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TÍTULO: AÇÃO DE DITERPENOS E SESQUITERPENO ISOLADOS DE DIFERENTES ESPÉCIES DECOPAIFERAS SPP. COM POTENCIAL ANTI-HELICOBACTER PYLORI IN VITROTÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDOCATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDEÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINASUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCAINSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): LUCAS KOZOSKI DE LIMAAUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINSORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): DR. JAIRO KENUPP BASTOS, DR. RODRIGO CÁSSIO SOLA VEZIANI, DR.SERGIO RICARDO AMBROSIO, MARIA ANITA LEMOS VASCONCELOS AMBROSIOCOLABORADOR(ES):
1. RESUMO
De acordo com a OMS, as mortes causadas por doenças infecciosas ocorrem em
quase nove milhões de pessoas por ano em países menos desenvolvidos de baixa
renda e escolaridade, as mortes por doenças infecciosas incluindo as manifestações
procedentes de infecções respiratória, síndrome da imunodeficiência adquirida,
doenças diarreicas, malária, tuberculose e infecções gástricas, são mais frequentes
e responsáveis por quase um terço dos óbitos. Helicobacter pylori é uma bactéria
microaerófila, Gram-negativa, espiralada que está presente no estômago humano de
forma comensal, entretanto, em situações de desequilíbrio da homeostase do
hospedeiro, este passa a assumir um perfil virulento capaz de desencadear injúrias
no sistema digestório. É uma bactéria de distribuição mundial e possui a estimativa
de já ter infectado 50% ou mais da população mundial, tornando-se uma das
infecções mais comuns do mundo. Atualmente vários estudos com espécies de
Copaifera estão relacionados aos seus compostos bioativos, entre eles, a classe dos
diterpenos e sesqueterpeno, que se mostram promissores no combate aos
microrganismos causadores de doenças que afetam de modo geral os seres
humanos. Os diterpenos são uma ampla e diversificada classe de produtos naturais
originados a partir da condensação de quatro unidades de isopreno - C5H8, são
biossintetizados a partir do ácido mevalônico, através do pirofosfato de 2E, 6E, 10E-
geranilgeranila (GGPP). O objetivo desse estudo foi avaliar efeito anti-Helicobacter
pylori “in vitro” dos diterpenos e sesquiterpeno isolado de diferentes espécies de
Copaifera spp. Para avaliação da atividade antibacteriana foram utilizados os
métodos de diluição em caldo visando à determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM), Concentrações Bactericidas Mínimas (CBM). Os resultados da
CIM/CBM exibiram valores promissores para os diterpenos e um sesquiterpeno
variaram de 3,12 a 400 μg/mL e 3,12 a 400 μg/mL, respectivamente. Assim, com
base neste estudo, pode-se concluir que os diterpenos e o sesquiterpeno isolado de
diferentes espécies de Copaifera spp. apresentaram atividade antibacteriana
promissora frente a H. pylori.
2. INTRODUÇÃO
De acordo com a organização mundial da saúde, as mortes causadas por
doenças infecciosas ocorrem em quase nove milhões de pessoas por ano (WHO,
2013a), em países menos desenvolvidos de baixa renda e escolaridade, as mortes
por doenças infecciosas incluindo as manifestações procedentes de infecções
respiratória, síndrome da imunodeficiência adquirida, doenças diarreicas, malária,
tuberculose e infecções gástricas, são mais frequentes e responsáveis por quase um
terço dos óbitos (WHO, 2013b).
A maioria das doenças infecciosas é decorrente de um simples agente
causador, cuja identificação é de extrema importância, não apenas para medidas de
controle como também para o diagnóstico e tratamento (FAUCI e MORENS, 2012).
São microrganismos patogênicos ou oportunistas como vírus, fungos, bactérias e
parasitas que acometem pacientes diagnosticados com doenças infecciosas, sendo
transmitidas de forma direta ou indireta entre as pessoas (WHO, 2014a), o
surgimento de infecções e doenças crônicas é dependente do habitat do indivíduo,
baseando-se na microbiota do hospedeiro (BEIRÃO et al., 2014).
As infecções gástricas ainda são motivos de preocupação para áreas como a
microbiologia, gastroenterologia e principalmente a oncologia, uma vez que
frequentemente a presença da bactéria Helicobacter pylori está diretamente
relacionada com quadros clínicos severos de infecções, podendo evoluir para o
desenvolvimento do câncer de estômago (HAJIMAHMOODI, 2011; GRACÍA et al,
2014, PROCTOR e DEANS, 2014).
H. pylori é uma bactéria microaerófila, Gram-negativa, espiralada que está
presente no estômago humano de forma comensal, entretanto, em situações de
desequilíbrio da homeostase do hospedeiro, este passa a assumir um perfil virulento
capaz de desencadear injúrias no sistema digestório (HAJIMAHMOODI et al., 2011).
É uma bactéria de distribuição mundial e possui a estimativa de já ter infectado 50%
ou mais da população mundial, tornando-se uma das infecções mais comuns do
mundo (BRUNTON et al, 2006).
Os principais tratamentos consistem na terapia tripla e quádrupla, onde a
terapia tripla, que consiste de um inibidor de bomba de prótons como o omeprazol e
combinações de dois antibióticos (amoxilina e claritromicina ou amoxilina e
metronidazol) e a terapia quádrupla adiciona um fármaco que contém bismuto
(BONIFÁCIO et al., 2014), levando a uma diminuição das doenças relacionadas a
esta bactéria e na prevalência da infecção no mundo. Entretanto, o sucesso destes
tratamentos está agora comprometido pelo aumento da resistência antimicrobiana
do patógeno (MEGRAUD et al., 2014), tornando se um motivo de preocupação
mundial (BIBI et al., 2011).
Adicionalmente, a rápida evolução que torna as bactérias cada vez mais
resistentes tem resultado em uma drástica diminuição do arsenal de drogas
disponíveis, gerando cepas resistentes a quase todos os agentes antimicrobianos,
fato que torna ainda mais necessária a busca por novas fontes antimicrobianas,
principalmente de origem natural (ROCHA et al.; 2011). Os extratos vegetais
mostram uma grande oportunidade de reverter este quadro devido à versatilidade
neles presente (DAS et al, 2010). Assim, a fitoterapia e as plantas medicinais
proporcionam potenciais terapêuticos e econômicos visados (COSTA et al., 2010).
As plantas medicinais possuem grande diversidade química em sua
composição, se destacando no mercado atual e motivando ainda mais pesquisas
nessa área. Possuem princípios ativos, conhecidos como compostos secundários do
metabolismo, desenvolvidos para defesa contra patógenos e são pertencentes a
diferentes classes como terpenos, alcalóides, quinonas, lignanas, flavonoides,
xantonas, lactonas, entre outras. Os extratos vegetais e óleos essenciais são uma
alternativa na diminuição do uso de medicamentos sintéticos, em vista do custo
reduzido, facilidade de acesso e pela capacidade de melhorar a atividade
terapêutica (VENTUROSO et al., 2011).
É importante frisar que o sucesso da erradicação do H. pylori não depende
apenas da susceptibilidade da linhagem bacteriana ao antimicrobiano utilizado na
terapia, mas este é um dos principais fatores, especialmente se considerarmos
pacientes infectados com linhagens sensíveis ao antimicrobiano (SIQUEIRA, 2007).
Portanto, a busca de um novo agente que seja eficaz e livre de efeitos colaterais é
desejável (MAZZOLIN et al. 2010, MANYI-LOH et al., 2012).
O termo produto natural é usualmente associado com os metabólitos
secundários ou micromoléculas produzidos por um organismo que geralmente
apresentam estrutura complexa, baixo peso molecular, marcantes atividades
biológicas e são encontrados em concentrações relativamente baixas, na maioria
das vezes o metabolismo secundário funciona como mecanismo de defesa contra
herbívoros, microrganismos, insetos e competição entre plantas (DEWICK et al.,
2009).
O Brasil possui a maior biodiversidade do planeta com 13% do total de
espécies existentes, mas apenas 1.100 espécies e seus compostos biativos foram
estudados (GOUVEIA et al., 2007). Desta biodiversidade destaca-se a Mata
Atlântica, que Segundo Colombo e Joly (2010) é um bioma muito complexo, maior
do que a maioria das florestas amazônicas, com grande diversidade e riqueza de
espécies em níveis extremamente elevados.
O nome copaíba é de origem tupi “cupa-yba” que significa árvore de deposito,
devido ao óleo-resina que é encontrado em seu interior (LAZARIS, 2009). Copaifera
é um gênero botânico, pertencente à família Leguminoseae, conhecido no cotidiano
popular como “copaíba, copaíbeiras e pau d’óleo” e possui mais de 30 espécies
vinculadas a América Latina (COSTA et al, 2011) e África Ocidental, comumente
encontrada no Brasil nas unidades federativas do Sudeste, Centro-Oeste e região
Amazônica (PIERI et al., 2009). Destaca-se pela sua ampla utilização para diversos
fins, farmacológicos ou não (LEANDRO et al., 2012).
Copaiferas apresentam crescimento lento, alcançando de 25 a 40 metros de
altura, podendo viver até 400 anos (Figura 2). As espécies deste gênero possuem
troncos ásperos, de coloração escura, medindo de 0,4 a 4 metros de diâmetro,
casca aromática, folhagem densa, flores pequenas e frutos secos do tipo vagem
(VEIGA JR E PINTO, 2002; LEANDRO et al., 2012).
Atualmente vários estudos com espécies de Copaifera estão relacionados aos
seus compostos bioativos, entre eles, a classe dos diterpenos, que se mostram
promissores no combate aos microrganismos causadores de doenças que afetam de
modo geral os seres humanos (PORTO et al., 2009; SOUZA et al. 2011a; FONSECA
et al., 2013). Os diterpenos são uma ampla e diversificada classe de produtos
naturais originados a partir da condensação de quatro unidades de isopreno - C5H8
(DEWICK, 2002), são biossintetizados a partir do ácido mevalônico, através do
pirofosfato de 2E, 6E, 10E-geranilgeranila (GGPP). De acordo com o número de
anéis e o padrão de ciclização de suas estruturas químicas, os diterpenos são
divididos em acíclicos, bicíclicos, tricíclicos, tetracíclicos, macrocíclicos e mistos
(HANSON, 2004; GARCIA et al., 2007). Em 2002, Veiga jr e Pinto relatavam que 28
diterpenos, foram descritos nos óleos de copaíba sendo todos estudados, esses
diterpenos pertenciam aos esqueletos caurano, labdano e clerodano. O ácido
copálico foi o único encontrado em todos os óleos analisados, e por esta razão, este
diterpeno pode ser considerado como biomarcador de óleos de copaíba. (ANA)
Na literatura podemos encontrar alguns trabalhos relacionados à atividade
antimicrobiana dos diterpenos isolados de espécies de copaifera (TINCUSI et al.,
2002; SOUZA et al., 2011a, SOUZA et al., 2011b; ABRÃO et al., 2015), como
também outras atividades como anti-inflamátoria (PAIVA et al., 2002), relaxante
muscular (CUNHA et al., 2003), tripanocida (VIEIRA et al., 2002), antitumoral
(OHSAKI et al., 1994), larvicida contra o Aedes aegypti (GERIS et al., 2008;
VALLOTO et al., 2011) dentre outras atividades. Frente aos aspectos analisados,
verifica-se a importância de investigar os diterpenos isolados de espécies de
copaiferas como alternativas terapêuticas no combate à bactérias multirresistentes.
Apesar da extensa literatura sobre substancias isoladas das diferentes
espécies de Copaifera spp, não há até o momento estudos de atividade
antimicrobiana sobre os diterpenos e o sesqterpeno, portanto, a pesquisa vem
contribuir deforma significativa para o potencial dos diterpenos e o sesqterpeno
frente à cepa de H. pylori.
3. OBJETIVO
O objetivo desse estudo foi avaliar efeito anti-Helicobacter pylori “in vitro” de
diterpenos e sesquiterpeno isolado de diferentes espécies de Copaifera spp.
4. METODOLOGIA
Os diterpenos e o sesquiterpeno avaliados neste estudo, foram fornecidos
gentilmente pelo Prof. Dr. Sérgio Ricardo Ambrósio, pesquisador e coordenador do
Curso de Pós-Graduação em Ciências da Universidade de Franca e vice-
coordenador do projeto temático intitulado “Validação química e farmacológica de
extratos e princípios ativos de espécies de Copaifera” (processo nº 2011/13630-7).
A CIM é definida como a menor concentração do agente antimicrobiano capaz de
inibir o crescimento bacteriano. Será utilizado o método de determinação da CIM por
microdiluição em microplaca segundo a metodologia preconizada pelo “Clinical and
Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2012), com adaptações, empregando a
resazurina como revelador do crescimento bacteriano.
E para a técnica da concentração inibitória mínima permite definir qual a menor
concentração dos deterpenos e o sesquiterpeno que exibiu uma ação bactericida
comprovada pela ausência de colônias no ágar Brucella. A interpretação do efeito
bacteriostático é aplicada quando o valor da CBM obtido for acima da CIM,
indicando que a CIM da substância apresentou uma ação inibitória, porém
reversível, atribuindo assim, um efeito bacteriostático.
5. DESENVOLVIMENTO
A bactéria utilizada no estudo Helicobacter pylori (ATCC 43526) será proveniente
da American Type Culture Collection (ATCC) mantida na coleção de cultura do
LaPeMA/UNIFRAN, sob criopreservação a -80°C. Para cada experimento, a bactéria
será inoculada previamente em meio de cultura ágar Brucella adicionado de sangue
desfibrinado de carneiro (5%), para confirmação da pureza da cepa.
Em uma balança analítica foi pesado um miligrama de cada diterpenos e
sesquiterpeno e dissolvido em 125μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e posteriormente
acrescentado 500μL de caldo Brucella. A concentração final de DMSO não será
superior a 5% e a solução nesta porcentagem será utilizada como controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de inoculação esterilizada, serão transferidas
culturas do microrganismo desenvolvidos em ágar Brucella adicionado de sangue
desfibrinado de carneiro (5%) para tubos contendo solução PBS (estéril) pH 7,0 até
obter turvação igual ao tubo 0,5 da escala McFarland, que corresponde a
aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL. Tal concentração, ainda será confirmada por
leitura espectrofotométrica, no comprimento de onda de 625 nm, equivalente a uma
transmitância de 96. Em uma microplaca esterilizada de 96 orifícios foi depositado
um total de 50μL do caldo Brucella com 50% soro fetal bovino, 50μL substância
teste, posteriormente mais 30 μL do caldo e 20μL suspensão microbiana, de forma a
obter-se uma concentração de substâncias puras de 0,195 a 400μg/mL, permitindo
determinar a concentração necessária para inibir o crescimento do microrganismo a
ser avaliado. Em um dos orifícios será feito o controle da cultura, o qual deve
apresentar crescimento bacteriano devido à ausência do agente antimicrobiano. Em
outros orifícios o controle de esterilidade do caldo e da amostra, e em outro o
controle do solvente (DMSO) utilizado para a solubilização da amostra. A tetraciclina
foi o controle positivo.
As placas foram incubadas a 37°C em estufa bacteriológica com 10% de CO2
por 72 horas. Após o tempo de incubação será adicionado em cada poço 30μL de
resazurina na concentração padronizada de 0,1mg/mL preparado em solução
aquosa. Para a realização da leitura será observada a mudança de coloração da
mesma através de uma reação de oxi-redução. A placa foi re-incubada durante 2
horas, sendo então observada a alteração da cor azul (sem crescimento bacteriano)
e a cor rosa (crescimento bacteriano).
A determinação da atividade bactericida ou bacteriostática será realizada
com todos os diterpenos e o sesquiterpeno. A solução de menor concentração da
amostra (CIM) capaz de impedir o crescimento bacteriano será utilizada para avaliar
se esses metabólitos apenas inibem o crescimento (bacteriostático) ou se eles
causam a morte (bactericida) desses microrganismos. O conteúdo do orifício
contendo essa solução foi inoculado em um novo ágar Brucella adicionado de
sangue desfibrinado de carneiro (5%). O meio foi incubado a 37°C com 10% de CO2
por 72 horas. O crescimento do microrganismo indicará que os metabólitos na CIM
são bacteriostáticos, enquanto que a ausência de crescimento indicará que os
derivados na CIM são bactericidas.
6. RESULTADOS
No presente trabalho foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a
Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos diterpenos e do sesquiterpeno de
diferentes espécies de Copaifera spp.
Segundo Ríos & Recio (2005) e Gibbons (2008), as substâncias isoladas que
apresentarem CIM inferior ou igual 10 μg/mL são considerados promissores nas
pesquisas de novos agentes antimicrobianos, sendo assim estes foram os
parâmetros utilizados no presente estudo para determinar se o diterpenos e o
sesquiterpeno Copaiferas foram promissores ou não.
Tabela 1: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)
dos deterpenos e do sesquiterpeno de diferentes Copaifera spp. e seus efeitos frente a H.
pylori
Amostra
Helicobacter pylori
Espécie
vegetal CIM CBM Efeito
2.11* C. pubiflora 25 μg/mL 25 μg/mL Bactericida
3.5* C. pubiflora 100 μg/mL 100 μg/mL Bactericida
4.11* C. pubiflora 100 μg/mL 100 μg/mL Bactericida
3.8* C. pubiflora 25 μg/mL 25 μg/mL Bactericida
Ácido copálico** C. multijuga 6,25 μg/mL 6,25 μg/mL Bactericida
Isômero do ácido copálico** C. duckei 12,5 μg/mL 12,5 μg/mL Bactericida
Ácido ent- agático reduzido** C. duckei 100 μg/mL 100 μg/mL Bactericida
* Diterpenos em fase final de elucidação estrutural **Diterpenos ***Sesquiterpeno
Os resultados da Tabela 1 demonstram que todos os diterpenos e do
sesquiterpeno foram efetivo contra H. pylori apresentando valores de CIM entre 3,12
a 400 μg/mL. O ácido caurenóico, ácido copálico, ácido hardwiickico foram os mais
promissores com efeito contra H. pylori com uma concentração de 3,12μg/mL,
6,25μg/mL e 6,25μg/mL, respectivamente.
Os resultados de CBM demonstram todos diterpenos e o sesquiterpeno
apresentaram valores entre 3,12 a 400 μg/mL. Todos diterpenos e do sesquiterpeno
apresentou efeito bactericida para o H. pylori.
A CIM e CBM da Tetraciclina usada como controle positivo foi de resultado
0,312 μg/mL, respectivamente; sendo assim um efeito bactericida.
Os controles de esterilidade realizados para validação da técnica (caldo
Brucella, solvente, soluções da substância e do controle positivo), inclusive os
controles de crescimento da cultura apresentaram-se conforme os padrões
estabelecidos. O controle do solvente (DMSO) a concentração de 5% em solução
aquosa não interferiu na atividade antibacteriana.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando os resultados obtidos neste trabalho com base nas condições
experimentas, pode-se concluir que:
Os ácidos caurenóico, copálico e hardwiickico apresentaram CIM inferior a 10
μg/mL, sendo considerados promissores nas pesquisas de novos agentes anti-
Helicobacter pylori.
Ácido poliático ** C. duckei 6,25 μg/mL 6,25 μg/mL Bactericida
Ácido caurenóico** C. oblongifolia 3,12 μg/mL 3,12 μg/mL Bactericida
Caurenol Sintética 400 μg/mL 400 μg/mL Bactericida
Ácido hardwiickico** C. pubiflora 6,25 μg/mL 6,25 μg/mL Bactericida
Ácido poliático** C. pubiflora 12,5 μg/mL 12,5 μg/mL Bactericida
(-)- trans-caryophylline*** C. multijuga 50 μg/mL 50 μg/mL Bactericida
Ácido ent-agático** C. duckei 100 μg/mL 100 μg/mL Bactericida
Tetraciclina *** 0,312 μg/mL 0,312 μg/mL Bactericida
Em relação a Concentração Inibitória Mínima, todos diterpenos e o sesquiterpeno
apresentaram atividade bactericida.
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