transformação de plantas seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração...
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Transformação de Plantas
• Seleção de tecido vegetal competente para propagação ou regeneração
• Método de transferência de gene• Identificação de células transformadas por seleção• Regeneração de plantas de células transformadas• Plantas transgênicas analisadas para confirmar
presença do transgene - herança e estabilidade• Plantas transgênicas avaliadas para performance
Transferindo genes para plantas
• O processo de introdução de genes em plantas chama-se transformação genética
• O gene sendo transferido para a planta é chamado de transgene
• Plantas com modifiçações genética são denominadas de transformadas ou transgênicas
• Denominação geral = Organismos Geneticamente Modificados (OGM)
Transferindo DNA para células de plantas
Célula Vegetal
núcleo
parede celular membranacitoplasmática
transgene
1. DNA pode ser transferido por meio biológico (Agrobacterium) ou físico (bombardeamento)
2. DNA deve cruzar várias barreiras
3. DNA deve se integrar ao cromossomo no núcleo da célula
4. Cada célula transformada é única
5. Número de células transformadas é mínimo
citoplasma
Cronologia da Transformação de Plantas
1907 Identificação de Agrobacterium tumefaciens como agente causal de galhas
1974 Descoberta de elemento extra-cromossomial ligado à indução de galhas
1975 Aquisição de habilidade oncogênica por transferência de plasmídeo1977 Transferência e manutenção de T-DNA em células de plantas1980 Uso de plasmídeo Ti para introdução de genes em plantas1981 Transmissão Mendeliana de genes introduzidos por Ti1983 Construção de genes marcadores quiméricos
Engenharia de vetor Ti para introdução de genes sem oncogênese1984 Regeneração de plantas resistentes à kanamicina com herança
Mendeliana1985 Estabelecimento de transformação e regeneração por disco foliar1987 Transformação através de bombardeamento com micropartículas
Transformação de Plantas• 1. Agrobacterium tumefaciens como vetor
– método de escolha– limitação de hospedeiro
• 2. Bombardeamento com micropartículas– usado em Monocotiledôneas e Legumes– versatilidade de tecido alvo
• 3. Protoplastos– célula vegetal sem parede celular– totipotência - similar a bactéria– permeabilização reversa membrana
• PEG• Eletroporação
Agrobacterium tumefaciens
• Bactéria de solo Gram-negativa, tipo bacilo• Causa galha da coroa (“crown gall”): videira, maçã,
etc• Afeta mais dicotiledôneas e pouco monocotiledôneas• Família Rhizobiaceae• Outras espécies:
– Agrobacterium rhizogenes -raiz em cabeleira (“hairy root)
– Agrobacterium rubi - hospedeiros limitados
– Agrobacterium radiobacter - não tumorogênica (sem Ti)
Agrobacterium
• Biovar: características fisiológicas, químicas e nutricionais
• Biovar I: A. tumefaciens, A. radiobacter e poucas
A. rhizogenes
• Biovar II: maioria A. rhizogenes e A. rubi
• Biovar III: A. viti (A. tumefaciens)
Agrobacterium
• Infecção natural - ferimentos• Quimiotactismo - fenóis, açúcares, amino ácidos• Formação de tumores• Expressão de genes da bactéria transferidos e
integrados de forma estável ao genoma vegetal• Capacidade tumorogênica - plasmídeo Ti =
– Ti = Tumor Inducing - 150 a 250 kpb• Regiões do plasmídeo Ti importantes:
– região T-DNA - Transfer DNA– região vir - genes de virulência
Agrobacterium
Região T-DNA• Tamanho: de 12 a 24 kb• Limitada por seqüências repetidas diretas
imperfeitas– bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-DNA
• Contém genes de síntese de reguladores de crescimento (hormônios vegetais) e de opinas
• Transferem genes para direcionar metabolismo para manutenção da Agrobacterium
Agrobacterium
Região T-DNA
Síntese de reguladores de crescimento• Auxina
– genes iaaM (tms1): triptofano 2-monooxigenase – gene iaaH (tms2): indol-3-acetamida
• Citocinina– gene tmr: isopentenil transferase
• adição de cadeia isopentenil a 5’-AMP• adição de OH = transzeatina
iaaM (tms1)iaaH (tms2)
ipt (tmr)
AgrobacteriumRegião T-DNASíntese de opinas• compostos únicos e incomuns• fonte de C e N para Agrobacterium• favorece transferência conjugativa de Ti • condensação de açúcares ou ácido orgânico + amino ácido
– arginina + piruvato = octopina– arginina + a-ketoglutaraldeído = nopalina– glutamato bicíclico = agropina
Catálise de opinas– no Ti, mas fora região T-DNA– específico para a cepa indutora do tumor
Agrobacterium
Região vir• genes responsáveis pela síntese de enzimas da
transferência e integração do T-DNA – transporte do ssT-DNA-membranas e paredes– proteção contra nucleases
• região de 35-40 Kb• 8 operons: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG e virH• 25 genes• virA, virF e virG - monocistrônicos• outros –policistrônicos• animação
AgrobacteriumRegião vir• sistema regulador positivo: virA e virG• regulam os outros genes vir
VirA: expresso constitutivamente– proteína de membrana interna - histidina kinase– reconhece compostos fenólicos sob pH 5-5,8– auto-fosforilação e fosforilação de VirGVirG - fosforilado se torna ativo– ativa sua própria transcrição– ativa transcrição outros genes vir– seqüência de 12 pb - vir box
AgrobacteriumRegião vir• virC e virD - geração e processamento do T-DNA• reconhecem borda direita do T-DNA
– virD1:- relaxamento da fita dupla (topoisomerase)– virD2:- corte da fita simples (endonuclease) e formação de
complexo-T com o ssT-DNA e direcionamento– virC1 e virC2: complementam atividade de virD1 e virD2
• virB e virE - formação de elementos estruturais de movimento do T-DNA– virE2: proteína do tipo “single strand binding ptn) protegendo T-
DNA de degradação por nucleases e direcionamento– virB1 a virB11: formação de tubo de conjugação– virH (ou pinF): responsável desintoxicação (tipo citocromo)
Agrobacterium
Região vir• mutações em virA, virB, virD e virG : eliminam
formação de tumores
• mutações de virC , virE, virF e virH: restringem gama de hospedeiro
animação
Agrobacterium
• Região vir é suficiente para transferir qualquer T-DNA - reconhece bordas
• Gene indutores de tumores podem ser retirados e substituídos no T-DNA
Geração de Linhagens
deAgrobacterium
Desarmadas
Remoção de oncogenes
Sistema de vetores de
Agrobacteriumpara transformação
A. Co-integrado
B. Binário
Plasmídeo Binário
CruzamentoTriparental
Agrobacteriume Escherichiacom auxíliopRK2013
helper
Agrobacterium
• Genoma seqüenciado C58: 5.674.062 bases
• cromossoma circular:– 2.841.490 pb (59,4% G+C) - 2789 ptn
• cromossoma linear:– 2.075.560 pb (59,3% G+C) - 1882 ptn
• plasmídeo pAtC58:– 542.779 pb (57,3% G+C) - 550 ptn
• plasmídeo pTiC58:– 214.233 pb (56,7% G+C) - 198 ptn
Bombardeamento com Micropartículas
micropartículas cobertas com DNA construído, acelerados por explosão,
introduzidos em células vegetais
Vantagens:1. transformação de Monocot e Legumes2. simplificação nas construções3. co-transformação com várias
construções4. ausência de falsos positivos5. protocolos de transformação
simplificados
Transformação por Bombardeamento
Transformação por Bombardeamento
Métodos Alternativos
1. Fibra “Silicon Carbide”- fibras penetram parede celular com DNA aderido- cristais únicos 0,6 x 10 a 80 mm- suspensões celulares - milho, aveia e tabaco- simples e flexível - domínio público
2. Eletroporação de tecidos intactos- expressão transiente em pólen de tabaco, base de folha de cereais, embriões de caupi- transformação estável em sementes- padronização de equipamento - capacitor
3. Eletroforese - embrião de cevada e orquídeas
4. Microinjeção - rotina para célula animais- utiliza micromanipulador- uso de protoplasto - vacúolo- oneroso, complexo e demorado
Transformação de Plantas• Introdução de genes heterólogos• Alteração da expressão gênica
– superexpressão• promotor constitutivo ou induzível
– gene anti-senso ou senso - silenciamento
• Aplicações– Melhoramento genético– Plantas como biorreatores– Estudo de função
Tipos de genes
1. Genes estruturais codificam enzimas
2. Genes regulatórioscodificam proteínas que controlam genes estruturais
(fatores de transcrição)-> definem
QUANDO, QUANTO e ONDE
Promotor
Gene Estrutural
Região Codificadora de Proteína
Regulatório
RR
R
Enzima
Gene Estrutural
Estratégias de Modificação de Rotas
Metabólicas
INTRODUÇÃO DE GENE• codificando enzima não existente ou
não funcional ou pouco eficiente• gene sentido oposto - ANTISENSO
– GENE -> ENEG• gene com controle alterado (promotor)
Reação em Rotas Metabólicas
A B C DX y u
E
z
Gene em Senso e Antisenso
Promotor
GGCAAGCT ENEG
Senso
Promotor
GENE AGCTTGCC
Antisenso
Rota Metabólica de Biossíntese
A B C DX y u
E
z
Reação Normal
Produtos D e E feitos
Rota Metabólica de Biossíntese
Introdução de novo gene
A B C DX y u
E
z
Introdução de gene w codificando enzima W
Produtos D e W feitos
WW
transformação
Reação em Rotas MetabólicasAntisenso
A B C DX y u
E
z
Introdução de gene y anti-senso inibindo Y
Produtos D e E não são feitos
transformação
Reação em Rotas Metabólicas:
Ex. resistência à herbicidaX
Y
Z
Amino Ácidos
EPSPS
Enzima fundamental
para sintetizar um grupo de amino ácidos
•Roundup inibe EPSPS• Carência de Aminoácidos• Planta morre
Soja RoundupReady
X
Y
Z
Amino Ácidos
EPSPS
CP4-EPSPS
Forma da enzima que NÃO
é inhibida por Roundup
“Bypass” MetabólicoAdicionando gene
codificando EPSPS que permite as plantas fazer
amino ácidos após aplicação de Roundup