para 1 µM,

90 % para 2,5 µM e 75 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 15 J/cm2, em cerca de 50 %

para 1 µM, 40 % para 2,5 µM e 35 % para 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

#°

*

#


*•

≠

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 21: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 15 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ○ p < 0,01 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, ● p < 0,001 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, □ em relação ao grupo 5 µM de NzPc, ■ p < 0,05 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA, ≠ p < 0,01 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA.


exposição à irradiação na densidade de energia de 15 J/cm2, as células do grupo laser


A porcentagem em relação ao controle ficou, para os grupos NzPc -15 J/cm2, em cerca de

90 % para 1 e 2,5 µM e 75 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 15 J/cm2, em cerca de 30

% para 1 µM, 25 % para 2,5 µM e 20 % para 5 µM.

45

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140

*#°


*

•

% e

m re

laçã

o ao

con

trol

e

Figura 22: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 15 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,05 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ○ p < 0,05 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, ● p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, □ p < 0,001 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, ■ p < 0,001 em relação ao grupo 5 µM de NzPc.


irradiação na densidade de energia de 45 J/cm2, as células do grupo laser tiveram aumento de

atividade mitocondrial em relação ao controle, ficando em cerca de 120 %. A porcentagem

em relação ao controle ficou, para os grupos NzPc - 45 J/cm2, em cerca de 90 % para 1 µM,

75 % para 2,5 µM e 40 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 45 J/cm2, em cerca de 55 %

para 1 µM, 15 % para 2,5 µM e 10 % para 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

100

120

140*

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laser 5 µM1 µMlaser 5 µM2,5 µM1 µM 2,5 µM

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o ao

cont

role

Figura 23: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 45 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,05 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ○ p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ● p < 0,001 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, □ p < 0,05 em relação ao grupo 5 µM de NzPc, ■ p < 0,001 em relação ao grupo 5 µM de NzPc, ≠ p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA.

46


exposição à irradiação na densidade de energia de 45 J/cm2, as células do grupo laser


A porcentagem em relação ao controle ficou, para os grupos NzPc - 45 J/cm2, em cerca de

90 % para 1 µM, 70 % para 2,5 µM e 40 % para 5 µM e, nos grupos NzPcBSA - 45 J/cm2, em

cerca de 20 % para 1 µM, 10 % para 2,5 µM e 5 % para 5 µM.

NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

80

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120

140

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°

laser 5 µM1 µMlaser 5 µM2,5 µM1 µM 2,5 µM

* # *•

% e

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laçã

o ao

con

trol

e

Figura 24: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA nas concentrações de 1 µM, 2,5 µM e 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 45 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser, # p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPc, ○ p < 0,001 em relação ao grupo 2,5 µM de NzPc, ● p < 0,001 em relação ao grupo 5 µM de NzPc, □ p < 0,001 em relação ao grupo laser, ■ p < 0,001 em relação ao grupo 1 µM de NzPcBSA.

Foram ainda realizados testes estatísticos para a comparação entre os efeitos obtidos

com a irradiação nas três densidades de energia utilizadas, após incubação de NzPc e

NzPcBSA na concentração de 5 µM, por ter se mostrado a mais eficiente para a PDT. A

figura 25 ilustra os resultados obtidos após 24 h. A figura 26 ilustra os resultados obtidos após

48 h.

47

laser NzPc NzPcBSA

0

20

40

60

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120

140

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4,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm2

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4,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm2 4,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm2

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laçã

o ao

con

trol

e

Figura 25: Representação gráfica da citotoxicidade após 24 h de incubação com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser - 4,5 J/cm2, # p < 0,001 em relação ao grupo laser - 15 J/cm2, ○ p < 0,001 em relação ao grupo laser - 45 J/cm2, ● p < 0,05 em relação ao grupo NzPc - 4,5 J/cm2, □ p < 0,001 em relação ao grupo NzPc - 4,5 J/cm2, ■ p < 0,001 em relação ao grupo NzPc - 15 J/cm2, ≠ p < 0,001 em relação ao grupo NzPcBSA - 4,5 J/cm2, ∇ p < 0,001 em relação ao grupo NzPcBSA - 15 J/cm2. Os valores das médias e EPM dos grupos NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 4,5 J/cm2 e dos grupos NzPc - 45 J/cm2 e NzPcBSA - 15 J/cm2 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas.

laser NzPc NzPcBSA

0

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4,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm24,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm2 4,5 J/cm2 45 J/cm215 J/cm2

% e

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laçã

o ao

con

trol

e

Figura 26: Representação gráfica da citotoxicidade após 48 h de incubação com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Os dados estão expressos em porcentagem em relação ao controle e os valores estão representados como média ± EPM de 1 experimento em sextuplicata. * p < 0,001 em relação ao grupo laser - 4,5 J/cm2, # p < 0,001 em relação ao grupo laser - 15 J/cm2, ○ p < 0,001 em relação ao grupo laser - 45 J/cm2, ● p < 0,01 em relação ao grupo NzPc - 4,5 J/cm2, □ p < 0,001 em relação ao grupo NzPc - 4,5 J/cm2, ■ p < 0,001 em relação ao grupo NzPc - 15 J/cm2, ≠ p < 0,001 em relação ao grupo NzPcBSA - 4,5 J/cm2, ∇ p < 0,05 em relação ao grupo NzPcBSA - 15 J/cm2. Os valores das médias e EPM dos grupos NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 4,5 J/cm2 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas.

48

5 DISCUSSÃO

Korbelik e colaboradores, em estudos realizados em 1991 e 1992, demonstraram que

TAMs acumulam maior quantidade de fotossensibilizador que as células tumorais. Liu e

Hamblin (2005) observaram que essa afinidade dos macrófagos com o fotossensibilizador

ocorre devido à expressão de receptores scavenger, característica desse tipo celular.

Macrófagos de retículo-sarcoma da linhagem celular murina J774 foram utilizados

neste trabalho por serem um sistema modelo para o estudo da PDT, em especial na PDT tendo

o receptor scavenger como alvo. Por exemplo, sabe-se que o receptor scavenger classe-A é

expresso em células J774, mas não em células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano. O

que permite analisar o papel do receptor scavenger na PDT através de estudo comparado entre

as duas linhagens (CHOI et al., 2004).

Brasseur e colaboradores (1999) descreveram a preparação e fototoxicidade de uma

série de fotossensibilizadores conjugados formados por BSA e cloro alumínio ftalocianina

tetrasulfonada (AlPcS4). Foram utilizadas as linhagens J774 e EMT-6 (células de carcinoma

mamário murino). A absorção do fotossensibilizador não foi medida diretamente, mas foi

encontrado alto grau de fototoxicidade nas células J774.

Do mesmo modo, Hamblin, Miller e Ortel (2000), conjugaram covalentemente o

fotossensibilizador clorina e6 e a proteína BSA. Tal como no estudo anterior, os conjugados

exibiram maior internalização e atividade fotodinâmica em células J774 em comparação com

a linhagem não-fagocítica OVCAR-5 de células de carcinoma de ovário humano. A captação

e fototoxicidade em células J774 foram fortemente diminuídas após incubação a 4 ºC,

indicando rota de entrada endocítica.

Huang e colaboradores (2003) sintetizaram uma ftalocianina catiônica que foi

posteriormente conjugada a BSA. Para os ensaios in vitro, foram utilizadas as linhagens J774

e células HepG2. Nas células HepG2 a fototoxicidade do conjugado foi significativamente

maior do que a da ftalocianina não conjugada (80 % das células sobreviveram quando

submetidas a PDT com a ftalocianina não conjugada enquanto menos de 30 % das células

sobreviveram a PDT com o conjugado). Os resultados da fototoxicidade do conjugado foram

ainda melhores com a linhagem J774. A viabilidade celular caiu de 74 % (para a ftalocianina

não conjugada) para 2 % (para o conjugado). Os resultados mostraram um aumento

extremamente significativo na eficiência da terapia com o conjugado em relação à não

conjugada.

49

Com base no fato de proteínas séricas acumularem-se no tecido tumoral, e também por

serem altamente captadas por TAMs através do MSR, sendo, portanto, potenciais

transportadoras de drogas antineoplásicas (GOLDSTEIN et al., 1981; HABERLAND;

FOGELMAN, 1985; KRATZ et al., 2000; ROSENKRANZ; JANS; SOBOLEV, 2000; LIU;

HAMBLIN, 2005) e ainda pelo sucesso demonstrado em estudos anteriores (BRASSEUR et

al., 1999; HAMBLIN; MILLER; ORTEL, 2000; HUANG et al., 2003; HUANG et al., 2006;

JIANG et al., 2006), o fotossensibilizador NzPc foi conjugado a BSA com o objetivo de

melhorar sua eficiência como fotossensibilizador para PDT.

O conjugado foi pela agitação de uma solução de BSA em excesso de NzPc em

tampão Tris-HCl, seguida de cromatografia em Sephadex G-100.

A separação na coluna de Sephadex é baseada na de técnica de cromatografia por

exclusão de tamanho, em que as moléculas menores do que os poros do gel podem se difundir

no interior dos poros, enquanto as moléculas maiores do que os poros do gel se limitam ao

espaço exterior e são, portanto, excluídas. Todos os géis possuem um intervalo de

fracionamento cujo limite superior é o tamanho da menor molécula excluída e o limite

inferior é representado por moléculas com diâmetros tão pequenos que eles podem se difundir

por todo espaço ocupado pelo solvente. Para moléculas cujo tamanho está dentro do intervalo

de fracionamento, o espaço disponível para a difusão durante a eluição é inversamente

proporcional ao volume molecular. Como consequência, quando uma mistura é adicionada

para separação, moléculas maiores são eluídas antes e moléculas menores são eluídas depois

(DE NOBILI; CHEN, 1999).

Na coluna de cromatografia realizada para a purificação de NzPcBSA, foi possível

observar duas frações azuis bem definidas e afastadas uma da outra. As duas frações foram

atribuídas a NzPcBSA e NzPc respectivamente, já que a molécula de BSA (com

66.000 g/mol) torna NzPcBSA significativamente maior que NzPc (com 1000,6 g/mol).

Como demonstrado nas figuras 11 e 12 , as amostras apresentaram espectros de

absorção diferentes, confirmando que se trata de dois compostos distintos.

A fração contendo NzPcBSA foi dialisada e liofilizada para a remoção do NH4HCO3 e

da água, respectivamente. Não foi possível solubilizar completamente o sólido obtido após a

liofilização, havendo perda significativa de material. Este fato explica o baixo rendimento,

7,5 %, obtido na reação.

Ré e colaboradores (2006) realizaram estudos de citotoxicidade com NzPc em células

J774. O fotossensibilizador foi incubado por 30 minutos na concentração de 840 µM. Nos

grupos PDT, as densidades de energia utilizadas foram 2 J/cm2, 5 J/cm2 e 10 J/cm2. Após

50

24 h, foi observada uma citotoxicidade no escuro de 2 a 7 %, enquanto nos grupos PDT houve

diminuição de até 50 % na viabilidade celular estimada a partir da atividade mitocondrial.

Em trabalhos realizados com outras ftalocianinas de silício com grupamentos

derivados de amino N-alquilados nas posições axiais foram utilizadas as densidades de

energia 48 J/cm2 (LO et al., 2004; HUANG et al., 2006) e 60 J/cm2 (JIANG et al., 2006; ZHU

et al. 2006).

Neste trabalho foram realizados ensaios com diferentes concentrações de

fotossensibilizador (1 µM, 2,5 µM e 5 µM) e densidades de energia (4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e

45 J/cm2) com o objetivo de verificar a influência dessas variáveis na eficiência fotodinâmica

do tratamento.

A mesma ftalocianina utilizada por Ré e colaboradores (2006) (NzPc) não apresentou

citotocixidade no escuro em células J774 após 24 h, havendo pequeno aumento na atividade

mitocondrial destas células em relação ao grupo controle. Após 48 h os resultados

mantiveram-se semelhantes aos resultados obtidos após 24 h com atividade mitocondrial

variando de 100 % a 115 % nos diferentes grupos (1 µM, 2,5 µM e 5 µM). A diferença de

resultados, de queda de 2 a 7 % para aumento de 5 a 10 % pode ser atribuída à significativa

diferença de concentrações de fotossensibilizador utilizadas nos dois estudos. As

concentrações utilizadas de fotossensibilizador (1 µM, 2,5 µM e 5 µM) foram determinadas

com base em outros estudos de PDT com ftalocianinas em que as concentrações foram de

1 a 10 µM (VARNES et al., 1990; HALKIOTIS; YOVA; PANTELIAS, 1999; RÜCK et al.,

2000; PLAETZER et al., 2002; FRISO et al., 2006).

Nos grupos irradiados, o estudo de Ré e colaboradores (2006) teve 50 % como a maior

porcentagem de morte celular em relação ao controle, neste trabalho obteve-se 95 % (45 J/cm2

- 48 h). Estes resultados sugerem que NzPc tem sua eficiência como fotossensibilizador

dependente não somente da concentração utilizada, mas também da densidade de energia

entregue às células.

Para cada densidade de energia utilizada neste trabalho, foram realizados os testes

estatísticos ANOVA e Tukey-Kramer para a comparação entre os efeitos obtidos com cada

uma das concentrações de NzPc e NzPcBSA.

Após 24 h da exposição à irradiação na densidade de energia de 4,5 J/cm2, a variação

de concentração de NzPc não produziu resultados estatisticamente significativos. Após 48 h

foi verficada diferença extremamente significativa entre o grupo 5 µM e os grupos 1 µM e

2,5 µM. No entanto, ainda com a maior concentração, a porcentagem de atividade

mitocondrial permaneceu alta (90 %) em relação ao grupo controle nos dois tempos

51

estudados. Com NzPcBSA, a variação de concentração produziu resultados estatisticamente

significativos após 48 h. No entanto, a menor porcentagem de atividade mitocondrial em

relação ao controle verificada nos grupos foi de cerca de 65 % (5 µM após 48 h) ainda

considerada insatisfatória se comparada a outros estudos de PDT (HUANG et al., 2003;

MACHADO et al., 2007).

Em estudo de PDT com células J774, Huang e colaboradores (2003) utilizaram uma

ftalocianina conjugada a albumina e, com densidade de energia de 1,8 J/cm2, obtiveram

porcentagem de atividade mitocondrial em relação ao controle de apenas 2 %. Os autores não

citam no trabalho as porcentagens obtidas nos grupos não irradiados com células J774.

Machado e colaboradores (2007) realizaram estudo com diferentes concentrações de

zinco-ftalocianina octabromada (ZnPcBr8) e, com densidade de energia de 4,5 J/cm2,

obtiveram porcentagem de atividade mitocondrial em relação ao controle menor que 5 %. No

entanto, na concentração de 1 µM, a ZnPcBr8 diminuiu a atividade mitocondrial das células

para 82 % em relação ao controle nos grupos não irradiados.

O conjugado NzPcBSA apresentou menor citotoxicidade, que a ZnPcBr8 (MACHADO

et al., 2007), nos grupos irradiados. No entanto, a menor citotoxicidade se manteve nos

grupos não irradiados ainda quando usadas concentrações mais altas (2,5 µM e 5 µM) que as

de Machado e colaboradores (2007) (1 µM).

Quando comparados os resultados obtidos com 4,5 J/cm2 com as mesmas

concentrações dos dois fotossensibilizadores, (1 µM de NzPc com 1 µM de NzPcBSA,

2,5 µM de NzPc com 2,5 µM de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 5 µM de NzPcBSA) as

diferenças entre os grupos foram muito significativas após 24 h e extremamente significativas

após 48 h.

Foram ainda comparados os resultados obtidos com concentrações maiores de NzPc

em relação às de NzPcBSA (2,5 µM de NzPc com 1 µM de NzPcBSA, 5 µM de NzPc com

1 µM de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 2,5 µM de NzPcBSA). Foram verificadas, após

48 h, diferenças extremamente significativas entre os grupos 2,5 µM de NzPc e 1 µM de

NzPcBSA e entre os grupos 5 µM de NzPc e 2,5 µM de NzPcBSA.

O conjugado apresentou maior efeito fotodinâmico mesmo quando comparadas

concentrações maiores de NzPc com menores de NzPcBSA, pode-se inferir, portanto, que

apesar de a PDT com NzPc e NzPcBSA com 4,5 J/cm2 não ter sido eficiente, houve melhora

significativa no efeito fotodinâmico de NzPc após conjugação com BSA. Estes resultados

podem ser atribuídos à maior especificidade aos receptores scavenger, presentes em

macrófagos da linhagem J774, conferida ao fotossensibilizador após a conjugação com BSA

52

(GOLDSTEIN et al., 1981; HABERLAND; FOGELMAN, 1985). Brasseur e colaboradores

(1999), Hamblin, Miller e Ortel (2000), Huang e colaboradores (2003), Huang e

colaboradores (2006) e Jiang e colaboradores (2006) também tiveram a eficiência de seus

fotossensibilizadores aumentada após conjugação com BSA.

Após 24 e 48 h da exposição à irradiação na densidade de energia de 15 J/cm2, a

variação de concentração de NzPc produziu resultados estatisticamente significativos somente

entre os grupos 1 µM e 5 µM. Além disso, ainda com a maior concentração, a porcentagem de

atividade mitocondrial permaneceu alta (75 %) em relação ao grupo controle nos dois tempos

estudados. Com NzPcBSA, após 24 h, a variação de concentração produziu resultados

estatisticamente significativos entre os grupos 1 µM e 2,5 µM e entre os grupos 1 µM e 5 µM.

Após 48 h, não foi verificada diferença estatisticamente significativa entre os grupos PDT. A

menor porcentagem de atividade mitocondrial em relação ao controle verificada nos grupos

foi de cerca de 20 % (5 µM após 48 h). Já considerada satisfatória se comparada com outros

estudos de PDT com densidade de energia próxima a 15 J/cm2 (VAN EPS; ADILI;

LAMURAGLIA, 1997; YSLAS et al., 2007).

Quando comparados os resultados obtidos com as mesmas concentrações dos dois

fotossensibilizadores, (1 µM de NzPc com 1 µM de NzPcBSA, 2,5 µM de NzPc com 2,5 µM

de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 5 µM de NzPcBSA) as diferenças foram extremamente

significativas após 24 e 48 h.



1 µM de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 2,5 µM de NzPcBSA). Entre todos os grupos

comparados as diferenças foram extremamente significativas.

Mesmo quando comparadas concentrações maiores de NzPc com menores de

NzPcBSA, o conjugado apresentou maior efeito fotodinâmico, portanto, confirmou-se a

melhora significativa no efeito fotodinâmico de NzPc após conjugação com BSA.

Para verificar a influência da variação de densidade de energia no efeito fotodinâmico

de NzPc e NzPcBSA, foram ainda realizados ensaios com 45 J/cm2.

A variação de concentração de NzPc produziu resultados estatisticamente

significativos após 24 e 48 h. Sendo que, após 48 h, todos os grupos comparados

apresentaram diferenças extremamente significativas. A menor porcentagem de atividade

mitocondrial em relação ao controle verificada nos grupos foi de cerca de 40 % (5 µM após

24 e 48 h). Com NzPcBSA, após 24 h, a variação de concentração produziu resultados

extremamente significativos entre o grupo 1 µM e os grupos 2,5 µM e 5 µM. Após 48 h, os

53

grupos comparados (exceto 2,5 µM e 5 µM) apresentaram diferenças extremamente

significativas. A menor porcentagem de atividade mitocondrial em relação ao controle

verificada nos grupos foi de cerca de 5 % (5 µM após 48 h). Este resultado é muito

satisfatório se comparado com outros estudos de PDT com densidade de energia próxima a

45 J/cm2 (VAN EPS; ADILI; LAMURAGLIA, 1997; LO et al., 2004; HUANG et al., 2006;

JIANG et al., 2006; ZHU et al. 2006).

Quando comparados os resultados obtidos com as mesmas concentrações dos dois

fotossensibilizadores, (1 µM de NzPc com 1 µM de NzPcBSA, 2,5 µM de NzPc com 2,5 µM

de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 5 µM de NzPcBSA) as diferenças foram extremamente

significativas após 24 e 48 h.



1 µM de NzPcBSA e 5 µM de NzPc com 2,5 µM de NzPcBSA). Entre os grupos comparados,

com a exceção da relação entre os grupos 5 µM de NzPc e 1 µM de NzPcBSA após 24 h que

apresentou diferença significativa, os demais grupos apresentaram diferenças extremamente

significativas.

Para a concentração de 5 µM de NzPc, por ter se mostrado a mais eficiente para a

PDT, foram ainda realizados os testes estatísticos ANOVA e Tukey-Kramer para a

comparação entre os efeitos obtidos com cada uma das densidades de energia entregues as

células. Após 24 h da exposição à irradiação, à exceção dos grupos NzPc - 4,5 J/cm2 e NzPc -

15 J/cm2, que apresentaram diferença significativa, os grupos apresentaram entre si diferenças

extremamente significativas. Sendo que entre os grupos NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA -

4,5 J/cm2 e os grupos NzPc - 45 J/cm2 e NzPcBSA - 15 J/cm2 não houve diferenças

estatisticamente significativas. Já após 48 h da exposição à irradiação, à exceção dos grupos

NzPc - 4,5 J/cm2 e NzPc - 15 J/cm2, que apresentarm diferença muito significativa e dos

grupos NzPcBSA - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 45 J/cm2, que apresentaram diferença significativa,

os grupos apresentaram entre si diferenças extremamente significativas. Sendo que entre os

grupos NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 4,5 J/cm2 não houve diferenças estatisticamente

significativas.

Esses dados reforçam a melhora no efeito fotodinâmico de NzPc após conjugação com

BSA já que, com a mesma concentração de ftalocianina, não houve diferenças

estatisticamente significativas entre grupos NzPcBSA que receberam menor densidade de

energia que grupos NzPc (Após 24 h: NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 4,5 J/cm2; NzPc -

45 J/cm2 e NzPcBSA - 15 J/cm2; após 48h NzPc - 15 J/cm2 e NzPcBSA - 4,5 J/cm2).

54

Além disso, confirmam a hipótese de que NzPc e NzPcBSA têm sua eficiência como

fotossensibilizador dependente não somente da concentração utilizada, mas também da

densidade de energia entregue às células.

Yslas e colaboradores (2007) realizaram estudo com 2, 9, 16, 23 - tetrametoxi-

ftalocianinato de zinco (ZnPcOCH3). Para os ensaios de PDT, foram utilizadas as densidades

de energia de 7, 11, 18 e 29 J/cm2. A viabilidade das células de carcinoma humano de laringe

da linhagem HEp-2 caiu de acordo com o aumento da densidade de energia. No grupo

irradiado com 7 J/cm2 houve cerca de 75 % de viabilidade após 24 h de tratamento; com

11 J/cm2 houve cerca de 55 %; com 18 J/cm2 houve cerca de 30 % e com 29 J/cm2 houve

cerca de 20%.

Halkiotis, Yova e Pantelias (1999) também utilizaram uma ftalocianina de zinco, a

zinco ftalocianina tetrasulfonada (ZnPcS4) e verificaram a influência da densidade de energia

utilizada na PDT em células de carcinoma humano de pâncreas MIA PaCa-2. Foram

utilizadas as densidades de energia de 0,5, 1, 3, 6 e 9 J/cm2. No grupo irradiado com 1 J/cm2

houve cerca de 70 % de viabilidade após 72 h de tratamento; com 3 J/cm2 houve cerca de

40 %; com 6 J/cm2 houve cerca de 25 % e com 9 J/cm2 houve cerca de 15%.

Hahn e colaboradores (1996), van Eps, Adili e LaMuraglia (1997) e Rück e

colaboradores (2000) utilizaram cloro alumínio ftalocianina tetrasulfonada (AlPcS4) para

estudos de PDT em cultura de células NIH-3T3 (fibroblastos embrionários murinos) e EMT-6

(carcinoma mamário murino), em cultura primária de células de músculo liso e em cultura de

células epiteliais de bexiga rato (RR 1022), respectivamente. Hahn e colaboradores (1996)

utilizaram as densidades de energia de 0,5; 1 e 1,5 J/cm2. No grupo irradiado com 0,5 J/cm2

houve cerca de 35 % de viabilidade após 24 h de tratamento; com 1 J/cm2 houve cerca de

15 % e com 1,5 J/cm2 houve cerca de 5%. No estudo de van Eps, Adili e LaMuraglia (1997),

foram utilizadas as densidades de energia de 10, 50 e 100 J/cm2. No grupo irradiado com

10 J/cm2 houve cerca de 50 % de viabilidade após 24 h de tratamento; com 50 e 100 J/cm2

houve cerca de 0 %. Rück e colaboradores (2000) utilizaram as densidades de energia de 0,1;

0,2; 0,5; 1; 2; 5; 6; 8 e 10 J/cm2. No grupo irradiado com 0,5 J/cm2 houve cerca de 110 % de

viabilidade após 48 h de tratamento; com 1 e 2 J/cm2 houve cerca de 30 %, com 5 J/cm2

houve cerca de 10 %, com 6 J/cm2 houve cerca de 5 % e com 8 e 10 J/cm2 fico próxima de

0 %.

Portanto, os dados mostrados nesse trabalho estão em concordância com o observado

em outros trabalhos de PDT com variação de densidade de energia.

55

6 CONCLUSÃO

O conjugado formado pelo fotossensibilizador ftalocianinato [bis-(iodeto de

trimetilaminoetanoxi)] de silício (NzPc) e albumina sérica bovina (BSA) foi preparado com

sucesso. Os diferentes espectros de absorção apresentados por NzPc e NzPcBSA confirmam

que se trata de dois compostos distintos.

Ambos fotossensibilizadores utilizados neste trabalho não apresentaram citotoxicidade

no escuro, que é uma das características desejáveis em fármacos usados na PDT.

O conjugado (NzPcBSA) apresentou melhor desempenho citotóxico como

fotossensibilizador para PDT que NzPc, o que corrobora com os trabalhos realizados por

outros grupos de pesquisa (BRASSEUR et al., 1999; HAMBLIN; MILLER; ORTEL, 2000;

HUANG et al., 2003; HUANG et al., 2006; JIANG et al., 2006).

A variação da concentração de fotossensibilizador teve influência na eficiência

fotodinâmica do tratamento, de maneira que a mais alta concentração utilizada (5 µM)

promoveu maior porcentagem de morte celular em relação ao grupo controle. Essa

concentração está dentro da faixa de 1 a 10 µM amplamente utilizada na PDT (VARNES et

al., 1990; HALKIOTIS; YOVA; PANTELIAS, 1999; RÜCK et al., 2000; PLAETZER et al.,

2002; FRISO et al., 2006).

A variação da densidade de energia teve influência na eficiência fotodinâmica do

tratamento, de maneira que a mais alta densidade de energia utilizada (45 J/cm2) promoveu

maior porcentagem de morte celular em relação ao grupo controle, esta densidade de energia

foi próxima a utilizada em trabalhos realizados com outras ftalocianinas de silício com

grupamentos derivados de amino N-alquilados nas posições axiais (48 J/cm2) (LO et al., 2004;

HUANG et al., 2006).

Para a avaliação in vitro dos efeitos do fotossensibilizador conjugado preparado neste

trabalho, foram realizados ensaios com macrófagos cancerígenos da linhagem J774, já que

macrófagos são as principais células do infiltrado leucocitário (BALKWILL; CHARLES;

MANTOVANI, 2005). Estudos preliminares demonstraram que no escuro há ausência de

citotoxicidade de NzPcBSA em células de carcinoma humano de cérvice (HeLa) e de

carcinoma humano de laringe (HEp-2). No entanto, novos estudos são necessários, para

verificar a eficiência de NzPcBSA como agente citotóxico em ensaios com células de

linhagens cancerígenas.

56

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64

ANEXO A

Diferenças estatísticas entre os grupos experimentais obtidas através dos testes ANOVA e Tukey-Kramer - grupos irradiados com as densidades de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2, após 24 e 48 h de tratamento. Resultados obtidos após 24 e 48 h de tratamento. 4,5 J/cm2 15 J/cm2 45 J/cm2 Grupos comparados 24h 48h 24h 48h 24h 48h ANOVA p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001 p<0,0001

laser x NzPc 1 µM p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001laser x NzPc 2,5 µM p > 0,05 p > 0,05 p < 0,001 p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001laser x NzPc 5 µM p < 0,01 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001laser x NzPcBSA 1 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001laser x NzPcBSA 2,5 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001laser x NzPcBSA 5 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 1 µM x NzPc 2,5 µM p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p < 0,05 p < 0,001NzPc 1 µM x NzPc 5 µM p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,05 p < 0,001 p < 0,001NzPc 1 µM x NzPcBSA 1 µM p < 0,01 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 1 µM x NzPcBSA 2,5 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 1 µM x NzPcBSA 5 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 2,5 µM x NzPc 5 µM p > 0,05 p < 0,01 p < 0,01 p < 0,05 p < 0,001 p < 0,001NzPc 2,5 µM x NzPcBSA 1 µM p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 2,5 µM x NzPcBSA 2,5 µM p < 0,01 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 2,5 µM x NzPcBSA 5 µM p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 5 µM x NzPcBSA 1 µM p > 0,05 p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,05 p < 0,001NzPc 5 µM x NzPcBSA 2,5 µM p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPc 5 µM x NzPcBSA 5 µM p < 0,01 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001NzPcBSA 1 µM x NzPcBSA 2,5 µM p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001NzPcBSA 1 µM x NzPcBSA 5 µM p > 0,05 p < 0,001 p < 0,01 p > 0,05 p < 0,001 p < 0,001

T u k e y -K r a m e r

NzPcBSA 2,5 µM x NzPcBSA 5 µM p > 0,05 p < 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05

65

ANEXO B

Diferenças estatísticas entre os grupos experimentais obtidas através dos testes ANOVA e Tukey-Kramer - grupos incubados com com NzPc e NzPcBSA na concentração de 5 µM seguida de irradiação com densidade de energia de 4,5 J/cm2, 15 J/cm2 e 45 J/cm2. Resultados obtidos após 24 e 48 h de tratamento. Grupos comparados 24h 48h ANOVA p < 0,0001 p < 0,0001

laser - 4,5 J/cm2 x laser 15 J/cm2 p > 0,05 p > 0,05 laser - 4,5 J/cm2 x laser 45 J/cm2 p > 0,05 p > 0,05 laser - 4,5 J/cm2 x NzPc - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,01 laser - 4,5 J/cm2 x NzPc - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 4,5 J/cm2 x NzPc - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 15 J/cm2 x laser 45 J/cm2 p > 0,05 p > 0,05 laser - 15 J/cm2 x NzPc - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p > 0,05 laser - 15 J/cm2 x NzPc - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 15 J/cm2 x NzPc - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPc - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPc - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPc - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 laser - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 4,5 J/cm2 x NzPc - 15 J/cm2 p < 0,05 p < 0,01 NzPc - 4,5 J/cm2 x NzPc - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 15 J/cm2 x NzPc - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p > 0,05 p > 0,05 NzPc - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 4,5 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPc - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p > 0,05 p < 0,001 NzPc - 45 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPcBSA - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 15 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001 NzPcBSA - 4,5 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,001

T u k e y - K r a m e r

NzPcBSA - 15 J/cm2 x NzPcBSA - 45 J/cm2 p < 0,001 p < 0,05

universidade do vale do paraÍba instituto de …livros01.livrosgratis.com.br/cp100615.pdf ·...

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