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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

ADRIANA GASPARETTO SOLETTI

EFEITOS DA SAZONALIDADE SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA,

POTENCIAL ANTIMICROBIANO, CITOTÓXICO E MUTAGÊNICO DOS

ÓLEOS ESSENCIAIS E FRAÇÕES DICLOROMETANO E ACETATO

DE ETILA DE Piper amplum E Piper cernuum

Itajaí

2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE DOUTORADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS






Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-orientadora: Profa. Dra. Angela Malheiros

Itajaí, Junho de 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

S43e

Soletti, Adriana Gasparetto, 1983- Efeitos da sazonalidade sobre a composição química, potencial antimicrobiano, citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum / Adriana Gasparetto Soletti, 2015. 183f. ; il.; fig.; tab. Cópia de computador (Printout(s)). Tese (Doutorado) Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz” Bibliografia: p.161-183 1. Óleos essenciais. 2. Plantas medicinais. 3. Piper amplum. 4. Piper cernuum. 5. Micoses. I. Título. CDU: 615.32

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293






Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.

____________________________________________________________ Clóvis Antônio Rodrigues, Doutor

Coordenador do Programa de Doutorado em Ciências Farmacêuticas

Apresentada perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

____________________________________________________________ Doutor Alexandre Bella Cruz (Univali)

Presidente

____________________________________________________________ Doutora Angela Malheiros (Univali)

Co-orientador

____________________________________________________________ Doutor Clóvis Antônio Rodrigues (Univali)

Membro Interno

____________________________________________________________ Doutora Márcia Maria de Souza (Univali)

Membro Interno

____________________________________________________________ Doutor Obdulio Gomes Miguel (UFPR)

Membro Externo

____________________________________________________________ Doutor Ricardo Andrade Rebelo (FURB)

Membro Externo Itajaí (SC), Junho de 2015.

Dedico este trabalho ao meu marido Giancarlo, amor da minha

vida, por aceitar trilhar esse caminho ao meu lado, ao Aureus José, meu filhote de quatro patas, meu companheiro fiel, e aos meus pais, Alcebíades e Ângela, por investir e incentivar minha caminhada infinita em busca do conhecimento e, pelo exemplo de família, de homem, de mulher, de casal, de pai, de mãe, de luta, de fé, de coragem, de caráter, enfim, por tudo!

Amo vocês!

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, pelo amor, carinho, compreensão, fé, luta, dedicação, por serem meu alicerce, meu porto seguro e principalmente por acreditar e investir em mim para realização desse projeto. Pois tudo que faço é para que tenham orgulho do ser humano que me tornei.

Agradeço ao Meu Amor, Giancarlo, pelo amor, companheirismo, carinho, por acreditar nesse sonho, pela paciência em dias incomuns, pela presença mesmo não estando presente, pelas histórias que temos para contar, e especialmente pelas que ainda escreveremos.

Agradeço ao Aureus José, meu cãozinho, por sua presença constante que me anima, me encoraja e faz todos os meus dias muito mais felizes.

Agradeço aos meus irmãos Marcelo, Alexandra e Maurício, pelo apoio, torcida, amor, carinho, amizade, e especialmente pelo que somos juntos, uma base forte, consolidada no amor.

Agradeço aos meus sogros Sergio e Terezinha pelo apoio, torcida e por proporcionar uma vida em Balneário Camboriu muito mais confortável.

Aos meus cunhados, Diogo, Giorgia, Francine, Gustavo, Geíza pela torcida e em especial a Lígia que contribuiu na construção desse trabalho.

Aos meus sobrinhos lindos Bernardo, Enzo, Gabriela e Matheus por me permitirem amar de uma forma totalmente nova.

Agradeço a minha família em geral, que de alguma forma e de algum lugar torceram e acreditaram nesta conquista.

Agradeço a Elza e Jéssica pela torcida de sempre, pelo apoio em todas as circunstâncias, e pelas comidinhas que alimentavam meu coração.

Agradeço a todos os meus amigos amados que mesmo estando distantes, se fazem presente.

Agradeço a Ana Milda, Roseane e Luciane, amigas que ganhei nessa caminhada, pelo companheirismo, pela divisão da carga, pelos bons momentos que se eternizarão em meu coração.

Agradeço aos meus sempre alunos, especialmente àqueles que se tornaram amigos e hoje são frutos de imenso orgulho e admiração, mas que acima de tudo me fizeram ter a certeza que a docência é minha verdadeira paixão.

Agradeço a Deus, pela fé e principalmente por ser a única certeza em dias que a dúvida era constante.

Agradeço ao Alexandre Bella Cruz e Angela Malheiros meus orientadores, pela dedicação, exemplo, empenho, paciência, ensinamentos

científicos e de vida, por ser parte importante nesse capítulo da minha vida.

Agradeço ao Clóvis Antônio Rodrigues, Márcia Maria de Souza, Obdulio Gomes Miguel e Ricardo Andrade Rebelo, membros da banca que muito contribuiram com esse trabalho. Agradeço ao Juliano e Elenize, pela cooperação e amizade.

Agradeço ao Clóvis Antônio Rodrigues e em seu nome, todos os professores da UNIVALI, que fizeram parte dessa caminhada. Ao CNPQ e FAPESP pelo apoio financeiro.

“... mas é preciso ter manha, é preciso ter graça, é preciso ter sonho sempre. Quem traz na pele essa marca, possui a estranha mania de ter fé na vida...”

Maria Maria – Milton Nascimento





Adriana Gasparetto Soletti Itajaí, Junho de 2015

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-orientador: Profa. Dra. Angela Malheiros Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 183 Espécies do gênero Piper têm sido investigadas como fonte de novos produtos naturais com atividades biológicas promissoras, destacando a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da sazonalidade na composição química, potencial antimicrobiano, citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes estações do ano. Os óleos foram extraídos por hidrodestilação com clevenger, e o hidrolato foi submetido a partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. Os óleos foram caracterizados por CG/EM, índice de retenção, IV e RMN 1H e 13C. A atividade antimicrobiana foi realizada por bioautografia e diluição em ágar. O potencial citotóxico e mutagênico foi realizado pelo ensaio de mutação reversa sobre S. cerevisae. Nos óleos essenciais de P. amplum, foi possível identificar 43 substâncias (91,54 a 93,93%), sendo os majoritários β-cariofileno (15,5 a 20,58%), α-pineno (10,29 a 14,86%), cadin-4-en-7-ol (5,72 a 8,06%), α-guaieno (6,6 a 8%), α-copaeno (5,98 a 7,85%), germacreno D (4,44 a 8,61%), Limoneno (5,10 a 6,45%) e germacreno B (3,09 a 5,07%). Nos óleos de P. cernuum, identificou-se 27 substâncias (92,89 a 98,44%), sendo os majoritários trans-dihydroagarofurano (30 a 36,7%), 4-epi-cis-dihidroagarofurano (11,2 a 13,4%), γ-eudesmol (7,64 a 11,65%), β-cariofileno (5,94 a 8,69%), elemol (5,89 a 9,15%), α-pineno (2,63 a 5,43%) e canfeno (2,16 a 4,55%). Os óleos essenciais e as frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum apresentaram-se ativos contra bactérias Gram positivas, dermatófitos e C. neoformans, sem evidência de potencial mutagênico para todas as amostras referentes às quatro estações do ano. Contudo foi possível concluir que a sazonalidade influenciou no rendimento, na composição química, na atividade antimicrobiana e no potencial citotóxico das amostras testadas. Demonstrando a importância na determinação da época de coleta mais adequada para a obtenção de produtos naturais com composição química mais constante, melhor atividade biológica e menor toxicidade. Palavras-chave: P. amplum. P. cernuum. Atividade antibacteriana. Atividade antifúngica. Potencial citotóxico. Potencial mutagênico. Óleos essenciais.

EFFECTS OF SEASONALITY ON THE CHEMICAL COMPOSITION,

ANTIMICROBIAL, CYTOTOXIC AND MUTAGENIC POTENTIAL OF

ESSENTIAL OILS AND FRACTIONS OF DICHLOROMETHANE AND

ETHYL ACETATE OF Piper Amplum AND Piper Cernuum

Adriana Gasparetto Soletti Itajaí, June 2015

Supervisor: Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz Co-supervisor: Prof. Dr. Angela Malheiros Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 183 Species of the Piper genus have been investigated as a source of new natural products with promising biological activities, particularly for the antimicrobial activity of the essential oils. This study aims to evaluate the influence of seasonality on the chemical composition, as well the antimicrobial, cytotoxic and mutagenic potential of essential oils and fractions of dichloromethane and ethyl acetate of P. amplum and P. cernuum in the different seasons of the year. The oils were extracted by Clevenger hydrodistillation, and the hydrolact was submitted to liquid-liquid partition with increasing polarity solvents. The oils were characterized by GC/MS, retention index, IR and 1H and 13C NMR. The antimicrobial activity was performed by bioautography and agar dilution. The cytotoxic and mutagenic potential were determined by the reverse mutation test on S. cerevisiae. It was possible to identify 43 substances in the essential oils of P. amplum (91.54 to 93.93%), the majority substances being β-caryophyllene (15.5 to 20.58%), α-pinene (10.29 to 14.86%), cadin-4-en-7-ol (5.72 to 8.06%), α-guaiene (6.6 8%), α-copaene (5.98 to 7.85%), germacrene D (4.44 to 8.61%), D-limonene (5.10 to 6.45%) and germacrene B (3.09 to 5.07%). In P. cernuum oils, 27 substances were identified (92.89 to 98.44%), the majority being trans-dihydroagarofurane (30 to 36.7%), 4-epi-cis-dihydroagarofurane (11.2 to 13.4%), γ-eudesmol (7.64 to 11.65%), β-caryophyllene (5.94 to 8.69%), elemol (5.89 to 9.15%), α-pinene (2.63 to 5.43%) and camphene (2.16 to 4.55%). The essential oils and fractions of dichloromethane and ethyl acetate of P. amplum and P. cernuum were active against Gram positive bacteria, dermatophytes and C. neoformans, with no evidence of mutagenic potential for all samples, for all four seasons of the year. However, it was possible to conclude that seasonality influences the performance, chemical composition, antimicrobial activity and cytotoxic potential of the tested samples, which demonstrates the importance of determining the most appropriate season for collection, in order to obtain natural products with the most constant chemical composition, best biological activity, and lowest toxicity. Keywords: P. amplum. P. cernuum. Antibacterial activity. Antifungal activity. Cytotoxic potential. Mutagenic potential. Essential oils.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Moléculas antibacterianas obtidas por modificação semissintética a partir de produto natural no período de 2006 a 2010............................................ 26

Figura 2: Mecanismos de resistência do Staphylococcus aureus aos antibióticos não β-lactâmicos e não glicopéptidos................................................ 29

Figura 3: Fases de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em meio completo................................................................................................................ 43

Figura 4: Fatores de influência no conteúdo e acúmulo de metabólitos secundários em planta.......................................................................................... 47

Figura 5: Rota biossintética dos fenilpropanoides............................................... 51

Figura 6: Estruturas precurssoras dos terpenoides............................................. 52

Figura 7: Distribuição geográfica de Piper em ambos os hemisférios................. 58

Figura 8: Folhas de Piper amplum....................................................................... 63

Figura 9: Folhas de Piper cernuum...................................................................... 63

Figura 10: Extração de óleo essencial de Piper amplum e Piper cernuum por hidrodestilação com o auxílio do aparato Clevenger............................................ 67

Figura 11: Partição líquido-líquido dos hidrolatos de Piper amplum e Piper cernuum, com diclorometano e acetato de etila, e posterior eliminação dos solventes em rota evaporador............................................................................... 68

Figura 12: Preparo de inóculos bacterianos e de fungos leviduriformes............. 72

Figura 13: Ensaio de bioautografia para o direcionamento das pesquisas quanto à localização dos compostos bioativos para atividade antimicrobiana....................................................................................................... 74

Figura 14: Representação do procedimento de determinação de atividade antimicrobiana pelo método de diluição em ágar: (a) concentração inibitória mínima; (b) concentração microbicida mínima..................................................... 77

Figura 15: Representação da ativação da levedura Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) para ensaio de mutagenicidade..................................................... 79

Figura 16: Representação da preparação do inóculo de Saccharomyces cerevisiae para o ensaio mutagênico.................................................................... 80

Figura 17: Representação do procedimento para realização da análise mutagênica............................................................................................................ 82

Figura 18: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................................... 89

Figura 19: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001)........................................................................................................... 97

Figura 20: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper amplum em relação a sazonalidade..................... 99

Figura 21: Análise comparativa dos compostos majoritários presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001)..................... 100

Figura 22: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano............................................................................ 102

Figura 23: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013)........................................................... 109

Figura 24: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum em relação a sazonalidade.................... 111

Figura 25: Análise comparativa dos compostos majoritários presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013)........................................................... 112

Figura 26: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................ 115

Figura 27: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano................................................................ 116

Figura 28: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano................................... 119

Figura 29: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.................................. 120

Figura 30: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper amplum obtidos na primavera..................................................................... 121

Figura 31: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper cernuum obtidos no inverno........................................................................ 122

Figura 32: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum...................................................... 126

Figura 33: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum nas estações de verão e outono.................................................................................. 127

Figura 34: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. aureus dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Santos et al. (2012) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006)............................. 132

Figura 35: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. pyogenes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003)................. 133

Figura 36: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra B. subtilis dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006)............................................ 134

Figura 37: Análise comparativa da atividade antifúngica contra M.gypseum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 137

Figura 38: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. mentagrophytes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012).................................................................................................................... 137

Figura 39: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. rubrum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 138

Figura 40: Análise comparativa da atividade antifúngica contra E. flocosum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 138

Figura 41: Análise comparativa da atividade antifúngica contra C. neoformans dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).................................................................................................................... 139

Figura 42: Análise comparativa da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.............................................................................. 146

Figura 43: Análise comparativa da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.............................................................................. 150

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Quantidade de matéria prima vegetal seca e triturada de Piper amplum e Piper cernuum e quantidade de água destilada necessária para obtenção de óleo essencial por hidrodestilação................................................... 67

Tabela 2: Rendimento dos óleos essenciais obtidos a partir das folhas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação.................... 84

Tabela 3: Densidade absoluta dos óleos essenciais obtidos de Piper amplum e Piper cernuum....................................................................................................... 87

Tabela 4: Rendimento das frações dicloromentano e acetato de etila obtidos a partir dos hidrolatos oriundos da extração dos óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum...................................................................................... 88

Tabela 5: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano........................................................................................................................ 90

Tabela 6: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano............... 103

Tabela 7: Valores de deslocamentos químicos de RMN 13C para as substâncias majoritárias presentes no óleo essencial de P. cernuum [ɣ v (ppm), CDCl3]................................................................................................................... 124

Tabela 8: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações............................................................................................... 130

Tabela 9: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações............................................................................................... 130

Tabela 10: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................ 136

Tabela 11: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................ 136

Tabela 12: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações................................................... 144

Tabela 13: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações.................................................. 145

Tabela 14: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................................................................................................... 148

Tabela 15: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras............................................................................................................... 149

Tabela 16: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. amplum nas quatro estações do ano............................... 154

Tabela 17: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. cernuum nas quatro estações do ano.............................. 155

Tabela 18: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. amplum nas quatro estações do ano................................................................................................................... 156

Tabela 19: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. cernuum nas quatro estações do ano................................................................................................................... 157

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

4-NQO Óxido de Nitroquinoleína

ANOVA Análise de Variância.

CBM Concentração Bactericida Mínima.

CC Cromatografia em Coluna.

CCD Cromatografia em Camada Delgada.

CDC Center for Diseases Control and Prevention.

CFM Concentração Fungicida Mínima.

CG Cromatografia Gasosa.

CIM Concentração Inibitória Mínima.

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute.

CMM Concentração Microcida Mínima.

DAEC Escherichia coli difusamente aderente.

DMSO Dimetilsulfóxido.

EAEC Escherichia coli enteroagragativa.

EHEC Escherichia coli enterohemorrágica.

EIEC Escherichia coli enteroinvasora.

EM ou MS Espectrometria de Massa

EPEC Escherichia coli enteropatogênica.

ESBLs β-lactamases de espectro ampliado.

ETEC Escherichia coli enterotoxigênica.

eV Eletro volt.

FDA Food and Drug Administration.

GISA Staphylococcus aureus resistente a vancomicina e teicoplamina.

IK Indice de Kovats.

IR Indice de Retenção.

LT Termolábel.

MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina.

NI Não Identificado.

NNIS National Nosocomical Infections Surveillance.

OECD Organization for economic Co-operation and Development.

PBP2a Penicilina ligada a proteína 2ª.

Rf Fator de retenção.

RMN Ressonância Magnética Nuclear.

SC Meio Mínimo Completo.

ST Termoestável.

TTC Cloreto 2,3,5 trifenil tetrazólico.

UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por Mililitros.

UFCs Unidades Formadoras de Colônias.

VISA Staphylococcus aureus resistente a vancomicina.

YEL Meio Líquido de Extrato de Levedura

YEPD Meio Ágar Extrato de Levedura

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 19

2 OBJETIVOS....................................................................................................... 21

2.1 Objetivo Geral............................................................................................. 21

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................... 21

3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 22

3.1 Atividade Antimicrobiana.......................................................................... 22

3.1.1 Staphylococcus aureus.................................................................... 27

3.1.2 Streptococcus pyogenes................................................................. 30

3.1.3 Bacillus subtilis................................................................................. 31

3.1.4 Escherichia coli................................................................................. 32

3.1.5 Dermatofitoses.................................................................................. 33

3.1.6 Micoses Oportunistas....................................................................... 34

3.1.6.1 Candidíase............................................................................. 34

3.1.6.2 Criptococose......................................................................... 37

3.1.6.3 Aspergilose............................................................................ 38

3.1.6.4 Mucormicose......................................................................... 39

3.2 Avaliação da Toxicidade........................................................................... 40

3.2.1 Mutagenicidade Sobre Saccharomyces cerevisiae....................... 41

3.3 Plantas Medicinais..................................................................................... 44

3.3.1 Metabolismo Secundário Vegetal e Influência Sazonal................ 46

3.3.2 Substâncias Obtidas de Plantas Medicinais e Atividade Antimicrobiana................................................................................................... 49

3.4 Óleos Essenciais....................................................................................... 49

3.4.1 Métodos Extrativos de Óleos Essenciais....................................... 53

3.4.2 Métodos de Caracterização de Óleos Essenciais.......................... 55

3.5 Família Piperaceae e o Gênero Piper....................................................... 57

3.5.1 Piper amplum.................................................................................... 62

3.5.2 Piper cernuum................................................................................... 63

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 66

4.1 Material Vegetal.......................................................................................... 66

4.1.1 Obtenção dos Óleos Essenciais e Frações.................................... 66

4.1.2 Partição Líquido-Líquido.................................................................. 67

4.1.3 Caracterização dos Óleos Essenciais............................................. 68

4.2 Material Microbiológico............................................................................. 70

4.2.1 Micro-organismos……….................................................................. 70

4.2.2 Atividade Antimicrobiana................................................................. 71

4.2.3 Preparo de Inóculos Bacterianos.................................................... 71

4.2.4 Preparo de Inóculos Fúngicos......................................................... 72

4.2.5 Bioautografia..................................................................................... 73

4.2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)............... 74

4.2.7 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Fungicida Mínima (CFM)..................................................................................... 76

4.3 Avaliação de Mutagenicidade................................................................... 78

4.3.1 Ativação e Preparação do Ínoculo da Levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................................................. 78

4.3.2 Análise Mutagênica........................................................................... 80

4.3.3 Análise Estatística............................................................................ 83

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................................................... 84

5.1 Obtenção dos Óleos Essenciais............................................................... 84

5.2 Densidade dos Óleos Essenciais............................................................. 86

5.3 Obtenção das Frações Diclorometano e Acetato de Etila..................... 87

5.4 Caracterização dos Óleos Essenciais...................................................... 88

5.4.1 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de Retenção – Piper amplum.................................................................. 89

5.4.2 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de Retenção – Piper cernuum................................................................ 101

5.4.3 Espectroscopia no Infravermelho – IV............................................. 113

5.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear – RMN......... 117

5.5 Bioautografia.............................................................................................. 125

5.6 Avaliação da Atividade Antimicrobiana................................................... 127

5.6.1 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essencias de Piper amplum e Piper cernuum................................................................................... 129

5.6.2 Atividade Antimicrobiana das Frações Diclorometano e Acetato de Etila de Piper amplum e Piper cernuum...................................................... 142

5.7 Avaliação de Mutagenicidade Frente ao Saccharomyces cerevisiae... 151

6 CONCLUSÕES.................................................................................................. 160

REFERÊNCIAS..................................................................................................... 161

19

1 INTRODUÇÃO

Plantas medicinais é um tema relevante e que, de maneira geral, desperta o

interesse das pessoas, pois além de seu uso popular com finalidade terapêutica,

pode contribuir de forma significativa com informações que conduzam a geração de

novas tecnologias pela divulgação e emprego das propriedades terapêuticas dos

vegetais (CECHINEL; YUNES, 1998; MACIEL et al., 2002; PINTO et al., 2002).

De acordo com Gragg e Newman (2012) os produtos naturais continuam

desempenhando um papel muito importante no processo de descoberta e

desenvolvimento de novos fármacos. Nos últimos 30 anos, as indústrias

farmacêuticas investiram seus esforços na pesquisa de novos medicamentos, com

destaque também para o tratamento de doenças infecciosas (microbiana,

parasitárias e virais) e câncer.

Dentre as famílias de plantas pertencentes à flora brasileira tem-se a família

Pipereaceae, a qual possui muitas espécies que apresentam atividades biológicas

promissoras, como atividade antitumoral, antimicrobiana, antimalária, antiparasitária

e inseticida. Os representantes dessa família também são usados em problemas do

trato respiratório e aparelho digestivo (BENEVIDES et al., 1999; CAMPOS et al.,

2005; 2007; GUERRINE et al., 2009) sendo, portanto material promissor para a

busca de novos fitofármacos ou protótipos para síntese de medicamentos sintéticos.

As infecções humanas causadas por micro-organismos como bactérias e

fungos, constituem um sério problema de preocupação mundial, uma vez que a

resistência microbiana aos agentes antimicrobianos é uma consequência do uso

indevido e irracional desses medicamentos, proporcionando condições favoráveis

para o surgimento e propagação de micro-organismos resistentes (WHO, 2014).

Tendo em vista que o surgimento de micro-organismos resistentes é um

problema complexo, pesquisas para a busca de compostos de fonte natural com

atividade antimicrobiana se fazem necessário, de maneira a encontrar novos

agentes antimicrobianos que minimizem problemas comuns, tais como: resistência

microbiana, baixa solubilidade e alta toxicidade (SALVADOR et al., 2003).

Assim sendo, a busca de novas alternativas terapêuticas com toxicidade

relativa baixa para terapias antimicrobianas e pesquisas com produtos naturais

devem ser encorajadas.

20

Neste contexto as plantas podem ser fontes de alvos farmacológicos

interessantes, destacando os efeitos dos óleos essenciais de espécies de Piper,

uma vez que a literatura científica já aponta atividade antimicrobiana de P. aduncum

e P. tuberculatum contra fungos Cladosporium sphaerospermum e C.

caldospurioides (NAVICKIENE et al., 2006); ação bacteriostática e fungistática de P.

angustifolium (TIRILLINI; VELASQUEZ; PELLEGRINO, 1996); atividade

antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans de P. cernuum e

P. regnellii (COSTANTIN et al., 2001); atividade antifúngica frente a Cladosporium

sphaerospermum e C. caldospurioides de P. malacophyllum (LAGO et al., 2005); e

atividade antibacteriana de P. nigrum (DORMAN; DEANS, 2000).

Indústrias farmacêuticas empregam os óleos essenciais como matéria prima

para medicamentos devido às suas propriedades farmacológicas próprias ou para a

semi-síntese de novos fármacos. Na indústria alimentícia, são utilizados como

condimentos, aromatizantes e edulcorantes, e ainda estão presentes nas indústrias

de cosméticos, domissanitários e na aromaterapia (NIERO; MALHEIROS, 2012;

HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

A utilização de óleos essenciais requer minuciosa caracterização química e

avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a variações de

fatores externos, destacando a sazonalidade, visto que a quantidade e, às vezes,

até mesmo a natureza das substâncias ativas não é constante durante o ano

(GLOBBO-NETO; LOPES, 2007), além da necessidade de avaliar não somente o

potencial farmacológico, mas também seu perfil toxicológico (HENRIQUES;

SIMÕES-PIRES; APEL, 2012), uma vez que substâncias presentes em óleos

essenciais são importantes na síntese ou semi-síntese de substâncias

antimicrobianas.

Sendo assim, a proposta do presente estudo foi avaliar o potencial

antimicrobiano, citotóxico e mutagênico de duas espécies pertencentes ao gênero

Piper, P. amplum e P. cernuum, analisando os efeitos da sazonalidade sobre essas

propriedades.

21

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar a composição química, a atividade antimicrobiana e o potencial

citotóxico e mutagênico dos óleos voláteis e frações obtidas a partir do hidrolato de

Piper amplum e Piper cernuum coletadas nas diferentes estações do ano.

2.2 Objetivos Específicos:

• Realizar a extração dos óleos essenciais, por hidrodestilação, das folhas

secas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação do ano;

• Proceder o fracionamento dos hidrolatos por partição líquido-líquido, com

solventes, diclorometano e acetato de etila;

• Estabelecer qualitativa e quantitativamente a composição química dos óleos

essenciais por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massas (CG/EM),

índice de retenção, espectroscopia de ressonância magnética nuclear e

infravermelho;

• Realizar a bioautografia dos óleos e frações diclorometano e acetato de etila

para localizar as substâncias com potencial antimicrobiano;

• Quantificar a atividade antimicrobiana através da determinação da

concentração inibitória mínima e microbicida mínima dos óleos essenciais e frações

diclorometano e acetato de etila, das espécies de Piper nas quatro estações do ano,

através do método de diluição em ágar;

• Avaliar o potencial citotóxico e mutagênico dos óleos essenciais e frações

dicloromentano e acetato de etila das espécies de Piper nas diferentes estações do

ano, através do ensaio de mutação reversa sobre a levedura Saccharomyces

cerevisiae (XV-185-14C).

22

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Atividade Antimicrobiana

Um dos grandes avanços da humanidade foi a descoberta da penicilina, em

1928, para o tratamento de infecções bacterianas. Desde então a indústria

farmacêutica disponibilizou, antimicrobianos cada vez mais eficazes para o

tratamento de bactérias Gram positivas (LIMA, 2001; SALVADOR et al., 2003;

FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004; MIMS

et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).

Dentre os antibióticos para terapia convencional, no período de 1940 a 1960,

destaca-se os β-lactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina),

tetraciclinas (clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), peptídeos (vancomicina) e

outros (cloranfenicol, rifamicina B, clindamicina e polimixina B), com apenas três

derivados sintéticos, a isoniazida, trimetropim e metronidazol, eficazes no tratamento

de infecções causadas por bactérias Gram positivas (LIMA, 2001; SALVADOR et al.,

2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004;

MIMS et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).

De 1960 a 1980 foram disponibilizados para uso terapêutico, antibióticos

semi-sintéticos eficazes no combate à bactérias Gram positivas e Gram negativas,

análogos aos antibióticos naturais já existentes. A maioria destes medicamentos foi

obtido a partir de protótipos microbianos, como derivados β-lactâmicos (análogos de

penicilina e cefalosporina, ácido clavulânico, aztreonam), análogos da tetraciclina,

derivados aminoglicosídicos (gentamicina, tobramicina, amicacina) (LIMA, 2001;

SALVADOR et al., 2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004;

PEREIRA et al., 2004; MIMS et al., 2005; GUIMARÃES, MOMESSO e PUPO, 2010;

LING et al., 2015).

Entre os anos 1980 a 2000 houve uma redução de novos protótipos

antibióticos para utilização na antibioticoterapia, e ao mesmo tempo ocorreu

aumento na incidência de resistência bacteriana. Este período é marcado pela

introdução da classe das fluoroquinolonas sintéticas, desenvolvidas a partir do ácido

nalidíxico, além do imipenem (derivado β-lactâmico), análogos da eritromicina

(derivado macrolídeo), e a combinação de dois derivados semi-sintéticos de

23

produtos microbianos, quinupristina e dalfopristina, a qual foi aprovada para uso em

infecções causadas por Enterococcus faecium resistente à vancomicina em 1999

pelo FDA (Food and Drug Administration) (LIMA, 2001; SALVADOR et al., 2003;

FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al., 2004; MIMS

et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al., 2015).

Em 2001, apenas um antibiótico de origem sintética da classe das

oxazolidinonas foi disponibilizado, a linezolida, com uso principal para tratamento de

infecções por cocos Gram positivos, especialmente em casos de resistência aos

tratamentos convencionais (BARROS et al., 2008).

Os programas de descoberta de antibióticos de fontes naturais têm sido

retomados em algumas indústrias farmacêuticas, levando à aprovação do

lipodepsipeptídeo natural daptomicina pelo FDA em 2003 (LIMA, 2001; SALVADOR

et al., 2003; FUCHS; WANNMACHER, 2004; CUNICO et al., 2004; PEREIRA et al.,

2004; MIMS et al., 2005; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010; LING et al.,

2015).

Recentemente Ling et al. (2015), isolaram uma nova substância, teixobactina,

de um micro-organismo do solo, cujo mecanismo de ação sugerido pelos autores é a

inibição da síntese da parede celular através da ligação ao lipídio II (precursor do

peptidioglicano) e lipídio III (precursor do ácido teicoico).

A teixobactina é relatada como um promissor agente terapêutico, uma vez

que possui atividade contra micro-organismos Gram posivitos, como Enterococcus,

M. tuberculosis, Clostridium difficile, Bacillus anthracis e S. aureus, incluindo cepas

resistentes, e ainda em teste de desenvolvimento de resistência, por meio de

plaqueamento com doses baixas do composto, não foi possível obter mutações

resistentes à teixobactina de S. aureus e M. tuberculosis. No entanto os

pesquisadores não descartam o desenvolvimento de resistência dos micro-

organismos a essa substância mesmo que em longo prazo (LING et al., 2015).

Com a introdução e o uso extensivo e muitas vezes inapropriado dos

antibióticos, más condições de higiene, fluxo contínuo de viajantes, aumento de

pacientes imunocomprometidos, falta de adesão ao tratamento e demora no

diagnóstico das infecções microbianas, há favorecimento do aumento da resistência

e disseminação de micro-organismos multirresistentes (TAVARES, 2000;

SALVADOR et al., 2003; BERQUÓ et al., 2004; ROSSI; ANDREAZZI, 2005;

ANTUNES et al., 2006). Assim sendo, a resistência dos micro-organismos aos

24

antimicrobianos limita o tempo de vida útil dos antibióticos, resultando na pesquisa

constante de novas substâncias (LING et al., 2015).

A grande maioria dos micro-organismos resistentes a antimicrobianos surge

em decorrência de alterações genéticas, que podem ser cromossômicas ou extra

cromossômicas (PEREIRA et al., 2004; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004;

GIEDRAITIENE et al., 2011).

A resistência cromossômica ocorre pela mutação espontânea em um lócus do

cromossomo microbiano que controla a sensibilidade à determinado agente

antimicrobiano. Já a resistência extra cromossômica ocorre por plasmídeos,

denominados fatores R, que podem estar livres no citoplasma ou integrados no

cromossomo do micro-organismo. Esses plasmídeos possuem genes para a

resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, e atuam, na grande maioria das

vezes, controlando a formação de enzimas capazes de destruir os agentes

antimicrobianos (PEREIRA et al., 2004; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004;

GIEDRAITIENE et al., 2011).

De acordo com a OMS em 2012, as doenças cardiovasculares foram a

principal causa de morte com 13,2%. As doenças infecciosas são apresentadas

separadamente, como infecções respiratórias com taxa de morte de 5,5%, doenças

diarreicas com 2,7% de mortes e tuberculose com 1,6% de mortes, totalizando 9,8%.

Se adicionarmos a esse cálculo, o percentual de mortes por HIV/AIDS (2,7%), uma

vez que essa infecção viral torna o paciente imunodeprimido, ou seja, susceptível a

qualquer outro tipo de infecção, esse percentual resulta em 12,5%, sugerindo que as

doenças infecciosas, de forma geral, foram a segunda causa de morte neste

respectivo ano (WHO, 2014).

Assim sendo, as infecções humanas consistem em um sério problema, sendo

que frequentemente os patógenos são micro-organismos como bactérias e fungos,

que possivelmente podem ser de linhagens multirresistentes isolados tanto de

pacientes hospitalizados quanto de pacientes da comunidade em geral

(NASCIMENTO et al., 2000; SALVADOR et al., 2003; BERQUÓ et al., 2004;

FERRONATO et al., 2007; COIMBRA et al., 2012).

No decorrer do tempo as infecções fúngicas humanas também apresentaram

um aumento significativo, sendo as dermatomicoses as principais responsáveis por

esse aumento. Ocorrendo especialmente em pacientes imunocomprometidos que

incluem importantes fatores de risco como, neutropenia, leucopenia, administração

25

de corticoesteroides e outros agentes antifúngicos, hepatotoxicidade, reações

cutâneas e lesões teciduais (SIDRIM et al., 1999; SALVADOR et al., 2003).

O amplo uso de antibacterianos e antifúngicos tópicos e sistêmicos em

pacientes imunossuprimidos resultou no aumento de micro-organismos resistentes

aos antimicrobianos. Essa resistência está associada, principalmente, com

imunossupressão severa, reincidência as infecções e tempo de tratamento

prolongado (TEICHERT et al., 2002).

O tratamento das micoses humanas e infecções bacterianas não é sempre

efetivo, pois os fármacos antifúngicos e antibacterianos disponíveis produzem

recorrência ou causam resistência, além de apresentarem importante toxicidade e

alto custo, levando a não adesão ao tratamento, constituindo um problema de saúde

pública especialmente em países em desenvolvimento (FENNER et al., 2006; COS

et al., 2006).

Os medicamentos à base de plantas têm sido amplamente utilizados por

muitos séculos, sendo que entre 1981 e 2010, novos agentes anti-infecciosos foram

descobertos a partir de produtos naturais, modificação semissintética ou síntese a

partir destes, totalizando 118 com atividade antibacteriana, 29 com atividade

antifúngica, 14 com atividade antiparasitária e 110 com atividade antiviral (GRAGG;

NEWMAN, 2012).

Entre os anos de 2006 e 2010 foram aprovados três novos medicamentos

antibacterianos obtidos através da modificação semissintética a partir de produto

natural. Sendo o primeiro retapamulina (semissintético de pleuromutilina), o segundo

ceftobiprole medocaril (pró-fármaco da cefalosporina) e o terceiro agente

antibacteriano modificado foi vancomicina telavancina (Figura 1). Neste mesmo

período, apenas um antifúngico foi obtido a partir de modificação semissintética de

produto natural, sendo ele equinocandina derivado da anidulafungina, porém sem

uma estrutura química estabelecida (GRAGG; NEWMAN, 2012).

26

Figura 1: Moléculas antibacterianas obtidas por modificação semissintética a partir de produto natural no período de 2006 a 2010.

Fonte: GRAGG; NEWMAN, 2012.

A resistência a agentes antimicrobianos é grave e preocupante e requer não

somente a pesquisa de novas substâncias com propriedade antimicrobiana, mas

também o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento eficaz contra

infecções bacterianas e fúngicas, uma vez que, entre as causas apontadas para o

fenômeno está o uso abusivo e indiscriminado de fármacos antimicrobianos

(SALVADOR et al., 2003; CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004; COS et al.,

2006). Sendo cada vez mais importante a busca de novos fármacos com efeito

biocida ou biostático, e o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento

27

de infecções (GALES et al., 1997; FALCÃO et al., 2002; PEREIRA et al., 2004;

CUNICO et al., 2004; BERQUÓ et al., 2004; COS et al., 2006).

Entre as principais ferramentas na busca de novos modelos moleculares

estão a informação de como as plantas são utilizadas por diferentes grupos étnicos,

e o estudo farmacológico das preparações utilizadas no âmbito da etnobotânica e da

etnofarmacologia (RATES, 2001; YUNES; CECHINEL FILHO, 2001).

Assim o papel das plantas medicinais na busca e descoberta de novos

fármacos ganhou mais espaço, porém somente uma pequena porcentagem, cerca

de 15%, das 250.000 a 350.000 espécies vegetais estimadas no mundo foram

estudadas cientificamente (MALHEIROS et al., 2010).

Neste contexto, a comprovada ação antimicrobiana dos óleos essenciais

constitui em uma alternativa no tratamento de doenças infecciosas, sendo que

diversas espécies vegetais apresentam substâncias com potencial antimicrobiano

(BAKKALI et al., 2008).

A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais vem sendo intensamente

estudadas por muitos pesquisadores, através de vários métodos de análises in vitro

realizados por difusão, diluição ou bioautografia. O método de difusão consiste em

depositar a amostra em discos de papel ou poços, sobre o meio sólido contento o

inoculo microbiano, e após o período de incubação realiza-se a leitura do halo de

inibição em milímetros. O método de diluição, em meio sólido ou líquido, caracteriza-

se por ser um método quantitativo, permitindo a determinação da concentração

inibitória mínima (CIM). Por fim, a bioautografia é muito importante para a

localização da substância responsável pelo efeito microcida ou microstático

(HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

3.1.1 Staphylococcus aureus

Dentre os estafilococos, a espécie S. aureus é o patógeno mais importante,

sendo encontrado no ambiente externo e nas narinas anteriores em cerca de 20 a

40% de adultos, constituindo frequentemente parte da microbiota normal no homem.

No entanto em condições apropriadas podem causar infecções oportunistas, que

vão de infecções cutâneas, relativamente benignas, a doenças sistêmicas

potencialmente fatais (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).

28

Várias são as infecções associadas à S. aureus, como foliculite, furúnculos e

carbúnculos, impetigo, mastite, infecções de feridas, bacteremia e endocardite,

meningite, pericardite, infeções pulmonares, osteomielite/artrite séptica, piomiosite

(infecção dos músculos esqueléticos), intoxicação alimentar (exotoxinas), síndrome

de pele escaldada (toxinas antigênicas) e síndrome do choque tóxico (toxinas

antigênicas) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,

2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).

Os fatores de virulência não são encontrados em todas as cepas de S.

aureus, destacando os polissacarídeos capsulares, que impedem a fagocitose e

promovem a aderência dos micro-organismos às células do hospedeiro, bem como à

dispositivos de próteses. A presença de peptideoglicano e ácido teicoico, aumentam

a rigidez e elasticidade da parede celular, contribuindo na aderência da bactéria às

mucosas. A proteína A, imunogênica, interfere na opsonização e ingestão dos micro-

organismos pelas células polimorfonucleares, ativando o complemento

desencadeando respostas de hipersensibilidade (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;

MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM,

2011; WINN et al., 2012).

A produção de enzimas como a β lactamase torna esse micro-organismo

resistente à penicilina e ampicilina. A síntese de hemolisinas, como a α e β

hemolisina, letal à uma ampla variedade de células. A produção de toxinas,

esfoliatinas ou epidermolíticas, estão associadas à síndrome da pele escaldada,

enterotoxinas A a E, H e I, associadas a intoxicação alimentar e superantígenos

associados a síndrome do choque tóxico (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


2011; WINN et al., 2012).

A resistência de S. aureus à penicilina tem importância essencialmente

histórica, sendo mediada pela aquisição de elementos genéticos que codificaram a

produção de β lactamases ou penicilinases, associada frequentemente a genes de

resistência a outros antibióticos (macrólidos, ácido fusídico e aminoglicosídeos)

(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009;

JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).

Destacando nesse grupo os S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), S.

aureus com resistência intermediária à glicopeptídeo (vancomicina e teicoplamina)

(GISA) ou S. aureus com resistência intermediária à vancomicina (VISA), que são

29

um desafio constante para as instituições de saúde, uma vez que ocorrem tanto em

ambiente hospitalar quanto na comunidade.

Dados do National Nosocomical Infections Surveillance (NNIS), do Center for

Diseases Control and Prevention (CDC), nos Estados Unidos da América (EUA),

mostraram que, desde 1999, a proporção de MRSA ultrapassa 50% entre os

pacientes em UTI. No Brasil, os índices de cepas MRSA são também bastante

elevados (40% a 80%), principalmente em UTIs.

A resistência do S. aureus aos antibióticos tem sido desenvolvida por

mutações em seus genes ou pela aquisição de genes de resistência de bactérias da

mesma espécie, ou não (MENDES, 2010).

Os principais mecanismos de resistência do S. aureus são apresentados na

Figura 2, onde a resistência que ocorre por mutação, gera uma alteração no sítio de

ação do antibiótico, enquanto que a resistência por aquisição de genes, transmitida

por plasmídeos e transposons, frequentemente envolve a inativação ou a destruição

do fármaco, podendo ainda destacar a bomba de efluxo e modificação do alvo

ribossômico (MENDES, 2010).

Figura 2: Mecanismos de resistência do Staphylococcus aureus aos antibióticos não β-lactâmicos e não glicopéptidos.

Fonte: MENDES, 2010.

30

3.1.2 Streptococcus pyogenes

A espécie S. pyogenes, pertence ao grupo A dos β hemolíticos. É um

patógeno humano de extrema importância, sendo a pele e as mucosas os únicos

reservatórios conhecidos para essa espécie (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


2011; WINN et al., 2012).

O principal fator de virulência dos estreptococos do grupo A consiste em um

antígeno de superfície celular denominado proteína M, que confere a esse micro-

organismo resistência a fagocitose e morte celular por polimorfonucleares, sendo

também capaz de formar complexo com o fibrinogênio, que se ligam aos neutrófilos,

liberando mediadores inflamatórios que induzem o extravasamento vascular,

componente patológico do choque tóxico estreptocócico (MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

A camada mais externa da célula do S. pyogenes é composta por uma

cápsula de ácido hialurônico, não imunogênica, que impede a opsonização por

células fagocíticas. Ainda, os estreptococos do grupo A produzem duas hemolisinas,

a estreptolisina O e a estreptolisina S que apresentam toxicidade a vários tipos

celulares, além de exotoxinas pirogênicas (superantígenos), determinantes da

virulência na patogenia da síndrome estreptocócica, induzindo a proliferação dos

linfócitos T do hospedeiro resultando na liberação maciça de diversas citocinas,

levando a hipotensão e choque (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;

ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011;

WINN et al., 2012).

Os estreptococos do grupo A produzem também hialuronidase, que

despolimeriza a substância fundamental do tecido conjuntivo, permitindo sua

disseminação, bem como a estreptoquinase que hidrolisa os coágulos de fibrina

impedindo a formação de barreiras de fibrina na periferia das lesões estreptocócicas,

também permitindo sua disseminação (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


WINN et al., 2012).

A infecção mais comum causada por S. pyogenes é a faringite, mas podem

causar uma variedade de infecções cutâneas superficiais, incluindo o impetigo,

erisipela, celulite, sepse puerperal e infecções pós-parto (TRABULSI; ALTERTHUM,

31

2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM;

INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).

Na evolução da faringite por estreptococos do grupo A, existe a preocupação

quanto às complicações não supurativas, ou seja, a febre reumática e a

glomerulonefrite, sendo a primeira associada a faringite prévia e a segunda a

infecções faríngeas ou cutâneas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


WINN et al., 2012).

Quanto a utilização de antimicrobianos para o tratamento, prevenção e

controle de S. pyogenes, estes são muito sensíveis à penicilina, mas apresentam

resistência ou pouca resposta clínica observada para tetraciclinas e sulfonamidas o

que tem limitado o uso destes antimicrobianos. Por fim, é importante ressaltar que a

frequência de cepas resistentes aos novos macrolídeos (azitromicina e

claritromicina) tem aumentado (CAMPONOVO, 2002; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

3.1.3 Bacillus subtilis

O gênero Bacillus compreende um grande grupo de bacilos Gram positivos. O

Bacillus subtilis é uma espécie saprófita comum no solo e na água, é um organismo

esporulado, mas não patogênico, sendo muito utilizado no controle e validação de

cilos de esterilização por calor seco e óxido de etileno (TRABULSI; ALTERTHUM,



Mesmo esse micro-organismo testado sendo não patogênico, justifica-se sua

avaliação antimicrobiana uma vez que outras espécies pertencentes a esse gênero

apresentam-se potencialmente patogênicas, como B. anthracis e B. cereus



Além disso, B. subtilis é muito utilizado em pesquisas, pois trata-se de um

indicador para possível atividade antimicrobiana frente a bacilos Gram positivos



32

3.1.4 Escherichia coli

E. coli é a espécie bacteriana mais comumente isolada em laboratórios

clínicos associados a doenças infecciosas que podem acometer praticamente todos

os tecidos e sistemas orgânicos dos seres humanos (TRABULSI; ALTERTHUM,



Está envolvida na sepse e no choque induzido por endotoxinas, além de

infecções do trato urinário e feridas, pneumonia em pacientes hospitalizados

imunossuprimidos, meningite em recém-nascidos, gastroenterite e colite

hemorrágica (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,

2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; INGRAHAM, 2011; WINN et al., 2012).

Dentre as cepas de E. coli diarregênica, tem-se a E. coli enterotoxigênica

(ETEC) que produzem enterotoxinas secretoras termolábeis (LT) e/ou termoestáveis

(ST) que não provocam lesão no epitélio mucoso, mas uma hipersecreção de cloro e

água deixando o intestino repleto de fluidos, resultando em uma diarreia líquida. A E.

coli enteropatogênica (EPEC), acomete habitualmente lactentes, aderindo-se às

células epiteliais intestinais em microcolônias localizadas produzindo lesões

histopatológicas, causando a destruição das microvilosidades intestinais, resultando

em vômitos e diarreia aquosa profusa. A E. coli enteroinvasiva (EIEC) invade as

células epiteliais causando diarreia aquosa, indistinguível da ETEC. A E. coli

enterohemorrágica (EHEC) não invadem as microvilosidades intestinais, somente se

aderem a elas produzindo enterohemolisinas denominada toxina Shiga, causando

diarreia abundante com sangue (colite hemorrágica), devido ao processo de

necrose. A E. coli enteroagregativa (EAEC) se adere às células epiteliais causando

diarreia aquosa mucoide. Por fim, tem-se ainda a E. coli difusamente aderente

(DAEC) que também se adere as células epitéliais resultando em diarreia aquosa



Cepas de E. coli possuem fatores de virulência específicos, que podem ser

organizados em duas categorias principais: adesinas e exotixinas (MURRAY;

ROSENTHAL; PFALLER, 2009).

A resistência de E. coli aos antibióticos β lactâmicos é conferida

especialmente as β lactamases de espectro ampliado (ESBLs), devido as enzimas

33

do tipo TEM ou SHV, denominadas ceftazidimases, codificadas em plasmídeos, que

hidrolisam penicilinas e cefalosporinas, principalmente a ceftazidima, mas são

inibidas pelo ácido clavulânico. Outro tipo de enzima, do tipo CTX-M são

consideradas cefotaximases, pois têm maior ação hidrolítica contra a cefotaxima. No

entanto, novas variantes dessas enzimas já foram identificadas e contribuem para a

crescente resistência de E. coli aos antibióticos (NARCISO et al., 2010).

3.1.5 Dermatofitoses

Dermatofitose é o termo que se refere a um complexo de doenças causadas

por várias espécies de fungos filamentosos relacionados aos gêneros Trichophyton,

Microsporum e Epidermophyton, reconhecidos como dermatófitos que podem causar

doenças em humanos e/ou animais, acometendo pele, pelos ou unhas, causando na

pele micoses cutâneas externas, ou seja, acometendo a camada mais externa – o

extrato córneo – e nas infecções nos pelos e unhas as camadas queratinizadas é

que são invadidas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

No Brasil as espécies de dermatófitos mais comumente isoladas em

dermatofitoses são Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes,

Microsporum canis, Microsporum gypseum, Epidermophyton flocosum e

Trichophyton tonsurans (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

As dermatofitoses recebem o nome de “tinhas” seguido pelo local anatômico

ou estrutura que afetam, assim sendo tem-se tinha capitis do couro cabeludo, tinha

barbae, tinha corporis, tinha cruris da região inguinal, tinha pedis do pé e tinha

unguium da unha (onicomicose) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


M. canis e M. gypseum estão associados à tinha corporis e tinha capitis, T.

rubrum à tinha pedis, tinha corporis, tinha cruris e onicomicose assim como T.

mentagrophytes que também pode estar associado a tinha capitis. E E. flocosum

pode causar infecções do tipo tinha pedis, tinha cruris e onicomicose (TRABULSI;

ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).

O tratamento para infecções causadas por dermatófitos incluem agentes

tópicos, como os derivados azólicos (miconazol, clotrimazol, econazol, tioconazol e

34

itraconazol), terbinafina e haloprogina. Bem como os antifúngicos orais incluindo

griseofulvina, itraconazol, fluconazol e terbinafina (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;

MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).

A falha do tratamento e/ou a recidiva da dermatofitose está geralmente

associada à interrupção da terapia antifúngica, entretanto a partir de um relato de

resistência de T. rubrum, isolado de uma paciente com onicomicose, à terbinafina,

passou-se a realizar estudos sobre os mecanismos de resposta e resistência dos

dermatófitos a diferentes antifúngicos, demonstrando que existe uma grande

diversidade de mecanismos de resistência que um único micro-organismo pode

desenvolver e/ou adquirir (PERES et al., 2010).

3.1.6 Micoses Oportunistas

Os fatores que predispõem as micoses oportunistas se classificam em

intrínsecos como neoplasias, diabetes, hemopatias diversas, AIDS e doenças que

alteram a imunidade celular, e extrínsecos como antibioticoterapia, corticoidoterapia,

antiblásticos, cirurgias de transplantes e ambientes hospitalares contaminados

(TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).

Os agentes mais comuns causadores de micoses oportunistas são Candida

spp., Criptococcus spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp e Mucor spp. Sendo que

estima-se que anualmente a incidência de infecções por Candida é de 72 a 290 por

milhão de individuos, por C. neoformans é de 30 a 66 por milhão e por Aspergillus é

de 12 a 34 por milhão (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

3.1.6.1 Candidíase

O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, tratando-se de

organismos eucariotos que podem ser unicelulares ou multicelulares. São

geralmente caracterizados pela forma leveduriforme, podendo apresentar formas

arredondadas ou ovais medindo aproximadamente de 2,0 a 4,0 µm (GUARRO,

1998) e reproduzem-se por brotamento ou gemulação.

35

Espécies do gênero Candida fazem parte da microbiota de cavidades (retal,

bucal, vaginal, uretral, nasal, aural) e da pele humanas. Estas espécies envolvem

um espectro amplo de doenças superficiais e invasivas (SEGAL; BAUM, 1994).

São considerados patógenos responsáveis por uma variedade de quadros

clínicos, desde desordens mucocutâneas, não comprometedoras ao indivíduo, a

exemplo de mulheres que desenvolvem candidíase vaginal, até infecções sistêmicas

neoplásicas (SEGAL; BAUM, 1994; DIGNANI; SOLOMKIN; ANAISSIE, 2003; WEIG;

GROB; MUHLSCHLEGEL, 1998).

Quando fatores de risco estão presentes nos hospedeiros humanos, incluindo

o uso prolongado e indiscriminado de antimicrobianos de amplo espectro, uso de

esteroides ou outras substâncias imunossupressoras, doenças como diabetes

mellitus e AIDS, e funções fagocitárias alteradas, infecções por Candida podem

comprometer vísceras como resultado de disseminação hematogênica da levedura

pelo organismo, especialmente em pacientes críticos, portadores de doenças

degenerativas e/ou neoplásicas (SEGAL; BAUM, 1994; DIGNANI; SOLOMKIN;

ANAISSIE, 2003; WEIG; GROB; MUHLSCHLEGEL, 1998).

Cerca de 100 espécies de Candida foram descritas, mas somente algumas

destas causam infecção (EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003). As principais

espécies de interesse clínico são: Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida

tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida guilliermondii e Candida

lusitaniae (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003), sendo que C. albicans é a espécie

isolada com mais frequência de materiais clínicos, correspondendo de 90 a 100%

dos isolados mucosos e de 50 a 70% dos isolados de infecções sanguíneas


Algumas espécies, como C. albicans, apresentam a capacidade de

dimorfismo, ou seja, pode ser encontrada sob formas leveduriformes

(blastoconídios) no estado saprofítico, estando associado à colonização

assintomática, ou como formas filamentosas (pseudohifas e hifas verdadeiras),

forma necessária para invadir tecidos mais profundos em processos patogênicos

(MOLERO et al., 1998).

Além disso, neste fungo pode ocorrer a formação de clamidósporos, que são

esporos arredondados que possuem uma espessa parede celular, permitindo a

adaptação em diferentes sítios biológicos (LACAZ; PORTO; MARTINS, 1991;

CHAFFIN et al., 1998).

36

Os determinantes da patogenicidade das espécies de Candida spp dependem

dos fatores de virulência, que aumentam sua capacidade de colonizar mucosas,

superfícies sintéticas e invadir tecidos. Tais fatores podem ser: adesão às células e

tecidos dos hospedeiros, produção de enzimas hidrolíticas (proteases, fosfolipases,

lípases, hialuronidase e condroitina sulfatase), dimorfismo (formação de tubo

germinativo com consequente desenvolvimento da forma filamentosa), alteração

fenotípica da morfologia celular e da colônia (switching fenotípico), variabilidade

genotípica, variabilidade antigênica, imunomodulação dos mecanismos de defesa do

hospedeiro e hidrofobicidade da superfície celular (CALDERONE; FONZI, 2001;

GHANNOUM; ABU-ELTEEN, 1990; EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003).

Verstrepen e Klis (2006) enfatizam, ainda, a notável capacidade de formação

de biofilme a partir da propriedade de adesão de alguns fungos como C. albicans,

característica de grande relevância médica e industrial, já que a presença de um

biofilme maduro dificulta a ação de antifúngicos e pode tornar-se um reservatório de

células com características de resistência a determinados medicamentos.

O número de pacientes predispostos a infecções causadas por micro-

organismos oportunistas, como espécies de Candida, vem crescendo

significativamente, principalmente em pacientes de risco destacando aqueles sob

tratamento para o câncer, transplantados, portadores do HIV, com distúrbios

endócrinos, gravidez, deficiência de ferro, xerostomia e desordens imunológicas

(SAMARANAYAKE; MacFARLANE, 1982; HUBE, 2000).

As candidíases são usualmente tratadas com derivados poliênicos

(anfotericina B), imidazólicos (fluconazol, cetoconazol, itraconazol), entretanto já

existem relatos de espécies de Candida resistentes a fluconazol. Nestes casos

utiliza-se anfotericina B ou uma equinocandina (anidulafingina, caspofingina ou

micafungina) (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,

2009).

O tratamento para as infecções por Candida tem enfrentado o desafio da

resistência do micro-organismo ao medicamento de escolha, identificada como a

maior causa de falha terapêutica no tratamento de doenças causadas por fungos

(BROSSCHE et al., 1998; DIEKEMA et al., 2002; TEICHERT et al., 2002).

Além disso, o efeito do fármaco dependente da espécie infectante, uma vez

que o mesmo medicamento pode ser ativo contra C. albicans, espécie mais

37

susceptível à maioria delas e não ter o mesmo efeito sobre C. tropicallis que exibe

uma resposta fraca à maioria dos antifúngicos (SOBEL; VASQUEZ, 2003).

Espécies de Candida desenvolvem resistência aos antifúngicos de várias

maneiras, destacando:

• Alteração na parede celular e membrana, dificultando a penetração do

antifúngico;

• Bomba de efluxo, removendo o antifúngico da célula;

• Mutação dos alvos dos antifúngicos, diminuindo sua capacidade de ligação;

• Ativação de vias alternativas que aumentam o metabolismo dos antifúngicos;

• Sequestro dos antifúngicos em organelas semelhantes a vacúolos; e

• Alteração cromossômica (EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003).

3.1.6.2 Criptococose

A criptococose é uma micose sistêmica causada por Cryptococcus spp., um

fungo leveduriforme, basidiomiceto encapsulado. Existem quatro sorotipos (A, B, C e

D) e três espécies patogênicas, C. neoformans variação neoformans (sorotipo D), C.

neoformans var. grubii (sorotipo A) e C. gattii (sorotipo B e C) (TRABULSI;


Essa infecção fúngica é normalmente adquirida através da inalação de células

de Cryptococcus spp. que se encontram sob forma de aerossóis dispersos no meio

ambiente, podendo apresentar-se como um processo pneumônico ou, como uma

infecção do sistema nervoso central (SNC) devido a disseminação hematogênica e

linfática a partir da infecção primaria pulmonar (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


C. neoformans é altamente neurotrópico sendo a forma mais comum da

doença a meningite criptococócica. Ambas as meninges e o tecido cerebral

subjacente são envolvidos resultando em febre, cefaleia, meningite, distúrbios

visuais, estado mental anormal e convulsões (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


É importante ressaltar que o quadro clínico está diretamente associado ao

estado imune do paciente, sendo grave em pacientes aidéticos, e em outros

38

comprometidos e tratados com esteroides e/ou imunossupressores (TRABULSI;


Quando não tratada rapidamente, a meningite criptococócica evolui

rapidamente para a morte. Assim sendo, a administração rápida de uma terapia

antifúngica apropriada e o efetivo controle da pressão do SNC garante o sucesso da

terapia (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER,

2009).

O tratamento consiste na administração de anfotericina B e flucitosina,

durante duas semanas (terapia de indução), seguida de fluconazol oral ou

itraconazol por mais oito semanas (terapia de consolidação). Pacientes com

síndrome da imunodeficiência humana (AIDS) geralmente necessitam de terapia de

manutenção por toda a vida, com fluconazol ou itraconazol. Em paciente não HIV

positivo, observa-se recidiva em até 26% dos casos dentro de 3 a 6 meses, nestes

casos o tratamento de consolidação é recomendado por até um ano (TRABULSI;


C. neoformans apresentam suscetibilidade in vitro a diferentes antifúngicos,

sendo a resistência deste micro-organismo aos antifúngicos um fenômeno pouco

frequente. No entanto, a terapia de longa duração com o fluconazol na criptococose

tem sido descrita como um dos fatores associados ao desenvolvimento de cepas

resistentes a este antifúngico. Devido a isso, o itraconazol tem sido apontado como

uma alternativa interessante ao fluconazol, devido à alta suscetibilidade de isolados

de C. neoformans a este antifúngico (SILVA et al., 2008).

3.1.6.3 Aspergilose

Aspergilose engloba várias doenças causadas por cerca de 19 espécies

pertencentes ao gênero Aspergillus, fungo filamentoso, sendo que a maioria das

infecções é causada por A. fumigatus, A. flavus, A. niger e A. terreus (TRABULSI;


O contato com esse micro-organismo pode causar reações alérgicas ou

doença pulmonar invasiva e destrutiva, e em pacientes imunossuprimidos pode

ocorrer a forma disseminada da doença (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


39

Os conídios dos Aspergillus spp. são constantemente inalados por estarem

dispersos no ar, solo e em material de decomposição, além desses sítios em

ambiente hospitalar podem ser encontrados em chuveiros, tanques de água entre

outros (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009).

As manifestações alérgicas, como sinusite alérgica, está associada a

obstrução e descarga nasal, cefáleia e dor facial. Quando os seios paranasais ou

vias aéreas inferiores, são colonizados por este micro-organismo pode resultar na

formação de aspergiloma, ou bola fúngica, que em geral são tratados cirurgicamente

quando há hemorragia pulmonar, sendo essa potencialmente fatal (TRABULSI;


As formas de aspergilose invasiva são conhecidas como aspergilose

disseminada ou pulmonar invasiva e localmente destrutiva, representando uma

infecção devastadora, observada em pacientes neutropênicos e imunossuprimidos.

Os pacientes apresentam febre e infiltrados pulmonares, acompanhados de dor

torácica pleurítica e hemoptise, além disso, a mortalidade normalmente é alta,

superando os 70% (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL;

PFALLER, 2009).

Outra característica desses fungos é a disseminação hematogênica para

sítios extrapulmonares, como cérebro, coração, rins e trato gastrointestinal, é comum

devido a sua natureza angioinvasiva (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


A terapia antifúngica específica para aspergilose normalmente envolve a

administração de anfotericina B (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


3.1.6.4 Mucormicose

As mucormicoses são infecções fúngicas graves, especialmente causadas

por Mucor ramosissimus, Mucor pusillus, Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae,

Rhizomucor sp. e Cunninghamella bertholettiae (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


A infeção pode acometer seios paranasais, cérebro, pulmões, aparelho

digestivo e outros órgãos (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY;


40

A principal característica de uma infecção causada por Rhizopus spp. é a

invasão dos vasos sanguíneos por suas hifas, resultando na mucormicose

rinocerebral, onde o fungo penetra provavelmente pela mucosa do nariz ou do seio

paranasal e se estende para a órbita ocular, meninges e lobos frontais do cérebro. A

disseminação se faz através dos vasos sanguíneos, cartilagem nasal e nervos.

Geralmente acomete diabéticos em acidose, sendo extremamente grave


A terapia inclui a reversão dos fatores predisponentes, retirada cirúrgica da

área infectada e administração de antifúngico, em geral, anfotericina B, de atividade

terapêutica limitada e muitos efeitos colaterais (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005;


3.2 Avaliação da Toxicidade

Para a população de modo geral os produtos naturais estão isentos de

reações adversas, ou seja, podem ser utilizados sem que haja risco algum. Fato

esse, que contribui significativamente para o aumento do uso de plantas medicinais

nos últimos anos. No entanto, esse desconhecimento dos efeitos secundários e

tóxicos de plantas utilizadas para fins terapêuticos pode levar a danos sérios

(NAVARRO MOLL, 2000; MENGUE et al., 2001). Além disso, a utilização

inadequada de um produto mesmo com baixa toxicidade, pode induzir a problemas

graves desde que existam outros fatores de risco como contraindicações ou uso

concomitante de outros medicamentos (SILVEIRA; BANDEIRA; ARRAIS, 2008).

Na década de 80 o confrei (Symphytum officinale L. Boraginaceae) era muito

utilizado no Brasil com a promessa de curar doenças como o câncer, porém estudos

posteriores comprovaram que essa planta é altamente hepatotóxica (BRASIL, 1992;

BARRACA, 1999; STICKEL; SEITZ, 2000). Outro exemplo é a Piper methysticum G.

Forst, popularmente conhecida como kava-kava, que foi responsável por muitos

casos de hepatotoxicidade na Europa (STICKEL et al., 2003; WHITTON et al., 2003;

CLOUATRE, 2004).

Mesmo com o crescente número de estudos científicos comprovando a

toxicidade de plantas medicinais utilizadas indiscriminadamente, ainda observa-se

que muitas dessas plantas continuam sendo utilizadas de forma inadequada e

irracional (OLIVEIRA; GONÇALVES, 2006).

41

Assim sendo, quando há o interesse em isolar ou desenvolver uma

substância com atividade farmacológica é de suma importância que seja realizada a

avaliação dos efeitos tóxicos, ainda em estágios iniciais do desenvolvimento de

novos fármacos (BELLA CRUZ et al., 2009).

Os testes para avaliar a toxicidade podem ser realizados através de métodos

in vitro, utilizando micro-organismos, células animais e/ou vegetais, e métodos in

vivo com modelos animais e humanos, esse último em fases finais dos ensaios

clínicos (MIGUEL; BOSCO, 2005).

Para tanto há agências que regulamentam os protocolos aceitos

internacionalmente para os ensaios biológicos, como a OECD (Organization for

Economic Co-operation and Development), e agências reguladoras como a ANVISA

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária), através da resolução n° 90 de 16 de

março de 2004 (BRASIL, 2004), o FDA e a EPA, que exigem como testes

preliminares de toxicidade in vivo, os ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e

reprodutiva, garantindo um grande avanço nos estudo com plantas medicinais tanto

nos aspectos farmacológicos quanto toxicológicos (BARROS, 2003).

Dentre os métodos para avaliar a toxicidade de produtos naturais dispõem-se

do teste com Artemia salina, que baseia-se na capacidade do extrato, composto ou

fração de matar os microcrustáceos cultivados em laboratório (CARBALLO et al.,

2002). O teste de toxicidade aguda que é realizado em mamíferos em um período de

24 horas, com administração de uma dose única ou doses múltiplas, geralmente por

via oral, de acordo com a RDC 90/2004 (BRASIL, 2004). O ensaio de

mutagenicidade sobre Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C), baseando-se na

mutação reversa para restauração ou compensação de um defeito gênico

responsável por um requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI,

2005). E por fim, o teste de micronúcleo utilizado para o monitoramento de danos

mutagênicos em populações expostas a substâncias mutagênicas e carcinogênicas

(MERSCH; BEAUVAIS, 1997).

3.2.1 Mutagenicidade Sobre Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae é um organismo eucarioto amplamente estudado, semelhante às

células dos mamíferos no que se referem às macromoléculas, organelas e

proteínas. Possui vantagens como genoma pequeno e crescimento rápido em

42

condições adequadas, tornando-a uma ferramenta importante nas pesquisas sobre

mutagênese, reparo do DNA e mecanismos que respondem ao estresse oxidativo

(COSTA; FERREIRA, 2001; GASPARRI, 2005; MOURA, 2006). Essas leveduras

podem crescer tanto em condições anaeróbias quanto aeróbias e, portanto, são

expostas continuamente às espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas como

bioprodutos do metabolismo (COSTA; FERREIRA, 2001).

A S. cerevisiae pertence ao grupo das leveduras anaeróbias facultativas, ou

seja, esse micro-organismo fermenta hexoses, como a glicose e a frutose,

independente da concentração de oxigênio (COSTA; FERREIRA, 2001). A glicose é

a principal fonte de carbono para S. cerevisiae, dessa forma em meio rico (YEPD 2%

glicose), observa-se várias fases de crecimento microbiano, representadas na Figura

3.

A Fase Lag caracteriza-se pela adaptação do micro-organismo ao meio. Na

Fase Exponencial ocorre divisão celular a cada hora e meia, utilizando energia

obtida a partir da fermentação da glicose. Na Fase Diáuxica a disponibilidade de

glicose no meio diminui, ocorrendo a desrepressão catabólica, paralisando

momentaneamente a divisão celular para que as células se preparem para o

metabolismo respiratório. Na Fase Pós Diáuxica a divisão celular assume ritmo lento

– uma divisão a cada três ou quatro horas – utilizando o etanol, obtido durante a

fermentação, como fonte de carbono, e por fim a fase estacionária com ausência de

fontes de carbono, não havendo divisão celular, no entanto as células são capazes

de sobreviver por longos períodos de tempo (FUGE; WERNER, 1997).

43

Figura 3: Fases de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em meio completo.

Fonte: FUGE; WERNER, 1997.

Os ensaios utilizando leveduras na determinação de agentes mutagênicos

ambientais e farmacológicos tem sido uma alternativa tendo em vista ser um ensaio

econômico, reprodutível, simples e rápido (MARTINS, 2010).

Os experimentos mais utilizados de mutações reversas consistem na

restauração ou compensação de um defeito gênico responsável por um

requerimento nutricional (ZIMMERMANN, 1975; GASPARRI, 2005).

A restauração se deve a uma reversão exata do defeito original, enquanto que

a compensação pode ser devido a uma mutação secundária dentro do gene

(mutação supressora interna) ou por uma mutação externa, como no caso dos alelos

sem sentido, (nonsense – mutação que resulta na alteração de um códon que

determina um aminoácido para um códon de terminação da síntese protéica)

(HAWTHORNE; LEOPOLD, 1974; ATKIN et al., 1993; GASPARRI, 2005).

A reversão da auxotrofia (micro-organismo mutante que tem necessidade de

fatores de crescimento) para prototrofia (micro-organismo que não necessitam de

fatores de crescimento) pode ser causada por uma substituição, inserção ou deleção

de pares de bases, ou ainda uma mutação induzida por supressor do gene mutante

original (HENRIQUES; VALSA; GOMES, 1987; GASPARRI, 2005).

Para que seja identificada a mutação reversa é necessária a utilização de uma

linhagem com alterações genéticas adequadas, como no caso da linhagem haploide

44

de S. cerecisiae XV185-14c, isolada por Von Borstel. Essa linhagem permite a

detecção de dois tipos de mutações lócus especifico: recersões do alelo ocre lis1-1

(alterado no códon UAA de término de cadeia) ou do alelo missense his1-7 (códon

alterado codifica um aminoácido diferente), e reversões por deslocamento quando

de leitura do DNA (frameshift) verificadas no lóculs hom3-10. As células revertentes

podem ser detectadas pela semeadura em placas contendo meio seletivo no qual o

fator de crescimento inicialmente requerido não está presente, ou em concentrações

muito baixas, permitindo um background de crescimento (PARRY; PARRY, 1984;

GASPARRI, 2005).

Os resultados dos testes de mutagenicidade representam grande importância

no desenvolvimento de novos fármacos, pois a legislação prevê que para indústrias

farmacêuticas obterem um novo registro de medicamento é obrigatório a

apresentação de requisitos de segurança, incluindo entre outros, ensaios

toxicológicos referentes a mutagenicidade in vitro e in vivo (NUNES, 2008).

3.3 Plantas Medicinais

As plantas medicinais são utilizadas pela população de um modo geral para o

tratamento de enfermidades ou cura de diversas doenças, sendo essa prática

realizada desde os primórdios tendo continuidade até os dias de hoje como fonte

abundante de novas substâncias com potencial atividade biológica (GRAGG;

NEWMAN, 2012).

Neste processo os povos primitivos proporcionaram a identificação de

gêneros e espécies vegetais, o reconhecimento do habitat, a época da colheita, bem

como as partes dos vegetais que se adequavam ao uso medicinal (DI STASI, 1996;

CECHINEL; YUNES, 1998; TAVARES, 2000; MACIEL et al., 2002; CARVALHO et

al., 2002).

Segundo Calixto (2000) e Silva (2004) planta medicinal é toda e qualquer

espécie vegetal que contenha substâncias que exerçam algum tipo de ação

farmacológica com fins terapêuticos, podendo ser administrada sob qualquer forma

por alguma via ao homem, e que ainda possa servir como precursor para síntese

químico-farmacêutica.

As plantas medicinais, bem como os extratos vegetais com finalidade

terapêutica, possuem grande relevância na área farmacêutica, contribuindo para o

45

desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos e/ou como suporte de novas

estruturas químicas para elaboração de abordagens combinatórias (química e

bioquímica) otimizando suas atividades farmacológicas (SIMÕES; SCHENKEL,

2002; GRAGG; NEWMAN, 2012).

Existe um entusiasmo quanto às potencialidades de exploração de recursos

naturais, tendo em vista que no mercado mundial de medicamentos, estimado em

mais de 300 bilhões de dólares anuais, aproximadamente 40% são oriundos direta

ou indiretamente de fontes naturais, destes, 75% de origem vegetal e 25% de

origem animal ou de micro-organismos. Sendo que os países mais desenvolvidos

como Estados Unidos, Japão e países da Europa destacam-se nesse segmento,

enquanto que no Brasil os investimentos estão restritos a um número reduzido de

empresas (RODRIGUES; NOGUEIRA; PARREIRA, 2008; KLEIN et al., 2009). Assim

sendo, o uso terapêutico de recursos naturais, tenta legitimar-se juntamente com os

medicamentos industrializados, rotineiramente presente no cotidiano das pessoas

modernas.

No Brasil foi criada a Política de Práticas Integrativas e Complementares no

Sistema Único de Saúde (SUS), instituída pela Portaria MS n° 971, de 03 de maio de

2006, que contempla diretrizes, ações e responsabilidades do governo federal,

estadual e municipal para oferta de serviços e produtos da homeopatia, plantas

medicinais e fitoterapia, medicina tradicional chinesa/acupuntura, assim como para

observatórios de saúde do termalismo social e da medicina antroposófica,

promovendo a institucionalização destas práticas no SUS (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2006; RODRIGUES; SANTOS; AMARAL, 2006).

A Portaria MS n° 971, de 03 de maio de 2006 tem como objetivo ampliar as

opções terapêuticas aos usuários do SUS, com garantia de acesso a plantas

medicinais, a fitoterápicos, e a serviços relacionados à fitoterapia, com segurança,

eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Somando-se a Política de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema

Único de Saúde, as ações decorrentes da Política Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006,

manifestadas em um Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,

instituída em 2007, visa “garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso

racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da

46

biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional”. Com

vistas a atingir o objetivo desse programa, dentre as proposições, destaca-se a de

“Promover e reconhecer as práticas populares e tradicionais de uso de plantas

medicinais, fitoterápicos e remédios caseiros” (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

No ano de 2010, a ANVISA, através da Resolução nº 10 de 09 de março de

2010, elencou uma série de medidas para assegurar o uso de plantas por parte da

população, considerando a necessidade de contribuir para a construção do marco

regulatório para a produção, distribuição e uso de plantas medicinais,

particularmente sob a forma de drogas vegetais. Estes documentos levam em

consideração, dados etnofarmacológicos e estudos realizados com estas plantas,

oferecendo maior segurança para a população no que se refere ao modo de uso,

bem como, sua eficácia (BRASIL, 2010).

Dentre as plantas relacionadas no Anexo I da Resolução nº 10 de 09 de

março de 2010, destaca-se Allium sativum (alho), Anacardium occidentale (cajueiro),

Arctium lappa (bardana), Caesalpinia ferrea (jucá), Casearia sylvestris (erva de

bugre), Lippia sidoides (alecrim pimenta) como anti-séptico, Mikania glomerata

(guaco) bronquite infecciosa, Punica granatum (romã) infecções da mucosa da boca

e anti-séptico e Stryphnodendrom adstrigens (barbatimão) anti-séptico tópico na pele

e mucosas bucal e genital.

3.3.1 Metabolismo Secundário Vegetal e Influência Sazonal

As plantas possuem suas próprias defesas que as protegem de outras

plantas, insetos, fitófagos e herbívoros predadores de uma maneira geral. Estas

defesas podem ser de natureza morfológica que envolve o desenvolvimento de

cascas mais rígidas, espinhos entre outros e/ou de natureza química

biossintetizando substâncias do metabolismo secundário, fenômeno conhecido

como alelopatia, que é a ciência que estuda processos relacionados, principalmente,

a metabólitos secundários produzidos por algas, plantas, bactérias e fungos que

influenciam os processos biológicos com efeitos positivos e negativos e que estão

na gênese de micromoléculas potencialmente bioativas (PINTO et al., 2002;

SARTORATTO et al., 2004).

Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários, os

compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados

47

pela fitoquímica clássica. As principais classes de constituintes que podem ser

detectadas são: ácidos graxos; terpenoides; esteroides; fenóis; alcaloides;

cumarinas, flavonoides taninos entre outros (MACIEL et al., 2002; CECHINEL;

YUNES, 1998).

As plantas medicinais apresentam uma variação em diferentes níveis, tanto

no que diz respeito a conteúdo total, quanto na proporção de metabólitos

secundários. Isso ocorre devido aos estímulos decorrentes do ambiente, no qual a

planta se encontra, redirecionando a rota metabólica, resultando na biossíntese de

diferentes compostos (MORAIS, 2009).

As variações temporais e especiais, como é demonstrado na Figura 4,

acontencem de forma sazonal e diária, inter e intraplanta, inter e intraespecífica,

devido a modificações resultantes da interação de processos bioquímicos,

fisiológicos, ecológicos e evolutivos. Ou seja, os metabólitos secundários

representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante, onde

sua síntese é comumente afetada por condições ambientais (GOUVEA et al., 2012).

Figura 4: Fatores de influência no conteúdo e acúmulo de metabólitos secundários em planta.

Fonte: GOBBO-NETO; LOPES, 2007.

É importante ressaltar que estímulos decorrentes do ambiente apresentam

correlações entre si, exercendo infuência conjunta no metabolismo secundário.

48

Desta forma, a sazonalidade é apontada como um dos fatores de maior importância,

visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza das substâncias ativas

não é constante durante o ano (GLOBBO-NETO; LOPES, 2007; SIMÕES et al.,

2010; CUNHA, 2011).

As diferentes estações do ano ocorrem devido à inclinação da terra em

relação ao sol, e se caracterizam especialmente pelos padrões climáticos, incluindo

variações de temperatura, radiação solar (raios UV e IV), luminosidade, dias mais

longos ou curtos, e índice pluiviométrico (MORAIS, 2009).

A temperatura seja do ambiente ou solo, bem como a luminosidade

apresentam papel relevante na fotossíntese, pois a interação destes fatores garante

um ambiente ideal para o processo fisiológico, apesar de algumas espécies terem se

adaptado ao seu habitat natural, sendo capazes de resistir a variações de

temperatura (SOUZA et al.,2008).

As alterações de temperatura e luminosidade influenciam na variabilidade da

produção de óleos essenciais, na maioria das vezes, apresentam um aumento em

seu teor quando as plantas produtoras se encontram em ambientes com

temperatura elevada, porém, em dias muito quentes, pode-se observar perda

excessiva dos mesmos. A intensidade luminosa também interfere na concentração e

na composição dos óleos essenciais, devido ao desenvolvimento de estruturas

(tricomas glandulares) que biossintetisam e armazenam o óleo essencial (MORAIS,

2009).

A radiação solar, raios UV e IV, pode elevar a produção substâncias devido

ao fato de que as reações biossintéticas são dependentes de suprimentos de

esqueletos carbônicos, realizados por processos fotossintéticos e de compostos

energéticos que participam da regulação dessas reações (TAIZ; ZEIGER, 2004).

O excesso de água no solo pode alterar processos químicos e biológicos,

limitando a quantidade de oxigênio e acelerando a formação de compostos tóxicos à

raiz. Por outro lado, a percolação intensa da água provoca a remoção de nutrientes

e inibição do crescimento normal da planta. Os excedentes hídricos causam menos

problemas que a seca. A deficiência hídrica, caracterizada por diferentes formas e

intensidades, é a principal causa de perda de produtividade, porém, apresenta

correlação direta na concentração de metabólitos secundários, havendo relatos na

literatura de que o estresse hídrico geralmente induz um aumento na produtividade

de alguns terpenoides (HAAG, 1987; ORTOLANI; CAMARGO, 1987).

49

3.3.2 Substâncias Obtidas de Plantas Medicinais e Atividade Antimicrobiana

A presença de substâncias com potencial antimicrobiano nos vegetais não é

fato recente, no entanto as pesquisas sobre determinadas espécies vegetais com

propriedades antimicobianas têm sido ampliadas, especialmente considerando os

problemas relacionados ao uso de antibióticos (ROSA et al., 2011).

Desta forma, há conhecimento sobre alguns tipos de compostos derivados de

plantas, com importante atividade antimicrobiana. Destacando os compostos

fenólicos cita-se o ácido cafeico, que atua como antiviral e antibacteriano; os fenóis

hidroxilados, como o piragolol e o catecol, tóxicos para alguns micro-organismos; a

7-metiljuglona e plumbagina ativa contra E. coli, Salmonella thyphymurium e S.

aurerus. Dentre os flavonoides cita-se o isoprenil-flavonas, ativo contra

Streptococcus formadores de placas dentárias; luteolina, mirecitina efetivos contra S.

aureus resistentes a meticilina; mirecitina ativa contre B. cepacia; quercetina, rutina

e apigenina com efeito antimicrobiano importante contra E. coli e K. pneumoniae;

catequinas ativa contra Streptococcus mutans; dentre os terpenoides cita-se o

muzigadial, sesquiterpeno ativo contra bactérias Gram-positivas; tricorabdal A,

diterpeno que inibe diretamente Helicobacter pylori; ainda, dentre os alcaloides cita-

se a cassina, ativa contra S. aureus, B. subtilis e E. coli, entre outros (LIMA, 2001).

Em síntese, os resultados de pesquisas realizadas com plantas medicinais

quanto ao potencial bactericida e fungicida que extratos, frações, óleos essenciais e

demais produtos, exercem sobre as espécies microbianas, têm sido promissoras e

comprovadas, geralmente por estudos biológicos in vitro de susceptibilidade ou

sensibilidade (SOUZA et al., 2013).

3.4 Óleos Essenciais

Segundo a definição da ANVISA (BRASIL, 1999), os óleos essenciais “são

produtos de origem vegetal obtido por processo físico e podem se apresentar

isoladamente ou misturados entre si, retificados, desterpenados ou concentrados”.

Devido a sua frequente presença nos vegetais, os óleos essenciais

constituem um objeto de estudo visando atividades biológicas com potencial

terapêutico importante. Dentre algumas atividades farmacológicas já atribuídas aos

óleos essenciais pode-se citar: antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante,

50

anticolinesterásica, anti-helmíntica, antiparasitária, analgésica, sedativa, antitumoral,

e ainda como promotores de permeação de fármacos administrados por via

transdérmica (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

As indústrias farmacêuticas e alimentícias empregam os óleos essenciais

tanto para uso humano como veterinário. A indústria farmacêutica os utiliza como

matéria prima para medicamentos devido às suas propriedades farmacológicas

próprias ou para a semi-síntese de novos fármacos. Na indústria alimentícia, são

utilizados como condimentos, aromatizantes e edulcorantes, e ainda estão presentes

nas indústrias de cosméticos, domissanitários e na aromaterapia (NIERO;

MALHEIROS, 2012; HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

Conforme relatado por Bizzo e colaboradores (2009), existem 300 óleos

essenciais de importância comercial no mundo, movimentando cerca de US$ 15

milhões/ano, destes pode-se destacar os 18 principais como laranja (Citrus

sinensis), menta japonesa (Mentha arvensis), eucalipto – tipo cineol (Eucalyptus

globulus e Eucalyptus spp.), citronela (Cymbopogon winterianus e C. nardus),

hortelã-pimenta (Mentha piperita), limão (Citrus limon), eucalipto – tipo citronela

(Eucalyptus citriodora), cravo-da-índia (Syzygium aromaticum), cedro (Juniperus

virginiana e J. ashei), lima destilada (Citrus aurantifolia), spearmint (Mentha spicata),

cedro (Chamaecyparis funebris), sassafrás (Cinnamomum micranthum), cânfora

(Cinnamomum camphora), coentro (Coriandrum sativum), grapefruit (Citrus paradisi)

e patchouli (Pogostemon cablin).

Os óleos essenciais podem ser encontrados em todas as estruturas vegetais,

sendo mais frequente em folhas, flores e frutos, e constituem uma mistura complexa

de substâncias, com estruturas químicas heterogêneas. São constituídos por

substâncias de baixa massa molecular, principalmente misturas de fenilpropanoides

e terpenoides, especificamente monoterpenos (C10) e sesquiterpenos (C15), embora

diterpenos (C20) também possam estar presentes. Além desses, uma variedade de

hidrocarbonetos alifáticos (lineares, ramificados, saturados ou insaturados), ácidos,

álcoois, aldeídos, ésteres acíclicos ou lactonas e compostos com nitrogênio e

enxofre também foram identificados (OLIVEIRA et al., 2006; YUNES; CECHINEL

FILHO, 2007; SIMÕES et al., 2010).

Os fenilpropanoides se originam a partir da rota biossíntética do ácido

chiquímico, cujo biossíntese está esquematizada na Figura 5, que basicamente,

formam unidades de ácido cinâmico e p-cumárico. Esses por sua vez, por redução

51

enzimática originam os propenilbenzenos ou alilbenzenos, por oxidação com

degradação de cadeias lateriais originam os aldeídos aromáticos e por ciclizações

enzimáticas intramoleculares produzem cumarinas (SIMÕES et al., 2010).

Figura 5: Rota biossintética dos fenilpropanoides.

Fonte: SIMÕES et al., 2010.

Os terpenoides são substâncias originadas a partir da rota biossintética do

ácido mevalônico, esquematizada na Figura 6, por condensação aldólica, e hidrólise

originando a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA, que é reduzida a mevalonato, e então

52

convertido a isopreno, unidades pentacarbonadas. Essas por sua vez, sofrem

condesação, de um número variado de unidades isoprênicas, resultando nos

esqueletos terpenoides (SIMÕES et al., 2010; NIERO; MALHEIROS, 2012).

Figura 6: Estruturas precurssoras dos terpenoides.

Fonte: SIMÕES et al., 2010; NIERO; MALHEIROS, 2012.

Tratando-se de uma mistura complexa de constituintes voláteis, os óleos

essenciais brutos podem ser analisados quanti e qualitativamente por cromatografia

a gás acoplada a espectrometria de massas. Porém quando incluídos em formas

farmacêuticas, alimentos entre outros, sua análise requer processos de extração que

antecedem a análise propriamente dita (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL,

2012).

A utilização de óleos essenciais requer minuciosa caracterização química e

avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a variações

genéticas populacionais, variações da composição química em diferentes órgãos de

uma mesma planta, além da influência climática e edáfica (PAINTER, 1951; ANAYA

et al., 1974; OLIVEIRA, 2006; YUNES; CECHINEL FILHO, 2007).

A volatilidade dos óleos essenciais associada ao aroma torna essas

substâncias perceptíveis conferindo-lhes funções ecológicas especialmente como

inibidores da germinação (ação tóxica), na proteção contra predadores (micro-

organismos, fungos, insetos e herbívoros), na atração de polinizadores, na proteção

53

contra a perda de água, aumento da temperatura, entre outros (BRUNETON, 1991;

YUNES; CECHINEL FILHO, 2007; BAKKALI et al., 2008).

Pesquisas sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais demonstrou

que compostos fenólicos, como carvacrol, eugenol e timol apresentam ação efetiva

tanto bacteriostática como bactericida. Entre os terpenoides alifáticos tem-se o

geraniol e borneol. Os álcoois caracterizam-se pela ação bactericida. Alguns

aldeídos apresentam potente ação antimicrobiana, como neral, geraniol, citronelal e

mentona. E por fim, na classe dos fenilpropanoides pode-se destacar o

cinamaldeído, que demonstrou atividade antifúngica (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES;

APEL, 2012).

Para avaliação da atividade antimicrobiana tem-se utilizado ensaios in vitro

especialmente os métodos de difusão, diluição e bioautografia, sendo que esse

último permite relacionar possíveis efeitos microcidas e/ou microstáticos com

componentes presentes no óleo (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

Assim como a grande maioria dos medicamentos, os óleos essenciais podem

apresentar toxicidade quando utilizados em doses elevadas. Já sendo conhecido

propriedades hepatotóxicas de algumas substâncias, como pulegona, composto

monoterpeno que de modo geral são considerados substâncias seguras, bem como

safrol que apresentou potencial genotóxico e carcinogênico. Logo, existe a

necessidade de avaliar não somente o potencial farmacológico de uma substância

de interesse, mas também seu perfil toxicológico (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES;

APEL, 2012).

3.4.1 Métodos Extrativos de Óleos Essenciais

Os métodos extrativos de óleos essenciais variam conforme a localização do

óleo na planta, bem como a proposta de utilização do mesmo (SIMÕES et al., 2010).

Dentre algumas técnicas, tem-se a enfloração, que consiste na extração de

óleos essenciais, de forma artesanal, não modificando a estrutura química dos

compostos e preservando o aroma, de folhas e flores com baixo teor de óleo e

delicadeza extrema. Neste processo, o material vegetal é depositado a temperatura

ambiente, sobre uma camada de gordura (apolar), durante certo período de tempo.

A seguir, o material vegetal esgotado é substituído por outro até a saturação total da

gordura que é então tratada com álcool. O álcool, por sua vez, é destilado a baixa

54

temperatura e o óleo essencial possui alto valor comercial (CLEVENGER, 1928;

FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003;

HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010) .

O arraste por vapor d’água é o método mais difundido de extração de óleos

voláteis, pois esses possuem pressão de vapor mais elevada que a da água, sendo,

por isso, arrastados pelo vapor d’água. A água é aquecida em um recipiente e o

vapor resultante desse processo é bombeado sob pressão para outro recipiente,

onde se encontra o material vegetal. O calor do vapor faz com que as paredes

celulares se abram. Dessa forma, o óleo que está armazenado entre as células

evapora junto com a água, até o tubo de resfriamento. A fase oleosa não se mistura

com a fase aquosa, podendo ser facilmente separados (CLEVENGER, 1928;

FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; BRAGA;

CREMASCO, 2003; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010).

Para extrações em pequena escala, realiza-se o processo de hidrodestilação,

empregando o aparato Clevenger. Diferentemente do arraste por vapor d’água, na

hidrodestilação o material vegetal é submetido ao contato direto com a água, e a

extração acontece em temperatura inferior a 100°C, protegendo os compostos

termolábeis. O óleo extraído fica retido no reservatório graduado do Clevenger,

também preenchido por água, após resfriamento do conjunto o óleo é então

coletado. Esse método fornece bons resultados, em curtos períodos de tempo,

porém em quantidade pequena (CLEVENGER, 1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO,

1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003;

SIMÕES et al., 2010).

A prensagem ou expressão é o método é empregado para a extração dos

óleos voláteis de frutos cítricos. Os pericarpos desses frutos são prensados e a

camada que contém o óleo volátil é, então, separada. Posteriormente, o óleo é

separado da emulsão formada com água através de decantação, centrifugação ou

destilação fracionada (CLEVENGER, 1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR,

2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003; HOSTETTMANN, 2003; LEITE, 2009;

SIMÕES et al., 2010).

Para a extração de óleos essenciais com solventes orgânicos as plantas são

imersas em solventes orgânicos apolares (hexano ou éter de petróleo) para extração

de compostos lipofílicos, e a separação realiza-se quimicamente, pela destilação em

temperaturas específicas, que causam somente a condensação do óleo e não dos

55

solventes. Neste caso, os óleos obtidos geralmente não são usados em

aromaterapia, pois geralmente contêm vestígios do solvente (CLEVENGER, 1928;

FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG, 2003;

HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010; SILVA et al., 2010).

Na extração por CO2 supercrítico, a parte vegetal de interesse é colocada em

um tanque, onde é injetado dióxido de carbono supercrítico. O CO2 é primeiramente

liquifeito através de compressão de 200 atmosferas e, em seguida, aquecido a uma

temperatura superior a 31°C. Nessa temperatura o CO2 atinge um quarto estado, no

qual sua viscosidade é análoga a de um gás, mas sua capacidade de dissolução é

elevada como a de um líquido. Uma fez efetuada a extração, reduz-se a pressão,

fazendo o CO2, retornar ao estado gasoso, resultando na sua eliminação. Esse

método permite recuperar os aromas naturais de vários tipos e não somente óleo

volátil, sendo utilizando para extração industrial de óleos voláteis (CLEVENGER,

1928; FARIAS, 1998; ARAÚJO, 1999; CHAAR, 2000; CALDERARI, 2002; CHENG,

2003; HOSTETTMANN, 2003; SIMÕES et al., 2010; HENRIQUES, SIMÕES-PIRES,

APEL, 2012).

3.4.2 Métodos de Caracterização de Óleos Essenciais

Para a separação, purificação e o isolamento de substâncias de óleos

essenciais, geralmente, empregam-se diferentes técnicas cromatográficas como,

cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia em coluna (CC),

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia gasosa (CG),

técnicas essas que também se destacam quanto ao conhecimento da composição

química, do princípio ativo e/ou do composto tóxico de uma planta (SOUZA-

MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010).

A CCD é o método mais comum de análise, para uma caracterização prévia

da composição química de uma droga vegetal, pois ser fácil, versátil, rápido e

sensível, sendo que para a caracterização qualitativa da amostra, é necessário o

emprego de substâncias padrões. A CC é uma técnica eficaz para separação e

isolamento de compostos de misturas complexas, sendo seu maior recurso a

possibilidade de variação de polaridade da fase móvel (CALDERARI, 2002).

O método de CG é mais preciso na identificação de compostos voláteis,

permitindo a quantificação de substâncias presentes, bem como a verificação de

56

alterações na constituição química de uma amostra. Esse método consiste na

separação dos componentes voláteis da amostra, baseando-se na distribuição

desses constituintes entre a fase estacionária (sólida ou líquida) e a fase móvel

(gás). Neste método a identificação dos compostos de forma individual é realizada

através da comparação dos tempos de retenção da amostra. Para maior

confiabilidade da identificação dos compostos, tem-se o índice de retenção (IR) que

relacionam o tempo de retenção dos compostos sob análise com o tempo de

retenção de um padrão (série homologa de hidrocarbonetos) (SOUZA-MOREIRA;

SALGADO; PIETRO, 2010).

A CLAE permite uma ampla análise de diferentes compostos com relativa

facilidade de manuseio, necessitando a solubilidade das amostras na fase móvel e

uma possível interação com a fase estacionária. Essa técnica pode detectar

compostos moleculares, iônicos, ionizáveis, orgânicos ou inorgânicos, a níveis de

concentrações de ppm e ppb ou inferiores (CIOLA, 2003; SOUZA-MOREIRA;

SALGADO; PIETRO, 2010).

No que diz respeito à identificação e determinação estrutural realiza-se o

acoplamento das técnicas cromatografias a métodos espectrométricos, como

espectrofotometria de UV-visível (DAD), espectrometria de massas (MS e MS-MS) e

ressonância magnética nuclear (RMN), fornecendo informações adicionais que

auxiliam a propor, com maior segurança, a estrutura molecular de substâncias

naturais (MONACHE, 2001; SOUZA-MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010).

A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) é

muito utilizada na caracterização de misturas complexas, permitindo a separação

dos constituintes pelo processo cromatográfico, seguida da análise pelo

espectrômetro de massas, que indica a massa molecular e o seu padrão de

fragmentação. Esse padrão de fragmentação pode ser comparado eletronicamente

com o banco de dados da biblioteca de especro de massas, permitindo a elucidação

estrutural da amostra por análise comparativa (SIMÕES et al., 2010).

A espectroscopia na região do infravermelho fornece informações dos grupos

funcionais presentes nas moléculas que compõe os óleos essências, porém é uma

técnica pouco seletiva no caso de misturas complexas (CHAAR, 2002).

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 13C e 1H é muito útil

para elucidação estrutural de compostos orgânicos. Geralmente é aplicada para

substâncias puras diluindo-as em solventes deuterado (SIMÕES et al., 2010).

57

O espectro de RMN 1H, fornece os deslocamentos químicos dos hidrogênios

presentes na molécula. A integração indica a quantidade de hdrogênios em um sinal

e as constantes de acoplamento (J) indicam a forma espacial dos hidrogênios

(MONACHE, 2001).

Os espectros de RMN 13C fornecem os deslocamentos químicos de vários

tipos de carbonos presentes na molécula, que estão distribuídos em um campo de 0

a 220 ppm, muito mais amplo que o de hidrogênio (0 a 16 ppm), permitindo uma

melhor distinção dos tipos de carbonos (MONACHE, 2001).

3.5 Família Piperaceae e o Gênero Piper

A família Piperaceae apresenta-se como uma das maiores famílias dentre as

angiospermas, sendo composta por 12 gêneros, distribuídos mundialmente. No

entanto dois gêneros destacam-se com maior importância, o gênero Piper e

Peperomia com aproximadamente 2000 e 1700 espécies distribuídas a nível mundial

(QUIJANO-ABRIL et al., 2006; WANKE et al., 2007; JUNQUEIRA, 2007; VANIN et

al., 2008).

No Brasil encontra-se quatro gêneros pertencentes a família Piperaceae,

destacando os gêneros Peperomia e Piper com maior diversidade de espécies,

sendo 166 e 265 espécies respectivamente (YUNCKER, 1966, 1972, 1973, 1974;

TEBBS, 1990; JOLY, 1998; JARAMILLO; MANOS 2001; ARIAS et al., 2006).

O gênero Piper é nativo, e ocorre de norte a sul do Brasil, podendo ser

encontrado no Norte (Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Tocantins, Acre,

Rondônia), Nordeste (Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,

Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito

Federal, Mato Grosso do Sul), Sudeste (Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo,

Rio de Janeiro), Sul (Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul) (GUIMARÃES et

al., 2012).

Mundialmente o gênero Piper possui aproximadamente 2000 espécies já

identificadas, com distribuição nas regiões tropicais e subtropicais, como África,

Ásia, Pacífico Sul, Andes, América Central, Amazônia e Mata Atlântica. Na Figura 7

é apresentado os números de espécies encontradas por região. Destacando a

Amazônia, Ásia, América Central e Mata Atlântica, como as regiões com maior

número de espécies do gênero Piper, sendo, portanto, uma fonte importante de

58

matéria prima para a pesquisa de susbtâncias bioativas (SENGUPTA; RAY, 1987;

PARMAR et al., 1997; JARAMILLO; MANOS 2001; WANKE et al., 2007).

Figura 7: Distribuição geográfica de Piper em ambos os hemisférios.

Fonte: JARAMILLO; MANOS 2001.

As espécies de Piper ocorrem de forma comum em regiões quentes e úmidas,

ou seja, regiões tropicais, sendo geralmente arbustivas e herbáceas, podendo ainda

apresentar-se como pequenas árvores ou vinhas. Possuem folhas simples e

alternadas, apresentando caules divididos por nodos salientes, e galhos de fácil

quebradura. Outra característica morfológica importante é a presença de

inflorescências ou infrutescências (YUNCKER, 1958; CRONQUIST, 1981; EVANS,

1991; JARAMILLO; MANOS 2001, MEDEIROS; GUIMARÃES 2007).

Diversas espécies de Piper são empregadas na produção de condimentos

devido ao sabor picante/forte e cheiro aromático, como a Piper nigrum (pimentas

branca e preta). Sendo também utilizadas para o tratamento de algumas

enfermidades, na medicina tradicional da China, no sistema Ayurvédico da Índia e

na América Latina, devido às propriedades biológicas e farmacológicas de seus

compostos (PIO-CORREA, 1974; GUIMARÃES et al., 1978; DI STASI et al., 1989;

MA et al., 2004; SANTOS et al., 2012).

Mesmo com forte evidência científicas do potencial terapêutico das espécies

do gênero Piper, apenas 10% dessas foram estudadas sob o ponto de vista

fitoquímico. Neste gênero destaca-se uma composição variada de metabólitos

59

secundários, como alcaloides, lignanas, neolignanas, lactonas, chalconas,

fenilpropanoídes, amidas, flavonoides, óleos essenciais entre outros, bem como um

número expressivo de compostos isolados (SENGUPTA; RAY, 1987; BENEVIDES et

al., 1999; AHMAD; TAWAN, 2002; MA et al., 2004; CORREA et al., 2011; SANTOS

et al., 2012).

No quadro 1 estão apresentadas algumas espécies pertencentes ao gênero

Piper investigadas como fonte de novos produtos naturais com atividades biológicas

promissoras, como atividade antitumoral, antimicrobiana, antimalária, antiparasitária,

inseticidas, problemas do trato respiratório e aparelho digestivo entre outras

(BENEVIDES et al., 1999; GUERRINE et al., 2009).

Destacando, também neste Quadro, pesquisas utilizando óleos essenciais

obtido de espécies de Piper, como a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais

de P. aduncum e P. tuberculatum contra fungos Cladosporium sphaerospermum e

C. caldospurioides (NAVICKIENE et al., 2006); ação bacteriostática e fungistática de

P. angustifolium (TIRILLINI; VELASQUEZ; PELLEGRINO, 1996); atividade

antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans de P. cernuum e

P. regnellii (COSTANTIN et al., 2001); atividade antifúngica frente a Cladosporium

sphaerospermum e C. caldospurioides de P. malacophyllum (LAGO et al., 2005); e

atividade antibacteriana de P. nigrum (DORMAN; DEANS, 2000).

60

Quadro 1: Atividade biológica de diferentes espécies do gênero Piper. Espécie Atividade Biológica Classe/Substância Fonte

Piper aduncum

Antiviral (poliovirus) - LOHEZIC-LE DEVEHAT et al.,

2002

Antiparasitária (formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonenses)

Chalconas TORRES-SANTOS et al., 1999

a;b

Antimicrobiana e molusquicida - LENTZ et al., 1998; ORJALA et al., 1993

Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.

caldospurioides) Óleo essencial NAVICKIENE et al., 2006

Piper angustifolium Lam. Bacteriostática e fungistática Óleo essencial TIRILLINI; VELASQUEZ;

PELLEGRINO, 1996

Piper auritum Antiespasmódica - MILIAN; TORRES; RODRIGUEZ, 2001

Piper betle Linn.

Antibacteriana (Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Estreptococcus pneumoniae e Klebsiella aerogenes)

Antifúngica moderada Antibacteriana (bactérias anaeróbias que causam halitose)

- SHITUT; PANDIT; MEHTA,

1999 RAMJI et al., 2002

Piper cernuum Antimicrobiana (Staphylococcus aureus e Candida albicans) Óleo essencial COSTANTIN et al., 2001

Piper crassinervium Kunth Antifúngica (Cladosporium cladosporioides e Cladosporium

sphaerospermum) Flavonas e hidroquinonas

feniladas DANELUTTE et al., 2003

Piper cubeba Antiviral (hepatite C) Extrato aquoso HUSSEIN et al., 2000

Piper futokadzura Sieb. Defesa contra insetos Piperona SIMOES et al., 2000

Piper gibbilimbum Antibacteriana (Staphylococcus epidermidis e Bacillus cereus) Alquifenóis ORJALA et al., 1998

ABE; TAKIKAWA; MORI, 2001

Piper guineense Antifúngica (fungos filamentosos e leviduruformes) - NGONO NGANE et al., 2003

Piper hispidum Antimalária - JENETT-SIEMS et al., 1999

Piper lanceaefolium Antifúngica (Candida albicans) - LOPEZ; MING; TOWERS, 2002

Piper longum

Defesa contra insetos Amidas e alcaloides SUNG-EUN LEE, 2000

YANG et al., 2002

Antiparasitária (Giardia lamblia e Entamoeba histolytica) - TRIPATHI et al., 1999 GHOSHAL; PRASAD;

LAKSHMI, 1996

61

Piper malacophyllum Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.

caldospurioides) Óleo essencial LAGO et al., 2005

Piper methysticum Forst Antimicrobiana - COSTA, 1994

BRUNETON, 1991

Piper nigrum

Antibacteriana Óleo essencial DORMAN; DEANS, 2000

Patógenos veiculados por alimentos Compostos fenólicos PRADHAN; VARIYAR;

BANDEKAR, 1999

Defesa contra insetos Amidas presentes em frutos PARK et al., 2002

Piper regnellii Antimicrobiana (Staphylococcus aureus e Candida albicans) Óleo essencial COSTANTIN et al., 2001

Antibacteriana e antifúngica (dermatófitos) Extrato das folhas PESSINI et al., 2003 e 2005

KOROISHI, 2008

Piper sarmentosum Antimalária - NAJIB NIK; RAHMAN et al.,

1999

Piper solmsianum Antibacteriana e antifúngica Conocarpano e

eupomatenoide-5 CAMPOS, 2006; CAMPOS et

al., 2005; CAMPOS et al., 2007.

Piper tuberculatum Jacq. Antitumorais e hipotensoras Amidas SIMOES et al., 2000

Antifúngica (Cladosporium sphaerospermum e C.

caldospurioides) Óleo essencial NAVICKIENE et al., 2006

62

3.5.1 Piper amplum

A espécie P. amplum é conhecida popularmente como caabepa, jaborandi,

murta ou pariparoba. Distribui-se geograficamente pelo Brasil nos estados da Bahia,

Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e Santa Catarina (GUIMARÃES;

MONTEIRO, 2006).

Assim como a grande maioria das espécies desse gênero, são plantas

arbustivas, com folhas de tamanho avantajado, com pecíolo de 3-3,5 cm de

comprimento e bainha caniculada e ramos cilíndricos, estriados, nodosos, glabros,

entrenós com cerca de 4-9 cm de comprimento, como representado na Figura 8

(GUIMARÃES; VALENTE, 2001).

Santos et al. (2001) e Angnes (2005) analisaram o óleo essencial das folhas

frescas de P. amplum, obtidos por hidrodestilação com aparato Clevenger, por

CG/EM e índice de retenção (IR), sendo que Santos et al. (2001) identificou 17

substâncias. Destas 22,5% eram monoterpenos e 34,9% sesquiterpenos,

destacando como compostos majoritários α-pineno (16,78%), β-cariofileno (9,82%),

E-nerolidol (8,3%), germacreno D (5,28%) e limoneno (3,5%). Angnes (2005)

caracterizou 19 constituintes, cerca de 90%, sendo 21,4% monoterpenos e 68,8%

sesquiterpenos, apresentando como substâncias majoritárias, β-cariofileno (24,4%),

valenceno (16,4%), α-pineno (12,9%), α-cadinol (8,5%), α-copaeno (4,2%) e

limoneno (3,8%).

Na literatura científica não existem relatos e/ou pesquisas sobre atividades

biológicas dos óleos essenciais desta espécie. No entanto, Muller (2011) testou o

extrato etanólico de P. amplum frente a quatro espécies de Candida, sendo elas C.

albicans, C. krusei, C. parapsilosis e C. cerevisiae, observando a ausência de

atividade antifúngica do extrato para todas as espécies testadas.

63

Figura 8: Folhas de Piper amplum.

Fonte: O autor (2013).

3.5.2 Piper cernuum

A espécie P. cernuum é conhecida popularmente como pau-de-cobra-cipó e

rabo-de-gambá. Caracteriza-se por ser um arbusto com folhas grandes, que estão

representadas na Figura 9, encontrado comumente na Amazônia, Nordeste, Sudeste

e Sul do Brasil. É utilizada na medicina popular na forma de infuso de folhas, para

fins analgésicos, dores no trato digestivo, problemas hepáticos, renais, bem como

para circulação (STIPP, 2000; DI STASI et al., 2002).

Figura 9: Folhas de Piper cernuum.

Fonte: O autor (2013).

64

Na literatura científica consta um único trabalho científico sobre a avaliação

fitoquímica a partir das folhas de P. cernuum, citando o isolamento de derivados de

ácido cinâmico, entre os quais o 3,4-dimetoxi-diidrocinamato de metila, ácido 3,4-

dimetoxi-diidrocinamico, 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-diidrocinamato de metila

(diidrosinapato de metila) e 3,5 dimetoxi-4-hidroxi-cinamato de metila (sinapato de

metila) e a lignana cubenina (DANELUTTE et al., 2005).

Alguns trabalhos foram encontrados relatando a obtenção e análise de óleos

essenciais a partir das folhas de P. cernuum. Torquilho et al. (2000) identificaram 26

constituintes (92,9%) presentes no óleo essencial das folhas frescas, destacando

como majoritários o cis-dihidroagarofurano (32,3%), α-pineno (10,2%), β-pineno

(7,4%), 10-epi-ɣ-eudesmol (7,1%) e β-elemol (6,7%). Já Costantin et al. (2001)

identificaram 36 constituintes (98,91%), sendo 27,5% monoterpenos e 71,4%

sesquiterpenos, destacando como majoritários biciclogermacreno (21,88%), β-

cariofileno (20,69%), α-pineno (7,16%), germacreno D (6,68%) e β-pineno (6,15%).

Costantin et al. (2001) e Zaindan (2005), avaliaram a atividade antimicrobiana

do óleo essencial de P. cernuum pelo método de difusão em ágar, relatando

atividade antibacteriana frente a S. aureus, Costantin et al. (2001) relata ainda

atividade antifúngica frente a Candida albicans.

Mesquita et al. (2005), analisaram óleo essencial das folhas de P. cernuum

por CG/EM e índice de retenção (IR), identificando 32 substâncias (76,6%), sendo

na coleta referente ao ano de 1999, 7,2% eram monoterpenos e 81,9%

sesquiterpenos. Na coleta realizada no ano de 2001, 9,9% eram monoterpenos e

72,6% sesquiterpenos, destacando como compostos majoritários trans-

dihidroagarofurano (22,4%), 10-Epi-γ-eudesmol (16,8%), germacreno D (9,0%),

elemol (7,2%), α-pineno (4,1%) e β-eudesmol (4,1%).

Assis et al. (2013), identificaram 16 compostos (94,4%) presentes no óleo

essencial de P. cernuum, utilizando CG/EM, CG/DIC e índice de retenção. Sendo

que neste óleos só foram encontrados sesquiterpenos. Os constituintes majoritários

foram o epi-cubebol (13,1%), β-elemeno (11,6%), espatulenol (9,6%), valeranone

(9,1%), β-cariofileno (8,3%), cis-β-guaieno (8,2%), óxido de cariofileno (7,7%) e ɣ-

muuroleno (7,6%).

Com relação a atividade antimicrobiana, Aguiar (2003) avaliou o óleo

essencial de P. cernuum através do método de difusão em ágar, observando a

inatividade da amostra frente a S. aureus, E. coli e P. aeruginosa.

65

Cordova et al. (2010), avaliou a atividade antimicrobiana do extrato bruto

hidroalcoólico das partes aéreas de P. cernuum, frente a molicutes (Mycoplasma

arginini, M. hominis e Ureaplasma urealyticum), pelo método de microdiluição em

caldo, observando atividade pela inibição de crescimento bacteriano, com CIM

variando de 5000 a 1250 ppm.

66

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material Vegetal

As folhas de Piper amplum e Piper cernuum foram coletadas no município de

Blumenau/SC (latitude: 26°97’69,66” S, longitude: 49/06’24,31” O e altitude: 200 m),

ao final de cada estação do ano, inverno (15 de setembro de 2012), primavera (15

de dezembro de 2012), verão (15 de março de 2013) e outono (15 de junho de

2013). As exsicatas foram preparadas e enviadas para o Herbário Dr. Roberto

Miguel Klein da Universidade Regional de Blumenau, sendo identificadas e

depositadas no sob o números 41606 e 4154, respectivamente.

4.1.1 Obtenção dos Óleos Essenciais e Frações

As folhas de Piper amplum e Piper cernuum foram coletadas nas quatro

estações do ano, sendo realizadas no mesmo local, dos mesmos arbustos e no

mesmo período do dia com o objetivo de reduzir o número de fatores interferentes e

tendo somente a sazonalidade como variável na produção de seus metabólitos

secundários.

As folhas foram secas em sala de secagem com temperatura ambiente e

umidade controlada, durante 5 a 7 dias, com o objetivo de minimizar a perda de

compostos voláteis. Posteriormente foram trituradas com auxílio de triturador de

plantas, até granulometria padronizada correspondente tamis de malha 9.

A obtenção do óleo essencial deu-se utilizando a técnica de hidrodestilação

com o auxílio do aparato Clevenger (Figura 10), durante um período de quatro

horas, sendo o procedimento repetido por mais quatro horas no dia seguinte. A

quantidade de água utilizada, especificada na Tabela 1, foi dependente da

necessidade da planta, uma vez que a mesma apresenta forte tendência a inchar

em contato com água.

67

Tabela 1: Quantidade de matéria prima vegetal seca e triturada de Piper amplum e Piper cernuum e quantidade de água destilada necessária para obtenção de óleo essencial por hidrodestilação.

Estações do Ano / Plantas

Piper amplum (g)

Água Destilada (mL)

Piper cernuum (g)

Água Destilada (mL)

Inverno 2012 237,79 3000 205,93 3000 Primavera 2012 119,27 2000 179,43 3500

Verão 2012/2013 156,36 2500 176,33 3800 Outono 2013 200,27 3000 195,82 4000

Figura 10: Extração de óleo essencial de Piper amplum e Piper cernuum por hidrodestilação com o auxílio do aparato Clevenger.

Aos óleos obtidos em cada estação, foi adicionado sulfato de sódio anidro, em

quantidade suficiente, para retirada da água restante. Posteriormente os óleos foram

armazenados em congelador, em eppendorf protegidos da luz (SIMÕES et al.,

2010). O rendimento extrativo de óleo essencial foi expresso em massa (g) e

porcentagem (%).

A densidade absoluta (g/mL) dos óleos essenciais obtidos foi realizada a

partir da verificação de volume (mL) e massa (g), em replicata (n=3), e calculou-se a

média e o coeficiente de variação (Cv = desvio médio x 100 / valor médio).

4.1.2 Partição Líquido-Líquido

Ao término do período de obtenção dos óleos essenciais, o hidrolato foi

filtrado e submetido à partição líquido-líquido com solventes imiscíveis entre si e em

ordem crescente de polaridade. Os solventes utilizados para a extração foram o

diclorometano e acetato de etila. Para cada 1000 mL de hidrolato foi utilizado 250

68

mL de cada solvente, repetindo o procedimento por mais duas vezes para cada

solvente, totalizando 750 mL de cada solvente supracitado.

As alíquotas das extrações foram reunidas, e a elas adicionou-se sulfato de

sódio anidro, em quantidade suficiente, para retirada da água restante. As frações

diclorometando e acetato de etila foram filtradas e concentradas em evaporador

rotatório, em temperatura máxima de 50 °C, para obtenção do resíduo seco (Figura

11). O rendimento extrativo das frações foi expresso em massa (g) e porcentagem

(%), a partir dos resultados obtidos.

Figura 11: Partição líquido-líquido dos hidrolatos de Piper amplum e Piper cernuum, com diclorometano e acetato de etila, e posterior eliminação dos solventes em rota evaporador.

4.1.3 Caracterização dos Óleos Essenciais

A análise química dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum foi

realizada por CG-EM e CG-DIC, utilizando metodologia proposta por Costantin et al.

(2001), com adaptações.

69

Os óleos essenciais foram diluídos em diclorometano na concentração de 1%.

As análises foram realizadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de

massas (CG/EM Shimadzu, QP2010 S) com coluna capilar Rtx-1 (100%

metilpolisilocsano, 30 m X 0,25 mm X 0,10 µm). Foi utilizado gás Hélio como

carreador em um fluxo de 0,8 mL/min, com temperatura de 300°C no injetor, modo

de injeção split. O volume injetado foi de 1 µL com razão de divisão de 40:1 e

programa de temperatura de 80 °C a 310 °C. As amostras foram analisadas utilizado

o espectrômetro de massas operando a 70 eV. A identificação dos compostos foi

realizada por comparação dos seus espectros de massas com os espectros da base

de dados NIST (Mass Spectral Library).

Os óleos também foram analisados por cromatografia gasosa (CG Shimadzu,

2010) acoplada detector de ionização de chamas (DIC), nas mesmas condições

descritas acima, exceto, temperatura de 310 °C no injetor, modo de injeção sliptless,

com volume injetado de 1,4 µL com razão de divisão de 1:50.

Os Índices de retenção (IR) foram calculados com base nos tempos de

retenção de uma série de alcanos lineares (C7 a C40 – SUPELCO), analisados nas

mesmas condições descritas, utilizando a equação de Van Den Dool e Kratz (1963),

demonstrada abaixo, uma vez que utilizou-se programa de temperatura programada

(MÜHLEN, 2009; ALVES; VICTOR, 2010).

Onde, IR significa índice de retenção; i a diferença do número de carbonos

entre os hidrocarbonetos que eluem depois e antes; Tr (X) o tempo de retenção da

substância desconhecida; Tr (HA) o tempo de retenção do hidrocarboneto que elui

antes da substância desconhecida; Tr (HD) o tempo de retenção do hidrocarboneto

que elui depois da substância desconhecida; N o número de carbonos do

hidrocarboneto que elui antes da substância desconhecida.

Foram também realizadas análises dos óleos essenciais por ressonância

magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e carbono-13 (RMN de 13C), bem

como análises por infravermelho (IV).

70

Para a análise por RMN os óleos essenciais das duas espécies de Piper

foram diluídos em clorofórmio deuterado na concentração de 0,04 g/mL tendo como

referência o tetrametilsilano e analisados em aparato Bruker Avance DPX 300.

As análises por IV dos óleos essenciais das duas espécies de Piper, foi

realizada através da técnica DRIFTS (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform

Spectroscopy), em celas de Seleneto de Zinco, utilizando o Espectrômetro

Interfotométrico por Transformada de Fourier IRPrestige – 21, SHIMADZU (Tokyo,

Japan).

Realizou-se a comparação dos dados obtidos com os dados disponíveis na

literatura.

4.2 Material Microbiológico

As bactérias foram mantidas em ágar Mueller-Hinton e os fungos

leviduriformes em ágar Sabouraud dextrosado, conservadas sob refrigeração (4 °C)

no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia dos Cursos de Farmácia e

Biomedicina da UNIVALI, campus de Itajaí, SC, sendo repicadas em intervalos de 15

a 30 dias para manter a viabilidade das colônias microbiana.

Os fungos filamentosos foram armazenados em ágar Sabouraud dextrosado,

conservados à temperatura ambiente na micoteca do mesmo Laboratório acima

citado, sendo também repicados em intervalos de 15 a 30 dias para manter a

viabilidade das colônias microbiana e prevenir transformações pleomórficas.

4.2.1 Micro-organismos

Para a avaliação antibacteriana, foram utilizadas cepas padronizadas a partir

do American Type Culture Collection (ATCC), sendo Staphylococcus aureus (ATCC

25923), Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Bacillus subtilis (ATCC 14579) e

Escherichia coli (ATCC 11775).

Para a avaliação antifúngica foram utilizadas cepas padronizadas a partir do

American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, EUA, e Ceremic (C),

Centro de Referencia Micológica, Facultad de Ciencias y bioquímicas

Farmacêuticas, Rosario, Argentina, sendo Microsporum canis (C 112), Microsporum

gypseum (C115), Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9972), Trichophyton rubrum

71

(C137), Epidermophyton flocosum (C114), Aspergillus fumigatus (ATCC 26934),

Rhizopus sp. (C135), Candida albicans (ATCC 10231) e Criptococcus neoformans

(ATCC 32264).

4.2.2 Atividade Antimicrobiana

A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração

microbicida mínima (CMM) dos óleos essenciais e frações, diclorometano e acetato

de etila, das espécies de Piper das diferentes estações do ano através do método de

diluição em ágar, que consistiu em diluições seriadas dos óleos e frações, em meio

de cultura apropriados, para bactéria ou fungo, seguida por incubação e posterior

verificação da menor concentração que inibiu o crescimento microbiano (KALEMBA;

KUNICKA, 2003; OSTROSKY et al., 2008).

Para a determinação das CMMs, a partir de cada uma das concentrações que

não apresentaram crescimento microbiano no ensaio da CIM, foi realizado as

respectivas subculturas em meio de cultura isento de óleo essencial ou fração, e

novamente, seguido de incubação e posterior verificação da menor concentração

que inibiu o crescimento microbiano.

Para localização das substâncias com atividade antimicrobiana em um

cromatograma obtido em CCD, foi realizado o ensaio de bioautografia

(HAMBURGUER; CORDEL, 1987; RAHALISON et al., 1994).

4.2.3 Preparo de Inóculos Bacterianos

Cada espécie bacteriana utilizada no presente trabalho foi transferida do meio

de manutenção para o meio ágar Mueller Hinton e incubada a 35°C por 18-24 horas,

para ativar a respectiva cultura.

Após reativação de cada espécie bacteriana, foi preparado o inóculo

microbiano, conforme demonstrado na Figura 12, selecionando de 4 a 5 colônias

bacterianas, que foram transferidas para um tubo de ensaio com 5 mL de solução de

cloreto de sódio a 0,86% estéril, seguido por homogeneização em agitador de tubos

por 15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520

nm, por comparação com a escala de McFarland nº 0,5, equivalente a

72

aproximadamente 1,5 x 108 células/mL, para o método de diluição em ágar (CLSI,

2009).

4.2.4 Preparo de Inóculos Fúngicos

Cada espécie de fungo leviduriforme utilizado nesta pesquisa foi cultivado em

ágar Sabouraud dextrosado, por pelo menos duas vezes para assegurar a

viabilidade das culturas jovens de 24 e 48 horas a 30 °C. Para o preparo do inóculo

fúngico, também demonstrado na Figura 12, foram selecionadas 5 colônias da

levedura, com aproximadamente 1 mm de diâmetro, que foram suspensas em 5 mL

de solução de cloreto de sódio a 0,85% estéril, seguido por homogeneização em

agitador de tubos por 15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por

espectrofotometria a 520 nm por comparação com a escala de McFarland nº 0,5

levando a concentração equivalente a aproximadamente 1 x 106 a 5 x 106 células/mL

(ESPINEL-INGROFF; PFALLER, 1995).

Figura 12: Preparo de inóculos bacterianos e de fungos leviduriformes.

Os inóculos dos fungos filamentosos foram preparados removendo os

conídeos de cada fungo a partir da cultura jovem previamente cultivada em ágar

73

Sabouraud dextrosado à temperatura ambiente de 7 a 10 dias. Com auxílio de uma

alça, a superfície da cultura foi raspada e o material foi transferido para um tubo com

10 mL com água estéril e homogeneizado em agitador de tubos.

A suspensão conidial foi filtrada, com auxílio de uma gaze, para remoção das

hifas e novamente homogeneizada e ajustada para 1 x 106 conídeos/mL pela adição

de água, utilizando uma câmara de Neubauer para determinação do número de

conídeos (LLOP et al., 2000).

4.2.5 Bioautografia

As amostras foram dissolvidas em solvente apropriado e aplicadas em placas

de CCD (sílica gel 60). Em seguida, as placas foram previamente submetidas à

eluição em diferentes sistemas de solventes para a escolha daquele que pudesse

fornecer a melhor resolução, ou seja, melhor separação entre as substâncias.

Para a realização da bioautografia dos óleos essenciais das diferentes

estações do ano das duas espécies de Piper, os mesmos foram aplicados em placa

de CCD sem diluições. Após absorção completa da alíquota de 1 µL de óleo

essencial puro pela sílica, foi realizada a corrida cromatográfica, em cuba saturada,

utilizando como fase móvel hexano: acetato de etila (95:5), que foi o sistema de

solventes que apresentou os melhores resultados de resolução.

Para a realização da bioautografia das frações diclorometano e acetato de

etila oriundas a partir dos hidrolatos gerados da extração dos óleos essenciais das

diferentes estações do ano das duas espécies de Piper, foi empregado solução com

concentração de 4 mg/mL das frações em acetona e, aplicou-se alíquotas de 10 µL

das amostras por ponto. Após absorção completa da alíquota das amostras pela

sílica e evaporação do solvente, foi realizada a corrida cromatográfica, em cuba

saturada, utilizando como fase móvel hexano: acetato de etial (60:40), que para

essas amostras foi o sistema de solventes com melhores resoluções.

Após a eluição e eliminação total dos resíduos dos solventes utilizados na

eluição das placas, foi distribuída sobre cada placa de CCD uma fina camada de

meio de cultura sólido fundido e arrefecido contendo inóculo microbiano (106

células/mL), as placas foram incubadas a 35 °C por 18 a 24 horas.

Para facilitar a leitura dos resultados, após o período de incubação foi

borrifado nas placas uma solução aquosa de cloreto de 2,3,5 trifenil tetrazólico (TTC)

74

(20 mg/mL) e estas foram novamente incubadas a 35 °C por mais 4 horas, como

demonstrado na Figura 13.

O critério empregado para a interpretação dos resultados de bioautografia foi

o aparecimento de zonas claras em torno das substâncias isoladas na CCD,

sugerindo a respectiva atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994).

Figura 13: Ensaio de bioautografia para o direcionamento das pesquisas quanto à localização dos compostos bioativos para atividade antimicrobiana.

4.2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

O método consiste em preparar diluições sucessivas das amostras a serem

testadas, em meios de cultura sólidos ou líquidos, semeados com bactéria ou fungo

em estudo. Depois do período de incubação, verifica-se a menor concentração da

amostra que inibiu o crescimento do micro-organismo utilizado no ensaio.

Os valores da CIM foram determinados através da diluição dos componentes

obtidos das espécies de Piper, em ágar empregando a metodologia descrita por

CLSI (2009) com modificações.

75

Os óleos essenciais foram utilizados puros, enquanto que as frações

diclorometano e acetato de etila foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) na

concentração inicial de 40 g/L. As amostras foram adicionadas em séries de 10

frascos com capacidade para 5 mL para realização da diluição seriada.

Para os óleos utilizou-se solução aquosa de tween 80 a 1% para facilitar a

diluição obtendo diferentes concentrações, de 25000 a 48 ppm. Já para as frações

obtidas dos hidrolatos foi utilizado água destilada como agente de diluição obtendo

concentrações de 1000 a 2 ppm. Em seguida, a cada frasco foi adicionado 1 mL de

meio de cultura ágar Mueller-Hinton para bactérias e 1 mL de ágar Sabouraud

dextrosado para os fungos leviduriformes e fungos filamentosos, seguido por

imediata homogeneização da mistura.

Após a solidificação dos meios de cultura, os micro-organismos, previamente

ativados, foram inoculados nas séries correspondentes, com auxílio de alça

calibrada de 1µL em cada frasco (meio de cultivo), correspondendo a uma

quantidade de 1,5 x 105 células bacterianas, 1 x 103 a 5 x 103 células fúngicas

leviduriformes. Para os fungos filamentosos foi empregado alça calibrada de 10 µL

correspondendo a 1 x 104 conídeos. Os frascos foram incubados a 35 °C por 18 a 24

horas para as bactérias, a 30°C por 24 a 48 horas para fungos leviduriformes, e a

temperatura ambiente (25 °C) por 5 a 15 dias para os fungos filamentosos, conforme

ilustrado na Figura 14a.

Decorrido o período de incubação, realizou-se as leituras da CIM através da

verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi

considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.

Durante os testes foram utilizados controles de meio de cultura, de micro-

organismo e solventes utilizados na solubilização das amostras, a fim de verificar

seu efeito sobre o micro-organismo. A concentração final de DMSO não excedeu

2,5%. A leitura dos resultados foi considerada válida somente quando houve

crescimento microbiano nos controles. Os ensaios foram realizados em triplicata.

76

4.2.7 Determinação da Concentração Microbicida Mínima: Bactericida Mínima

(CBM) e Fungicida Mínima (CFM)

Para determinar a concentração microbicida (bactericida ou fungicida) mínima

foram selecionadas as culturas que apresentaram inibição do desenvolvimento

bacteriano ou fúngico no ensaio da CIM, conforme ilustração da Figura 14b, sendo

realizadas suas respectivas subculturas em meio de cultura próprio para cada tipo

de micro-organismo (bactéria ou fungo) isento do componente supostamente

inibitório (óleo essencial ou fração do hidrolato) e novamente seguido de incubação

nas mesmas condições anteriormente relatadas para a determinação da CIM, e

posterior verificação da menor concentração que inibiu o crescimento do micro-

organismo em questão.

Para a interpretação dos resultados foi considerado que a inibição no ensaio

de CIM e crescimento de micro-organismo na subcultura (CBM ou CFM) significa

ação bacteriostática ou fungistática e a ausência do crescimento na subcultura

significa ação bactericida ou fungicida (BARON; FINEGOLD, 1990).

77

Figura 14: Representação do procedimento de determinação de atividade antimicrobiana pelo método de diluição em ágar: (a) concentração inibitória mínima; (b) concentração microbicida mínima.

78

4.3 Avaliação de Mutagenicidade

Para essa análise foi utilizada a linhagem haploide Saccharomyces cerevisiae

(XV-185-14C), como descrito por Medina et al. (2008), com algumas modificações.

4.3.1 Ativação e Preparação do Ínóculo da Levedura Saccharomyces cerevisiae

Os procedimentos realizado para ativação e preparação do inóculo da

levedura S. cerevisiae são ilustrados nas Figuras 15 e 16.

A ativação da levedura se deu a partir de dois repiques consecutivos em meio

YEPD solidificado (2% de dextrose, 2% de bactopeptona, 1% de extrato de levedura,

2% ágar) o qual foi incubado a 30°C durante 24 a 48 horas protegido da luz

(AUSUBEL et al., 1989).

Após o segundo repique (ativação) realizado conforme descrição acima, em

frasco de Erlenmeyer, protegido da luz, contendo 20mL de YEL (2% de dextrose, 2%

de bactopeptona, 1% de extrato de levedura) foi inoculado uma colônia

característica isolada da linhagem de Saccharomyces cerevisiae e incubado sob

agitação orbital (DIST), a 180 rpm e 30°C, durante 24 horas, para atingir a fase

estacionária.

Decorrido o período de incubação, coletou-se uma alíquota (100 µL) que foi

diluída 1:10 em solução salina fosfato tamponada (PBS - Na2HPO4 10 mM, KH2PO4

1,76 mM, KCl 2,7 mM e NaCl 137mM; pH 7,4), após homogeneização a solução

resultante foi novamente diluída 1:10 nas mesmas condições. Desta última diluição

foi coletada uma alíquota para contagem de células em câmara de Neubauer com

auxilio de microscópio óptico. Para a continuação do experimento foi utilizado como

critério contagem de 170 a 200 ou mais células, com 70% em processo de

germinação, garantindo que desta forma as culturas possuíam concentração de 1 a

2 x 108 células/mL.

79

Figura 15: Representação da ativação da levedura Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) para ensaio de mutagenicidade.

Posteriormente à contagem de células, a cultura contida no Erlenmeyer foi

transferida para tubo Falcon e centrifugada a 5000 rpm por 5 minutos, sendo o

sobrenadante desprezado. A partir deste ponto realizou-se o processo de lavagem

do precipitado formado, que consistiu em adicionar PBS em quantidade suficiente

para suspender e homogeneizar o precipitado formado no tubo Falcon, submetendo-

o novamente ao processo de centrifugação nas mesmas condições. O processo de

lavagem foi repetido por mais uma vez para eliminar os aminoácidos histidina,

metionina e lisina presentes no caldo YEL.

Ao final do processo de lavagem, ao precipitado foi adicionada solução PBS

em quantidade estabelecida pela fórmula abaixo, para que obtivesse um inóculo

com concentração estimada de 1 x 108 células/mL.

80

TI = CCL x 106 x VTCL (mL)

109

Onde, TI significa o tamanho do inóculo em células por mililitro; CCL é o

número de células da cultura liquida em YEL; VTCL é o volume total da cultura

liquida em YEL.

Figura 16: Representação da preparação do inóculo de Saccharomyces cerevisiae para o ensaio mutagênico.

4.3.2 Análise Mutagênica

Para a realização da análise mutagênica, representada na Figura 17, foi

empregado o meio mínimo completo (SC) suplementado com todos os aminoácidos,

e os meios SC sem histidina (SC-his), SC sem lisina (SC-lis) e SC sem metionina

(SC-met), dos quais os respectivos aminoácidos foram omitidos, conforme descrito

por Ausubel e colaboradores (1989).

Inicialmente foi preparado uma série de diluições das amostras, obtendo para

os óleos essenciais as concentrações de 25000, 12500 e 6250 ppm em solução

aquosa de tween 80 1%, e para as frações diclorometano e acetato de etila as

concentrações de 1000, 500 e 250 ppm em solução PBS.

81

Como controle negativo foi utilizado a solução de PBS, e como controle

positivo foi utilizado a substância óxido de nitroquinoleína (4-NQO 5 µM) (Sigma).

Para cada amostra, foi preparada uma série de eppendorf (1,5 mL) que

incluía os controles e as diluições da amostra. A cada eppendorf foi adicionado 850

µL de solução PBS e 100 µL do inóculo recém-preparado, conforme item anterior,

atingindo um volume final equivalente a 1 mL. As células do inóculo foram tratadas

por 1 hora a 30 °C, sob agitação de 800 rpm.

Decorrido o período de tratamento determinou-se a sobrevivência do micro-

organismo através de semeadura em meio mínimo completo (SC). Para tanto, foram

realizadas três diluições decimais de cada amostra tratada, semeando uma alíquota

de 100 µL da última diluição com auxílio de alça de Drigalski, em placa contendo

meio mínimo completo (SC), correspondendo a concentração de 1 x 103 células/mL.

Para a detecção de mutação induzida (revertentes das marcas auxotróficas

his1-7, lis 1-1, hom3-10) procedeu a semeadura de 100 µL das amostras recém-

tratadas, sem diluição (concentração aproximada de 1 x 108 células/mL), com auxilio

da alça de Drigalski, nos meios mínimos seletivos (SC-his, SC-lis e SC-met).

Todas as placas foram incubadas a 30 °C, na ausência de luz, durante 5 dias

e posteriormente ao período de incubação foi realizado a contagem de unidades

formadoras de colônias (UFC).

82

Figura 17: Representação do procedimento para realização da análise mutagênica.

83

4.3.3 Análise Estatística

Os testes de citotoxicidade e mutagenicidade sobre a levedura S. cerevisiae

foram realizados em duplicata, e os resultados analisados estatisticamente utilizando

o Teste ANOVA-Tukey HSD (honestly significant difference), comparando as

estações do ano, bem como os tratamentos dos óleos essenciais e frações com o

controle negativo (PBS). Foi considerado estatisticamente significativo *p<0,05,

**p<0,001 e ***p<0,0001.

84

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Obtenção dos Óleos Essenciais

As duas espécies de Piper foram avaliadas em relação a porcentagem de

óleo extraído. Na Tabela 2 estão apresentados os rendimentos para as duas

espécies nas diferentes coletas realizadas ao final de cada estação. O maior

rendimento de óleo essencial foi nas coletas realizadas no final do outono, e o

menor rendimento nas coletas realizadas no final do inverno. Observou-se também,

rendimentos similares de óleos essenciais para P. amplum nas coletas realizadas no

final da primavera e do verão, e para P. cernuum foi verificado que inverno e

primavera apresentaram rendimentos semelhantes, assim como verão e outono.

Tabela 2: Rendimento dos óleos essenciais obtidos a partir das folhas de Piper amplum e Piper cernuum coletadas ao final de cada estação.

Estações do Ano / Plantas Rendimento

Piper amplum Massa óleo (g) (%)

Piper cernuum Massa óleo (g) (%)

Inverno 2012 1,644 (0,691) 3,067 (1,489) Primavera 2012 1,188 (0,996) 2,984 (1,663)

Verão 2012/2013 1,410 (0,902) 3,656 (2,073) Outono 2013 2,352 (1,175) 4,228 (2,159)

A sazonalidade influenciou no rendimento de óleo essencial para as duas

espécies, sendo que na estação de outono obtiveram-se os maiores rendimentos, e

os menores rendimentos foram obtidos no inverno. Indicando que condições

ambientais, como índice pluviométrico, intensidade das radiações solares e

especialmente baixas temperaturas, contribuem tanto para o rendimento quanto

para a síntese de metabólitos secundários (CERQUEIRA et al., 2009).

A redução dos rendimentos de óleos essenciais, principalmente no inverno,

pode ser explicada pelo acionamento do mecanismo natural que degrada

metabólitos secundários e direciona seus compostos químicos para a manutenção

do metabolismo primário (TAIZ; ZEIGER, 2004).

Óleos essenciais das folhas frescas de P. amplum coletadas em maio,

agosto, novembro de 2003 e janeiro, maio e novembro de 2004, obtidos por Angnes

(2005), por hidrodestilação com Clevenger, apresentaram rendimento variando de

0,06 a 0,12%. O mês de novembro, referente à primavera, apresentou o maior

85

rendimento, porém não superior aos rendimentos obtidos no presente estudo

(1,175%) onde a diferença foi a utilização de folhas secas. Isto sugere que além da

sazonalidade e localização geográfica, o processo de secagem do material vegetal

pode influenciar no rendimento do óleo essencial.

Com relação à P. cernuum, Torquilho et al. (2000) utilizaram folhas frescas

coletadas em outubro de 1995 (primavera), com rendimento de óleo essencial de

1,9%. Resultado diferente ao observado na mesma estação no presente estudo

(1,663%).

Mesquita et al. (2005), realizaram extração de óleo essencial de P. cernuum,

em anos distintos, a partir das folhas secas a temperatura ambiente, sem descrever

época ou mês de coleta. Das coletas realizadas no ano de 1999, obtiveram

rendimento de 1,7%, já as coletas referentes ao ano de 2001, o rendimento de óleo

reduziu para 0,6%. O rendimento de óleo da coleta de 1999 foi similar ao do

presente trabalho na estação de primavera (1,663%), porém no ano de 2001 o

rendimento foi inferior aos encontrados no presente trabalho para qualquer uma das

estações do ano (1,489 a 2,159%).

Em estudo realizado por Aguiar (2003), o óleo essencial de P. cernuum foi

obtido a partir de amostras coletadas no inverno e primavera de 1999, verão e

primavera de 2000 e duas coletas no verão de 2001. Para a extração do óleo

utilizou-se folhas frescas em todas as amostras, com exceção de uma amostra

coletada no inverno de 1999, que foi utilizado folhas secas. Os rendimentos dos

óleos essenciais obtidos a partir das folhas frescas variaram de 0,32 a 0,52%,

enquanto que o rendimento do óleo obtido a partir das folhas secas coletadas no

inverno apresentou um resultado de 1,67%, superior para a mesma estação do

presente estudo (1,489%).

Entre os procedimentos de controle de qualidade pós-colheita de plantas

medicinais, a secagem é um processo crucial à preparação adequada das drogas

vegetais, que objetiva levar as plantas a baixos teores de umidade. O teor de

umidade residual acima de 10% favorece o desenvolvimento de fungos e bactérias,

bem como possibilita a atividade hidrolítica de diversas enzimas presentes nas

células vegetais, levando à degradação dos princípios ativos (SIMÕES et al., 2010).

Desse modo, o processo de secagem permite a conservação das plantas,

mantendo sua qualidade física e química por mais tempo. No caso de plantas

produtoras de óleo essencial, a secagem deve ser criteriosa em razão da

86

volatilidade dos óleos essenciais. Por isso, a definição de metodologias de secagem

mais apropriadas para cada espécie é necessária, visando a assegurar os teores de

substâncias ativas (VON HERTWIG, 1991).

A localização dos óleos essenciais nas plantas varia de acordo com a família

botânica a qual pertence, podendo ocorrer em estruturas secretoras especializadas,

tais como pêlos ou tricomas glandulares (Lamiaceae), corpos oleíferos (Apiaceae),

bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae) ou células

parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae e Poaceae), como é o caso

de P. amplum e P. cernuum (SIMÕES et al., 2010; LEWINSOHN et al.,1998), que

podem contribuir para a minimização da perda de substâncias voláteis durante o

processo de secagem.

Poucas são as informações encontradas na literatura científica relatando

estudo com P. amplum e P. cernuum, relacionando a época de colheita em função

da produção de princípios ativos, o que seria de grande importância uma vez que a

composição dos metabólitos secundários nas plantas ocorre durante o crescimento

em decorrência a fatores genéticos, ambientais e técnicas de cultivo, sendo a época

da coleta um dos fatores de maior importância, uma vez que a quantidade de

constituintes ativos não é constante durante o ano (BOTREL et al., 2010).

Além disso, as variações de rendimentos dos óleos essenciais observadas no

presente estudo são indicativos de que uma rede complexa de fatores e/ou

condições ambientais, tais como temperatura, umidade, duração e intensidade das

irradiações solares, índice pluviométrico, interação com polinizadores e predadores

contribuem tanto para o rendimento quanto para a síntese de metabólitos

secundários (CERQUEIRA et al., 2009).

5.2 Densidade dos Óleos Essenciais

Para cada óleo essencial de P. amplum e P. cernuum extraídos nas quatro

estações do ano, foi calculado a densidade absoluta (g/mL), que estão apresentados

na Tabela 3.

A média da densidade absoluta de P. amplum variou de 0,9397 a 0,9507

g/mL, e a densidade de P. cernuum variou de 0,9833 a 0,9957 g/mL. O coeficiente

de variação calculado demonstra um conjunto de dados homogêneos para este

estudo.

87

Tabela 3: Densidade absoluta dos óleos essenciais obtidos de Piper amplum e Piper cernuum.

Estações do Ano / Plantas

Piper amplum Piper cernuum

Densidade Absoluta g/mL (Valor Médio ± Desvio Médio)

Coeficiente de Variação (%)

Densidade Absoluta g/mL (Valor Médio ± Desvio Médio)

Coeficiente de Variação (%)

Inverno 2012 0,9397 ± 0,0009 0,096 0,9893 ± 0,0024 0,242 Primavera 2012 0,9507 ± 0,0009 0,095 0,9947 ± 0,0022 0,221

Verão 2012/2013 0,9400 ± 0,0007 0,074 0,9880 ± 0,0040 0,405 Outono 2013 0,9410 ± 0,0013 0,138 0,9833 ± 0,0016 0,163

Os valores de densidade obtidos foram maiores que os observados no estudo

realizado por Aguiar (2003), em que o óleo essencial de P. cernuum, obtido das

folhas frescas coletadas no verão, apresentou densidade média de 0,9539 g/mL.

A variação de densidade absoluta observada entre as amostras das duas

espécies de Piper, do presente estudo, bem como no estudo realizado por Aguiar

(2003), podem ter origem na variabilidade da sua composição, pelas condições

ambientais (SIMÕES et al., 2010). Sendo importante ressaltar que somente o estudo

realizado por Aguiar (2003) apresenta densidade absoluta de óleos essenciais de

acordo com a época de colheita, porém não trata-se de um estudo sobre influência

da sazonalidade em aspectos dos óleos essenciais.

A densidade de óleos essenciais, dentre outras análises físico-químicas,

como rotação ótica e índice de refração, são métodos simples e de baixo custo, com

extrema importância para detectar adulterações, que são muito comuns na

comercialização de óleos essenciais, como a adição de óleos inertes para aumento

de rendimento (SANTOS et al., 2009).

5.3 Obtenção das Frações Diclorometano e Acetato de Etila

A partir do hidrolato resultante das hidrodestilações realizadas para obtenção

dos óleos essenciais das duas espécies de Piper, procedeu-se a partição líquido-

líquido, com solventes em ordem crescente de polaridade, diclorometano e acetato

de etila. Os rendimentos resultantes após eliminação do solvente em evaporador

rotatório estão apresentados na Tabela 4.

O rendimento de resíduo seco em todas as amostras não ultrapassou a faixa

de 0,3%, sendo os maiores rendimentos para as frações diclorometano e acetato de

etila para P. amplum, as estações de primavera e outono, respectivamente, e para

88

P. cernuum, as estações de verão para a fração diclorometano, e primavera para a

fração acetato de etila. Os menores rendimentos de resíduo seco para as duas

frações para ambas as espécies de Piper se deu no inverno.

Os rendimentos das frações de acetato de etila, exceto para as estações

verão e outono para P. cernuum, foram superiores aos obtidos no fracionamento

com diclorometano. Este resultado era esperado uma vez que a extração foi

realizada com água e aquecimento e isto favorece a extração de substâncias mais

polares.

Tabela 4: Rendimento das frações dicloromentano e acetato de etila obtidos a partir dos hidrolatos oriundos da extração dos óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum.

Estações do Ano / Plantas Frações Rendimento (%)

Piper amplum Resíduo Seco

Piper cernuum Resíduo Seco

Inverno 2012 Diclorometano 0,034 0,052

Acetato de Etila 0,109 0,113

Primavera 2012 Diclorometano 0,114 0,207


Verão 2012/2013 Diclorometano 0,055 0,263


Outono 2013 Diclorometano 0,057 0,213


5.4 Caracterização dos Óleos Essenciais

A análise química dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum nas

coletas feitas nas quatro estações foi realizada por CG-EM e CG-DIC. A

identificação dos compostos foi realizada por comparação dos seus espectros de

massas com os espectros da base de dados NIST (Mass Spectral Library) e pelo

valor dos índices de retenção (IR) calculados com base nos tempos de retenção de

uma série de alcanos lineares (C7 a C40 – SUPELCO). A quantificação se deu pela

área relativa dos picos cromatográficos.

Para as duas espécies de Piper, a análise por CG-DIC, foi menos sensível na

identificação de susbtâncias em pequenas concentrações nos óleos essencais,

quando comparada a análise por CG-EM.

De acordo com Henriques, Simões-Pires e Apel (2012) os óleos essenciais

brutos, por tratar-se de uma mistura de substâncias voláteis, podem ser analisados

diretamente por cromatografia a gás sem tratamento prévio, além de uma simples

89

diluição, permitindo análise semi-quantitativa, e qualitativa quando acoplado a

espectrometria de massas.

5.4.1 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de

Retenção – Piper amplum

Os óleos de Piper amplum obtidos nas coletas realizadas ao final das

diferentes estações do ano apresentaram perfis cromatográficos semelhantes. Na

Figura 18 podem ser visualizados os cromatogramas, onde se observa mudanças na

intensidade de alguns picos cromatográficos. Isto indica pequenas variações de

concentração dos constituintes dos óleos essenciais nas distintas estações do ano.

Figura 18: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.

Quarenta e três substâncias foram determinadas e identificadas por CG/EM e

índice de retenção, representando 92,58% no inverno, 91,54% na primavera, 92,71

% no verão e 93,93% no outono. Na Tabela 5 estão apresentadas as substâncias

encontradas no óleo e as suas porcentagens nas coletas realizadas.

90

Tabela 5: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano.

Classe Terpênica / Constituinte Químico IRCalc. Estrutura

Química

Piper amplum

Inverno Primavera Verão Outono

Pico T.R. (min) % Pico T.R.

(min) % Pico T.R. (min) % Pico T.R.

(min) %

Hidrocarbonetos monoterpenos

α-pineno 934

1 4.052 10,29 1 4.062 11,01 2 4.058 14,86 1 4.059 12,02

Canfeno 948

2 4.249 0,13 2 4.256 0,15 3 4.253 0,17 2 4.256 0,11

β-pineno 975

3 4.650 0,23 3 4.657 0,26 4 4.655 0,27 3 4.657 0,30

β-mirceno 984

4 4.765 0,28 4 4.771 0,35 5 4.770 0,34 4 4.773 0,32

α-felandreno 1002

5 5.052 0,98 5 5.059 1,26 6 5.058 1,14 5 5.060 1,18

δ-3-careno 1015

6 5.198 0,04 6 5.204 0,04 7 5.203 0,06 6 5.206 0,08

p-cimene -

7 5.309 0,98 7 5.317 0,95 8 5.316 0,86 8 5.318 0,52

Limoneno 1023

8 5.491 5,73 8 5.500 5,10 9 5.498 6,45 9 5.499 5,11

β-ocimeno -

9 5.759 0,11 9 5.768 0,05 11 5.767 0,12 10 5.769 0,12

91

ɣ-terpineno -

10 6.016 0,04 10 6.022 0,04 12 6.021 0,05 11 6.023 0,06

(+)-4-careno -

x x x 11 6.636 0,05 13 6.638 0,05 x x x

(4E,6Z)-2,6-Dimetil-2,4,6-octatrieno -

11 7.459 0,15 13 7.467 0,06 14 7.468 0,14 x x x

Monoterpenos oxigenados

4-Carvomenthenol -

12 8.475 0,07 15 8.480 0,09 15 8.483 0,06 x x x

α-terpineol 1180

13 8.715 0,06 16 8.721 0,08 16 8.725 0,06 x x x

Mirtenol -

14 8.865 0,17 17 8.872 0,28 17 8.873 0,05 x x x

Piperitone -

16 10.021 0,10 19 10.024 0,11 18 10.026 0,13 x x x

Acetato Mirtenol -

18 11.990 0,32 21 11.995 0,69 19 11.995 0,23 12 11.998 0,36

Hidrocarbonetos sesquiterpenos

Elixeno -

20 12.700 1,99 23 12.709 2,62 21 12.709 1,46 14 12.709 2,46

92

α-cubebeno 1344

21 13.057 0,25 24 13.063 0,28 22 13.062 0,45 15 13.065 0,18

(+)-Cicloisosativeno -

22 13.523 0,31 25 13.528 0,22 23 13.530 0,33 16 13.532 0,23

Ylangeno -

23 13.611 0,09 26 13.618 0,07 24 13.617 0,13 17 13.625 0,06

α-copaeno 1370

24 13.734 7,85 27 13.745 6,35 25 13.736 5,98 18 13.738 6,25

β-elemeno 1383

25 14.025 0,95 28 14.030 0,61 28 14.031 1,51 19 14.034 1,13

β-cariofileno 1411

27 14.768 20,36 32 14.788 17,49 32 14.763 15,50 20 14.773 20,58

β-cubebeno -

28 14.965 0,90 33 14.971 0,72 33 14.970 1,15 21 14.972 0,63

α-guaieno 1442

30 15.192 7,04 35 15.200 7,01 35 15.197 8,03 23 15.200 6,6

α-cariofileno 1450

33 15.533 2,58 38 15.539 2,48 38 15.536 2,08 26 15.540 2,58

Sativeno -

34 15.709 0,33 40 15.712 0,29 39 15.717 0,38 27 15.720 0,28

ɣ-muuroleno 1476

36 16.033 2,42 43 16.042 1,83 40 16.041 3,06 29 16.045 1,92

93

Germacreno D 1483

37 16.156 5,53 44 16.165 4,44 41 16.165 8,04 30 16.168 8,61

β-selineno 1487

38 16.285 1,71 45 16.293 1,61 42 16.292 1,65 31 16.295 1,54

Germacreno B 1555

40 16.523 3,18 47 16.534 3,85 44 16.527 3,09 33 16.533 5,07

δ-guaieno -

42 16.739 1,78 49 16.749 2,13 46 16.744 2,39 35 16.746 1,71

Calameneno -

44 16.963 0,15 51 16.969 0,15 49 16.968 0,13 37 16.970 0,08

δ-cadineno -

45 17.090 2,84 52 17.100 2,64 50 17.097 3,26 38 17.098 2,67

4-Isopropil-1,6-dimethil-1,2,3,4,4a,7-

hexahidronaftaleno -

46 17.307 0,32 53 17.314 0,32 51 17.315 0,27 39 17.316 0,25

α-muuroleno -

48 17.450 0,12 55 17.450 0,11 53 17.450 0,20 41 17.452 0,11

Sesquiterpenos oxigenados

Ent-espatulenol 1571

52 18.193 1,04 59 18.206 2,21 55 18.197 0,40 45 18.204 0,19

94

Óxido de Cariofileno -

53 18.339 1,66 60 18.347 1,17 56 18.341 0,47 46 18.344 0,73

Globulol -

54 18.433 2,99 61 18.440 3,81 57 18.436 1,86 47 18.439 2,96

2-(4a,8-Dimethil-2,3,4,4a,5,6,7,8-octahidro-2-

naphthalenil)-2-propanol -

x x x 65 18.810 0,13 x x x x x x

Cadin-4-en-7-ol 1637

66 19.908 6,34 74 19.928 8,06 68 19.909 5,72 58 19.914 6,77

α-bisobolol 1688

69 20.609 0,17 78 20.613 0,37 69 20.619 0,13 60 20.618 0,16

Identificados (%) 92,58 91,54 92,71 93,93 Hidrocarbonetos monoterpenos (%) 18,96 19,32 24,51 19,82

Monoterpenos oxigenados (%) 0,72 1,25 0,53 0,36 Hidrocarbonetos sesquiterpenos (%) 60,70 55,22 59,09 62,94

Sesquiterpenos oxigenados (%) 12,20 15,75 8,58 10,81

95

Os picos com tempo de retenção entre 4,00 e 7,50 minutos correspondem a

18,96 a 24,51% do total e são os hidrocarbonetos monoterpenos. Os picos com

tempo de retenção entre 8,40 a 12,0 minutos correspondem aos monoterpenos

oxigenados, representando de 0,36 a 1,25% do total das substâncias identificadas.

Os picos com tempo de retenção entre 12,70 a 17,50 minutos são constituídos por

estruturas da classe dos hidrocarbonetos sesquiterpenos e correspondem a 55,22 a

62,94%. Por fim os sesquiterpenos oxigenados são encontrados entre 17,90 a 20,70

minutos e representam de 8,58 a 15,75%.

Diante disso, aparentemente a sazonalidade influencia quantitativamente nas

classes das substâncias identificadas, ou seja, em todas as estações notou-se

variação na concentração total de hidrocarbonetos monoterpenos, monoterpenos

oxigenados, hidrocarbonetos sesquiterpenos e sesquiterpenos oxigenados, com

predominância de sesquiterpenos em relação aos monoterpenos, e de

hidrocarbonetos em relação aos oxigenados. Destaca-se em especial a estação de

verão, que apresentou menor concentração de sesquiterpenos e maior concentração

de monoterpenos, em comparação as demais estações.

Comparando as diferentes estações do ano, percebe-se que no outono e no

verão houve maior concentração de substâncias nos óleos de P. amplum,

demonstrando que as variações de temperatura exercem influência no

desenvolvimento do vegetal, afetando, portanto a produção de metabólitos

secundários, que em geral, nos óleos essenciais, parece aumentar em temperaturas

mais elevadas, apesar de dias muito quentes levarem a uma perda excessiva destes

metabólitos (EVANS, 1996).

A estação de verão (2012/2013) foi acometida por um período intenso e curto

de chuva, sendo que o estresse hídrico ou o efeito da seca frequentemente tem

consequências significantes nas concentrações de metabólitos secundários em

plantas, dependendo do grau de estresse e do período em que ocorre. Os seus

efeitos em curto prazo podem levar a um aumento da concentração dos metabolitos

secundários, enquanto que em longo prazo o efeito é oposto (HAAG, 1987,

ORTOLANI; CAMARGO, 1987).

Ainda é notório que intensidade de luz e radiação ultravioleta são fatores que

também influenciam a concentração e/ou composição de metabólitos secundários,

especialmente nos óleos essenciais que são fotossensíveis (GLOBBO-NETO;

96

LOPES, 2007), no entanto as amostras do presente estudo foram coletadas de um

único espécime vegetal que encontrava-se parcialmente inserido na mata.

Das amostras de P. amplum coletadas por Angnes (2005), três perfis

cromatográficos foram identificados, referentes às coletas em maio de 2003, janeiro

e novembro de 2004, relatando maior concentração de constituintes voláteis na

primavera, devido à atração de polinizadores, e no verão, pelos mecanismos de

defesa contra a perda de água. Diferentemente nesse estudo, o maior rendimento

de substâncias voláteis foi no outono (93,93%), seguido pelo verão (92,71%),

inverno (92,58%) e primavera (91,54%).

Angnes (2005) ainda analisou o óleo essencial das folhas frescas de P.

amplum, coletadas em novembro de 2004 (primavera) por CG/EM e índice de

retenção, caracterizando 19 constituintes (90%). Do total de substâncias

identificadas, 21,4% eram monoterpenos e 68,8% sesquiterpenos, corroborando

com o presente estudo onde também observou-se predomínio dessa classe

terpênica.

Santos et al., (2001), analisaram o óleo essencial das folhas frescas de P.

amplum, coletadas no outono, por CG/EM e índice de retenção, identificando 17

substâncias (57,4%), sendo 22,5% monoterpenos e 34,9% sesquiterpenos,

porcentagem inferior de identificação de substâncias quando comparadas ao

presente estudo em todas as estações, sendo o outono, a estação com maior teor

de substâncias voláteis identificadas (93,93%).

O presente estudo se destaca devido à 43 substâncias identificadas, quando

em comparação com Santos et al. (2001) e Angnes (2005), com 17 e 19 substâncias

respectivamente. No entanto a porcentagem de monoterpenos e sesquiterpenos se

assemelham no presente estudo em comparação com Angnes (2005), porém se

diferem em relação a Santos et al. (2001), que apresenta uma porcentagem próxima

entre essas duas classes terpênicas. Para melhor visualização, estas informações

estão apresentadas na Figura 19.

97

Figura 19: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001).

98

Na Figura 20, estão apresentadas as substâncias majoritárias presentes nos

óleos de P. amplum, com seus respectivos rendimentos. Destacando o β-cariofileno

(15,5 a 20,58%), α-pineno (10,29 a 14,86%), cadin-4-en-7-ol (5,72 a 8,06%), α-

guaieno (6,6 a 8,0%), α-copaeno (5,98 a 7,85%), germacreno D (4,44 a 8,61%),

Limoneno (5,10 a 6,45%) e germacreno B (3,09 a 5,07%) (Tabela 5). Desses, α-

pineno e Limoneno são monoterpenos, cadin-4-en-7-ol sesquiterpeno oxigenado e

os demais sesquiterpenos.

A sazonalidade também influencia quantitativamente a composição dos óleos

essenciais, sendo que das 8 substâncias majoritárias, β-cariofileno, germacreno D e

germacreno B (37,5%) apresentaram maior teor no outono; α-pineno, α-guaieno e

Limoneno (37,5%) apresentaram maior teor no verão; cadin-4-en-7-ol (12,5%) maior

teor na primavera; e α-copaeno (12,5%) maior teor no inverno.

Na pesquisa realizada a partir dos óleos essenciais das folhas frescas de P.

amplum, Santos et al. (2001) destacaram como substâncias majoritárias, o α-pineno

(16,78%), β-cariofileno (9,82%), E-nerolidol (8,3%), germacreno D (5,28%) e

limoneno (3,5%). E Angnes (2005) relatou como substâncias majoritárias β-

cariofileno (24,4%), valenceno (16,4%), α-pineno (12,9%), α-cadinol (8,5%), α-

copaeno (4,2%), e limoneno (3,8%).

Na Figura 21 está apresentada uma análise comparativa das substâncias

majoritárias e suas concentrações em comparação à Santos et al. (2001) e Angnes

(2005).

99

Figura 20: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper amplum em relação a sazonalidade.

100

Figura 21: Análise comparativa dos compostos majoritários comuns presentes nos óleos essenciais de Piper amplum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Angnes (2005) e Santos et al. (2001).

101

Em comum ao presente estudo, Santos et al. (2001) e Angnes (2005) também

destacam dentre as substâncias majoritárias α-pineno e Limoneno, Santos et al.

(2001) relata ainda a presença de Germacreno D, e Angnes (2005) α-copaeno.

Santos et al. (2001), destaca concentrações de 16,78% para α-pineno, 5,28%

para germacreno D e 3,5% para Limoneno, para as amostras coletadas no outono,

sendo que no presente estudo para a mesma estação destaca-se maior

concentração para Limoneno (5,11%) e Germacreno D (8,61%).

Angnes (2005) apresenta concentrações de 12,9% para α-pineno, 3,8% para

Limoneno e 4,2% para α-copaeno, para as amostras coletadas na primavera, sendo

que no presente estudo para a mesma estação observou-se maior concentração

para Limoneno (5,1%) e α-copaeno (6,35%).

De fato, os metabólitos secundários representam uma interface química entre

as plantas e o ambiente. Os estímulos decorrentes do ambiente, no qual a planta se

encontra, podem redirecionar a rota metabólica, ocasionando a biossíntese de

diferentes compostos e/ou variação na concentração destes (SIMÕES et al., 2010).

Muitos fatores podem estar envolvidos na biossíntese de metabólitos

secundários, dentre estes fatores, podem-se ressaltar as interações planta/micro-

organismos, planta/insetos e planta/planta; idade e estádio de desenvolvimento;

fatores como luminosidade, temperatura, pluviosidade, nutrição, época e horário de

coleta, bem como técnicas de colheita e pós – colheita. É válido ressaltar que estes

fatores podem apresentar correlações entre si, não atuando isoladamente, podendo

exercer influência conjunta no metabolismo secundário (CUNHA, 2011).

Contudo, o ideal é que, juntamente com os ensaios para verificação da

atividade biológica, seja realizada a análise química dos óleos essenciais a fim de

determinar as melhores condições de colheita favorecendo a obtenção de matérias

primas vegetais de melhor qualidade, o que possibilitará a obtenção de óleos

essenciais com composição química mais constante, acarretando resultados de

atividades biológicas mais confiáveis (MORAIS, 2009).

5.4.2 Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e Índice de

Retenção – Piper cernuum

Os óleos de Piper cernuum obtidos nas coletas realizadas no final das

diferentes estações do ano apresentaram perfis cromatográficos similares. Na Figura

102

22 podem ser visualizados os cromatogramas, onde observa-se diferenças na

intensidade de alguns picos cromatográficos, sugerindo pequenas variações de

concentração para alguns constituintes dos óleos essenciais nas distintas estações,

como foi também observado para P. amplum.

Figura 22: Cromatogramas dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.

Vinte e sete substâncias foram determinadas e identificadas por CG/EM e

índice de retenção, representando 93,80% no inverno, 93,19% na primavera,

98,44% no verão e 92,89% no outono (Tabela 6).

103

Tabela 6: Análise por CG-DIC e CG-EM dos constituintes dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas coletas das diferentes estações do ano.

Classe Terpênica / Constituinte Químico IRCalc. Estrutura

Química

Piper cernuum

Inverno Primavera Verão Outono

Pico T.R. (min) % Pico T.R.

(min) % Pico T.R. (min) % Pico T.R.

(min) %

Hidrocarbonetos monoterpenos

α-pineno 933

1 4.047 5,43 1 4.040 2,63 1 4.050 4,10 1 4.047 4,88

Canfeno 947

2 4.246 4,55 2 4.239 2,16 2 4.249 3,22 2 4.245 3,00

β-pineno 974

3 4.646 1,52 3 4.639 0,73 3 4.649 1,10 3 4.646 1,27

β-mirceno 984

4 4.760 0,27 4 4.755 0,12 4 4.763 0,21 4 4.761 0,19

Limoneno 1023

5 5.485 0,57 5 5.481 0,27 5 5.487 0,41 5 5.486 0,36

Monoterpenos oxigenados

Metil Geranate -

6 11.892 1,22 6 11.893 0,58 8 11.897 0,81 6 11.897 0,60

Hidrocarbonetos sesquiterpenos

Elixeno -

7 12.689 0,82 7 12.689 0,79 10 12.697 0,80 7 12.694 0,75

α-copaeno 1370

9 13.711 0,92 8 13.710 0,48 12 13.717 0,73 8 13.714 0,54

104

β-bourboneno -

10 13.901 0,09 x x x 13 13.906 0,05 9 13.900 0,06

β-elemeno 1383

11 14.009 0,46 9 14.010 0,27 14 14.014 0,34 10 14.015 0,33

β-cariofileno 1410

13 14.736 8,69 10 14.730 6,18 16 14.746 6,28 12 14.735 5,94

ɣ-elemeno -

15 14.993 0,25 12 14.993 0,20 18 15.000 0,21 14 14.999 0,19

α-bergamoteno -

16 15.115 0,19 13 15.116 0,11 19 15.121 0,15 15 15.118 0,14

(-)-aristoleno -

17 15.233 0,14 14 15.231 0,06 20 15.234 0,11 16 15.234 0,10

α-cariofileno 1468

20 15.511 1,05 15 15.512 0,73 23 15.514 0,90 18 15.514 0,78

Germacreno D -

23 16.141 2,89 18 16.139 2,05 27 16.152 2,00 21 16.143 1,99

β-cadideno -

25 16.381 1,89 19 16.373 1,48 29 16.409 1,53 23 16.381 1,55

Sesquiterpenos oxigenados

4-epi-cis-dihidroagarofurano

1488

27 16.544 12,61 21 16.537 12,29 30 16.581 11,23 24 16.544 13,37

105

Trans-dihidroagarofurano 1488

28 16.642 32,68 22 16.630 36,40 31 16.679 36,68 25 16.642 30,03

Elemol 1546

35 17.523 5,89 27 17.524 7,84 37 17.547 7,66 30 17.534 9,15

(+/-)-trans-nerolidol 1559

36 17.876 0,43 28 17.876 0,44 38 17.882 0,46 31 17.881 0,47

Guaiol 1598

40 18.688 0,92 32 18.691 0,95 44 18.702 1,57 35 18.695 1,46

2-(4a,8-Dimethyl-2,3,4,4a,5,6,7,8-

octahydro-2-naphthalenyl)-2-propanol

-

42 18.914 0,32 34 18.916 0,46 47 18.927 0,58 37 18.920 0,60

ɣ-eudesmol 1629

44 19.214 8,29 36 19.216 12,93 49 19.251 13,29 39 19.225 11,99

β-eudesmol 1644

50 19.798 0,98 42 19.800 1,68 54 19.816 2,21 45 19.802 1,81

α-eudesmol -

52 19.917 0,66 44 19.914 1,24 56 19.931 1,68 47 19.919 1,19

Bulnesol -

54 20.194 0,07 46 20.197 0,12 58 20.201 0,13 49 20.200 0,15

106

Identificados (%) 93,80 93,19 98,44 92,89 Hidrocarbonetos monoterpenos (%) 12,34 5,91 9,04 9,70 Monoterpenos oxigenados (%) 1,22 0,58 0,81 0,60 Hidrocarbonetos sesquiterpenos (%) 17,39 12,35 13,10 12,37 Sesquiterpenos oxigenados (%) 62,85 74,35 75,49 70,22

107

Os picos com tempo de retenção entre 4,00 e 5,50 minutos correspondem a

5,91 a 12,34% do total e são os hidrocarbonetos monoterpenos. O pico com tempo

de retenção entre 11.891 e 11.898, corresponde a monoterpeno oxigenado com

concentração de 0,58 a 1,22%. Os picos com tempo de retenção entre 12,6 a 16,4

minutos são constituídos por estruturas da classe dos hidrocarbonetos

sesquiterpenos e correspondem a 12,35 a 17,39% do total. Por fim os

sesquiterpenos oxigenados são encontrados entre 17,5 a 20,3 minutos e

representam de 62,85 a 75,49%.

Assim como para P. amplum, a sazonalidade também influenciou

quantitativamente nas classes das substâncias identificadas, ou seja, em todas as

estações notou-se variação na concentração total de hidrocarbonetos

monoterpenos, monoterpenos oxigenados, hidrocarbonetos sesquiterpenos e

sesquiterpenos oxigenados, com predominância de sesquiterpenos em relação aos

monoterpenos, e de hidrocarbonetos monoterpenos em relação aos monoterpenos

oxigenados.

Mas diferentemente de P. amplum, nos óleos de P. cernuum coletados ao

final de cada estação do ano, houve predominância de sesquiterpenos oxigenados

em relação aos hidrocarbonetos sesquiterpenos.

Comparando o teor de substâncias voláteis presentes nos óleos de P.

cernuum nas diferentes estações do ano, nota-se que a estação de verão

apresentou maior concentração destas substâncias. Esta estação caracteriza-se, de

modo geral, com o aumento de temperatura e luminosidade, dias mais longos, bem

como maior radiação UV e IV.

Diante disso, elevações de temperatura, na maioria das vezes, apresentam

aumento no teor de metabólitos secundários, porém, em dias muito quentes, pode-

se observar perda excessiva dos mesmos. A intensidade luminosa também interfere

na concentração e na composição dos óleos essenciais, devido ao desenvolvimento

de estruturas (tricomas glandulares) que biossintetisam e armazenam o óleo

essencial (MORAIS, 2009).

A radiação solar, raios UV e IV, pode elevar a produção substâncias devido

ao fato de que as reações biossintéticas são dependentes de suprimentos de

esqueletos carbônicos, realizados por processos fotossintéticos e de compostos

energéticos que participam da regulação dessas reações (TAIZ; ZEIGER, 2004).

108

A estação de verão (2012/2013) referente ao presente estudo foi acometida

por um período intenso e curto de chuva. O excesso de água apresenta correlação

direta na concentração de metabólitos secundários, havendo relatos na literatura de

que o estresse hídrico geralmente induz um aumento na produtividade de alguns

terpenoides (HAAG, 1987; ORTOLANI; CAMARGO, 1987).

Na Figura 23, tem-se uma análise comparativa da concentração de

hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, nas

diferentes estações, com outros autores.

A partir das análises dos óleos essenciais as folhas de P. cernuum por

CG/EM e índice de retenção, Costantin et al. (2001) identificaram 36 substâncias

(98,91%), sendo 27,5% monoterpenos e 71,4% sesquiterpenos, Mesquita et al.

(2005) identificaram 32 substâncias (89,1 e 83,4%), sendo que na coleta referente

ao ano de 1999, 7,2% eram monoterpenos e 81,9% sesquiterpenos, na coleta

realizada no ano de 2001, 10,8% eram monoterpenos e 72,6% sesquiterpenos, e

Assis et al. (2013), identificou 16 substâncias (94,4%) todas sesquiterpenos.

Em comparação com o presente estudo, Costantin et al. (2001) apresentaram

maior quantidade e porcentagem de identificação de substâncias voláteis presentes

no óleo essencial. No estudo realizado por Mesquita et al. (2005) foram identificadas

mais substâncias que o presente estudo, porém com menor porcentagem para as

duas coletas realizadas em 1999 e 2000. Ainda, Assis et al. (2013) identificaram

menos substâncias porém com porcentagem superior as estações de inverno,

primavera e outono do presente estudo.

A concentração de sesquiterpenos para o presente estudo bem como para

Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013), foi superior aos

monoterpenos, sendo que para esse último Costantin et al. (2001) relata

concentração superior aos demais, e Assis et al. (2013) destacaram a ausência

dessa classe terpênica.

Somente Costantin et al. (2001) relataram o mês de coleta de material

vegetal, referindo-se a estação de outono, que ao comparar com os resultados deste

trabalho na mesma estação, nota-se concentração maior de sesquiterpenos e menor

concentração de monoterpenos, indicando que mesmo tratando-se da mesma

espécie e com coleta realizada na mesma estação do ano, pode ocorrer

variabilidade na composição química dos óleos essenciais, também pelo localização

geográfica onde a planta está inserida.

109

Figura 23: Análise comparativa da concentração de hidrocarbonetos terpênicos presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Mesquita et al. (2005) e Assis et al. (2013).

110

Para P. cernuum no presente estudo, como substâncias majoritárias, foram

encontradas trans-dihidroagarofurano (30,03 a 36,68%), 4-epi-cis-dihidroagarofurano

(11,23 a 13,37%), γ-eudesmol (7,64 a 11,65%), β-cariofileno (5,94 a 8,69%), elemol

(5,89 a 9,15%), α-pineno (2,63 a 5,43%) e canfeno (2,16 a 4,55%) (Tabela 6).

Desses α-pineno e canfeno são monoterpenos, β-cariofileno é sesquiterpenos, trans-

dihidroagarofurano, 4-epi-cis-dihidroagarofurano, elemol e γ-eudesmol são

sesquiterpenos oxigenados.

Como está apresentado na Figura 24, a sazonalidade também influencia

quantitativamente a composição dos óleos essenciais, sendo que das 7 substâncias

majoritárias identificadas, α-pineno, canfeno e β-cariofileno apresentam maior teor

no inverno, γ-eudesmol maior concentração na primavera, trans-dihidroagarofurano

maior teor no verão, 4-epi-cis-dihidroagarofurano e elemol maior teor no outono.

Na pesquisa realizada com os óleos essenciais de P. cernuum, Torquilho et

al. (2000) apresentaram como substancias majoritárias o cis-dihidroagarofurano

(32,3%), α-pineno (10,2%), β-pineno (7,4%), 10-epi-ɣ-eudesmol (7,1%) e β-elemol

(6,7%). Costantin et al. (2001) relataram a presença de biciclogermacreno (21,88%),

β-cariofileno (20,69%), α-pineno (7,16%), germacreno D (6,68%) e β-pineno

(6,15%). Mesquisa et al. (2005) identificaram como majoriatários o trans-

dihidroagarofurano (22,4%), 10-Epi-γ-eudesmol (16,8%), germacreno D (9,0%),

elemol (7,2%), α-pineno (4,1%) e β-eudesmol (4,1%). E Assis et al. (2013)

destacaram o epi-cubebol (13,1%), β-elemeno (11,6%), espatulenol (9,6%),

valeranone (9,1%), β-cariofileno (8,3%), cis-β-guaieno (8,2%), óxido de cariofileno

(7,7%) e ɣ-muuroleno (7,6%).

Na Figura 25 está apresentada uma análise comparativa das substâncias

majoritárias e suas concentrações em comparação aos estudos realizados por

Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquisa et al. (2005) e Assis et al.

(2013).

111

Figura 24: Análise comparativa do teor das substâncias majoritárias presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum em relação a sazonalidade.

112

Figura 25: Análise comparativa dos compostos majoritários comuns presentes nos óleos essenciais de Piper cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001), Mesquisa et al. (2005) e Assis et al. (2013).

113

Dentre as substâncias majoritárias, α-pineno é comum para o presente

estudo, e também para Torquilho et al. (2000), Costantin et al. (2001) e Mesquita et

al. (2005), sendo que esses autores apresentaram maior concentração para essa

substância, exceto as estações de inverno e outono do presente estudo em

comparação com Mesquita et al. (2005).

Costantin et al. (2001) e Assis et al. (2013) apresentaram em comum com o

presente estudo o β-cariofileno, sendo somente a estação de inverno com teor

superior ao resultado encontrado por Assis et al. (2013).

Ainda, em comum com os resultados apresentados por Mesquita et al. (2005)

tem-se o trans-dihidroagarofurano e o elemol, sendo o primeiro com maior teor em

todas as estações, e o segundo com concentração superior na primavera, verão e

outono do presente estudo.

Assim como foi observado para P. amplum, a natureza dos metabólitos

secundários, assim como a teor das substâncias majoritárias, variou também para os

óleos de P. cernuum em comparação a outras pesquisas. Desta forma, as

justificativas quanto aos metabólitos secundários e suas variações descritas nos

resultados apresentados para P. amplum, se aplicam da mesma forma para P.

cernuum.

5.4.3 Espectroscopia no Infravermelho - IV

Os óleos essenciais também foram analisados por infravermelho (IV), sendo

que os espectros resultantes das análises apresentam um rico agregado de bandas

de absorção, fornecendo informações estruturais sobre as substâncias presentes

nos óleos essenciais (FELICIANO et al., 2012).

Nas Figuras 26 e 27 estão apresentados os espectros de IV dos óleos das

duas espécies de Piper obtidos das coletas realizadas no final das diferentes

estações do ano.

A composição dos óleos essenciais tanto de P. amplum quanto de P.

cernuum é constituída principalmente por mono e sesquiterpenos, e destes os

sesquiterpenos se destacam. Idependente das estruturas, todos os compostos,

mono e sesquiterpenos, apresentaram bandas de absorção características de

estiramentos de ligações CH alifáticos entre 2850 a 2980 cm-1 e deformação destas

ligações entre 1500 a 1300 cm-1. Acima de 3000 cm-1 estão os estiramentos de

114

ligações CH olefínicos, estas são de fraca intensidade. Para estas ligações são

observados bandas de deformação próximo a 900 cm-1. Assim como os

estiramentos de C=C estão em aproximadamente 1600 cm-1.

As duas espécies de Piper apresentam sesquiterpenos oxigenados (Piper

amplum entre 8,58 a 15,75% e Piper cernumm entre 62,85 a 75,49%), dos quais,

exceto o óxido de cariofileno, possuem a função álcool. Os estiramentos das

ligações OH estão entre 3500 a 3300 cm-1 e C-O entre 1300 a 1100 cm-1. Estas

bandas de absorção são geralmente mais intensas, porém nos espectros dos óleos

estas se apresentam de fraca intensidade, pois estão em baixa proporção em

relação às demais ligações.

É importante ressaltar que essa técnica apresentou limitações, uma vez que

há diferenças no teor das substâncias presentes nos óleos essenciais nas diferentes

estações do ano para as duas espécies de Piper, o que não é observados nos

espectros de IV.

A análise de P. amplum por espectroscopia no infravermelho realizada por

Angnes (2005), é semelhante ao presente estudo.

115

Figura 26: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.

Legenda: a) inverno; b) primavera; c) verão; d) outono.

116

Figura 27: Espectros de infravermelho dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.

Legenda: a) inverno; b) primavera; c) verão; d) outono.

117

No espectro de IV a região abaixo de 1500 cm-1 é conhecida como região de

impressão digital, onde são encontradas bandas de absorção específicas das

substâncias. Sendo essa geralmente utilizada no controle de qualidade para

confirmação de estruturas.

Avaliando a região entre 1500 e 700 cm-1 nos espectros dos óleos das duas

espécies percebe-se que o óleo da P. cernuum apresenta maior aglomerado de

bandas, ficando evidente a diferença na composição química dos óleos das duas

espécies, além de que o óleo de P. cernuum sugere a presença de substâncias mais

elaboradas sob o ponto de vista químico devido a maior quantidade de bandas

nessa região.

As principais fraudes e/ou problemas relacionados aos produtos naturais são,

a substituição de determinada espécie por outra semelhante, e adulteração de parte

ou do todo da planta por outra espécie. Sendo este um problema persistente uma

vez que as plantas são entidades muito complexas, podendo possuir centenas de

metabólitos secundários (VILEGAS; CARDOSO; QUEVEDO, 2012).

Desta forma, observando as diferenças espectrais dos óleos das duas

espécies de Piper do presente estudo, a análise por espectroscopia no IV, pode ser

útil no controle de qualidade para verificação da autenticidade da espécie em

questão, tendo em vista que trata-se de uma metodologia de fácil análise e maior

acessabilidade.

5.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear - RMN

A ressonância magnética nuclear (RMN) vem sendo utilizada nos últimos

anos no controle de qualidade de espécies vegetais. Na ressonância magnética

nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) obtem-se informações dos esqueletos de

hidrogênio presentes nas estruturas. Já na ressonância magnética nuclear de

carbono-13 (RMN de 13C) são encontrados os carbonos presentes. Os espectros

possuem regiões que são características de determinados tipos de carbonos e seus

hidrogênios, que são utilizados para a identificação das substâncias.

Os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum obtidos nas coletas das

distintas estações foram avaliados por RMN 1H, resultando em espectros idênticos

entre si para as duas espéceis de Piper. Diante dessa semelhança, optou-se em

118

somente analisar um óleo, de qualquer estação, para cada espécie de Piper por

RMN 13C.

Os espectros de RMN 1H podem ser visualizados nas Figuras 28 e 29. Para

cada uma das espécies os espectros de RMN 1H foram idênticos para os óleos das

quatro coletas representativas das diferentes estações do ano, porém os espectros

das duas espécies apresentam diferenças que as distinguem uma da outra.

A natureza terpênica pode ser visualizada na região de 0,6 a 2,5 ppm, região

esta característica de hidrogênios alifáticos. Assim como a região de 4,0 a 6,0 ppm

são encontrados os hidrogênios ligados a carbonos oxigenados e hidrogênios

olefínicos, respectivamente.

Os espectros de carbono (Figuras 30 e 31) são mais facilmente avaliados do

que os espectros de RMN 1H, pois eles podem fornecem para cada carbono um

sinal. Desta forma, são visualizados nos espectros vários sinais entre 15 e 55 ppm,

nesta região são encontrados os carbonos alifáticos, já entre 105 a 155 ppm estão

os carbonos olefínicos, entre 70 e 100 ppm estão os carbonos oxigenados e nesta

região fica evidenciada a diferença na composição química dos óleos avaliados.

119

Figura 28: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper amplum obtidos nas diferentes estações do ano.

120

Figura 29: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio dos óleos essenciais de Piper cernuum obtidos nas diferentes estações do ano.

121

Figura 30: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper amplum obtido na primavera.

122

Figura 31: Ressonância magnética nuclear de carbono do óleo essencial de Piper cernuum obtido no inverno.

123

Inicialmente houve dificuldade para a identificação das duas substâncias

majoritárias presentes nos óleos de P. cernuum, uma vez que elas não se

encontravam na biblioteca NIST (Mass Spectral Library) disponível no laboratório.

Estudos com essa mesma espécie, apresentaram como majoritários

isômeros dihidriagarofurano (MESQUITA, et al. 2005). Diante disso, a RMN 13C foi

utilizada para a correta identificação destas duas substâncias. Com a análise dos

espectros e comparação com Cavalli et al. (2004), foi possível identificar as duas

substâncias majoritárias, trans-dihidroagarofurano e 4-epi-cis-dihidroagarodurano.

Além das duas substâncias majoritárias, foi também possível identificar os sinais

relativos às outras substâncias majoritárias conforme apresentados na Tabela 7

(FERREIRA et al., 2001; MAATOOQ, 2002).

Diante disso, a RMN 13C, pode ser útil na identificação de substâncias

majoritárias presentes em misturas complexas. E, assim como análise por IV,

também pode ser uma ferramenta no controle de qualidade de óleos essenciais, a

fim de evitar adulterações e ou problemas com a legitimidade da espécie vegetal.

124

Tabela 7: Valores de deslocamentos químicos de RMN 13C para as substâncias majoritárias presentes no óleo essencial de P. cernuum [δ v (ppm), CDCl3]. Carbonos α-pineno Canfeno β-cariofileno 4-epi-cis-dihydroagarofurano Trans-dihydroagarofurano Elemol ɣ-eudesmol

1 47.03 42.21 53.56 37.19 37.41 39.69 40.35

2 144.51 47.03 39.86 17.74 16.88 39.86 19.51

3 116.01 24.79 30.05 30.52 29.36 22.58 33.11

4 31.27 28.86 48.08 43.07 40.35 49.32 124.31

5 41.14 46.90 154.90 86.99 87.82 28.47 134.99

6 38.11 98.99 40.35 42.21 38.50 52.68 26.35

7 31.45 35.03 29.46 43.40 44.54 147.88 49.32

8 26.35 25.37 124.31 25.78 24.95 112.04 23.30

9 20.79 25.37 134.99 37.96 37.99 24.79 42.21

10 22.98 - 34.78 39.69 38.50 72.72 34.42

11 - 28.35 81.58 80.96 20.79 72.72

12 - 30.05 31.27 30.52 27.13 27.13

13 - 22.58 23.30 23.54 27.13 26.95

14 - 111.64 25.20 22.84 147.88 24.79

15 - 16.29 16.88 17.74 111.64 19.51

125

5.5 Bioautografia

A bioautografia é um método de rastreio para a detecção de atividade

biológica, sendo simples, de baixo custo, relativamente rápido e sem a necessidade

de equipamentos sofisticados. Além disso, permite o biodirecionamento para o

isolamento de substâncias ativas (CHOMA; GRZELAK, 2011).

O teste da bioautografia foi realizado utilizando Staphylococcus aureus (ATCC

25923), pois nos ensaios preliminares esta bactéria apresentou sensibilidade aos

componentes das espécies de Piper, resultando em ensaio importante para indicar

as substâncias que apresentavam atividade antibacteriana.

Ainda para o ensaio de bioautografia, inicialmente também foi empregado

outro micro-organismo sensível, o Microsporum gypseum (C115), no entanto o

crescimento deste fungo não foi homogêneo em toda a superfície do meio de

cultura, inviabilizando a leitura dos resultados e por este motivo o micro-organismo

em questão não foi empregado na bioautografia.

Para melhor análise dos resultados da bioautografia, tanto para os óleos

essenciais quanto para as frações diclorometano e acetato de etila para as duas

espécies de Piper, preparou-se placas de CCDs idênticas sendo que uma foi

revelada com anisaldeído sulfúrico e aquecimento, e luz UV 365 nm, e com outra

realizou-se a bioautografia.

Como pode ser observado nos resultados de bioautografia, Figura 32a, a área

clara com Rf de 0,29 em destaque se refere à inibição do crescimento bacteriano

(halo de inibição), provocada por uma substância ou mistura de substâncias com

efeito antibacteriano. Esta atividade foi observada nas amostras em todas as

estações nas duas espécies de Piper, sendo que no inverno observou-se halos de

inibição menos intensos, provavelmente pela baixa concentração de amostra nos

pontos 1 e 2.

Na figura 32b está apresentada a placa que foi eluida com fase móvel

composta por hexano: acetato de etila (95:5) e revelada com uma solução de

anisaldeido sulfúrico. Os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, em todas as

estações, apresentam mono e sesquiterpenos na composição, consequentemente

as manchas com valores de Rf maiores são referentes aos compostos mais

apolares, que são os monoterpenos. As manchas com menores valores de Rf, como

o caso das bandas referentes aos halos de inibição, com Rf variando de 0,28 a 0,30,

126

podem ser de sesquiterpenos. As duas espécies apresentam vários sesquiterpenos

na sua composição, por isso não se pode afirmar quais são as substâncias que

podem ter contribuido para a formação do halo de inibição.

Figura 32: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo óleos essenciais de Piper amplum e Piper cernuum.

(a) CCD submetida à bioautografia frente a S. aureus; (1) óleo essencial de P. amplum no inverno; (2) óleo essencial de P. cernuum no inverno; (3) óleo essencial de P. amplum na primavera; (4) óleo essencial de P. cernuum na primavera; (5) óleo essencial de P. amplum no verão; (6) óleo essencial de P. cernuum no verão; (7) óleo essencial de P. amplum no outono; (8) óleo essencial de P. cernuum no outono; (b) CCD eluida em fase móvel composta por hexano: acetato de etila (95:5) e revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.

Na revelação das placas de CCDs para as frações de dicloromentano e

acetato de etila, referente às estações de inverno, primavera e outono, não foi

possível observar nenhum halo de inibição de crescimento microbiano, sugerindo

que o sistema de solventes utilizados para a eluição das CCDs, hexano: acetato de

etila (60:40), não foi adequado para rastreamento de compostos com atividade

antimicrobiana, uma vez que no ensaio de diluição em ágar foi possível observar

pequena atividade antimicrobiana frente a S. aureus.

Como pode ser observado nos resultados da bioautografia, Figura 33a, a área

clara com Rf de 0,34 e 0,54 em destaque se refere à inibição do crescimento

bacteriano (halo de inibição), provocada, provavelmente, por uma substância ou

mistura de substâncias de média polaridade com atividade antibacteriana. Esta

atividade foi observada para a fração dicloromentano de P. cernuum no verão.

127

Na figura 33b está apresentada a placa que foi eluida com fase móvel

composta por hexano: acetato de etila (60:40), com revelação com anisaldeído

sulfúrico e aquecimento.

Figura 33: Bioautografia e cromatografia em camada delgada contendo frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum e Piper cernuum nas estações de verão e outono.

(a) CCD submetida à bioautografia frente a S. aureus; (1) fração diclorometano de P. amplum no outono; (2) fração diclorometano de P. amplum no verão; (3) fração diclorometano de P. cernuum no verão; (4) fração diclorometano de P. cernuum no outono. (b) CCD eluida em fase móvel composta por hexano: acetato de etila (60:40), com revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento; (1) fração diclorometano de P. amplum no verão; (2) fração diclorometano de P. amplum no outono; (3) fração diclorometano de P. cernuum no verão; (4) fração diclorometano de P. cernuum no outono.

A bioautografia consiste na separação preliminar de substâncias de acordo

com sua polaridade, assim sendo esses compostos, previamente separados, podem

apresentar a atividade antibacteriana mais evidenciada, quando comparados com

misturas complexas, que podem não destacar a possível atividade antimicrobiana de

alguns compostos presentes em concentrações relativamente baixa, ou a inatividade

devido a possível interação entre as substâncias presentes nessas misturas.

5.6 Avaliação da Atividade Antimicrobiana

A sensibilidade dos micro-organismos aos antimicrobianos é representada

pela concentração inibitória mínima (CIM), que corresponde à menor concentração

do antimicrobiano capaz de inibir o desenvolvimento visível do micro-organismo.

128

Assim sendo esse método é o mais adequado para a avaliação da susceptibilidade

do micro-organismo ao antimicrobiano testado, uma vez que a partir deste pode

ainda estabelecer a concentração microcida mínina (CMM), que corresponde à

menor concentração do antimicrobiano capaz de destruir o micro-organismo


Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo

responsável por um processo infeccioso que exija terapia antimicrobiana, quando é

impossível predizer a sensibilidade desse organismo, mesmo conhecendo a sua

identificação. Os testes de sensibilidade são indicados, com maior frequência,

quando se acredita que o organismo causador pertence a uma espécie capaz de

apresentar resistência aos agentes antimicrobianos normalmente usados


A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos óleos puros

(25000 a 48 ppm) e das frações diclorometano e acetato de etila diluídas em

dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração inicial de 40 µg/µL (1000 a 2 ppm), frente

aos micro-organismos estudados, foi realizada pelo método de diluição em ágar.

Sequencialmente ao estabelecimento da CIM, determinou-se a concentração

bactericida mínima (CBM) e a concentração fungicida mínima (CFM). A partir desses

ensaios pode-se avaliar o potencial citotóxico das amostras testadas, tendo em vista

a capacidade dos mesmos em inviabilizar o metabolismo microbiano.

Infelizmente não existe um consenso sobre o nível de inibição aceitável para

produtos naturiais, dessa forma alguns autores comparam a atividade antimicrobiana

de produtos naturais com antibióticos sintéticos padrões, considerando como boa

atividade antimicrobiana aquele produto que apresentar resultado similar ou com

níveis de inibição superior ao antibiótico utilizado como padrão (KALEMBA;

KUNINCKA, 2003). Desta forma, não é simples estabelecer um critério para

avaliação da atividade antimicrobiana, pois depende da finalidade do que está em

análise.

No presente trabalho, para os resultados dos testes da atividade

antimicrobiana foi considerada a revisão de Kalemba e Kunincka (2003), que relatam

não haver relação entre os antibióticos utilizados como padrões na avaliação

antimicrobiana e os compostos de plantas.

129

Desta forma, optou-se em comparar a atividade antimicrobiana de outros

óleos essenciais sobre os mesmos micro-organismos utilizados no presente estudo,

submetidos a análises com os óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum.

5.6.1 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essencias de Piper amplum e Piper

cernuum

Os óleos de P. amplum demonstraram atividade contra bactérias Gram

positivas, B. subtilis e S. pyogenes. Enquanto que os óleos essenciais de P.

cernuum além desses dois micro-organismos, também apresentaram atividade

contra S. aureus, conforme demonstrado na Tabela 8 e 9.

130

Tabela 8: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações (n=3).

Óleos Essenciais

Concentração Inibitória Mínima – CIM (ppm) e Concentração Microcida Mínima – CMM (ppm)

Bactérias Gram Positivas Bactérias Gram Negativas

S. aureus S. pyogenes B. subtilis E. coli

CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM

Inverno 2012 6250 / 12500 780 / 12500 6250 / 12500 > 25000 / NR Primavera 2012 12500 / 25000 780 / 780 1560 / 3120 > 25000 / NR

Verão 2012/2013 12500 / 25000 780 / 3120 3120 / 6250 > 25000 / NR Outono 2013 6250 / 25000 1560 / 6250 195 / 6250 > 25000 / NR

Staphylococcus aureus (S. aureus); Streptococcus pyogenes (S. pyogenes); Bacillus subtilis (B. subtilis); Escherichia coli (E. coli); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).

Tabela 9: Atividade antibacteriana de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações (n=3).

Óleos Essenciais





Inverno 2012 780 / 3120 780 / 780 390 / 390 > 25000 / NR Primavera 2012 1560 / 12500 780 / 1560 390 / 780 > 25000 / NR

Verão 2012/2013 780 / 25000 780 / 780 48 / 48 > 25000 / NR Outono 2013 780 / 780 780 / 3120 48 / 48 > 25000 / NR


131

Como está demonstrado na Figura 34, os óleos essenciais de P. cernuum,

especialmente nas estações de inverno, verão e outono, apresentaram melhor

atividade contra S. aureus, quando comparados aos óleos de P. amplum do

presente estudo, bem como em relação aos resultados apresentados por Costantin

et al. (2001) que avaliou a atividade antibacteriana dos óleos essenciais de P.

cernuum e P. regnelli, Santos et al. (2012) que analisou o óleo essencial de P.

malacophyllum, e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006) que avaliaram

diversas plantas aromáticas.

Os resultados encontrados para atividade antimicrobiana pelo método de

diluição em ágar foram confrontados com os resultados da bioautografia para os

óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum frente a S. aureus. Assim sendo,

observa-se que a possível atividade contra essa bactéria Gram positiva visualizada

no ensaio de bioautografia, em todas as estações, para ambas as espécies de Piper,

pode ser confirmada na análise de diluição em ágar, uma vez que todas as amostras

de P. amplum e P. cernuum demonstraram atividade antibacteriana frente a esse

micro-organismo (CIM 780 a 12500 ppm).

132

Figura 34: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. aureus dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Costantin et al. (2001), Santos et al. (2012) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).

133

Como é apresentado na Figura 35, os óleos de P. amplum nas estações de

inverno, primavera e verão, e os óleos de P. cernuum em todas as estações

apresentaram melhor atividade antibacteriana contra para S. pyogenes, em

comparação ao cinnamon, substância considerada ativa por Kalemba e Kunincka

(2003), contra esse micro-organismo.

Figura 35: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra S. pyogenes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003).

Os resultados de atividade antibacteriana contra B. subtilis encontrados no

presente estudo, destacados na Figura 36, demonstram que os óleos de P. cernuum

no verão e outono, bem como o óleo de P. amplum no outono são promissores em

relação a outros estudos realizados com plantas aromáticas e/ou substâncias

presentes em óleos essenciais descritos por Kalemba e Kunincka (2003) e

Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).

134

Figura 36: Análise comparativa da atividade antibacteriana contra B. subtilis dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Kalemba e Kunicka (2003) e Prabuseenivasan, Jayakumar e Ignacimuthu (2006).

135

Os óleos de P. amplum e P. cernuum apresentaram bons resultados contra os

dermatófitos, bem como atividade antifúngica contra C. neoformans. Os resultados

estão apresentados nas tabelas 10 e 11. Nas Figuras 37, 38, 39, 40 e 41 estão

apresentados os resultados da atividade antifúngica, dos óleos essenciais das duas

espécies de Piper do presente estudo. A atividade antifúngica dos óleos foi mais

promissora que os óleos de outras duas espécies de Piper analisadas por Santos et

al. (2012) e Santos (2009).

Os óleos essenciais das duas espécies de Piper se comportaram de maneira

distinta frente a cada micro-organismo, e nas diferentes estações do ano. Contra M.

gypseum a estação de verão, primavera e inverno para P. cernuum, e a estação de

primavera para P. amplum apresentaram os melhores resultados. Para a atividade

antifúngica contra T. mentagrophytes destaca-se as estações de inverno, verão e

outono para P. cernuum, e a estação de verão para P. amplum. Os resultados

antifúngicos contra T. rubrum, demonstram maior efetividade para os óleos de P.

cernuum na primavera, verão e outono, além da estação de outono para P. amplum.

Contra E. flocosum, observa-se melhor atividade antifúngica na primavera verão e

outono para P. cernuum, e a estação de outono para P. amplum. Por fim, os

resultados obtidos contra C. neoformans, demonstram que os óleos essenciais de P.

cernuum, em todas as estações, são promissores na atividade antifúngica frente a

esse micro-organismo.

136

Tabela 10: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).

Óleos Essenciais


Filamentosos Leveduras

Dermatófitos Oportunistas

M. can M. gyp T. men T. rub E. flo A. fum Rhi sp C. alb C.neo

CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM CIM / CMM

Inverno 2012 > 25000 / NR 1560 / 1560 97 / 97 780 / 12500 48 / 97 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 12500

Primavera 2012 > 25000 / NR 195 / 195 97 / 12500 195 / 25000 195 / 780 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 6250

Verão 2012/2013 > 25000 / NR 780 / 3120 48 / 48 390 / 12500 97 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 1560 / 12500

Outono 2013 > 25000 / NR 780 / 1560 195 / 3120 97 / 6250 48 / 195 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 780 / 25000 Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).

Tabela 11: Atividade antifúngica de óleos essenciais de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).

Óleos Essenciais






Inverno 2012 > 25000 / NR 195 / 195 48 / 48 195 / 6250 195 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48

Primavera 2012 > 25000 / NR 97 / 97 97 / 195 48 / 6250 48 / 195 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48

Verão 2012/2013 > 25000 / NR 48 / 6250 48 / 48 48 / 780 48 / 390 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 97

Outono 2013 > 25000 / NR 390 / 3120 48 / 195 48 / 780 48 / 97 > 25000 / NR > 25000 / NR > 25000 / NR 48 / 48 Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).

137

Figura 37: Análise comparativa da atividade antifúngica contra M. gypseum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).

Figura 38: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. mentagrophytes dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012).

138

Figura 39: Análise comparativa da atividade antifúngica contra T. rubrum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).

Figura 40: Análise comparativa da atividade antifúngica contra E. flocosum dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).

139

Figura 41: Análise comparativa da atividade antifúngica contra C. neoformans dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo em comparação com Santos et al. (2012) e Santos (2009).

Os resultados de atividade antifúngica dos óleos essenciais de P. amplum e

P. cernuum do presente estudo são também promissores quando comparados a

óleos essenciais obtidos de outras plantas aromáticas, cujos autores classificaram a

atividade antifúngica promissora, como o óleo de Cinnamomum suvabenium (CIM de

470 a 2520 ppm) (KALEMBA; KUNINCKA, 2003) e Melaleuca alternifolia (CIM de 80

a 600 ppm) (HAMMER; CARSON; RILEY, 2002).

Alguns estudos sobre avaliação da composição química do óleo essencial de

outras espécies de Piper, bem como a avaliação de sua atividade antifúngica foram

realizados, no entanto os autores destacam a necessidade de novas análises.

Navickiene et al. (2006) avaliaram a atividade antifúngica dos óleos

essenciais das folhas de três espécies de Piper, obtidos por hidrodestilação com

utilização de Clevenger, bem como a composição química desses óleos por CG-EM.

Para P. aduncum, os autores relatam como compostos majoritários, linalol (31,7%),

biciclogermacreno (11,2%), nerolidol (10,4%) e β-cariofileno (9,1%), para P.

arboreum biciclogermacreno (49,5%) e β-cariofileno (25,1%), e para P. tuberculatum

β-cariofileno (40,2%), β pineno (12,5%), α pineno (10,4%), trans-ocimeno (8,6%) e β

farneseno (8,3%). Para avaliação da atividade antifúngica frente ao Cladosporium

140

cladosporioides e C. sphaerospermum, os autores utilizaram a técnica de

bioautografia, não observando atividade antifúngica promissora.

Vieira et al. (2011) realizaram extração do óleo essencial das folhas frescas

de P. diospyrifolium por hidrodestilação utilizando o aparato Clevenger. E analisaram

esse óleo por CG-MS e índice de Kovats, observando como compostos majoritários

o (E)-eudesma-6,11-diene (21,12%), β-cariofileno (16,76%), ɣ muuroleno (10,57%),

limoneno (8,47%), e germacreno B (6,2%). Para a atividade antifúngica utilizaram o

método de disco difusão frente a C. albicans (12,3 mm), C. parapsilosis (15 mm) e C.

tropicalis (9,3 mm), relatando atividade antifúngica interessante para o óleo na

concentração de 20000 ppm.

Mesmo observando a influência da sazonalidade na atividade antimicrobiana

e na composição quantitativa das substâncias presentes nos óleos essenciais, das

duas espécies de Piper, obtidos a partir das coletas nas quatro estações, não foi

possível estabelecer uma correlação direta, entre o aumento da concentração de

substâncias com a melhora da atividade antimicrobiana. Isto sugere que a atividade

antimicrobiana possa estar relacionada ao conjunto de substâncias presentes nos

óleos e não necessariamente a uma, ou a um conjunto de substâncias majoritárias,

uma vez que substâncias presentes em menor concentração podem contribuir com a

ação farmacológica, possivelmente pelo sinergismo entre os compostos

(HENRIQUES et al., 2012).

Contudo, conhecendo as substâncias majoritárias presentes nos óleos de P.

amplum e P. cernuum, alguns autores relatam a atividade antimicrobiana dessas

substâncias, de forma isolada ou como majoritária em óleos de diversas plantas

aromáticas.

Os sesquiterpenos agarofuranos são considerados importantes indicadores

quimiotaxonômicos (BRÜNING; WAGNER, 1978). Membros deste grupo tem atraído

interesse devido a sua ampla gama de atividades biológicas (XIA et al., 2002), tais

como citotóxica, inseticida (NÚÑEZ, et al. 2004; WHITSON, et al. 2006),

imunossupressora (DUAN, et al. 2001), anti-HIV (HORIUCH et al. 2006), antitumoral

(GONZÁLEZ, et al. 2000) e quimioprotetora (PERESTELO et al. 2010). Ainda,

estudos relataram que ésteres de dihidroagarofurano têm sido referidos como

eficazes no combate de micro-organismos resistentes, devido à capacidade de

reverter mecanismos de resistência bacteriana, como no caso da bomba de efluxo

(LEE; FLOREANCIG, 2004).

141

Autores destacam que -ariofileno, germacreno D e germacreno B são

substâncias majoritárias em diversos óleos essenciais que possuem atividade

antimicrobiana frente a diferentes micro-organismos (JUTEAU et al., 2002;

GONZAGA et al., 2003; IACOBELLIS et al., 2005; CHAVAN; SHINDE; NIRMAL,

2006).

Derivados de β-cariofileno, usados como conservante de alimentos,

medicamentos e cosméticos, têm sido estudados, a partir de testes in vitro, como

antifúngico para tratamento de dermatofitóses, sendo comparados com

medicamentos como ciclopirox olamina e sulconazol (YANG et al., 1999; SCHMIDT

et al., 2010). No presente estudo, tem-se dentre as substâncias majoritárias, o β-

cariofileno, com maior concentração no outono (20,58%) para P. amplum e no

inverno (8,7%) para P. cernuum, o que pode justificar a forte atividade antifúngica

frente à maioria de dermatófitos analisados. Porém não é possível correlacionar a

melhoria da atividade antimicrobiana às estações de outono para P. amplum e

inverno para P. cernuum, devido a maior concentração de β-cariofileno.

Bakkali et al. (2008), relata que Limoneno tem capacidade citotóxica frente a

S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae, na concentração de 600 a

5000 ppm. E Henriques, Simões-Pires e Apel (2012), descreveram que o limoneno

possui um grupamento alílico que influencia o efeito inibidor, especialmente contra

bactérias Gram negativas.

Nos óleos essenciais das duas espécies de Piper foi evidenciada a presença

de Limoneno, sendo que em P. amplum a concentração encontrada foi de 5,11 a

6,45%, e para P. cernuum de 0,27 a 0,57%. Substância que pode ter contribuído

para a atividade antimicrobiana observada, no entanto sem atividade evidenciada

contra E. coli.

Costantin et al. (2001) na avaliação de atividade antimicrobiana do óleo de P.

cernuum pelo método de difusão em ágar, utilizaram como padrão o eugenol na

concentração de 50000 ppm. E concluíram que essa substância é muito ativa para

S. aureus (23,6 mm) e C. albicans (29,3 mm). Na presente pesquisa a CIM dos óleos

essenciais frente a S. aureus, tanto para P. amplum (CIM de 6250 a 12500 ppm)

quanto para P. cernuum (CIM de 780 a 1560 ppm), foram menores que a

concentração de eugenol utilizada por Costantin et al. (2001), demonstrando que as

duas espécies de Piper são promissoras quanto sua atividade antimicrobiana.

142

No presente trabalho, dentre as substâncias majoritárias, tem-se o α-pineno

tanto no óleo essencial de P. amplum (10,29 a 14,86%), quanto no óleo de P.

cernuum (2,63 a 5,43%). De acordo com Burt (2004) α-pineno é uma substância

importante encontrada em óleos essenciais com atividade antibacteriana.

A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais pode variar de acordo com

sua a composição química, e esta por sua vez está susceptível a fatores como a

sazonalidade, apontada como um dos fatores de maior importância, visto que a

quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza das substâncias ativas não é

constante durante o ano (GLOBBO-NETO; LOPES, 2007). As estações do ano se

caracterizam, de modo geral, pelas variações de temperatura, índice pluviométrico,

intensidade de luz e radiação ultravioleta.

É importante ressaltar que o óleo essencial de uma planta pode conter

constituintes majoritários, porém substâncias presentes em menor concentração

podem contribuir com a ação farmacológica, possivelmente pelo sinergismo entre os

compostos (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2012).

5.6.2 Atividade Antimicrobiana das Frações Diclorometano e Acetato de Etila

de Piper amplum e Piper cernuum

Os resultados da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato

de etila de P. amplum e P. cernuum obtidos a partir dos hidrolatos referentes às

coletas das quatro estações do ano estão apresentados nas Tabelas 12 e 13.

Comparando a atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato

de etila das duas espécies de Piper, como é demonstrado nas Figuras 42, as

frações diclorometano de P. amplum foram mais efetivas contra S. aureus e B.

subtilis, quando em comparação com as frações de P. cernuum. E, sem atividade

promissora contra S. pyogenes para as frações diclorometano e acetato de etila de

P. amplum e P. cernuum.

Muller (2011) avaliou a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos das

partes aéreas de P. amplum, P. cernuum e P. aduncum. A P. cernuum foi inativa

frente a todos os micro-organismos testados, incluindo, S. aureus, S. pyogenes, B.

subtilis (Gram positivas) e ainda E. coli (Gram negativas), na concentração máxima

testada de 1000 ppm. Já a P. amplum apresentou atividade contra B. subtilis (CIM

250 ppm), S. aureus (CIM 1000 ppm), e inatividade frente a S. pyogenes (Gram

143

positivas) e E. coli (Gram negativas). P aduncum também apresentou atividade

antimicrobiana frente a S. pyogenes (CIM 250 ppm), B. subtilis (CIM 62,5 ppm) e S.

aureus (CIM 31,25 ppm).

Zaidan et al. (2005) realizaram experimento avaliando a atividade

antimicrobiana de extratos metanólicos das folhas secas de P. sarmentosum, na

concentração de 2000 µg/disco, relatando atividade frente a S. aureus (halo de

inibição de 9 mm).

Diante disso, em comparação a Muller (2011) e Zaidan et al. (2005) que

realizaram procedimentos extrativos diretamente das partes aéreas, o presente

estudo optou pelo fracionamento do hidrolato, resultante das extrações dos óleos

essenciais com solventes em ordem crescente de polaridade, para a pesquisa de

atividade antimicrobiana. Sendo que esse produto também pode ser considerado

alvo de pesquisa para substâncias bioativas termorresistentes, em virtude da

atividade antimicrobiana apresentada.

O dado comum em todos os estudos, incluindo o presente, é a inatividade das

amostras testadas frente às bactérias Gram negativas, nas concentrações máximas

testadas. A literatura relata que bactérias Gram negativas são mais resistentes aos

antimicrobianos, devido a sua membrana externa (HANAMANTHAGOUDA et al.,

2010).

A atividade antibacteriana observada a partir dos halos de inibição de

crescimento microbiano encontrados na bioautografia frente a S. aureus, para as

frações diclorometando no verão e outono e fração acetato de etila no verão para P.

amplum, bem como para a fração acetato de etila no verão para P. cernuum, foi

também evidenciada no teste de diluição em ágar, demonstrando que a

bioautografia pode contribuir na busca de substâncias bioativas.

144

Tabela 12: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações (n=3).

Frações





Inve

rno

2012

Diclorometano 250 / 1000 1000 / > 1000 250 / 250 > 1000 / NR

Acetato de Etila 1000 / > 1000 > 1000 / NR 500 / 1000 > 1000 / NR

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano 125 / 500 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR

Acetato de Etila > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano 250 / 1000 1000 / > 1000 250 / 250 > 1000 / NR

Acetato de Etila 500 / 1000 > 1000 / NR 500 / 500 > 1000 / NR

Out

ono

2013

Diclorometano 250 / 500 1000 / 1000 250 / 250 > 1000 / NR

Acetato de Etila > 1000 / NR > 1000 / NR 1000 / 1000 > 1000 / NR


145

Tabela 13: Atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações (n=3).

Frações





Inve

rno

2012

Diclorometano 1000 / > 1000 1000 / > 1000 1000 / > 1000 > 1000 / NR

Acetato de Etila 500 / > 1000 > 1000 / NR > 1000 / NR > 1000 / NR

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano 500 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR

Acetato de Etila 1000 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano 1000 / > 1000 1000 / > 1000 500 / 500 > 1000 / NR

Acetato de Etila 500 / > 1000 > 1000 / NR 1000 / 1000 > 1000 / NR

Out

ono

2013

Diclorometano > 1000 / NR > 1000 / NR 1000 / > 1000 > 1000 / NR

Acetato de Etila 1000 / > 1000 > 1000 / NR 1000 / > 1000 > 1000 / NR


146

Figura 42: Análise comparativa da atividade antibacteriana das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.

147

Os resultados da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de

etila de P. amplum e P. cernuum obtidos a partir dos hidrolatos referentes às coletas

das quatro estações do ano (Tabelas 14 e 15), demonstram que as frações são

promissoras para os dermatófitos, bem como contra C. neoformans. As frações

diclorometano de P. amplum e P. cernuum, bem como a fração de acetato de etila

de P. cernuum, nesta ordem, foram as mais efetivas na atividade antifúngica, como

é demonstrado na Figura 43.

Neste estudo observou-se também a inatividade das frações diclorometano e

acetato de etila das duas espécies de Piper contra C. albicans na concentração

máxima testada de 1000 ppm, assim como observado por Muller (2011), para os

extratos etanólicos de P. amplum e P. cernuum frente a C. albicans, C. krusei, C.

parapsilosis e S. cerevisiae.

Foi possível observar diferenças nos resultados da atividade antimicrobiana

em relação às estações do ano, assim como para os óleos essenciais, o que pode

estar relacionado às variações químicas dos extratos analisados, atribuídas a

aspectos edáficos e climáticos que alteram a produção das substâncias ativas nas

plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Contudo, não foi possível estabelecer uma correlação direta entre a

sazonalidade, substâncias majoritárias e atividade antimicrobiana. Uma vez que, não

foi realizada avaliação da composição química das frações diclorometano e acetato

de etila para as duas espécies de Piper, por tratar-se de uma análise experimental

para utilização do hidrolato em pesquisa de substâncias bioativas.

148

Tabela 14: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper amplum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).

Frações






Inve

rno

2012

Diclorometano >1000 / NR 125 / >1000 62,5 / 125 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125

Acetato de Etila 1000 / >1000 250 / >1000 250 / 500 125 / 250 62,5 / 125 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano 250 / >1000 125 / 125 62,5 / 250 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 250 / 500

Acetato de Etila >1000 / NR 1000 / 1000 1000 / >1000 250 / 250 500 / >1000 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano 1000 / >1000 125 / 500 125 / 1000 62,5 / 125 62,5 / 125 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 250 / 1000

Acetato de Etila >1000 / NR 500 / >1000 500 / 500 250 / 500 62,5 / 1000 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Out

ono

2013

Diclorometano 500 / >1000 125 / 125 62,5 / 62,5 62,5 / 62,5 62,5 / 250 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125

Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 250 500 / >1000 500 / 500 250 / 500 > 1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).

149

Tabela 15: Atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de Piper cernuum, nas diferentes estações, frente a fungos filamentosos e leveduras (n=3).

Frações






Inve

rno

2012

Diclorometano >1000 / NR 250 / >1000 125 / 500 250 / 500 250 / 1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Acetato de Etila >1000 / NR 500 / >1000 250 / >1000 250 / >1000 250 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano >1000 / NR 125 / 125 125 / 125 125 / 500 125 / 250 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 125 / 125

Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 250 125 / 125 125 / 500 125 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano >1000 / NR 125 / 1000 125 / 125 62,5 / 1000 125 / 500 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 500 / 1000

Acetato de Etila >1000 / NR 250 / 1000 125 / 125 125 / >1000 62,5 / 500 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Out

ono

2013

Diclorometano >1000 / NR 250 / 250 125 / >1000 62,5 / 1000 125 / 1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR

Acetato de Etila >1000 / NR 500 / 500 250 / >1000 125 / >1000 125 / >1000 >1000 / NR >1000 / NR >1000 / NR 1000 / >1000

Microsporum canis (M. can); Microsporum gypseum (M. gyp); Trichophyton mentagrophytes (T. men); Trichophyton rubrum (T. rub); Epidermophyton flocosum (E. flo); Aspergillus fumigatus (A. fum); Rhizopus sp (Rhi sp); Candida albicans (C. alb); Cryptococcus neoformans (C. neo); Partes por Milhão (ppm); Não Realizado (NR).

150

Figura 43: Análise comparativa da atividade antifúngica das frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum, observados nos resultados do presente estudo.

151

5.7 Avaliação de Mutagenicidade Frente ao Saccharomyces cerevisiae

Mutações reversas consistem na restauração ou compensação de um defeito

gênico responsável por um requerimento nutricional. A linhagem haploide de

Saccharomyces cerevisiae (XV-185-14C) trata-se de um micro-organismo

geneticamente modificado para auxotrofia, ou seja, com necessidade de fatores de

crescimento, neste caso aminoácidos histidina, lisina e metionina (PARRY; PARRY,

1984; GASPARRI, 2005).

Para analisar a mutagenicidade, dos óleos essenciais e frações diclorometano

e acetato de etila obtidas da partição dos hidrolatos de P. amplum e P. cernuum nas

quatro estações, foi utilizado o teste de mutação reversa frente à linhagem haploide

acima citada. Foi avaliado a capacidade das amostras causarem mutação reversa

nesse micro-organismo tornando-o prototrófico, isto é, sem a necessidade de fatores

de crescimento. Esse ensaio também possibilita avaliar a citotoxicidade das

amostras.

Os resultados da avaliação da sobrevivência (citotoxicidade) para os óleos

essenciais de P. amplum, apresentados na Tabela 16, mostram que os tratamentos

não influenciam a viabilidade celular, porém as estações de inverno e verão

apresentaram diferença estatística significante quando comparadas com o controle

negativo (PBS), sugerindo que a sazonalidade pode influenciar no potencial

citotóxico.

Para os óleos de P. cernuum percebe-se o contrário, as estações do ano não

influenciaram a viabilidade celular, mas o tratamento de 25000 ppm apresentou

diferença estatística significante quando comparadas com o controle negativo (PBS),

sugerindo que o aumento de concentração pode potencializar a citotoxidade (Tabela

17).

Para as frações dicloromentano de P. amplum a sazonalidade não influenciou

a viabilidade celular, mas o tratamento de 1000 ppm apresentou diferença estatística

significante quando comparadas com o controle negativo (PBS), sugerindo que o

aumento da concentração pode reduzir a viabilidade celular (Tabela 18). Porém para

as frações acetato de etila de P. amplum tanto as estações de verão e primavera,

quanto os tratamentos de 1000 e 500 ppm, apresentaram diferença estatística

significante quando comparadas com o controle negativo (PBS), sugerindo que a

152

sazonalidade e aumento de concentrações pode reduzir a viabilidade celular (Tabela

18).

Os resultados das frações diclorometano e acetato de etila de P. cernuum,

apresentados na Tabela 19, demonstram que os tratamentos não influenciaram a

viabilidade celular, porém as estações de verão e inverno das frações

dicloromentano e a estação verão das frações acetato de etila, apresentaram

diferença estatística significante quando comparadas com o controle negativo (PBS),

sugerindo que a sazonalidade pode contribuir no potencial citotóxico.

Os resultados apresentados acima podem ser validados tendo em vista que

nos ensaios realizados o controle positivo (4 NQO) demonstrou baixa viabilidade

celular em todas as análises, apresentando diferença estatística significante quando

comparadas com o controle negativo (PBS), que apresentou 100% de viabilidade

celular, comprovando o potencial citotóxico do 4 NQO (Tabelas 16, 17, 18 e 19).

Estudos realizados por Péres et al. (2009) para avaliação da citotoxicidade

dos óleos essenciais de P. gaudichaudianum, utilizando ensaio cometa e teste de

micronúcleo, demonstraram que os óleos dessa espécie de Piper possuem forte

efeito citotóxico, genotóxico e mutagênico em células V79 (células de fibroblastos de

pulmão de Hamster chinês).

Assis et al. (2013) avaliaram a citotoxicidade em Artemia salina dos óleos

essenciais de P. cernuum, P. glabratum, P. hispidum e P. madeiranum, e

demonstraram que P. glabratum e P. madeiranum, com DL50 de 45,61 ppm e 49,64

ppm respectivamente, foram as mais tóxicas; P. cernuum apresentou toxicidadade

moderada, DL50 de 200,03 ppm e P. hispidum baixa toxicidade ou não toxicidade,

DL50 de 404,80 ppm.

Em análise prévia, dos resultados desta pesquisa, os óleos essenciais de P.

amplum não apresentaram citotoxicidade nas estações de primavera e verão, assim

como para todos os tratamentos analisados. E para P. cernuum também observou-

se ausência de potencial citotóxico para todas as estações do ano, bem como para

os tratamento de 6250 e 12500 ppm. Sugerindo que essas amostras são

promissoras para a continuidade de novas análises para a confirmação da ausência

de toxicidade.

Muller (2011) avaliou o potencial citotóxico de extratos de P. amplum e P.

cernuum, pelo ensaio com Artemia salina, relatando citotoxicidade para as amostras

analisadas.

153

No presente estudo também foi observado possível potencial citotóxico nas

frações de acetato de etila na primavera e verão, e nas concentrações de 1000 e

500 ppm, bem como nas frações diclorometano a 1000 ppm para P. amplum. Já

para P. cernuum o potencial citotóxico foi observado nas frações diclorometando no

inverno e verão, assim como para a fração de acetato de etila no verão.

De um modo geral os monoterpenos são considerados substâncias seguras,

no entanto dependendo da dose utilizada podem causar reações tóxicas. Já os

sesquiterpenos presentes em óleos essenciais têm seus efeitos citotóxicos descritos

sobre algumas linhagens de células tumorais. Como exemplos o E-nerolidol, β-

cariofileno e α-humuleno que são conhecidos pela atividade citotóxica, contra células

de adenocarcinoma renal (ACHN), carcinoma de protata, melanoma e câncer de

mama, porém sem conhecimento de seu mecanismo (PÉRES et al., 2009).

Assim sendo, é necessário que outras análises sejam realizadas para garantir

a segurança quanto ao potencial citotóxico das amostras de óleos e frações

dicloromentano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum.

154

Tabela 16: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. amplum nas quatro estações do ano.

Óleos Essenciais

Tratamento (ppm)

Sobrevivência (%) (media e desvio

padrão)

Revertentes his 1/108 sobreviventesa

(média e desvio padrão)c

Revertentes lis 1/108 sobreviventesb


Revertentes met 1/108 sobreviventesa


Inverno 2012***

25000 19,9 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 22,0 ± 2,1 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 29,7 ± 7,8 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Primavera 2012

25000 97,1 ± 4,2 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 12500 115,1 ± 2,1 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 147,4 ± 8,5 2,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0

Verão 2012/2013***

25000 33,6 ± 2,1 3,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 43,4 ± 3,5 2,0 ± 0,0 3,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 6250 44,4 ± 6,4 2,0 ± 1,4 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0

Outono 2013

25000 48,8 ± 9,9 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 87,7 ± 7,8 2,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 88,3 ± 0,7 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7

PBS 0 100,0 ± 3,5 1,5 ± 0,7 2 ± 0,0 1 ± 0,0 4 NQO 1 4,1 ± 3,5* 245 ± 17,0*** 301 ± 15,6*** 263 ± 22,6***

Nitroquinoleína-1-óxido (4 NQO 5µM – Controle Positivo); Tampão Salina Fosfato (PBS – Controle Negativo); aRevertentes de lócus-específico; bRevertentes de lócus não-específico; cmédia e desvio-padrão de dois experimentos independentes; Dados significativos em relação ao grupo controle negativo (PBS) *p<0,05; **p<0,001; ***p<0,0001 no teste ANOVA (Tukey HSD Test – honestly significant difference).

155

Tabela 17: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com os óleos essenciais de P. cernuum nas quatro estações do ano.

Óleos Essenciais

Tratamento (ppm)


padrão)







Inverno 2012

25000 19,2 ± 2,1*** 1,5 ± 0,7 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 24,0 ± 4,2 2,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 142,6 ± 6,4 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Primavera 2012

25000 30,1 ± 3,5*** 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 12500 40,4 ± 5,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 6250 88,9 ± 9,2 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7

Verão 2012/2013

25000 43,0 ± 8,5*** 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 12500 62,0 ± 9,2 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 6250 65,9 ± 7,1 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

Outono 2013

25000 35,6 ± 6,4*** 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 12500 59,8 ± 3,5 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 6250 69,1 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0

PBS 0 100,0 ± 5,7 0,5 ± 0,7 1 ± 0,0 2 ± 1,4 4 NQO 1 13,7 ± 2,1* 262,5 ± 17,7*** 283 ± 26,9*** 261,5 ± 38,9***


156

Tabela 18: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. amplum nas quatro estações do ano.

Frações Tratamento

(ppm)


padrão)







Inve

rno

2012

Diclorometano 1000 22,0 ± 1,4** 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 62,6 ± 0,7 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 74,2 ± 2,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Acetato de Etila

1000 59,0 ± 3,5* 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 60,8 ± 7,8* 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 73,8 ± 4,9 1,0 ± 0,0 1,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano

1000 45,4 ± 7,8** 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 80,9 ± 9,2 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 250 93,1 ± 3,5 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

Acetato de Etila*

1000 38,3 ± 8,5* 2,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 71,8 ± 6,4* 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 250 81,9 ± 9,2 2,0 ± 1,4 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano 1000 40,7 ± 4,2** 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 91,7 ± 7,8 2,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 106,4 ± 5,7 2,0 ± 1,4 0,5 ±0,7 0,0 ± 0,0

Acetato de Etila*

1000 44,0 ± 4,9* 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 500 48,0 ± 4,9* 2,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 55,0 ± 6,4 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Out

ono

2013

Diclorometano 1000 56,5 ± 7,1** 3,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 57,8 ± 3,5 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 250 96,4 ± 8,5 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0

Acetato de Etila

1000 66,4 ± 6,4* 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 70,0 ± 9,2* 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 88,6 ± 5,7 2,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0

PBS 0 100,0 ± 4,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2 ± 1,4 4 NQO 1 16,0 ± 5,7* 292 ± 19,8*** 267,5 ± 16,3*** 320,5 ± 17,7***


157

Tabela 19: Indução de mutação pontual (his 1-7 e lis 1-1) e mutação por deslocamento do quadro de leitura ou frameshift (hom 3-10) na linhagem haploide XV 185-14c de Saccharomyces cerevisiae, após o tratamento com as frações de diclorometano e acetato de etila de P. cernuum nas quatro estações do ano.

Frações Tratamento

(ppm)


padrão)







Inve

rno

2012

Diclorometano** 1000 23,0 ± 4,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 42,0 ± 9,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 46,6 ± 7,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Acetato de Etila 1000 62,1 ± 9,9 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 500 99,7 ± 5,7 1,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 100,9 ± 3,5 1,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7

Prim

aver

a 20

12 Diclorometano

1000 77,8 ± 4,9 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 500 89,3 ± 7,8 2,5 ± 07 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 250 113,1 ± 5,7 2,0 ± 0,0 2,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0

Acetato de Etila 1000 69,3 ± 7,1 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 500 103,5 ± 7,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 133,6 ± 9,2 2,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 2,5 ± 0,7

Ver

ão

2012

/201

3 Diclorometano** 1000 28,4 ± 1,4 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 500 35,0 ± 7,8 0,5 ± 0,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 250 39,5 ± 6,4 1,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7

Acetato de Etila*

1000 44,0 ± 9,9 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,7 2,0 ± 0,0 500 47,7 ± 5,7 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 2,0 ± 1,4 250 52,8 ± 7,8 0,0 ± 0,0 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7

Out

ono

2013

Diclorometano 1000 60,7 ± 9,2 1,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 1,0 ± 1,4 500 65,4 ± 3,5 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,0 ± 0,0 250 98,4 ± 4,9 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

Acetato de Etila 1000 99,5 ± 8,5 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 500 102,3 ± 5,7 0,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 250 109,1 ± 4,9 1,5 ± 0,7 1,5 ± 0,7 0,5 ± 0,7

PBS 0 100,0 ± 9,9 1,5 ± 0,7 1 ± 1,4 1 ± 0,0 4 NQO 1 14,5 ± 4,9* 261 ± 18,4*** 320,5 ± 19,1*** 289 ± 19,8***


158

A partir dos resultados da avaliação da mutagenicidade, os óleos essenciais e

frações diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes

estações do ano e nas diferentes concentrações, não apresentaram atividade

mutagência sobre a linhagem haploide de S. cerevisiae (XV-185-14C) de revertentes

de his 1/108 sobreviventes, revertentes de lis 1/108 sobreviventes e revertentes de

hom 1/108 sobreviventes, na concentração máxima testada de 25000 ppm para os

óleos essenciais e 1000 ppm para as frações. Além disso, também pode-se observar

pela análise estatística que a sazonalidade não influenciou o potencial mutagênico

das amostras analisadas no presente estudo (Tabelas 16, 17, 18 e 19).

O controle negativo (PBS) apresentou um pequeno crescimento microbiano

em todos os ensaios, o que sugere que esse micro-organismo é revertente de

histidina, lisina e metionina de forma espontânea. Logo, desconsiderando o

crescimento microbiano espontâneo, assegura-se mais efetivamente a ausência de

potencial mutagênico das amostras testadas.

Nos experimentos realizados, o controle positivo (4 NQO) demonstrou

mutação aumentada de revertentes de his 1/108 sobreviventes, revertentes de lis

1/108 sobreviventes e revertentes de hom 1/108 sobreviventes, comprovando sua

mutagenicidade conhecida.

Santin et al. (2011) avaliaram a mutagenicidade do extrato etanólico das

partes aéreas de P. aduncum e Muller (2011) avaliou a mutagenicidade dos extratos

etanólico das partes aéreas de P. cernuum, P. amplum e P. aduncum frente à

linhagem haploide de S. cerevisiae (XV-185-14C). Os autores observaram ausência

de potencial mutagênico na concentração máxima testada de 500 ppm.

No presente estudo, as frações diclorometano e acetato de etila das duas

espécies de Piper analisadas, não demonstraram mutagenicidade neste mesmo

ensaio, na concentração máxima testada de 1000 ppm, sugerindo uma maior

segurança quanto a concentração, quando comparadas com os resultados

encontrados por Santin et al. (2011) e Muller (2011).

Em estudo realizado por Gomes-Carneiro et al. (2005), através do teste de

Ames, observou-se que α-pineno não apresentou genotoxicidade nem

mutagenicidade. Connor e demais pesquisadores em 1985, utilizaram o mesmo

teste supracitado, e apresentaram resultado negativo para mutagenicidade do

limoneno. Ainda, Bakkali et al. (2008) também descreve que α-pineno e limoneno

são substâncias desprovidas de mutagenicidade.

159

As afirmações de Gomes-Carneiro et al. (2005), Connor et al. (1985) e Bakkali

et al. (2008) vão de encontro aos resultados de ausência de potencial mutagênico

dos óleos essenciais de P. amplum e P. cernuum no presente estudo, destacando

que α-pineno é uma das substâncias majoritárias presente nos óleos essenciais de

P. amplum (10,29 a 14, 86%), e P. cernuum (2,63 a 5,43%), bem como Limoneno

nos óleos essenciais de P. amplum (5,10 a 6,45%), mas também presente nos óleos

de P. cernuum (0,27 a 0,57%).

De acordo com Oga (2003), os testes de mutagênese têm sido utilizados

como testes de triagem para prever o potencial carcinogênico de substâncias, no

entanto, esses testes somente avaliam as substâncias que causam câncer por

mecanismos mutagênicos, ou seja, com ação direta no material genético. Sendo

assim, quando observa-se resultados negativos de mutagenicidade frente a S.

cerevisiae, considera-se um indicativo de que essas substâncias não possuem ação

carcinogênica, no entanto o câncer pode se desenvolver por outros mecanismos não

mutagênicos, logo outros testes devem ser realizados.

A partir de todos os testes realizados com os óleos essenciais e frações

diclorometano e acetato de etila de P. amplum e P. cernuum nas diferentes estações

do ano, os resultados são animadores quanto ao potencial antimicrobiano e a

segurança. Porém ainda se faz necessário a continuidade de pesquisas com essas

duas espécies de Piper, especialmente quanto à análise química das frações obtidas

a partir de hidrolato resultado de extração de óleo essencial, além de diferentes

testes quanto à citotoxicidade e mutagenicidade para obtenção de substâncias

bioativas mais seguras.

160

6 CONCLUSÕES

• A sazonalidade influenciou no rendimento, na composição química, na

atividade antimicrobiana e no potencial citotóxico das amostras testadas;

• Análises por CG/EM, índice de retenção e RMN 13C, permitiu identificar quali

e quantitativamente 43 e 27 substâncias nos óleos essenciais de P. amplum e P.

cernuum respectivamente;

• As substâncias majoritárias encontradas nos óleos de P. amplum foram β-

cariofileno, α-pineno, cadin-4-en-7-ol, α-guaieno, α-copaeno, germacreno D,

limoneno e germacreno B;

• As substâncias majoritárias encontradas nos óleos de P. cernuum foram

trans-dihidroagarofurano, 4-epi-cis-dihidroagarofurano, γ-eudesmol, β-cariofileno,

elemol, α-pineno, canfeno;

• Os óleos de P. amplum e P. cernuum apresentaram-se ativos contra bactérias

Gram positivas, dermatófitos e levedura oportunista C. neoformans, com potencial

citotóxico mais evidenciado no inverno e verão, para P. amplum, e na concentração

de 25000 ppm para P. cernuum, porém sem atividade mutagênica em todas as

estações, nas diferentes concentrações;

• As frações diclorometano e acetato de etila provenientes do fracionamento

dos hidrolatos de P. amplum e P. cernuum apresentaram atividade antibacteriana

frente a bactérias Gram positivas e apresentaram-se promissores para os

dermatófitos e levedura oportunista C. neoformans;

• A citotoxicidade das frações diclorometano e acetato de etila, para P. amplum

e P. cernuum, sofreram influência da sazonalidade e das concentrações utilizadas,

porém sem evidência quanto ao potencial mutagênico, em todas as estações e

concentrações utilizadas;

• Foi possível observar diferenças nos resultados da atividade antimicrobiana e

potencial citotóxico em relação às estações do ano, tanto para os óleos essenciais

quanto para as frações, entretanto, para os óleos essenciais, não foi possível

relacionar de forma direta a variação da composição quantitativa, nas diferentes

estações do ano, com a maior efetividade da atividade antimicrobiana e aumento do

potencial citotóxico.

161

REFERÊNCIAS

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