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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

ANA CRISTINA SANCHES FLUMIGNAN

AVALIAÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS NA REDUÇÃO ENZIMÁTICA DO NITRATO PARA FINS ANALÍTICOS

MOGI DAS CRUZES, SP

2006

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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

ANA CRISTINA SANCHES FLUMIGNAN

AVALIAÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS NA REDUÇÃO ENZIMÁTICA DO NITRATO PARA FINS ANALÍTICOS

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em biotecnologia Área de Concentração: Exatas

Orientador: Prof. Dr. André Fernando de Oliveira

Mogi das Cruzes, SP

2006

FINANCIAMENTO: FAPESP, FAEP E DAEE/FAEP

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao Divino Mestre Jesus que em todos os

momentos tem sido sempre meu melhor amigo e companheiro.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos os meus amigos e familiares pelo apoio, pela

amizade e pela preocupação.

Agradeço muito a minha mãe pelo exemplo de humildade,

simplicidade, bondade e força constante.

Agradeço meu pai por me proporcionar as oportunidades de

estudar, trabalhar e na realização de meus objetivos.

Agradeço ao meu companheiro João pela paciência, carinho,

esforço, dedicação e ao seu amor.

Agradeço ao Vô Zé, Vó Antônia e a Madrinha Belica (in

memorian) pela educação, amor e carinho dispensados.

Agradeço a Vó Clarice e ao Padrinho Roberto pelo amor e

auxílio por toda a vida.

Agradeço aos meus irmãos Zeca e Angelica pela união e

companheirismo.

Agradeço a Neila e Pedro por estarem sempre presentes,

incentivando e por vossa ajuda quando aqui cheguei.

Agradeço a Vilma A.Guimarães e a João F. Machado por me

cederem seus dias de folga, sem eles não teria tempo para concluir as

cinéticas.

Agradeço em especial a minha grande amiga Josi pela sua

ajuda inesgotável em todos os sentidos.

Agradeço de coração a verdadeira amizade que encontrei nesta

pessoa maravilhosa, que considero como meu irmão: Alexandre Correia de

Lima.

Agradeço do fundo da minha alma tudo que todos do

laboratório fizeram por mim (e não foi pouco): Alexandre Amâncio, Jonas,

Mônica, Débora, Sebastian, Aline Calixto, Aline Abbib, Hosney e Sérgio.

Agradeço a Professora Elisa e ao Professor Nelson pela

RESUMO Nitrato e nitrito são íons incolores, inodoros altamente solúveis em água e fracamente retidos no solo. Uma vez na água, o nitrato, devido a sua alta estabilidade e solubilidade, além de não formar espécies voláteis em equilíbrio-ácido base, permanece na água até a sua utilização por plantas e outros microrganismos. Por estes motivos, muitos estudos usam o nitrato como indicador potencial de poluição da água. Com o excesso de nitrato em ambiente aquático, as plantas aquáticas e algas podem se reproduzir excessivamente (eutrofização), caso haja disponibilidade de outros nutrientes (principalmente fósforo) e, eventualmente ocorrer uma grande diminuição do oxigênio dissolvido e causar a morte de espécies aeróbias, assim como impedir a realização da fotossíntese por algas e plantas submersas devido ao bloqueio da luz solar. Ao ser ingerido, o nitrato é rapidamente absorvido pelo trato gastrintestinal superior e poderá ser reduzido a nitrito devido à ação de nitrato redutases bacterianas, que poderão estar presentes na cavidade oral, estômago, intestino delgado, intestino grosso e bexiga. No sangue humano o nitrito ao chegar na corrente sanguínea pode causar metahemoglobinemia, ou seja, o íon ferroso da hemoglobina fica suscetível à oxidação pelo nitrito para a forma férrica que é instável para o transporte de oxigênio. Outro risco potencial a saúde é a formação do N-nitroso carcinogênico (também conhecido como nitrosaminas ou nitrosamidas) obtidos da reação entre amidas ou aminas secundárias ou terciárias. Por estes motivos existe a necessidade de um versátil, rápido e econômico ensaio para nitrato que permita a determinação precisa do mesmo para diversas amostras como água, alimentos e fluidos corporais humanos. Dentre os diversos métodos conhecidos para a determinação de nitrato a estratégia mais utilizada consiste na sua redução para nitrito e posterior determinação deste último, mediante, por exemplo, a reação de Griess. Geralmente cádmio metálico é o agente redutor preferido porque fornece uma redução quantitativa de nitrato para nitrito com desprezível redução de nitrito para espécies inferiores. Contudo, este redutor apresenta algumas desvantagens sendo a principal delas a geração de resíduos tóxicos. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação de extratos brutos como fontes enzimáticas alternativas de baixo custo, para a redução do nitrato em amostras de água, com fins analíticos. Os testes foram divididos em três grupos de acordo com a fonte de nitrato redutase: o uso de cepas ou espécies distintas de fungos do gênero Fusarium, o uso de apenas um tipo de cepa de Escherichia coli e algumas fontes de origem vegetal como alface, gengibre e broto de feijão. Após a reação enzimática do nitrato com nitrato redutase o nitrito foi determinado com auxílio da reação de Griess. Quando se utilizou nitrato redutase de broto de feijão o método apresentou boa linearidade, baixa turbidez, boa eficiência (73%) e muitas vantagens quando comparados com as fontes de Nar microbiológicas e demais fontes vegetais: o preparo é rápido e muito fácil, tempo de reação curto, os equipamentos utilizados são simples, não descarta metais pesados, é inócuo para os analistas.

Palavra-chave: Nitrato redutase, determinação de nitrato, nitrito.

ABSTRACT Nitrate and nitrite are colorless, inodorous ions, highly soluble in water and weakly retained in the soil. Once in water, nitrate, because of its high stability and solubitity, besides not forming volatile species in acid-base equilibrium, it remains in water until its use by plants and other microorganisms. For these reasons, plenty of studies use the nitrate as a potential indicator of the water pollution. With the excess of nitrate in aquatic environment, aquatic plants and seaweed can reproduce in excess (eutrophication), in case there is availability of other nutrients (especially phosphorus) and, occasionally occur a large diminish of dissolved oxygen and cause death of aerobic species, as well as to block the accomplishment of photosynthesis by seaweeds and submerged plants because of the block of the solar light. Upon being swallowed, the nitrate is rapidly absorbed by the tract gastrointestinal upper and can be reduced to nitrite because of the action nitrate reductases bacterial, which can be present in the oral cavity, stomach, small intestine, large intestine and bladder. In the human blood, upon arriving in the blood flux the nitrite can cause methemoglobinemia, i.e., the ferrous ion of hemoglobin gets susceptible to the oxygenation by nitrite to the ferric form, which is unstable to the transportation of oxygen. Another potential risk to health is the formation of N-nitroso carcinogenic (also known as nitrosamines or nitrosamides) obtained from the reaction between amides or secondary or tertiary amines. For these reasons there is the necessity of a versatile, fast and economic essay to nitrate which allows the precise determination of it for several samples as water, food and human corporal fluids. Among the several methods known to the determination of nitrate, the most used strategy consists in its reduction to nitrite and later determination of this last one, through, for instance, the reaction of Griess. Usually metallic cadmium is the preferred reduction agent because it supplies a quantitative reduction of nitrate to nitrite with despicable reduction of nitrite to inferior species. However, this reduction agent shows some disadvantages, and the main one is the formation of toxic residues. The present work had as objective the evaluation of rough extracts as alternative enzymatic sources of low cost, for the reduction of nitrate in samples of water, with analytical ends. The tests were divided into three groups, according to the source of nitrate reductase: the use of strain or distinct species of fungi of the kind Fusarium, the use of just one kind of strain of Escherichia coli and some sources of vegetal origin as lettuce, ginger and beans sprout. After the enzymatic reaction of the nitrate with nitrate reductase the nitrite was determined with the auxiliary of the reaction of Griess. When nitrate reductase of beans sprout was used the method showed good linearity, low dimness, good efficiency (73%) and lots of advantages when compared to the sources of microbiological nitrate reductase and others vegetal sources: the preparation is fast and very easy, time of reaction is short, the used equipments are simple, it does not discard heavy metals, it is innocuous to the analysts.

Keywords: Determination of nitrate, nitrate reductase, nitrite.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Estruturas químicas dos reagentes usados na reação de Griess 22

Figura 2 – Mecanismo para as etapas de diazotação. . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Figura 3 – Espectro de absorção na região do visível do composto

produzido na etapa de acoplamento na reação de Griess. . . . . . 23

Figura 4 – Interação dos doadores e aceptores de elétrons com nitrato 28

Figura 5 – Diferentes espécies de Fusarium após 7 dias de crescimento. . 31

Figura 6 – Discos de micélio - ágar crescendo em meio de cultura líquido. 32

Figura 7 – Suspensão enzimática antes da filtração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Figura 8 – Avaliação dos extratos de F.cacus e F.oxysporum como fontes

enzimáticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Figura 9 – Avaliação da atividade da nitrato redutase com meio reacional

com água ou tampão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Figura 10 – Avaliação da biomassa da espécie cactus como fonte

de nitrato redutase em diferentes meios. . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Figura 11– Avaliação da atividade da nitrato redutase proveniente

da espécie cactus com diferentes proporções de biomassa. . . 46

Figura 12 – Influência de ácido ascórbico e glicose na atividade da nitrato

redutase proveniente da biomassa da espécie cactus . . . . . . . . 47

Figura 13 – Espectro evidenciando uma banda a 260 nm característica do

NAD+.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Figura 14 – Estudo do efeito da concentração de vitamina C no

sobrenadante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Figura 15 – Estudo do efeito da concentração de vitamina C no meio

ressuspendido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Figura 16 – Avaliação da atividade da Nar em meio reacional com

presença de sulfito de sódio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Figura 17– Avaliação da atividade da Nar em meio reacional com

ausência de oxigênio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Figura 18– Diversas concentrações de nitrato em meio em anaerobiose. . . 53

Figura 19 – Avaliação da atividade da nitrato redutase proveniente da

cepa n˚ 69. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Figura 20 – Teste utilizando Escherichia coli como fonte de Nar. . . . . . . . 55

Figura 21 – Curva analítica da concentração de nitrito formado e a

concentração de nitrato adicionado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

Figura 22 – Produção de Nar em condições anaeróbicas de crescimento 57

Figura 23 – Teste utilizando broto de feijão como fonte de Nar. . . . . . . . . 58

Figura 24 – Utilizando o protetor polivinilpirrolidona (PVP-VA). . . . . . . . 59

Figura 25 – Utilizando o protetor PVP-VA com diferentes concentrações

de nitrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Figura 26 – Utilizando diferentes concentrações do protetor PVP-VA. . . . 61

Figura 27 – Utilizando uma concentração de 0,04 g/mL do protetor

PVP-VA em diferentes concentrações de nitrato. . . . . . . . . . 62

Figura 28 – Curva analítica da concentração de nitrito formado em função

da concentração de nitrato adicionado em tecido vegetal. . . . 63

Figura 29 – Avaliação da atividade da Nar em diferentes concentrações

de nitrato e pHs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Figura 30 – Avaliação do poder tamponante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Figura 31 – Avaliação do poder tamponante, considerando os valores de

eficiência máxima para as concentrações de fosfato no meio

reacional. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO NITRATO E NITRITO. . . . . 12

1.2 ASPECTOS AMBIENTAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3 ASPECTOS TOXICOLÓGICOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.4 ASPECTOS DE LEGISLAÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.5 INTERESSE NA DETERMINAÇÃO DE NITRATO. . . . . . . . . . . . 17

1.6 ASPECTOS ANALÍTICOS NA DETERMINAÇÃO DE NITRATO. 18

2 OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3 MÉTODO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.1 CONDIÇÕES REACIONAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.1.1TESTE UTILIZANDO FUSARIUM COMO FONTE DE NITRATO REDUTASE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31

3.1.2 TESTE UTILIZANDO ESCHERICHIA COLI COMO FONTE DE NITRATO RESUTASE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

3.1.3 TESTE UTILIZANDO VIGNA RADIATA L. COMO FONTE DE NITRATO REDUTASE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

35

3.2 MATERIAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.4 REAGENTES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.5 EQUIPAMENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4 RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5 CONCLUSÕES E ETAPAS FUTURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO NITRATO E NITRITO

O íon nitrato é a base conjugada do ácido nítrico (HNO3) ácido forte (pKa = -1,37) que

se dissocia em água formando íons nitrato. O íon nitrito por sua vez é a base conjugada do

ácido nitroso (HNO2), ácido fraco (pKa = 3,37).(ANDRADE, 2004)

Nitrato e nitrito são íons incolores (o nitrato apresenta um máximo em 220 nm),

inodoros, altamente solúveis em água e fracamente retidos no solo.(NOLLET, 2000)

Enquanto nitrato é muito estável, o nitrito é altamente reativo e estão distribuídos

naturalmente em alimentos vegetais e animais.(FOX, 1983)

1.2 ASPECTOS AMBIENTAIS

Concentrações de nitrito em sistemas aquáticos geralmente são encontradas em valores

abaixo da concentração de 0,5 mg N/L devido a sua tendência a ser oxidado para nitrato.

Altas concentrações de nitrito podem estar indicando poluição de água em estuários ou

proximidades levando à redução da atividade microbiana. A poluição de corpos d’água por

fontes de nitrogênio usualmente começa com a introdução de fezes, urina, animais mortos ou

plantas. Por exemplo, os primeiros contêm quantidades apreciáveis de nitrogênio incorporado

aos compostos orgânicos, enquanto que a urina que contém nitrogênio na forma de uréia. A

ação bacteriana sob a matéria orgânica resulta em degradação e liberação de amônia que

poderá ser oxidada aerobicamente a nitrito por bactérias como as

Nitrossomonas.(ANDRADE, 20004)

NH3 + 2H2O → NO2 + 7H+ + 6e

13

que, por sua vez se converte a nitrato pela ação de bactérias como Nitrobacter:

NO2 + H2O NO3¯ + 2H+ + 2e

Por outro lado, as concentrações de nitrato em águas profundas dos mares e

reservatórios naturais de água não poluída estão, usualmente, abaixo de 0,05 mg N/L. Em

reservatórios rasos e superfícies de córregos a concentração pode variar desde valores

menores que 0,1 mg N/L até 20 mg N/L dependendo, por exemplo, do tipo de solo e do uso

da terra nas proximidades dos reservatórios.

Quando o nitrato está presente nas águas, devido a sua alta estabilidade e solubilidade,

além do fato de não formar espécies voláteis em equilíbrios ácido-base, ele permanece na

água até sua utilização por plantas e outros microrganismos. Por estes motivos, muitos

estudos usam o nitrato como indicador potencial de poluição da água. A contaminação do

meio ambiente pelo nitrato pode ocorrer principalmente através:

•

•

•

•

Uso intensivo de fertilizantes químicos nitrogenados e de compostagem, uma vez que

o rendimento da agricultura depende muito do suprimento de nitrato no

solo.(BORCHEDING, 2000; ZHU, 2006)

As águas de chuva e de irrigação ao atingir o solo podem solubilizar e transportar

nitrato e nitrito solubilizados até reservatórios de água.

Descartes de efluente doméstico municipal e industrial, sistemas de descartes e

detritos, uma vez que esses contêm uma grande quantidade de nitrogênio orgânico e amônia.

Após um período de tempo, estas espécies em ambiente aeróbio podem ser transformadas

para nitrato.

Alta população de gado em pequenas áreas com grande produção de esterco.

Com o excesso de nitrato em ambiente aquático, as plantas aquáticas e algas podem se

reproduzir excessivamente (eutrofização), caso haja disponibilidade de outros nutrientes

(principalmente fósforo) e, eventualmente ocorrer uma grande diminuição do oxigênio

dissolvido e causar a morte de espécies aeróbias, assim como impedir a realização da

fotossíntese por algas e plantas submersas devido ao bloqueio da luz solar.(ANDRADE,2004)

14

Outros efeitos negativos da eutrofização são: desenvolvimento excessivo e prejudicial

de algas, provocando alterações profundas da biota, com a substituição de espécies de peixes

e outros organismos. Quando essas algas começam a morrer há decomposição de matéria

orgânica, causando um aumento no consumo do oxigênio dissolvido e anóxia. Ainda,

degradação da qualidade da água, com alterações de composição, cor, turbidez, transparência,

liberação de gases e produção de maus odores, levando a prejuízos consideráveis para o

tratamento para água de abastecimento, irrigação e para aproveitamentos hidroelétricos, como

prejuízos para recreação, turismo e paisagismo, além do aumento da evaporação, elevação de

nível e entraves para o escoamento das águas, condições propícias para a criação de

mosquitos, larvas e outros vetores. Mas, a preocupação principal é com a produção de

substâncias tóxicas, as hepatotoxinas e neurotoxinas.(AZEVEDO NETO,1988)

De maneira geral, os nutrientes que devem ser removidos ou ter suas cargas reduzidas

nos efluentes são nitrogênio e o fósforo, pois são considerados os principais limitantes ou

controladores da produtividade primária.

1.3 ASPECTOS TOXICOLÓGICOS

Do ponto de vista fisiológico, ao ser ingerido, o nitrato é rapidamente absorvido pelo

trato gastrintestinal superior e poderá ser reduzido a nitrito devido à ação de Nars (nitrato

redutases) bacterianas, que poderão estar presentes na cavidade oral, estômago, intestino

delgado, intestino grosso e bexiga.(WARD, 2005; LUNDBERG, 2004)

Nitratos e nitritos além de estarem presentes em diversas concentrações em diversos

vegetais (Tabela 1) também são utilizados na indústria alimentícia como aditivos intencionais

na tecnologia de produtos cárneos devido à capacidade do nitrito de combinar-se com a

mioglobina presente na carne, originando o pigmento óxidonitricomioglobina, pigmento este

responsável pela cor avermelhada da carne curada.

15

Tabela 1: Concentrações de nitrato e nitrito presente em alguns vegetais.

Vegetal NO3-/ ppm NO2

- / ppm Repolho 784 0,5

Pepino 24 0,5

Berinjela 302 0,5

Alface 1.100 0,4

Cenoura 72 0,6

Espinafre 2.200 0,7

Brócolis 464 1,0

Couve-Flor 254 1,1

O nitrato de potássio é utilizado na elaboração de queijos já que inibe o crescimento de

bactérias do tipo Clostridium butyricum, presentes no leite e que produzem fermentações

indesejáveis, podendo comprometer a qualidade do produto.

Tanto nitrato como nitrito têm sido utilizados como protetores contra Clostridium

botulinum, mas estudos revelam que esta proteção é insuficiente quando há abundância de

esporos resistentes.(TURRA, 1999)

O nitrito ao chegar na corrente sanguínea pode causar metahemoglobinemia, ou seja, o

íon ferroso da hemoglobina fica suscetível à oxidação pelo nitrito para a forma férrica que é

instável para o transporte de oxigênio onde a oxihemoglobina passa a ser chamada de

metahemoglobina.(COSS, 2004; YANG, 2005; SILVA, 1998; FANQUIN, 2005)

Apenas uma quantidade muito pequena de metahemoglobina se encontra presente no

sangue normal (até 2%), pois o eritrócito (hemácia) possui um sistema efetivo para reduzir o

Fe3+ hemínico de volta ao estado Fe2+ chamado de sistema NADH-citocromo b5

metahemoglobina redutase. Ele consiste de NADH produzido pela glicólise, uma

flavoproteína denominada citocromo b5 redutase (também conhecida como metahemoglobina

redutase) e citocromo b5 que é então regenerado pela ação do citocromo b5

redutase.(MURRAY, 1998)

Existem duas situações em que hemácias produzem metahemoglobinemias:

- Metahemoglobinemia hereditária: existe uma deficiência da atividade da

metahemoglobina redutase que é transmitida de forma autossômica recessiva;

16

- Metahemoglobinemia adquirida: em que a metahemoglobina é causada devido à

ingestão de drogas ou substâncias químicas como, por exemplo, o nitrato que poderá ser

reduzido a nitrito.(LORENZI, 1999)

A atenção maior deve ser voltada para os indivíduos mais suscetíveis que são:

- Crianças lactentes de até três meses de idade, pois a atividade da NADH-citocromo b5

redutase é de aproximadamente de 50-60% da atividade encontrada em adultos. Do mesmo

modo o pH intestinal de crianças é altamente suficiente para contribuir para o crescimento de

organismos intestinais que são particularmente eficientes na conversão do nitrato ingerido

para nitrito.(ZEMAN, 2002)

- Indivíduos com acidez gástrica reduzida que resulta na proliferação de espécies

bacterianas capazes de reduzir nitrato para nitrito.(GEFFNER, 1981)

- Mulheres grávidas, uma vez que o nitrito é conhecido por causar aborto espontâneo e

ser teratogênico.

Os sinais mais evidentes ocorrem quando acima de 10 % da hemoglobina se encontra na

forma de metahemoglobina que são descolorações azuladas da pele e mucosas (cianose), já

acima de 30% os sintomas são fadiga, dor de cabeça, taquicardia e vertigem. Acima de 55% a

60 % a oxigenação dos tecidos fica inadequada podendo resultar em dispnéia, acidose,

arritmias, paralisias, coma e convulsões. A morte pode acontecer a níveis acima de 70 %

(FURLANI, 2006)

O diagnostico pode ser suspeitado quando além dos sinais e sintomas uma amostra de

sangue está com a coloração marrom e não avermelhada quando exposta ao ar.(FINAN, 1988)

Devido ao aspecto não convencional das membranas e mucosas a metahemoglobinemia

costuma ser referida como doença do sangue azul e quando ocorre em crianças síndrome do

bebê azul.

Os casos de intoxicação estão geralmente relacionados com a ingestão de água contendo

mais de 100mg/L de NO3-. Também tem sido observado prejuízo na função da tireóide,

decréscimo na alimentação e interferência no metabolismo das vitaminas A e E .(SANTOS,

2005)

Outro risco potencial a saúde é a formação do N-nitroso carcinogênico (também

conhecido como nitrosaminas ou nitrosamidas) obtidos da reação entre amidas ou aminas

secundárias ou terciárias.(KIANG, 1978)

As nitrosaminas (ou nitrosamidas) estão presentes em produtos alimentícios,

farmacêuticos, amostras ambientais (água, solo, ar...), pesticidas herbicidas, cosméticos, etc.

17

As nitrosaminas são um dos carcinógenos mais potentes e versáteis, produzindo

tumorações em muitas espécies e praticamente em todos os órgãos do corpo. São rapidamente

metabolizadas e em indivíduos suscetíveis apenas uma dose pode produzir tumorações, sendo

considerado o nível de exposição tolerável pelo homem para nitrosaminas mais voláteis é de

5 a 10 µg/Kg .(SANCHES, 2003)

Mesmo evitando o consumo de produtos contendo nitrosaminas, estudos in vitro,

envolvendo nitrito e aminas secundárias, têm mostrado que o suco gástrico de mamíferos

prova ser um excelente meio para a produção de derivados do nitroso.(DOMBROWSKI,

1972)

Embora os vegetais sejam ricos em nitrato, visto que a planta absorve nitrato como

fonte de nitrogênio para seu crescimento, os índices epidemiológicos do risco de câncer são

menores devido a fatores protetores como α-tocoferol e ácido ascórbico presentes nestes

alimentos (são conhecidos como inibidores da formação de compostos N-nitroso).

1.4 ASPECTOS DE LEGISLAÇÃO

Segundo a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos o nível máximo

considerado de contaminação para nitrato em água ingerida é 0,16 mmol/L, sendo

recomendada pela Organização Mundial de Saúde a ingestão diária é de 0,003 mg de

nitrato/kg de peso corporal.(BORCHERDING, 2000)

1.5 INTERESSE NA DETERMINAÇÃO DE NITRATO

O interesse na quantificação de nitrato em fluidos biológicos tem aumentado

significativamente desde a elucidação das propriedades do óxido nítrico (NO) em diagnóstico

clínico.(GRANGER, 1996)

O NO é um produto da L-arginina na presença da NO sintetase (E.C 1.14.13.39) em

diferentes tipos celulares.

18

Muitos estudos quantitativos têm usado medidas de nitrato e nitrito (já que são produtos

estáveis da oxidação de NO) em sistemas biológicos e culturas celulares como índice da

produção de NO uma vez que a determinação direta do NO é difícil por ele ser um radical

livre liberado pelas células em concentrações na ordem de pmol/L e nmol/L e tem um curto

tempo de vida.(SCHIMIDT,1995; LI, 2000)

Além do mais, NO é relativamente instável em presença de oxigênio e é rapidamente e

espontaneamente auto-oxidado em uma das fases do gás para produzir uma variedade de

óxidos de nitrogênio em solução aquosa.(GRISHAM, 1996)

Clinicamente os níveis de nitrato aumentam no soro após septsemia e gastrenterite. No

fluido cerebroespinhal, os níveis de nitrato e nitrito aumentam após meningite e Síndrome de

Parkinson. Crianças com síndrome nefrótica apresentam teores elevados de nitrato na urina.

Na urina de pacientes com artrite reumatóide os valores de nitrato e creatina aumentam três

vezes em relação aos níveis normais, e duas vezes em pacientes com infecção gastroentérica.(

FRIEDBERG, 1997; DEMBNY, 1998)

Por estes motivos existe a necessidade de um versátil, rápido e econômico ensaio para

nitrato que permita a determinação precisa do mesmo para diversas amostras como água,

alimentos e fluidos corporais humanos.

1.6 ASPECTOS ANALÍTICOS NA DETERMINAÇÃO DE NITRATO

São inúmeros os métodos para determinação e monitoramento de nitrato em água,

fluidos corporais humanos, plantas e solo e podem ser divididos em duas categorias:

A) Direto:

Com detecção direta, no UV (220 nm), ou com uso de eletrodo íon seletivo, ou por

derivatização, nitração de acido salicílico, nitração de fenóis, cromatografia a gás após

19

derivatização, cromatografia de íons, eletroforese capilar direta e indireta, polarografia. Os

métodos diretos podem ser:

A1) Métodos diretos sem derivatização

A2) Métodos diretos com derivatização

B) Indireto - Redução de espécies do nitrogênio

Com redução a nitrito e detecção espectrofotométrica, eletroquímica,

quimioluminescência. Com redução para amônia e detecção espectrofotométrica,

potenciométrica, condutimétrica. Ou ainda, com redução a óxidos gasosos com detecção de

quimioluminescência. A redução poderá ser:

B1) Redução heterogênea do nitrato

B2) Redução homogênea para nitrito

B3) Redução fotoquímica

B4) Redução enzimática

A.1- Métodos Diretos Sem Derivatização

A medida direta de nitrato, em 220 nm, como método padrão de análise não requer

nenhum reagente adicional e é adequado para amostras com baixo teor de matéria orgânica,

água natural não contaminada e água potável. Devido à matéria orgânica dissolvida também

absorver em 220 nm e nitrato não absorver a 275 nm, uma segunda medida pode ser usada

para corrigir o valor de nitrato.

Assim, dentre os interferentes a matéria orgânica dissolvida é a principal, embora

surfactantes, nitrito, e Cr (VI) também interfiram nessa determinação, além de vários íons

inorgânicos não encontrados em quantidades apreciáveis em água natural.

O eletrodo íon-seletivo para nitrato é um sensor potenciométrico com uma faixa

analítica usual de 10-5 e 10-1 mol/L (0,14 a 1400 mg NO3- N/L). O eletrodo mais comum é

baseado em um par iônico formado com Aliquat 336S, dissolvido em membranas de PVC. O

baixo limite de detecção é determinado por uma pequena, mas finita partição do par-iônico na

solução.

20

Dentre os interferentes, os íons cloreto e bicarbonato apresentam coeficientes de

seletividade maiores que 0,1 e 0,05, respectivamente. Íons que são potencialmente

interferentes, mas que não ocorrem normalmente em água potável são o NO2-, CN-, S2-, Br-, I-,

ClO3- e ClO4

-. Embora os eletrodos funcionem satisfatoriamente em tampão entre pH 3 e 9

são usualmente observados valores discrepantes, de maneira que este sensor, é usado de modo

semi-quantitativo em medidas em águas de rios e estações de tratamento de

efluentes.(CLESCERI,1998)

A.2- Métodos Diretos com Derivatização

O método de nitração do ácido salicílico, também conhecido como método do salicilato

é usado para determinação de nitrato não apenas em águas, mas também em extratos de solos

e plantas. O método se baseia na formação, em meio ácido e com aquecimento, dos íons

nitrônio (NO2+), que reagem com salicilato, em meio básico formando principalmente um

composto nitrobenzóico de cor amarela. Como o nitrogênio no nitrato não tem capacidade

eletrofílica, o elemento precisa ser ativado a nitrônio, que é um eletrófilo forte. O

procedimento envolve aquecimento da amostra até a secura, pois a água precisa ser removida

para conversão do NO3- a NO2

+. Portanto, o método é trabalhoso, demorado, e limita o

número de amostras a serem analisadas, particularmente quando se utilizam grandes volumes

de amostras de água.(FERREIRA, 2006)

B. Indireto

A determinação indireta do nitrato apresenta vantagens em relação à direta: maior

sensibilidade, maior precisão e melhor seletividade, ou seja, é menos sujeita à interferência de

outros íons.(MANTOVANI, 2005)

Dentro destes métodos, entretanto, convém destacar que a redução de nitrato para nitrito

é a principal estratégia para determinação desse íon.

Essa redução pode ser acompanhada por adição de um agente redutor homogêneo ou

heterogêneo ou através de reduções fotoquímicas ou ainda por reações enzimáticas.

21

B1)Redução Heterogênea do nitrato.

Os agentes redutores freqüentemente usados em estado sólido são: liga de cádmio, ou

cádmio metálico granulado recoberto com cobre ou ligas de zinco, adicionado diretamente na

amostra ou passando a amostra através de uma coluna contendo o agente redutor. O uso de

sistemas de injeção em fluxo tem facilitado bastante o procedimento.

Geralmente ele é o reagente preferido porque fornece uma redução quantitativa de

nitrato para nitrito com desprezível redução do nitrito para oxidação de espécies

inferiores.(ANDERSON, 1979)

NO3- + Cd 0 + 2H+ pH 7,.5 NO2

- + Cd 2+ + H2O (PATTON, 2002)

Tampão imidazol

Algumas desvantagens da redução cobre-cádmio é a degradação da superfície redutora

causada por uma gradual perda de cobre e de cádmio, a precipitação de outras espécies

presentes em amostras de água na superfície, a perda de carga na coluna devido à

compactação de partículas e a adsorção de certos componentes, principalmente matéria

orgânica. Para evitar a precipitação do Cd 2+ formado, cloreto de amônio ou EDTA são

adicionados à amostra, embora a degradação do agente redutor persista e a coluna deve ser

periodicamente regenerada para recuperar a camada da superfície metálica, até que seja

finalmente substituída pelo consumo do reagente.

A principal desvantagem deste método é a geração de resíduos tóxicos de Cd 2+.

Quando ocorre exposição ao cádmio os efeitos agudos consistem em edema e irritação. A

toxicidade crônica afeta os rins. Ocorre indução da síntese de metalotioneína, uma proteína de

ligação de metal, no fígado e nos rins. Quando este mecanismo de defesa é superado, o

cádmio provoca lesão dos túbulos contornados proximais, causando proteinúria. Ele pode

causar também cardiopatia, doença pulmonar crônica obstrutiva e infertilidade

feminina.(COTRAN, 2000)

Há uma crescente conscientização da toxicidade do cádmio, entretanto ele continua

sendo usado com preocupação por analistas. Os custos associados com os processos de

descartes aquáticos contendo cádmio e seu correto descarte também tem aumentado.

22

Estes fatores levam a explorar mais alternativos agentes redutores para a rotina na

determinação de nitrato.

O zinco metálico tem sido utilizado sozinho ou combinado com íons magnésio, para

promover essa redução. O método requer um estrito controle da temperatura e tempo de

reação para evitar a redução do nitrogênio para um estado de oxidação menor que III.

Reduções quantitativas não são obtidas e os melhores rendimentos reportados estão entre 85-

90%, em meio alcalino.

O nitrito formado é, em geral, monitorado espectrofotometricamente usando a reação de

Griess, qualquer que seja o agente redutor utilizado.

Princípio do método de Griess:

A reação de Griess é baseada na formação de um diazocomposto. Inicialmente, o nitrito

reage com a sulfanilamida (Figura 1a) em meio ácido (reação de diazotação) e o produto

reage com n-(1-naftil)-etilenodiamina (NNED – Figura 1b) formando o diazocomposto

(Figura 2).

(a)

(b) NH2

NH2

O OSNH2

NH

Figura 1 - Estruturas químicas dos reagentes usados na reação de Griess. (a) sulfanilamida;

(b) N-(1-Naftil) etilenodiamina.

23

dimetilamina

Figura 2 - Mecanismo para as etapas de diazotação (A) e acoplamento(B) da reação de Griess para determinação de nitrito.

diazocomposto

O espectro do diazocomposto obtido é apresentado na Figura 3. O máximo em 540

nm, que apresenta uma absortividade molar de 3,4. 104 L/(mol. cm) é usualmente utilizado

para a obtenção da curva analítica.

Figura 3 - Espectro de absorção na região do visível do composto produzido na reação de

Griess, obtido com solução padrão de nitrito de sódio 0,33 mg N/L. B2) Redução Homogênea para nitrito.

24

A redução do nitrato por hidrazina em meio alcalino, catalisada pelo íon cobre.

Diferentes métodos baseados neste princípio têm sido desenvolvido e adaptados para

diferentes tipos de água. A principal limitação é provavelmente a grande dependência da taxa

de conversão com a temperatura, que pode levar a uma pobre reprodutibilidade. Além disso, o

método apresenta interferências principalmente por cátions, tais como Mg2+, Ca2+ e Fe3+, pois

eles podem precipitar hidróxidos em meio alcalino. Essas interferências têm sido eliminadas

removendo esses cátions com resina catiônica ou por precipitação em meio alcalino e

filtração, ou mesmo trabalhando em altas temperaturas, quando o tempo para a determinação

é diminuído. A adição de agentes complexantes raramente é utilizada para evitar a inibição do

efeito catalítico do cobre. Esta inibição é causada por complexantes naturais, tais como os

ácidos húmicos ou fúlvicos, presentes em matrizes de águas de rios e lagos e de solo. Essa

interferência pode ser minimizada pela adição de íon zinco a amostra, para competir por esses

ligantes, ou, equivalentemente, com o aumento da concentração do cobre (II). Em alguns

casos isto é possível adicionando um agente complexante para remover a espécie interferente

específica sem afetar a reação catalítica permitindo a determinação de nitrato em água do mar

com limite de detecção de 0,003 mgN/L.

B3) Redução Fotoquímica

A irradiação da amostra com ultravioleta produz a redução do nitrato para nitrito por

fotólise deste ânion. A redução fotoquímica envolve um ou mais estados de excitação através

de diferentes caminhos. A predominância de uma reação sobre as outras e conseqüentemente,

o rendimento da fotólise, depende do pH, da concentração inicial de nitrato, da intensidade e

do comprimento de onda da radiação eletromagnética utilizada. A fotólise pela luz solar

ocorre naturalmente em ambiente aquático e pode ser reproduzida em laboratório pelo uso de

lâmpada de mercúrio. Alguns autores reportam uma eficiência de redução de 93 % para

nitrato após a irradiação da amostra por 8 minutos em pH alcalino e predominância da

emissão em 254 nm.(NOLLET, 2000)

25

Em outro método, o íon nitrato pode também ser determinado por quimiluminescência

após formação fotoquímica de espécies oxidantes, como peroxinitrito, que causam a oxidação

de luminol, responsável pelo efeito luminescente.(CAVACCHIOLI, 2003)

B4) Redução Enzimática

Neste método utilizam-se enzimas específicas na conversão do nitrato para nitrito, que

são chamadas de nitrato redutases. Estas enzimas estão amplamente distribuídas na natureza e

são produzidas por uma variedade de animais, plantas e microrganismos incluindo

fungos.(XUEIJUANG, 2006)

Nestes organismos, a redução do nitrato pode ocorrer por duas razões, devido as duas

principais rotas metabólicas:

♦ Assimilação do nitrato : neste caso o nitrogênio é utilizado como fonte para o

crescimento do organismo ( biossíntese);

♦ Respiração do nitrato (Dissimilação do nitrato) : ocorre geração de energia metabólica

com o nitrato como aceptor de elétrons uma vez que ele será utilizado como oxidante na

cadeia respiratória sob condições anaeróbias.(OLIVEIRA, 2005; MARTINEZ-ESPINOSA,

2001; KHAN, 2006)

Baseado nessas funções, as nitrato-redutases podem ser classificadas em duas classes

distintas:

I)Nitrato-redutase Assimilatória

São encontradas em plantas verdes, algas, fungos, leveduras, e algumas bactérias que

participam da redução do nitrato a amônia que será incorporada aos compostos

orgânicos.(HOFF, 1992)

A purificação e caracterização, em 1953, da piridina nucleotídeo nitrato redutase em

Neurospora e folhas de soja, representou a primeira e definitiva examinação reportada da

nitrato redutase assimilatória.(BOYER, 1963). Existem kits comerciais para determinação de

26

nitrato contendo nitrato redutase purificada, mas o custo costuma ser elevado (em torno de

100 dólares duas unidades as nitrato redutase – NADH dependente).

Dentre as fontes de nitrato redutase assimilatória, pode-se citar: Zea mays (milho),

Aspergilus niger (fungo filamentoso), Candida utillis (levedura), Neurospora crassa

(nitratooxidorredutase EC 1.6.6.3), Anabaena cylindrica (cianobacteria dependente de

ferredoxina), Eclothiohadospira shaposnikovii (cianobactéria fotossintética), Azobacter

vinelandii (flavodoxina dependente), Azobacter chrooccum (bactéria fixadora de nitrogênio),

Klebsiella pneumoniae, Rodobacter capsulatus e Haloferax mediterranei (NADH

dependentes).(MIKAMI, 1984)

As nitrato redutases ferredoxina dependentes ocorrem em procarióticos e têm como

função alternativa fisiológica nos anaeróbicos. Outros exemplos:

-Chlorella vulgaris (NADH dependente, EC. 1.6.6.1) alga

unicelular.(SOLOMONSON,1975; GEWTIZ, 1981)

-Nicotiana pumblaginifolia (embora a nitrato redutase esteja presente em níveis

relativamente baixos em tecidos de plantas superiores na Nicotiana é particularmente muito

baixa)

Na Trema guineensis atividade nas folhas é de 11.9 µmol NO2 gf. wt-1h-1, embora nas

raízes a atividade seja reduzida.(POONNACHIT, 2004)

Onde o transporte do nitrato para o meio intracelular é mediado pela permease do

nitrato e após a sua assimilação ocorre redução seqüencial do nitrato para nitrito, pela ação da

nitrato redutase e do nitrito para amônia, pela ação da nitrito redutase, que será utilizada para

biossíntese celular.(CHOW, 2004; LILLO, 2004)

I) Nitrato-redutase Dissimilatória

É encontrada em algumas bactérias, não tem sido encontrada em plantas e uma pequena

parte de sua estrutura é parecida com a nitrato redutase assimilatória.(HOFF, 1992)

Em alguns organismos, essas enzimas têm a capacidade de usar o nitrato como aceptor

terminal de elétrons no lugar do oxigênio. Devido a esta fisiológica e enzimológica

similaridade a respiração aeróbica, esse processo é usualmente chamado de respiração do

nitrato ou dissimilatória redução do nitrato.(UNKLES, 2004)

27

A primeira demonstração da respiração do nitrato em bactérias não denitrificantes foi

feita quando observaram que E.coli não cresceu anaerobicamente em um meio contendo

lactato como fonte de carbono a menos que um aceptor de elétrons como o nitrato fosse

colocado no meio.(HOFF, 1992)

Alguns exemplos de fontes de nitrato redutase respiratória são as Paracoccus

denitrificans, Pseudomonas aeruginosas, Pseudomonas stuzeri.(BORCHERDING, 2000). Na

E. coli (EC 1.7.99.4) a nitrato redutase está ligada a membrana e pode ser induzida em

grandes quantidades por crescimento anaeróbico em presença de nitrato.(MACGREGOR,

1974) A enzima apresenta uma habilidade de translocar prótons, pois ocupa uma localização

transmembranica na membrana citoplasmática.(MORPETH, 1985). Na Klebsiella aerogenes a

enzima também está ligada à membrana.(VAN`TRIET, 1975)

As nitrato redutases-respiratória ligadas à membrana são geralmente proteínas

integrais da membrana com o sítio ativo localizado na face citoplasmática da membrana

citoplasmática.(JEPSON, 2004)

A estrutura da nitrato redutase

De modo geral nitrato redutase apresenta um grande complexo multirredox que possui

duas subunidades idênticas (homodímero, podendo também se apresentar na forma de

homotetrâmero), de subunidades de peso molecular de aproximadamente 95 a 140 kDa e 50

kDa respectivamente, cada uma composta por três grupos prostéticos em domínios separados.

Nas extremidades c-terminal localiza-se o domínio FAD, mais ao centro o domínio Heme e na

extremidade terminal o molibdênio numa estequiometria de 1:1: 1. Cada cofator domínio

constitui de um elemento estrutural autônomo e igualmente isolado que reserva esta atividade

parcial. O molibdênio é responsável pela redução do nitrato, sendo também operado em

presença de doadores de elétrons sintéticos.(PEREIRA, 2006; SOLOMONSON, 1990;

MOUREAUX, 1989,FERREYRA, 2004; RIDLEY, 2006)

De maneira simples, uma unidade da nitrato redutase pode ser entendida de acordo com

a figura 4:

28

Fe (CN)63-

Cyt c MV

NAD(P)H

NO3-

MoFAD HEMENAD(P)+

NO2-

Figura 4 - Interação dos doadores e aceptores de elétrons com nitrato redutase.(BARBIER, 2005)

De acordo com o doador de elétron podemos dividir a nitrato redutase em dois grupos:

1) Diaforase: grupo de enzimas que usa NAD (P)H como doador de elétrons e inclui

NADH, dentre eles, a Ferricianida nitrato redutase (NADH: Fr), a NADH: citocromo c

redutase (NADH: CR) e a NADH: diclorofenolindol redutase (NADH: DR).

A NADH: FR requer FAD, enquanto que a NADH: CR E NADH: DR requerem FAD e

heme como grupos prostéticos.

2) Redutoras do nitrato, tais como a Reduzida flavina nitrato redutase (FH: NR),

Reduzida metil viologênio (MV: NR), Reduzida azul de bromofenol (BB: NR).A FH: NR e

BB: NR requerem apenas Mo.A Nar na maioria dos organismos se apresenta na forma de

homodímero, mas pode se apresentar na forma de Homotetrâmero como por exemplo na

Chlorella. sp (SOLOMONSON, 1990) ou Heterodímero (Klebsiella pnenumoniae,

Rhodobacter capsulatus (MARTINEZ-ESPINOSA, 2001), Haloferax denitrificans) e

Heterotrimétrica (na Haloferax volcanii).

Localização da nitrato redutase

A localização da nitrato redutase pode variar muito, dependo das necessidades

fisiológicas do organismo.

Como por exemplo, nas plantas existe uma necessidade eficiente para transferência do

nitrito formado pela nitrato redutase para os cloroplastos onde será reduzido a amônia pela

nitrito redutase, portando a mesma se encontrará no citosol, mesmo porque o NADH é

29

produzido no citosol. A nitrato redutase tem sido encontrada em diversos compartimentos

celulares, tais como em cloroplastos na Moraphidium braunii (alga verde), no plasmelema e

membrana tonoplástica das células miceliais de Neurospora crassa, assim como no

citoplasma do mesófilo celular em folhas de Zea mays (milho).

Portanto diferentes fontes de nitrato redutase podem se utilizadas no método da

redução enzimática, sendo a utilização de extratos brutos considerada mais vantajosa quando

comparada com outros métodos, pois:

- É uma fonte inesgotável de enzimas e não necessita de cofatores (os quais apresentam

custo comercial elevado).

- A nitrato redutase apresenta tempo de reação rápida, maior eficiência e especificidade

requerendo menor energia.(CAMPBELL, 1999)

- A análise é mais seletiva para nitrato;

- Apresenta menor interferência ou falso positivo;

- As condições de reação são simples;

- Não adiciona reagentes pesados;

- O custo da análise é baixo;(CAMPBELL, 2002)

30

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar extratos brutos na redução

enzimática do nitrato para fins analíticos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os objetivos específicos compreenderam em:

- Avaliar diferentes fontes de nitrato redutase visando seu uso como extrato bruto para

determinação de nitrato.

- Utilizar reagentes não carcinogênicos, de fácil descarte e de baixo custo.

31

3 MÉTODO

Todas as soluções foram preparadas com água tipo 1 ( 18,18 MΩ.cm ), obtida em um

purificador de água ultra System – Gehaka.

3.1 CONDIÇÕES REACIONAIS

Os testes foram divididos em três grupos de acordo com a fonte de nitrato redutase: o

uso de cepas ou espécies distintas de fungos do gênero Fusarium, o uso de apenas um tipo de

cepa de Escherichia coli e utilizando fontes de origem vegetal como alface, gengibre e Vigna

radiata L. conhecida como broto de feijão.(LIMA, 2004)

3.1.1 TESTE UTILIZANDO FUSARIUM COMO FONTE DE NITRATO REDUTASE

(FONTE FÚNGICA)

Foram testadas as seguintes fontes de fungos para a biossíntese de nitrato redutase:

Fusarium cactus, Fusarium oxysporum (cepa 55.1), Fusarium oxysporum (cepa 07),

Fusarium oxysporum (cepa 69). Essas foram cultivadas em meio de cultura sólido e mantidas

a temperatura de 28 °C por 7 dias em estufa BOD Q – 315D ( QUIMIS ®), Figura 5.

Figura 5 - Diferentes espécies de Fusarium após 7 dias de crescimento.

32

Destes foram repicados 3 discos de micélio – ágar de 5 mm de diâmetro e transferidos

para Erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultura líquido, e incubados a 28 °C por 12

dias em estufa BOD Q – 315D ( QUIMIS ®) a fim de produzir biomassa necessária para os

ensaios seguintes, Figura 6.

Figura 6 - Discos de micélio - ágar crescendo em meio de cultura líquido.

Neste grupo, os testes foram divididos em duas partes: o uso do extrato sem a presença

da biomassa (ou seja, os filamentos dos fungos) e outro contendo a biomassa.

3.1.1.1 EXTRATO DE FUSARIUM COMO FONTE ENZIMÁTICA

O extrato foi pesado e transferido para um erlenmeyer onde água destilada previamente

autoclavada foi adicionada na proporção de 100 mL de água para 10 g de extrato. Este extrato

ficou suspenso em água por 3 dias a 28 °C em estufa para a liberação de nitrato redutase para

o meio extracelular.

Figura 7 - Suspensão enzimática antes da filtração.

33

O material é filtrado em filtro de papel comum para eliminar o excesso de células que

podem deixar o meio turvo. Em seguida parte é filtrada em membrana de 0,45 µm para a

retenção de células.

Quantidades da solução de nitrato de sódio 315 mg N/L (estoque) foram adicionadas ao

extrato e após homogeneização iniciou a cinética enzimática.

Foram coletadas alíquotas de 1 mL do extrato com nitrato de sódio adicionado ao longo

do tempo (de hora em hora) sendo que ao término de cada tempo a alíquota coletada foi

mantida refrigerada ( 3 °C) para interromper a reação enzimática.

Em seguida foi feita a determinação do nitrito formado pela ação da nitrato redutase

através do Método de Griess, com auxílio de um espectrofotômetro Diode - Array Agilent

8354 A.

3.1.1.2 BIOMASSA DE FUSARIUM COMO FONTE ENZIMÁTICA

A biomassa foi pesada, triturada e transferida para Erlenmeyer onde água destilada ou

tampão foi adicionado na proporção de 10 g de biomassa para 100 mL de água ou diferentes

tipos de tampão

Quantidades da solução de nitrato de sódio (estoque) foram adicionadas ao extrato e

após homogeneização iniciou a cinética enzimática.

Foram realizados vários testes com a biomassa como fonte enzimática.

3.1.1.2.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA NITRATO REDUTASE

Para verificar a atividade da nitrato redutase em diferentes meios reacionais foram

utilizados os tampões fosfato 100 mmol/L a pH 6,0 e 7,2, tampão acetato a pH 5,0 e água.

Avaliou-se também a atividade da nitato redutase na presença de ácido ascórbico e glicose.

Foi adicionado 0,03 % (m/V) de glicose e diversas concentrações (0,1, 0,5 e 1% m/V) de

ácido ascórbico (vitamina C) em tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,0. Após a homogeneização

o material foi centrifugado, sendo o precipitado ressuspendido em tampão fosfato 100

mmol/L pH 6,0 e adicionou-se solução de nitrato (estoque) ao precipitado e ao sobrenadante.

34

A atividade da nitrato redutase na presença de sulfito de sódio foi estudada. Ao meio

reacional (tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,0) foi adicionado 0,1 % de sulfito de sódio. Para

a remoção do oxigênio dissolvido no meio reacional, preparado conforme descrito

anteriormente, borbulhou-se gás nitrogênio no meio reacional.

3.1.2 ESCHERICHIA COLI COMO FONTE DE NITRATO REDUTASE (FONTE

BACTERIANA)

3.1.2.1 Produção de nitrato redutase em condições aeróbicas de crescimento microbiano

e cinética enzimática

As colônias de Escherichia coli foram cultivadas em meio de cultura sólido. Foram

incubadas a 28 °C em meio aeróbio por 24 horas. Em seguida, com a alça bacteriológica, as

colônias foram transferidas e suspensas para o meio de cultura líquido . Foram incubadas a 28

°C em meio aeróbio por 3 dias na ausência de nitrato.

O meio líquido foi centrifugado e o precipitado foi ressuspendido com solução tampão

fosfato 100 mmol/L pH 6,0. Diferentes concentrações de nitrato foram adicionadas e após

homogeneização iniciou – se a cinética.

3.1.2.2 Produção de nitrato redutase em condições anaeróbicas de crescimento

microbiana e cinética enzimática

As colônias de Escherichia coli foram cultivadas em meio de cultura sólido. Foram

incubadas a 28 °C em meio aeróbio por 24 horas. Em seguida, com a alça bacteriológica, as

colônias foram transferidas e suspensas para o meio de cultura líquido, saturado previamente

com gás nitrogênio, a fim de se obter o crescimento bacteriano em meio anaeróbio.

Permaneceram a 28 °C por 3 dias na ausência de nitrato.

O meio líquido foi centrifugado e o precipitado foi ressuspendido com solução tampão

fosfato 100 mmol/L pH 6,0. Diferentes concentrações de nitrato foram adicionadas e após

35

homogeneização iniciou – se a cinética. Em seguida gás nitrogênio foi borbulhado no meio

reacional para expulsão do oxigênio por saturação para que a cinética prosseguisse em

anaerobiose.

3.1.3 TESTE UTILIZANDO VIGNA RADIATA L. COMO FONTE DE NITRATO

REDUTASE (FONTE VEGETAL)

As porções frescas de broto de feijão foram adquiridas diariamente no comércio local.

3.1.3.1 Avaliação da atividade da nitrato redutase com meio reacional com tampão

fosfato 100 mmol/L pH 6,0.

Uma porção de broto de feijão foi pesada e as partes foram picadas em tamanhos

uniformes. Adicionou-se 50 mL de tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,0 e solução de nitrato

de sódio (estoque).

Para se ter certeza de que o nitrito detectado no meio reacional é produto da reação

enzimática da nitrato redutase com nitrato e não um produto liberado pelas células vegetais,

um branco foi feito colocando-se todos os reagentes exceto a solução de nitrato.

3.1.3.2 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando o protetor

polivinilpirrolidona (PVP-VA)

Diferentes quantidades de PVP-VA foram adicionadas para que as concentrações sejam:

0,01 g/mL, 0,02 g/mL, 0,04 g/mL, 0,08 g/mL e 0,16 g/mL e quantidades da solução de nitrato

de sódio (estoque) foram adicionadas a fim de se obter as seguintes concentrações finais de

nitrato: 15 mgN/L, 10 mgN/L e 5 mgN/L.

3.1.3.3 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando uma concentração de

0,04g/mL do protetor PVP-VA em diferentes pHs e concentrações de fosfato.

36

Para verificar o poder tamponante, diferentes concentrações de fosfato (50,100 e 200

mmol/L) em diferentes pHs (5,5; 6,0; 6,2; 7,0) foram requeridas a uma concentração fixa de

nitrato (15 mgN/L).

3.2 MATERIAIS

3.2.1 Fontes vegetais utilizadas

- Broto de feijão;

- Alface;

- Gengibre.

3.2.2 Obtenção das cepas utilizadas nos ensaios

Foram utilizadas para biossíntese de nitrato redutase as seguintes fontes obtidas da

coleção de cultura do laboratório de genética molecular da Escola Superior de Agronomia

Luis de Queiroz (ESALQ-USP) Piracicaba-SP:

- Fusarium oxysporum (cepas n° 07, n° 55.1 e n° 69);

-Fusarium cactus.

-Escherichia coli (DAUFPE 221)

3.2.3 Preparo dos meios de cultura

3.2.3.1 Meio de cultura sólido para Fusarium:

37

Pesou-se 0,5 g de extrato de levedura, 2 g de extrato de malte e 2 g de ágar e dissolveu-

se em 100 mL de água destilada. Autoclavou-se o meio (Vertical mo 415- FANEN) a 121°C

por 15 minutos e distribuiu-se em placas de Petri (20 mL) e após solidificação adicionou-se

ao mesmo um disco de micélio – ágar (este preparo foi realizado em câmara de fluxo

laminar).

3.2.3.2 Meio de cultura líquido para Fusarium:

Pesou-se 0,5 g de extrato de levedura, 2 g de extrato de malte e dissolve-se em 100 mL

de água. Autoclavou-se o meio foi e adicionou-se ao mesmo 3 discos de micélio - ágar.

3.2.3.3 Meio de cultura sólido para Escherichia coli

Pesou-se 4 g de triptona soja ágar e dissolveu-se em 100 mL de água. Autoclavou-se a

121°C por 15 minutos e distribuiu-se em placas de Petri (20 mL) e após solidificação colônias

de Escherichia coli inoculou-se ao meio (este preparo foi realizado em câmara de fluxo

laminar).

3.2.3.4 Meio de cultura líquido para Escherichia coli

Pesou-se 3 g de triptona soja caldo e dissolveu-se em 100 mL de água. Autoclavou-se o

meio a 121°C por 15 minutos e ao meio inoculou-se colônias provenientes do meio de cultura

sólido.

3.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES

38

3.3.1 Reagente Espectrofotométrico para nitrito

Pesou-se 4 g de sulfanilamida (C6H8O2N2S) e 0,1 g de N-(1- naftil) - etilenodiamino

dihidrocloridrico e dissolveu-se em cerca de 30 mL água e 10 mL de ácido fosfórico

concentrado, em seguida completou-se o volume para 100 mL no balão volumétrico.

3.3.2 Solução de nitrato de sódio 315 mgN/L (estoque)

Pesou-se 0,1912 g de nitrato de sódio e dissolveu-se em cerca de 50 mL de água e em

seguida completou-se o volume para 100 mL no balão volumétrico

3.3.3 Tampão fosfato

3.3.3.1 Tampão fosfato 200 mmol/L

Pesou-se 2,756 g de NaH2PO4.H2O e dissolveu-se em água. Os valores de pH avaliados

foram: 5,5; 6,0; 6,2; 7,0; ajustados com NaOH ou HCl. Após ajuste do valor de pH

completou-se o volume para 100 mL no balão volumétrico.


Pesou-se 1,3799 g de NaH2PO4.H2O e dissolveu-se com água, até aproximadamente 100

mL. Os valores de pH avaliados foram: 5,0; 5,5; 6,0; 6,2; 7,0; 7,2 e 8,0; ajustados com NaOH

39

ou HCl. Após ajuste do valor de pH completou-se o volume para 100 mL no balão

volumétrico.


Pesou-se 0,6899 g de NaH2PO4.H2O e dissolveu-se em água. Os valores de pH

avaliados foram: 5,5; 6,0; 6,2; 7,0; o valor de pH foi ajustado com NaOH ou HCl. Após ajuste

do valor de pH completou-se o volume para 100 mL no balão volumétrico.

3.3.3.4 Tampão acetato 100 mmol/L pH = 5,0

Massa de 0,8203 g de CH3COONa foi dissolvida em água, adicionando 83 uL de HCl

concentrado (12 mol/L), ajustado o pH para 5,0 completou-se para 100 mL no balão

volumétrico.

3.3.4 Curva analítica para nitrito na faixa de concentração de 0,020 a 0,50 mg N/L

Pesou-se 0,9861 g de NaNO2 e dissolveu-se em água, completando o volume para

1000 mL no balão volumétrico (solução estoque 200 mgN/L).

Aos balões volumétricos de 100 mL foram adicionadas alíquotas, da solução estoque

200 mgN/L, de 100; 250; 500; 1000; 2000; 2500 uL sendo o volume completado com água.

Desta forma, foram obtidas soluções de concentrações 0; 020; 0,050; 0,10; 0,20; 0,40; 0,50

mgN/L, utilizadas na construção da curva analítica.

3.3.5 Curva analítica para amônia na faixa de concentração de 0,050 a 1,50 mg N/L

Pesou-se 3,819 g de NH4Cl e dissolveu-se em água, completando-se para 1000 mL no

balão volumétrico (solução estoque 1000 mgN/L).

40

Adicionou-se 10 mL dessa solução estoque 1000 mgN/L a um balão volumétrico e

completou-se para 100 mL com água, a fim de obter-se uma solução com concentração final

de 100 mgN/L de NH4Cl.

Aos balões volumétricos de 100 mL adicionou-se alíquotas, da solução estoque 100

mgN/L, de 50; 100; 250; 500; 1000; 1500 uL e completou-se o volume com água. Dessa

forma, obteve-se soluções de concentrações 0; 0,050; 0,10; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5 mgN/L

utilizadas na construção da curva analítica.

3.3.6 Determinação de nitrito

A determinação de nitrito foi realizada com auxílio da reação de Griess. Uma alíquota

de 1 mL, retirada dos meios reacionais, foi misturada com 1 mL de reagente

espectrofotométrico, homogeneizada e mantida em banho-maria a 25˚C por 30 minutos. A

medida da absorbância foi realizada em 540 nm em um espectrofotômetro Agilent 8453 A. A

linha base foi corrigida nos seguintes comprimentos de onda: 540, 427, 445, 620, 648 e 685

nm.

3.4 REAGENTES

Os reagentes utilizados no desenvolvimento e aplicação do método para a

determinação de nitrato foram:

- Sulfanilamida (Synth)

- N-(1- naftil) - etilenodiamino dihidrocloridrico (Merck)

- Ácido fosfórico concentrado (J. T. Baker)

-Nitrato de sódio (Carlo Erba)

-Nitrito de sódio (Carlo Erba)

41

3.5 EQUIPAMENTOS

Os equipamentos utilizados nos procedimentos microbiológicos foram:

- Autoclave Vertical mod 415- FANEN

- Estufa BOD Q – 315D (QUIMIS ®)

- Centrifuga mod C.T. A 2815 . Para a determinação de nitrito foi empregado espectrofotômetro Agilent 8453.

42

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

A biossíntese de nitrato redutase e a otimização de sua atividade na redução do nitrato

foi estudada.

4.1 Fusarium como fonte de nitrato redutase

4.1.1 Extrato como fonte enzimática

Na Figura 8, através do método de Griess, apresenta-se a variação da concentração de

nitrito formado durante a incubação do extrato de duas espécies de fungos, F. oxysporum 55.1

e F.cactus, a partir de 6,0 mgN/L de nitrato. Observa-se um aumento contínuo da

concentração de nitrito no meio contendo extrato de F. oxysporum, atingindo-se um patamar a

partir das 72 horas de incubação, com uma eficiência de conversão de nitrato à nitrito de 30 %

e não foi observado um período de indução. Para a espécie F.cactus, foi observado um

máximo de concentração de nitrito atingindo um máximo de 24 horas. A eficiência observada

foi de 8,3 %. A eficiência foi calculada comparando a concentração de nitrito medida no meio

reacional (em mgN/L) com a concentração de nitrato inicialmente no meio (também em

mgN/L).

43

0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

0 , 8

1

1 , 2

1 , 4

1 , 6

1 , 8

2

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0T e m p o /h o r a s

Con

cent

raçã

o ni

trito

( m

gN/L

)

Figura 8 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por extrato filtrado em membrana 0.45 µm das espécies: F. cactus ( ) e F. oxysporum n° 55.1 ( ) . Concentração inicial de nitrato foi de 6,0 mgN/L.

4.1.2 Biomassa como fonte enzimática

4.1.2.1 Avaliação da atividade da nitrato redutase com meio reacional com água ou

tampão.

Na figura 9 é apresenta-se a variação da concentração de nitrito formado durante a

incubação da biomassa da espécie cactus a partir de 15 mgN/L de nitrato. Observa-se um

aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da espécie cactus

atingindo-se um máximo em 38 horas. Observou-se uma eficiência de 33,3 %.

44

0

0 ,5

1

1 ,5

2

2 ,5

3

3 ,5

4

4 ,5

5

5 ,5

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

T e m p o /ho ras

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 9 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio

formado pela biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução de nitrato. Concentração inicial de nitrato 15 mgN/L.

Na avaliação da atividade da nitrato redutase com meio reacional com água ou tampão a

figura 10 mostra a variação da concentração de nitrito formado durante a incubação da

biomassa da espécie cactus a partir de 15 mgN/L de nitrato nos diferentes meios tamponados.

Observa-se um aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da

espécie cactus atingindo-se um máximo em 27 horas. Observou-se uma eficiência de 77,1 %

para o meio não tamponado (água), 61,4 % para pH 6.0, 0,09 % para pH 5.0, e 10,86 % para

pH 7.2.

O ponto ótimo para a redução do nitrato parece estar próximo ao valor 6,0. Na solução

não tamponada (água) esse valor de pH pode ter sido atingido, obtendo-se então, uma maior

eficiência. A ausência de tamponamento é uma condição experimental não adequada, pois não

há controle.

45

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

0 1 0 2 0 3 0 4T em po / h o ras

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

0


formado pela biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução de nitrato nos diferentes meios em : água ( ), pH 5,0 ( ♦ ), pH 6,0 ( ), pH 7,2 ( ). Concentração inicial 15 mgN/L.

4.1.2.2 Avaliação da atividade da nitrato redutase com diferentes proporções de

biomassa

A atividade da nitrato redutase proveniente da espécie cactus com diferentes proporções

de biomassa foi avaliada como mostra a figura 11 através da variação da concentração de

nitrito formado a partir de 15 mgN/L. Observa-se um aumento contínuo da concentração de

nitrito no meio contendo a biomassa da espécie cactus atingindo um máximo em 15 horas. A

eficiência observada foi de 50,5 % para 1g de biomassa (suspensa em 10 mL de tampão),

8,7% para 2 g de biomassa (suspensa em 10 mL de tampão) e 6% para 3 g de biomassa (

suspensa em 10 mL de tampão). A quantidade elevada de material orgânico em suspensão

pode ter apresentado problemas de transporte de massa na solução, determinando as

eficiências baixas com o aumento da massa de fungos no meio.

46

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30

Tempo/ horas

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 11 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por diferentes proporções biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução de nitrato. Concentração de nitrato inicial 15 mgN/L. Proporções: 1g ( ), 2g ( ) e 3g ( ).

4.1.2.3 Avaliação da atividade da nitrato redutase na presença de ácido ascórbico e

glicose

Na avaliação da influência de ácido ascórbico e glicose a figura 12 mostra a variação da

concentração de nitrito formado durante a incubação de biomassa da espécie cactus a partir de

15 mgN/L de nitrato na presença de 0,03% de glicose e 0,1% de vitamina C, e outro meio

contendo apenas 0,1% de vitamina C na solução de nitrato . Observa-se um aumento contínuo

da concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da espécie cactus atingindo-se um

máximo em 20 horas. A eficiência observada foi de 63,4 % para o meio com glicose e

vitamina C, 53,4% e de 33,4% para o meio com vitamina C. Observa-se que a vitamina C

pode estar atuando como anti-oxidante auxiliando na estabilidade da enzima, já que neste

experimento a queda brusca do nitrito após atingir eficiência máxima diminuiu.

47

0 ,0

1 ,0

2 ,0

3 ,0

4 ,0

5 ,0

6 ,0

7 ,0

8 ,0

9 ,0

1 0 ,0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0T e m p o / h o ra s

Con

cent

raçã

o ni

trito

(m

gN/L

)


formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato e vitamina C, e em contato com solução tampão com nitrato, vitamina C e glicose nos meios centrifugados e ressuspedidos. Concentração inicial 15 mgN/L de nitrato. Sobrenadante-vitamina C ( ), ressuspendido-vitamina C ( ), sobrenadante-vitamina C e glicose ( ♦ ), ressuspendido-vitamina C e glicose ( ).

No caso da glicose, parece estar envolvida na redução do cofator NAD+(forma oxidada)

para NADH (forma reduzida necessária para que ocorra a atividade enzimática), conforme a

reação:

H2O + NAD+ + GLICOSE-6-P → 6-P-GLUCONATO + NADH + H+

Observa-se a relação entre a glicose e a regeneração parcial do cofator, pois NAD+

apresenta uma absorbância direta no UV de 260 nm, como pode ser verificado no

sobrenadante antes de iniciar a cinética, na Fig.13.

48

Figura 13 - Espectro do sobrenadante, antes de adicionar a solução de nitrato, glicose e ácido ascórbico. O espectro evidencia uma banda a 260 nm característica do NAD+.

Foi avaliada a influência da concentração de ácido ascórbico juntamente com a glicose

na atividade da nitrato redutase presente no sobrenadante e no ressuspendido da biomassa de

F.cactus.

Neste estudo, empregou-se diferentes concentrações de ácido ascórbico (0,1, 0,5 e 1%),

mantendo-se a concentração da glicose em 0,03%.

Para o sobrenadante, observa-se um aumento contínuo da concentração de nitrito para

todos os meios citados (fig. 14), com exceção do meio contendo 1% de ácido ascórbico. A

eficiência observada no sobrenadante foi de 47,7% com 0,1% de ácido ascórbico e 40% com

0,5% de ácido ascórbico.

49

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30

Tempo/h

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)


formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato e diversas concentrações de vitamina C no sobrenadante. Concentração inicial 15 mgN/L de nitrato.Concentrações de vitamina C: 0,1% ( ), 0,5% ( ), 1% ( ).

Para o ressuspendido (fig.15), a eficiência observada foi de 80% para 0,1% de ácido

ascórbico, 6,7% com 0,5% ácido ascórbico e 33,4% com 1% de ácido ascórbico.

Nos meios contendo 1% de ácido ascórbico pode ser que o mesmo esteja agindo como

inibidor, principalmente no caso do sobrenadante. Tanto no sobrenadante quanto no

ressuspendido, o máximo de formação de nitrito ocorreu em 25 horas.

50

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

0 5 10 15 20 25 30

Tempo /horas

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)


formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato e diversas concentrações de vitamina C no ressuspendido. Concentração inicial 15 mgN/L de nitrato. Concentrações de vitamina C: 0,1% ( ), 0,5% ( ), 1% ( ).

4.1.2.4 Avaliação da atividade da nitrato redutase na presença de sulfito de sódio

Outra espécie redutora cuja influência na atividade da nitrato redutase foi avaliada

consistiu em sulfito de sódio. Foi realizada a incubação de biomassa da espécie cactus com 15

mgN/L de nitrato na presença e na ausência de sulfito de sódio. Observou-se um aumento

contínuo da concentração de nitrito apenas na ausência do sulfito atingindo um máximo em

24 horas (Figura 16), com uma eficiência de 60 % enquanto que no meio contendo sulfito

houve uma total inibição na redução do nitrato. A solução tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,0

com biomassa sem que a solução de nitrato fosse adicionada é para garantir de que não existe

a presença de nitrito no meio, ou seja, o nitrito estará presente se houver redução do nitrato

adicionado ao meio pela ação enzimática da nitrato redutase.

51

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

Tempo /h

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 16 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato ( ), solução tampão com nitrato e sulfito ( ), e sol tampão apenas ( ♦ ). Concentração inicial 15 mgN/L de nitrato.

4.1.2.5 Avaliação da atividade da nitrato redutase na ausência de oxigênio

Na Figura 17 apresenta-se a variação da concentração de nitrito formado durante a

incubação de biomassa da espécie cactus a partir de 15 mgN/L de nitrato em meio reacional

saturado de nitrogênio para expulsão de oxigênio (possível agente oxidante). Observa-se um

aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da espécie cactus.

Então, no meio saturado com nitrogênio atingiu-se um máximo em 30 horas e a eficiência

observada foi de 80 % .

52

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 4Tem po/ horas

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

0

Figura 17 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato em meio em anaerobiose (passagem de nitrogênio). Concentração inicial 15 mgN/L de nitrato.

Na Figura 18 é apresentada a variação da concentração de nitrito formado durante a

incubação de biomassa da espécie cactus a partir de 15 mgN/L , 5mN/L e 7,5 mgN/L de

nitrato, e a cepa 07 a partir de 15 mgN/L de nitrato, sendo que todos os meios estão saturados

de nitrogênio (pois o estudo anterior indicou ser melhor na ausência do oxigênio). Observa-se

um aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da espécie

cactus atingindo um máximo em 24 horas. A eficiência observada foi de 80 % para o meio da

espécie cactus com 15 mgN/L, de 100% para a concentração 7,5 mgN/L e 90 % para a

concentração 5 mgN/L . Enquanto que a cepa 07 com 15 mgN/L apresentou uma eficiência

máxima de 42,7 %.

53

0

2

4

6

8

1 0

1 2

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5te m p o /h

conc

entra

ção

nitri

to (m

gN/L

)

Figura 18 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por biomassa da espécie cactus diretamente em contato com a solução tampão com nitrato e diversas concentrações de nitrato em meio em anaerobiose. F.cactus: 15mgN/L ( ), 7,5 mgN/L ( ), 5 mgN/L ( ) e cepa 07 ( ).


incubação de biomassa da cepa n°69 a partir de 5 mgN/L de nitrato em meio reacional

saturado de nitrogênio para expulsão de oxigênio. Observa-se um aumento contínuo da

concentração de nitrito no meio contendo a biomassa da cepa n° 69 atingindo um máximo em

30 horas. A eficiência observada foi de 4 % para o meio em anaerobiose.

54

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 5 10 15 20 25 30Tempo/ horas

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 19 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por biomassa da cepa n° 69 diretamente em contato com a solução tampão com nitrato em meio em anaerobiose (passagem de nitrogênio). Concentração inicial 5 mgN/L de nitrato.

4.2. Escherichia coli como fonte de nitrato redutase

4.2.1 Produção de nitrato redutase em condições aeróbicas de crescimento microbiano e

cinética enzimática


incubação de células de E.coli a partir de 15 mgN/L , 5 mN/L , 3 mgN/L e 1 mgN/L de nitrato

em condições reacionais de aerobiose. Pode-se identificar a formação de um patamar de

concentração de nitrito no período analisado de 20 a 27 horas.

55

0 , 0

0 , 5

1 , 0

1 , 5

2 , 0

2 , 5

3 , 0

3 , 5

4 , 0

4 , 5

0 1 0 2 0T e m p o / h o r a s

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

3 0

Figura 20 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por células de E.coli suspensas em solução tampão com diversas concentrações de nitrato de em meio aerobiótico. Concentrações: 15 mgN/L ( ), 5 mgN/L ( ), 3 mgN/L( ) e 1 mgN/L ( ).

Uma curva analítica foi obtida lançando-se em gráfico a concentração de nitrito

determinada em função da concentração de nitrato adicionado ao meio. Observa-se, através da

inclinação da curva obtida, uma eficiência de 27% na conversão do nitrato a nitrito (Figura

21).

56

y = 0,2714x - 0,2223R2 = 0,9895

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 5 10 15 20

Concentração nitrato ( mg N/L)

Con

cent

raçã

o ni

trito

( m

g N

/L)

Figura 21 - Curva analítica da concentração de nitrito formado e a concentração de nitrato adicionado.

4.2.2 Produção de nitrato redutase em condições anaeróbicas de crescimento microbiana

e cinética enzimática


incubação de células de E.coli da a partir de 15 mgN/L , 5 mN/L ,3 mgN/L e 1 mgN/L de

nitrato em condições reacionais de anaerobiose, onde pode-se observar uma eficiência muito

baixa.

57

0 ,0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7

0 ,8

0 ,9

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0T e m p o / h o ra s

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)


formado por células de E.coli suspensas em solução tampão com diversas concentrações de nitrato de em meio anaerobio. Concentrações: 15 mgN/L ( ), 5 mgN/L ( ), 3 mgN/L( ) e 1 mgN/L ( ).

4.3 Testes utilizando fontes vegetais de nitrato redutase

As fontes vegetais como alface e gengibre embora tenham apresentado atividade

foram descartadas devido à dificuldades na obtenção de extratos limpos, o que foi possível

utilizando broto de feijão.

4.3.1 Teste utilizando broto de feijão como fonte de nitrato redutase

4.3.2 Avaliação da atividade da nitrato redutase no meio reacional com tampão apenas.

58


incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L de nitrato e tampão. Observa-se um

aumento contínuo da concentração de nitrito formado no meio contendo tecido vegetal

atingindo um máximo em apenas 4 horas. A eficiência observada foi de 28,07 %.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

0 50 100 150 200 250 300 350Tempo/ minutos

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 23 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por tecido vegetal triturado suspenso em solução tampão sem nitrato () e com nitrato ().

4.3.3 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando o protetor PVP-VA.


incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L de nitrato, tampão e polivinilpirrolidona

(PVP). Observa-se um aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo tecido

vegetal atingindo um máximo em 3 horas. Já houve um aumento pois a eficiência observada

foi de 37,8 % .

59

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6T e m p o / h o ra s

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

8


formado por tecido vegetal triturado suspenso em solução tampão apenas () ou contendo: PVP () e PVP com nitrato ().

4.3.4 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando o protetor PVP-VA com

diferentes concentrações de nitrato.


incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L ,10 mgN/L e 5 mgN/L de nitrato, tampão e

0,01g/mL polivinilpirrolidona (PVP). Observa-se um aumento contínuo da concentração de

nitrito no meio contendo tecido vegetal atingindo um máximo em 3,5 horas. A eficiência

observada foi de 34,7 % para 15 mg N/L.

60

0

1

2

3

4

5

6

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0T e m p o / m in

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 25 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por tecido vegetal triturado suspenso em solução tampão com diversas concentrações de nitrato: 15 mgN/L ( ), 10 mgN/L ( ), 5 mgN/L ( )

4.3.5 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando diferentes concentrações do

PVP-VA uma concentração fixa de 15 mgN/L de nitrato.


incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L de nitrato, tampão fosfato 100 mmol/l pH

6,0 e diversas concentrações de polivinilpirrolidona (PVP). Observa-se um aumento contínuo

da concentração de nitrito no meio contendo tecido vegetal atingindo um máximo em 4 horas.

A eficiência observada foi de 46 %,49% e 45% para 0,04 g/mL, 0,08 g/mL e 0,16 g/mL de

PVP, respectivamente. Esse comportamento pode ser explicado, pois a faixa de eficiência

máxima para essas concentração de PVP neste experimento estão muito próximas.

61

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 100 200 300 400 500

Tem po/ m in

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 26 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por tecido vegetal triturado suspenso em solução tampão com diversas concentrações de PVP: 0,04 g/mL ( ), 0,08 g/mL ( ) e 0,16 g/mL ( ).

4.3.6 Avaliação da atividade da nitrato redutase utilizando uma concentração de

0,04g/mL do protetor PVP-VA em diferentes concentrações de nitrato.


incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L, 12,5 mgN/L ,10 mgN/L, 7,5 mgN/L,5

mgN/L de nitrato, tampão fosfato 100 mmol/L pH 6,0 e 0,08 g/mL de polivinilpirrolidona

(PVP). Observa-se um aumento contínuo da concentração de nitrito no meio contendo tecido

vegetal atingindo um máximo em 3 horas. A eficiência observada foi de 58,7 %,56,8% ,

45,2% ,38,8% e 35,4% para 15 mgN/L, 12,5 mgN/L ,10 mgN/L, 7,5 mgN/L, 5 mgN/L,

respectivamente.

62

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0

T e m p o / m in

Con

cent

raçã

o ni

trito

(mgN

/L)

Figura 27 - Variação da concentração de nitrito formado em função do tempo. Meio formado por tecido vegetal triturado suspenso em solução tampão com 0,08 g/mL de PVP e diversas concentrações de nitrato: 15 mgN/L ( ), 12,5 mgN/L ( ), 10 mgN/L ( ), 7,5 mgN/L ( ), 5 mgN/L ( ).

A partir dos dados da figura 27, uma curva analítica foi traçada que poderá ser utilizada

na determinação da concentração de nitrato numa possível amostra a ser analisada.

63

y = 0 ,7307x - 2 ,2844R 2 = 0 ,983

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

0 5 10 15 20

C oncentração ( m gN /L)

Conc

entr

ação

( m

gN/L

)

Figura 28 - Curva analítica da concentração de nitrito formado em função da concentração de nitrato adicionado.


0,04g/mL do protetor PVP-VA em diferentes concentrações de nitrato e pHs.

Na figura 29 é apresentada a variação de nitrito formado durante a incubação de tecido

vegetal a partir de 15 mgN/L, 10 mgN/L e 5 mgN/L de nitrato, 0,04 g/mL de

polivinilpirrolidona (PVP) em diferentes pHs. Observa-se a melhor eficiência para a maioria

dos pHs em 6,0.

64

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

4 4 , 5 5 5 , 5 6 6 , 5 7 7 , 5 8p H

Con

cent

raçã

o ni

trito

( m

gN/L

)1 5 m g N / L1 0 m g N / L5 m g N / L

Figura 29 - Variação da concentração de nitrito em função do pH do meio reacional, considerando os valores de eficiência máxima para as de nitrato adicionadas


0,04 g/mL do protetor PVP-VA em diferentes pHs e concentrações de fosfato.

Para verificar a influência do poder tamponante apresenta-se na, Figura 30, a variação

de nitrito formado durante a incubação de tecido vegetal a partir de 15 mgN/L de nitrato; 0,04

g/mL de polivinilpirrolidona (PVP) em diferentes pHs e concentrações de fosfato. Observa-se

a melhor eficiência (49,6%) para pH 5,5 em fosfato 50 mmol/L, sendo a segunda melhor

eficiência (46,6%) para pH 6,2 em fosfato 100 mmol/L.

65

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 50 100 150 200 250

Concentração de fosfato (mmol/L)

Con

cent

raçã

o de

nitr

ito (m

gN/L

)

Figura 30 - Variação da concentração de nitrito em função da concentração de fosfato,

considerando os valores de eficiência máxima para os diferentes pHs a uma concentração fixa de nitrato adicionada. Legenda dos pHs 5,5 ( ), 6,0 ( ), 6,2 ( ) e 7,0 ( ).

Esses dados também foram representados pela eficiência em função do pH (Figura 31).

Observa-se uma diminuição da eficiência em tampão fosfato 200 mmol/L e 50 mmol/L

quando o pH aumenta, enquanto em tampão fosfato 100 mmol/L ao aumentar o pH até 6,2

ocorre aumento da eficiência. Esse comportamento pode ser explicado devido a variação da

força iônica.

66

0

1

2

3

4

5

6

7

8

5 5,5 6 6,5 7 7,5

pH

Con

cent

raçã

onitr

ito (m

gN/L

)

Figura 31 - Variação da concentração de nitrito em função do pH, considerando os valores de eficiência máxima para as diferentes concentrações de fosfato no tampão a uma concentração fixa de nitrato adicionada.Legenda das concentrações de fosfato 50 mmol/L (♦), 100 mmol/L (), 200 mmol/L ().

5 CONCLUSÕES E ETAPAS FUTURAS

A partir dos estudos realizados com três tipos distintos de extratos brutos pode-se

resumir suas principais características.

5.1 Fusarium

Na avaliação da nitrato redutase de Fusarium, na redução enzimática do nitrato para fins

analíticos, embora a conversão tenha chegado até 100% o mesmo apresentou baixa

linearidade e diversas desvantagens como:

67

- Tempo de 10 dias necessário para o crescimento da biomassa;

- O período de incubação de no mínimo 20 hs;

- Necessidade de equipamentos microbiológicos (muitas vezes ausentes nos laboratórios

de química analítica);

- O preparo e o custo dos meios de cultura;

- Está suscetível a contaminações;

- O descarte precisa ser auto-clavado;.

5.2 E.coli

Quando se utilizou nitrato redutase de E.coli o método apresentou boa linearidade, baixa

turbidez, mas apresentou eficiência reduzida de 27% e diversas desvantagens microbiológicas

assim como Fusarium. O cuidado deve ser ainda maior, pois E.coli é uma enterobacteria

capaz de contaminar os analistas.

5.3 Vigna radiata L.

Quando se utilizou nitrato redutase de broto de feijão o método apresentou boa

linearidade, baixa turbidez, boa eficiência 73% e muitas vantagens quando comparados com

as fontes de nitrato redutases microbiológicas:

- Preparo rápido e muito fácil;

- Obtido facilmente no comércio local;

- O tempo de reação é pequeno, de no máximo 6 hs;

- Os equipamentos utilizados são simples, facilitando o uso dessa fonte em laboratório

de análises clínicas;

- É inócuo para os analistas;

- O descarte é simples.

Desta forma observa-se que o método de análise utilizando nitrato redutase de broto de

feijão para a determinação de nitrato mostrou-se promissor para o monitoramento desta

68

espécie em amostras de água, com as seguintes vantagens: emprego de reagentes não

carcinogênicos, não adiciona cofatores (uma vez que os extratos brutos fornece os mesmos),

baixo consumo de reagentes, extremamente econômico, não gera resíduos tóxicos.

Etapas Futuras

- Padronizar protocolos de análise visando aumentar a repetibilidade do método;

-Validação do método (comparar com outros métodos utilizando águas de efluentes de

estação de tratamento de água);

-Estudar fontes similares;

-Uso de extrato bruto aplicado em análise por injeção em fluxo, substituindo a coluna de

cádmio.

69

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