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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
CAMPUS DE SOBRAL
THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO
ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES
DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÃO INDUZIDA
POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS
SOBRAL – CE
2013
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THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO
ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE
CONVULSÃO INDUZIDA POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa dePós-Graduação em Biotecnologia – Curso de Medicina,da Universidade Federal do Ceará – Campus de Sobral,como requisito parcial para obtenção do Título de Mestreem Biotecnologia.Área de concentração: Macromoléculas.
Orientador: Prof. Dr. Gerado Cristino Filho
Sobral – CE
2013
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Dados Internacionais de Catalogação na PublicaçãoUniversidade Federal do Ceará
Biblioteca Curso de Medicina de Sobral
P722e Pinheiro, Thales Fontenele Moraes.Estudos dos efeitos neuroprotetores da trimetazidina no modelo de convulsão induzida por
pilocarpina em camundongos. / Thales Fontenele Moraes Pinheiro. – 2013.89 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Curso de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Sobral, 2013.
Área de Concentração: Macromoléculas. Orientação:Prof. Dr. Gerardo Cristino Filho.Coorietanção: Profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar
1. Trimetazidina. 2. Fernobarbital 3. Pilocarpina . I. Título.
CDD 616.853
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THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO
ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE
CONVULSÃO INDUZIDA POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programade Pós-Graduação em Biotecnologia daUniversidade Federal do Ceará – Campus deSobral, como requisito parcial para obtenção doTítulo de Mestre em Biotecnologia.Área de concentração: Macromoléculas.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof. Dr. Gerardo Cristino Filho (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC) – Campus Sobral
___________________________________________________
Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos
Universidade Federal do Ceará (UFC)
___________________________________________________
Profa. Dra. Danielle Silveira Macêdo
Universidade Federal do Ceará (UFC)
5
AGRADECIMENTOS
À minha esposa Lissiana, pelo amor, carinho, dedicação e companheirismo, no apoio ecompreensão nos momentos de ausência.
À minha filha Lícia, pelo sorriso e abraço de todos os dias que me dão forças para continuar, epor tudo o que tem me ensinado desde que veio ao mundo.
Aos meus pais, Tália e João Eudes, meus irmãos, Luciano e Eudes, pelo apoio durante todos osmomentos da minha vida.
Ao professor Dr. Gerardo Cristino Filho, pela orientação e ensinamentos que permitiram aelaboração desse trabalho.
À Professora Dra. Mirna Marques Bezerra, cujo apoio foi fundamental neste projeto.Ao corpo docente do programa de Biotecnologia, pela oportunidade de receber conhecimentos
que permitiram meu crescimento pessoal e profissional, pelos momentos de reflexões e críticasconstrutivas.
Aos alunos de iniciação científica, Jonatas, Luziana, Emanuel, Tarcísio e Rayane, que, foramfundamentais para a realização dos experimentos.
À amiga doutoranda Emmanuelle Noronha, pela amizade verdadeira e apoio nos experimentos.Aos colegas de mestrado pelo apoio nas disciplinas, em especial, Alexandre, Anita e Ricardo
(doutorando), que me incentivaram em todos os momentos difíceis.À equipe de apoio do laboratório e hospedaria de animais, por sempre garantir que os
experimentos sempre tivessem sucesso.À equipe de Laboratório de Farmacologia da UFC Fortaleza, pelo apoio nas análises de
Cromatografia.À Universidade Federal do Ceará (UFC) – Campus Sobral, e ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, pela oportunidade de realização de um Curso de Mestrado.Aos animais de experimentação, que sacrificam a vida no altar da ciência e garantem um mundo
melhor para nós humanos.
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RESUMO
A epilepsia é uma doença neurológica que afeta aproximadamente 1% da população no mundotodo. Atualmente, as drogas antiepilépticas convencionais disponíveis promovem o controle das crises ea melhora de apenas cerca de 75 - 80% dos pacientes. A maior limitação para o uso prolongado dessesagentes está relacionada aos inúmeros efeitos adversos que apresentam. Portanto, o desenvolvimento denovos agentes antiepilépticos com melhor eficácia e menos efeitos adversos é de suma importância parapesquisa médica. Os íons cálcio desempenham um importante papel na gênese da crise convulsiva. Atrimetazidina utilizada no tratamento de doenças isquêmicas preserva o funcionamento das bombasiônicas e o fluxo transmembrana de cálcio, sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. A literaturatem demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes e antiinflamatórias em váriosmodelos experimentais em animais. Muitos estudos mostraram que a trimetazidina apresenta efeitoprotetor em lesões isquêmicas não apenas no coração, mas também no cérebro, pulmão, rim, intestino efígado. O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos da trimetazidina sozinha ou associadaao fenobarbital no modelo de convulsão induzida por pilocarpina e determinar seus efeitos sobre aneurodegeneração envolvida na fisiopatologia dessa doença. Os animais (camundongos Swiss adultosmachos, 20-30g) receberam injeções de trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/Kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/Kg, i.p.) ou solução salina - NaCl 0,9%, i.p. durante sete dias. Após60 minutos da última injeção das drogas em estudo ou veículo, foi administrada pilocarpina na dose 400mg/Kg, i.p. ou 320 mg/kg, i.p. depois os animais foram submetidos aos testes comportamentais e emseguida foram sacrificados e seus cérebros dissecados para realização das análises neuroquímicas. Aadministração de TMZ reduziu o número de mortes em todas as doses testadas, todavia a maior dose (20mg/Kg) mostrou melhor efeito, aumentou a latência de convulsão em 41% (11,76±0,75) comparado aocontrole (8,36±0,41), levou à ausência de convulsões em 10% dos animais; reduziu a ocorrência deestado epiléptico em 10% e protegeu 29% dos animais da morte. Foi verificado um aumento dasconcentrações de MDA no hipocampo dos animais tratados com pilocarpina (Controle = 98,8 ± 5,5;PILO = 336,5 ± 25,2), esse efeito foi parcialmente revertido com o pré-tratamento com TMZ nas dosesde 10 e 20 mg/kg (TMZ5 = 284,6 ± 19,7; TMZ10 = 171,3 ± 20,1; TMZ20 = 175,3 ± 20,1). A associaçãodo TMZ na menor dose (5 mg/kg) com a dose sub-anticonvulsivante de FEN (10 mg/kg) promoveuredução dos níveis de MDA em 48% (TMZ5+FEN10 = 174,6 ± 23,0) quando comparado com o grupocontrole. Resultados semelhantes foram observados com a determinação das concentrações denitrito/nitrato. Além disso, o TMZ foi capaz de reverter as alterações produzidas por pilocarpina nosníveis de GABA e glutamato. Os resultados deste estudo sugerem que a trimetazidina possui atividadeanticonvulsivante no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos, possivelmentedevido a sua ação modulatória nos canais de cálcio.
Palavras-chave: Trimetazidina. Fenobarbital. Antioxidante. Pilocarpina. Convulsões.
7
ABSTRAT
Epilepsy is a neurological disease that affects approximately 1% of the population worldwide.Currently, the conventional antiepileptic drugs available promote seizure control and improvement ofonly about 75-80% of patients. The biggest limitation to the prolonged use of these agents is related tonumerous adverse effects they present. Therefore, the development of new antiepileptic drugs withbetter efficacy and fewer adverse effects is of paramount importance for medical research. Calcium ionsplay an important role in the genesis of seizures. Trimetazidine used in the treatment of ischemicdiseases preserves the operation of ionic pumps and transmembrane flux of calcium, sodium andpotassium while maintaining cellular homeostasis. The literature has shown that trimetazidine anti-inflammatory and antioxidant properties in several experimental animal models. Many studies haveshown that trimetazidine had a protective effect on ischemic injury not only in the heart but also in thebrain, lung, kidney, intestine and liver. The present work aims to study the effects of trimetazidine aloneor associated with phenobarbital on seizure model induced by pilocarpine and determine their effects onneurodegeneration involved in the pathophysiology of this disease. The animals (adult male Swiss mice,20-30g) were injected with trimetazidine (5, 10 and 20 mg / kg, ip), phenobarbital (10 and 30 mg / kg,ip), clonazepam (0.5 mg / kg ip) or saline - 0.9% NaCl ip for seven days. 60 minutes after the lastinjection of vehicle or drug under study was administered at a dose pilocarpine 400 mg / kg, ip or 320mg / kg, i.p. after the animals were subjected to behavioral tests and were then sacrificed and their brainsdissected for neurochemical analysis performance. TMZ administration reduced the number of deaths atall doses tested, but the highest dose (20 mg / kg) showed better effect, increased the latency of seizuresin 41% (11.76 ± 0.75) compared to control ( 8.36 ± 0.41) led to absence seizures in 10% of animals,reduced the occurrence of status epilepticus in 10% and 29% of animals protected from death. Therewas an increase of MDA concentration in the hippocampus of animals treated with pilocarpine (Control= 98.8 ± 5.5, 336.5 ± 25.2 = PILO), this effect was partially reversed by pretreatment with the TMZDoses of 10 and 20 mg / kg (TMZ5 = 284.6 ± 19.7; TMZ10 = 171.3 ± 20.1; TMZ20 = 175.3 ± 20.1).The combination of TMZ at the lowest dose (5 mg / kg) with anticonvulsant dose of sub-PHE (10 mg /kg) caused a reduction in the levels of MDA by 48% (TMZ5 FEN10 + = 174.6 ± 23.0) when comparedwith the control group. Similar results were observed with the determination of the concentrations ofnitrite / nitrate. Also, the TMZ was able to reverse the changes produced by pilocarpine in the levels ofglutamate and GABA. The results of this study suggest that trimetazidine possesses anticonvulsantactivity in the model of pilocarpine-induced seizures in mice, possibly due to its modulatory action oncalcium channels.
Keywords: Trimetazidine. Phenobarbital. Antioxidant. Pilocarpine. Seizures.
8
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Modelos experimentais de epilepsia 20
Quadro 2 - Fármacos antiepilépticos 27
Quadro 3 - Estrutura química da trimetazidina 29
Quadro 1 - Protocolo de Tratamento Experimental do Tratamento dos Animais 32
Quadro 2 - Parâmetros comportamentais observados após a injeção de
pilocarpina
33
Quadro 3 - Escala de Racine para intensidade de respostas motoras dos animaisà injeção de pilocarpina
34
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação comfenobarbital (FEN) nas alterações comportamentais e convulsõesinduzidas por PILO em camundongos........................................... 41
Tabela 2- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação comfenobarbital (FEN) na escala de Racine utilizando modelo deconvulsão induzido por pilocarpina em camundongos...................
45
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Potencialização da atividade anticonvulsivante do Fenobarbital (FEN
10mg/Kg) pela associação com Trimetazidina (TMZ 5mg/kg)
42
Figura 2 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas
com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em hipocampo de camundongos
tratados com PILO (320mg/kg, i.p.)
47
Figura 3 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas
com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleos da base de
camundongos tratados com PILO (320mg/kg, i.p.)
49
Figura 4 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas
com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtex pré-frontal tratados
com PILO (320mg/kg, i.p.)
51
Figura 5 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em
hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão
com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
53
Figura 6 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito/nitrato em núcleos
da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com
pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
55
Figura 7 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito/nitrato em córtex
pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com
57
11
pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
Figura 8 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, sobre os níveis de GSH em hipocampo de camundongos
submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
59
Figura 9 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, sobre os níveis de GSH nos núcleos da base de camundongos
submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
61
Figura 10 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, sobre os níveis de GSH em córtex pré-frontal de camundongos
submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
63
Figura 11 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN, FEN ou CNZP sobre os níveis de MPO em hipocampo de
camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina
(320mg/kg, i.p.)
65
Figura 12 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN na concentração do GLU em hipocampo de camundongos
submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
67
Figura 13 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com
FEN na concentração do GABA em hipocampo de camundongos
submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)
69
12
LISTA DE ABREVIATURAS
Ach - Acetilcolina
ANOVA - Analise de variancia
ATP - Adenosina tri-fosfato
CEPA - comitê de ética em pesquisa animal
CNZP - Clonazepam
CPF - córtex pré-frontal
DTNB 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico)
EPM - Erro padrao da media
ERO - Especies reativas do oxigenio
FEN - Fenobarbital
GABA - Acido gama-amino butirico
GSH - Glutationa Reduzida
HC - hipocampo
HPLC - Cromatografia liquida de alto desempenho
MDA - Malonildialdeido ou malondialdeido
MPO - Mieloperoxidase
MTT - 3-( 4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
NB - Núcleos da Base
nm - nanômetro
NMDA - N-metil-D-aspartato
PILO - Pilocarpina
ROS - espécie reativa de oxigênio
SCP - Sinais colinérgicos periféricos
SLN - Salina
SNC - Sistema Nervoso Central
TBA - Acido tiobarbitúrico
TBARS - Substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TMZ - Trimetazidina
13
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 15
1.1. Epilepsia 15
1.2. Histórico 16
1.3. Definição e classificação das crises epilépticas 17
1.4. Modelos animais de epilepsia 19
1.4.1. Modelo de Convulsões Induzidas por Pilocarpina 22
1.5. Epilepsia e estresse oxidativo 23
1.6. Drogas antiepilépticas 26
1.6.1. Trimetazidina 28
2. OBJETIVOS 30
2.1. Gerais 30
2.2. Específicos 30
3. METODOLOGIA 31
3.1. Animais 31
3.2. Drogas utilizadas nos tratamentos 31
3.3. Protocolo de tratamento dos grupos experimentais 31
3.4. Estudo comportamental 33
3.5. Determinação da atividade dos sistemas antioxidantes 34
3.5.1. Determinação da concentração da glutationa reduzida (GSH) 34
3.6. Determinação do índice de peroxidação lipídica e produção de nitrito 35
3.6.1. Determinação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) 35
3.6.2. Determinação do conteúdo de nitrito 36
14
3.7. Determinação das concentrações de aminoácidos com HPLC 36
3.8. Determinação da Mieloperoxidase (MPO) 37
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 38
5. RESULTADOS 39
5.1. ESTUDO COMPORTAMENTAL 39
5.1.1 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-
tratados ou não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com
fenobarbital (TMZ+FEN), fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP).
39
5.1.2 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-
tratados ou não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com
fenobarbital (TMZ+FEN), fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP) na escala de
Racine
43
5.2. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES DO PRÉ-
TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU
CLONAZEPAM NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR
PILOCARPINA
46
5.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou
CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) no modelo de convulsão induzido por pilocarpina
46
5.2.1.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em hipocampo de camundongos tratados com PILO.
46
5.2.1.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em núcleos da base de camundongos tratados com PILO.
48
5.2.1.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em córtex pré-frontal de camundongos tratados com PILO.
50
15
5.2.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou
CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato no modelo de convulsão induzido por
pilocarpina
52
5.2.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos
submetidos à convulsão com PILO
52
5.2.2.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em núcleos da base de camundongos
submetidos à convulsão com PILO
54
5.2.2.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN
ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em córtex pré-frontal de
camundongos submetidos ao modelo de convulsão com PILO
56
5.3. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM
TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU CLONAZEPAM NAS
CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA NO MODELO DE CONVULSÕES
INDUZIDAS POR PILOCARPINA
58
5.3.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN sobre os
níveis de glutationa (GSH) no hipocampo de camundongos submetidos ao modelo
de convulsão com PILO
58
5.3.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN sobre os
níveis de glutationa (GSH) nos núcleos da base de camundongos submetidos ao
modelo de convulsão com PILO
60
5.3.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN sobre os
níveis de glutationa (GSH) no córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao
modelo de convulsão com PILO
62
5.4 DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS DO PRÉ-
TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÕES
64
16
INDUZIDAS POR PILOCARPINA
5.4.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou
CNZP sobre os níveis de mieloperoxidase (MPO) em hipocampo de camundongos
submetidos à convulsão com PILO
64
5.5. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM
TRIMETAZIDINA E/OU FENOBARBITAL NA CONCENTRAÇÃO DOS
AMINOÁCIDOS NEUROTRANSMISSORES EM HIPOCAMPO DE
CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE CONVULSÕES
INDUZIDAS POR PILOCARPINA
66
5.5.1 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN na
concentração do aminoácido excitatório glutamato (GLU) em hipocampo de
camundongos submetidos à convulsão com PILO
66
5.5.2 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN na
concentração do aminoácido inibitório GABA em hipocampo de camundongos
submetidos à convulsão com PILO
68
6. DISCUSSÃO 70
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 74
8. CONCLUSÃO 76
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77
17
1. INTRODUÇÃO
1.1. Epilepsia
A epilepsia, transtorno cerebral mais freqüente na população geral, é uma síndrome complexa, de
etiologia diversa e caracteriza-se por alterações crônicas, recorrentes e paroxísticas na função neuronal,
decorrentes de anormalidades na atividade elétrica cerebral. A disfunção neurológica na sua fase aguda é
chamada de crise epiléptica, e pode se manifestar através de alterações sensitivas, emocionais ou
cognitivas (QUINTANS-JUNIOR et al., 2007; BUCKMASTER & HANEY, 2012).
As causas de epilepsia compreendem a predisposição genética, lesões cerebrais, intoxicação e
tumores. A incidência e a prevalência da epilepsia são mais elevadas nos países da America Latina em
relação aos países do hemisfério Norte. Estima-se que, no Brasil, cerca de três milhões de pessoas
apresentem alguma forma de epilepsia e, aproximadamente, cem mil novos casos somam-se a cada ano
(BURNEO et al., 2005).
Sabe-se que atividade convulsiva está associada a mudanças bioquímicas em algumas áreas
cerebrais e afeta diversos neurotransmissores: dopamina, glutamato, serotonina, ácido γ-aminobutírico
(GABA) (CAVALHEIRO et al., 1994); o metabolismo dos carboidratos; os sistemas de segundos
mensageiros e a expressão gênica, processos envolvidos na fisiopatologia das alterações neuronais
(SIMONIC et al., 2000; VEZZANI et al., 2013).
A epilepsia é um dos distúrbios neurológicos graves mais comuns em todo o mundo (HIRTZ et
al., 2007). Estima-se que cerca de 3% das pessoas serão diagnosticadas com epilepsia em algum
momento de suas vidas (SANDER, 2003). Sua prevalência é de 1% da população mundial, ou seja,
cerca de 60 milhões de pessoas, somando-se a cada ano aproximadamente três milhões de novos casos.
Pelo menos 50% dos casos começam na infância ou adolescência, provavelmente devido a maior
vulnerabilidade a infecções no sistema nervoso central (meningite), acidentes (traumatismos cranianos)
e doenças como varicela, caxumba e sarampo, cujas complicações podem levar a crises epilépticas.
18
Outra faixa etária com maior prevalência de crises epilépticas são os idosos, principalmente devido ao
próprio processo de envelhecimento e suas complicações vasculares (LEONARD et al., 1994).
Estima-se que cerca de cinquenta milhões de pessoas sofrem de epilepsia com crises ativas
necessitando de tratamentos, e 30% desses pacientes apresentam crises refratárias (sem resposta) ao
tratamento medicamentoso disponível no mercado (WHO, 2010). Cerca de 90% dos casos de epilepsia
ocorrem em países em desenvolvimento. Na Índia, por exemplo, estima-se um custo de 0,5% do PIB
para tratar pacientes com epilepsia (~5 milhões); na Europa esse valor é de 20 bilhões de Euros (WHO,
2010). No Brasil, embora os estudos epidemiológicos sejam escassos, estima-se que a epilepsia atinja
2% a 4% da população, correspondendo a aproximadamente três milhões de pessoas em diferentes
idades e classes sociais (FERNANDES et al., 2013).
1.2 Histórico
Existem relatos sobre crises epilépticas em textos de origem babilônica que datam de 2000 a.C.
O termo "epilepsia", no entanto só foi referido pela primeira vez na Grécia antiga, com o significado de
"ser tomado, atacado, possuído", provavelmente fazendo alusão ao que ocorre durante uma crise
epiléptica. Na antiguidade, a epilepsia era considerada como fruto de possessão por entidades espirituais,
e a falta de conhecimento levou diversos povos como gregos, romanos, hebreus, árabes e outros a
criarem estigmas e crenças associando a epilepsia ao misticismo, e essa concepção perdurou ao longo
dos tempos, mantendo-se ainda nos dias atuais (FERNANDES, 2013).
Apesar dos relatos de Hipócrates (400 a.C.) e Galeno (175 d.C.) sugerindo que a epilepsia era
decorrente de anomalias no cérebro, o comportamento ou pensamento popular daquela época, não
mudou, chegando a extremos por exemplo durante a Idade Média, onde a Santa Inquisição perseguiu e
condenou à morte muitos epilépticos considerados loucos e hereges (MOREIRA, 2004).
Somente com os progressos na área de neurofisiologia, no século XIX, é que a epilepsia passou a
ser encarada pela comunidade científica como uma doença com base cerebral. Um dos pioneiros nessa
área foi John Hughlings Jackson, um neurologista britânico, que propôs uma base anatômica e
fisiológica organizada para a hierarquia e localização das funções cerebrais (FERNANDES, 2013).
Então, a partir do século XX, os avanços nos conhecimentos neurofisiológicos comprovaram que a
epilepsia tinha origem cerebral e devia ser encarada como uma doença a ser tratada e dessa forma os
cientistas finalmente entraram em um consenso. A descoberta do neurônio e dos mecanismos de
19
transmissão neuronal ocorrida nos séculos XVIII e XIX foi fundamental para que a epilepsia pudesse ser
compreendida (MOREIRA, 2004). Os avanços científicos mais recentes contribuíram para um maior
entendimento sobre os mecanismos envolvidos com a geração das crises epilépticas e hoje um dos
maiores desafios para os pesquisadores é fazer com que essas informações cheguem ao maior número de
pessoas possível para que os pacientes deixem de ser discriminados ou estigmatizados e possam ser
diagnosticados e tratados adequadamente.
1.3 Definição e classificação das Crises Epilépticas
Epilepsia é considerada um distúrbio cerebral causado pela predisposição permanente do cérebro
em gerar crises epilépticas espontâneas, recorrentes, acompanhadas de consequências neurobiológicas,
cognitivas e sociais (FISHER et al, 2005). As crises epilépticas são definidas como manifestações
clínicas que refletem disfunção temporária de um conjunto de neurônios, geralmente atividade excessiva
e/ou hipersincrônica, autolimitada ou não. Dependendo da localização, as crises podem ser focais, ou
seja, com início em uma região restrita do encéfalo, ou generalizada, quando as descargas se originam
concomitantemente nos dois hemisférios. As crises focais podem ser simples, quando há preservação da
consciência durante o ictus (crise epiléptica), ou complexas, quando há perda de consciência
(FERNANDES et al., 2013).
As crises devem ser avaliadas juntamente com outros dados do paciente, como idade, análise de
imagem e eletroencefalograma, exame físico para definir o diagnóstico sindrômico fundamental para
elaboração de uma programação terapêutica (YACUBIAN, 2002).
As síndromes epilépticas idiopáticas são aquelas com provável predisposição genética que se
apresentam sem substrato lesional detectável por exames de imagem. As crises geralmente são bem
controladas por tratamentos. As síndromes epilépticas sintomáticas são aquelas cujas crises são
decorrentes de lesão estrutural em áreas do sistema nervoso central, e as síndromes provavelmente
sintomáticas são aquelas em que a lesão presumida não pode ser demonstrada com exames disponíveis
(FERNANDES et al., 2013).
20
As crises epilépticas podem se manifestar com graus diferentes de envolvimento muscular, onde
o evento motor consiste de um aumento ou diminuição da contração muscular. O aumento da contração
muscular pode ser do tipo tônico (significando contração muscular mantida durante segundos ou
minutos), clônico (contrações musculares, seguidas de relaxamentos gerando abalos musculares
sucessivos) ou mioclônico (contrações musculares muito breves, semelhantes a choques). A diminuição
da contração muscular caracteriza as mioclonias negativas e as crises atônicas (ENGEL, 2001).
As chamadas crises parciais ou focais são caracterizadas, clínica e eletrencefalograficamente,
pela ativação de uma parte do cérebro, sendo subdividas em crises parciais simples, quando há
preservação da consciência e crises parciais complexas, quando há comprometimento da mesma. As
crises generalizadas são aquelas em que há envolvimento, desde o início, de amplas áreas de ambos os
hemisférios cerebrais. São consideras não classificáveis, as crises que não se enquadram nos dois
subtipos acima (OLIVEIRA, 2010).
- Crises epilépticas parciais
- Crises epilépticas parciais simples: Caracterizadas pelo fato de o paciente ficar consciente durante a
crise. As mais freqüentes são as motoras, que podem se manifestar como abalos musculares das mãos,
pés ou face; estas crises podem progredir para um lado todo do corpo e podem desenvolver uma crise
generalizada do tipo tônico-clônica.
- Crises epilépticas parciais complexas: estão associadas a uma alteração da consciência. O sinal
transmitido antes da crise pode ser uma sensação de sonho, de medo, opressão no estômago que sobe
para a garganta, e ainda um quadro de alucinações, tais como: ouvir sons, sentir cheiros e gostos
estranhos. Associadas as essas sensações ocorre perda de contato com o meio ambiente, aumento da
salivação, movimentos de mastigação, de marcha e/ou movimentos estereotipados com as mãos. Podem
ser seguidas de crises tônico-clônicas.
- Crises epilépticas generalizadas
- Crises tônico-clônicas: que podem se iniciar com um grito acompanhado de perda da consciência com
queda ao solo, endurecimento do corpo e abalos musculares generalizados. Pode ocorrer perda de saliva
com sangue devido à mordedura da língua, coloração arroxeada dos lábios, respiração ruidosa, às vezes
21
ocorre também aumento da micção. A duração é de poucos minutos e após a crise há sonolência,
podendo acordar com vômitos, dor de cabeça e dores musculares.
- Crises tônicas: ocorre perda da consciência, queda ao solo, o corpo fica endurecido, com a respiração
irregular, aumento da salivação, coloração arroxeada da pele.
- Crises miclônicas: tem como característica principal ser de curta duração e manifestar-se
principalmente após o despertar, com movimentos bruscos de todo o corpo, semelhantes a um choque ou
susto, principalmente nos membros superiores.
- Crises de ausência: a crise pode se manifestar como um desligamento com o ambiente externo ocorre
interrupção da fala e das atividades motoras por alguns segundos, voltando logo a seguir à atividade que
estava realizando antes da crise. Essas crises podem se repetir várias vezes ao dia, ocorrendo perda de
consciência de forma parcial ou completa.
- Crises atípicas de ausência: caracterizada pela ocorrência de ataques com aparecimento e término mais
rápidos do que o habitual para as crises de ausência, associados a um EEG mais heterogêneo.
- Crises atônicas: caracterizada pela perda do tônus postural, com inclinação da cabeça e queda devido à
perda do equilíbrio.
1.4. Modelos Animais de Epilepsia
A fisiopatologia da epilepsia ainda não está completamente definida. Os modelos de convulsão
em animais reproduzem alterações comportamentais e eletroencefalográficas que são semelhantes à
epilepsia em humanos (BEM-ARI et al., 1981; VEZZANI et al., 2013). Estes modelos são utilizados
para estudar o envolvimento dos sistemas de neurotransmissores como moduladores da epileptogênese,
como também permitem observar as alterações comportamentais, histopatológicas, e outros dados
neuroquímicos relacionados ao processo convulsivo (COSTA-LOTUFO et al., 2002; SCHOLL et al.,
2013).
Desde a década de 1960, os modelos experimentais servem como screening farmacológico de
drogas antiepilépticas (WHITE, 1997), contribuindo, paralelamente, com informações a respeito dos
22
mecanismos envolvidos na gênese e manutenção das crises. De um modo geral, dois fatores são cruciais
em estudos desta natureza: a escolha do modelo experimental e as drogas a serem estudadas
(WOLFENSOHN et al., 2013).
Nas décadas de 1980 e 1990, dois modelos foram extensamente utilizados: o modelo da
pilocarpina e o modelo do ácido caínico, e ambos replicam características fenomenológicas das
epilepsias humanas do lobo temporal (TURSKI et al., 1989). A administração local ou sistêmica desses
compostos resulta em um padrão de crise límbica duradoura bastante característica (status epilepticus),
que após um período conhecido como silencioso (de 3 a 14 dias), leva o animal a apresentar crises
espontâneas e recorrentes. A lesão cerebral induzida pelo status epilepticus nesses modelos pode ser
considerada como equivalente a um evento epileptogênico no ser humano, como, por exemplo, uma
convulsão febril (TURSKI et al., 1989).
Quadro 1 – Modelos experimentais de epilepsia
MODELO
EXPERIMENTAL
TIPO DE EPILEPSIA CARACTERÍSTICAS
Estimulação química
Estricnina
(Descrito em 1900)
Crises com foco
cortical
Agudo. Extensões tônicas. Antagonismo
competitivo da glicina. Excitabilidade reflexa da
medula aumentada.
Pentilenotetrazol (PTZ)
(Descrito em 1960)
Pequeno mal e crises
generalizadas
Agudo. Crises generalizadas de ausência ou
mioclônicas e crises tônico-clônicas. Inibição de
canais de cloreto associados ao GABAA.
Picrotoxina
(Descrito em 1960)
Epilepsia do lobo
temporal (quando
aplicada na amígdala)
Agudo e crônico. Epilepsia focal recorrente.
Crises parciais ou de ausência. Antagonismo dos
receptores GABAérgicos.
Bicuculina
(Descrito em 1970)
Epilepsia de longa
duração (quando
aplicada na amígdala)
Agudo e crônico. Epilepsia de longa duração.
Antagonismo dos receptores GABAA.
Substâncias
colinomiméticas
Epilepsias focais e do
lobo temporal
Agudo e crônico.
Administração sistêmica de pilocarpina pode
23
(Descrito em 1949) desenvolver status epilepticus. Mimetiza a
epilepsia do lobo temporal nos achados
histopatológicos, eletrográficos, manifestações
comportamentais e padrão de resposta
terapêutica.
Modelos com
predisposição genética
Crise audiogênica em
camundongos
(Descrito em 1924)
Crises tônico-clônicas Agudo. Alterações bioquímicas presentes na
maioria das epilepsias. Convulsões conduzidas
por intensas estimulações auditivas.
Fotossensibilidade
genética
(Descrito em 1966)
Crises
centro-encefálicas
Agudo. O babuíno senegalês Papio papio
apresenta atividade paroxística e motora em
resposta a estimulação luminosa intermitente.
Mimetiza crises de origem centro-encefálica no
homem.
Estimulação elétrica
Eletrochoque
(Descrito em 1870)
Epilepsia focal
Crises tônico-clônicas
Agudo.
Muito usado na triagem de antiepilépticos.
Estimulação por pulsos elétricos repetitivos.
Kindling
(Descrito em 1969)
Crises parciais e
generalizadas, pequeno
mal e auras
Agudo e crônico.
Estimulações elétricas (ou administrações de
PTZ) contínuas, em limiares subconvulsivantes
resultam que quadro progressivo de convulsões.
Desencadeiam-se convulsões espontâneas. Avalia
a epilepsia e a epileptogênese.
Neurotoxinas
Ácido caínico
(Descrito em 1970)
Epilepsia do lobo
temporal
Agudo e crônico.
Injeção intraventricular produz crise
comportamental, acompanhada por lesão cerebral
semelhante a da epilepsia temporal.
Fonte: Adaptado de Oliveira, 2010
24
1.4.1. Modelo de Convulsões Induzidas por Pilocarpina
A epilepsia do lobo temporal humana é uma desordem crônica, frequentemente associada a um
estímulo inicial precipitante como estado epiléptico, trauma e convulsões febris prolongadas (ENGEL;
PEDLEY, 1997). É um dos distúrbios neurológicos mais comuns, apresentando taxa de prevalência de
5% (DELORENZO et al., 2001). Este tipo de epilepsia é particularmente resistente a medicamentos
anticonvulsivantes, representando um grande problema na terapêutica (TURSKI et al., 1987; TEJADA
et al., 2013).
A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é um tipo de epilepsia focal que apresenta grande
relevância clínica devido a sua alta incidência e gravidade. Os pacientes com ELT apresentam crises
focais simples ou complexas que se originam em estruturas mesiais do lobo temporal, geralmente
precedidas por auras. A auras correspondem a manifestações sensitivo-sensoriais, vegetativas ou
psíquicas puramente subjetivas e que ocorrem em 20% a 90% dos pacientes com epilepsia do lobo
temporal. Em geral são de curta duração, não excedendo 1 ou 2 minutos. São exemplos: aura epigástrica
(sensação de náusea, mal-estar); medo; depressão e angústia (frequentemente ocorre no período
interictal mas pode ocorrer antes da crise); déjà-vu, jamais vu; e pensamento forçado (impressão de estar
vivenciando algo que já aconteceu antes - déjà-vu, ou que parece totalmente estranho - jamais vu, ou
pensamento que ocorre repetidamente mesmo quando se tenta concentrar em outro fato); alucinações
gustativas, olfativas, auditivas, somestésicas e visuais.
O modelo de convulsões decorrentes da administração do agonista muscarínico pilocarpina em
roedores assemelha-se, em muitos aspectos, à epilepsia “lobo-temporal”, “psicomotora” ou “límbica”,
como, por exemplo, nos padrões eletroencefalográficos, comportamento e sequelas morfológicas
(LEITE et al., 1990; CAVALHEIRO et al., 1991; OLIVEIRA et al., 2007; VEZZANI et al., 2013).
De uma maneira geral, as convulsões induzidas por pilocarpina podem produzir danos neuronais
em diversas áreas e, especialmente, nas estruturas límbicas, causando perda neuronal no hipocampo,
amígdala, córtex piriforme, córtex entorrinal, septum lateral, tálamo, neocórtex e substância negra,
sugerindo o envolvimento de diferentes áreas durante o estabelecimento do processo epiléptico
(TURSKI et al., 1987; HONCHAR et al., 1990; BORELLI et al., 2002; SCHOLL et al., 2013).
25
O hipocampo tem sido sugerido como sendo o sítio de origem da atividade convulsiva induzida
por pilocarpina (TURSKI et al.,1983a,b). Outros achados sugerem como sítio inicial dessas convulsões,
o pálido ventral ou nucleo accumbens (CLIFFORD et al., 1987). Estudos eletroencefalográficos e
autoradiográficos realizados posteriormente sugeriram ambas as áreas como locais de início das
convulsões (LABANDEIRA-GARCIA et al., 1994; KULKARNI; GEORGE, 1995). O corpo estriado,
além de ser uma das áreas mais acometidas, pode estar relacionado de forma importante aos mecanismos
de propagação e manutenção (epileptogênese) da convulsão (MARINHO et al., 1998).
O modelo de epilepsia com pilocarpina tem sido extensivamente analisado, uma vez que exibe
convulsões recorrentes espontâneas e pode esclarecer muitas das alterações vistas na epilepsia do lobo
temporal. As mudanças histopatológicas observadas no hipocampo reproduzem muitas alterações
observadas em humanos, incluindo perda neuronal e remoção do tecido de sustentação do sistema
nervoso (MARINHO et al., 1997; TEJADA et al., 2013).
1.5. Epilepsia e Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo foi definido por Sies (1991) como ״uma perturbação do equilíbrio: pró-
oxidante – antioxidante, em favor do primeiro, a qual é potencialmente capaz de causar dano celular״. O
estresse oxidativo é causado principalmente por radicais livres que são moléculas que possuem um ou
mais elétrons desemparelhados. Em geral, são instáveis e têm vida muito curta devido à natureza livre de
seus elétrons que são capazes de reagir com diversos compostos ou alvos celulares, causando danos
teciduais por interagirem com carboidratos, ácidos nucléicos (DNA), proteínas e lipídios. Uma
conseqüência desse desequilíbrio é a oxidação dos lipídios da membrana celular, processo denominado
de lipoperoxidação que pode comprometer a estrutura da membrana e até mesmo levar a morte celular
(MOSLEY et al., 2006; NAKAMURA; LIPTON, 2009; TEJADA et al., 2013).
Os radicais livres são moléculas altamente reativas que podem interagir e formar várias espécies
reativas, como as espécies reativas do oxigênio (ROS) e se não neutralizadas podem levar ao estresse
oxidativo, exacerbar a inflamação e promover dano tecidual. Os radicais livres incluem as espécies
reativas do oxigênio (ROS) como o superóxido (O2·-), o radical hidroxila (OH·), radical peróxido
26
(ROO·), o peróxido de hidrogênio (H2O2), bem como as espécies reativas do nitrogênio (RNS), como o
óxido nítrico (NO) e o peroxinitrito (ONOO·) e espécies reativas do cloro (RCS) como o ácido
hipocloroso (HOCl) (Mosley et al., 2006).
Essas espécies químicas são abundantes na natureza, produzidas normalmente no metabolismo
celular e encontradas no meio ambiente, facilmente formadas com exposição excessiva a luz solar,
poluição, álcool, inseticidas, radiação, exercício intenso, etc. Existem mecanismos antioxidantes que
neutralizam os radicais livres, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase, a glutationa, glutationa
peroxidase e redutase, a vitamina E, a vitamina C, e outras substancias capazes de inativar ou reduzir a
formação dos radicais livres (TEJADA et al., 2013).
O dano oxidativo ocorre devido ao desequilíbrio entre a produção dos radicais livres e as defesas
antioxidantes celulares. Através da respiração celular normal ou da respiração mitocondrial desregulada,
grandes quantidades de ROS podem ser produzidos e desencadearem efeitos deletérios no delicado
equilíbrio neuronal do SNC. O estresse oxidativo está realmente implicado como sendo a principal causa
da injúria neuronal em várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia (AGUIAR et al., 2008;
FOLBERGROVÁ et al., 2013).
Um dos processos oxidativos mais amplamente estudados é aquele onde ocorre a quebra dos
lipídios das membranas celulares e a formação do radical peroxil (LOO). Este processo chamado de
peroxidação lipídica é extremamente complexo e lesivo, porque uma vez iniciado, ele pode ser
propagado, já que o radical peroxil formado pode reiniciar o processo, que pode ocorrer indefinidamente
(NAKAMURA; LIPTON, 2009).
A membrana celular é um dos componentes mais suscetíveis à ação das ROS, que provocam
alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares levando a perda da seletividade na
troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e
formação de produtos citotóxicos (como o malonaldeído), culminando com a morte celular. A
peroxidação lipídica também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento, de câncer, de
doenças neurodegenerativas e de epilepsia.
27
Nem sempre os processos de peroxidação lipídica são prejudiciais, pois seus produtos são
importantes na reação em cascata a partir do ácido aracdônico (formação de prostaglandinas) e, portanto,
na resposta inflamatória. Todavia, o excesso de tais produtos pode ser lesivo (NAKAMURA; LIPTON,
2009).
Vários estudos já comprovaram que as ROS podem estar envolvidas na causa ou conseqüência
de doenças humanas associadas ao estresse oxidativo. Por isso, antioxidantes naturais e sintéticos têm
sido recomendados para o alívio dos sinais e sintomas destas doenças e, mesmo, para bloquear sua
evolução (NAKAMURA; LIPTON, 2009).
Os antioxidantes podem atuar em diferentes aspectos na proteção dos organismos contra os
radicais livres. O primeiro mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir a sua geração,
principalmente através da inibição das reações em cadeia com os íons metálicos (ferro e cobre). Os
antioxidantes devem ser substancias capazes de inativar os radicais livres gerados pelo metabolismo
celular ou por fontes exógenas, impedindo o dano aos lipídios, proteínas, ácidos graxos e DNA, evitando
assim as lesões aos constituintes celulares e a consequente morte celular. Outro mecanismo de proteção
é promover o reparo das lesões produzidas pelos radicais livres. Esse processo está relacionado com o
reparo da molécula do DNA e a reconstituição das membranas celulares danificadas. Em algumas
situações pode ocorrer uma adaptação do organismo em resposta a geração desses radicais livres com o
aumento da síntese das enzimas antioxidantes (FOLBERGROVÁ et al., 2013).
O cérebro é mais vulnerável ao estresse oxidativo do que outros tecidos, por que contém uma
grande quantidade de lipídios e metais oxidáveis, e tem, em relação aos outros tecidos, menos
mecanismos antioxidantes (WALZ et al., 2000). O estresse oxidativo pode alterar dramaticamente a
função celular e modificar a liberação e/ou síntese de outros compostos que podem estar relacionados
com a morte neuronal induzida pela convulsão. Por isso, tem sido implicado em uma variedade de
condições neurológicas agudas e crônicas, incluindo a epilepsia (SHIN et al., 2008; FOLBERGROVÁ et
al., 2013).
Foi sugerido que o dano neuronal após o estado epiléptico induzido por pilocarpina seria
resultante da produção exagerada de peróxido de hidrogênio, radical hidroxil e superóxido decorrentes
28
da disfunção mitocondrial (SKAPER et al., 1998; KUTLUHAN et al., 2009; FOLBERGROVÁ et al.,
2013). A ligação entre disfunção mitocondrial e epilepsia é reforçada pelo fato de que alguns pacientes
com epilepsia do lobo temporal apresentam deficiência mitocondrial no foco das convulsões (KUNZ et
al., 2000; HUBBARD et al., 2013; ROWLEY & PATEL, 2013). Apesar dessas evidências, o
envolvimento das ROS no mecanismo das convulsões epilépticas ainda não está bem esclarecido.
1.6. Drogas Antiepilépticas
Substâncias com propriedades anticonvulsivantes têm sido exaustivamente estudadas na tentativa
de se conhecer drogas com eficácia para tipos específicos de convulsão, bem como os mecanismos
controladores do aparecimento dessas convulsões (TURSKI et al., 1989). Na fase aguda das convulsões
induzidas por pilocarpina podem ser identificados compostos com eficácia no tratamento da epilepsia
refratária e/ou neuroproteção contra danos induzidos por convulsões sustentadas (QUEIROZ et al.,
2002).
A descoberta do fenobarbital em 1912 marcou o início da farmacoterapia moderna da epilepsia.
Nos 70 anos seguintes, fenitoína, carbamazepina, valproato de sódio e uma série de benzodiazepínicos
tornaram-se disponíveis e efetivaram-se como drogas antiepilépticas consagradas (BRODIE; DICHTER,
1996).
Atualmente, existem muitas opções de drogas antiepilépticas que podem ser utilizadas na clínica,
no entanto, estima-se que cerca de 30% dos pacientes não conseguem uma resposta terapêutica
adequada e, além disso, seu uso prolongado acarreta efeitos adversos e risco de toxicidade. As drogas
antiepilépticas de primeira geração (fenobarbital, fenitoína, carbamazepina, diazepam e valproato de
sódio), segunda geração (lamotrigina, vigabatrina, tiagabina, topiramato, gabapentin e levetiragetam) e
terceira geração foram, inicialmente, estudadas em modelos animais (SMITH et al., 2007) (Quadro 2).
Embora os mecanismos de ação das drogas antiepilépticas comercializadas atualmente ainda não
sejam completamente entendidos, de modo geral, envolvem alteração no balanço entre excitação e
inibição neuronais. Em nível celular, são conhecidos três mecanismos básicos: modulação de canais
iônicos dependentes de voltagem (Na+, Ca++, K+); aumento da neurotransmissão inibitória mediada pelo
29
GABA; e atenuação da neurotransmissão excitatória, particularmente a mediada pelo glutamato
(CZAPINSKI et al., 2005).
Quadro 2 – Fármacos antiepilépticos
Antiepiléptico Mecanismo de Ação Efeitos Adversos
Carbamazepina Atua principalmente por
bloqueio uso-dependente dos
canais de sódio
Sedação, ataxia, náuseas e distúrbios visuais
(relacionados a dose), retenção hídrica, redução
de granulócitos, anemia aplástica.
Fenitoína Atua principalmente por
bloqueio uso-dependente dos
canais de sódio
Confusão, hiperplasia gengival, erupções
cutâneas, anemia, teratogênese. São comuns
interações medicamentosas.
Valproato Causa inibição fraca da GABA
transaminase, tb efeito sobre
canais de sódio e cálcio tipo T
Tremor, náuseas, vômito, calvície,
teratogenicidade, lesão hepática (rara, mas
grave)
Etossuximida Atua bloqueando canais de
cálcio tipo T
Náuseas e vômitos, dores de estômago, soluço,
anorexia
Lamotrigina Atua sobre canais de sódio e
cálcio e inibe liberação de
aminoácidos excitatórios
Erupções cutâneas
Fenobarbital Atua principalmente por
bloqueio uso-dependente dos
canais de sódio, potencializa a
ação do GABA em receptores
GABAA
Sedação, anemia megaloblástica, reações de
hipersensibilidade.
Benzodiazepínicos
(clonazepam e
diazepam)
Atua em receptores GABAA
potencializando a ação do
GABA
Sedação
Outros agentes: vigabatrina, felbamato, gabapentina, pregabalina, tiagabina, topiramato,
levetiracetam, zonisamida, rufinamida, estiripentol.
Fonte: Rang & Dale, 2011.
30
1.6.1. Trimetazidina (Vastarel®)
O principal objetivo das pesquisas sobre novas drogas antiepilépticas é o desenvolvimento de
fármacos mais eficazes, específicos para cada tipo de epilepsia e com menos efeitos colaterais. Os
agentes antiepilépticos comercializados atualmente afetam principalmente o transporte de íons através
da membrana celular eou modulam a neurotransmissão inibitória ou excitatória (LIBROWSKI et al.,
2007). A grande quantidade de efeitos adversos associados a esses agentes representa a maior limitação
para seu uso prolongado (GUPTA; MALHOTRA, 2000). Portanto, o desenvolvimento de novos agentes
antiepilépticos com melhor eficácia e efeitos adversos míninos é de suma importância.
O íon cálcio exerce um importante papel durante a epileptogênese. Vários estudos comprovaram
que o aumento do influxo de cálcio na célula está implicado na atividade convulsivante nos neurônios
(BADING; HILMAR, 1999). Recentemente foi demonstrado que bloqueadores de canais de cálcio,
particularmente as diidropiridinas sozinhas ou associadas a drogas antiepilépticas convencionais,
reduzem a incidência de convulsões em vários modelos experimentais de epilepsia (GUPTA et al., 2003;
JAIN et al., 2010).
A trimetazidina é um derivado lipofílico da piperazina, um anti-helmíntico que possui vários
derivados importantes, de grande interesse nas doenças isquêmicas (Quadro 3). A trimetazidina
preserva o metabolismo energético da célula exposta à hipoxia ou à isquemia, evitando a queda das
taxas intracelulares de ATP. Preserva, também, o funcionamento das bombas iônicas e o fluxo
transmembrana de sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. Estudos demonstraram que a
trimetazidina melhora os sintomas e reduz a freqüência da angina através da manutenção da homeostase
do cálcio nas células (ISKESEN et al., 2006). Na cardiomiopatia isquêmica a trimetazidina pode inibir o
acúmulo de cálcio nas células regulando a passagem de íons através da membrana (BELARDINELLI,
2002).
A literatura tem demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes,
antiinflamatórias, antinociceptivas e gastroprotetoras em vários modelos experimentais com animais
(ABDEL-SALAM; EL-BATRAN, 2005). Muitos estudos mostraram que a trimetazidina apresenta
efeito protetor em lesões isquêmicas não apenas no coração (BELARDINELLI, 2002), mas também no
31
cérebro (IQBAL et al., 2002; DHOTE; BALARAMAN, 2008), pulmão (INCI et al., 2001), rim
(CHANDER et al., 2003), intestino (TETIK et al., 1999) e fígado (SETTAF; MORIN, 1999).
Quadro 3 – Estrutura química da trimetazidina
Piperazina Trimetazidina
Fonte: Index Merck, 11ª Edição.
O desenvolvimento de novos agentes antiepilépticos com melhor eficácia e menos efeitos
adversos é de suma importância para pesquisa médica. Os íons cálcio desempenham um importante
papel na gênese da crise convulsiva. A trimetazidina (TMZ) utilizada no tratamento de doenças
isquêmicas preserva o metabolismo energético da célula exposta à hipóxia ou à isquemia, evitando a
queda das taxas intracelulares de ATP. Preserva também o funcionamento das bombas iônicas e o fluxo
transmembrana de cálcio, sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. A literatura tem
demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias,
antinociceptivas e gastroprotetoras em vários modelos experimentais com animais (ABDEL-SALAM;
EL-BATRAN, 2005).
Jain e colaboradores (2010) sugeriram que a trimetazidina apresenta atividade anticonvulsivante
no modelo de convulsão induzida por eletrochoque em camundongos. Portanto, diante desses indícios
pode haver a possibilidade da trimetazidina exercer efeitos benéficos sobre a convulsão, o que poderia
representar uma opção terapêutica como adjuvante no tratamento da epilepsia.
32
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar os efeitos neuroprotetores da trimetazidina sozinha ou em associação com fenobarbital
no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos, realizando, ainda, estudo
comparativo com agente antiepiléptico clássico eficaz no modelo de convulsões em estudo
(clonazepam).
2.2 Específicos
- Realizar estudo comportamental dos animais pré-tratados com trimetazidina sozinha e/ou em
associação com fenobarbital no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos;
- Determinar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre a
peroxidação lipídica, formação de nitrito-nitrato e concentração de glutationa reduzida (GSH) em
cérebro de camundongos após as convulsões induzidas por pilocarpina;
- Analisar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre as
alterações nas concentrações dos neurotransmissores GABA e glutamato em cérebro de
camundongos após as convulsões induzidas por pilocarpina;
- Investigar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre o
processo inflamatório envolvido no modelo de epilepsia estudado, através da análise das
concentrações de mieloperoxidase (MPO) em cérebro de camundongos após as convulsões
induzidas por pilocarpina.
.
33
3. METODOLOGIA
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss adultos machos (20-30g). Durante todos os experimentos,
os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com no máximo 20 animais, em condições ambientais
semelhantes, com ciclo claro / escuro alternado de 12 horas, com luzes acesas às 06:00h, recebendo
ração padrão tipo Purina e água ad libitum. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da UFC (Protocolo N-59/07).
3.2. Drogas Utilizadas nos Tratamentos
- Trimetazidina (Vastarel®), comprimidos 20mg (Servier);
- Fenobarbital (Gardenal®), comprimidos 50mg (Sanofi);
- Clonazepam (Rivotril®), comprimidos 0,5mg (Roche);
- Cloridrato de pilocarpina (Sigma Chemical Co., USA).
Os reagentes usados no preparo dos tampões e demais soluções foram de grau analítico.
3.3. Protocolo de Tratamento dos Grupos Experimentais
Os experimentos foram conduzidos entre 8:00 e 10:00 horas. Os animais receberam injeções de
trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30 mg/kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/kg, i.p.) ou
solução salina - NaCl 0,9%, i.p. [a pilocarpina foi dissolvida em solução salina e as demais drogas foram
dissolvidas em solução de 1% de Tween 80] durante sete dias. Após 60 minutos da última injeção das
drogas em estudo ou veículo, foi administrada pilocarpina na dose 400 mg/kg, i.p. (P400) para os
estudos comportamentais iniciais com tempo de observação dos animais de 1 hora. Depois foi utilizada
apenas pilocarpina na dose de 320 mg/kg, i.p. precedida de metil-escopolamina (1 mg/kg, i.p.) para a
determinação da escala de Racine (observação dos animais durante 2 horas) em todos os experimentos
seguintes. A metil-escopolamina (1 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes da administração da
34
pilo, para inibir a ação colinérgica da pilo em nível periférico, permitindo dessa forma, a ação da droga
somente no sistema nervoso central, mais especificamente nos receptores muscarínicos e possibilitando
um maior tempo de observação do comportamento dos animais. As crises convulsivas motoras e
límbicas iniciaram cerca de 15-25 minutos após a injeção de Pilo. Outros quatro grupos receberam
apenas trimetazidina (10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30 mg/kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/kg,
i.p.) ou solução salina, i.p.
Quadro 4 – Protocolo de Tratamento Experimental do Tratamento dos Animais
GRUPOS TRATAMENTO
1 Trimetazidina (5 mg/kg, i.p.) + PILO
2 Trimetazidina (10 mg/kg, i.p.) + PILO
3 Trimetazidina (20 mg/kg, i.p.) + PILO
4 Trimetazidina (5 mg/kg, i.p.) + Fenobarbital (10 mg/kg, i.p.) + PILO
5 Fenobarbital (10 mg/Kg, i.p.) + PILO
6 Fenobarbital (30 mg/Kg, i.p.) + PILO
7 Clonazepam (0,5 mg/Kg, i.p.) + PILO
8 Solução salina - NaCl 0,9% + PILO
9 Solução salina - NaCl 0,9%
Após a injeção de pilocarpina, os animais tratados e controles foram colocados em ambiente
reservado para observação dos grupos pelo período de 1h (P400) ou 2h (P320) para o estudo
comportamental. Os animais que não receberem pilocarpina foram observados por igual período. Os
animais que não sobreviveram até o final do período de observação foram decaptados logo após a morte
e os sobreviventes foram sacrificados por deslocamento cervical e decapitados logo após estudo
comportamental. Hipocampo, corpo estriado e córtex pré-frontal foram imediatamente isolados,
removidos sobre gelo e armazenados à -80°C para a realização dos estudos neuroquímicos.
35
3.4. Estudo Comportamental
Alterações Comportamentais Após Indução de Convulsões e Estado Epiléptico por Administração
de Pilocarpina.
Os animais tratados e controles foram divididos em gaiolas contendo 6 a 10 animais e colocados
em ambiente reservado, sendo feita a observação direta. Os seguintes parâmetros foram observados:
presença de sinais colinérgicos periféricos, convulsões motoras, instalação de estado epiléptico, número
de mortes, latência de convulsão e latência de morte em cada grupo. Estas observações foram
acompanhadas por um observador experiente durante 120 minutos e classificadas de acordo com a
escala de Racine (Racine, 1972). O Quadro 2 apresenta estes parâmetros juntamente com suas
características. O Quadro 3 mostra os parâmetros da escala de Racine. O nível de intensidade da crise
na fase aguda da injeção sistêmica de pilocarpina é graduado de 1 a 5 (quanto maior o grau maior a
intensidade da crise).
Quadro 5 - Parâmetros Comportamentais Observados após a Injeção de Pilocarpina
PARÂMETROS CARACTERÍSTICAS
1. Sinais colinérgicos periféricos (SCP) Tremores, miose, cromodacriorréia,
piloereção, diarréia, salivação
2. Convulsão Tônico / clônica
3. Estado epiléptico Convulsões intermitentes
4. No de mortes Determinado durante o período de 1 hora
depois da última administração realizada
5. Latência de convulsão Intervalo de tempo em minutos entre a
última injeção e o aparecimento da primeira
convulsão
6. Latência de morte Intervalo de tempo em minutos entre a
última injeção e a morte do animal
Fonte: Adaptado de Turski et al., 1983a.
36
Quadro 6 - Escala de Racine para intensidade de respostas motoras dos animais à injeção depilocarpina.
Escore Comportamento
0 Normal (sem convulsão) – imobilidade
ConvulsãoLímbica
1 Automatismos Faciais - Movimentos faciais (focinho),hiperatividade, coçar, cheirar (sniffing,), grooming, wet dog shakes
2 Mioclonias de cabeça e pescoço - Balançar a cabeça, olhar fixo,tremor
ConvulsãoMotora
3 Clonias de patas anteriores - Contração e extensão das patasanteriores
4 Clonias de patas posteriores, rearing e salivação
5 Elevação e queda - estado epiléptico
(Racine, 1972)
3.5. Determinação da Atividade dos Sistemas Antioxidantes
3.5.1. Método da Determinação da Concentração da Glutationa Reduzida (GSH)
A determinação da concentração da GSH baseia-se na reação do reagente de Ellman, o 5,5'-
ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um dissulfeto misto mais ácido 2-
nitro-5-tiobenzóico. A medida do produto de reação formado foi feita por leitura da absorbância a 412
nm. Foram preparados homogenatos a 10% das áreas cerebrais a serem estudadas, em EDTA 0,02 M,
em seguida foram retirados 400 μL desse homogenato e adicionados 320 μL de água destilada e mais 80
μL de ácido tricloroacético a 50%. O material foi agitado e centrifugado a 3000rpm por 15 min. Em
seguida foi recolhido 400 μL do sobrenadante e acrescido 800 μL de tampão Tris-HCl 0,4M, pH 8,9 e
mais 20 μL de DTNB 0,01M e após 1 minuto da reação foi feita a leitura da coloração em 412 nm,
através de um espectrofotômetro. A concentração da glutationa reduzida foi expressa em nanograma de
GSH / g de tecido.
37
Curva padrão de Glutationa Reduzida (GSH)
A partir da solução padrão de GSH (1mg/mL), foi preparado 4mL (em triplicata) de soluções a
6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL. O branco foi feito com água destilada (4 mL) e a cada tudo das soluções
de GSH foi acrescentado de 4 mL de tampão Tris HCl 0,4M (pH 8,9). Foi adicionado ainda a cada tubo
0,1 mL de DTNB (0,01M) e feita a leitura da absorbância a 412 nm após 1 min da adição do DTNB, e
foi determinada a equação da curva padrão de GSH.
3.6. Determinação do Índice de Peroxidação Lipídica e Produção de Nitrito/Nitrato
3.6.1. Método da Determinação da Peroxidação Lipídica (TBARS)
O grau de lipoperoxidação nas áreas cerebrais foi medido através da determinação dos níveis de
TBARS, conforme o método de Huong et al (1998), seguindo o protocolo a seguir.
Foi preparado o homogenato das áreas cerebrais a 10% em solução de cloreto de potássio (KCl)
0,15 M. 0,25 mL do homogeneizado foram colocados em tubos de ensaio, adicionados 0,5 mL de
tampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4 e 0,25 mL do sistema catalisador da formação de
radicais livres. Após incubação dessa mistura a 37º C, por 30 minutos, a reação foi interrompida pela
adição de 0,5 mL de solução de ácido tricloroacético a 10%. Em seguida, a mistura foi submetida à
centrifugação a 3000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante separado e acrescido de 0,5 mL de solução
de ácido tiobarbitúrico 0,8%. Após a agitação, essa mistura foi mantida em um banho de água fervente
(95-100°C) por 15 min., a seguir resfriada em banho de gelo por alguns minutos e posteriormente
tomada para leitura em espectrofotômetro a 532 nm.
Curva-padrão de malonildialdeído (MDA)
A partir da solução padrão de MDA (6mols), foram preparadas as soluções a 0,627; 1,247; 2,463;
4,8; 9,16 e 16,77μmol. O branco foi feito com água destilada. A leitura da absorbância foi feita a 532nm
para determinação da equação da curva-padrão de MDA.
38
3.6.2. Determinação do Conteúdo de Nitrito
Preparação da Curva Padrão:
Foram pesados 7mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água destilada (estoque-10mM) foi
feita as diluições em série (10 e 20x), ficando 1mM, 100M, 10M, 5M, 2,5M, 1,25M, 0,625M,
0,312M. Foi feita uma equação da reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN et al. 1981).
Método:
Em um tubo branco foi adicionado 500L do reagente mais 500L de água destilada, em um
outro tubo teste foi adicionado 500L do reagente mais 500ul do homogenato de tecido a 10% em água
destilada. Foi feita a leitura em espectrofotômetro a 560nm.
3.7. Determinação das concentrações dos aminoácidos GABA e Glutamato com HPLC
- Método
Para determinação das concentrações dos aminoácidos, foi utilizado o equipamento de
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detector de fluorescência. A espectroscopia de
fluorescência pode ser usada como método de detecção específica, e é um dos mais sensíveis para
compostos que fluorescem. Fluorescência pode ser desenvolvida em compostos não fluorescentes por
reações de derivatização realizadas pré ou pós-coluna.
- Procedimento Experimental
Os animais foram decaptados logo após a realização do teste comportamental e,
imediatamente, tiveram seus cérebros dissecados sobre o gelo. O hipocampo foi utilizado para preparar
homogenatos a 10 %. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30
segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O sobrenadante foi
39
separado e filtrado através de uma membrana (Millipore- 0,2 μm) e posteriormente associado a uma
solução de derivatização pré-coluna, para obtenção de fluorescência, em uma proporção de 1:1. Um
minuto depois do início dessa associação uma alíquota de 20 μl foi retirada e injetada no equipamento de
HPLC para análise química.
Para a determinação das concentrações dos aminoácidos, uma coluna de fase-reversa C18
(Shimadzu, Japão), foi utilizada. A fase móvel composta de duas fases: A (pH 6,95)- acetato de sódio
(0,1 M), metanol (6 %, v/v) e tetrahidrofurano (1,5 %); B- Metanol puro (100 %), correu em um fluxo
de 1,0 ml/min em um gradiente de 30 min de duração (MASSIEU; TAPIA, 1997). GABA e Glutamato
(GLU) foram detectados usando um detector de fluorescência (Modelo RF-535 da Shimadzu, Japão)
com comprimento de ondas excitação e emissão de 370 e 450 nm, respectivamente. Os cromatogramas
foram registrados e quantificados por um computador usando um software da Shimadzu®. As
concentrações dos aminoácidos foram determinadas por comparação com os padrões injetados no HPLC
no dia do experimento e foram expressos em μmol/g de tecido.
3.8. Determinação da Mieloperoxidase (MPO)
Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos de neutrófilos. Essa enzima pode
ser utilizada, portanto, como marcador para o conteúdo de neutrófilos dos tecidos. A ação da MPO está
explicada abaixo:
Neste ensaio, a H2O2 é clivada por meio da MPO liberada das amostras de tecido por
homogeneização com tampão HTAB (detergente). O radical oxigênio (O_) resultante se combina com
diidrocloreto de ɵ-dianisidina, o doador de hidrogênio (AH2), que é convertido a um composto colorido
(A). O aparecimento deste composto, ao longo do tempo, é medido por espectrofotômetro (460nm) para
determinar o conteúdo de MPO do ensaio.
H2O2 H2O + O_
O_ + AH H2O + A
40
4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os resultados obtidos nos
diferentes grupos foi utilizado o teste t-Student (comparação entre duas médias) ou análise de variância
seguida do teste de Tukey (post hoc). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas
quando P<0,05. Os valores foram expressos como Média ± EPM.
41
5. RESULTADOS
5.1. ESTUDO COMPORTAMENTAL
5.1.1 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-tratados ou
não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com fenobarbital (TMZ+FEN),
fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP).
Após a administração de pilocarpina, 400mg/Kg, i.p. (P400) os animais mostraram sinais
colinérgicos periféricos (miose, piloereção, cromodacriorréia, diarréia, tremores), e movimentos
estereotipados, seguidos por convulsões motoras límbicas em 100% (40/40) dos animais tratados. O
processo convulsivo persistiu e progrediu para status epilepticus (estado epiléptico) em 94% (27/29)
desses camundongos, levando à morte de 98% (28/29) dos animais (Tabela 1).
A administração de TMZ, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de
P400, aumentou a latência de convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente, todavia,
a dose de 20 mg/kg, foi a que mostrou melhor efeito quando comparada às demais doses (p < 0,001).
Aumentou a latência de convulsão em 94% comparado ao controle, levou à ausência de convulsões em
15% (04/24) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 16% (05/24) e protegeu 31%
(08/24) dos animais da morte (Tabela 1).
A administração da associação de TMZ+FEN, i.p., durante sete dias e no último dia de
tratamento 60 min antes de P400, aumentou a latência de convulsão em 125% quando comparada ao
controle (p < 0,001), levou à ausência de convulsões em 23% (05/21) dos animais; reduziu a ocorrência
de estado epiléptico em 38% (08/21) e protegeu 48% (10/21) dos animais da morte (Tabela 1 e Figura
1).
A administração de FEN, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de
P400, aumentou a latência de convulsão nas duas doses testadas, todavia, a dose de 30 mg/kg, foi a que
mostrou um aumento mais expressivo nas latências de convulsão quando comparada à dose de 10mg/kg
(p < 0,005). Aumentou a latência de convulsão em 146% comparado ao controle, levou à ausência de
42
convulsões em 40% (09/21) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 56% (12/21) e
protegeu 58% (13/21) dos animais da morte (Tabela 1).
A administração de CNZP, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de
P400, aumentou a latência de convulsão. O efeito protetor demonstrado pelo clonazepam foi
determinado anteriormente por outros membros do nosso grupo testando-se três doses, 0,25, 0,5 e
1mg/kg, i.p. Na ocasião não foi observado o efeito de forma dose-dependente, e a dose de 0,5mg/kg, que
foi selecionada para as análises seguintes, mostrou um aumento mais expressivo nas latências de
convulsão quando comparada às demais doses (OLIVEIRA et al., 2010). O clonazepam na dose de
0,5mg/kg aumentou a latência de convulsão em 187% comparado ao controle, levou à ausência de
convulsões em 63% (12/19) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 86% (16/19) e
protegeu 73% (14/19) dos animais da morte (Tabela 1).
Sinais colinérgicos periféricos e movimentos estereotipados permaneceram inalterados em todos
os grupos pré-tratados com as drogas testadas. Nenhum animal, dos grupos que receberam apenas salina
isotônica, apenas TMZ, FEN ou CNPZ apresentou atividade convulsiva.
43
Tabela 1- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação com fenobarbital (FEN) nasalterações comportamentais e convulsões induzidas por PILO em camundongos
GRUPO N Convulsão(%)
Latência deconvulsão
(min)
StatusEpilepticus
(%)
Morte(%)
Controle 29 100 8,2±0,35 94 98
TMZ5 24 94 10,8±0,5 80 73
TMZ10 20 94 13,5±0,86 85 73
TMZ20 24 85 15,9±2,1a 84 69
TMZ5+FEN10 21 77 18,5±1,7a,b 62 52
FEN10 24 82 13,6±0,9a 57 53
FEN30 21 60 20,2±1,2a,b,c,f 44 42
CNZP 0,5 19 37 23,6±1,87a,b,c,d,f 14 27
Camundongos Swiss, machos, receberam salina 0,9% (controles) ou trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg,i.p.), sozinha e/ou associada ao fenobarbital (TMZ 5mg/kg + FEN 10mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/kg, i.p.) e clonazepam (0,5mg/kg, i.p.) durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos após a últimaadministração foi administrada pilocarpina (400 mg/kg, i.p.). Os animais foram observados durante 1hora após a injeção de P400. a vs controle, b vs TMZ5, c vs TMZ10, d vs TMZ20, e vs TMZ5+FEN10, fvs FEN10, com p<0,05 (ANOVA seguido por teste de Tukey).
44
Figura 1. Potencialização da atividade anticonvulsivante do Fenobarbital (FEN 10mg/Kg) pela
associação com Trimetazidina (TMZ 5mg/kg). Camundongos Swiss, machos, receberam salina ou as
drogas testadas, i.p., durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos antes de P400 (pilocarpina, 400mg/Kg,
i.p.). Média + EPM, n=20. * p < 0,05 comparado ao grupo controle; ** p < 0,001 comparado aos demais
grupos (ANOVA e Tukey).
PILO
*
**
45
5.1.2 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-tratados ou
não com trimetazidina (TMZ), sozinha e/ou em associação com fenobarbital (TMZ+FEN),
fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP) na escala de Racine
Após a administração de pilocarpina, 320mg/Kg, i.p. (PILO) os animais apresentaram as
manifestações do comportamento pré-convulsivo (acinesia, tremor, automatismos oroalimentares,
salivação, coçar a cabeça) entre 12,2±1,38 minutos seguidos por convulsões motoras límbicas em 96 %
(48/50) dos animais tratados. O processo convulsivo persistiu e progrediu para status epilepticus (estado
epiléptico) em 88% (12/50) desses camundongos. Essas convulsões ocorreram após um período de
latência de 18,2±1,9 minutos e atingiram o escore da escala de Racine 4,8±0,5 (Tabela 2).
O pré-tratamento com TMZ, i.p., durante sete dias, aumentou a latência do comportamento pré-
convulsivo e a latência da primeira convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente,
todavia, a dose de 20 mg/kg, foi a que mostrou um aumento significativo nesses parâmetros quando
comparada às demais doses (p < 0,001). Aumentou a latência do comportamento pré-convulsivo em 46
%, a latência da primeira convulsão em 42 % comparado ao controle, e reduziu os escores da escala de
racine em 33 % (Tabela 2).
O pré-tratamento com a associação de TMZ+FEN, i.p., durante sete dias aumentou a latência do
comportamento pré-convulsivo em 100 %, a latência da primeira convulsão em 50 %, e reduziu os
escores da escala de Racine em 33 %, quando comparada ao controle (p < 0,001) (Tabela 2).
O pré-tratamento com FEN, i.p., durante sete dias na dose de 10 mg/kg não alterou os parâmetros
comportamentais, mas na dose de 30 mg/kg promoveu aumento da latência do comportamento pré-
convulsivo em 69 %, da latência da primeira convulsão em 38 %, e reduziu os escores da escala de
Racine em 31 %, quando comparada ao controle (p < 0,005) (Tabela 2).
O pré-tratamento com clonazepam (CNZP, i.p.) durante sete dias praticamente dobrou a latência
do comportamento pré-convulsivo, aumentou a latência da primeira convulsão em 90 %, e reduziu os
escores da escala de Racine em 62 %, quando comparado ao controle (p<0,001) (Tabela 2). O efeito
protetor demonstrado pelo clonazepam foi determinado anteriormente testando-se três doses, 0,25, 0,5 e
46
1mg/kg, i.p. Na ocasião não foi observado o efeito de forma dose-dependente, e a dose de 0,5mg/kg, que
foi selecionada para as análises seguintes, mostrou um aumento mais expressivo nas latências de
convulsão quando comparada às demais doses (p < 0,001).
Nenhum animal, dos grupos que receberam apenas salina isotônica ou apenas TMZ, FEN ou
CNPZ sem a administração de pilocarpina apresentou atividade convulsiva.
47
Tabela 2- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação com fenobarbital (FEN) naescala de Racine utilizando modelo de convulsão induzido por pilocarpina em camundongos
GRUPO ComportamentoPré-convulsivo
(min)
Latência daprimeira
convulsão (min)
Escore da Escalade Racine
Controle 12,2±1,38 18,2±1,9 4,8±0,5
TMZ5 13,4±1,6 20,8±2,5 3,6±0,3
TMZ10 15,1±2,1 23,5±3,1 4,1±0,4
TMZ20 17,8±2,2 a 25,9±3,1a 3,2±0,3 a
TMZ5+FEN10 24,4±3,2a,b,c 28,5±3,7a,b 2,4±0,4 a,b
FEN10 11,6±1,22e 21,6±2,9 3,9±0,5
FEN30 20,7±1,6a,b,c,f 25,2±3,2a,b 3,3±0,2
CNZP 0,5 33,8±4,1a,b,c,d,f 34,6±4,7a,b,c,d,f 1,8±0,2 a,b,c,d,f
Camundongos Swiss, machos, receberam salina 0,9% (controles) ou trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg,i.p.), sozinha e/ou associada ao fenobarbital (TMZ 5mg/kg + FEN 10mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/kg, i.p.) e clonazepam (0,5mg/kg, i.p.) durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos após a últimaadministração foi administrada metil-escopolamina (1 mg/Kg, i.p.) e 30 min depois foi administradapilocarpina (320 mg/kg, i.p.). Os animais foram observados durante 1 hora após a injeção de P320. a vscontrole, b vs TMZ5, c vs TMZ10, d vs TMZ20, e vs TMZ5+FEN10, f vs FEN10, com p<0,05(ANOVA seguido por teste de Tukey).
48
5.2. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES DO PRÉ-TRATAMENTO COM
TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU CLONAZEPAM NO MODELO DE CONVULSÕES
INDUZIDAS POR PILOCARPINA
5.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre
a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) no modelo de
convulsão induzido por pilocarpina.
Os resultados da análise da produção de substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em hipocampo, núcleos da base e córtex pré-frontal dos diferentes grupos de tratamento foram
expressos em μg de MDA (malonildialdeído)/ mg de proteína (Figuras 2, 3 e 4).
5.2.1.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre
a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em hipocampo de
camundongos tratados com PILO.
Um aumento significativo na concentração de MDA em relação aos demais grupos foi
evidenciado no hipocampo dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles (tratados
apenas com salina - SLN). O TMZ apenas nas doses de 10 e 20 foi capaz de reverter a elevação dos
níveis de MDA induzida por Pilo. Quando administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis de
MDA na área cerebral estudada. Embora o TMZ na dose de 5 mg/kg e FEN na dose de 10 mg/kg
sozinhos não tenham alterado a elevação dos níveis de MDA provocada por Pilo, a associação dessas
duas drogas promoveu uma redução significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo
tratado com P320 (SLN+PILO) (Figura 2). Hipocampo: Controle = 98,8 ± 5,5 (8); PILO = 336,5 ±
25,2 (8); TMZ5 = 284,6 ± 19,7 (8); TMZ10 = 171,3 ± 20,1 (8); TMZ20 = 175,3 ± 20,1 (8);
TMZ5+FEN10 = 174,6 ± 23,0 (8); FEN10 = 265,1 ± 19,8 (8); FEN30 = 279,5 ± 24,5 (8); CNZP0,5 =
245,2 ± 9,2 (8).
49
Figura 2. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) emhipocampo de camundongos tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência delipoperoxidação, com base na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. avs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).
50
5.2.1.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP
sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleos
da base de camundongos tratados com PILO.
Um aumento significativo na concentração de MDA em relação aos demais grupos foi
evidenciado no núcleo da base dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles
(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ em todas as doses testadas foi capaz de reverter a elevação
dos níveis de MDA induzida por PILO (320mg/kg, i.p.). Quando administrado isoladamente TMZ não
alterou os níveis de MDA na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas dose de 10 e 30 mg/kg
não tenha alterado a elevação dos níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10
promoveu uma redução significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo tratado com P400
(SLN+PILO) (Figura 3). Núcleos da base: Controle = 155,2 ± 8,3 (8); PILO = 369,5 ± 19,3 (8); TMZ5
= 227,8 ± 16 (8); TMZ10 = 201,7 ± 22,6 (8); TMZ20 = 173,7 ± 15,9 (8); TMZ5+FEN10 = 199,0 ± 25,1
(8); FEN10 = 252,1 ± 21,2 (8); FEN30 = 314,5 ± 11,4 (8); CNZP0,5 = 219,4 ± 12,7 (8).
51
Figura 3. Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleosda base de camundongos tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência delipoperoxidação, com base na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. avs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).
52
5.2.1.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP
sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtex
pré-frontal de camundongos tratados com PILO.
Um aumento significativo na concentração de MDA em relação aos demais grupos foi
evidenciado no núcleo da base dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles
(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ nas doses de 10 e 20 foi capaz de reverter a elevação dos
níveis de MDA induzida por PILO. Quando administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis de
MDA na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas dose de 10 e 30 mg/kg não tenha alterado a
elevação dos níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução
significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo tratado com PILO (SLN+PILO) (Figura
4). Núcleos da base: Controle = 173,2 ± 7,8 (8); PILO = 332,1 ± 112,2 (8); TMZ5 = 277,8 ± 22,1 (8);
TMZ10 = 183 ± 11,3 (8); TMZ20 = 167,2 ± 18,3 (8); TMZ5+FEN10 = 153,1 ± 20,4 (8); FEN10 = 271,8
± 10,5 (8); FEN30 = 315,2 ± 21,4 (7); CNZP0,5 = 221,4 ± 11,4 (7).
53
Figura 4. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtexpré-frontal tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência de lipoperoxidação, combase na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. a vs SLN, b vsSLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05 (ANOVA e Teste deTukey).
PILO
54
5.2.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre
a produção de nitrito e nitrato no modelo de convulsão induzido por pilocarpina
5.2.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP
sobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com
PILO
Um aumento significativo na concentração de nitrito e nitrato em relação aos demais grupos foi
evidenciado no hipocampo dos animais tratados com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados
apenas com salina - SLN). O TMZ apenas nas doses de 5 e 10 foi capaz de reverter a elevação dos níveis
de nitrito e nitrato induzida por PILO. Na ausência da PILO, administrado isoladamente TMZ não
alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. Embora o FEN na dose de 10 mg/kg
sozinho não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada por PILO, a associação
com TMZ promoveu uma redução significativa dos níveis de nitrito e nitrato quando comparada ao
grupo controle (SLN+PILO) (Figura 5). Hipocampo: Controle = 14,37 ± 1,6 (6); PILO = 29,06 ± 3,0
(6); TMZ5 = 10,94 ± 13,9 (6); TMZ10 = 17,44 ± 1,7 (5); TMZ20 = 18,4 ± 1,7 (5); TMZ5+FEN10 =
15,68 ± 1,9 (6); FEN10 = 31,11 ± 3,8 (5); FEN30 = 16,72 ± 2,3 (6); CNZP0,5 = 18,95 ± 2,29 (6).
55
Figura 5. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo deconvulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN, bvs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05 (ANOVA e Testede Tukey).
PILO
SLN
SLN+P400
TMZ5
TMZ10
TMZ20
TMZ5+FEN10
FEN10
FEN30CNZP
Nitr
itoe
nitr
ato
(M
/gde
teci
do)
56
5.2.2.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP
sobre a produção de nitrito e nitrato em núcleos da base de camundongos submetidos à convulsão
com PILO
Um aumento significativo na concentração de nitrito e nitrato em relação aos demais grupos foi
evidenciado no núcleo da base dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles
(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ em todas as doses testadas foi capaz de reverter a elevação
dos níveis de nitrito e nitrato induzida por PILO. Quando administrado isoladamente, na ausência de
PILO, TMZ não alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. FEN sozinho na dose de
10 mg/kg e em associação com o TMZ não alterou a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada
por PILO, no entanto FEN sozinho na maior dose promoveu uma redução significativa dos níveis de
nitrito e nitrato quando comparado ao grupo tratado com PILO (SLN+PILO) (Figura 6). Núcleos da
base: Controle = 14,75 ± 1,1 (6); PILO = 36,52 ± 4,9 (6); TMZ5 = 16,61 ± 1,5 (6); TMZ10 = 20,19 ±
2,3 (6); TMZ20 = 17,16 ± 0,52 (5); TMZ5+FEN10 = 30,28 ± 2,7 (5); FEN10 = 30,75 ± 4,1 (6); FEN30
= 20,81 ± 1,1 (6); CNZP0,5 = 31,22 ± 3,88 (6).
57
Figura 6. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito/nitrato em núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo deconvulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN, bvs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,01 (ANOVA e Testede Tukey).
PILO
NB
SLN
SLN+P40
0TMZ5
TMZ10
TMZ20
TMZ5+FEN10
FEN10
FEN30CNZP
0
10
20
30
40
50a
bb
b
a a,c
b
a
58
5.2.2.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP
sobre a produção de nitrito e nitrato em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo
de convulsão com PILO
Um aumento significativo na concentração de nitrito e nitrato em relação aos demais grupos foi
evidenciado no córtex pré-frontal dos animais tratados com PILO (p<0,001) em relação aos controles
(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ nas doses de 5 e 10 foi capaz de reverter a elevação dos
níveis de nitrito e nitrato induzida por PILO. Quando administrado isoladamente, na ausência de PILO,
TMZ não alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas
doses de 10 e 30 mg/kg não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada por PILO,
a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa dos níveis de nitrito e nitrato quando
comparada ao grupo tratado com PILO (SLN+P320) (Figura 7). Córtex pré-frontal: Controle = 17,42 ±
1,9 (6); PILO = 36,28 ± 4,4 (6); TMZ5 = 20,3 ± 1,2 (6); TMZ10 = 19,88 ± 1,7 (6); TMZ20 = 26,8 ±
1,89 (6); TMZ5+FEN10 = 14,01 ± 2,6 (6); FEN10 = 56,74 ± 5,3 (6); FEN30 = 25,94 ± 2,6 (6);
CNZP0,5 = 18,94 ± 2,1 (6).
59
Figura 7. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito/nitrato em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelode convulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN,b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,01 (ANOVA e Testede Tukey).
PILO
CPF
SLN
SLN+P400
TMZ5
TMZ10
TMZ20
TMZ5+FEN10
FEN10
FEN30CNZP
0
20
40
60
80
a
b bb
a,b,d,f
b
60
5.3. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA,
SOZINHA E/OU EM ASSOCIAÇÃO COM FENOBARBITAL, CLONAZEPAM NAS
CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR
PILOCARPINA
5.3.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN sobre os níveis de
glutationa (GSH) no hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com PILO
Uma redução significativa na concentração de GSH foi observada no hipocampo dos animais
tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ
sozinho na dose de 5mg/kg não foi capaz de reverter a redução dos níveis de GSH induzida por PILO.
Embora o FEN na dose de 10 mg/kg sozinho também não tenha alterado os níveis de GSH, a associação
com TMZ5 promoveu uma recuperação parcial dos níveis de GSH provocada por PILO (SLN+PILO)
(Figura 8). Hipocampo: Controle = 117,8 ± 12,1 (6); PILO = 44,34 ± 4,3 (8); TMZ5 = 65,75 ± 9,3 (8);
FEN10 = 66,5 ± 8,2 (7); TMZ5+FEN10 = 112,6 ± 7,5 (8).
61
Figura 8. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveis deGSH em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=6-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, dvs FEN10; com p<0,01 (ANOVA e Teste de Tukey).
PILO
HC
SLN
SLN+PILOTMZ5
TMZ10
TMZ20
TMZ5+FEN10
FEN10
FEN300
50
100
150
a
b,c,d
a a a,fa,f
b
62
5.3.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN sobre os níveis de
glutationa (GSH) nos núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com
PILO
Houve uma redução na concentração de GSH nos núcleos da base dos animais tratados com
PILO (p<0,005) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ sozinho na dose
de 5mg/kg não foi capaz de reverter a redução dos níveis de GSH induzida por PILO. FEN na dose de
10 mg/kg sozinho também não alterou a elevação dos níveis de GSH provocada por PILO, mas a
associação FEN com TMZ5 promoveu uma recuperação os níveis de GSH a níveis próximos dos
controles (SLN) (Figura 9). Hipocampo: Controle = 143,2 ± 6,8 (7); PILO = 48,41 ± 3,3 (8); TMZ5 =
88,27 ± 7,6 (8); FEN10 = 91,10 ± 7,4 (7); TMZ5+FEN10 = 132,3 ± 10,1 (8).
63
Figura 9. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveis deGSH nos núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=7-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, dvs FEN10, f vs TMZ5+FEN10; com p<0,005 (ANOVA e Teste de Tukey).
PILO
64
5.3.3 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN sobre os níveis de
glutationa (GSH) no córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com
PILO
Houve redução na concentração de GSH no córtex pré-frontal dos animais tratados com PILO
(p<0,001) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ sozinho na dose de
5mg/kg assim como o FEN sozinho na dose de 10 mg/kg não foram capazes de reverter a elevação dos
níveis de GSH induzida por PILO. Todavia a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma recuperação dos
níveis de GSH (Figura 10). Hipocampo: Controle = 137,7 ± 9,6 (7); PILO = 83,73 ± 8,3 (8); TMZ5 =
77,97 ± 15,5 (8); FEN10 = 86,71 ± 6,7 (7); TMZ5+FEN10 = 124,6 ± 5,3 (8).
65
Figura 10. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveisde GSH em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão compilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=7-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, cvs TMZ5; com p<0,001 (ANOVA e Teste de Tukey).
PILO
66
5.4. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS DO PRÉ-TRATAMENTO
COM TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR PILOCARPINA
5.4.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre
os níveis de mieloperoxidase (MPO) em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com
PILO
Um aumento significativo na concentração de MPO em relação aos demais grupos foi
evidenciado no hipocampo dos animais tratados com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados
apenas com salina - SLN). O TMZ apenas na dose de 20 foi capaz de reverter a elevação dos níveis de
MPO induzida por PILO. Na ausência da PILO, administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis
de MPO na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho em todas as doses testadas não tenha alterado
a elevação dos níveis de MPO provocada por PILO, a dose de 10mg/kg em associação com TMZ
promoveu uma redução significativa dos níveis de MPO quando comparada ao grupo controle
(SLN+PILO) (Figura 7). Hipocampo: Controle = 1,68 ± 0,2 (6); PILO = 4,77 ± 0,52 (6); TMZ5 = 3,38
± 0,22 (6); TMZ10 = 3,16 ± 0,26 (6); TMZ20 = 2,85 ± 0,25 (6); TMZ5+FEN10 = 2,46 ± 0,32 (6);
FEN10 = 3,65 ± 0,45 (6); FEN30 = 3,2 ± 0,5 (6); CNZP0,5 = 2,1 ± 0,25 (6).
67
Figura 11. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre os níveis de MPO em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão compilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=06. a vs SLN, b vs SLN+PILO;com p<0,05 (ANOVA e Teste de Tukey).
SLN
SLN+PILOTMZ5
TMZ10
TMZ20
TMZ5+FEN10
FEN10
FEN30CNZP
Uni
dade
sde
MPO
/mg
dete
cido
PILO
68
5.5. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA
E/OU FENOBARBITAL NA CONCENTRAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS GABA E
GLUTAMATO EM HIPOCAMPO DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE
CONVULSÕES INDUZIDAS POR PILOCARPINA
5.5.1 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentração
do aminoácido excitatório glutamato (GLU) em hipocampo de camundongos submetidos à
convulsão com PILO
Foi observado um aumento de 168% na concentração de GLU no hipocampo dos animais
tratados com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ
apenas na dose de 20 apresentou uma tendência a reverter a elevação dos níveis de GLU induzida por
PILO. Embora o FEN sozinho não tenha alterado a elevação dos níveis de GLU provocada por PILO, a
associação com TMZ promoveu uma redução significativa (32%) dos níveis de GLU quando comparada
ao grupo controle (SLN+PILO) (Figura 12). Hipocampo: Controle = 33,27 ± 5,2 (5); PILO = 89,38 ±
5,96 (4); TMZ5 = 65,72 ± 7,14 (5); TMZ10 = 69,75 ± 6,12 (4); TMZ20 = 61,23 ± 5,19 (3);
TMZ5+FEN10 = 60,32 ± 6,26 (5); FEN10 = 72,15 ± 6,18 (4).
69
Figura 12. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentraçãodo GLU em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=3-5. a vs SLN, b vs SLN+PILO; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).
PILO
70
5.5.2 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentração
do aminoácido inibitório GABA em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com
PILO
Foi observado um aumento de 2x na concentração de GABA no hipocampo dos animais tratados
com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ apenas na
dose de 20 apresentou uma tendência a reverter a elevação dos níveis de GABA induzida por PILO. Não
foram observadas diferenças significativas entre os grupos tratados (Figura 13). Hipocampo: Controle =
25,24 ± 2,1 (5); PILO = 76,40 ± 8,4 (4); TMZ5 = 65,90 ± 7,4 (5); TMZ10 = 71,43 ± 8,6 (4); TMZ20 =
49,78 ± 6,5 (4); TMZ5+FEN10 = 56,38 ± 7,5 (5); FEN10 = 82,02 ± 7,66 (5).
71
Figura 13. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentraçãodo GABA em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=4-5. a vs SLN; com p<0,05 (ANOVA e Testede Tukey).
PILO
72
6. DISCUSSÃO
O presente estudo testou a trimetazidina nas doses de 5, 10 e 20mg/kg e em associação com o
fenobarbital no modelo de convulsões induzidas por pilocarpina em camundongos. Os resultados
demonstraram que, para os grupos tratados com trimetazidina, ocorreu maior atividade protetora contra
convulsões e status epilepticus. O percentual de morte foi reduzido proporcionalmente ao aumento das
doses nos grupos tratados com timetazidina quando comparados ao grupo controle, porém o grupo que
associava a trimetazidina ao fenobarbital sofreu redução ainda maior. A latência de convulsão aumentou
proporcionalmente nos grupos TMZ10, TMZ20 e TMZ5+FEN10 quando comparados ao grupo controle.
Houve aumento da latência do comportamento pré-convulsivo e da latência da primeira
convulsão proporcionalmente ao aumento das doses nos grupos tratados com timetazidina quando
comparados ao grupo controle, porém o grupo que associava a trimetazidina ao fenobarbital sofreu
aumento superior. Também foi observada uma redução dos escores da escala de Racine dos animais pré-
tratados com TMZ quando comparados ao grupo controle. Esses resultados demonstram que o pré-
tratamento com TMZ reduziu a intensidade e a severidade das convulsões induzidas por pilocarpina,
provavelmente devido as suas ações modulatórias nos canais iônicos, através da redução do estresse
oxidativo e dos seus efeitos antiinflamatórios.
O modelo de convulsões decorrentes da administração do agonista muscarínico pilocarpina em
roedores assemelha-se, em muitos aspectos, à epilepsia “lobo-temporal”, “psicomotora” ou “límbica”,
como, por exemplo, nos padrões eletroencefalográficos, comportamento e sequelas morfológicas
(LEITE et al., 1990; CAVALHEIRO et al., 1991; OLIVEIRA et al., 2005). De uma maneira geral, as
convulsões induzidas por pilocarpina podem produzir danos neuronais em diversas áreas e,
especialmente, nas estruturas límbicas, causando perda neuronal no hipocampo, amígdala, córtex
piriforme, córtex entorrinal, septum lateral, tálamo, neocórtex e substância negra, sugerindo o
envolvimento de diferentes áreas durante o estabelecimento do processo epiléptico (TURSKI et al.,
1987; HONCHAR et al., 1990; BORELLI et al., 2002; SCHOLL et al., 2013).
O hipocampo tem sido sugerido como sendo o sítio de origem da atividade convulsiva induzida
por pilocarpina (TURSKI et al.,1983a,b). Outros achados sugerem como sítio inicial dessas convulsões,
o pálido ventral ou nucleo accumbens (CLIFFORD et al., 1987). Estudos eletroencefalográficos e
73
autoradiográficos realizados posteriormente sugeriram ambas as áreas como locais de início das
convulsões (LABANDEIRA-GARCIA et al., 1994; KULKARNI; GEORGE, 1995; BUCKMASTER &
HANEY, 2012; SCHOLL et al., 2013).
Evidências indicam desequilíbrio entre a geração de radicais livres e os sistemas antioxidantes,
além disso, as espécies reativas do oxigênio (ROS) têm sido implicadas no desenvolvimento das
convulsões e da neurodegeneração induzida pelo processo convulsivo. Estudos sugerem que as
convulsões induzidas por pilocarpina estão relacionadas com o aumento do estresse oxidativo (TALFIK,
2011).
O estresse oxidativo foi definido por Sies (1991) como uma pertubação do equilíbrio: pró-
oxidante – antioxidante, em favor do primeiro, a qual é potencialmente capaz de causar dano celular.
Uma conseqüência desse desequilíbrio é a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados da membrana
celular, processo denominado de lipoperoxidação. A ocorrência da lipoperoxidação pode comprometer a
estrutura da membrana, danificando-a ou eventualmente causar completa destruição culminando com a
morte celular (MOSLEY et al., 2006; NAKAMURA; LIPTON, 2009; ROWLEY & PATEL, 2013).
Os nossos resultados demonstram que o estresse oxidativo realmente aumenta durante as
convulsões induzidas por pilocarpina, indicando que o dano cerebral induzido pelo processo oxidativo
desempenha um papel crucial na fisiopatologia das convulsões. Foi observado um aumento das
concentrações de MDA e nitrito/nitrato em todas as áreas estudadas dos animais submetidos a convulsão
induzida por pilocarpina.
Foi observada a elevação da concentração de MDA no hipocampo, núcleos da base e córtex pré-
frontal dos animais tratados com PILO em relação aos controles. Nos grupos tratados TMZ10 e TMZ20
houve redução da concentração de MDA. Embora o FEN sozinho não tenha alterado a elevação dos
níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa
desses níveis quando comparada ao grupo controle, demonstrando que uma possível associação dessas
drogas pode ter um efeito satisfatório mesmo utilizando subdoses, promovendo assim a redução dos
efeitos colaterais.
74
Foi observada a elevação dos níveis de nitrito e nitrato no hipocampo, núcleos da base e córtex
pré-frontal dos animais tratados com PILO em relação aos controles. Nos grupos tratados TMZ5,
TMZ10 e TMZ20 houve reversão da elevação dos níveis de nitrito e nitrato. Embora o FEN sozinho na
menor dose (dose subanticonvulsivante) não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato, a
associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa desses níveis quando comparada ao
grupo controle, demonstrando que uma possível associação dessas drogas pode ter um efeito satisfatório
mesmo utilizando subdoses, promovendo assim a redução dos efeitos colaterais.
Os resultados obtidos demonstraram que o pré-tratamento com TMZ na menor dose (5 mg/kg)
apresentou um efeito menor quando comparado com as maiores doses, assim como FEN na subdose (10
mg/kg) também não apresentou efeitos significativos nos parâmetros analisados, porém a associação da
TMZ com FEN nas menores doses apresentaram melhores efeitos, com redução da severidade das
convulsões, recuperação dos níveis de nitrito e nitrato, recuperação dos níveis de glutationa e efeito anti-
inflamatório com a redução das concentrações de MPO. Além disso, a associação também promoveu
recuperação dos níveis de glutamato e houve uma tendência a recuperação também dos níveis de
GABA.
A proteção demonstrada pela TMZ no presente estudo está de acordo com estudos anteriores que
observaram que drogas bloqueadoras de canais de cálcio apresentaram efeito protetor em vários modelos
de convulsão em animai (LUSZCZKI, 2007; JAIN et al., 2010).
A trimetazidina também apresenta ação bloqueadora de canais de cálcio e pode reduzir o
conteúdo de cálcio intracelular. Já é bem conhecido na literatura que alguns anticonvulsivantes agem
interferindo com canais de cálcio, reduzindo a excitabilidade neuronal (JAIN et al., 2010). No presente
estudo a dose subanticonvulsivante de TMZ foi associada com uma dose subanticonvulsivante de
fenobarbital. Essa associação apresentou efeitos benéficos revertendo boa parte das alterações induzidas
pela pilocarpina e reduzindo a severidade das convulsões. Esses resultados são comparáveis com alguns
dos efeitos obtidos com TMZ sozinha nas maiores doses (10 e 20 mg/kg) e com a dose
anticonvulsivante do fenobarbital (30 mg/kg).
75
Esses resultados sugerem que a trimetazidina apresenta atividade anticonvulsivante e
neuroprotetora no modelo de convulsão induzida por pilocarpina, possivelmente devido a modulação
dos canais de cálcio, reduzindo o estresse oxidativo e o processo inflamatório, consequentemente o dano
neuronal. No entanto, são necessários mais estudos, utilizando inclusive tratamento crônico e outras
análises neuroquímicas para esclarecer o exato mecanismo de ação da trimetazidina na epilepsia.
76
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
- A administração de TMZ, durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes da pilocarpina,
aumentou a latência de convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente, todavia, a dose
de 20 mg/kg, foi a que mostrou melhor efeito quando comparada às demais doses;
- Enquanto TMZ e FEN sozinhos nas menores doses praticamente não apresentaram efeitos benéficos
nesse modelo, a associação de TMZ na menor dose com FEN na dose subanticonvulsivante aumentou a
latência de convulsão em 125%, levou à ausência de convulsões em 23% dos animais; reduziu a
ocorrência de estado epiléptico em 38% e protegeu 48% dos animais da morte, mostrando uma possível
potenciação de efeitos, com resultados semelhantes aqueles observados com o FEN sozinho na dose
anticonvulsivante (30 mg/kg);
- O TMZ na maior dose reduziu a severidade das convulsões, assim como a associação das subdoses
TMZ+FEN, com resultados semelhantes aos obtidos com FEN na dose anticonvulsivante, mostrando
que o TMZ é capaz de proteger contra os episódios convulsivos induzidos por PILO;
- A pilocarpina causou aumento no conteúdo de MDA e nitrito/nitrato no CPF, HC e CE, demonstrando
que o estresse oxidativo tem um papel importante no mecanismo de lesão induzida por PILO e essas
alterações foram parcialmente revertidas com o pré-tratamento com TMZ, principalmente nas maiores
doses e mais uma vez, a associação das subdoses de TMZ+FEN apresentou efeito semelhante a TMZ na
maior dose e ao FEN na dose anticonvulsivante, comprovando o efeito antioxidante da TMZ e a
potenciação dos efeitos do FEN;
- A associação das subdoses de TMZ+FEN reverteu os efeitos da pilocarpina nos níveis de glutationa
reduzida em todas as áreas testadas, embora a administração dessas mesmas doses sozinhas não tenha
promovido qualquer alteração, mostrando mais uma vez a potencialização dos efeitos do FEN mediada
pela TMZ;
- O TMZ apenas na dose de 20 foi capaz de reverter a elevação dos níveis de MPO induzida por PILO.
Embora o FEN sozinho em todas as doses testadas não tenha alterado a elevação dos níveis de MPO
77
provocada por PILO, a dose de 10mg/kg em associação com TMZ promoveu uma redução significativa
dos níveis de MPO, mostrando que a TMZ provavelmente apresentou efeitos anti-inflamatórios nesse
modelo;
- As concentrações dos aminoácidos neurotransmissores GABA e glutamato aumentaram
significativamente no hipocampo dos animais controle (PILO) e essas concentrações foram parcialmente
recuperadas nos animais pré-tratados com a associação TMZ+FEN.
78
8. CONCLUSÃO
A análise dos resultados apresentados neste trabalho nos permitiu concluir que a trimetazidina
apresentou efeitos neuroprotetores no modelo de convulsão induzida por pilocarpina, sendo necessários
mais estudos para elucidação dos mecanismos envolvidos nesta neuroproteção.
Os dados revelaram ainda um estudo inédito e que abre possibilidades para o aprofundamento de
novas pesquisas sobre o uso da trimetazidina como adjuvante no tratamento da epilepsia com efeito de
potencializar as ações do fenobarbital, que é um anticonvulsivante padrão, permitindo uma redução da
dose deste e com isso redução dos seus efeitos colaterais.
79
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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