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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNICAS MÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA MESTRADO EM HIGIENE VETERINÁRIA E PROCESSAMENTO TEC NOLÓGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

LUCIMAR LIMA MARTINS AVALIAÇÃO DO PERFIL BACTERIOLÓGICO DE SALSICHAS TIP O “HOT DOG” TRADICIONAL E DE FRANGO COMERCIALIZADAS NOS MUNICÍP IOS DO RIO DE JANEIRO E NITERÓI – RJ COM DETERMINAÇÃO DE ATIVI DADE DE ÁGUA

E pH

NITERÓI

2006

LUCIMAR LIMA MARTINS

AVALIAÇÃO DO PERFIL BACTERIOLÓGICO DE SALSICHAS TIPO “HOT DOG” TRADICIONAL E DE FRANGO COMERCIALIZADAS NOS MUNICÍPIOS DO RIO DE JANEIRO E NITERÓI – RJ COM DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE ÁGUA

E pH

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal.

Orientador: Prof. Dr. Iacir Francisco dos Santos

Niterói

2006

LUCIMAR LIMA MARTINS

AVALIAÇÃO DO PERFIL BACTERIOLÓGICO DE SALSICHAS TIPO “HOT DOG” TRADICIONAL E DE FRANGO COMERCIALIZADAS NOS MUNICÍPIOS DO RIO DE JANEIRO E NITERÓI – RJ COM DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE ÁGUA

E pH

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal.

Aprovado em: _________________________

BANCA EXAMINADORA:

___________________________________ Prof. Dr. Iacir Francisco dos Santos – Orientador

UFF

___________________________________ Prof. Dr. Luiz Antonio Trindade de Oliveira – Co-Orientador

UFF

___________________________________ Prof. Dr. Robson Maia Franco

UFF

___________________________________ M.V. Dra. Maria da Graça Fichel do Nascimento

EMBRAPA – Agroindústria de Alimentos

Niterói

2006

AGRADECIMENTOS Primeiramente a DEUS pela iluminação espiritual permanente na minha caminhada e assim tudo me permitir. À minha mãe Alda e à minha irmã Carmen por tornarem meu sonho realidade e serem fontes diárias de amor, carinho, incentivo e compreensão.

Ao meu namorado Leonardo por todo amor, apoio, paciência e pela presença segura, competente e estimulante, que me deu forças para superar todos momentos difíceis que passamos juntos.

Ao Prof. Iacir Francisco dos Santos – meu orientador, amigo e exemplo profissional, pelo aprendizado da humildade onde não bastam conhecimentos técnicos-científicos, pelo crédito no meu trabalho, e por propiciar-me a oportunidade de alcançar mais uma etapa ilustre de experiência, meu respeito e gratidão serão eternos.

Ao Prof. Robson Maia Franco por toda sabedoria transmitida, amizade e preocupação, principalmente por ser mestre por vocação e não por ocasião.

Ao Prof. Luiz Antônio Trindade de Oliveira por todo carinho, atenção e ensinamentos transmitidos. Aos Professores Elmiro Rosendo do Nascimento e Lauro Boechat pela ajuda segura e competente nas análises estatísticas e por todos os ensinamentos fundamentais para minha formação. Ao Prof. Sérgio Borges Mano – Coordenador do Programa de Pós – Graduação em Medicina Veterinária na área de Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal – UFF, por toda preocupação em transmitir-me o máximo do seu conhecimento. Ao Drausio de Paiva Ferreira por toda confiança, apoio e principalmente pela amizade conquistada.

À Juliana Bezz – grande amiga, pela ajuda segura e competente nos experimentos, e principalmente pela amizade, paciência e solidariedade. A todos professores que participaram da minha formação pelo carinho e incentivo profissional. Aos colegas de turma, principalmente aos que se tornaram amigos, Deus nos uniu caprichosamente em busca de um mesmo ideal, foram momentos de incertezas, inseguranças e também momentos de muitas, mas muitas alegrias e confraternizações. Às minhas amigas Alessandra Cuñas, Aline Pacheco, Cláudia Leal, Danielle Barbosa, Mônica Macedo e Simone Ferreira, a Medicina Veterinária nos uniu e me fez concluir que amigos são irmãos que Deus nos permite escolher, ou talvez sejam anjos que caem do céu, muito obrigada por todos os momentos compartilhados. Às minhas amigas Danielle Pereira e Flávia Marques fontes fundamentais de amizade, com certeza a satisfação dessa conquista é fruto da torcida e do apoio de vocês. Às minha mais novas amigas Flávia Calixto e Yoli, com certeza o mundo seria bem melhor se em cada lugar existissem pessoas maravilhosas como vocês, muito obrigada por cada momento de felicidade compartilhado.

“É melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à derrota, do que formar fila com os pobres de espírito, que nem gozam muito, nem sofrem muito porque vivem mergulhados em penumbra cinzenta que não conhece a vitória e nem derrota.”

Autor desconhecido.

RESUMO No mundo inteiro, apesar da evolução tecnológica das últimas décadas quanto as técnicas de conservação e higiene dos alimentos, as doenças transmitidas por alimentos são um dos principais problemas de saúde pública, onde os alimentos são os principais vetores de enfermidades entéricas agudas, colocando em alerta os serviços de inspeção e de vigilância sanitária e a comunidade científica. Após a reflexão da posição de destaque que embutidos cárneos vêm ocupando no mercado consumidor, associado ao fato de que registros oficiais de surtos de Enfermidade Transmitida por Alimento (ETA) indicam que mais de 74% dos surtos em que o veículo alimentar é estabelecido, pratos a base de carne bovina e de frango são os principais incriminados, foi desenvolvida esta pesquisa com objetivo de avaliar o perfil bacteriológico de salsichas tipo “hot dog” de carne bovina (tipo tradicional) e de carne de frango (tipo frango) comercializadas a vácuo e a granel, adquiridas em diferentes supermercados dos municípios de Rio de Janeiro e Niterói - RJ frente a presença potencial de patógenos. Nesse estudo pretendeu-se também avaliar a interrelação entre os valores de atividade de água (Aa) e pH das amostras analisadas com os descritos na literatura. As amostras foram submetidas às seguintes análises bacteriológicas: enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli; contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva; contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens e detecção de Salmonella spp. A metodologia utilizada foi a convencional com modificações pertinentes. Comparando-se os resultados obtidos com a legislação em vigor, observou-se que 34% das amostras foram consideradas impróprias ao consumo, tendo sido isolados todos os microrganismos pesquisados. Em relação à Aa foi observado o crescimento de microrganismo em valores inferiores aqueles descritos na literatura. De acordo com os resultados observados, pode-se concluir que as salsichas tipo “hot dog” avaliadas são passíveis de levar a quadros de doenças transmitidas por alimentos, representando um risco à saúde coletiva. Palavras-chaves: salsichas, microrganismos, atividade de água, pH.

ABSTRACT Despite the technological evolution throughout the last decades regarding food hygiene and conservation techniques worldwide, the foodborne diseases are one of the main problems of public health, where the food is the main vector of high enteric diseases, putting in alert the inspection and sanitary vigilance services and the scientific community. After the reflection of the success that meat sausages has been occupying on consumer’s market, and also by the fact that the official registers of out breaks sources spreads indicates that more than 74% of the spreads that the food vehicle is established, chicken and meat dishes are the most blamed, a research has been developed to try to rate the bacteriological profile of bovine and chicken “hot dog” sausages that are vacuumed and retail commercialized and comes from supermarkets in Rio de Janeiro and Niteroi-RJ, facing the potential presence of patogenics. The study also intended to show the relation between the values of activity water (aw) and the pH of the analyzed samples with the ones described by the literature. The samples were submitted to the following bacteriological analysis: coliforms at 35ºC and 45ºC enumeration, and Escherichia coli; Staphylococcus spp. coagulase positive counting; Clostridium sulfito reductors at 46ºC and Clostridium perfringens counting and Salmonella spp. research. The utilized methodology was traditional with appropriate modifications. By comparing the achieved results with the current legislation we could see that 34% of the sample was considered inappropriate to consume, with the isolation of every microorganism researched. About aw, we could observe the microorganism growth in smaller values than the ones described by the literature. According to these results, we can conclude that the “hot dog” sausages may cause foodborne illness, representing a huge risk to people’s health. Keywords: sausages, microorganism, activity water, pH

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 123 Figura 2: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo, p. 123 Figura 3: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel, p. 124 Figura 4: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo, p. 124 Figura 5. Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel, p. 124 Figura 6: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” analisadas em relação ao tipo e à forma de comercialização, p. 125 Figura 7: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 126 Figura 8: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo, p. 126 Figura 9: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel, p. 127

Figura 10: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo, p. 127 Figura 11: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel, p. 127 Figura 12: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” em relação ao tipo e à forma de comercialização, p. 128 Figura 13: Freqüência relativa dos resultados obtidos na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 129 Figura 14: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a granel, p. 129 Figura 15: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na detecção de Salmonella spp. nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 130 Figura 16: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na detecção de Salmonella spp. nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a granel, p. 130 Figura 17. Freqüência relativa (%) das amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel fora do padrão estabelecido por lei quanto o número de análises, p. 131 Figura 18: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli, nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 133 Figura 19: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo, p. 133 Figura 20: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel, p. 134 Figura 21: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo, p. 134

Figura 22: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel, p. 134 Figura 13.1: Médias de pH das amostras de salsichas “hot dog” segundo os tipos de embalagens, p. 143 Figura 14.1: Médias de Aa das amostras de salsichas “hot dog” segundo os tipos de salsichas, p. 145 Figura 14.2 Médias de Aa das salsichas “hot dog” tradicionais dentre os tipos deembalagens, p. 145 Figura 23: Material para pesagem das amostras na câmara asséptica, p. 191 Figura 24: Aparelho “Stomacher” para cominuição e homogeneização das amostras, p. 191 Figura 25: Estufa de incubação a 37ºC, p. 191 Figura 26: Banho-maria com agitação para incubação a 45ºC ± 0,2ºC, p. 192 Figura 27: Caldo Escherichia coli (EC) e caldo verde brilhante bile lactose (VBBL) – teste confirmativo para coliformes a 45ºC e coliformes a 35ºC, p. 192 Figura 28: Caldo “Fluorocult” – teste confirmativo de coliformes a 35ºC, p. 192 Figura 29: Caldo “Fluorocult” – teste confirmativo de E. coli. (1) fluorescência positiva; (2) indol negativo; (3) indol positivo, p. 193 Figura 30: Ágar Baird Parker com crescimento sugestivo de colônias atípicas de S. aureus, p. 193 Figura 31: Ágar Baird Parker com crescimento sugestivo de colônias típicas de S. aureus, p. 193 Figura 32: Esfregaço corado pelo método de Gram – presença de cocos Gram-positivos, p. 194 Figura 33: Prova da Dnase positiva no ágar azul de toluidina-DNA, p. 194 Figura 34: Prova da coagulase. (1) coágulo grande e organizado ; (2) coágulo pequeno e desorganizado; (3) não formação de coágulo, p. 194 Figura 35: Prova da fermentação tempestuosa do leite. (1) positivo; (2) negativo, p. 195 Figura 36: Prova da fermentação da lactose e liquefação da gelatina. (1) negativo; (2) positivo; (3) negativo para liquefação da gelatina, p. 195 Figura 37: Prova da fermentação da rafinose. (1) negativo; (2 e 3) positivos, p. 195

Figura 38: Caldo selenito cistina (SC) e caldo tetrationato (T) – enriquecimento seletivo para pesquisa de Salmonella spp. , p. 196 Figura 39: Ágar Hecktoen – plaqueamento seletivo para pesquisa de Salmonella spp. (presença de colônias sugestivas), p. 196 Figura 40: Ágar XLD – plaqueamento seletivo para pesquisa de Salmonella spp. (presença de colônias sugestivas), p. 196

LISTA DE QUADROS Quadro 1: Staphylococcus spp. enterotoxigênicos não produtores de coagulase, p. 53 Quadro 2: Enumeração de coliformes a 35ºC e a 45ºC, p. 185 Quadro 3: Enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli, p. 185 Quadro 4: Contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 187 Quadro 5: Contagem de Clostridium sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 189 Quadro 6: Detecção de Salmonella spp., p. 189

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Resultado das análises bacteriológicas realizadas em amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 122 Tabela 3: Enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli em salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 132 Tabela 4: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1), p. 135 Tabela 4.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1), p. 136 Tabela 5: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 45ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1), p. 136 Tabela 5.1. Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram coliformes a 45ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1), p. 136 Tabela 6: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2), p. 137 Tabela 6.1. Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2), p. 137

Tabela 7: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) Eschericia coli na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2), p. 138 Tabela 7.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Escherichia coli na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia. coli pelo método 2 (NMP2)dentro de NMP2, p. 138 Tabela 8: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) colônias típicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 138 Tabela 8.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram colônias típicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 139 Tabela 9: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) colônias atípicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 139 Tabela 9.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram colônias atípicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 140 Tabela 10: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) Salmonella spp. na pesquisa de Salmonella spp., p. 140 Tabela 10.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Salmonella spp. na pesquisa de Salmonella spp., p. 140 Tabela 11: Quantidades de amostras de salsichas que não ocorreram (ocorreram) Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 141 Tabela 11.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 141 Tabela 12: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) Clostridium perfringens na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 142 Tabela 12.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Clostridium perfringens na

contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 142 Tabela 13: Análise da variância dos valores de pH das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens, p. 142 Tabela 13.1: Médias de pH das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens, p. 143 Tabela 14: Análise da variância dos valores de Aa das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens, p. 143 Tabela 14.1: Análise da variância dos valores de Aa das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens, com novo desdobramento da soma de quadrados de tratamentos, p. 144 Tabela 14.2: Médias de pH das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens, p. 144 Tabela 2: Perfil bacteriológico das amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel, p. 180

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS Aa Atividade de água ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária APPCC Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle BPF Boas Práticas de Fabricação de Alimentos ºC Graus Celsius CDC Centro de Controle de Doenças cm2 centímetros quadrados DAEC Escherichia coli Difusamente Aderentes EaggEC Escherichia coli Enteroagregativas Eh Potencial de oxiredução EHEC Escherichia coli Enterohemorrágicas EIEC Escherichia coli Enteroinvasoras ELISA “Enzime Linked Immunosorbente Assay” EPEC Escherichia coli Enteropatogênicas ETA Enfermidade Transmitida por Alimento ETEC Escherichia coli Enterotoxigênicas EUA Estados Unidos da América do Norte FDA “Food and Drug Administration”

FEEC Escherichia coli Facultativamente Enteropatogênicas g grama H2S Sulfeto de Hidrogênio IL Interleucinas KGy Kilogray LT Toxina Termossensível MHC Complexo de Histocompatibilidade Maior min minuto mL mililitros mV milivolts µm micrometro NaCl Cloreto de Sódio NaNO2 Nitrato de Sódio ng nanograma NMP Número Mais Provável NMP1 Enumeração de Coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC – Método 1 NMP2 Enumeração de Coliformes a 35ºC e Escherichia coli – Método 2 OSP “Option Sensitivity Plate” pH Potencial de Hidrogênio PPHO Procedimento Padrão de Higiene Operacional % por cento RIISPOA Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de

Origem Animal SE “Enterotoxin Staphylococical” SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida STx1 Shiga Verotoxina 1

STx2 Shiga Verotoxina 2 TSST-1 “Toxin 1 Toxic Shock Syndrome” UFC Unidades Formadoras de Colônias UFF Universidade Federal Fluminense

SUMÁRIO AGRADECIMENTOS , p. 4 RESUMO, p. 7 ABSTRACT , p. 8 LISTA DE FIGURAS , p. 9 LISTA DE QUADROS , p. 13 LISTA DE TABELAS , p. 14 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS , p. 17 1 INTRODUÇÃO, p. 23 2 REVISÃO DE LITERATURA , p. 26

2.1 EMBUTIDOS, p. 26

2.1.1 Principais alterações e defeitos nos embutidos de massa cozida

a seco , p. 27

2.2 PADRÃO MICROBIOLÓGICO, p. 30

2.3 A IMPORTÂNCIA DA AVALIAÇÃO BACTERIOLÓGICA, p. 32

2.4 COLIFORMES A 35ºC, COLIFORMES A 45ºC E Escherichia coli, p. 36

2.4.1 Taxonomia e características da Escherichia coli, p. 37

2.4.2 Gastrenterites de origem alimentar causadas por E. coli, p. 39

2.4.3 Epidemiologia , p. 43

2.4.4 Fatores que afetam o crescimento da E. coli em alimentos , p. 46

2.4.5 Medidas preventivas , p. 48

2.5 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DO Staphylococcus aureus, p. 49

2.5.1 Gastrenterites de origem alimentar c ausadas por S. aureus, p. 51


2.5.3 Fatores que afetam o crescimento do S. aureus em alimentos , p. 67


2.6 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DO Clostridium perfringens, p. 73

2.6.1 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or C. perfringens, p. 75


2.6.3 Fatores que afetam o crescimento do C. perfringens em alimentos , p. 79


2.7 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DA Salmonella spp. , p. 82

2.7.1 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or Salmonella spp. , p. 83


2.7.3 Fatores que afetam o crescimento da Salmonella spp. em alimentos , p. 94


2.8 A IMPORTÂNCIA DA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ÁGUA (Aa), p. 98

3 METODOLOGIA, p. 105

3.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS, p. 105

3.2 MATERIAL E MÉTODOS, p. 105

3.2.1 Material , p. 105

3.2.2 Métodos , p. 106

3.2.2.1 Bacteriologia, p. 106

3.2.2.2 Preparo das amostras, p. 106

3.2.2.3 Enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli,

contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, contagem Clostridium spp.

sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens, p. 107

3.2.2.3.1 Enumeração de coliformes a 35ºC e a 45ºC – Método 1, p. 108

3.2.2.3.2 Enumeração de coliformes totais e Escherichia coli – Método 2 (FRANCO;

MANTILLA, 2004), p. 109

3.2.2.3.3 Contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, p. 110

3.2.2.3.4 Contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium

perfringens, p. 112

3.2.2.4 Pesquisa de Salmonella spp., p. 114

3.2.2.5 Determinação de atividade de água (Aa) e pH, p. 120

3.2.2.5.1 Determinação do pH, p. 120

3.2.2.5.2 Determinação da Aa, p. 120

3.3 ANÁLISE ESTATISTICA DOS RESULTADOS, p. 120

4 RESULTADOS , p. 122 5 DISCUSSÃO, p. 146 6 CONCLUSÕES, p. 166 7 SUGESTÕES, p. 167 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS , p. 168 9 APÊNDICES, p. 180

9.1 PERFIL BACTEROLÓGICO DAS AMOSTRAS ANALISADAS, p. 180

9.2 RESULTADOS DAS ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS, p. 185

9.3 FOTOGRAFIAS, p. 191

1 INTRODUÇÃO

O estilo de vida dos consumidores tem mudado muito nos últimos anos, onde

a tendência acentua-se para o consumo de alimentos mais saudáveis e de preparo

fácil e rápido. As indústrias de maneira geral acompanham essas mudanças

ofertando, cada vez mais, diferentes produtos onde as salsichas de carne avícola e

bovina merecem destaque pela grande aceitabilidade.

Os produtos cárneos de salsicharia ocupam posição de destaque nas

indústrias alimentícias e, em seu conjunto, destacam-se nas estatísticas brasileiras,

pois dados não oficiais apontam uma produção em torno de 1,2 milhões de

toneladas/ano. Estes produtos apresentam um amplo consumo popular, com

tendência a um contínuo crescimento, são atrativos para o seu consumo a grande

diversificação de produtos tradicionais e o lançamento freqüente de produtos novos

com rotulagens atrativas. A difusão e ainda favorecida pela possibilidade de

fracionamento em pesos menores (FORTUNA; FRANCO, 2005).

As salsichas são bastante consumidas principalmente em virtude do seu

baixo custo e curto tempo de preparo. Contudo, os microrganismos deteriorantes e

patogênicos em produtos derivados de carnes de aves e bovina possuem grande

significado para a saúde coletiva. A contaminação bacteriana destes alimentos é

indesejável mas praticamente inevitável, pois dependem da carga microbiana inicial

presentes nas carcaças usadas como matéria-prima, das condições de higiene na

manipulação e do tempo e temperatura de processamento e estocagem. Desta

forma, a produção de embutidos com padrões de qualidade satisfatórios requer

diversos fatores, sobretudo a observância daqueles relacionados à qualidade

sanitária da matéria-prima, às condições de higiene dos estabelecimentos e à

tecnologia utilizada na sua fabricação pois, a industrialização consiste na

24

transformação das carnes em produtos alimentícios, realizando integralmente um

ciclo que tem seu início na produção de carnes com qualidade.

A composição química, peculiar de cada produto cárneo, aliada à diversidade

de processamento e condições de embalagem irão determinar a microbiota capaz

de proliferar no produto e definir o maior ou menor risco da presença e crescimento

de bactérias patogênicas. Assim, se o produto cárneo for preparado e conservado

em condições sanitárias inadequadas, ou elaborado a partir de carne fresca obtida e

conservada de forma insatisfatória, do ponto de vista higiênico, pode apresentar

contagens altas de microrganismos, acarretando problemas na qualidade do produto

e de segurança à saúde do consumidor (CARDONHA; FERREIRA, 2003).

As enfermidades bacterianas transmitidas por alimentos são muito

prevalentes no Brasil e no mundo, podendo ocorrer sob a forma de surto ou

individualmente. A contaminação bacteriana de alimentos representa sério problema

de segurança alimentar, sendo responsável por mais de 90% das ocorrências de

Enfermidades Transmitidas por Alimentos (ETA), que constituem um grupo de

doenças nas quais fica implícito que o alimento contaminado é o mais importante

veículo do agente patogênico.

Além disto, sabe-se que apenas um pequeno percentual das ocorrências

chega ao conhecimento das instituições que investigam essas doenças, o que

prejudica a qualidade da informação epidemiológica, pois infelizmente, no Brasil, não

possuímos bases estatísticas de casos de doenças alimentares. Portanto, para se

ter uma idéia dos agentes mais freqüentes envolvidos em surtos de ETA é

necessário recorrer às estatísticas de países que possuem registros

epidemiológicos. Em países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de alimentos

é considerado aparentemente seguro do ponto de vista de higiene e saúde pública,

a ocorrência de doenças desta natureza é também significante e vem aumentando,

apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e controle de alimentos

(PAVIA; BORGES; PANETTA, 2000).

Nos Estados Unidos da América do Norte, o número de casos de intoxicação

alimentar oscila de 6,5 a 80 milhões/ano, sendo que desse total somente 21% são

ocasionados por alimentos de preparação caseira. Segundo a “Food and Drug

Administration (FDA)”, as despesas com doenças alimentares varia de 7,7 a 23

bilhões de doláres/ano. Esses valores justificam a tomada de medidas preventivas e

corretivas, onde a prática do sistema de Análise de Perigos e Pontos de Críticos de

25

Controle (APPCC) desempenha um papel importante na garantia da qualidade e

sanidade do alimento e consequente redução do número de doenças de origem

alimentar. A ocorrência dessas doenças está associada a uma sucessão de eventos

que permitem a contaminação, multiplicação ou sobrevivência do agente no

alimento, bem como a ingestão do microrganismo ou seus metabólitos por indivíduo

suscetível (LOVATTI, 2003; PINTO; BERGMANN, 2003).

A partir da análise microbiológica é possível estimar a vida comercial do

produto, assim como pela pesquisa de microrganismos patogênicos ou indicadores

da qualidade higiênico-sanitária do produto pode-se verificar a existência ou não de

risco à saúde do consumidor. Baseando-se nesses fatos visando a proteção da

saúde coletiva, a legislação nacional e a de diferentes países estabelecem critérios e

limites microbiológicos, para diversos tipos de alimentos, buscando ao máximo uma

uniformização das análises microbiológicas.

O estudo do perfil bacteriológico é de extrema importância do ponto de vista

de saúde pública, pois registros indicam que mais de 74% dos incidentes de ETA em

que o veículo alimentar é estabelecido, pratos a base de carne bovina ou de frango

são os incriminados (HOBBS; ROBERTS, 1998). Por esta razão um dos objetivos

deste trabalho foi avaliar o perfil bacteriológico de salsichas de carne bovina e de

frango obtidas no comércio varejista nos municípios do Rio de Janeiro e Niterói – RJ

frente à presença potencial de patógenos. Nesse estudo também pretendeu-se

avaliar a interrelação entre os valores de atividade de água e pH das amostras

analisadas comparando-as com os descritos na literatura e desta forma constatar

possíveis variações na ecologia bacteriana.

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 EMBUTIDOS

Os embutidos são produtos de grande aceitação no mercado consumidor e

representam uma forma saudável e saborosa de ingestão de proteína animal. São

assim chamados os produtos preparados de massa de carne crua, cozida ou

defumada, embutida ou ensacada em tripas naturais ou artificiais. De modo geral, os

embutidos apresentam uma durabilidade bem maior que a matéria-prima in natura,

podendo alguns deles manterem-se, até mesmo, fora de refrigeração por longo

tempo, sem se deteriorar (CALIL et al., 1990).

A formulação dos produtos embutidos precisa ser aprovada pelos órgãos

responsáveis, mas é possível constatar que muitos desses alimentos não

apresentam boa qualidade, em virtude da utilização de matérias-primas de qualidade

inferior, na maioria das vezes. Além disso as embalagens são elementos de grande

importância na conservação de embutidos. As de plástico, embaladas a vácuo,

representam um avanço tecnológico considerável, constituindo uma barreira física

para a contaminação e impedindo a proliferação bacteriana (CALIL; GALANTE,

1998). As embalagens previnem, deste modo, a ocorrência de ETA, pois de acordo

com Silla e Simonsen (1985) as embalagens a vácuo são muito utilizadas em

produtos cárneos cozidos devido a baixa concentração de oxigênio nessa atmosfera,

que atua aumentando a vida de prateleira destes produtos, auxiliado pela

refrigeração a temperaturas entre 4ºC e 9ºC. Os embutidos comercializados a granel

podem ter a sua durabilidade diminuída em função do tipo de embalagem, e

aumentando o risco de contaminação e deterioração, durante as várias fases de

distribuição e comercialização.

27

A conservação dos embutidos deve-se a fatores físicos e químicos

associados, como o uso do calor e do frio, bem como a utilização de aditivos

químicos que, através de reações apropriadas, mantém o produto com

características de aceitabilidade, dentro das exigências comerciais do mercado.

Outro fator de significativa importância é a atividade metabólica da microbiota

presente, principalmente bactérias ácido-lácticas, que ao produzirem ácidos em

concentrações moderadas e bacteriocinas funcionam como meio eficiente para

melhorar a conservação (DROSINOS et al., 2005).

Atualmente, vários recursos têm sido empregados na conservação de

alimentos. Dessa maneira os métodos de conservação possuem como objetivos

principais: o aumento do prazo de validade dos alimentos e a melhoria da qualidade

microbiológica e sanitária dos mesmos; além de promover a obtenção de novos

produtos com características sensoriais diferenciadas (ADAMS; MOSS, 1997;

PRADO et al., 2000).

De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade da

Salsicha (BRASIL, 2000a), entende-se por salsicha o produto cárneo industrializado,

obtido da emulsão de carne de uma ou mais espécies de animais de açougue,

adicionado de ingredientes, embutido em envoltório natural, ou artificial ou por

processo de extrusão, e submetido a um processo térmico adequado.

A salsicha tipo “hot dog” é definida como um produto de salsicharia embutido

de massa cozida a seco. Os produtos de salsicharia são genericamente definidos

como produtos cárneos picados, cominuídos ou migados em variados graus. São

constituídos por carnes de diversas espécies e/ou sangue, vísceras e outros tecidos

animais aprovados para consumo. Podem ser curados ou não, embutidos ou não;

quando embutidos, utilizam-se envoltórios naturais ou artificiais aprovados pela

legislação competente (PARDI et al., 2001).

2.1.1 Principais alterações e defeitos nos embutido s de massa cozida a seco O Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem

Animal (RIISPOA), em seu artigo 422, cita: “Devem ser considerados alterados e

impróprios para o consumo: (1) quando a superfície é úmida, pegajosa, exsudando

líquido; (2) quando à palpação se verifiquem partes ou áreas flácidas ou

28

consistência anormal; (3) quando há indício de fermentação pútrida; (4) quando a

massa apresenta manchas esverdeadas ou pardacentas ou coloração sem

uniformidade; (5) quando a gordura está rançosa; (6) quando o envoltório está

perfurado por parasitos que atingiram também a massa; (7) nos casos de odor e

sabor estranhos, anormais; (8) quando se constatem germes patogênicos; e (9)

quando manipulados em más condições de higiene, traduzidas pela presença de E.

coli típica” (BRASIL, 1997).

De acordo com Frazier e Westhoff (1993), nos embutidos os microrganismos

que os alteram podem crescer sobre a superfície da tripa, entre a tripa e a carne, ou

no seu interior. Se a superfície externa da tripa dos embutidos estiver úmida podem

crescer os micrococos e as leveduras formando uma capa mucilaginosa, como

aparece com freqüência nas salsichas tipo “Frankfurt” que se umedecem ao serem

extraídas do frio e mantidas a temperaturas mais elevadas. Se os embutidos

apresentarem um teor de umidade menor, os mofos podem produzir uma película

sobre sua superfície e modificar sua cor. A multiplicação dos microrganismos entre a

tripa e a carne é favorecida pelo acúmulo de umidade nesta parte durante a cocção,

no caso da tripa ser permeável a água. Quando são usadas duas tripas, a interna

pode se umedecer antes de colocar a segunda, de modo que a água fica

armazenada entre ambas. A permeabilidade da tripa interna aos nutrientes solúveis

favorece a multiplicação das bactérias. Várias espécies de bactérias são capazes de

se multiplicar no interior dos embutidos durante períodos de armazenamentos de

longa duração ou armazenamento a temperaturas acima de 10,5ºC. O

desaparecimento da cor vermelha dos embutidos para a cor acinzentada é atribuído

ao oxigênio e à luz, e é possível que seja acelerado pela atividade de certas

bactérias. Para explicar a formação dos chamados anéis do frio tem sido implicado

várias causas, como por exemplo, a oxidação, a produção por parte de bactérias de

ácidos orgânicos ou de substâncias redutoras, o excesso de água e a cocção

insuficiente.

Segundo Pardi et al. (2001), os principais defeitos e alterações de embutidos

de massa cozida a seco são os seguintes:

a) Defeitos de aspecto: defumação irregular, adição excessiva de água,

enchimento incompleto do embutido, armazenagem em local muito úmido e

quente. A alteração é quase sempre causada por Micrococcus spp. e

29

Streptococcus spp., mas podem também agir como coadjuvantes diversas

espécies de leveduras e germes psicrófilos Gram-negativos dos gêneros

Pseudomonas spp. e Achromobacter spp.;

b) Defeitos de liga e corte: temperatura muito baixa ocasiona uma emulsão

defeituosa da gordura e quando a temperatura é muito elevada pode causar a

desnaturação das proteínas;

c) Defeitos de cor: cor esverdeada devido a ação de Lactobacillus spp.

produtores de peróxidos ou de outras bactérias. Também devido ao emprego

insuficiente de nitrito ou uso excessivo de sal comum;

d) Acidificação: proliferação de bactérias acidificantes, como Micrococcus spp.,

Lactobacillus spp. etc;

e) Putrefação: a massa torna-se mole, desfeita e apresenta aspecto cinza ou

branco-cinza, devido principalmente a germes esporógenos aeróbios,

bactérias Gram-negativas como o Bacillus spp., Proteus spp. ou ainda

microrganismos esporógenos anaeróbios.

O esverdeamento dos embutidos pode surgir como um anel verde no

invólucro, como um centro verde, ou como uma zona superficial de cor verde. A

causa do esverdeamento provavelmente seja a produção de peróxido de hidrogênio,

pelas espécies heterofermentativas de Lactobacillus spp., e pelas espécies de

Leuconostoc spp. ou por outras bactérias catalase negativa. O pH ligeiramente ácido

e a presença de pequenas quantidades de oxigênio favorecem o esverdeamento

dos embutidos (TOMPKIN; MCNAMARA; ACUFF, 2001).

O anel verde abaixo do invólucro dos embutidos de grande tamanho, ou o

centro verde dos de pequeno tamanho, aparece entre 12 e 36 horas após seu

tratamento, incluídos aqueles que são conservados sob refrigeração. Antes de

proceder a defumação e a cocção do embutido ocorre o crescimento bacteriano e a

produção de peróxidos estáveis. Estes seguem produzindo o esverdeamento

mesmo após de serem submetidos aos tratamentos citados. Os centros verdes nos

embutidos de grande calibre, como na mortadela bolonhesa, só aparecem

transcorridos quatro ou mais dias depois de terem sido elaborados e entre uma e 12

horas depois de cortados em rodelas, devido ao crescimento de um elevado número

de bactérias causadoras deste tipo de alteração, como conseqüência do tratamento

térmico ou da refrigeração insuficientes. O esverdeamento da superfície de corte dos

30

embutidos indica que estão contaminados e com o desenvolvimento e multiplicação

de bactérias halotolerantes, produtoras de peróxido (provavelmente bactérias

lácticas), que são capazes de crescer a temperaturas baixas. O esverdeamento é

acompanhado da formação de capa mucilaginosa na superfície do embutido, sendo

importante salientar que esta alteração pode ser transmitida de um embutido a outro

(FRAZIER; WESTHOFF,1993).

2.2 PADRÃO MICROBIOLÓGICO

As técnicas empregadas na fabricação de embutidos tornaram-se cada vez

mais sofisticadas e os cuidados higiênicos redobrados, principalmente nas indústrias

que visam a boa qualidade final na produção. Contudo, a grande variedade de

ingredientes usados nesses produtos pode influir na carga microbiana do produto

final, pois tem sido demonstrado que a contaminação dos embutidos pode também

estar relacionada com condimentos contaminados utilizados em seu preparo (CALIL

et al., 1990; OLIVEIRA, 1983; OLIVEIRA; FRANCO; CARVALHO, 1992; OLIVEIRA;

FRANCO; CARVALHO, 1994). Por esta razão a fiscalização dos ingredientes, das

condições de preparo, da estocagem e transporte é de extrema importância na

garantia da qualidade, segurança, salubridade e sanidade do alimento em todos os

estágios de sua elaboração até a mesa do consumidor. Apesar disto, muitos

produtos são vendidos sem preencher os padrões microbiológicos mínimos

aceitáveis, tendo como uma das causas um número considerável de fábricas

clandestinas (CALIL et al., 1990; CHAVES et al., 2000; MILANI et al., 2003).

Compete às indústrias a produção de alimentos dentro dos padrões de

qualidade e condições previstas na legislação específica, cabendo aos serviços de

inspeção a observância no atendimento a todos os preceitos técnicos e higiênico-

sanitários, que ocupando o vazio da falta de controle de qualidade, atua visando

prevenir a ocorrência de problemas que possam afetar a saúde coletiva. Do mesmo

modo, o serviço de vigilância sanitária deve atuar no comércio, de forma a assegurar

as condições originais do produto no momento de sua comercialização (CHAVES et

al., 2000).

De acordo com essa visão, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) no uso da atribuição que lhe confere o artigo 11, inciso IV do regulamento

31

aprovado pelo Decreto 3029, de 16 de abril de 1999, aprovou a Resolução RDC nº

12, de 2 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001), onde são estabelecidos os limites de

tolerância quanto aos índices microbiológicos para diferentes classes de alimentos,

considerando a necessidade de constante aperfeiçoamento das ações de controle

sanitário na área de alimentos, visando a proteção à saúde da população e a

regulamentação dos padrões microbiológicos para produtos alimentícios;

considerando a definição de critérios e padrões microbiológicos para alimentos,

indispensáveis para a avaliação das Boas Práticas de Fabricação de Alimentos e

Prestação de Serviços (BPF), da aplicação do Sistema de Análise de Perigos e

Pontos Críticos de Controle (APPCC) e da qualidade microbiológica dos produtos

alimentícios, incluindo a elucidação de Enfermidade Transmitida por Alimentos

(ETA); e considerando a importância de compatibilizar a legislação nacional com

regulamentos harmonizados no Mercosul. A salsicha, não havendo especificação

quanto ao seu tipo, enquadra-se em produtos cárneos cozidos ou não, embutidos ou

não e produtos a base de sangue e derivados processados. Seus limites são:

• Coliformes a 45ºC: 103/g

• Staphylococcus spp. coagulase positiva: 3x103/g

• Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC : 5x102/g

• Salmonella spp.: Ausência em 25g

32

____________ 1ICMSFa. Meats and meat products. In: Microbial ecology foods. ICMSF, New York: Academic Press, 1980. p. 333-409. 2 v. ICMSFb. Poultry and poultry meat products. In: Microbial ecology foods. ICMSF, New York: Academic Press, 1980. p.410-458. 2 v.

2.3 A IMPORTÂNCIA DA AVALIAÇÃO BACTERIOLÓGICA

Os produtos derivados de carne bovina e de aves são obtidos a partir de

animais de sangue quente. Apresentam microbiota bastante heterogênea composta

por bactérias mesófilas e psicotróficas próprias do animal de origem,

assim como do meio ambiente em que foram criados. É importante ressaltar ainda

que por ocasião do processamento tecnológico das carnes algumas outras espécies

bacterianas podem ser introduzidas nas carnes pela manipulação, utensílios e

equipamentos (ICMSF, 1980a; ICMSF, 1980b apud1 TOMPKIN; MCNAMARA;

ACUFF, 2001). A fabricação de produtos de origem animal, notadamente os

embutidos, requer o emprego de técnicas que envolvem desde a simples

manipulação do alimento até a utilização de sofisticado maquinário. Na verdade,

para obtenção de um produto de boa qualidade deve-se aplicar um grau de

tecnologia que contemple, não só a adequação das instalações e dos equipamentos,

mas, sobretudo, os preceitos de sanidade das matérias-primas cárneas, pois a

qualidade da matéria-prima utilizada para preparação dos embutidos, notadamente

dos crus, tem significativa importância, onde as contaminações de superfície ou

originárias de animais doentes representam, através dos embutidos, um risco

potencial à saúde coletiva (CALIL et al., 1990).

Os microrganismos e/ou seus produtos metabólicos, em determinadas

quantidades, são indicadores da qualidade do alimento e estão diretamente

relacionados com o prazo de vida comercial dos mesmos, o que nos permitir fazer

avaliação da qualidade e previsão do prazo de vida comercial dos alimentos

cumprindo os seguintes critérios: devem estar presentes e ser detectados em todos

os alimentos cuja qualidade ou falta da mesma deve se avaliar; sua multiplicação e

seu número devem ter uma relação direta negativa com a qualidade do alimento;

devem ser detectados e contados facilmente e diferenciados dos outros

microrganismos; ser contados numa jornada de trabalho; seu crescimento não deve

ser obstaculizado por outros componentes da microbiota do alimento; terem

associação constante com o patógeno que deve indicar; terem uma taxa de morte

que ao menos seja paralela ao do patogênico; e que resistam por um tempo maior

33

que do patogênico de interesse; não existirem em alimentos que estão isentos do

patógeno, exceto em quantidade mínimas (JAY, 1994).

Segundo Franco e Landgraf (1996), microrganismos indicadores são grupos

ou espécies de microrganismos que, quando presentes em um alimento, podem

fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, sobre a

provável presença de patógenos, sobre a deterioração potencial do alimento, ou

indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, a produção ou o

armazenamento.

A pesquisa de coliformes a 45ºC nos alimentos fornece, com maior segurança

que a de coliformes totais, informações sobre as condições higiênicas do produto e

melhor indicação eventual da presença de enteropatógenos. Em alimentos

processados, a presença de um número considerável de coliformes indica:

processamento inadequado e/ou recontaminação pós-processamento, sendo as

causas mais freqüentes aquelas provenientes da matéria-prima de baixa qualidade,

equipamentos/utensílios sujos ou manipulação sem cuidados de higiene; e

proliferação microbiana que pode permitir a multiplicação de microrganismos

patogênicos e toxigênicos. Outros indicadores como os Staphylococcus spp., em

número elevado no alimento, são uma indicação de perigo potencial à saúde pública

devido à enterotoxina estafilocócica, bem como à sanificação questionável,

principalmente quando o processo de produção envolve manipulação do alimento; e

os Clostridium spp., que são formadores de esporos, podem permanecer nos

alimentos quando a maioria dos microrganismos entéricos for destruída. Além disso,

ainda que o Clostridium perfringens e o C. botulinum são importantes patógenos

causadores de toxinfecções de origem alimentar (FRANCO; LANDGRAF, 1996;

FERNANDES; MIRANDA, 2001; OLIVEIRA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2003).

As carnes bovinas, suínas e de aves são as matérias-primas mais

comumente empregadas na produção de embutidos cárneos cozidos e curados, e

nas suas várias formas são os alimentos mais comumente implicados como

responsáveis pelas notificações de surtos de toxinfecções alimentares gerais e

familiares, embora estes alimentos, em virtude da sua tecnologia de produção,

sejam raramente responsáveis por surtos, porém a manipulação pode introduzir

patógenos tornando os mesmos veículos de ETA (HOBBS; ROBERTS, 1998;

HOFFMANN; GARCIA-CRUZ; VINTURIM, 1997; TERRA, 1998).

34

O uso da carne de aves para produção de carnes processadas tem

aumentado e se tornado muito importante, onde carnes de frango e de peru são as

mais usadas em virtude da ampla oferta no mercado e baixo custo (JACKSON,

2000; KUBBEROD et al., 2002). A carne mecanicamente separada de aves é usada

com freqüência como matéria-prima na produção de salsichas. As salsichas durante

o processo de obtenção sofrem tratamento térmico a temperatura de 72ºC. Após o

cozimento, a população de bactérias ácido-lácticas presente na microbiota normal

do produto desenvolve um mecanismo de proteção contra o crescimento de

bactérias Gram negativas e saprofíticas. Contudo, a contaminação com patógenos

como Salmonella spp., em carne de aves, pode ser um problema na preservação

das salsichas. Pois, algumas salmonelas podem ser viáveis a temperatura de

refrigeração e as bactérias ácido lácticas presentes não prevenirem a contaminação

por salmonelas (DEUMIER; COLLIGNAN, 2003; KIM; FRANK; CRAVEN, 1996;

KOTZEKYDOU; BLOUKAS, 1998).

No momento em que carnes bovina e de aves são cozidas e

subsequentemente refrigeradas de forma a prevenir a deterioração, as bactérias

normalmente presentes nestes tecidos são em grande parte reduzidas, ficando

alguns esporos e, ocasionalmente, um pequeno número de bactérias termodúricas.

Por esta razão, o ambiente de processamento após cozimento é climatizado e uma

baixa recontaminação com bactérias psicotróficas normalmente ocorre. Estas

ultimamente são a causa de deterioração e consequente redução do prazo de

validade (ALMEIDA FILHO; SIGARINI, 2002; GUIMARÃES; SOUSA; PENA, 2004;

MARQUES et al., 2003; TOMPKIN; MCNAMARA; ACUFF, 2001).

A microbiota constituída de microrganismos mesófilos, psicotróficos,

coliformes, Escherichia coli e Staphylococcus aureus tem sido utilizada para avaliar

a qualidade microbiológica, as condições sanitárias durante o processamento e a

preservação da qualidade do produto. A presença de coliformes em produtos

cozidos indica contaminação pós-processamento, contudo deve ser ressaltado que a

microbiota natural de carnes de aves e bovina pode incluir coliformes com

capacidade de crescimento lento em temperaturas de refrigeração. Este é um dos

fatores que tornam a contagem de coliformes um indicador efetivo da qualidade de

refrigeração de produtos de carnes bovina e de aves (TOMPKIN; MCNAMARA;

ACUFF, 2001).

35

De acordo com Uyttendaele, Vankeirsbilck e Debevere (2001), foi constatada

em carnes e seus derivados comercializados na América do Norte, a presença de E.

coli O157:H7 em 2 a 4% de produtos cárneos cominuídos, 1,5% de carne suína,

1,5% de carne de aves e 2% de carne de ovinos. A presença de E. coli O157:H7 em

embutidos pode ser justificada pela ocorrência da contaminação cruzada durante o

processo de manufatura, pois este patógeno resiste ao armazenamento e

refrigeração (LAHTI et al, 2001).

Álvarez-Astorga et al. (2002), analisando amostras de frangos e derivados

comercializados no varejo, na Espanha, verificaram um nível elevado de mesófilos,

em torno de 60% das amostras (maioria embutidos) e consideraram amostras de

qualidade inaceitável. De acordo com estes resultados foi sugerida contaminação

cruzada e/ou temperatura abusiva durante o processamento ou exposição do

produto, uma vez que instalações para corte/moedura, se inadequadamente

sanificadas, incluem carga microbiana ao produto. Além do processo de moagem

levar ao aumento da superfície o que favorece o crescimento bacteriano. Uma outra

explicação para alta contagem bacteriana em embutidos pode ser a elaboração

destes produtos com matéria prima de baixa qualidade microbiológica. A presença

de Salmonella spp. em alimentos, por sua vez, torna-os impróprios para o consumo,

uma vez que esse é reconhecidamente um microrganismo implicado em surtos de

infecção alimentar. É importante salientar que o processamento tecnológico dos

produtos cárneos cozidos normalmente destrói Salmonella spp. e outros patógenos

não esporuláveis. Contaminações após cozimento podem ocorrer e, em

temperaturas favoráveis, o desenvolvimento do microrganismo em questão

(SALVATORI; BESSA; ITAPEMA, 2003).

Em relação aos alimentos, o grupo dos Staphylococcus spp. coagulase

positiva são os mais importantes, pelas seguintes razões: primeiro, porque sua

presença em alimentos processados pode indicar deficiência de processamento ou

condições higiênicas inadequadas do processo; segundo, porque suas

enterotoxinas, uma vez presente no alimento, poderão causar intoxicação alimentar.

Na literatura, são descritos inúmeros surtos de intoxicação alimentar causados pela

ingestão de alimentos contendo enterotoxinas estafilocócicas pré formadas,

constituindo um risco à saúde coletiva (SILVA; GANDRA, 2004).

36

2.4 COLIFORMES A 35ºC, COLIFORMES A 45ºC E Escherichia coli Os gêneros e espécies que compõem este grupo pertencem à família

Enterobacteriaceae, que se caracteriza por incluir microrganismos Gram negativos,

anaeróbicos facultativos, fermentadores da glicose produzindo ácido, oxidase

negativa, geralmente catalase positiva e redutores de nitrato, móveis por flagelos

peritríquios ou imóveis. Os gêneros desta família mais comumente encontrados em

alimentos são: Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella,

Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella e Yersinia. Os microrganismos

do grupo coliformes são definidos com base em reações bioquímicas e não relações

genéticas, sendo importante salientar que o termo coliformes não possui validade

taxonômica (BRENNER, 1984; KORNACKI; JOHNSON, 2001; TRABULSI; TOLEDO,

1998).

Os coliformes a 35ºC compreendem microrganismos capazes de fermentar a

lactose com produção de ácido e gás, em 24 a 48 horas a 35ºC. O grupo inclui

diversas espécies, dentre as quais se encontram bactérias gastrentéricas próprias

do homem e de outros animais de sangue quente, como também bactérias não

entéricas, como por exemplo Serratia spp. e Aeromonas spp., e por esta razão sua

numeração é menos representativa da indicação de contaminação fecal que a

enumeração de coliformes termotolerantes e E. coli. Contudo, presença em

alimentos é uma indicação útil de contaminação em virtude da prática de condições

de higiene inadequadas (BRENNER, 1984).

Os coliformes a 45ºC a princípio eram denominados fecais com intuito de

selecionar apenas os coliformes originários do trato gastrintestinal, porém diversos

estudiosos consideram o termo termotolerantes mais apropriado uma vez que

algumas espécies são capazes de fermentar a lactose produzindo ácido e gás em

48 horas a 44,5-45,5ºC não sendo necessariamente de origem fecal (KORNACKI;

JOHNSON, 2001; SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997).

De maneira geral, os coliformes a 45ºC produzem ácido e gás em caldo EC,

em temperaturas entre 44,5 e 45,5ºC. Um teste para coliformes a 45ºC é

essencialmente um teste para E. coli típicas, embora algumas espécies de

Citrobacter spp., Klebsiella spp. e Enterobacter spp. se adequem a esta definição

(JAY, 2005; KORNACKI; JOHNSON, 2001). Vale ressaltar que dentre as bactérias

de habitat originalmente fecal, a E. coli é a mais conhecida e a mais facilmente

37

diferenciada dos membros não entéricos. Embora também possa ser introduzida nos

alimentos a partir de fontes não fecais é o melhor indicador de contaminação fecal

conhecido até o momento, principalmente, pela sua relação com a presença de

outros enteropatógenos, como por exemplo Salmonella spp. (JAY, 2005).

2.4.1 Taxonomia e características da Escherichia coli O gênero Escherichia pertence a família Enterobacteriaceae, compreende as

espécies E. coli, E. fergusonii, E. hermanii, E. vulneris, E. blattae. A espécie

denominada E. coli é um bastonete Gram negativo, não esporulado, oxidase

negativa, móvel por flagelos peritríquios ou não móvel, anaeróbia facultativa capaz

de fermentar glicose em ácido (lático, acético e fórmico que é hidrolisado a

hidrogênio e dióxido de carbono) e gás em temperaturas compreendidas entre 44,5

e 45,5ºC. Produz β-galactosidase e indol, mas não forma sulfito de hidrogênio, não

hidrolisa a uréia, não forma acetil metil carbinol ou acetoína, embora alguns autores

relatem cepas H2S positivas (BRENNER, 1984; TRABULSI; TOLEDO, 1998;

VARNAN; EVANS, 1996).

Esta espécie pertence ao grupo de coliformes a 45ºC, sendo descrita pela

primeira vez por Escheric em 1885 ao tentar isolar o agente etiológico da cólera,

sendo inicialmente denominada Bacterium coli commune devido sua presença em

todos os casos estudados. A partir de então, diversos estudos foram realizados onde

foi verificado que este microrganismo é mais facilmente isolado e identificado que os

demais patógenos e, por esta razão tornou-se o mais efetivo indicador das

condições de higiene e sanidade do produto analisado, torna-se desejável identificar

a ocorrência de E. coli na população analisada e a partir de provas bioquímica

denominadas IMViC (Indol, Vermelho de metila, Voges Proskauer e Citrato) pode-se

indicar a presença de E.coli através de reações (+,+, -, -) para o tipo I ou típica e (-,

+, -, -) para o tipo II ou atípica. Entretanto, ressalta-se que este perfil pode ser

encontrado em outras cepas do gênero. É importante ainda ressaltar que nem todas

as cepas enteropatogênicas e as enterohemorrágicas crescem a 44,5ºC na

formulação convencional do caldo EC, porém, se reduzida a concentração de sais

biliares de 0,15% para 0,112%, o crescimento ocorre (JAY, 2005).

38

____________ 2DRASAR, B. S.; HILL, M. J. The distribuition of bacterial flora in the intestine. In: DRASAR, B. S.; HILL, M. J. Human intestinal flora. London: Academic Press, 1974. p. 36-43.

A E. coli é a espécie comensal predominante na microbiota anaeróbica

facultativa do trato intestinal dos humanos e dos animais de sangue quente

(DRASAR; HILL, 1974 apud2 FRANCO, 2002).

O habitat primário da E. coli é o trato intestinal de animais de sangue quente,

embora este microrganismo possa estar presente no ar, na poeira, nas mãos e

contaminar . Sua presença em alimentos além de indicar contaminação fecal ou más

condições de higiene também indica a possível presença de outros enteropatógenos

(KORNACKI; JOHNSON, 2001; JAY, 2005; SIRIKEN et al., 2005).

A E. coli, como a maioria das enterobactérias, é um microrganismo mesófilo

típico capaz de se desenvolver entre 7 e 46ºC, sendo 37ºC sua temperatura ótima

para crescimento e produção de enterotoxinas, embora algumas cepas possam

multiplicar-se a temperaturas de refrigeração (em torno de 4ºC). São destruídas a

60ºC em poucos segundos, mas algumas cepas resistem por vários meses a

temperaturas de refrigeração e até mesmo de congelamento (GERMANO;

GERMANO, 2001).

A habilidade para distinguir cepas de E. coli sorologicamente é importante em

pesquisa, o que permite separar os diversos sorotipos envolvidos em síndromes

gastrentéricas. A sorologia é baseada em diferentes antígenos encontrados na

estrutura da superfície bacteriana, onde os três principais antígenos são: os

antígenos somáticos “O” termoestáveis, relacionados com polissacarídeos da

membrana externa; antígenos flagelares “H” termolábeis, relacionados com

proteínas dos flagelos; e antígenos capsulares “K” termoestáveis, relacionados com

polissacarídeos capsulares (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Segundo Trabulsi e Toledo (1998), em torno de 60, dos 171 sorogrupos “O”

de E. coli, são os mais freqüentemente encontrados em associação com humanos.

Dos 60, aproximadamente 25 sorogrupos fazem parte da flora normal dos intestinos,

sendo que a maioria corresponde aos sorogrupos associados à infecção urinária,

meningite e bacteremia. Os outros 35 sorogrupos são agentes de infecção intestinal,

correspondendo a quatro categorias de E. coli enteropatogênica denominadas: E.

coli enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli

enteroinvasora (EIEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC). Jay (2005) relata que

são reconhecidos cerca de 200 sorotipos para E. coli. Como as proteínas do flagelo

são menos heterogêneas do que as cadeias laterais de carboidratos que compõem

39

os grupos “O”, existem consideravelmente menos grupos antigênicos “H”

(aproximadamente 30).

2.4.2 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or E. coli Apesar da E. coli ter sido considerada um patógeno oportunista, o interesse

das indústrias de alimentos sobre o microrganismo inicialmente era restrito ao

aspecto de microrganismo indicador. Entretanto, desde 1990 a E. coli é reconhecida

como um patógeno específico tanto de ambiente intestinal quanto extraintestinal

(VARNAN; EVANS, 1996). Algumas cepas de E. coli, têm habilidade de causar

distúrbio gastrintestinal, urinário e/ou ao sistema nervoso central. Cepas diarréicas

de E. coli podem ser divididas em diferentes categorias patogênicas (KORNACKI;

JOHNSON, 2001).

Com base nas características das doenças, no efeito em certas culturas de

células e nos grupos sorológicos, são reconhecidos cinco grupos de E. coli

virulentos: E. coli enteroagregativas (EaggEC); E. coli enteropatogênicas (EPEC); E.

coli enteroinvasivas (EIEC); E. coli enterotoxigênicas (ETEC) e E. coli

enterohemorrágicas (EHEC), que são responsáveis por cinco tipos de gastrenterites

(BUCHANAN; DOYLE, 1997; FRANCO; LANDGRAF, 1996; HOBBS; ROBERTS,

1998; TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNANS; EVANS, 1996). Existem também as

E. coli facultativamente enteropatogênicas – FEEC (FRANCO; LANDGRAF, 1996) e

as E. coli difusamente aderentes – DAEC (PARDI et al., 2001).

Entre os veículos transmissores da E. coli, além da água de bebida,

encontram-se os mais variados alimentos, destacando-se o leite e seus derivados. A

carne e seus derivados também são importantes veículos, bem como todos os

alimentos excessivamente manipulados (MAGNANI et al., 2000; PARDI et al., 2001).

De um modo geral, a gastrenterite causada pela E. coli se caracteriza por

diarréia sem sangue ou exudato inflamatório. As doses infectantes variam de acordo

com o tipo de cepa considerada, com a idade do indivíduo exposto, bem como seu

estado imune (GERMANO; GERMANO, 2001).

O mecanismo de patogenicidade depende do agente causal e da origem do

grupo das linhagens invasoras ou infecciosas ou das formadoras de enterotoxinas.

No primeiro caso dá-se uma infecção do tipo disenteria, com multiplicação das

40

bactéria no cólon. As linhagens formadoras de enterotoxinas provocam sintomas

caracterizados por diarréia aguda profunda e acentuada desidratação do indivíduo.

O período de incubação varia de 5 a 48 horas, média entre 10 e 24 horas, de acordo

com as características do agente (PARDI et al., 2001).

A EaggEC está relacionada com o grupo EPEC, mas a aderência agregativa

apresentada por essas linhagens é única. Elas exibem a capacidade de um tipo

específico de aderência a células HEp-2 conhecido como “empilhamento de tijolos”.

Algumas linhagens produzem uma enterotoxina termoestável (“ST”), a qual foi

designada “EAST1”. A característica clínica distinta das linhagens EaggEC consiste

em uma diarréia persistente com duração superior a 14 dias, especialmente em

crianças. Não está elucidado se os membros deste grupo são patógenos de origem

alimentar (HARRIGAN, 1998; JAY, 2005; MENG, FENG; DOYLE, 2001; VARNAN;

EVANS, 1996).

A EPEC associa-se a surtos de diarréia infantil e neonatal. Estas linhagens

geralmente não produzem enterotoxinas, exibem uma aderência localizada à

mucosa intestinal. Após a colonização do intestino são produzidas lesões do tipo

“ligação e desaparecimento” mediadas por plasmídeos. As EPEC causam diarréia

em crianças geralmente menores de um ano, onde a severidade dos sintomas pode

variar extremamente, desde a não detecção dos sintomas a casos severos ou letais.

Na maioria dos casos os sintomas perduram de 12 a 36 horas, onde se observa

diarréia que pode conter muco e raramente sangue. Vômitos e febre baixa

normalmente acompanham a diarréia. Os sintomas podem ser prolongados onde a

desidratação com posterior acidose e choque são as complicações mais comuns

(TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNAN; EVANS, 1996).

O reservatório das EPEC parece ser o próprio homem. Nos hospitais e

berçários a transmissão se dá por contato pessoal. Crianças com diarréia

representam a principal fonte de infecção, sendo importante ressaltar o papel das

equipes de enfermagem que podem funcionar como fonte ou veículo na transmissão

(TRABULSI; TOLEDO, 1998).

A síndrome gastrentérica por EPEC é causada a partir da ingestão de 106 a

1010 células viáveis/g de alimento. As cepas de EPEC atacam as células da mucosa

intestinal, destruindo as microvilosidades, levando ao desenvolvimento de lesões

características. Ocorre diarréia líquida que raramente se torna crônica (JAY, 1994).

41

A EIEC produz enterite tipo “shigelose”, que pode originar-se do alimento, da

água ou pelo contato pessoal. As EIEC penetram nas células epiteliais do cólon,

multiplicam-se e propagam-se nas células adjacentes. Esta predileção pelo cólon

tem como conseqüência uma diarréia volumosa, podendo ser sanguinolenta ou não.

A disenteria é rara e os membros mais susceptíveis da população são os mais

jovens, sendo mais comum em crianças com mais de dois anos, e os mais velhos. O

período de incubação é de duas a 48 horas com uma média de 18 horas (JAY, 2005;

PARDI et al., 2001; TRABULSI; TOLEDO, 1998).

Na infecção por ETEC, também conhecida como “diarréia dos viajantes”, o

contágio é geralmente realizado através da cadeia homem-alimento-homem, onde

os doentes eliminam grandes quantidades de bactérias pelas fezes contaminando

suas mãos e vestes, que se tornam veículos de contaminação. A dose infectante é

alta, em torno de 106 a 1010 células bacterianas, que também se aplica as síndromes

causadas por EIEC (FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY, 2005; PARDI et al., 2001).

Estas linhagens se ligam e colonizam o intestino delgado por meio de fatores

antigênicos de colonização fimbrial. Uma vez ligados produzem uma ou duas

enterotoxinas, “ST” e “LT” (termossensível) e por um processo mediado por

enterotoxinas causam hipersecreção de íons cloreto e água pelas células da mucosa

do intestino. Ocorre uma inibição da reabsorção do sódio ficando o intestino repleto

de fluídos. Ao contrário das EPEC, as ETEC provocam diarréia tanto em criança

quanto em adultos. As síndromes gastrentéricas são raramente acompanhadas por

febre (mais comum em crianças) e a diarréia é súbita, freqüentemente

acompanhada de vômito e dor abdominal. Pode ocorrer desidratação e resultar em

óbito se não houver o tratamento de suporte. A duração dos sintomas é de um a

dois dias, mas pode persistir e gradualmente reduzir-se com a diminuição da

severidade dos mesmos (VARNAN; EVANS, 1996).

O grupo EHEC foi designado para alocar as cepas de E. coli O157:H7 e

O26:H11. Tais cepas possuem propriedades que as diferenciam das demais E. coli,

pois não são capazes de fermentar o sorbitol, são β-glucuronidase negativos e têm

dificuldades de se multiplicar ou mesmo não se multiplicar nas temperaturas

normalmente empregadas para a pesquisa de E. coli em alimentos (FRANCO;

LANDGRAF, 1996; PARDI et al., 2001).

42

____________ 3RILEY, L. W.; REMIS, R. S.; HELGERSON, S. D.; McGEE, H. B.; WELLS, J. G.; DAVIS, B. R.; HEBERTE, R. J.; OLCOLT, H. M.; JOHNSON, L. M.; HARGRETT, N. T.; BLAKE, P. A.; COHEN, M. L. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. New England Journal of Medicine, v. 308, p. 681-685, 1983.

A E.coli O157:H7 é considerada um agente emergente de ETA e constitui um

dos maiores motivos de preocupação para as autoridades em saúde pública, sendo

responsável pela forma enterohemorrágica da infecção.

Foi identificada em surtos pela primeira vez em 1982 nos EUA, como agente

determinante de colite hemorrágica (RILEY et al., 1983 apud3 FRANCO, 2002). A

principal fonte de infecção é o consumo de produtos de origem animal que não

sofreram tratamento térmico. As EHEC afetam somente o intestino grosso e

produzem grande quantidades de toxinas similares as toxinas Shiga (verotoxina,

verocitotoxina) sendo identificadas como Stx1 e Stx2. Por motivos que ainda não

estão claros, a Stx2 parece ser mais significativa na etiologia da colite hemorrágica e

da síndrome urêmica hemolítica que a Stx1; contudo sabe-se que dois a sete por

cento das infecções por E. coli O157:H7 desenvolvem-se causando a síndrome

urêmica hemolítica (MENG; FENG; DOYLE, 2001; JAY, 2005). Ainda não se sabe ao

certo a dose infectante para o desenvolvimento da manifestação clínica. Diversos

autores relatam que a dose infectante é relativamente baixa podendo ser tão baixa

quanto 10 UFC, entretanto, Buchanan e Doyle (1997) relatam que a dose infectante

está na faixa de duas a 2000 células bacterianas.

A colite hemorrágica é caracterizada, clinicamente, por dores abdominais

severas (semelhante a apendicite) e diarréia aguda, seguida de diarréia

sanguinolenta (em um ou dois dias), com grandes quantidades de sangue nas fezes

e ausência de febre. No início da doença ocorrem vômitos e extensa distensão

abdominal. O período de incubação varia de três a oito dias , sendo mais comum de

três a quatro dias, contudo já foi registrado período de incubação de 14 dias. A

enterocolite pode evoluir gravemente para síndrome urêmica hemolítica que se

caracteriza pela tríade: anemia hemolítica, trombocitopenia e falência renal

(FRANCO; LANDGRAF, 1996; TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNAN; EVANS,

1996).

Segundo Jay (1994) a FEEC está aparentemente relacionada a surtos

esporádicos de diarréia. Porém, Meng, Feng e Doyle (2001) descrevem que

nenhuma notificação foi realizada associando tais patógenos a surtos de origem

alimentar.

43

Segundo Harrigan (1998), as cepas de DAEC não estão caracterizadas,

entretanto Meng, Feng e Doyle (2001) associam as cepas com diarréia infantil, os

dados relativos à sua patogenicidade são raros e não há surtos associados.

2.4.3 Epidemiologia A E. coli faz parte da microbiota normal do trato intestinal do homem e de

diversos animais. Incluída na família Enterobacteriaceae, onde estão alocados os

mais importantes patógenos de origem entérica. A maioria das cepas patogênicas

relacionadas aos distúrbios gastrentéricos (diarréias) e, com exceção das cepas

enterohemorrágicas, que estão relacionadas à colite hemorrágica e a síndrome

urêmica hemorrágica, são de origem humana, contudo algumas cepas ETEC

responsáveis por doenças humanas são carreadas pelos intestinos animais (MENG;

FENG; DOYLE, 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

O microrganismo é excretado em grande número pelas fezes e desta forma

contamina os cursos d’água e o meio ambiente de maneira geral, principalmente

onde a higiene é deficiente. Existem evidências que a E. coli permaneça na água

doce e estuarina por períodos menores que a Salmonella spp., sendo importante

salientar que em muitos casos a contaminação é ininterrupta. Os animais, em

especial os bovinos, parecem ser os reservatórios da E. coli O157:H7, tendo em

vista que a carne bovina foi o alimento mais associado à surtos de origem alimentar.

Contudo, existem relatos de casos de colite hemorrágica sem que tenha havido o

contato com animais. Outros animais e pássaros também são reservatórios do

sorotipo O157:H7, pois existem relatos de isolamento em frangos, suínos, ovinos e

cordeiros. (FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY, 2005; PARDI et al., 2001; VARNAN;

EVANS, 1996).

A importância da carne bovina como veículo de infecção da E. coli O157:H7

está diretamente relacionada ao fato dos bovinos serem reservatório do

microrganismo em questão. Uma série de fatores interferem na real prevalência da

E. coli O157:H7 no rebanho, como por exemplo, método de isolamento utilizado no

estudo, a região onde se encontra a população animal analisada, assim como a

dieta destes animais. Uma pesquisa realizada no Reino Unido revelou que 4% dos

“swabs” retais foram positivos para E. coli O157:H7 (JAY, 2005).

44

O isolamento de E. coli O157:H7 ocorrido em um reservatório de água não

tratada nos EUA, onde não existiam evidências de contaminação por fontes

humanas ou bovinas, levou os autores a admitirem a possibilidade de cervos

selvagens terem acesso ao reservatório (VARNAN; EVANS, 1996).

De um modo geral, esta bactéria foi isolada de 0,3 a 2,2% das amostras

fecais coletadas de bezerros e gado saudável nos EUA, Canadá, Reino Unido,

Alemanha e Espanha (DEAN-NYSTROM; BOSWORTH; CRAY JUNIOR, 1997). Em

outro estudo, Cray Junior e Moon (1995) infectaram bezerros e gado adulto e

constataram que os bezerros liberaram E. coli O157:H7 por mais tempo que o gado

adulto, o que pode ser justificado pelo fato da microbiota do rúmen dos bezerros não

estar tão bem estabelecida quanto ao do gado adulto, o microrganismo inoculado

ficou restrito ao trato gastrintestinal. Além disso, a maioria dos infectados

permaneceu clinicamente normal.

As diarréias causadas por E. coli apresentam distribuição mundial. Contudo a

real extensão da ocorrência não está dimensionada, principalmente devido a

elevada sub-notificação dos casos. Em áreas onde a diarréia é endêmica,

geralmente não é possível associar a doença com alimentos específicos. Nos casos

de diarréia infantil normalmente a água de preparo do alimento é o veículo de

transmissão. A partir de relatos de surto têm-se informações que além da água de

bebida, outros alimentos já foram identificados como veículo, com destaque para o

leite e seus derivados, a carne e seus derivados e os alimentos manipulados

(GERMANO; GERMANO, 2001; JAY, 2005).

A EPEC está associada à diarréia infantil, tanto em países desenvolvidos,

onde é isolada em surtos esporádicos e com baixa freqüência nos casos de diarréias

endêmicas, como naqueles em desenvolvimento, onde está entre os principais

enteropatógenos da diarréia infantil, em especial dos lactentes, com altos índices de

mortalidade. No Brasil, a EPEC é responsável por cerca de 30% dos casos de

diarréia aguda em crianças pobres com idade inferior a seis meses. Entre os anos

60-70 diversos surtos causado por EPEC em adultos foram registrados e os

alimentos envolvidos foram a água de bebida, derivados lácteos (queijos), pastéis de

carne e carne suína resfriada (FRANCO; LANDGRAF, 1996; VARNAN; EVANS,

1996).

A ETEC está diretamente associada a “diarréia dos viajantes”, sendo a mais

importante causa de diarréia, ocorrendo nos países em desenvolvimento,

45

principalmente em regiões onde as condições de saneamento são precárias e

consequentemente as condições de higiene são pobres. Atinge todas as faixas

etárias, principalmente aqueles indivíduos que se deslocam de regiões

desenvolvidas para regiões com problemas de saneamento. Esses surtos ocorrem

em virtude do consumo de água contaminada ou alimentos contaminados, tendo

sido relatados surtos com derivados lácteos. Contudo, em alguns casos, os

manipuladores de alimentos são mais importantes que alimentos específicos (PARDI

et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

A EIEC acomete normalmente crianças e adultos. Seu isolamento em surtos

não é freqüente. Em alguns estudos a água e outros alimentos contaminados são

apontados, envolvendo principalmente o sorogrupo O124. Existem relatos de surtos

devido o consumo de pescado (salmão) e derivado lácteo (queijo). Entretanto,

acredita-se que o veículo mais comum de transmissão seja o contato interpessoal

(FRANCO; LANDGRAF, 1996; VARNAN; EVANS,1996).

Dentre os alimentos, a carne bovina é uma das fontes potenciais de E. coli

O157:H7, pelo fato do trato intestinal dos bovinos ser o reservatório deste

microrganismo, e a síndrome causada por E. coli O157:H7 recebeu inicialmente a

denominação de “doença do hambúrguer” por ter aparecido em surto causado por

hambúrgures contaminados (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

As infecções por EHEC têm sido relacionadas epidemiologicamente com

carne moída para hambúrgueres. As primeiras evidências foram obtidas de surtos

nos estados de Oregon e Michigan, que envolveram 21 e 26 casos respectivamente.

Em Minessota um surto afetou 31 estudantes, onde o alimento incriminado foi pastel

de carne, e o subcozimento ocorreu na planta processadora (VARNAN; EVANS,

1996).

De acordo com Uyttendaele, Vankeirsbilck e Debevere (2001), o primeiro

estudo publicado sobre a prevalência de E. coli O157:H7 em carnes foi realizado por

Doyle e Shoeni (1987) que obtiveram os seguintes dados: 3,7% de 164 amostras de

carnes de gado, 1,5% de 264 amostras de carnes suínas, 1,5% de 263 amostras de

carnes de aves domésticas e 2,0% de amostras de carnes de cordeiro. Esse

autores, ao estudarem carnes e seus derivados, comercializados na América do

Norte, encontraram dados bem semelhantes, tendo obtido a presença de E. coli

O157:H7 em 2 a 4% de produtos cárneos cominuídos, 1,5% de carne suína, 1,5%

de carne de aves e 2% de carne de ovinos.

46

De um modo geral, a ocorrência de EHEC em alimentos é muito variável,

devendo-se levar em consideração as dificuldades de isolamento da mesma.

Quando são utilizadas sondas de DNA para detectar linhagens de EHEC, obtêm-se

consideravelmente mais resultados positivos (JAY, 2005).

Ao referir-se aos portadores humanos de E. coli é de suma importância a

distinção feita entre as cepas patogênicas, reconhecidas como enteropatógenos,

das não patogênicas que estão presentes no intestino da maioria da população

humana. No que se refere aos portadores sãos, muitas vezes os noticiários chegam

a conclusões equivocadas. O que geralmente ocorre são indivíduos acometidos por

infecções brandas ou assintomáticas, onde os adultos em geral são mais resistentes

às infecções por EPEC que as crianças e, no geral, crianças são infectadas pelo

contato com os adultos. Tal situação relaciona-se principalmente com condições de

falta de higiene e pobreza, e atenção especial deve ser dada aos berçários. Em

relação a ETEC, relatam-se estados de portador transitório, mas que pode ser

importante na propagação da enfermidade. No caso de portadores de EIEC, não se

tem conhecimento da extensão e, no caso de EHEC, deve ser visto com cautela os

riscos de transmissão por portadores humanos em especial as equipes de

enfermagem, onde as infecções podem ser resultado de exposições sucessivas

(VARNAN; EVANS, 1996).

2.4.4 Fatores que afetam o crescimento da E. coli em alimentos

Em geral o comportamento da E. coli em alimentos é semelhante ao de outros

membros da família Enterobacteriaceae. Entretanto, alguns fatores podem diferir.

Tal como todas as bactérias a sobrevivência e o crescimento da E. coli em alimentos

são dependentes da interação entre vários fatores extrínsecos e intrínsecos, como

temperatura, irradiação, pH, atividade de água, ingredientes de cura, competição

com outros microrganismos (BUCHANAN; DOYLE, 1997; VARNAN; EVANS, 1996).

Em relação à temperatura, o padrão geral de crescimento da E. coli em

alimentos situa-se entre 7 a 48ºC com o ótimo de temperatura de crescimento e

produção de toxinas em 37ºC. Contudo, existem exceções onde cepas patogênicas

crescem a baixas temperaturas, entre 4ºC e 5ºC, ocorrendo também a produção de

enterotoxina por algumas linhagens de E. coli O157:H7. Desta forma, mesmo que

47

ocorra inibição do crescimento, cepas de E. coli O157:H7 sobrevivem em produtos

refrigerados. A temperatura máxima de crescimento para E. coli O157:H7 é mais

baixa que para outros sorotipos, visto que inúmeras cepas são incapazes de crescer

a 44,5ºC, temperatura rotineiramente usada no isolamento de E. coli. É importante

ressaltar que o mesmo pode ocorrer com outras linhagens, pois apesar de todas as

cepas patogênicas crescerem a 37ºC, para algumas a temperatura ótima de

crescimento está em torno de 30ºC. A resistência térmica para a maioria dos

sorovares está em valores D tipicamente de cinco minutos a 55ºC e 0,1 minuto a

60ºC. No caso de E. coli O157:H7, os valores D60ºC nos seguintes produtos são:

0,45-0,47min na carne bovina; 0,37-0,55min na lingüiça suína; 0,38-0,55min na

carne de frango e 0,55-0,58min na carne de peru. Desta forma, conclui-se que a

pasteurização e o cozimento adequado são eficazes na destruição deste

microrganismo. É importante salientar que pesquisadores concluem que a

resistência térmica diminui quando o alimento é estocado em refrigeração ou

congelado, se comparado com aquele mantido a 37ºC, onde o estresse ocasionado

pelo tratamento térmico (refrigeração ou congelamento) permite uma inativação

térmica mais rápida que aquelas culturas mantidas em temperatura ótima de

crescimento. Em contrapartida a E. coli O157:H7 sobrevive nove meses a -20ºC em

carne moída (JAY, 2005; UYTTENDAELE; VANKEIRSBILCK; DEBEVERE, 2001;


Quanto à irradiação, a sensibilidade da E. coli é similar à da Salmonella spp.,

onde a dose de 3kGy é efetiva no controle deste microrganismo (VARNAN; EVANS,

1996).

No que se refere ao pH, Varnan e Evans (1996) descrevem que embora o

ICMSF (1980) refira-se a valores de pH de 4,4 a 9,0, muitos outros fatores como

temperatura, atividade de água e natureza do acidulante interferem diretamente

neste parâmetro. Segundo Jay (2005), em diversos estudos são relacionadas tais

interações e foi confirmada a capacidade de crescimento em pH abaixo de 4,0 (JAY,

2005).

O nível mínimo de atividade de água para o crescimento de E. coli em

condições ótimas, é de 0,95. Diversos estudos referentes à sobrevivência da E. coli

O157:H7 enfocam principalmente o efeito do cloreto de sódio (NaCl). O aumento da

concentração de NaCl a 6% permitiu o crescimento somente em valores de pH entre

5,6 e 6,8 e a temperaturas 15ºC e 35ºC. Também ocorreu crescimento em algumas

48

combinações de 4% de NaCl com valores de pH entre 6,2 e 6,8 e temperaturas ente

15ºC e 35ºC (VARNAN; EVANS, 1996).

Vale ressaltar que a E. coli parece não ter qualquer aumento de resistência

aos aditivos alimentares antimicrobianos (BUCHANAN; DOYLE, 1997).

Como competidor entre os microrganismos a E. coli compete melhor com os

microrganismos deteriorantes do que a Salmonella spp. e, em alimentos

fermentados, pode alcançar números significativos ao competir com as bactérias

ácido-lácticas. Em baixas temperaturas, tem seu número sobreposto por

psicotróficos como a Pseudomonas spp. Todavia é capaz de igualar-se e crescer em

temperaturas abaixo de 5ºC (VARNAN; EVANS, 1996).

2.4.5 Medidas preventivas A E. coli ao ser detectada em um alimento pode indicar contaminação de

origem fecal ou não, mas indica condições higiênicas insatisfatórias. Além disso,

diversas linhagens são patogênicas para o homem e animais. Considerando-se as

condições ecológicas da E. coli e sua resistência às condições adversas, sua

eliminação total dos alimentos e consequente prevenção da saúde coletiva,

principalmente o sorotipo O157:H7, representa um desafio. Isto significa que

sucessivas estratégias preventivas são obrigatórias para a redução ou eliminação

deste patógeno (BUCHANAN; DOYLE, 1997).

Devem ser tomados cuidados especiais com as águas de abastecimento,

especialmente em locais onde a higiene é precária, visto que a E. coli é excretada

em grande quantidade no meio ambiente, podendo assim contaminar as águas de

abastecimento que freqüentemente estão incriminadas em surtos por cepas

patogênicas de E. coli (VARNAN; EVANS, 1996).

Cuidados especiais devem ser dispensados à educação sanitária dos

manipuladores de alimentos, assim como à higiene e desinfecção dos

equipamentos, instalações e instrumental em geral envolvidos na produção de

alimentos, também devem ser tomados cuidados com o uso adequado das técnicas

de oclusões, no momento do abate. Além de ser igualmente importante a cocção e a

refrigeração adequadas dos alimentos manipulados (PARDI et al., 2001).

49

____________ 4BAIRD-PARKER, A. C. The basis for the classification of staphylococci and micrococci. Ann. N. BY. Acad. Sci., v. 236, p. 7-14, 1974.

Em síntese, concordando com a unanimidade dos microbiologistas,

Buchanan e Doyle (1997) ressaltam que a aplicação dos princípios do APPCC

incluindo as BPF e PPHO (Procedimento Padrão de Higiene Operacional) continuam

a ser os meios mais efetivos para o desenvolvimento sistemático da segurança

alimentar, garantindo a redução do risco de infecções por cepas patogênicas de E.

coli, desde que implementados em toda a cadeia de produção, ou seja, desde a

produção da matéria-prima até o produto final.

2.5 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DO Staphylococcus aureus De acordo com Schleifer (1986), a família Micrococcacea é composta por

quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus.

Segundo Silva e Gandra (2004) a primeira descrição de bactérias do gênero

Staphylococcus foi realizada por Ogoston (1880), que descreveu estes

microrganismos como cocos em formas de cachos e responsáveis por infecções

piogênicas. As primeiras espécies discriminadas através da produção de pigmentos:

S. aureus, de cor amarelo ouro e S. albicans com colônias brancas. Em 1974, Baird

Parker (apud4 SILVA e GANDRA, 2004) reconhecia apenas três espécies de

importância clínica, utilizando como característica diferencial a prova da coagulase,

como coagulase positiva o S. aureus e como coagulase negativa o S. epidermidis e

o S. saprophyticus.

O gênero Staphylococcus é formado atualmente por 32 espécies, das quais,

cinco são capazes de produzir uma enzima extracelular, a coagulase. Entre essas

espécies denominadas de Staphylococcus spp. coagulase positiva, o

Staphylococcus aureus é a espécie mais prevalente em surtos de intoxicação

alimentar estafilocócica, devido a capacidade da maioria de suas cepas produzirem

enterotoxinas. Entretanto, S. intermedius e S. hyicus também podem produzir

enterotoxinas e já foram descritas em surtos (SILVA; GANDRA, 2004).

As enterotoxinas são proteínas puras, cuja composição de aminoácidos,

estrutura molecular e atividades farmacológicas são bastantes semelhantes entre si,

possuindo, entretanto, propriedade imunológicas distintas (FRAZIER e WESTHOFF,

1993). Tomando-se por base suas características antigênicas, as enterotoxinas são

classificadas, atualmente em enterotoxina estafilocócica e com base em métodos

50

sorológicos, identificam-se 10 enterotoxinas estafilocócicas, denominadas “SEA”,

“SEB”,”SEC1”, “SEC2”, “SEC3”, “SED”, “SEE”, “SEG”, “SEH” e “SEI” (DINGES;

ORWIN; SCHLIEVERT, 2000). São resistentes à hidrólise pelas enzimas gástricas e

jejunais, e são estáveis ao aquecimento a 100°C dur ante 30 minutos, não sendo

inativadas totalmente pela cocção normal, pasteurização e outros tratamentos

térmicos usuais (JAY, 1994), sendo a enterotoxina do tipo A, a mais freqüentemente

associada à gastrenterite estafilocócica (PARDI et al., 2001, SILVA; GANDRA,

2004).

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, com

diâmetro variando entre 0,5 e 1,5µm, imóveis e não formadores de esporos. Quando

visualizados em microscópicos, aparecem em forma de cacho de uva, por se

dividirem em planos diferentes. Entretanto, de acordo com a idade da colônia podem

ser encontradas isoladas, aos pares, agrupadas em tétrades ou, ainda em pequenas

cadeias. A maior parte das espécies apresentam metabolismo respiratório e

fermentativo e têm capacidade de fermentar uma variedade de carboidratos,

principalmente em aerobiose, com produção final de ácido, mas não de gás

(FRANCO; LANDGRAF, 2002).

Contudo, a despeito de ser um germe fermentativo e proteolítico, em

condições favoráveis o microrganismo multiplica-se no alimento, até alcançar

números elevados, inclusive em produtos cárneos, sem que sejam alterados cor,

odor e sabor (FRAZIER; WESTHOFF, 1993; PARDI et al., 2001).

Os estudos relacionados aos fatores extrínsecos e intrínsecos que interferem

na multiplicação destes microrganismos foram realizados com S. aureus, devido esta

ser a espécie mais relacionada com surtos de intoxicação alimentar (FRAZIER;

WESTHOFF, 1993; JAY, 1994), onde são relatados os seguintes parâmetros,

capacidade de multiplicação na faixa de pH de 4,8 (sendo o pH mínimo em

aerobiose menor que em anaerobiose, onde o pH é mínimo 5,5) a 8,0, o pH ótimo

situa-se entre 6,0 e 7,0; temperatura de multiplicação e produção de enterotoxina

entre 4 e 46ºC, ou até 47,8ºC, a multiplicação é mais rápida entre 20 e 45ºC, embora

a 45ºC seja quatro vezes mais rápida que a 20ºC. É importante salientar a

halotolerância a 10 até 20% de NaCl, bem como a 60% de açúcares, a nitratos e a

atividade de água (Aa) mínima de crescimento de até 0,83, sem produção de

enterotoxinas, com produção de enterotoxinas é de 0,86 em aerobiose e 0,90 em

anaerobiose (FRAZIER; WESTHOFF, 1993; FRANCO; LANDGRAF, 2002).

51

Bactérias do gênero Staphylococcus podem ser encontradas no solo, na água

e no ar, tendo como reservatórios os animais e o homem, sendo capazes de

sobreviverem por longos períodos em objetos secos e inanimados. O homem é o

principal reservatório de S. aureus, que pode ser encontrado nas fossas nasais e na

garganta, ou seja, nasofaringe, pele ou trato gastrintestinal. Sua presença em

alimentos demonstra contaminação humana pós-processamento, deficiência de

processamento (maioria das vezes quebra da cadeia de frio ou desobediência de

tempo/temperatura de conservação), contaminação cruzada, inadequadas

condições de higiene e sanificação de utensílios, equipamentos e ambiente

(BRASIL, 2000b; LANCETTE; BENNETT, 2001; SILVA; GANDRA, 2004).

2.5.1 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or S. aureus

A intoxicação alimentar por enterotoxinas elaboradas por S. aureus, em

determinados países, é a mais freqüente. A agressão ao organismo do ingestor do

alimento contaminado dá-se por causa da enterotoxina pré-formada e, portanto, dos

fenômenos tóxicos que caracterizam a enfermidade. Sob certas condições,

entretanto, os sintomas desse tipo comum de envenamento alimentar ocorrerão

como resultado do crescimento de S. aureus no trato intestinal e, provavelmente, em

outro lugar do corpo (PARDI et al., 2001).

O S. aureus é uma bactéria que produz um amplo espectro de doenças desde

lesões superficiais até severas infecções sistêmicas, no homem e em outros

animais. É um importante patógeno nosocomial, sendo descrito como agente

etiológico significativo em infecções hospitalares, desde 1950; é também o

microrganismo mais freqüente associado às mastites caprina e bovina (PEREIRA et

al., 2000).

O S. aureus é, sem dúvida, dentro do gênero Staphylococcus, a espécie mais

relacionada a casos de intoxicação alimentar, sendo numerosos surtos atribuídos a

este microrganismo. É encontrado no meio ambiente e coloniza a pele, períneo,

axilas, vaginas e outros sítios do corpo humano e de animais. Estima-se que esteja

presente nas fossas nasais de 30 a 50% de humanos adultos saudáveis. Esse

percentual aumenta para 60 a 80% entre pacientes e pessoas hospitalizadas. Os

portadores assintomáticos que os apresentem na garganta somam de quatro a 70%

52

em diferentes países Por estas razões, os manipuladores de alimentos podem

tornar-se portadores assintomáticos, possibilitando que este microrganismo se

dissemine dentro de plantas de processamento, o que facilita a contaminação

cruzada de produtos prontos para o consumo (JAY, 1994; PARDI et al., 2001;

SILVA; GANDRA, 2004).

A presença de S. aureus em alimentos é interpretada como indicativa de

contaminação dos manipuladores, bem como limpeza e sanificação inadequadas de

superfícies e de utensílios, materiais e equipamentos. Staphylococcus spp.

enterotoxigênicos podem ser carreados para os alimentos durante ou após o

processamento, através do manuseio inadequado e refrigeração insuficiente, o que

pode possibilitar o crescimento dos microrganismos e a produção e liberação de

enterotoxinas no alimentos (LANCETTE; BENNETT, 2001).

O S. intermedius é considerado um microrganismo patogênico de interesse

veterinário, sendo encontrado como parte da microbiota da pele e de cavidades

nasais e orais de cães, visons, eqüinos e gatos, podendo causar infecções

cutâneas, urinárias, ósseas e do sistema nervoso central em várias espécies

animais (JAY, 1994; OLIVEIRA, 2000). Essa bactéria tem sido isolada de feridas

infectadas de seres humanos, causadas por mordeduras de cães, bem como casos

de mastite bovina, sendo também relacionada a vários surtos de intoxicação

alimentar, principalmente em produtos de origem animal (OLIVEIRA, 2000).

O S. hyicus e o S. intermedius são considerados patógenos de interesse

veterinário, encontrados principalmente em suínos e bovinos, tendo sido isolados no

leite dessa última espécie. Freqüentemente, estão associados à epidermite

exudativa, doença aguda que acomete suínos lactentes e recém desmamados.

Muitas vezes estes microrganismos são predominantemente encontrado em

rebanhos leiteiros com problemas de mastite (JAY, 1994; OLIVEIRA, 2000).

A gastrenterite estafilocócica é causada pela ingestão de alimentos que

contenham uma ou mais enterotoxinas, as quais são produzidas somente por

algumas espécies e linhagens de Staphylococcus spp. Embora a produção de

enterotoxinas esteja geralmente associada a S. aureus coagulase e termonuclease

positivos, algumas espécies que não produzem nenhuma dessas enzimas também

podem produzir enterotoxinas (JAY, 2005).

A produção de enterotoxinas não está restrita à espécie S. aureus. Espécies

coagulase negativa, capazes de produzir toxinas, foram evidenciadas conforme

53

exposto, cronologicamente, no Quadro 1 (PEREIRA; CARMO; PEREIRA, 2001;

PEREIRA et al., 2000). Outras espécies de Staphylococcus, além de S. aureus, são

capazes de produzir enterotoxinas, embora esta característica já tivesse sido

relatada, também, para outras espécies coagulase positivas, como S. hyicus e S.

intermedius.

Quadro 1: Staphylococcus spp. enterotoxigênicos não produtores de coagulase.

Staphylococcus spp. não produtores de

coagulase

Enterotoxina estafilocócica Publicação

+ Nr Thatcher e Simon (1956)

S. epidermidis C Bergdoll et al. (1967)

S. epidermidis A e C Danielson e Helberg (1977)

S. epidermidis, S. haemolyticus, S. capitis A, B e C Olvisk (1982)

S. hyicus ? Hoover et al. (1983)

+ Nr Adesiyun e Usman (1983)

S. hyicus Nr Adesiyun et al. (1984) S. intermedius A, B e C Fukuda et al. (1984)

+ A, C, “TSST-1” Crass e Bergdoll (1986)

S. cohnii, S. haemolyticus, S. xylosus A, B e C Bautista et al. (1986 e

1988) S. chromogenes, S. warneri, S. sciuri, S. lentus

A, B e C Valle et al. (1990)

+ Nr Nanu e Narayan ( 1992)

S. epidermidis C Marên et al. (1992) + A Oliveira (1995) S. waneri, S. epidermidis A Oliveira et al. (1995) + A, B e C Pereira et al. (1995) + A, B e C Pereira et al. (1996)

+: presença; Nr: não relatada; ?: não identificada Fonte: Pereira; Carmo; Pereira, 2001.

Entre as enterotoxinas estafilocócicas identificadas, a “SEA” é recuperada

mais freqüentemente em surtos de intoxicação alimentar, sendo a “SED” a segunda

mais freqüente. Um pequeno número de surtos está associado a “SEE”. A incidência

relativa de enterotoxinas específicas entre linhagens isoladas de diversas fontes

varia consideravelmente. Entre as linhagens de S. aureus isoladas de alimentos

54

grandes variações foram observadas, e foi demosntrado que a “SED” está mais

associada com isolados de aves do que com linhagens humanas (JAY, 2005).

Os Staphylococcus spp. têm sido isolados esporadicamente de uma grande

variedade de fontes que incluem o solo, a água, aareia da praia, o ar e os alimentos,

entre outras; no entanto, podem ser disseminados por portadores humanos ou

animais (BRASIL, 2000b; PEREIRA et al., 2000).

Em geral, pode-se esperar a presença de estafilococos, mesmo que em

pequenas quantidades, em quase todos os alimentos de origem animal ou naqueles

diretamente manipulados, a não ser que tenham sido aplicados tratamentos térmicos

para destruição desses microrganismos (JAY, 2005).

A patogênese de S. aureus é devida a fatores de virulência na forma de

toxinas, enzimas e outras proteínas associadas à parede celular, mediados por

genes plasmidiais ou cromossômicos, que combinados conduzem à doença. S.

aureus utiliza extensivas estratégias para sobrepujar as defesas microambientais do

hospedeiro infectado e potencialmente colonizar os tecidos. Evidências, de estudos

recentes sugerem que exotoxinas envolvidas na síndrome do choque tóxico e

intoxicações alimentares são superantígenos, proteínas multifuncionais que

invariavelmente exibem atividade letal, pirogenicidade e a capacidade de induzir

hipersensibilidade a endotoxinas (JAY, 2005; PEREIRA et al., 2000).

As bactérias do gênero Staphylococcus secretam várias enzimas e toxinas

que são responsáveis por uma diversidade de patologias, tanto em humanos, quanto

em animais, que podem ser divididas em: infecções e doenças causadas por

toxinas. As infecções podem ser localizadas, como pústulas, furúnculos, impetigos,

processos mais extensos e graves, como infecção pós cirúrgica, osteomielite,

pneumonia, endocardite, meningite, entre outras, ou disseminadas, como

bacteremia e septicemia. As doenças causadas por toxinas também apresentam

amplo espectro de manifestações clínicas, como celulite, síndrome da pele

escaldada, síndrome do choque tóxico e intoxicação alimentar (SILVA; GANDRA,

2004).

As bactérias do gênero Staphylococcus, como já dito, produzem uma grande

variedade de toxinas extracelulares e de fatores de virulência, os quais estão

relacionados à patogenicidade e aos mecanismos de resistência aos

antimicrobianos disponíveis. Entre esses, destaca-se a toxina 1 da síndrome do

choque tóxico (“TSST-1”). A “TSST-1” é um polipeptídeo de cadeia simples, com

55

____________

5JONES, T. O.; WIENEKE, A. A. Staphylococcal toxic shock syndrome. Vet. Rec., v. 119, p. 435, 1986.

propriedades biológicas comuns a outras exotoxinas pirogênicas e superantigênicas,

com capacidade de induzir febre, aumentar a letalidade do choque endotóxico,

estimular a proliferação inespecífica de células T e induzir a produção de

interleucina-1, de gama interferon e do fator alfa de necrose tumoral (DINGES;

ORWIN; SCHIEVERT, 2000).

O primeiro relato de detecção de TSST-1 produzida por Staphylococcus spp.

de origem animal foi em 1986 por JONES e WIENEKE (apud5 FAGUNDES;

OLIVEIRA, 2004). A “TSST-1” é reconhecida como a principal causa da síndrome do

choque tóxico em seres humanos, caracterizada por febre, hipotensão, congestão

em vários órgãos e choque letal (CARDOSO; CARMO; SILVA, 2000).

Os sintomas da intoxicação alimentar por Staphylococcus spp. está

geralmente associada a ingestão de toxinas pré-formadas e não pela colonização

intestinal. Contudo, o crescimento e a produção de enterotoxinas ocorre nos casos

de colite pseudomembranosa e síndrome do choque tóxico, no qual a enterotoxina B

está implicada (VARNAN; EVANS, 1996).

Algumas linhagens produtoras de enterotoxinas também produzem “TSST”, e

alguns sintomas do choque tóxico parecem ser causados pelas “SEA”, “SEB” e

“SEC1” (JAY, 2005).

Os sinais observados na maioria dos casos de gastrenterite estafilocócica

inclui náuseas, vômitos, contrações abdominais, diarréia, sudorese, cefaléia,

prostação e, algumas vezes, uma queda na temperatura corporal. A intoxicação

geralmente não é letal, sendo que a duração dos sintomas é de 1 a 2 dias, podendo

evoluir para quadros mais severos, dependendo da susceptibilidade do indivíduo. O

período de incubação varia de 30 minutos a oito horas após a ingestão do alimento

contaminado, com média de 4 horas. A taxa de mortalidade é bastante baixa ou

nula, a morte geralmente ocorre em pacientes idosos, muito jovens ou, em pacientes

com doenças debilitantes (JAY, 2005; PARDI et al, 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Após cessarem os sintomas, a pessoa acometida não possui imunidade

comprovada a intoxicações recorrentes, embora alguns animais tornem-se

resistentes à enterotoxina após repetidas doses orais. Os sintomas são referentes à

ingestão de enterotoxinas pré-formadas e é natural que culturas de fezes possam

ser negativas para a presença de S. aureus, embora isso seja raro. A prova da

intoxicação alimentar estafilocócica é estabelecida mediante a recuperação de

56

Staphylococcus spp. enterotoxigênicos das sobras de alimentos e das culturas de

fezes das pessoas acometidas (JAY, 2005).

Franco e Landgraf (2002) relatam que não existe uma concordância sobre a

dose infectante capaz de causar sintomatologia em seres humanos, porém, de

maneira geral estima-se que 1µg é a dose infectante para o desenvolvimento de

intoxicação estafilocócica. JAY (2005) relata que 20µg seriam suficientes para

causar ETA.

Em relação ao crescimento microbiano onde se dê a produção de

enterotoxinas, demonstrou-se que alimentos envolvidos em intoxicações alimentares

apresentaram contagens entre 50 e 200 x 106 estafilococos por grama de alimento, o

que justifica o padrão estabelecido por legislação atual, de acordo com o Ministério

da Saúde ser de 103 Staphylococcus spp. coagulase positiva por grama de alimento

(BRASIL, 2001; PARDI et al, 2001).

É importante salientar que o número mínimo de células de S. aureus

necessário para produzir níveis de enterotoxinas considerados suficientes para

causar gastrenterite em humanos (1µg/g) parece diferir entre os substratos e entre

as enterotoxinas em particular (JAY, 2005).

As enterotoxinas estafilocócicas não agem diretamente nas células intestinais.

O sítio de ação para a ocorrência do quadro de emese, são vísceras abdominais

onde receptores são ativados na área subcortical ativando o centro do vômito via

nervo vago e simpático aferentes (VARNAN; EVANS, 1996).

As enterotoxinas e a toxina da síndrome do choque tóxico são classificadas

como super antígenos bacterianos. Com esses antígenos, células CD4 facilitam o

contato entre o receptor do antígeno das células T e as moléculas de classe II do

complexo de histocompatibilidade maior (MHC). Superantígenos estafilocócicos

ligam-se diretamente às cadeias de receptores β das células T “helper” sem nenhum

processamento. Após a ligação ao MHC de moléculas de classe II, as enterotoxinas

estimulam as células T a produzirem citocinas semelhantes à interleucinas (IL),

gama-interferon e fator de necrose tumoral. Entre as citocinas, há produção

abundante de IL-2, a qual parece ser responsável por muitos, se não pela maioria,

dos sintomas da gastrenterite estafilocócica. As atividades emética e de proliferação

das células T podem estar desassociadas (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

57

2.5.2 Epidemiologia

O S. aureus, bactéria ubíqua, difunde-se universalmente, sendo em alguns

países, o agente de intoxicação microbiana de maior prevalência (PARDI et al.,

2001). O S. aureus é extremamente resistente ao estresse e possui grande

habilidade e adaptabilidade de crescimento fora do hospedeiro. Este microrganismo

pode sobreviver por longos períodos em água contaminada, e pode colonizar

alimentos e plantas de processamento a partir de equipamentos e utensílios não

higienizados corretamente (VARNAN; EVANS, 1996).

Staphylococcus spp. enterotoxigênicos coagulase positiva, uma vez presentes

no alimento, podem sintetizar enterotoxinas que quando ingeridas provocam, após

um período de incubação de geralmente de 30 minutos a quatro horas, sintomas de

vômito, diarréia, dores abdominais e prostação. É importante salientar que a

potencialidade em causar doença depende do sorovar enterotoxigênico. A “SEA”

seguida da “SED” são normalmente consideradas as mais patogênicas (FRANCO;

LANDGRAF, 2002; VARNAN; EVANS, 1996).

Em relação à enterotoxigenicidade dos Staphylococcus spp., o S. aureus,

usual ou pauciprodutor mostra-se, de maneira contundente, como agente

desencadeador, por excelência, dos processos de intoxicação estafilocócica,

chegando a representar envolvimento em surtos estafilocócicos um índice

estatisticamente superior a 98% (PEREIRA et al., 2000).

Por muitos anos, o S. aureus foi considerado a única espécie do gênero

capaz de produzir enterotoxinas, bem como coagulase, enzima extracelular muito

utilizada na rotina laboratorial na identificação deste microrganismo. Posteriormente,

outras espécies como S. intermedius e S. hyicus produtoras de enterotoxinas foram

identificadas em surtos de intoxicação alimentar. Em função destes fatores, bem

como a grande semelhança fenotípica destas três espécies, a legislação atual

estabelece a pesquisa e enumeração de Staphylococcus spp. coagulase positiva ao

invés da enumeração de S. aureus (BRASIL, 2001; SILVA; GANDRA, 2004). Estas

três espécies microbianas apresentam características morfológicas idênticas em

diferentes meios de cultivo, bem como algumas reações bioquímicas extremamente

semelhantes, o que torna difícil sua diferenciação. Na rotina laboratorial, o teste da

coagulase em tubo é o método padrão empregado para identificar e classificar

Staphylococcus spp. como coagulase positiva e, muitas vezes o único teste para

58

identificar o isolado como S. aureus, contudo deve-se ressaltar que este

procedimento não permite a diferenciação entre as espécies, além do fato de que

nem todas as estirpes coagulase positiva causam intoxicações, fato que contraria a

hipótese inicial que relaciona a produção de toxinas à coagulase (PARDI et al.,

2001) sendo o inverso também verdadeiro, o que é extremamente importante tanto

do ponto de vista epidemiológico quanto no desenvolvimento de pesquisas, o que

sugere uma reavaliação dos métodos de análise destes microrganismos (BOARI et

al., 2003; SILVA; GANDRA, 2004).

Durante muitos anos, associou-se a capacidade de produzir coagulase,

termonuclease e enterotoxinas apenas ao S. aureus, por esta razão, como dito

anteriormente, os testes laboratoriais eram direcionados, especificamente, para esta

espécie. Nas últimas décadas, a metodologia de rotina para o isolamento, e

numeração e identificação de S. aureus, em alimentos utiliza, primeiramente, um

ágar seletivo diferencial, sendo mais utilizado o ágar Baird Parker, seguido da

coloração pelo método de Gram e da confirmação bioquímica da espécie através

dos testes de produção de coagulase livre, termonuclease e catalase, pois além das

enterotoxinas tais enzimas são fatores de violência produzidos por determinadas

espécies de Staphylococcus spp. e portanto utilizadas no diagnóstico laboratorial

para identificação deste gênero e suas espécies (CUNHA NETO; SILVA;

STAMFORD, 2002; LANCETTE; BENNETT, 2001; SILVA; GANDRA, 2004).

A coloração pelo método de Gram é o primeiro teste a ser realizado, pois a

ausência de cocos Gram-positivos indica prova negativa para Staphylococcus spp.,

enquanto a presenaç dos mesmos indica a necessidade da realização de testes

complementares (BRASIL, 2000b)

A catalase atua inativando o peróxido de hidrogênio e radicais livres tóxicos

formados pelo sistema de mieloperoxidase no interior das células fagocitárias, sendo

utilizado para diferenciar o gênero Staphylococcus do Streptococcus (SILVA;

GANDRA, 2004).

A termonuclease é uma fosfodiesterase que pode clivar o DNA ou RNA. É

produzida pela maioria das cepas de S. aureus, S. schleiferi, S. intermedius e S.

hyicus. O aquecimento a 65ºC altera a sua estrutura, mais essa mudança é

rapidamente e completamente reversível. Sua presença em alimentos é usada como

uma medida indireta do crescimento de S. aureus podendo, também, indicar a

presença potencial de enterotoxinas (JAY, 1994).

59

____________ 6OMORI, G.; KATO, Y. A staphylococal food-poioning caused by coagulase negative strain. Biken’s J., v.2, p. 92, 1959.

Com relação a coagulase extracelular, sete diferentes tipos antigênicos têm

sido descritos, entretanto, sua única função na patogenicidade bacteriana parece ser

a formação de coágulos a fim de inibir a fagocitose. Salienta-se que algumas

espécies apresentam dois tipos de coagulase: a coagulase livre, que catalisa a

reação entre uma substância presente no plasma, denominada de “fator de reação

de coagulase” e no fibrinogênio, formando a fibrina e a coagulase ligada, presente

na superfície da parede celular bacteriana, reagindo diretamente como fibrinogênio

produzindo uma rápida aglutinação das células bacterianas. Ambos os tipos

recobrem as células bacterianas com fibrina tornando-as resistentes à opsonização

e a fagocitose (LANCETTE; BENNETT, 2001).

A capacidade de produzir uma ou mais enterotoxinas é encontrada em 30 a

50% das cepas de S. aureus. Cardoso et al. (2000), ao examinar 48 linhagens

enterotoxigênicas de S. aureus, isoladas de produtos lácteos, observaram que pelo

menos 16 delas produziram mais de um tipo de enterotoxina. A enterotoxina mais

comumente encontrada foi a do tipo A (em 37, 7% do total de isolados), seguida pelo

tipo B (17,7%), D (11,8%) e C (10,6%). A produção simultânea de diferentes tipos de

toxinas pode aumentar os seus efeitos toxigênicos isolados, sugerindo que essa co-

produção possa desempenhar papel importante na patogenia das infecções

intramamárias produzidas por esse microrganismo (FAGUNDES; OLIVEIRA, 2004).

Raros são os estudos sobre o crescimento de Staphylococcus spp. coagulase

negativa em alimentos e uma possível razão da quase não evidência destes em

pesquisas de alimentos envolvidos em surtos poderia ser relacionado com a

incapacidade ou inabilidade de seu crescimento em substratos alimentícios.

Entretanto, deve-se considerar que, sabidamente, espécies coagulase negativas

poderiam, potencialmente, alcançar alimentos uma vez que tanto o homem como

animais são portadores usuais destas estirpes, já que, uma vez nos alimentos, seu

crescimento pode conduzir a produção de enterotoxinas (PEREIRA et al., 2000;

JAY, 2005).

No que diz respeito a surtos, o primeiro relato envolvendo estafilococos

coagulase negativa ocorreu em Osaka, Japão, descrito em 1959 por Omori e Kato

(apud6 PEREIRA; CARMO; PEREIRA, 2001) envolvendo 40 estudantes de uma

escola secundária. A pesquisa para averiguação foi realizada a partir das fezes dos

pacientes e dos pratos consumidos. Foi realizado experimento em gatos jovens e o

efeito emético foi observado após 30 minutos de ingestão.

60

____________ 7EVENSON, M.L.; HINDS, M.W.; BERNSTEIN, R.S. Estimation of human dose of staphylococal enterotoxin A from a large outbreak involving chocalat milk. Int. J. Food Microbiol., v. 7, p. 311-316, 1998.

Historicamente, a confirmação da presença de enterotoxinas estafilocócicas

para elucidação de surtos tem sido conduzida através de métodos biológicos, que

consistem na administração da toxina por via gástrica em macacos e por via

intraperitonial ou intravenosa em gatos, a partir da observação da sua capacidade

de reação emética nas espécies acima citadas (PEREIRA; CARMO; PEREIRA,

2001). Contudo, outras técnicas de detecção foram desenvolvidas e fundamentadas

nas reações antígeno-anticorpo, valendo ressaltar a técnica “OSP” (“Optimum

Sensitivity Plate”), com capacidade de detecção igual a 0,5µ/g de enterotoxinas, em

fluído sobrenadante de cultura. Questionamentos a respeito da eficácia e

sensibilidade destes métodos passaram a existir quando um surto ocorrido nos

Estados Unidos com leite achocolatado contendo 0,4 a 0,7ng/g de enterotoxina,

descrito em 1998, por Everson et al. (apud7 PEREIRA; CARMO; PEREIRA, 2001), foi

detectado por utilização do método de “ELISA” (“Enzyme Linked Immunosorbent

Assay”) não poderia, entretanto, ter sido alcançado pelos métodos tradicionais como

“OSP”, o que levou ao refinamento de metodologias analíticas como as técnicas de

“ELISA”.

Em relação a susceptibilidade à intoxicação estafilocócica, existe uma

variação considerável, sendo os adultos os indivíduos mais comumente atingidos.

Porém, convém ressaltar que, como na maioria das enfermidades, a intoxicação por

Staphylococcus spp. coagulase positiva torna-se mais grave nos idosos, crianças e

imunodeprimidos. Não existe relação direta à hábitos alimentares ou cultura

alimentar (VARNAN; EVANS, 1996).

De acordo com Pereira et al. (2000), os portadores de S. aureus

desempenham um papel importante na epidemiologia e patogênese da infecção. Em

indivíduos sadios, pode-se distinguir três padrões de interação com o patógeno: os

portadores persistentes, cerca de 20% dos indivíduos portam quase sempre um tipo

de linhagem; os portadores intermitentes, uma grande proporção da população

(60%) alberga linhagens que mudam com freqüência variável; os não-portadores,

20% das pessoas raramente albergam qualquer tipo de linhagem. Portadores de S.

aureus têm sido identificados como um importante fator de risco para infecções em

pacientes cirúrgicos, os que fazem hemodiálise ou aqueles com infecções pelo vírus

da imunodeficiência humana (PEREIRA; SIQUEIRA-JUNIOR, 1995).

O homem é considerado a maior fonte de estafilococos para a contaminação

61

de alimentos (JAY, 2005; PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996). Em alguns

países a presença de S. aureus na região nasal comprova que o indivíduo é

portador deste microrganismo, tornando-se uma condição impeditiva para sua

contratação como manipulador de alimentos, fato este que não ocorre na legislação

brasileira (SILVA JUNIOR, 2001).

O perfil higiênico-sanitário dos manipuladores de alimentos tem se mostrado

freqüentemente inaceitável no diz respeito a contaminação microbiana em diversos

sítios anatômicos. Maciel et al. (2002) analisando manipuladores sem sinais

aparentes de infecção estafilocócica em uma indústria de lingüiças no Rio de Janeiro

– RJ, verificou que 67% dos manipuladores eram colonizados, com uma ocorrência

de 11% nas narinas e mãos. A orofaringe destacou-se com principal ponto de

colonização (45%), podendo ser um potencial foco de contaminação quando

associada à desobediência das boas práticas de higiene.

A maioria dos animais domésticos abriga S. aureus. A mastite estafilocócica é

bem difundida nos rebanhos leiteiros, e as chances de se contrair intoxicação

alimentar são grandes se o leite infectado for consumido ou utilizado na fabricação

de queijos. Há poucas dúvidas de que as diversa linhagens causadoras da mastite

bovina sejam provenientes de humanos, contudo algumas espécies são chamadas

“linhagens animais”. Em um estudo com linhagens de Staphylococcus spp. isoladas

de produtos crus de carne suína, todas pertenciam ao tipo de espécie animal.

Contudo durante a fabricação de produtos com carne suína, essas “linhagens

animais” foram substituídas por espécies humanas, até o ponto em que nenhuma

das linhagens animais originais pode ser detectada (JAY, 2005).

No Estado da Paraíba, pesquisadores isolaram linhagens de S. aureus de

bovinos, aparentemente sadios, em fase de lactação, na pele do úbere e tetas e

menos freqüentemente nas fossas nasais (PEREIRA; SIQUEIRA-JÚNIOR, 1995).

Em levantamentos epidemiológicos nacionais e internacionais, o S. aureus

está presente em cerca de 50% das infecções da glândula mamária dos bovinos

leiteiro. Foi verificado o predomínio de bactérias do gênero Staphylococcus na

etiologia da mastite (32 e 80%), com o isolamento de 16 cepas produtoras de

enterotoxinas. Os dados obtidos indicam um risco potencial à saúde humana

associado ao consumo do leite dos rebanhos analisados, uma vez que a maioria dos

casos diagnosticados de mastite eram do tipo subclínico, ou seja, os animais não

62

apresentavam alterações visíveis na glândula mamária e tão pouco no leite

(FAGUNDES; OLIVEIRA, 2004).

Na área de vigilância sanitária dos alimentos, S. aureus é um microrganismo

freqüentemente responsável por surtos de intoxicação alimentar, devido ao

importante papel desempenhado pelos manipuladores, durante as diferentes etapas

de processamento dos alimentos, somado ao risco de contaminação das matérias-

primas, desde que sua origem e às temperaturas inadequadas de conservação pós-

cocção (PRADO et al., 2002; RIBEIRO et al., 2001).

Os alimentos comumente associados à surtos de intoxicação estafilocócica

são as carnes e seus derivados, saladas, cremes e outros produtos de confeitarias.

Na maioria das vezes estes alimentos são contaminados após o processamento ou

cozimento quando os microrganismos de competição são eliminados. Entretanto, a

formação de enterotoxinas é mais pronunciada quando as temperaturas são

adequadas ao crescimento dos S. aureus. O que geralmente ocorre com os

produtos cárneos fermentados e com os produtos de confeitaria, onde

freqüentemente dá-se a formação de enterotoxinas, principalmente em virtude do

processo de fermentação inadequado (LANCETTE; BENNETT, 2001).

Nos alimentos processados onde os estafilococos são destruídos a sua

presença indica contaminação pela manipulação. Esta contaminação pode ser

introduzida diretamente no alimento a partir de lesões presentes na pele dos

manipuladores ou a partir de perdigotos contaminados nas infecções respiratórias ou

nos portadores assintomáticos. A contaminação de produtos processados também

pode acontecer quando os mesmos são depositados ou expostos à superfícies

contaminadas. Contudo, quando grande número de Staphylococcus spp. são

encontrados em produtos processados, na maioria das vezes, este produto sofreu a

interferência de condições de higiene inadequadas, temperaturas de controle de

processamento ou armazenagem inadequada (CUNHA NETO; SILVA; STAMFORD,

2002; LANCETTE; BENNETT, 2001; PARDI et al., 2001).

Nas carnes cruas a presença de Staphylococcus spp. é praticamente

inevitável. Muitas das espécies presentes são próprias do animal de origem, porém

como já dito algumas espécies são de origem humana, introduzidas pela

manipulação por ocasião do manejo e do abate, principalmente em locais onde as

condições de higiene são pobres. As carnes de aves podem estar altamente

contaminadas como resultado de equipamentos de abate colonizados por

63

Staphylococcus spp. Outro fato importante é que quando presente em grande

número nas carnes cruas, estas podem ser veículos de contaminação cruzada

(VARNAN; EVANS, 1996).

Em muitos surtos estafilocócicos imputados ao consumo de carne, os fatores

que mais predispõem à contaminação originam-se da inadequada manipulação dos

produtos, resultando em contaminação cruzada (manipuladores de alimentos,

alimento cru e alimento contaminado) e na exposição dos produtos a temperaturas

adequadas ao crescimento (HOFFMANN et al., 1996; PARDI et al., 2001).

O S. aureus está freqüentemente presente em produtos cárneos cozidos em

números baixos, porém quando presentes em altas concentrações, geralmente

devido ao processamento em níveis inaceitáveis de higiene ou temperaturas de

controle inadequados. Os produtos cárneos cozidos geralmente passam por dois

estágios de produção com temperaturas controle diferenciadas, onde na ocorrência

de falhas entre os dois estágios de tratamento térmico, pode haver o crescimento de

Staphylococcus spp. assim como a produção de enterotoxinas. Os produtos cozidos

são freqüentemente envolvidos em surtos porque de que em sua maioria são

produzidos em grande quantidade e armazenados em pilhas, em número elevado,

sob temperatura ambiente ou de refrigeração (HOBBS; ROBERTS, 1998; VARNAN;

EVANS, 1996).

Após o processamento os produtos cárneos cozidos são substratos seletivos

excelentes para o crescimento de Staphylococcus spp., pois os mesmos encontram-

se na presença de NaCl e na ausência de competição microbiana (PARDI et al.,

2001). Desta forma, a contaminação pode ocorrer em virtude da manipulação,

armazenagem inadequada ou até mesmo pela adição de ingredientes contaminados

após o cozimento (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

A presença de Staphylococcus spp. é um dos maiores problemas em salames

e outros produtos fermentados. Um grande número de casos de intoxicação

estafilocócica tem ocorrido envolvendo estes produtos. Nas fermentações

inadequadas ocorre o crescimento de Staphylococcus spp. durante a maturação e

produção de enterotoxinas. Após o processo completo, mesmo que ausente ou

mesmo com um pequeno número de células viáveis, o produto final não tem garantia

de qualidade. De acordo com os resultados de alguns estudos, os seguintes fatores

devem ser observados na produção de embutidos fermentados secos ou semi-

secos: a probabilidade de crescimento de Staphylococcus spp. amplia-se com o

64

aumento dos níveis iniciais de contaminação da matéria-prima; o pH inicial mais alto

da carne aumentará o seu crescimento em um pH máximo “standard”

(preferencialmente abaixo de 6,0), para carnes deve ser adotado pelos

processadores; uso de “starters” de bactérias ácido-láticas é necessário para

assegurar o grau máximo de inibição de patógenos; e carboidrato suficiente deve ser

adicionado para assegurar o crescimento efetivo da cultura “starter” (HOFFMANN;

GARCIA-CRUZ; VINTURIM, 1997; PARDI et al., 2001).

No pescado a ocorrência de S. aureus está diretamente associada ao

processo de manipulação, e surtos ocasionais envolvendo pescado cozido e

mantido em temperaturas inadequadas, principalmente pelo “aquecimento” antes do

consumo tem sido reportado (VARNAN; EVANS, 1996).

Hiluy et al. (1996) ao analisarem 22 amostras de produtos pesqueiros (peixes,

ostras e camarão) verificaram a ocorrência de S. aureus em 50% das amostras de

camarão e 20% das de peixe, relatando a manipulação inadequada na captura,

processamento e manuseio como fontes de contaminação.

A contaminação do leite com S. aureus pode ocorrer através das duas vias,

uma vez que se trata de um microrganismo patogênico que pode causar inflamações

no úbere das vacas, além de estar presente em superfícies de utensílios e

equipamentos de ordenha (FONSECA; SANTOS, 2000). Assumpção et al. (2003),

ao avaliaram o processo de fabricação de queijo prato em um laticínio de Lavras,

Minas Gerais - MG, durante os meses de outubro a abril de 2000, analisando o leite

cru, o leite pasteurizado resfriado, as mãos e antebraços dos funcionários, a

salmoura, a água de imersão das fôrmas e o queijo embalado. O resultado da

pesquisa revelou contagens elevadas de Staphylococcus spp. coagulase positiva e

de S. aureus (4x103 a 4,8x106 UFC/mL e 4x103 a 3,3x105 UFC/mL,

respectivamente), que foram encontradas em quatro avaliações no leite cru. Após a

pasteurização, as contagens foram reduzidas a <1 UFC/mL. Em três das cinco

avaliações, o queijo prato apresentou contagens de ECP (104, 105 e 2,3x105 UFC/g)

superiores às permitidas pela legislação vigente. A água de imersão das fôrmas e a

salmoura apresentaram contagens de ECP e S. aureus inferiores a 1 UFC/mL não

se constituindo em importantes fontes de contaminação. As mãos e os antebraços

dos funcionários foram possivelmente as fontes de contaminação do queijo, isto é,

alta contagem nos queijos estava associada à contagem elevada nas mãos (4x102

UFC/cm2) ou nos antebraços (4,7x102 e 3,3x103 UFC/cm2) dos manipuladores.

65

Existem relatos de casos de Staphylococcus spp. crescendo e sintetizando

enterotoxinas antes do tratamento térmico e dada a resistência térmica das

enterotoxinas, numerosos surtos têm ocorrido com leite e derivados (BOARI et al.,

2003). Exemplos incluem leite em pó na Índia, doce de leite e leite achocolatado,

que nos EUA envolveu 500 crianças em uma escola. Intoxicação estafilocócica em

crianças ocorre com freqüência por causa do uso de leite cru em fórmulas infantis,

leite em pó onde a baixa atividade de água age como mecanismo seletivo para o

crescimento de S. aureus, um vez que este microrganismo possuem habilidade de

crescimento nestas condições que são adversas para a maioria das outras

bactérias. Somado a baixa atividade de água está a temperatura de armazenagem

destes produtos (BOARI et al., 2003; VARNAN; EVANS, 1996).

O S. aureus cresce bem em diversos tipos de vegetais, todavia em vegetais

não cozidos são geralmente inibidos pelos microrganismos acompanhantes. Seu

envolvimento em surtos onde os veículos são pratos a base de vegetais,

normalmente dá-se pela contaminação cruzada (manipulação), uma vez que,

saladas habitualmente são preparadas com as mãos. Em conservas vegetais o

crescimento geralmente ocorre devido a resistência dos Staphylococcus spp. ao

efeito antimicrobiano dos componentes aniônicos que provavelmente inibe os

microrganismos competidores (HOBBS; ROBERTS, 1998; VARNAN; EVANS, 1996).

Os produtos de confeitaria estão freqüentemente envolvidos nos surtos de

intoxicação alimentar por S. aureus. Na maioria dos casos, os microrganismos

sobrevivem ao curto tempo de cozimento e possui habilidade crescer no produto nas

temperaturas de armazenagem, que geralmente são temperaturas ambiente ótimas

ao crescimento dos mesmos. Em outro casos, os microrganismos crescem e

produzem enterotoxinas durante o preparo das massas antes do cozimento. Existe

relatos não confirmados de intoxicação estafilocócica pelo consumo de pão, onde se

acredita que a contaminação ocorra no fatiamento (VARNAN; EVANS, 1996).

De acordo com Frazier e Westhoff (1993), proteínas e amido em abundância

parecem estimular a produção de toxinas, o que justifica a alta ocorrência de surtos

por intoxicações estafilocócicas onde produtos de confeitaria são altamente

incriminados como responsáveis.

A contaminação microbiológica dos alimentos tem sido objeto de preocupação

constante em diversos países. Os casos notificados constituem somente uma

pequena parcela do número total, contudo estima-se que o nos EUA entre um a dois

66

milhões de pessoas são acometidas por gastrenterites provocadas por toxinas

estafilocócicas presentes, sobretudo em produtos de origem animal (JAY, 2005).

No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, foram registrados 593.212

casos de intoxicação alimentar entre 1984 e 1997, porém sem especificar as toxinas,

os microrganismos ou as fontes envolvidas. Estes dados, possivelmente

subestimados devido ao pouco número de notificação de surtos, demonstram a

relevância das medidas de controle sanitário dos alimentos destinados ao consumo

humano, particularmente das matérias primas de origem animal (FAGUNDES;

OLIVEIRA, 2004), pois como descrito por Vara et al. (2000), o S. aureus constitui o

agente causal mais freqüente nos surtos, ainda que nos últimos anos, outros

patógenos como a Salmonella spp., E. coli e Shigella spp. tenham sido reportadas

como agente causal de alguns surtos. Estima-se que a intoxicação por enterotoxina

estafilocócica seja a mais prevalente nos surtos de enfermidades transmitidas por

alimento. Embora no Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde entre 1997 e

2001, a vigilância epidemiológica de ETA registrou a Salmonella spp. como principal

agente e, em segundo lugar, o S. aureus (BRASIL, 2002), situação idêntica a nossa

é reportada no Chile, segundo Prado et al. (2002) o agente causal mais freqüente

em surtos é a Salmonella spp. seguida pelo S. aureus.

Inúmeros surtos de intoxicação alimentar causados pela ingestão de

alimentos contendo enterotoxinas estafilocócicas pré-formadas são descritos na

literatura (JAY, 2005). Em função do risco à saúde coletiva que sua presença

representa em alimentos, estabeleceu-se, em diversos países, a obrigatoriedade de

sua pesquisa e enumeração de Staphylococcus spp. coagulase positiva, como parte

das ações de fiscalização sanitária de órgãos governamentais (SILVA; GANDRA,

2004).

Além de constituir um grave problema de saúde coletiva, a partir da

ocorrência de ETA, Pereira et al. (2000) aduz que, nos últimos anos o surgimento de

microrganismos multiresistentes constituem um problema relevante no controle de

infecções e terapêutica. S. aureus resistente a meticilina (“MRSA”) tem sido descrito

como o principal patógeno nosocomial em todo o mundo, capaz de causar uma

grande variedade de infecções. Algumas linhagens “MRSA”, denominadas linhagens

epidêmicas (“EMRSA”), são capazes de rapidamente se difundirem entre os

pacientes; uma vez introduzidas em uma instituição, essas linhagens “EMRSA” são

difíceis de controlar e erradicar.

67

Além da vasta resistência aos mais diversos antibióticos, S. aureus pode

ainda apresentar resistência a íons metálicos (arsenato, cádmio, mercúrio) e a

biocidas, tais como acriflavina, cloreto de benzalcônio, cetrimida, e clorexidina. A

seleção e manutenção dessas marcas de resistência se explicam pela presença

desses agentes como poluentes urbanos ou industriais ou mesmo o uso hospitalar

como antisséptico (HIRAMATSU et al., 2001).

Diante do panorama de resistência bacteriana e de sua importância para a

saúde pública, foram analisadas 61 carcaças de frango comercializadas na cidade

do Recife, entre outubro de 2001 e abril de 2002, sendo 30 amostras in natura, sem

marca, adquiridas em seis mercados públicos e 31 amostras resfriadas, de cinco

marcas, adquiridas em sete supermercados. As amostras foram enviadas ao

laboratório, onde foram processadas para o isolamento de Staphylococcus spp. e

posteriormente submetidas ao teste de sensibilidade microbiana. O antibiótico mais

eficaz foi a vancomicina e o menos a eritromicina. Apesar da baixa ocorrência de

resistência de Staphylococcus spp. à vancomicina, aproximadamente 10% das

cepas, esse resultado é preocupante, pois é o medicamento humano mais utilizado

para combater infecções hospitalares, principalmente as causadas por estafilococos

resistentes ao grupo das penicilinas, incluindo oxacilina, meticilina e amoxicilina.

Este fato também constitui um alerta para médicos veterinários, pelo fato da

eritromicina ser rotineiramente empregada no tratamento de doenças de aves,

podendo a longo prazo trazer conseqüências indesejáveis, como o desenvolvimento

de Staphylococcus spp. resistentes à eritromicina (FREITAS et al., 2004).

2.5.3 Fatores que afetam o crescimento do S. aureus em alimentos Em relação aos fatores de crescimento do S. aureus, de início ressalta-se o

contraste entre a menor resistência da forma bacilar e a tenacidade da enterotoxina

à ação do calor (PARDI et al., 2001).

Embora sejam mesófilas, algumas linhagens de S. aureus podem crescer a

temperaturas até 6,7ºC. De acordo com os resultados de pesquisas linhagens

causadoras de intoxicação alimentar podem crescer em creme de ovos a 45,5ºC,

mas diminuíram a 46,5ºC e a 49ºC com o tempo de incubação. Em temperaturas

mais elevadas, como acontece no cozimento, ou nos primeiros momentos da

68

preparação culinária, comprovou-se que há ligeira proliferação na salada de

presunto a 44,4ºC, enquanto que no frango cozido e recheado (“ao rei”), a esta

mesma temperatura, desenvolveram-se quantidades comparativamente superiores

(PARDI et al., 2001). Em geral, o crescimento ocorre na faixa de 7 a 47,8ºC, e as

enterotoxinas são produzidas entre 10ºC e 46ºC, contudo, a temperatura ótima está

entre 40ºC e 45ºC. As temperaturas mínimas e máximas de crescimento e produção

de enterotoxinas assumem condições ótimas diferentes de acordo com outros

parâmetros (JAY, 2005).

Mesmo com estresse térmico, culturas de S. aureus podem ter habilidade em

sintetizar enterotoxinas, coagulase e termonuclease. Linhagens produtoras de “SEB”

parecem ter maior resistência térmica. Em alguns estudos foi comprovada a relativa

resistência das células bacterianas, e foi verificado que nem sempre a pasteurização

destrói o S. aureus (VARNAN; EVANS, 1996).

Ainda sobre a termorresistência, pesquisadores afirmam que nem sempre a

pasteurização destrói os Staphylococcus spp., sendo possível matar um milhão de

células por mililitro ou grama de alimento, à temperatura de 66ºC, por pelo menos 12

minutos, ou a 60ºC, durante um período de 78 a 86 minutos. A resistência ao calor

varia de acordo com o tipo de alimento e a estirpe de Staphylococcus spp. Em razão

da resistência das enterotoxinas à pasteurização e às temperaturas de cocção

aplicadas no âmbito da culinária, indica-se a esterilização a 117ºC para inativá-las

com mais segurança, contudo, alguns autores relatam que para se destruir a

enterotoxina, é necessário tratamento drástico como, por exemplo, a autoclavagem

a 121ºC, durante 30 minutos. A toxina não inteiramente inativada pode, embora

parcialmente, reconstituir-se nos alimentos mantidos a 25ºC por 24 horas (JAY,

2005; PARDI et al., 2001; SILVA; GANDRA, 2004).

As enterotoxinas são bastantes resistentes ao calor. A atividade biológica da

“SEB” foi mantida após o aquecimento por 16 horas, a 60ºC e em pH 7,3. O

aquecimento de uma mistura de enterotoxinas por 30 minutos, a 60ºC, não resultou

em mudanças nas reações sorológicas. O aquecimento de “SEE” a 80ºC, por três

minutos, ou a 100ºC, por um minuto, causou a perda da sua capacidade de reagir

sorologicamente. A “SEC” se mostrou mais termorresistente que a “SEA” ou “SEB”

em tampão fosfato salino. A resistência relativa ao aquecimento dessas três

enterotoxinas foi “SEC” > “SEB” > “SEA” (JAY, 2005).

69

As células de S. aureus são sensíveis a doses de irradiação de 0,5 a 2KGy,

porém estudos afirmam que doses entre 0,3 e 0,5KGy são suficientes para inativar

este microrganismo. No uso da irradiação na conservação de alimentos, no caso dos

estafilococos deve ser ressaltado que na ausência dos microrganismos de

deterioração, normalmente, destruídos com este tratamento, a habilidade de crescer

rapidamente dos estafilococos pode ser considerada um fator de risco a segurança

alimentar (PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Considerando o pH, o S. aureus pode multiplicar-se ente 4,0 e 9,8, mas sua

faixa ótima está entre 6,0 e 7,0. Assim como para outros parâmetros de crescimento,

o valor mínimo de pH necessário para o crescimento depende de quão próximos das

condições ideais estão os demais parâmetros. Em maionese caseira, enterotoxinas

foram produzidas quando o pH inicial estava tão baixo quanto 5,15, e o pH final de

crescimento não foi inferior a 4,7. Em geral, a produção de “SEA” é menos sensível

ao pH que a produção de “SEB”. O tamponamento de um meio de cultura em pH 7,0

acarreta maior produção de “SEB” do que quando o meio não é tamponado ou

tamponado em pH ácido (JAY, 2005).

O pH ideal para o crescimento e produção de enterotoxinas pelo S. aureus,

está relacionado com diversos fatores, em especial, a condição de anaerobiose. Em

condição de aerobiose, a habilidade de crescer e produzir enterotoxinas por este

microrganismo ocorre com o pH mínimo de 4,0, já em anaerobiose, os valores

limites são pH 4,6 e 5,3, respectivamente. Estudos revelam que há alguma variação

de pH de acordo com o sorovar envolvido, em condições aeróbicas os valores

mínimos para a produção de enterotoxinas foram: “SEA” 4,9; “SEB” 5,0; “SEC2” 4,9;

“SEE” 4,8; e os valores correspondentes em anaerobiose foram: “SEA”, “SEB” e

“SEC2” 5,7; e “SEE” 6,0 (VARNAN; EVANS, 1996).

De acordo com os autores, supra citados, a natureza do acidulante também

possui considerável importância na determinação do valor mínimo de pH necessário

para o crescimento e produção de enterotoxinas. O pH limite para “SEA” é 4,5

quando usado ácido clorídrico, mas quando é usado ácido lático o pH é 5,0, o que

deve ser considerado de extrema importância nas formulações do alimentos.

Os Staphylococcus spp. são os únicos microrganismos capazes de crescer

em atividade de água menores que outras bactérias não halofílicas. O crescimento

foi demonstrado com valores abaixo de 0,83 em condições ideais, embora 0,86 seja

70

reconhecido como valor mínimo de Aa para o crescimento e produção de

enterotoxinas (FRANCO; LANDGRAF, 2002; JAY, 2005).

O valor mínimo de Aa para o crescimento e produção de enterotoxinas por

estafilococos varia de acordo com o umectante utilizado, entre outros fatores, onde a

produção de “SEB” possui com limite Aa entre 0,98 e 0,99 quando o glicerol é

utilizado como umectante, em contrapartida com o NaCl a Aa requerida está entre

0,90 e 0,92 (VARNAN; EVANS, 1996).

O S. aureus é um microrganismo halotolerante, com capacidade de

crescimento em concentrações de 0 a 10-20% de NaCl. Na maioria dos alimentos

ocorre a redução do crescimento com o NaCl em concentrações entre 5-7%, sendo

que nos produtos fermentados as concentrações de NaCl são geralmente menores,

então os estafilococos podem alcançar altos níveis de crescimento. Contudo, nestes

produtos as culturas bacterianas próprias são os inibidores dos estafilococos, dentre

outros patógenos (FRANCO; LANDGRAF, 2002; VARNAN; EVANS, 1996).

Em interações entre a concentração de NaCl e pH, autores observaram que

utilizando um meio com proteína hidrolisada, incubado a 37ºC por oito dias, ocorreu

o crescimento e produção de enterotoxina C em pH de 4,00 a 9,83 sem NaCl. Com

4% de NaCl, a faixa de pH restringiu-se a 4,4 a 9,43. Toxinas foram produzidas com

uma concentração de 10% de NaCl e pH 5,45 ou superior, mas não com 12% de

NaCl. Em geral, o aumento da concentração de NaCl aumenta o pH mínimo (JAY,

2005).

O S. aureus é normalmente considerado resistente ao nitrito, em um estudo

para verificar o efeito deste ingrediente sobre a produção de enterotoxina constatou-

se que 200mg/L de nitrito não inibiu a produção de enterotoxina B, contudo um

pequeno efeito inibitório ocorre em combinação com 2% de NaCl. Algumas

observações envolvem as normais concentrações de sal e demais ingredientes de

cura na indústria, apontando para a inibição da formação de enterotoxina, o que

ocorre com um aporte abundante de oxigênio. Na ausência de oxigênio, houve a

suspensão da toxina, ainda que os microrganismo continuassem a se desenvolver

de modo limitado (PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

O S. aureus compete pobremente com outros microrganismos e raramente

alcança número significativo, ou produz quantidade significante de enterotoxina

quando os microrganismos de deterioração estão presentes. O efeito inibitório das

bactérias ácido-lácticas, é de particular interesse, uma vez os S. aureus constituem

71

um perigo nos produtos fermentados, as bacteriocinas produzidas pelas bactérias

ácido-lácticas atuam sobre microrganismos patógenos, entretanto, alguns S. aureus

possuem habilidade de adaptação ao efeito inibitório das bacteriocinas (JAY, 2005;


2.5.4 Medidas preventivas

Para se delinear um plano de controle da intoxicação estafilocócica, deve-se

partir da premissa que é fundamental evitar a contaminação, impedir o crescimento

de microrganismo e destruir os estafilococos presentes no alimento. Pode-se evitar a

contaminação, com a adoção de medidas gerais de higiene do ambiente nos

estabelecimentos, do equipamento e utensílios em geral, a do pessoal e do

transporte no recinto da indústria evitando-se maus hábitos e a ocorrência de

resfriados, feridas e outras fontes de microrganismo. Devem ser tomados cuidados

especiais, inclusive com o pessoal sadio, quanto à higiene das mãos que deverá ser

rotineira, como acontece nas indústrias sob inspeção federal. Este procedimento é

plenamente justificável, ao se reconhecer o homem como principal veículo de

contaminação do S. aureus. A automatização do processamento de alimentos,

reduzindo ao mínimo a manipulação é uma prática recomendável desde que tais

equipamentos sejam corretamente sanificados (PARDI et al., 2001).

Alimentos susceptíveis que apresentam baixas contagens de Staphylococcus

spp. permanecerão livres de enterotoxinas e outros riscos de intoxicação se

mantidos abaixo de 4,4ºC ou acima de 60ºC até serem consumidos. Entre os surtos

identificados, os cinco fatores mais freqüentemente desencadeadores dos mesmos

foram: refrigeração inadequada; alimentos preparados com muita antecedência;

manipuladores infectados com maus hábitos de higiene pessoal; cozimento ou

processamento inadequado; alimentos mantidos sob aquecimento em temperaturas

que favorecem o crescimento microbiano e/ou a produção de enterotoxinas. A

refrigeração inadequada representou sozinha, 25,5% dos fatores contribuintes para

a ocorrência dos surtos, os cinco fatores contribuíram com o desencadeamento de

68% dos surtos (JAY, 2005).

A fim de prevenir a ocorrência de Staphylococcus spp. em alimentos, podem

ser indicados a pasteurização dos produtos que comportam esta prática e o uso

72

sistemático da refrigeração para aqueles sujeitos a contaminação, pois alimentos

susceptíveis não devem ser mantidos dentro da faixa de temperatura de crescimento

dos Staphylococcus spp. por mais de três a quatro horas. A ausência total de

Staphylococcus spp., ou sua baixa contagem nos alimentos, desde que se adotem

cuidados preventivos em geral, não permitirá contaminações em níveis alarmantes

quanto à formação de enterotoxinas, além de levar as fatais contaminações pelos

microrganismos concorrentes a inibir ainda mais seu crescimento (HOBBS;

ROBERTS, 1998; PARDI et al., 2001).

Ademais se deve evitar a todo custo a contaminação cruzada, pois mesmo

em ambientes irrepreensivelmente limpos, desde que haja contaminação e

condições favoráveis, os Staphylococcus spp. multiplicam-se rapidamente, em

virtude da falta de competidores. Se a contaminação cruzada for muito difícil de

evitar, a melhor providência é inibir a multiplicação a partir da refrigeração com

temperaturas abaixo de 5ºC durante a produção, distribuição e venda dos alimentos

(LANCETTE; BENETT, 2001; PARDI et al., 2001).

O uso de temperatura baixa e embalagem a vácuo é um método excelente de

prolongamento do tempo em que o produto pode permanecer nas prateleiras, em

virtude da inibição da flora aeróbica. A temperatura, neste caso, deverá ser mantida

em nível baixo, pois os Staphylococcus spp. crescem e produzem enterotoxinas

anaerobicamente. Até o presente momento, a utilização de temperatura baixa é o

método mais indicado para a prevenção de produção de enterotoxina (FRANCO;

LANDGRAF, 2002; PARDI et al., 2001).

O uso de antibióticos resulta na seleção de linhagens de microrganismos

resistentes e na eliminação do efeito competitivo da microflora dos alimentos.

Estuda-se o uso de substâncias químicas e/ou espécies competidoras encontradas

naturalmente no alimento. O uso de radiações ionizantes, têm sido estudado, com a

ressalva de que com a eliminação dos microrganismos de deteriora pode haver

facilitação à colonização por Staphylococcus spp. e que as radiações não eliminam

as enterotoxinas pré estabelecidas. A liofilização de alimentos é um método de

prevenção contra os microrganismos inicialmente presentes (PARDI et al., 2001;


Além das medidas anteriormente citadas, convém ressaltar a importância da

educação sanitária, nos supermercados, casas de carnes, principalmente nos

estabelecimentos onde os produtos são fatiados e vendidos dessa forma, assim

73

como, o cozimento adequado dos alimentos, manutenção em temperaturas

superiores a 60ºC, refrigeração dos alimentos úmidos em pequenas quantidades,

evitar que pessoas com infecções respiratórias ou lesões na pele entre em contato

com os alimentos e afastamento dos funcionários que tenham desarranjos

intestinais, combate adequado as moscas, evitar toque nos alimentos que não são

consumidos cozidos e por serem os Staphylococcus spp. capazes de viver em

qualquer ambiente, um cuidado especial com as varreduras e remoção de pó nas

dependências de manipulação (PARDI et al., 2001).

2.6 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DO Clostridium perfringens O gênero Clostridium compreende mais de 60 espécies, pertencente a família

Bacillaceae, composta por microrganismos Gram-positivos, móveis ou imóveis,

formadores de esporos ovais ou esféricos. Produtores de ácidos e álcoois a partir de

carboidratos e peptonas. Podem ser proteolíticos, sacarolíticos, nenhum dos dois ou

ambos, podem metabolizar carboidratos, álcoois, aminoácidos, purinas, esteróides,

entre outros componentes orgânicos. Algumas espécies fixam o nitrogênio

atmosférico. Geralmente são catalase negativa, contudo algumas cepas podem ser

positivas. A grande maioria das espécies são obrigatoriamente anaeróbicas, porém

algumas possuem certa tolerância ao oxigênio onde ocorre o crescimento; contudo,

não ocorre a esporulação em presença do ar atmosférico (SNEATH, 1986;

TRABULSI; TOLEDO, 1998).

Dentre as diversas espécies deste gênero o Clostridium perfringens

caracteriza-se por ser um membro típico, praticamente não esporula em condições

habituais de cultura, seus esporos são relativamente pouco resistente ao calor,

destruindo-se pelo aquecimento a 100ºC em cinco minutos e a 80ºC em 30 minutos;

porém alguns esporos resistem a 100ºC por uma hora ou mais. O choque térmico

geralmente provoca a germinação dos esporos (LABBE, 2001; SNEATH, 1986;

TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNAN; EVANS, 1996).

O C. perfringens é um mesófilo, com temperaturas de crescimento entre 37ºC

e 45ºC, com temperaturas mínima de crescimento em torno de 15-20ºC e máxima

em torno de 50 e 51,7ºC, sendo 40-45ºC sua temperatura ótima de crescimento e

para esporulação 35-40ºC. Com respeito ao pH, crescem e esporulam bem a pH

74

situado entre 6,0 e 7,0, mas geralmente não crescem abaixo de 5,0 nem acima de

8,5. Está largamente distribuído nos solos e água, e usualmente está presente no

trato intestinal de homens e animais (FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY, 1994).

Produzem uma série de proteínas biologicamente ativas, algumas com

atividade tóxica e outras com atividade enzimática. Possui intensa atividade

metabólica em alimentos. É capaz de produzir uma série de enzimas hidrolíticas

extracelulares, incluindo colagenases, hialurinadeses, deoxirribonucleases,

proteinases que hidrolizam a caseína e a gelatina, e lecitinase que algumas vezes é

utilizada para identificar a presença de C. perfringens, todavia sua ausência não

descarta a possibilidade da presença do microrganismo em questão (FRANCO;


O C. perfringens é um importante agente patogênico causador de intoxicação

alimentar, enterites em humanos e enterotoxemia em animais domésticos. Este

microrganismo produz em torno de 15 toxinas, e divide-se em cinco tipos

toxigênicos, denominados A, B, C, D e E, que se diferenciam com base na produção

de toxinas. Cepas pertencentes aos C. perfringens tipo A, e algumas cepas dos tipos

C e D causam intoxicação de origem alimentar. As cepas de C. perfringens tipo A

estão relacionadas com ETA, e têm sido associadas à casos de diarréia infantil,

inclusive síndrome da morte súbita infantil e diarréia em recém nascido, embora esta

relação não esteja bem definida. Além de possuir relação com inúmeras doenças

extraintestinais no homem e animais, inclusive a gangrena gasosa (mionecrose

clostridial), hemólise intravascular e septicemia, o C. perfringens é também

comumente isolado de abcessos abdominais, peritonites, celulites, abcessos pré-

retais, colangites, lesões cutâneas e subcutâneas entre outras infecções tissulares

(STAGNITTA; MICALIZZI; GUZMÁN, 2002; TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNAN;

EVANS, 1996).

Outras espécies de C. perfringens são agentes causadores de enfermidades

de seres humanos e animais. O C. perfringens tipo C é o agente da enterite

necrótica (“pigbel”), que é uma doença de origem alimentar que atinge ao homem,

enquanto os tipos B e C causam enterite necrótica e enterotoxemia em animais de

criação (VARNAN; EVANS, 1996).

75

2.6.1 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or C. perfringens O C. perfringens é um dos microrganismos mais comumente envolvidos em

ETA. Os alimentos geralmente envolvidos são os derivados cárneos ou de aves

cozidos contendo um grande número de células viáveis. As linhagens do tipo A são

as mais encontradas como causadoras de intoxicação alimentar, assim como as

clássicas linhagens da gangrena gasosa. Ao contrário destas, as linhagens

enterotoxigênicas são geralmente termorresistentes. Algumas linhagens do tipo C

produzem enterotoxinas e podem causar intoxicação alimentar, sendo a

enfermidade mais grave denominada enterite necrótica (LABBE, 2001; JAY, 2005).

A toxina termolábil é produzida a partir da esporulação das células ingeridas

ao nível do intestino e é responsável pelos sintomas desta enfermidade. É

importante salientar que tal toxina geralmente não se forma no alimento, contudo

aquele que apresente condições ideais para esporulação pode conter enterotoxina

(PARDI et al., 2001).

A intoxicação alimentar por C. perfringens tipo A caracteriza-se pelos

seguintes sinais e sintomas: dor abdominal aguda, diarréia e náusea, em alguns

casos a náusea é acompanhada por vômitos e febre raramente. O período de

incubação varia entre 8-22 horas, podendo ser curto em torno de 6 horas. A dose de

infecção varia de 106 a 108 células bacterianas. Exceto em idosos, crianças ou

imunodeprimidos, a enfermidade tem duração média de um ou dois dias. A taxa de

mortalidade é baixa, e tudo indica que a enterotoxina não provoca imunidade,

contudo anticorpos circulantes podem ser encontrados em indivíduos com histórico

da doença (JAY, 2005; PARDI et al., 2001; SILVA JUNIOR, 2001; VARNAN;

EVANS, 1996).

O fator causal da intoxicação por C. perfringens é a enterotoxina sintetizada

por células esporuladas nos estágios tardio da esporulação. Esta toxina liga-se à

proteínas receptoras nas células epiteliais do trato intestinal, que levam à alterações

nas membranas celulares e a morte das células por lise ou distúrbios de

metabolismo. A enterotoxina é citotóxica, provocando danos às células epiteliais das

pontas das vilosidades (JAY, 2005).

No caso da enterite necrótica causada pelo C. perfringens tipo C, os sintomas

podem ser atribuídos à ação da β-toxina que promove alterações na mucosa,

reduzindo a mobilidade das vilosidades e assim permitindo o ataque bacteriano. A

76

____________ 8HOBBS, B. et al. Clostridium welchii food posoning. J. Hyg., v. 51, p. 75-101, 1953.

absorção da toxina causa a necrose da mucosa intestinal. Observa-se dor severa na

região umbilical, na maioria dos casos ocorre constipação, mas fezes

sanguinolentas podem ocorrer. Vômitos não são freqüentes; febre, letargia,

desidratação são sintomas comuns, mas em alguns casos não estão presentes. A

mortalidade é alta em torno de 30-40% (JAY 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

2.6.2 Epidemiologia

O C. perfrigens tem como habitat normal o solo e o trato intestinal do homem

e de outros animais de sangue quente, existindo variações na distribuição de acordo

com o tipo de microrganismo. O tipo A faz parte habitualmente da microbiota

intestinal de homens e animais, tendo sido freqüentemente isolado das fezes de

ambos; os tipos B, C, D e E parecem ser parasitas obrigatórios, são isolados dos

animais, mas ocasionalmente podem se isolados do homem. Esta associação com o

trato intestinal faz com que este microrganismo esteja freqüentemente presente nos

cursos d’água, como resultado da poluição ambiental, pode estar presente em

sedimentos marinhos e sua presença em água potável pode ser usada como

indicação de poluição fecal remota (SIQUEIRA, 1995; VARNAN; EVANS, 1996).

As intoxicações microbianas por C. perfringens vêm recebendo nos últimos

anos maiores atenções. Possivelmente a elevada incidência deva-se aos avanços

nos métodos anaeróbicos utilizados para sua detecção. Na década de 40, quando

ainda denominado C. wechii, o atual C. perfringens era utilizado como indicador da

poluição hídrica, devido a sua capacidade esporogênica e resistência de seus

esporos, pois ao estar presente nas fezes, no esterco e no esgoto, era carreado

para as águas nas mesmas condições que os coliformes, em razão de possuírem

maior resistência que estes, indicando poluição remota, mesmo na ausência dos

coliformes (PARDI et al., 2001).

Embora o C. perfringens esteja associado com casos de gastrenterites desde

1895, a primeira demonstração de sua importância etiológica nas intoxicações foi

feita por McClung, ao investigar quatro surtos, nos quais o frango foi o alimento

incriminado. Hobbs et al. (1953 apud8 JAY, 2005) na Grã Bretanha, foram os

primeiros a estudar os detalhes característicos desta doença. Embora os

pesquisadores britânicos estivessem mais informados sobre o microrganismo como

77

causa de intoxicações alimentares durante as décadas de 50-60, alguns incidentes

foram notificados nos EUA até 1960. Atualmente, a intoxicação por C. perfringens

está bastante difundida tanto nos EUA como em outros países (JAY, 2005).

De acordo com Frazier e Westhoff (1993), em relação aos aspectos

epidemiológicos, as seguintes condições são necessárias para a presença de um

surto de intoxicação por C. perfringens: (1) que o alimento esteja contaminado com

este microrganismo; (2) que trate-se de um alimento cozido e que nele haja

condições necessárias para a multiplicação bacteriana; (3) que tal alimento não

tenha sido refrigerado convenientemente, permitindo a partir de uma temperatura

ideal de crescimento para o microrganismo em questão, que este multiplique-se

abundantemente; (4) que o alimento seja consumido sem um novo aquecimento, de

forma que um grande número de células bacterianas sejam ingeridas e (5) que estas

células esporulem e elaborem enterotoxinas. Sendo importante ressaltar que tais

condições são um retrato real das situações descritas nas ocorrências de surtos de

intoxicação alimentar causada por C. perfringens.

As linhagens enterotoxigênicas encontram-se no solo, na água, em

alimentos, na poeira, em especiarias, tendo sido detectada uma prevalência de

65,7% de espécies do gênero Clostridium em diferentes condimentos vegetais de

uso comum na indústria de embutidos (OLIVEIRA; FRANCO; CARVALHO, 1994) e

no trato intestinal de homens e outros animais. Diversos autores têm afirmado que a

incidência de linhagens não-hemolíticas e termorresistentes oscila entre 2 e 6% da

população geral. Os tipos termolábeis são comuns no trato intestinal de humanos,

podendo ser transmitidos para as carnes no momento do abate ou pela

contaminação posterior por utensílios, manipuladores ou poeira. Por ser formador de

esporos ressalta-se o fato deste microrganismo resistir à condições adversas como

dessecação, aquecimento e à ação de determinados compostos tóxicos (JAY,

2005).

Alimentos a base de carne bovina e de frango têm sido os principais

causadores de intoxicação alimentar por C. perfringes. Em virtude da alta

prevalência do C. perfringens no trato intestinal dos animais, dificilmente consegue-

se evitar a contaminação da carne fresca, devendo-se então sempre ser

considerada a possibilidade de sua ocorrência. A maioria dos surtos relatados é

associada à alimentação em estabelecimentos institucionais, como restaurantes,

78

hospitais, fábricas e escolas (FRANCO; LANDGRAF, 1996; PARDI et al., 2001;

VASCONCELOS; IARIA, 1991).

O C. perfringens é comumente encontrado em carnes bovinas e de aves,

alimentos desidratados como sopas, vegetais, condimentos/especiarias entre outros

alimentos. O nível de contaminação reflete diretamente as condições higiênico-

sanitárias de obtenção e processamento destes alimentos. A incidência é variável,

estando de acordo com a qualidade da matéria-prima e as condições de

processamento dos alimentos. Tem sido reportado algo em torno de 70% dos casos

terem como alimentos incriminados as carnes e seus derivados; contudo, produtos

curados raramente são incriminados devido à ação dos agentes de cura sobre o

Clostridium spp. (LABBE, 2001; OLIVEIRA; FRANCO; CARVALHO, 1994; VARNAN;

EVANS, 1996).

É extrema a ubiqüidade de C. perfringens. As intoxicações por este

microrganismo são freqüentes, onde a gastrenterite provocada pelo C. perfringens

permanece como uma das doenças de origem alimentar mais comuns, associadas

ao consumo de carnes, principalmente ao consumo de “roast beef” e a carne de ave

aquecida, acompanhadas de molhos, sucos e decorações cozidos no dia anterior ou

horas antes da ingestão e que sofreram um resfriamento lento. Um cozimento

moderado mata as células vegetativas e a flora microbiana competidora da carne,

mas ativa os esporos sobreviventes, que podem, eventualmente, germinar e crescer

no baixo meio redox da grande peça de carne cozida e resfriada lentamente (PARDI

et al., 2001).

Em relação ao leite, a presença de C. perfringens geralmente ocorre pela

contaminação com fezes, desta forma freqüentemente encontra-se este

microrganismo no leite cru, ou pasteurizado onde se torna causa de deterioração.

Contudo, surtos com envolvimento de leite ou derivados lácteos têm sido pouco

reportados. Há descrição de um surto envolvendo queijo que foi fatiado com o

mesmo utensílio utilizado em carne crua, e um outro surto envolvendo um pudim que

permaneceu “morno” por um longo período, ou seja, refrigerado inadequadamente.

No caso do pescado, existe a possibilidade da presença do C. perfringens no

mesmo. Nos EUA, peixes são freqüentemente envolvidos em intoxicações por C.

perfringens. No Reino Unido, foi relatado um surto envolvendo mais de 800 pessoas,

a partir de um incidente ocorrido em dois dias consecutivos envolvendo um salmão

que havia sido armazenado por um longo período entre o cozimento e o consumo.

79

Em relação a outros alimentos, como as saladas de verduras, de legumes,

condimentos e especiarias, também já relatados em surtos, a contaminação

provavelmente ocorra a partir do solo ou da água (VARNAN; EVANS, 1996).

Em relação aos portadores humanos, têm o C. perfringens tipo A como um

membro comum da flora intestinal, onde cerca de 80 a 100% da população sadia

excreta este microrganismo. O microrganismo também pode fazer parte da flora

normal oral e vaginal de algumas pessoas, podendo estar presente na urina. Desta

forma os manipuladores de alimentos podem ser veículos da infecção (VARNAN;

EVANS, 1996).

2.6.3 Fatores que afetam o crescimento do C. perfringens em alimentos A temperatura é o mais importante fator no controle do C. perfringens. O

microrganismo poderá crescer em temperaturas abaixo de 6ºC, mas o crescimento

na maioria das vezes está escasso em temperaturas entre 15-20ºC, sendo o

resfriamento a 10ºC uma medida de controle significante, além do fato das células

vegetativas não resistirem ao congelamento ou longos períodos de refrigeração,

porém alguns esporos podem sobreviver. Outro ponto relevante é que o crescimento

nunca ocorre até duas horas após a cocção, o que significa dizer que se o

resfriamento ocorre em até duas horas a segurança está garantida. Todavia, o

crescimento é extremamente rápido a temperaturas em torno de 45ºC, com período

de geração de 10-12 minutos, e em alguns casos sete minutos. A temperatura

máxima de crescimento é em média 50ºC, por esta razão, os alimentos devem ser

aquecidos antes de servir no mínimo a 60ºC, sendo 75ºC a temperatura considerada

ideal. De acordo com diversos autores, as temperaturas ótimas para crescimento

estão na faixa de 30-48ºC e para esporulação entre 37-40ºC (FRANCO;

LANDGRAF, 1996; LABBE, 2001; PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Em relação à termorresistência, as células vegetativas são destruídas em

média a 75ºC. Esta temperatura deve ser alcançada no reaquecimento dos

alimentos antes do consumo. Contudo, em relação ao esporos, estes se dividem em

duas categorias com respeito a termorresistência, onde a sobrevivência a 100ºC

pode ser de poucos minutos a até quatro horas. Os valores D90 para as cepas

termorresistentes não-hemolíticas está em torno de 15-145 minutos, e para as cepas

80

termolábeis hemolíticas em média de seis a sete minutos. E a toxina termolábil é

destruída a 60ºC por dez minutos. Desta forma o tratamento térmico associado aos

ingredientes de cura contribui para maior segurança dos produtos cárneos cozidos e

curados (LABBE, 2001; PARDI et al., 2001).

O C. perfringens cresce em valores de pH entre 5,0 e 9,0, contudo estes

valores interagem com outros fatores, como a natureza do acidulante utilizado e a

temperatura, mas de maneira geral não crescem em valores abaixo de 5,0 ou acima

de 8,5 (VARNAN; EVANS, 1996; JAY, 2005).

Na presença de NaCl o limite de atividade de água (Aa) para o C. perfringens

é de 0,95 a 0,96. Os valores variam de acordo com o umectante presente. É

importante salientar que os valores de Aa estão diretamente relacionados ao pH e a

temperatura, devendo portanto ser considerado tal interação (VARNAN; EVANS,

1996). Outros autores relatam que Aa mínima para o crescimento é de 0,97, embora

existam registros onde Aa mínima para o crescimento e germinação de esporos em

presença de NaCl ou sacarose encontram-se em torno de 0,95 e 0,97, ou

aproximadamente 0,93 com glicerol (JAY, 2005).

O C. perfringens não é um anaeróbio estrito como os outros clostrídios, sendo

relativamente tolerante ao oxigênio. Seu potencial redox é relativamente alto em

torno de +320-350 mV, dependo do substrato e do valor do pH. O potencial redox da

carne é diminuído por ocasião do cozimento, e o C. perfringens freqüentemente

cresce em condições de aerobiose (LABBE, 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

C. perfringens normalmente não está presente em produtos cárneos curados,

contudo existe a possibilidade de crescimento em algumas concentrações de NaCl e

NaNO2. Em relação aos produtos cárneos curados e cozidos, existe uma

significativa segurança devido aos efeitos associados dos agentes de cura (sal e

nitrito) e o tratamento térmico próprio do processamento tecnológico. As

temperaturas alcançadas estão em torno de 70-90ºC que levam à expressiva

redução das células bacterianas, acrescentando-se o fato de que a presença de

200mg/L de NaNO2 reduz aproximadamente 95% das células e 3,5% de NaCl a

aproximadamente 100%. Os produtos cárneos curados e cozidos dificilmente serão

veículos de infecção deste microrganismo, pois além do processamento térmico e da

presença dos sais de cura, estes alimentos geralmente são mantidos estocados sob

refrigeração (FRANCO; LANDGRAF, 1996; PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS,

1996).

81

O C. perfringens compete pobremente com a maioria dos microrganismos de

deterioração. Sua presença é rara em alimentos tratados termicamente, mas em

algumas ocasiões poderá desenvolver-se caso ocorra uma inibição de outros

microrganismos termoresistentes, como por exemplo, os Enterococcus spp. e os

Lactobacillus spp. (VARNAN; EVANS, 1996).

2.6.4 Medidas preventivas A proteção dos alimentos frente ao crescimento de C. perfringens é

semelhante àquela utilizada contra a maioria dos microrganismos patógenos, onde o

emprego de programas como o APPCC e BPF, que incluem corretas práticas de

higiene, educação sanitária dos manipuladores, desde a obtenção da matéria-prima

até o produto final, reduzem os riscos de contaminação e consequentemente

protegem a saúde do consumidor. A maioria dos surtos causados por C. perfringens

devem-se a produtos cárneos, desta forma cuidados especiais aos mesmos

precisam ser enfatizados. A proteção da carne baseia-se no reduzido crescimento

deste microrganismo a temperatura abaixo de 15ºC, ressaltando que a temperatura

crítica de conservação de produtos cárneos está abaixo de 5ºC. Na alimentação

comunitária ou no âmbito doméstico, e também nas indústrias, os alimentos cozidos

devem ser mantidos sempre acima de 65,5ºC, e caso não venham a ser consumidos

imediatamente resfriá-los a pelo menos 4,4ºC. Na ocasião do reaquecimento dos

alimentos para servir, estes devem alcançar temperaturas em torno de 74ºC no

centro do alimento, e no caso do comércio manter em estufas de aquecimento a

65,5ºC; pois, os fatores que mais contribuem para a ocorrência de surtos

provocados por C. perfringens são: resfriamento inadequado, manutenção a quente

imprópria, preparação do alimento um dia ou mais antes de servi-lo, reaquecimento

inadequado. Considerando o curto tempo de geração, em torno de oito minutos, em

temperatura ótima para o crescimento, ou seja, no estado “morno” em média 45ºC, a

significância desses fatores deve ser ressaltada, principalmente em

estabelecimentos preparadores de alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY,

2005; SILVA JUNIOR, 2001; PARDI et al., 2001).

82

2.7 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS DA Salmonella spp. Os microrganismos do gênero Salmonella, pertencentes à família

Enterobacteriaceae, apresentam as seguintes características: são bastonetes Gram-

negativos, não esporulados, oxidase negativo, catalase positivo, anaeróbios

facultativos, redutores do nitrato a nitrito, geralmente produtores sulfeto de

hidrogênio, fermentadores de carboidratos, normalmente produtores gás a partir da

glicose; a maioria móveis por flagelos peritríquios; o citrato geralmente é usado

como única fonte de carbono; descarboxilam a lisina e a ornitina, não desaminam a

fenilanina e o triptofano e não produtores de urease (BRENNER, 1984; LE MINOR,

1984; VARNAN; EVANS, 1996).

De maneira geral, as Salmonella spp. são mesófilas, crescem na faixa de

temperatura entre 5 e 45ºC, com temperatura ótima de 37ºC. Crescem em pH na

faixa de 4,5 e 9,0, onde valores abaixo do primeiro e acima do segundo são

considerados bacteriostáticos, sendo o pH ótimo entre 6,5 e 7,5 e crescem em

alimentos com atividade de água entre 0,93 e 0,99 (VARNAN; EVANS, 1996).

A resistência das Salmonella spp. varia dependendo do tipo, mas em geral é

elevada. São destruídas quando submetida a 60ºC por 15 minutos, podendo

sobreviver por semanas na água destilada e por um período mais longo nas águas

puras que nas poluídas, em virtude da falta de competição biológica. Não resistem à

exposição direta dos raios solares por mais de oito horas, porém suportam bem a

dessecação, resistindo por 122 horas à luz indireta. Resistem bem às temperaturas

de refrigeração, no entanto o congelamento provoca uma redução significativa no

número de microrganismos, mas nunca a destruição completa (PARDI et al., 2001).

As Salmonella spp. são amplamente distribuídas na natureza, tendo como

habitat primário o trato intestinal de homens e animais, podendo estar presente em

outras partes do corpo. Sendo excretada pelas fezes, freqüentemente contaminam

água e alimentos, que servem como veículos de transmissão. A infecção de homens

e animais é normalmente adquirida mediante a ingestão de alimentos contaminados


A classificação das Salmonella spp. tem variado nos últimos anos, embora

microbiologistas e epidemiologistas considerem os mais de 2600 sorovares de

Salmonella spp. como se cada um fosse uma espécie. Le Minor e Popoff (1987)

agruparam todas as salmonelas em apenas duas espécies, a S. enterica e a S.

83

bongori, onde sorovares foram divididos em cinco subespécies ou grupos, muito dos

quais classificados como S. enterica. Os maiores grupos correspondem às seguintes

subespécies: grupo II (S. enterica subsp. salamae); grupo IIIa (S. enterica subsp.

arizonae); grupo IIIb (S. enterica subsp. diarizonae); grupo IV (S. enterica subsp.

houtenae); e grupo VI (S. enterica subsp. indica). Os organismos pertencentes ao

grupo V foram elevados a espécie como S. bongori (BRENNER, 1984; JAY, 2005;

TRABULSI; TOLEDO, 1998).

É de grande importância epidemiológica, a divisão do gênero Salmonella em

tipos sorológicos, os quais são distribuídos no esquema de identificação prática

denominado de esquema de “Kauffmann e White”. Este esquema tem por base a

composição antigênica das salmonelas com relação a similaridade no conteúdo de

um ou mais antígenos, que se distinguem em: antígenos somáticos (O), antígenos

capsulares (K) e antígenos flagelares (H). Outros meios bastante empregados são a

fagotipagem, biotipagem, tipagem de bacteriocinas e genotipagem, que empregados

em conjunto contribuem de maneira significativa com os estudos epidemiológicos

(TRABULSI; TOLEDO, 1998; VARNAN; EVANS, 1996).

Ainda com propósitos epidemiológicos, as Salmonella spp. podem ser

distribuídas em três grupos: as que infectam somente o homem, que incluem a S.

Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B e S. Paratyphi C, são os agentes da febre

tifóide e paratifóide, as mais graves de todas as doenças causadas por Salmonella

spp.; os sorovares adaptados aos hospedeiros, que compreendem a S. Gallinarum

(aves), a S. Dublin (gado), S. Abortus-equi (cavalos), S. Abortus-ovis (ovinos) e S.

Cholerasuis (suínos), alguns dos quais são patógenos humanos e costumam ser

adquiridos por meio de alimentos; e os sorovares não adaptados, são os sorovares

patogênicos aos homens e animais, incluindo muitos sorovares causadores de

infecções alimentares (BARRETO; VIEIRA, 2002; FRANCO; LANDGRAF, 1996; JAY

2005; VARNAN; EVANS, 1996).

2.7.1 Gastrenterites de origem alimentar causadas p or Salmonella spp.

As bactérias do gênero Salmonella spp. são agentes freqüentes de surtos de

ETA. Por ser um microrganismo entérico, pode estar presente nos intestinos de

animais de sangue quente e mais raramente, também nos de sangue frio. Em

84

função da sua capacidade de disseminação no meio ambiente, esta bactéria pode

ser isolada de locais variados e diferentes (águas doces superficiais, águas

estuarinas, carnes animais, pescados, verduras, ovos, entre outros) e

consequentemente, de diversas matérias primas alimentares. Podendo ainda ser

veiculada pelo homem, na condição de portador assintomático (FRANCO;


Os sorotipos das salmonelas podem estar estritamente adaptado a um

hospedeiro em particular ou podem ser ubiquitários. O homem é o único reservatório

natural de S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C, estes sorovares normalmente não são

patogênicos aos animais e raramente são transmitidos por alimentos, neste caso a

transmissão pessoa-a-pessoa é a mais importante. Os sorovares ubíquos, como é o

caso da S.Typhimurium, que afetam homens e animais, são geralmente transmitidos

pela água e alimentos contaminados, são responsáveis por infecções gastrentéricas

com severidade variável de acordo com o tipo sorológico, idade e condições de

saúde do hospedeiro. Os sorotipos adaptados a uma determinada espécie animal,

como a S. Abortus-ovis (ovinos) e a S. Gallinarum (aves), geralmente não afetam o

homem. Contudo a S. Cholerasuis, que primariamente causa enfermidades em

suínos, pode afetar ao homem causando doença sistêmica severa que alcança a

maior taxa de mortalidade (21%) dentre as enfermidades causadas por salmonelas,

em razão do curso septicêmico que normalmente a acompanha. Em medicina este

mesmo agente é causa de infecção digestiva assintomática e complicações como

osteomielite, endocardite e osteoartrite (JAY, 2005; PARDI, et al., 2001; VARNAN;

EVANS, 1996).

As Salmonella spp. são responsáveis por graves surtos de toxinfecções

alimentares, sendo os produtos de origem animal os principais veículos de

transmissão deste patógeno e os sorovares não tifóides a principal causa de

enfermidades alimentares em diferentes regiões do mundo. Carnes e derivados

cárneos são reportados como os veículos mais freqüentes deste microrganismo.

Estudos têm revelado que carnes de aves, ovos e seus derivados são os principais

alimentos incriminados em surtos, e que a contaminação normalmente ocorre pós-

processamento, devido a contaminação cruzada entre produtos crus e já

processados, quase sempre associada as pobres condições de higiene dos locais

de processamento e inadequadas temperaturas de armazenagem (CAPITA et al.,

2003; ESCARTIN et al., 1999; GIOMBELLI, 2000; PARDI et al., 2001).

85

Nos casos de febre tifóide e febre entérica, os sintomas são muito graves

devido o desenvolvimento de septicemias. Geralmente aparecem de 10 a 14 dias

após a infecção, todavia o período de incubação pode perdurar até cinco semanas

dependendo da dose de infecção. Inicialmente ocorre anorexia, dor de cabeça e dor

abdominal, acompanhados de febre intermitente em torno de 40ºC. A constipação é

mais freqüentemente relatada do que a diarréia durante vários estágios da doença.

Na maioria dos casos a severidade dos sintomas é mais aparente na segunda

semana de infecção, podendo ocorrer “rash” cutâneo, bradicardia, esplenomegalia e

leucopenia; a partir da terceira e quarta semana a febre declina. A taxa de

mortalidade, em média, é de 10% (VARNAN; EVANS, 1996).

Quanto à S. Typhi, sabe-se que bastam uns poucos microrganismos para que

ocorra infecção, onde doses abaixo de 103 são suficientes para ocorrência da

enfermidade, sendo importante relatar a maior suscetibilidade de crianças e idosos


A enfermidade clínica causada no homem pela ingestão de alimentos

contaminados por Salmonella spp. não tifóides tem um período de incubação de oito

a 36 horas, com extremos oscilando entre cinco e 72 horas, havendo relatos de

períodos tão curtos como três horas em um surto causado por S. Enteritidis PT4,

embora períodos superiores a 72 horas não sejam comuns. São descritos períodos

de um a 12 dias para S. Newport; um a oito dias para S. Heidelberg e de três a sete

dias para S. Typhimurium. A extensão elevada deste períodos obviamente dificulta

as investigações epidemiológicas (HOBBS; ROBERTS, 1999; PARDI et al., 2001;


Os sintomas variam de indivíduo para indivíduo, não apenas de acordo com a

resistência manifestada por cada um deles, mas também em função da virulência e

da carga microbiana contida no alimento (PARDI et al. ,2001). Como sintomatologia

são descritas cefalgias, vômitos, eventuais cólicas abdominais e diarréia, elevando-

se raramente a febre a mais de 38ºC. Esses sintomas são geralmente

acompanhados por fraqueza, fadiga muscular, febre moderada, nervosismo e

sonolência, os quais persistem por dois a três dias. A fase aguda é superada num

período que vai de dois a cinco dias, mesmo que a febre e diarréia ainda persistam

por cerca de duas semanas. O mal-estar e os efeitos mais danosos da infecção

devem-se a desidratação e a toxemia. A morbidade é variável, sendo mais sentida

pelas crianças e idosos. A taxa de mortalidade, em média, é de 4,1% sendo 5,8%

86

durante o primeiro ano de vida, 2% entre o primeiro e 50 anos e de 15% em pessoas

acima de 50 anos (GERMANO; GERMANO, 2001; JAY, 2005; PARDI et al., 2001).

Em relação a sintomas atípicos tem-se relatos da diarréia com sangue, o que

normalmente não ocorre nas salmoneloses, onde 42% das pessoas afetadas por S.

Typhimurium DT124 apresentaram sangue nas fezes durante a infecção associada

ao consumo de salame, já em um surto causado por S. Enteritidis PT4, o quadro de

diarréia foi precedido por um período de 24 a 48 horas de severa cefalgia, mialgia,

febre, enrijecimento do pescoço e fotobia, além de uma possível associação de

quadros de salmoneloses com colite ulcerativa (VARNAN; EVANS, 1996).

Os sintomas de quadros extra-intestinais estão geralmente associados aos

sorovares adaptados ao homem, nos quadros extra-intestinais devido a infecção por

sorovares não adaptados estão relacionados ao desenvolvimento de doenças

crônicas. Alguns sorovares não adaptados possuem um alto poder invasivo

ocasionando uma série de enfermidades agudas ou crônicas como meningites,

septicemias, osteomielites, pneumonias, cistites, síndrome urêmica hemolítica,

pericardites, entre outras. O sorovares normalmente envolvidos são: S. Cholerasuis,

S. Dublin, S. Virchow, S. Panama e S. London (VARNAN; EVANS, 1996).

A dose de infecção varia de acordo com o sorovar e com o tipo de alimento

envolvido. Nas salmoneloses em geral, estudos têm revelado que concentrações em

torno de 105 a 109 células/g são suficientes para que ocorra a doença. Embora

existam relatos de surtos ocorridos com baixo número de células, como por 1 a

2,5x101 células de S. Estbourne em chocolate, 1 a 5x101 células de S. Heidelberg

em queijo e 1,7x101 células em água (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

Na fase aguda, o microrganismo pode ser isolado da matéria fecal e quase

sempre as culturas de sangue são negativas. A presença dos microrganismos nas

fezes diminui gradualmente, com redução de mais ou menos 50% na segunda

semana, cerca de 15% na quarta e raramente perdura por mais de seis a oito

meses, em média, o período de excreção é de cinco semanas (PARDI et al., 2001;


A despeito da cura clínica, os que continuam excretando Salmonella spp. são

tidos como portadores. As bactérias restantes localizam-se em certos locais dos

intestinos, na vesícula biliar, no fígado ou até nos rins, sendo excretadas

continuamente e esta eliminação pode perdurar por meses e até anos. A excreção

normalmente ocorre por fezes, mas também pode dar-se através da urina. O que

87

ocorre com o homem acontece também com os animais, que passam a ser

comportar como importantes reservatórios (PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS,

1996).

Segundo Jay (2005), embora esses microrganismos sejam rapidamente

eliminados do trato intestinal, mais de 5% dos pacientes tornam-se portadores,

podendo contribuir para a disseminação dessa bactéria, principalmente quando se

trata de manipuladores de alimentos (BARRETO; VIEIRA, 2002).

Barros, Pavia e Panetta (2002) relatam que o portador humano, manipulador

em estabelecimentos de alimentação, vem sendo citado como o maior responsável

por surtos de salmonelose.

As infecções por Salmonella spp. têm início na mucosa intestinal, nas

enterocolites sem invasão da corrente circulatória, as salmonelas atravessam a

camada epitelial, indo proliferar na lâmina própria da mucosa. Nas infecções

sistêmicas, como febre tifóide e febre entérica, a bactéria é introduzida na corrente

sanguínea por via linfática (TRABULSI; TOLEDO, 1998).

Linhagens virulentas de Salmonella spp. iniciam a infecção em células não

fagocitárias, unindo-se à mucosa intestinal por meio de fímbrias. Em seguida, ocorre

a penetração da mucosa intestinal, principalmente nos folículos linfóides das placas

de Peyer. A infecção tem início no íleo e, uma vez dentro do intestino, elas invadem

as células M das placas de Peyer. Das vesículas dessas células, as salmonelas

penetram nos lisossomos. O mecanismo de penetração envolve uma interação

profunda entre a bactéria e a célula hospedeira, que resulta em uma “comunicação

cruzada” e como conseqüência ocorrem rearranjos no citoesqueleto e

desorganização da membrana, sendo seguidos pela absorção das bactérias por

macropinocitose. Uma vez dentro dessas células, elas permanecem em vacúolos

ligados à membrana durante todo seu estágio intracelular. Após a multiplicação, as

células são rompidas, e o patógeno é disseminado. A penetração das células

bacterianas nos macrófagos é acompanhada pela desorganização da membrana e

macropinocitose. Nas enterocolites, de maneira geral, os microrganismos ficam

restritos à lâmina própria e são fagocitados pelos macrófagos e monócitos,

resultando em uma resposta inflamatória decorrente da hiperatividade do sistema

retículo endotelial. Nestes casos, raramente observa-se septicemias, ficando a

infecção restrita à mucosa intestinal (JAY, 2005; PINTO, 2000).

88

A resposta inflamatória do hospedeiro se dá com hipertrofia e hiperplasia dos

folículos linfóides mediada por liberação de prostaglandinas que estimula a

adenilciclase, produzindo ativa secreção de fluídos que resulta em diarréia aquosa.

A produção de toxinas e citotoxinas podem estar relacionadas com as causas da

diarréia, mas seus papéis na invasão celular e subsequente patogênese ainda não

foram totalmente esclarecidos. Postula-se que enterotoxinas produzidas por S.

Typhimurium e S. Enterica tenham modo de ação semelhante a toxina da cólera, ou

seja, interfere no mecanismo de controle e atividade da adenilciclase e que as

salmonelas produzam uma única citotoxina responsável por injúrias na mucosa

intestinal (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

2.7.2 Epidemiologia

Entre os patógenos entéricos as Salmonella spp. são as maiores causas de

ETA constituindo um grave problema de saúde pública, onde a preocupação com a

ubiquidade dos microrganismos deste gênero e com efeitos decorrentes de sua

propagação nos alimentos tem extensão universal (PARDI et al., 2001; ROSE et al.,

2002).

De acordo com Franco e Landgraf (1996), a distribuição geográfica dos

diferentes sorotipos é variável, contudo alguns sorotipos apresentam uma

distribuição regional, como verificada para a S. Derby (México); S. Panama (Europa);

S. Weltewreden (Ásia); S. Virchow (Reino Unido e ex-União Soviética).

De maneira geral os indivíduos mais susceptíveis são os idosos e as crianças,

nos quais os sintomas são geralmente mais severos e, por vezes ocorre o

desenvolvimento de outras enfermidades. A salmonelose pode estar associada à

Síndrome de Reiter, que tem predileção pelos mais jovens; e também por pacientes

portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), onde bacteremias

recorrentes podem ser o primeiro sinal de tal enfermidade. Outras patologias pré-

existentes modificam o comportamento das salmonelas como a esquistossomose, a

anemia falciforme e a verruga peruana, onde estudos relatam que alterações do

complemento ou deficiência na fagocitose levam quase sempre ao desenvolvimento

de bacteremias. Em alguns casos a susceptibilidade pode ser aumentada por fatores

diretamente ligados ao mecanismo de virulência do patógeno em questão, como é o

89

caso de suplementações com ferro, que podem aumentar a virulência da S.

Typhimurium, pois a salmonelas necessitam de ferro para desenvolver-se e produzir

fatores de virulência, assim como antibioticoterapia nas infecções por cepas

resistentes, dietas pobres em proteínas que aumentam a susceptibilidade a

infecções por enteropatógenos de maneira geral, entre outros fatores (TRABULSI;

TOLEDO, 1998; VARNAN; EVANS, 1996).

O risco de se adquirir infecções por Salmonella spp. é obviamente maior onde

os padrões de higiene são baixos e o clima é quente. Estas condições estão

diretamente relacionadas à diarréia dos viajantes e a diarréia infantil. Outros fatores

de risco podem estar associados aos indivíduos que trabalham em contato com os

animais, manipuladores de alimentos, seus familiares e visitantes. As condições de

alojamento também influenciam no aumento de exposição ao risco, como em locais

onde não há saneamento básico, ou nos quais a manutenção de higiene é

dificilmente controlada como em prisões, creches, acampamentos e hospitais. O

risco torna-se maior onde as condições de higiene são pobres e as medidas de

prevenção não são aplicadas (URIO et al., 2001; WELLS et al., 2001).

Segundo Barros, Pavia e Panetta (2002), os hábitos alimentares podem

influenciar consideravelmente a epidemiologia das Salmonella spp., principalmente

em relação ao consumo de alimentos crus ou mal cozidos. As infecções humanas

geralmente ocorrem após o consumo de alimentos, principalmente produtos cárneos

e a base de ovos, ou água contaminada com matéria fecal. Sendo importante

ressaltar que o risco de toxinfecção por Salmonella spp. assume caráter especial

quando atenta-se para o fato de que sua presença não é denunciada pelo aspecto

ou sabor (PARDI et al., 2001).

Outro fato importante em relação a contaminação de alimentos, é que apesar

da Salmonella spp. ser considerada um microrganismo de ampla disseminação, e

ser capaz de difundir-se com facilidade pelos alimentos a partir de um foco de

contaminação, seja contaminação cruzada, equipamentos ou utensílios não

higienizados, manipulador ou animal doente ou portador assintomático, plantas de

processamento em condições de higiene deficientes, entre outras causas, estes

microrganismos são encontrados em pequenas quantidades nos alimentos, pois não

são bons competidores além de serem fortemente inibidos pela microbiota láctica,

bem como pelas demais bactérias deteriorantes ou patogênicas presente nos

alimentos (PINTO, 2000).

90

O isolamento de Salmonella spp. em alimentos, apresenta um problema para

os bacteriologistas, pelo baixo número de microrganismos presentes, associado a

microbiota bacteriana mista e numerosa, por esta razão as técnicas de cultivo

tradicionais envolvem etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo,

plaqueamento seletivo, testes bioquímicos preliminares, provas bioquímicas e

sorológicas, visando ao máximo a recuperação das células normalmente injuriadas

pelo processamento tecnológico, assim como oferecendo condições favoráveis ao

seu desenvolvimento em detrimento dos competidores (ANDREWS et al., 2001).

A freqüência da ocorrência de Salmonella spp. em populações de animais

susceptíveis deve-se, em parte, à contaminação de animais livres de salmonelas por

animais que portam este microrganismo ou que são infectados por ele. Estudos

realizados em matadouros no Brasil, visando a identificação de animais portadores,

os autores encontraram taxas de 7,2% de portadores intestinais das 3020 amostras

de fezes examinadas, onde 147, ou 24,5% correspondiam a suínos; 35, ou 8,7% aos

eqüinos; 13, ou 2,6% às aves; 9 ou, 1,8% aos bovinos; 3, ou 1,7% aos felinos; 5, ou

1,6% aos caninos e 5, ou 1,4% aos leporinos. De caprinos e ovinos não foi isolada

nenhuma salmonela. Em mais de 70% dos isolamentos realizados, os sorotipos

mais freqüentes foram representados pela S. Derby, S.Typhimurium e S. Anatum,

com predomínio da S. Derby nos suínos e S.Typhimurium nas aves, cães, gatos e

coelhos e da S. Anatum nos eqüinos. A S. Dublin predominou nos bovinos (PARDI

et al., 2001).

O nível de contaminação bacteriana pode aumentar consideravelmente

durante as operações de abate, pois a contaminação de carcaças por matéria fecal

é esperada durante e imediatamente após as operações de abate. Durante o

transporte dos animais até as plantas processadoras, situações de estresse podem

levar a excreção de Salmonella spp. por animais doentes ou portadores e assim

contaminar animais sadios (MREMA; MPUCHANE; GASHE, 2006).

Em exames do conteúdo do rúmen de gado saudável, após o abate,

Salmonella spp. foram encontradas em 45% das amostras. Cerca de 57% das

amostras coletadas do ambiente de transporte do gado até o abatedouro foram

positivas para este microrganismo. Em uma pesquisa em abatedouros de frangos,

os autores encontraram uma taxa de 3 a 5% de portadores intestinais de salmonelas

(JAY, 2005).

91

Segundo Jay (2005), a taxa da incidência de Salmonella spp. nas rações

animais industriais, em 1989, foi de aproximadamente 49%. Entre os distribuidores

inspecionados pelo Departamento de Agricultura dos EUA , a taxa foi de 20 a 25%, e

de apenas 6% em rações peletizadas. Em um trabalho realizado com criadores de

frango, pesquisadores observaram que 60% das carnes e das farinhas de ossos

continham Salmonella spp., e a ração foi tida como um considerável fonte de

contaminação nesses criatórios. A contaminação dos ingredientes distribuídos por

salmonelas ocorre de forma significativa devido à recontaminação. Os principais

sorovares encontrados em rações animais são S. Senftenberg, S. Montivideo e S.

Cerro. A S. Enteritidis não foi encontrada em ingredientes distribuídos ou em rações

prontas.

Nas infecções humanas, são tidos como passíveis de conter organismos

viáveis, todos os produtos de origem animal. Assim, independentemente da infecção

endógena a partir de infecções fecais por eliminadores intestinais, incluem-se

naquelas fontes as carnes frescas e preparadas, aves, pescados, ovos e leite. As

carnes e os produtos cárneos estão entre os alimentos mais suspeitos. As carnes

picadas contam-se entre as mais suscetíveis. As carnes frescas são as mais

comumente contaminadas por Salmonella spp., sendo a incidência variável, de

acordo com a espécies em questão, as práticas de manejo, a higiene durante as

operações de abate e manipulação subseqüente. Em casos extremos as

contaminações de frangos podem chegar a 100% (ALMEIDA FILHO; SIGARINI,

2002; HOFFMANN et al., 1996; PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Salmoneloses são raramente adquiridas a partir do consumo direto de carnes

cruas, mas sim de produtos processados. Na maioria dos surtos os alimentos

envolvidos foram insuficientemente cozidos ou contaminados após o cozimento,

onde as carnes cruas são potentes fontes de contaminação cruzada. A refrigeração

inadequada também constitui um importante meio de propagação da contaminação.

Produtos cozidos podem também contaminar-se a partir dos manipuladores ou

ingredientes adicionados após o cozimento. Os produtos frescais estão envolvidos

com menor freqüência. De um modo geral, tem-se observado que os produtos não

cozidos suficientemente ou que não estiveram sob refrigeração apropriada são os

que oferecem maior risco. A manipulação excessiva constitui um agravamento a

mais (BREDHOLT; NEBASKKEN; HOLER, 1999; LITTLE et al., 1998; MATTICK et

92

al., 2002; CAPITA et al., 2003; PARDI et al., 2001; ROSE et al., 2002; SALGADO-

MANCHA et al., 1999).

Produtos cárneos fermentados como os salames têm como matéria-prima

carnes frescas, e as Salmonella spp. podem sobreviver ao processo de fermentação

(LOBO et al., 2001; SIRIKEN et al., 2006). Em um surto envolvendo o consumo de

salame, no Reino Unido, causado pelo sorovar S.Typhimurium DT24, 71 casos

foram confirmados, destes 55 eram crianças menores de 16 anos. Outros surtos

envolvendo salame foram reportados na Austrália e na Itália, mas a Salmonella ssp.

é normalmente está em segundo lugar como perigo nas carnes fermentadas, os

Staphylococcus aureus são geralmente os microrganismos mais freqüentes nestes

produtos (VARNAN; ERVANS, 1996).

Das 7.907 Salmonella spp. isoladas pelo Centro de Controle de Doenças

(CDC) durante o ano de 1996, 70% foram provenientes de alimentos crus e

processados, sendo 42 % isoladas de carne de peru e de frango. A carne de frango

e seus derivados têm sido reconhecidos como importantes reservatórios de

salmonelas e são freqüentemente incriminados por contaminação por Salmonella

spp. (BAEUMLER; HARGIS; TSOLIS, 2000; JAY, 2005).

Um estudo com carnes e produtos de frango no Canadá, revelou que as

Salmonella spp. estavam presente em 17,5% das 596 amostras de carne suína,

69,1% das 230 amostras de carne de peru, 60,9% das amostras de carne de frango,

mas em apenas 2,6% das amostras de carne bovina (JAY, 2005).

A ocorrência das salmoneloses é crescente em diferentes países. Pesquisas

confirmam a predominância de ovos e derivados como fontes de infecção nestes

surtos. Nos EUA 25% das salmoneloses em humanos têm como causa de infecção

o consumo de ovos e seus derivados. A maioria das infecções associada ao

consumo de ovos, está relacionada ao consumo de ovos crus ou produtos

confeccionados com os mesmos, como por exemplo, maioneses, creme de ovos,

entre outros. Contudo, existem relatos de surtos envolvendo ovos insuficientemente

cozidos e pasta de ovos congelada. O sorovar mais freqüentemente isolado é a S.

Enteritidis, sendo o fagotipo 4 no oeste europeu, em especial na Espanha, e os

fagotipos 8 e 13a nos EUA, seguido pelo sorovar S.Typhimurium (ADREWS et al.,

2001; GIOVANNINI et al., 2004).

A razão do aumento da incidência de surtos por S. Enteritidis associada à

produtos a base de ovos e frango não está clara. As possíveis vias de contaminação

93

de ovos por S. Enteritidis são as seguintes: transovariana; translocação a partir do

peritônio para a gema ou oviduto; penetração do microrganismo proveniente da

cloaca na casca do ovo; lavagem de ovos e manipuladores de alimentos (JAY,

2005).

O leite cru é um dos alimentos de origem animal inevitavelmente contaminado

por Salmonella spp. e o seu consumo é considerado um fator de risco para a

infecção por salmonelas assim como para outros enteropatógenos, entretanto a

pasteurização elimina o problema. Na maioria dos casos, a segurança está

relacionada ao correto processamento tecnológico do leite e seus derivados, assim

como a prevenção da re-contaminação a partir da aplicação de corretas práticas de

higiene. Todavia, os dois maiores surtos de salmonelose ocorreram em

circunstâncias incomuns. Em 1994, um surto acometeu mais de 224.000 pessoas. O

alimento envolvido foi um sorvete produzido com leite que havia sido transportado

em um caminhão tanque, o qual previamente fora utilizado para transportar ovos

líquidos. O sorovar isolado foi a S.Enteritidis, e os casos ocorreram em pelo menos

41 estados dos EUA. Um outro surto ocorreu em 1985, envolvendo 200.000

pessoas. O alimento veículo foi um leite 2% produzido por um laticínio em Illinois,

sendo a S. Typhimurium o agente etiológico (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

O pescado fresco geralmente está contaminado por Salmonella spp. quando

obtido ou capturado em águas contaminadas por matéria fecal, o que é um problema

comum em praticamente todos os países, e por esta razão pescados frescos têm

sido envolvidos em surtos. Um surto ocasionado pelo consumo de salmão fresco,

destacou um outro fator importante, na ocorrência de surtos que é a manipulação

inadequada em cozinhas residenciais ou em estabelecimentos manipuladores de

alimentos, principalmente no que se refere as condições de higiene (VARNAN;

EVANS, 1996).

Produtos de confeitaria como chocolate têm sido incriminados em surtos de

salmoneloses, neste produto o tratamento térmico durante o processo de produção

não é o suficiente para destruir as células bacterianas, contudo sua baixa atividade

de água atua como mecanismo de inibição para o crescimento destes

microrganismos, mas a sobrevivência pode ser longa. Dois grandes surtos

internacionais com chocolate tiveram como sovares incriminados a S. Napoli e S.

Eastbourne, tendo como fator diferencial as baixas doses de infecção de salmonelas

ingeridas no chocolate. Outros gêneros alimentícios têm sido reportados como

94

veículos de infecção, com por exemplo, saladas de vegetais, em especial aquelas

com molho de maionese, pastas, entre outros alimentos (HOBBS; ROBERTS, 1998;


De um modo geral, a salmonelose é uma infecção de alta morbidade, porém

de baixa letalidade, resultando em perdas econômicas elevadas, devido à

necessidade de cuidados médicos, hospitalizações e queda de produtividade do

indivíduo acometido por esta enfermidade. O Departamento de Agricultura dos EUA

estima que entre 696.000 – 3.840.000 casos de salmonelose não tifóide ocorram e,

870 – 1.920 óbitos ocorram por ano, custando em torno de 0,9 a 12,2 bilhões de

dólares (ANDREWS et al., 2001).

A precisa prevalência dos casos de salmonelose ocorridos não é conhecida,

uma vez que surtos pequenos geralmente não são notificados às autoridades de

saúde pública. Pesquisadores do CDC indicam que, nos EUA, em média 40.000

casos ocorrem a cada ano, com 500 mortes. Assim como nos casos de

gastrenterites por estafilococos, um grande número de surtos ocasionados por

salmonelas ocorre em festas ou situações similares (JAY, 2005).

2.7.3 Fatores que afetam o crescimento da Salmonella spp. em alimentos

A resistência das salmonelas varia dependendo dos tipos, mas geralmente é

elevada. A Salmonella spp. tem como temperatura ótima para o crescimento 37ºC,

muito embora cresça bem em temperatura ambiente, tanto acima quanto abaixo

daquela. As salmonelas crescem entre 5ºC e 45-47ºC. A habilidade de crescer em

temperaturas abaixo de 7ºC depende do sorovar em questão, normalmente os

seguintes sorovares são hábeis em baixas temperaturas: S. Bredeney, S.

Typhimurium e S. Virchow, são hábeis para crescer em temperaturas entre 5-6ºC;

entretanto, a S. Agona, S. Senftenberg e S. Hadar crescem em temperaturas abaixo

de 6ºC. No geral, crescimento em temperaturas abaixo de 10ºC é ‘baixo, contudo

pode tornar-se significante quando a refrigeração é pobre e a vida útil é prolongada

(PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Com relação a destruição pelo calor, as salmonelas geralmente são

destruídas em temperaturas de pasteurização do leite. As Salmonella spp. são

destruídas em alimentos com alta atividade de água pelo aquecimento mínimo de

95

74ºC, sendo o valor D60 para a maioria dos sorovares entre 0,2 e 6,5 minutos,

contudo há evidências que sucessivos tratamentos térmicos sub-letais aumentam a

resistência da S. Typhimurium. O sorovar S. Senftenberg é o mais resistente ao

calor que todos os outros sorovares de Salmonella spp., porém embora este sorovar

seja considerado 30 vezes mais resistente ao calor que a S. Typhimurium, esta

última demonstrou-se mais resistente ao calor seco. Estudos demonstram que

células crescidas a 44ºC são mais resistentes ao calor que aquelas crescidas em

temperaturas entre 15-35ºC. Existe uma interelação entre a resistência térmica e os

valores de pH, onde a maioria dos sorovares de Salmonella spp. raramente têm uma

resistência maior em pH 5,5 que em pH 8,5 (VARNAN; EVANS, 1996; JAY, 2005).

As salmonelas normalmente têm seu número reduzido quando submetidas à

temperaturas entre –2ºC e –5ºC, sendo as de congelamento comercialmente usadas

em torno de –23ºC,o que provoca uma redução significativa do número de

microrganismos (VARNAN; EVANS, 1996).

A irradiação tem sido proposta como um efetivo tratamento no controle das

salmonelas, pois estes microrganismos são completamente sensíveis à radiação

ionizante, e doses de 5 a 7,5 kGy são suficientes para eliminá-las na maioria dos

alimentos (JAY, 2005).

O melhor pH para seu crescimento está entre 4,5 e 9,0, sendo o pH ótimo

valores entre 6,5 e 7,5. O pH ótimo de crescimento é próximo da neutralidade, sendo

considerados bactericidas valores acima de 9,0 e abaixo de 4,0. Valores de pH

abaixo de 4,1, inativam as células podendo destruí-las. O pH mínimo de crescimento

foi registrado como 4,05 (com HCl e ácido cítrico), mas dependendo do ácido

utilizado para baixar o pH, o mínimo pode ser de 5,5. O efeito dos ácidos utilizados

para baixar o pH mínimo de crescimento interage com outros fatores como atividade

de água, conteúdo nutricional e temperatura, em respeito ao crescimento,

sobrevivência e morte das células bacterianas. A aeração, por exemplo, é uma

condição que favorece o crescimento em pH baixo; já o uso de ácido acético na

confecção de maionese promove um garantia de qualidade maior no que diz

respeito ao controle do crescimento de Salmonella spp. que quando utilizado ácido

cítrico ou ácido clorídrico (JAY, 2005; VARNAN; EVANS, 1996).

Em relação à umidade disponível, a inibição do crescimento foi observada em

valores de atividade de água abaixo de 0,94 em meios com pH neutro, podendo ser

considerada a atividade de água mínima 0,93. No caso do potencial de oxi-redução

96

valores abaixo de Eh 30 mV limitam o crescimento das salmonelas, sendo

importante ressaltar que os parâmetros citados estão diretamente relacionados à

outros fatores de crescimento podendo assim ocorrer variações de acordo com os

demais parâmetros (PARDI et al., 2001; VARNAN; EVANS, 1996).

Quando as condições de crescimento são considerados ideais, as salmonelas

são hábeis em crescer em concentrações de 4% de NaCl e 350mg/L de NaNO2 de

acordo com o sorovar em questão, portanto na utilização destes dois ingredientes

em combinação, os valores de pH e temperatura têm extrema importância nesta

interação. Ao contrário dos Staphylococcus spp., as Salmonella spp. não toleram

grandes concentrações de sais. Salmouras com concentrações acima de 9% são

consideradas bactericidas (VARNAN; EVANS, 1996; JAY, 2005).

O crescimento das Salmonella spp. pode ocorrer em produtos curados,

defumados, cozidos, mas em produtos crus e curados a inibição do crescimento está

mais relacionada com a competição com outras bactérias, assim como nos produtos

fermentados, embora surtos por salmonelas tenham sido constantemente relatados

(ANDREWS et al., 2001).

A habilidade em competir com outros microrganismos, depende do tipo de

Salmonella spp. envolvido na competição. A maioria compete pobremente com

microrganismos de deterioração, particularmente com as bactérias ácido lácticas, o

que é importante na elaboração de produtos fermentados, onde o processo de

fermentação assim como o de acidificação podem ser utilizados como mecanismos

de inibição (SIRIKEN et al., 2006).

2.7.4 Medidas preventivas

Em vista da distribuição mundial da Salmonella spp., o controle da

salmonelose será alcançado tornando animais e pessoas livres desse

microrganismo. O que obviamente é uma tarefa difícil, porém não impossível (JAY,

2005).

Para prevenir a salmonelose, deve-se obedecer alguns princípios

fundamentados no intuito de evitar a contaminação dos alimentos manipulados por

homens doentes ou portadores assintomáticos, e provenientes de animais

igualmente doentes ou portadores de materiais contaminados como carnes, ovos e

97

ingredientes em geral. Deve-se atentar ainda para as possibilidades de

contaminação cruzada (PARDI et al., 2001).

Ao nível dos consumidores, o portador de Salmonella spp. tem um papel

importante. A rigor, com relação a eventuais portadores assintomáticos, deve ser

incluído o exame de fezes entre os exames periódicos normalmente exigidos aos

manipuladores de alimentos. No casos de portadores positivos, a medida

recomendada é que ocorra o afastamento do mesmo até que seis coproculturas

chegue a resultados negativos. A preparação inadequada e a manipulação de

alimentos em residências e em estabelecimentos de alimentação continuam sendo

os principais fatores causais de infecções alimentares (JAY, 2005; PARDI et al.,

2001).

No que se refere ao controle da contaminação cruzada medidas simples,

porém eficientes devem ser adotadas, como por exemplo, higienização das mãos e

utensílios que entram em contato com o alimento cru, evitando que entre em contato

com o alimento que já sofreu tratamento térmico ou produtos que são ingeridos crus,

como saladas. Outras medidas a serem aplicadas são: conveniente cocção, visto

que o patógeno é destruído a 60ºC por 15 minutos; manipulação em temperatura

adequada, pois este microrganismo cresce rapidamente em temperatura ambiente,

todavia a aplicação eficiente e contínua do frio impede o desenvolvimento

microbiano, visto que a maioria das salmonelas não crescem em temperaturas

abaixo de 7ºC; separar alimentos crus de cozido, conforme já referenciado; higiene

corporal permanente, onde a educação sanitária de todas as pessoas envolvidas na

produção de alimentos é medida imperativa no controle de enfermidades

transmitidas por alimentos; limpeza e sanificação eficazes e controladas dos

equipamentos, utensílios e ambiente, evitando assim a propagação de

contaminação como também inibindo o crescimento de microrganismos patogênicos

assim como os de deteriora. A higiene deve ser feita não somente através da

limpeza e desinfecção de equipamentos, utensílios e instalações em geral, mas

também mantendo-os livres de possíveis contaminação por insetos e roedores

(HOBBS; ROBERTS, 1998).

Em relação a adoção de medidas que previnam a contaminação dos produtos

de origem animal, deve-se atentar para as possibilidades de contaminação do

animal, iniciando-se a partir das boas práticas de manejo, como o controle de

qualidade das rações fornecidas aos animais, pois uma vez contaminadas, infectam

98

____________ 9SCOTT, W. J. Water relations of Staphylococcus aureus at 30ºC. Austral. J. Bio. Sci. ,v. 6, p. 549, 1953.

os animais ao consumi-las; medidas de higiene devem ser aplicadas também nos

currais onde a partir das fezes e bebedouros podem ocorrer a disseminação de

enfermidades. Cuidados especiais devem ser tomados durante as operações de

abate, evitando-se o máximo contaminações no ato da esfola e o ponto crítico a

seguir é a prática da evisceração, obrigatoriamente precedida, nos bovinos, pelas

oclusões de reto e porção cranial do esôfago, objetivando-se evitar a ruptura de

segmentos do trato gastrintestinal, este cuidados especiais devem estar presentes

em todas as plantas de processamento, devendo seguir até a obtenção do produto

final, estocagem, preparo e consumo (PARDI et al., 2001, WELLS et al., 2001).

Em suma, a implementação de BPF/PPHO e dos princípios do APPCC, são

os instrumentos mais significativos para o controle das salmoneloses em criações,

indústrias e estabelecimentos manipuladores de alimentos (BARROS; PAVIA;

PANETTA, 2002; GERMANO; GERMANO, 2001).

2.8 A IMPORTÂNCIA DA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ÁGUA (Aa)

O conceito de atividade de água foi introduzido por Scott (1953, apud9 RÖDEL

et al., 1982) na microbiologia, e correspondia aos conceitos já descritos na literatura

como grau de hidratação, tensão de vapor e equilíbrio de umidade.

A inter-relação entre o pH e a atividade de água (Aa), geralmente se dá da

seguinte forma: com a diminuição da Aa, o limite de pH de crescimento dos

microrganismos encontra-se limitado (TROLLER, 1980). Desta forma, junto com pH

e a temperatura, o valor de Aa apresenta-se como critério de fácil determinação,

mediante o qual se pode avaliar a estabilidade microbiológica de carnes e produtos

cárneos (RÖDEL et al., 1982).

Por tanto, o valor da Aa corresponde ao estado de equilíbrio que se origina

entre a pressão do vapor de água no alimento examinado e a pressão do vapor de

água da atmosfera circundante em uma câmara fechada. Para descrever este

estado, emprega-se também o conceito de umidade relativa, que corresponde 100

vezes o valor da Aa. O valor da Aa serve como medida da água disponível para os

microrganismos, por exemplo, nas carnes ou produtos cárneos. Do total de água

que contêm a carne e os produtos cárneos, só uma determinada parte se encontra à

disposição de bactérias, leveduras e fungos para o seu metabolismo e reprodução.

99

Desta maneira, a determinação da situação microbiológica destes alimentos não

pode ser realizada através do conteúdo total de água (umidade), mas somente

mediante o valor da Aa (RÖDEL et al., 1982).

O alimento é uma fonte importante de contaminação microbiológica e, para

sua conservação, geralmente sofre processamentos visando a diminuição de

microrganismos deterioradores e a eliminação de patogênicos. Os processos são

normalmente definidos em função de parâmetros como pH, Aa, potencial de oxi-

redução e a natureza química do alimento. Também são muito importantes o nível

de contaminação inicial, bem como o nível máximo admissível para seu consumo

seguro (MATULIS et al., 1995; NETO et al., 1996).

A Aa, o pH e a composição química do alimento são fatores que determinam

o tipo de deterioração microbiana que poderá se desenvolver no produto. O limite

máximo de água disponível para o desenvolvimento microbiano é condicionado pelo

Aa do alimento. A maioria das bactérias não cresce em Aa abaixo de 0,91, e

bolores, em Aa abaixo de 0,80. Alguns fungos xerofílicos podem crescer em Aa de

até 0,65. Observa-se que os alimentos perecíveis, como carnes e leite, são os que

oferecem maior disponibilidade de água para o crescimento microbiano. Os

semiperecíveis situam-se entre 0,88 e 0,96, faixa em que ainda é possível grande

deterioração microbiana, razão pela qual devem ser processados ou resfriados para

poderem ser consumidos em períodos mais longos. Os preservados por salga

situam-se ao redor de 0,75 de Aa, valor da Aa das soluções salinas. Os alimentos

desidratados situam-se abaixo de 0,60; quando acondicionados adequadamente,

outras reações de deterioração, tais como escurecimento, descoloração ou oxidação

são as que deverão definir sua vidas de prateleira, sendo importante destacar que a

secagem ou a desidratação é um dos métodos mais antigos de conservação de

alimentos, onde a secagem é uma conseqüência direta da remoção da água, sem a

qual não há crescimento microbiano (MCMINN; MAGEE, 1997; NETO et al., 1996).

Comprovando a hipótese acima citada, de que a Aa, o pH e a composição

química determinam o desenvolvimento microbiano dos alimentos, Buchanan e

Doyle (1997) realizaram experimento onde foi verificado o efeito da adição de três

umectantes não iônicos no crescimento de E. coli O157:H7 em caldo infusão

cérebro-coração. Foram utilizados o manitol (0,50; 100; 150; 200gl-1), o sorbitol

(0,50; 100; 150; 200gl-1) e a sacarose (0,50; 100; 150; 200; 300 gl-1) em combinação

com quatro diferentes níveis de pH (4,5; 5,5; 6,5; 7,5) e três diferentes temperaturas

100

de incubação. O crescimento foi verificado a partir da contagem de células viáveis, e

curvas de crescimento usando a equação de Gompertz para derivação do tempo de

geração, duração da fase lag e densidade máxima populacional. Ao aumentar a

concentração dos umectantes (isto é, diminuir a Aa) junto com diminuição da

temperatura e pH, objetivando o aumento da fase lag e do tempo de geração, os

resultados obtidos foram comparados com estudos onde foi utilizado o cloreto de

sódio, apresentando resultados positivos como nos estudos comparados. Os autores

concluíram que, a adição de umectantes ou de cloreto de sódio, diminui a estimativa

de crescimento de microrganismos patogênicos uma vez que os mesmos exigem aa

mínima para seu desenvolvimento. De maneira global, os resultados indicam que os

modelos desenvolvidos podem ser usados para obtenção da estimativa de

crescimento bacteriano na presença de outros solutos.

Ryu, Deng e Deuchat (1999), realizaram um outro experimento comprovando

novamente o fato acima citado. A Aa, o pH e a composição química do alimento são

fatores determinantes no desenvolvimento de microrganismos no mesmo,

determinando a inativação de E. coli O157:H7 em carnes inoculadas com a mesma,

comparando os efeitos produzidos pelos seguintes parâmetros: Aa (0,34 ± 0,06 e

0,68 ± 0,01), cloreto de sódio (0,5; 3,0 e 20%) e temperatura (5 e 25ºC) durante um

período de armazenamento de oito semanas. Concluíram que a redução da Aa

associada ao aumento da concentração de cloreto de sódio resultaram numa

significativa redução no número de células viáveis durante o período de estocagem.

No entanto, ocorreu uma sobrevivência significativamente alta nas carnes

inoculadas que continham 0,5 e 3,0% de sal, quando comparadas com aquelas com

20%. A medida da inativação foi acentuada com Aa de 0,34 ± 0,06 em comparação

com Aa de 0,68 ± 0,01 e na temperatura de 25º a 5ºC.

Existe algumas relações entre Aa, temperatura e nutrição. Primeiro, a

qualquer temperatura, a capacidade de crescimento diminui com a redução da Aa.

Segundo, o intervalo de Aa no qual os microrganismos crescem é maior na sua

temperatura ótima de crescimento. Terceiro, a presença de nutrientes aumenta o

intervalo de Aa no qual os microrganismos sobrevivem, desta forma os valores

descritos na literatura são pontos de referência, pois mudanças na temperatura ou

na quantidade de nutriente pode levar ao crescimento de microrganismos em aa

mais baixas (JAY, 2005).

101

A Aa é dependente da temperatura (MATTICK et al., 2001). Mudanças na

temperatura a alteram, devido às mudanças na conformação da água, na

dissociação da água, na solubilidade dos solutos em água ou no estado da matriz.

Sendo a atividade de água definida como o estado de energia da água no alimento

e, portanto, potencial para agir como um solvente e participar de reações químicas e

bioquímicas e no crescimento microbiano (FONTANA, 2000).

Este autor, ressalta que a determinação da Aa torna-se cada vez mais

importante, pois diversos países têm estabelecido “standards” compulsórios

baseados nos valores de Aa admissíveis, onde a prevenção da qualidade do

alimento, a partir desta análise, será utilizada tanto pelo industrial como pelas

exigências governamentais. A monitorização da Aa é um ponto crítico de controle

para muitas indústrias e pode ser incorporados em muitos programas de qualidade,

onde a prioridade é a proteção da saúde do consumidor. A medição da Aa e

aplicação de outras ciências baseadas em análise de controle de qualidade do

alimento ajudam a garantir a oferta de produtos com alta qualidade e segurança.

A aplicação principal da medida da Aa concerne ao controle do crescimento

microbiano, contudo a redução da mesma também preserva os alimentos pela

redução de reações químicas que levam a deteriora. Outros aspectos, tais como, a

qualidade ou propriedade organolépticas são importantes, mas a segurança do

alimento é o critério mais significativo, e isto significa o controle do crescimento

microbiano. O limite mais baixo para o crescimento de microrganismos nos

alimentos está em torno de Aa 0,60. Na escala entre um e 0,60 de Aa, um grande

número de microrganismos pode crescer, dentre eles estão alguns patógenos. Em

conseqüência disto, como já dito anteriormente, as agências reguladoras em muitos

países estão começando a definir padrões de Aa para alimentos processados

(RAHMAN, GUIZANI; AL-RUZEIKI, 2004).

Quando a escala de Aa move-se em direção às condições mais

desfavoráveis, os Micrococcus spp., os Staphylococcus spp. e uma ou duas

espécies halofílicas são as principais ameaças até níveis de 0,87-0,85. Neste limite,

as bactérias, com exceção das halofílicas, não crescerão. Nestes níveis, sem a

competição das bactérias, as leveduras e fungos predominarão, criando maiores

problemas de deterioração se o ar for limitado ou o sistema contiver açúcar. Muitos

fungos xerofílicos e leveduras osmofílicas crescerão em níveis de Aa tão baixos

quanto 0,75-0,65. Os microrganismos Gram negativos que ocorrem nos processos

102

de deterioração, e em especial as enterobactérias, são particularmente mais

sensíveis à diminuição da Aa. A maioria da enterobacteriáceas paralisa sua

multiplicação em Aa abaixo de 0,95. No limite inferior das bactérias tolerantes à

baixa Aa estão as halofílicas, que raramente se envolvem nos processos de

deterioração do alimento humano, e esse tipo de deterioração é comumente

causado por bactérias dos gêneros Halobacterium e Halococcus e pode-se preveni-

la com uso de métodos especiais de higiene. Afora esta exceção e poucas outras,

as bactérias Gram-positivas, são via de regra, mais resistentes às baixas atividades

de água, razão pela qual, nas carnes curadas encontra-se regularmente esta flora.

Por este motivo, a resistência do Staphylococcus aureus torna-se particularmente

perigosa (NISSEN; HOLCK, 1998; PARDI et al., 2001).

Em geral, as bactérias necessitam de maiores valores de Aa para o

crescimento, com as Gram-negativas necessitando de maiores valores que as Gram

positivas. A maior parte das bactérias deteriorantes de alimentos não cresce com Aa

menor que 0,91. A respeito de bactérias patogênicas em alimentos, o S. aureus

cresce e produz enterotoxina até 0,86, apesar de, sob condições ideais, se

desenvolverem valores de Aa de até 0,83, sem, no entanto, produzir enterotoxinas,

ao passo que o C. botulinum não cresce abaixo de 0,94. Assim como os mofos e

leveduras crescem numa faixa maior de pH, o mesmo ocorre em relação à Aa

(SAMELIS; KAKOURI; REMENTZIS, 2000).

Em síntese, o efeito geral de diminuir Aa a um valor abaixo do ótimo é

aumentar a fase lag de crescimento, reduzir a velocidade de crescimento e o

tamanho da população final. Esses efeitos são resultantes da influência adversa da

baixa quantidade de água sobre as atividades metabólicas, pois todas as reações

químicas das células necessitam de um meio aquoso. Entretanto, deve-se ter em

mente, que a Aa influencia outros parâmetros do meio, como pH, temperatura e o

Eh. Estudos revelam que a Aa mínima aumenta quando a temperatura de incubação

diminui, e quando tanto a temperatura quanto o pH são desfavoráveis ao

crescimento, a Aa mínima de crescimento é maior, contudo a interação entre a

atividade de água e a temperatura mostra-se mais significativa, podendo ser

considerado o ponto chave para o controle do crescimento, da sobrevivência e da

inativação dos microrganismos (JAY, 2005; MATTICK et al., 2001; VALDRAMIDIS et

al., 2005).

103

A estratégia empregada pelos microrganismos como proteção contra o

estresse osmótico é o acúmulo intracelular de solutos compatíveis. Para isso, as

bactéria utilizam íons K+, glutamato, glutamina, prolina, γ-aminobutirato, alanina,

glicina, betaína, sacarose, trealose e glucosil-glicerol. As Gram negativas tende a

acumular prolina por meio do aumento de transporte. Em um meio de cultivo com

alta força osmótica, a prolina aumenta a velocidade de crescimento de S. aureus

mediante o uso de um sistema de transporte de baixa afinidade. O que tem relação

direta com o uso de compostos específicos para diminuir a Aa, o controle da

atividade de água com glicerol permite o catabolismo em valores de Aa abaixo

daqueles verificados para o ajuste feito com glicose. Em todos os casos em que o

NaCl é utilizado para ajustar a Aa, o catabolismo do substrato cessou em valores de

Aa maiores que o mínimo para o crescimento, enquanto o glicerol permitiu o

catabolismo em Aa menor que a mínima para o crescimento. Apesar de alguns

resultados contrários há evidências de que o glicerol é claramente menos inibitório

para organismos vivos que compostos como a sacarose e o NaCl (JAY, 2005).

O crescimento de algumas células pode ser grande em Aa reduzida,

enquanto certos produtos extracelulares não são produzidos. Uma baixa Aa faz com

que cesse a produção de enterotoxina B por S. aureus, apesar do seu grande

crescimento celular. Vale ressaltar que o microrganismo em questão, possui

habilidade de se multiplicar em uma ampla faixa de pH (entre 4,0 e 9,8) e de

temperatura (entre 7 e 47,8ºC), apresentando tolerância a concentrações de 10 a

20% de cloreto de sódio, bem como a nitratos (SILVA; GANDRA, 2004).

De um modo geral, o efeito da baixa Aa na nutrição dos microrganismos atua

a medida em que as necessidades celulares que são mediadas em um ambiente

aquoso são progressivamente interrompidas. Adicionalmente ao efeito sobre os

nutrientes, uma baixa Aa possui efeito sobre o funcionamento da membrana celular,

a qual deve permanecer em estado fluido. Espera-se que a secagem de

componentes internos da célula ocorra quando as células são colocadas em um

meio com Aa tão baixa a ponto de ocorrer equilíbrio entre a quantidade de água nas

células e no substrato. Apesar dos mecanismos não estarem totalmente

esclarecidos, todas as células microbianas necessitam da mesma Aa interna. De

certa forma, as que conseguem crescer em condições extremas de baixa Aa

aparentemente o fazem devido à sua capacidade de concentrar sais, polióis,

aminoácidos, dentre outros compostos em concentrações internas suficientes não só

104

para evitar a perda de água pelas células, mas para extrai-la de um ambiente já

pobre desse solvente (JAY, 2005).

3 METODOLOGIA

3.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Controle Microbiológico de

Produtos de Origem Animal e no Laboratório de Controle Físico-Químico de

Produtos de Origem Animal do Departamento de Tecnologia de Alimentos da

Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense – UFF.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1 Material

Um total de 100 amostras de salsichas “hot dog” de carne bovina (tipo

tradicional) e de frango (tipo frango) comercializadas a vácuo e a granel foram

obtidas de forma aleatória em estabelecimentos comerciais varejistas localizadas

nos municípios do Rio de Janeiro e de Niterói – RJ. Das 100 amostras de salsichas

“hot dog”: 25 correspondiam ao tipo tradicional comercializada a vácuo; 25

correspondiam ao tipo frango comercializada a vácuo; 25 correspondiam ao tipo

tradicional comercializada a granel e 25 correspondiam ao tipo frango

comercializada a granel.

A obtenção das amostras obedeceu as especificações da Resolução nº 12,

de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001), sendo procedida da seguinte forma: as

amostras embaladas a vácuo foram obtidas em suas embalagens originais não

violadas, e as amostras a granel foram solicitadas em balcões de pesagem,

observando a quantidade mínima de 500 gramas por unidade amostral. As amostras

106 foram enviadas ao laboratório devidamente identificadas e em condições adequadas

para análise, tendo sido transportadas para o laboratório, em caixas isotérmicas com

gelo, por no máximo uma hora. No laboratório foram prontamente identificadas e

registradas em um caderno de entrada de amostras. O processo de análise foi

iniciado no dia de obtenção das mesmas, procedendo-se então as primeiras etapas

das testes bacteriológicos. Posteriormente as amostras foram encaminhadas para

as análises físico-químicas.

3.2.2 Métodos 3.2.2.1 Bacteriologia

As análises foram realizadas segundo as determinações contidas na RDC nº

12 de 02/01/01 (BRASIL, 2001), e com base nas técnicas descritas pelo Laboratório

Nacional de Referência Animal – LANARA (BRASIL, 2003), com modificações

pertinentes.

As amostras foram recebidas em caixa isotérmica com gelo e mantidas sob

refrigeração, no Laboratório de Controle Microbiológico da Faculdade de Veterinária

da Universidade Federal Fluminense – UFF, Niterói-RJ. Foram submetidas às

seguintes análises: enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e

Escherichia coli, contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, contagem

Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens e detecção de

Salmonella spp.

3.2.2.2 Preparo das amostras

No interior da câmara asséptica, após sanificação das superfícies (pisos,

paredes, teto e bancada) com hipoclorito de sódio a 10%, e posteriormente

sanificação da bancada com etanol a 70% cada embalagem de salsicha “hot dog” foi

aberta com assepsia, sendo a amostra fragmentada com auxílio de instrumental,

esterilizado por flambagem, e colocada em envelope estéril para “stomacher”. Foram

pesadas duas subamostras em balança digital (Marte® modelo AS2000C), na zona

de segurança do bico de Bünsen. É importante salientar que a vidraria utilizada no

107

experimento foi previamente esterilizada em forno Pasteur a 170ºC por uma hora. As

soluções e meios de cultura foram preparados e esterilizados em autoclave,

conforme suas respectivas especificações, assim como o material descartável. A

eficácia da esterilização em autoclave foi confirmada com o uso de ampolas

Sterikon bioindicador (MERCK nº 10594), que contêm caldo nutritivo, indicador de

pH e esporos de Bacillus stearothermophilus. A ampola foi introduzida junto com o

material autoclavado na parte inferior e central da autoclave e após a esterilização

as ampolas foram incubadas a 60ºC ± 2ºC por 24-48 horas. No caso de esterilização

eficiente, os esporos do microrganismo em questão são destruídos não ocorrendo

portanto alteração do meio; em caso contrário, ocorre a germinação dos esporos

que é observada a partir da viragem do indicador para amarelo, pela produção de

ácido e turbidez em conseqüência do crescimento do microrganismo (MERCK,

1994).

3.2.2.3 Enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli, contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva, contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens • Preparo da amostra

Foram assepticamente pesados 25g da amostra de salsicha “hot dog” em

envelope estéril próprio para a técnica, adicionados de parte dos 225mL de solução

salina peptonada 0,1% - SSP 0,1% (BRASIL, 2003), sendo cada envelope colocado

no aparelho “stomacher” (SEWARD® Stomacher 80) para cominuição e

homogeneização por aproximadamente dois minutos.

A partir desta suspensão amostral (diluída 10-1) foram realizadas diluições

decimais seriadas de 10-2 a 10-10 que serviram de inóculos para os diferentes meios

de isolamento.

108

3.2.2.3.1 Enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC - Método 1

• Teste presuntivo A partir da diluição 10-1, foram inoculados 10mL em uma série de três tubos

contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração dupla; das diluições 10-2 a

10-10, foram inoculados 1 mL em caldo lauril sulfato de sódio (Oxoid® CMS0451) em

uma série de três tubos com concentração simples. Os tubos inoculados foram

incubados por 24-48horas a 36ºC ± 1ºC (Estufa Termolyne® Type 42000). Após a

incubação, a presença de gás nos tubos de Durham indicou presença presuntiva de

coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC.

• Teste confirmatório

Para a realização do teste confirmativo da presença de coliformes a 35ºC, foi

repicado, com o auxílio da alça, os cultivos com presença de gás para tubos

contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose (Oxoid® CM0031) que foram

incubados por 24-48horas a 36ºC ± 1ºC.

A presença de coliformes a 35ºC foi confirmada pela produção de gás no

interior do tubo de Durhan.

Para a realização do teste confirmativo da presença de coliformes a 45ºC, foi

repicado com o auxílio da alça os cultivos com presença de gás para tubos contendo

caldo EC (Merck® nº 110765) que foram incubados por 24-48horas a 45ºC ± 0,2ºC,

em banho-maria com agitação (Polyscience® 8201).

A presença de coliformes a 45ºC foi confirmada pela produção de gás no tubo

de Durhan.

Os resultados dos tubos positivos foram anotados, de cada uma das

diluições. Em seguida, foi realizado o cálculo do número mais provável (NMP) por

grama de amostra analisada, aplicando-se a seguinte fórmula:

NMP= NMP da tabela x fator de diluição intermediária 100

A tabela para obtenção do NMP utilizada foi baseada nas seguintes fontes:

AOAC (1980), APHA (1992) e APHA (2001).

3.2.2.3.2 Enumeração de coliformes a 35ºC e E. coli - Método 2 (FRANCO; MANTILLA, 2004)

109

A partir das diluições 10-2 a 10-10, foram semeados 100µL em séries de três

tubos tipo “eppendorfs” contendo 1000µL do meio “Fluorocult LMX Broth Modified

acc. to Marrafi and Osmer” (Merck® nº 10620), sendo incubados a 36ºC ± 1ºC por

24-48 horas. Logo após a incubação procedeu-se a leitura e interpretação do teste.

Neste meio de cultivo a alta qualidade alimentícia e o tampão de fosfatos

garantem um rápido crescimento de coliformes. O lauril sulfato presente inibe as

bactérias Gram positivas. A identificação simultânea de coliformes a 35ºC e E. coli é

possível pela adição de substrato cromógeno 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-

galactopiranosideo (X-GAL), o qual é metabolizado pelos coliformes e produzem

uma viragem de cor do meio para verde azulado. O 1-isopropil-β-D-1-

tiogalactopiranosideo (IPTG) atua como substância intensificadora da síntese

enzimática e aumenta a atividade da β-D-galactosidase. O substrato fluorógeno 4-

metilumbeliferil-β-D-glucoronídeo é metabolizado pela enzima β-D-glucorinidase

altamente específica para E. coli, cuja presença é comprovada pela exposição à luz

ultravioleta mediante o aparecimento de fluorescência. O conteúdo de triptofano do

meio de cultivo melhora a reação do indol, obtida a partir da adição do reativo de

Kovac’s onde, na presença do indol, ocorre o desenvolvimento de um anel

vermelho-violeta na superfície do meio de cultura, indicando teste positivo (MERCK,

1994).

A leitura foi realizada com auxílio de lâmpada ultravioleta, onde os tubos tipo

“eppendorfs” positivos para coliformes a 35ºC contêm meio com uma coloração azul

esverdeada, e os positivos para E. coli, fluorescência azul esverdeada e indol

positivos. Os tubos tipo “eppendorfs” positivos foram anotados em cada uma das

diluições para, em seguida, ser feito o cálculo do NMP por grama de amostra,

aplicando-se a seguinte fórmula:

NMP= NMP da tabela x fator de diluição intermediário x 10 (fator de correção) 100 A tabela para obtenção do NMP utilizada foi baseada nas seguintes fontes:

AOAC (1980), APHA (1992) e APHA (2001).

3.2.2.3.3 Contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva

• Contagem

110

A partir das diluições 10-2 a 10-4, foi inoculado 0,1mL em placas de ágar Baird

Parker (Merck® nº 5406). Com auxílio do bastão de “hockey”, o inóculo foi

espalhado sobre a superfície do ágar e após a absorção as placas foram incubadas

invertidas por 24-48 horas a 36ºC ± 1ºC.

Com a inoculação em ágar Baird Parker pode-se evidenciar a habilidade dos

Staphylococcus spp. crescerem na presença de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio

em combinação com 0,2 a 0,5% de cloreto de lítio e 0,12 a 1,26% de glicina. Desta

forma, o S. aureus reduzem anaeróbia e aerobiamente o telurito, produzindo

colônias pretas e a suplementação com gema de ovo possibilita a verificação das

atividades lipolítica e proteolítica do microrganismo em questão, por meio do

aparecimento de um halo de transparência e um de precipitação ao redor da colônia,

respectivamente.

Em suma, as colônias típicas de Staphylococcus spp., incluindo o S. aureus,

se apresentarão com as seguintes características: puntiformes, pretas, com halos

transparentes, rodeadas por uma zona opaca, brilhantes e convexas.

Excepcionalmente, espécies não lipolíticas produzem colônias sem halo de

transparência e zona opaca ao seu redor.

Para as provas complementares (coloração pelo método de Gram, prova da

coagulase, pesquisa da termonuclease e prova da catalase) foram selecionadas

cinco colônias típicas e/ou atípicas.

• Coloração pelo método de Gram modificado por Hucker

No teste de Gram, a partir da verificação das características morfológicas e

tintoriais, a presença de cocos Gram-positivos indica a possível presença de

Staphylococcus spp.

• Prova da coagulase

Para o teste da coagulase, foram transferidas, com auxílio da agulha, cinco

colônias típicas e/ou atípicas selecionadas das placas de cultura para tubos

contendo 2mL de caldo “BHI” (Oxoid® CM225), que foram incubados por 18-24h a

36ºC ± 1ºC.

111

Esta prova baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o plasma

oxalatado de coelho pela ação da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.

Após a incubação, foram transferidos 0,3mL de cada tubo de cultivo em BHI para

tubos estéreis contendo 0,3mL de plasma oxalatado de coelho e incubados a 36ºC ±

1ºC por 6 horas. O plasma de coelho utilizado foi o Coagu-plasma Laborclin.

A formação de um coágulo grande e organizado ou a coagulação total foram

considerados resultados positivos para a prova; a formação de coágulo pequeno e

desorganizado ou organizado, foi avaliada em conjunto com provas

complementares.

• Prova da catalase

Na prova da catalase, com o auxílio de um bastão de vidro, foi retirada uma

alíquota do cultivo em “BHI” e transferido para uma lâmina contendo uma gota de

peróxido de hidrogênio 3%. A formação de bolhas indica prova positiva para

catalase, enzima que possui a capacidade de decompor o peróxido de hidrogênio e

liberar oxigênio. Esta prova é fundamental na separação dos Staphylococcus spp.

dos Streptococcus spp.

• Prova da termonuclease

Para pesquisa da termonuclease, os tubos de cultura mantidos em “BHI”

foram submetidos à fervura em banho-maria por 15 minutos. Então, inoculado no

ágar azul de toluidina-DNA (BRASIL, 2003), e incubado por quatro horas a 36ºC ±

1ºC em câmara úmida. Após a incubação o aparecimento de um halo rosa indica

prova positiva e característica de S. aureus, pois o mesmo, pela ação da enzima

Dnase, degrada o DNA em oligonucleotídios.

3.2.2.3.4 Contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens

• Contagem

112

A partir das diluições 10-1 a 10-3, foi inoculado 1mL em placas de ágar sulfito

polimixina sulfadiazina – SPS (Merck® nº 10235) pelo método de vazagem e

incubadas por 18-24horas a 36ºC ± 1ºC em jarra de anaerobiose. Após a inoculação

em meio de cultura seletivo e incubação em anaerobiose, os Clostridium spp.

formam colônias pretas, devido à reação de redução do sulfito a sulfeto, que reage

com citrato de amônia e ferro III, formando um precipitado preto (LABBE, 2001).

Após a incubação, foram selecionadas placas contendo Unidades Formadoras de

Colônias (UFC) típicas de Clostridium spp. sulfito redutores.

A condição de anaerobiose em jarra Gaspack foi obtida pelo método de

passivação do cobre, tendo como indicador de anaerobiose o meio tioglicolato com

resazurina conforme descreve Jürgensen e Jürgensen (s.d).

Para a realização dos testes confirmativos para Clostridium perfringens, nos

quais se evidenciam características de: imobilidade, redução de nitratos, produção

de ácido e gás a partir da lactose, fermentação da rafinose e liquefação da gelatina,

foi repicadas, com o auxílio da agulha, cinco colônias típicas para o ágar estoque e

cinco para caldo tioglicolato (Oxoid® CM0173), sendo incubados por 24 horas a

36ºC ± 1ºC em anaerobiose. Após a incubação foram realizados os seguintes testes:

• Coloração pelo método de Gram modificado por Hucker Após a verificação das características morfológicas e tintoriais, a partir da

coloração do esfregaço em lâmina pelo método de Gram, com a observação de

bastonetes retos com extremidades arredondadas e Gram-positivos, deu-se

prosseguimento aos demais testes confirmativos. Para coloração foi utilizada a

seguinte técnica:

1) Retirou-se do meio de cultura colônias isoladas, colocou-se na lâmina e

adicionou-se uma gota de solução salina estéril para obter-se a suspensão;

2) Secou-se a lâmina (sobre a chama);

3) Colocou-se solução de cristal violeta, deixando por 1min;

4) Lavou-se a lâmina com água destilada;

5) Colocou-se o lugol por 1min;


113

7) Colocou-se o álcool (lâmina inclinada) por alguns segundos;


9) Colocou-se fucsina por 30s;

10) Secou-se com papel absorvente (não esfregar);

11) Observou-se ao microscópio sob imersão.

• Fermentação tempestuosa (“storm test")

Foi transferido 1 mL da cultura recente obtida no meio tioglicolato para o meio

leite com ferro (BRASIL, 2003). Após a inoculação foi adicionado selo estéril e

incubou-se a 46 ± 1ºC em banho-maria por 18 horas. Este teste é baseado na

fermentação tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro. Esta

fermentação caracteriza-se pela formação de coágulo bem definido, com grande

formação de gás, durante a incubação em temperatura seletiva.

• Prova da motilidade e redução do nitrato

Foi repicada uma alíquota da cultura em ágar estoque (BRASIL, 2003) para o

meio motilidade nitrato (Difco® BD4068508), sendo incubado por 24 horas a 36ºC ±

1ºC.

O teste da motilidade é negativo na ocorrência de Clostridium spp. sulfito

redutores, onde o crescimento se dá apenas na linha de inoculação, e o teste da

redução do nitrato positivo, onde ocorre o aparecimento da coloração vermelha,

após a adição de solução de alfa-naftilamina 0,5% e de ácido sulfanílico 0,8%,

indica positividade da prova e característica de C. perfringens.

• Prova da lactose e da gelatina

114

Foi repicada uma alíquota da cultura em ágar estoque para o meio lactose

gelatina (BRASIL, 2003) e incubado por 24-44horas a 36ºC ± 1ºC. Após incubação

os tubos foram mantidos em geladeira por 1 hora.

A fermentação da lactose é indicada pela formação de bolhas de gás e pela

mudança da cor do meio de vermelho para amarelo e a gelatina torna-se liquefeita

na presença de C. perfringens permanecendo neste estado após a refrigeração.

• Prova da fermentação da rafinose Foi repicada uma alíquota da cultura isolada em ágar estoque para um tubo

de fermentação contendo caldo para fermentação de carboidratos adicionado de 1%

de rafinose (BRASIL, 2003). Após a inoculação adicionou-se selo estéril (óleo

mineral) e incubou-se por 72h a 36ºC ± 1ºC. A fermentação da rafinose é indicada

pela viragem do meio para amarelo, o C. perfringens fermenta a rafinose.

3.2.2.4 Detecção de Salmonella spp. A detecção de Salmonella spp. é dividida nas seguintes etapas: pré-

enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento e seleção, triagem bioquímica,

identificação bioquímica e prova de soroaglutinação.

• Preparo da amostra

Foram assepticamente coletados 25g de amostra de salsicha “hot dog” para

detecção de Salmonella spp. Em envelopes estéreis próprios para técnica, foram

adicionados parte da solução salina peptonada tamponada 1% - SSPT1% (Oxoid®

CM0509), sendo encaminhadas para o aparelho “stomacher” para cominuição e

homogeneização em velocidade média por dois minutos.

• Pré-enriquecimento

115

O meio de pré-enriquecimento foi completado até aos 225 mL de SSPT1%,

homogeneizados e deixados em repouso em temperatura ambiente por

aproximadamente 60 minutos. A suspensão amostral foi incubada por, no mínimo,

16 horas e não mais que 20 horas a 36ºC ±1ºC. Este procedimento visa promover a

recuperação das células bacterianas que em virtude do processamento industrial,

neste caso tratamento térmico e cura, sofreram estresse, mas não foram inativadas

biologicamente. A utilização de SSPT1%, promove a manutenção do pH em torno de

7,0, impedindo que as bactérias presentes acidifiquem o meio impedindo a

recuperação das salmonelas.

• Enriquecimento seletivo

Após a incubação o cultivo foi homogeneizado e transferido 1mL do pré-

enriquecimento para tubos contendo 10mL de caldo tetrationato (Oxoid® CM0029) e

1mL para tubos contendo 10mL de caldo selenito-cistina (Merck® nº 1077090500),

em seguida foram incubados a 41ºC ± 0,5ºC (Estufa FANEM Ltda.) por 24 a 30

horas. Nesta etapa, a presença de substâncias inibidoras e a temperatura de

incubação são os fatores de seletividade que favorecem o crescimento do

microrganismo em questão. No caldo tetrationato os agentes inibidores são o

tetrationato e o verde brilhante que agem sobre microrganismos Gram positivos, no

caldo selenito-cistina, o agente inibidor é o selenito de sódio que atua sobre os

coliformes e enterococos.

• Isolamento e seleção

A partir dos tubos com cultura foi realizado o plaqueamento seletivo, onde os

mesmos foram homogeneizados e os cultivos inoculados em placas de cultura com

os seguintes meios: bismuto sulfito – BS (Merck® nº 5418), xilose lisina desoxicolato

– XLD (Merck® nº 5287) e Hecktoen enteric – HE (Merck® nº 11681) e então

incubados por 24 ± 2 horas a 36ºC ±1ºC.

116

Após a incubação as placas inoculadas que possuíam colônias com as

características abaixo descritas foram consideradas suspeitas e submetidas a

coloração pelo método de Gram e posteriormente aos testes bioquímicos.

1) No ágar BS, o verde brilhante e o bismuto inibem consideravelmente os

microrganismos acompanhantes, as colônias típicas se apresentarão pretas,

devido o sulfito de ferro, pequenas, com halo esbranquiçado e com brilho

metálico, em virtude da redução dos íons bismuto a bismuto metálico. As

colônias podem sofrer mudanças do marrom para o preto com aumento do

tempo de incubação para produzir, por assim dizer, o efeito do halo. Se não

houver crescimento em 24 horas nas placas de ágar BS, deve-se reincubar

por mais 24 horas e realizar nova leitura.

2) No ágar HE os sais biliares inibem grande parte da flora acompanhante, as

salmonelas produzem colônias verde-azuladas, em virtude dos indicadores

azul de bromotimol e fucsina ácida, com halo e/ou centro enegrecidos. A

produção de H2S pode levar ao aparecimento de colônias completamente

pretas, pela combinação do tiossulfato com um sal de ferro. Espécies atípicas,

lactose ou sacarose positiva e coliformes levam a produção de colônias

róseas.

3) No ágar XLD as colônias típicas são geralmente róseas com halo ou centro

pretos. A produção de H2S é evidenciada devido à presença de sais de ferro e

tiossulfato, como dito anteriormente, leva à produção de colônias totalmente

pretas. As espécies atípicas lactose e sacarose positiva e os coliformes

surgem como colônias amarelas, com halo ou centro enegrecidos. A

diferenciação das cores deve-se à degradação a ácido da xilose, lactose e

sacarose em presença do indicador de pH vermelho de fenol, e a

descarboxilação da lisina produzindo cadaverina é reconhecida pela presença

de uma coloração vermelho-escuro, devido ao aumento de pH ao redor das

colônias (ANDREWS et al., 2001; MERCK, 1994).

• Coloração pelo método de Gram modificado por Hucker

Após a verificação das características morfológicas e tintoriais, a partir da

coloração do esfregaço em lâmina pelo método de Gram, com a observação de

117

bastonetes Gram-negativos, deu-se prosseguimento aos demais testes

confirmativos.

• Triagem bioquímica

As placas que possuíam colônias suspeitas foram selecionadas. Destas três

ou mais colônias foram inoculadas em “Triple Sugar Iron Agar” – “TSI” (Isofar® nº

2051), onde verificou-se a produção de H2S e a utilização da glicose, sacarose e

lactose; e em “Lysine Iron Agar” – “LIA” (Merck® nº 111640), onde monitorou-se a

produção de H2S e a descarboxilação da lisina. Estes cultivos foram incubados por

24 horas a 36ºC ± 1ºC.

Esta etapa baseia-se na evidenciação das propriedades fisiológicas e

metabólicas das culturas suspeitas em meios indicativos não seletivos, onde a

observação do fenótipo indica a bactéria presente.

Com o crescimento da Salmonella spp. no meio “TSI”, ocorre formação de

uma coloração amarela na base do tubo pela fermentação da glicose; indicação da

produção de ácido pelo vermelho de fenol; uma coloração vermelha no ápice pela

utilização da peptona como fonte de nitrogênio, pela produção de radicais alcalinos e

o indicador vermelho de fenol em meio básico permanece vermelho; além de uma

cor preta pela redução do tiossulfato de sódio do meio pelo microrganismo,

formando H2S, na fase intermediária. Já o meio “LIA”, apresenta a base e o ápice

com uma coloração violeta pela descarboxilação da lisina que forma a cadaverina,

um composto alcalino que neutraliza o ácido pela utilização da glicose, além da

coloração preta pela formação do H2S.

A partir daí, foram realizadas provas bioquímicas complementares daqueles

cultivos que apresentaram comportamento atípico próprio das Salmonella spp.,

como por exemplo, fermentação da lactose (bisel do “TSI” e “LIA” ácidos),

fermentação da sacarose (bisel do “TSI” ácido), não produção de H2S e não

descarboxilação da lisina.

A confirmação foi feita com o teste de soroaglutinação, inoculando-se a

cultura em ágar nutriente (Merck® nº 5450) inclinado. Obteve-se cultivo em fase

logarítimica, incubando-se por 24 horas a 36ºC ± 1ºC.

118

• Identificação bioquímica Muitos testes bioquímicos podem ser utilizados para identificação da

Salmonella spp., contudo, esta identificação pode ser obtida com testes que incluem

reações em “TSI”/”LIA”, prova da uréia, prova do citrato, prova do indol-sulfeto-

motilidade, prova da oxidase, prova do VP, prova da fenilalanina e prova da redução

do nitrato. Estes testes, geralmente, são suficientes para indicar a presença de

Salmonella spp.

Para prova da uréia, a cultura foi inoculada em caldo uréia (Oxoid CN0071)

incubado por 24horas a 36ºC ± 1ºC. Neste meio não havendo crescimento do

microrganismo, a manutenção da coloração inicial indica que não ocorreu a hidrólise

da uréia, comportamento típico das Salmonella spp. A alcalinização do meio indica a

ação da urease.

Para o teste do citrato, a cultura foi inoculada no meio citrato de Simmon’s

(Merck® nº 1025010500) e incubada por 24 horas a 36ºC ± 1ºC. Após a incubação

o crescimento foi observado pela mudança da cor original do meio para azul.

Contudo, diversas espécies de Salmonella spp. não utilizam o citrato como fonte de

carbono.

Após a inoculação no meio Sulfeto-Indol-Motilidade – SIM (Merck® nº

105450) e incubação por 24 horas a 36ºC ± 1ºC, as cepas típicas de Salmonella

spp. produziram H2S com isto o meio adquiriu uma cor preta. Pode ocorrer ou não o

crescimento difuso pelo meio, indicando a motilidade da maioria das salmonelas.

Foram adicionadas três gotas do reativo de Kovac’s para a prova do indol. O

desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfície do meio de cultura,

indica teste positivo, contudo a Salmonella spp. é indol negativa.

Para a prova da oxidase, do cultivo presente no ágar nutriente foi retirada

uma alíquota com auxílio de palitos de madeira estéries e espalhada sobre tiras para

o teste da oxidase (Probac®) impregnadas com o reagente (4n-tetrametil-parafileno-

diamina). No caso de Salmonella spp. a reação é negativa, não ocorrendo formação

de cor vermelha ou azul.

No caldo “MR-VP” (Merck® nº 105712), a cultura foi inoculada e incubada por

24 horas a 36ºC ± 1ºC, e o resultado é considerado negativo para Voges-Proskauer,

quando não houver mudança de cor após a adição de 0,6mL de solução de alfa-

119

naftol 5% e, em seguida, adiciona-se 0,2mL de solução de hidróxido de potássio

40% e agitação do tubo para oxigenação do meio, em se tratando de Salmonella

spp.

O meio usado para a prova da fenilanina foi o ágar fenilalanina (BRASIL,

2003), e após incubação por 24 horas a 36ºC ± 1ºC, o cultivo foi coberto com uma

solução de cloreto férrico a 10%. Se o meio permanecer com a cor amarela indica

prova negativa e característica de Salmonella spp.

Para a prova de redução do nitrato a cultura foi inoculada em caldo nitratado

motilidade e incubada por 24 horas a 36ºC ± 1ºC, adicionado 0,5mL de solução de

alfa-naftilamina 0,5% e 0,5mL de ácido sulfanílico 0,8%. O aparecimento da

coloração vermelha indica a positividade da prova próprio das salmonelas e demais

componentes da família Enterobacteriaceae (KORNACKI; JOHNSON, 2001). Sendo

importante salientar que a identificação foi complementada com testes sorológicos,

pois nem todas Salmonella spp. produzem reações bioquímicas típicas.

• Sorologia O gênero Salmonella é caracterizado sorologicamente pelos seus

componentes antigênicos. A Salmonella spp. foi identificada a partir das reações

bioquímicas presuntivas e do teste sorológico positivo, pela técnica de aglutinação

em lâmina, para os antígenos O dos grupos A,B,C,D, e E, antígeno Vi e antígenos

flagelares a; b; c; d; i; 1, 2, 5 com a utilização do soro polivalente anti-salmonelas da

Probac do Brasil®. O soro polivalente anti-salmonelas é preparado de acordo com

os sorotipos de Salmonella spp. recomendados por Edwards e Ewing (1972), que

aglutina a grande maioria das amostras de Salmonella spp. isoladas comumente de

humanos e dos animais.

Para o controle dos testes de soroaglutinação, misturou-se três gotas de soro

a três gotas de solução salina estéril para verificação de possível autoaglutinação do

mesmo. O soro utilizado nesta pesquisa não era autoaglutinável.

Desta forma, pode-se confirmar a presença de tais microorganismos nos

produtos analisados, podendo inclusive avaliar o grau de comprometimento na

ocorrência de doença ao consumidor e o estado higiênico-sanitário destes produtos,

120

quando relacionados à presença de bactérias envolvidas em casos de Enfermidades

Transmitidas por Alimentos (ETA).

3.2.2.5 Determinação de atividade de água (Aa) e pH As amostras de salsichas “hot dog” foram encaminhadas ao Laboratório de

Controle Físico-Químico da Faculdade de Veterinária da UFF, Niterói-RJ.

3.2.2.5.1 Determinação do pH Para determinação do pH foi utilizada a metodologia com base nas técnicas

descritas no pelo LANARA (BRASIL, 1981), sendo pesados 50g de amostra em um

“becher” e adicionados 10mL de água destilada sendo homogeneizados com o

auxílio do bastão de vidro e então procedida a leitura do pH, com o uso de um

pHmetro (Handylab® 1) previamente calibrado com soluções tampão (pH 4,0 e 7,0).

3.2.2.5.2 Determinação da Aa Para determinação da atividade de água (aa) foi utilizado o aparelho Pawkit

Decagon®. A preparação da amostra e a utilização do aparelho foram realizadas

conforme instruções descritas no manual de operação.

No Pawkit, após a colocação da amostra no compartimento, um sensor de

umidade dielétrico detecta as mudanças na condução elétrica que ocorrerão com a

alteração da umidade relativa do compartimento. Por monitoração da mudança da

condição elétrica, a umidade relativa do espaço é computada. Quando a atividade

de água da amostra e a umidade relativa do ar atingem o equilíbrio, a medida da

umidade do espaço fornece a atividade de água da amostra.

3.3 ANÁLISE ESTATISTICA DOS RESULTADOS

A análise estatística dos dados foi determinada pela média aritmética,

variações entre as médias, adotando-se a análise da variância para os dados de pH

121

e Aa; os dados das análises bacteriológicas foram analisados segundo o critério de

ocorrência ou não ocorrência (RODRIGUES, 1993).

4 RESULTADOS

Os resultados das análises bacteriológicas realizadas comparados com os

padrões estabelecidos pela Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001

(BRASIL, 2001), podem ser visualizados na Tabela 1. Do total de 100 amostras de

salsichas “hot dog” analisadas, 25 eram do tipo tradicional (carne bovina)

comercializadas em embalagem a vácuo (TV), 25 do tipo frango (carne de frango)

comercializadas a vácuo (FV), 25 do tipo tradicional comercializadas a granel (TG) e

25 do tipo frango comercializadas a granel (FG).

Tabela 1: Resultado das análises bacteriológicas realizadas em amostras de salsichas tipo “hot dog”.

Procedimento analítico Limite * Amostras

analisadas Amostras positivas

Amostras dentro do

padrão

Amostras fora do padrão

Coliformes a 45ºC 103/g 100 17 84 16

Staphylococcus spp. coagulase positiva

3x103/g 100 42 79 21

Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC

5x102/g 100 5 95 5

Detecção de Salmonella spp.

Ausência em 25g

100 3 97 3

(*) Resolução RDC no 12 (Brasil, 2001).

Em relação à ocorrência de coliformes a 45ºC (Figura 1), verificou-se que 83

amostras de salsichas “hot dog” apresentaram ausência de coliformes a 45ºC;

destas, 22 amostras corresponderam a TV, 22 amostras a FV, 24 amostras a TG e

15 amostras FG. Uma amostra FG apresentou valor de NMP1 dentro do limite

123

estabelecido pela legislação vigente e um total de 16 amostras valores acima do

limite estabelecido. Nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional, os

coliformes a 45ºC apresentaram valores de NMP1 acima do limite num total de

quatro amostras, sendo três amostras (12%) TV (Figura 2) e uma amostra (4%) TG

(Figura 3); nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango foram encontrados em 12

amostras, sendo três amostras (12%) FV (Figura 4) e nove amostras (36%) FG

(Figura 5).

Figura 1: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel.

.

Figura 2: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo.

88%

12%

Ausência de coliformes a 45ºC Acima de 103/g

83%

1% 16%

Ausência de coliformes a 45ºC Até 103/g Acima de 103/g

124

Figura 3: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel.

Figura 4: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo.

Figura 5: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas tipo frango comercializadas a granel.

96%

4%


88%

12%


60% 4%

36%

Ausência de coliformes a 45ºC Até 103/g Acima de 103/g

125

Comparando os resultados obtidos entre as amostras de salsichas “hot dog”

analisadas, quanto a enumeração de coliformes a 45ºC, constatou-se que as

amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a

vácuo comportaram-se de maneira semelhante quanto a ocorrência de coliformes a

45ºC, ambos os tipos tiveram 12% das amostras com valores de NMP1 acima do

limite estabelecido. Entretanto, as amostras “hot dog” tipo tradicional e tipo frango

comercializadas a granel apresentaram percentagens de ocorrência bem

diferenciadas, onde apenas 4% das amostras TG encontraram-se acima do limite

estabelecido, em contrapartida, coliformes a 45ºC foram encontrados em 40% das

amostras FG, sendo 36% com valores de NMP1 acima do limite estabelecido (Figura

6).

Figura 6: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de coliformes a 45ºC nas amostras de salsichas “hot dog” analisadas em relação ao tipo e à forma de comercialização.

(*) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo. (**) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo. (***) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. (****) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

Em 37 amostras de salsichas “hot dog” detectaram-se Staphylococcus spp.

coagulase positiva, sendo cinco amostras TV, 11 amostras FV, seis amostras TG e

15 amostras FG. Das amostras de salsichas “hot dog” analisadas 63% apresentaram

ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva; destas 20 amostras TV, 14

amostras FV, 17 amostras TG e 10 amostras FG, como demonstra a Figura 7. Das

amostras de salsichas “hot dog” positivas, 21 amostras encontravam-se em

desacordo com o limite estabelecido para este tipo de alimento, sendo três amostras

de salsichas “hot dog” tipo tradicional, uma amostra (4%) TV (Figura 8) e duas

12 12

4

36

4

0

10

20

30

40

Acima de 103/g TV*

Acima de 103/g FV**

Acima de 103/g TG*** Acima de 103/g FG**** Até 103/g FG

126

amostras (8%) TG (Figura 9); e 18 amostras de salsichas “hot dog” tipo frango, seis

amostras (24%) FV (Figura 10) e 12 amostras (48%) FG (Figura 11).

Figura 7: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel. Figura 8: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo.

63% 21%

16%

Ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva

Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g

16% 4%

80%

Até 3x103/g Acima de 3x103/g Ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva

127

Figura 9: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. Figura 10: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo. Figura 11: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

68% 8%

24%

Ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g

56% 24%

20%

Ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva Acima de 3x103/g Até 3x103/g

40%

48%

12%

Ausência de Staphylococcus spp. coagulase positiva Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g

128

As amostras de salsichas “hot dog” tipo frango apresentaram maior número

de amostras positivas para Staphylococcus spp. coagulase positiva, onde 44% das

FV e 60% das FG foram positivas, contudo nas amostras de salsichas “hot dog” tipo

tradicional, 20% das TV e 32% das TG foram positivas para Staphylococcus spp.

coagulase positiva (Figura 12).

Figura 12: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras de salsichas “hot dog” em relação ao tipo e à forma de comercialização.

(*) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo. (**) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. (***) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo. (****) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

Em cinco amostras de salsichas “hot dog” foram detectados Clostridium spp.

sulfito redutores a 46ºC/ Cl. perfringens (Figura 13), que apresentaram contagens

acima do limite estabelecido pela legislação, sendo uma amostra (4%) TG e quatro

amostras (16%) FG (Figura 14). Verificou-se que os Clostridium spp. sulfito

redutores só estiveram presentes nas amostras de salsichas “hot dog”

comercializadas a granel de ambos os tipos. Do total de amostras de salsichas “hot

dog” analisadas 95% foram negativas (25 amostras TV, 25 amostras FV, 24

amostras TG e 21 amostras FG). Nas amostras comercializadas a vácuo não

ocorreram Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC.

4

12

24

48

16 16 20

12

0

10

20

30

40

50

60 Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g TV*

Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g TG** Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g FV*** Staphylococcus spp. coagulase positiva acima de 3x103/g FG**** Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g TV Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g TG Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g FV Staphylococcus spp. coagulase positiva até 3x103/g FG

129

Figura 13: Freqüência relativa dos resultados encontrados na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens em amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel. Figura 14: Freqüência relativa (%) dos resultados encontrados na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a granel.

(*) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. (**) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

Na pesquisa de Salmonella spp., 97 amostras de salsichas “hot dog”

apresentaram ausência deste microrganismo (Figura 15) e, em três amostras de

salsichas “hot dog” foi detectada a sua presença, sendo uma amostra (4%) TG e

duas amostras (8%) FG (Figura 16).

95%

5%

Ausência de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC Acima de 5x102/g

4% 16%

80%

Acima de 5x102/g TG*

Acima de 5x102/g FG** Ausência de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC

130

Figura 15: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na detecção de Salmonella spp. nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel. Figura 16: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na detecção de Salmonella spp. nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a granel.

(*) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. (**) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

Analisando o resultado do perfil bacteriológico das amostras de salsichas “hot

dog” em conjunto (Tabela 2), verificou-se que 47 amostras apresentaram ausência

dos microrganismos pesquisados e 52 amostras apresentaram-se positivas (em uma

amostra ocorreu o crescimento apenas de coliformes a 35ºC). Destas, 33 amostras

de salsichas “hot dog” encontraram-se fora do padrão estabelecido pela Resolução

RDC nº 12 (BRASIL, 2001), sendo três amostras TV, cinco amostras TG, sete

amostras FV e 18 amostras FG. Do total de amostras de salsichas “hot dog” fora dos

padrões: 21amostras encontravam-se fora do padrão em uma análise, sendo sete

amostras tipo tradicional, onde duas amostras (8%) TV e cinco amostras (20%) TG;

97%

3%

Ausência de Salmonella spp.

Presença de Salmonella spp.

42%

4% 8%

46%

Ausência de Salmonella spp. TG*

Ausência de Salmonella spp. FG**

Presença de Salmonella spp. TG

Presença de Salmonella spp. FG

131

e 14 amostras tipo frango, sendo cinco amostras (20%) FV e 9 amostras (36%) FG;

dez amostras encontraram-se fora dos padrões em duas análises, onde uma

amostra (4%) TV, duas amostras (8%) FV e sete amostras (28%) FG; e duas

amostras (8%) FG foram condenadas em três análises. Nenhuma amostra

encontrou-se fora do limite estabelecido por lei em quatro análises (Figura 17).

Figura 17. Freqüência relativa (%) das amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel fora do padrão estabelecido por lei quanto o número de análises.

(*) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo.

(**) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo.

(***) Salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel.

(****) Salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

É importante salientar que das 38 amostras positivas para um agente, 25

foram positivas para Staphylococcus spp. coagulase positiva, sendo quatro TV, nove

FV, seis TG e seis FG; sete foram positivas para coliformes a 45ºC, sendo duas TV,

uma FV, uma TG e três FG; uma amostra TV foi positiva para Clostridium sulfito

redutores a 46ºC e C. perfringens; três foram positivas para Salmonella spp., sendo

uma TG e duas FG; 1 amostras foram positivas para dois agentes, sendo oito

amostras positivas para Staphylococcus spp. coagulase positiva e coliformes a 45ºC

(uma TV, duas FV e cinco FG) e duas amostras FG foram positivas para

Staphylococcus spp. coagulase positiva e Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e

Clostridium perfringens; duas amostras FG foram positivas para três agentes

(Staphylococcus spp. coagulase positiva, coliformes a 45ºC e Clostridium spp.

sulfito redutores a 46ºC e C. perfringens).

Ainda com relação a presença de coliformes a 45ºC (Tabela 3),

especificamente, a Escherichia coli, 15 amostras de salsichas “hot dog”

8

20 20

36

4 8

28

8

0

5

10

15

20

25

30

35

40 Fora do padrão em 1 análise TV*

Fora do padrão em 1 análise FV**

Fora do padrão em 1 análise TG***

Fora do padrão em 1 análise FG****

Fora do padrão em 2 análises TV

Fora do padrão em 2 análises FV

Fora do padrão em 2 análises FG

Fora do padrão em 3 análises FG

132

apresentaram valores de NMP2 acima do limite estabelecido (Figura 18), sendo

cinco amostras tipo tradicional, quatro amostras (16%) TV (Figura 19) e uma

amostra (4%) TG (Figura 20), e 10 amostras tipo frango, uma amostra (4%) FV

(Figura 21) e nove amostras (36%) FG (Figura 22). Os métodos NMP1 e NMP2

concordaram quanto à presença de coliformes a 45ºC e E. coli em 14 amostras.

Tabela 3: Enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli em salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel.

NMP1* NMP2** Amostras / Nº Coliformes a

35ºC Coliformes a

45ºC Coliformes a

35ºC Escherichia

coli 1 <3 <3 2,4x107 <3 3 <3 <3 2,4x1010 1,5x109

4 2,4x1010 2,4x108 1,1x1010 1,5x109 5 2,4x109 2,4x109 4,6x108 4,6x106

6 1,1x106 7,0x105 2,4x1010 2,4x1010

7 <3 <3 2,4x1010 <3 8 <3 <3 2,4x1010 <3

12 <3 <3 9,0x102 <3 13 <3 <3 4,6x1010 <3 14 <3 <3 1,5x1010 <3 26 <3 <3 2,4x107 <3 27 2,4x108 2,4 x108 <3 <3 28 2,4 x108 2,4 x106 <3 <3 29 2,4 x1010 2,4 x109 2,4x1010 2,4x1010 37 <3 <3 4,0x102 <3 38 <3 <3 4,0x102 <3 39 <3 <3 4,6x104 <3 40 <3 <3 2,3x103 <3 41 <3 <3 9,3x109 <3 68 4,3x102 <3 <3 <3 69 4,3 x102 <3 <3 <3 71 <3 <3 4,0x102 <3 73 1,5x103 1,5x103 2,4x104 <3 74 2,1x103 0 2,4x106 1,1x106

79 9,3x102 4,3 x102 <3 <3 83 4,6 x106 4,6 x103 <3 <3 84 <3 <3 4,0x102 <3 85 1,1x104 2,4 x103 2,4x104 2,4x104

86 <3 <3 4,6x104 <3 87 <3 <3 2,4x103 <3 88 <3 <3 7,5x103 4,3x103

89 <3 <3 4,6x104 <3 90 <3 <3 4,6x105 4,6x105

91 1,1 x105 1,1 x105 <3 <3

133

Continuação da Tabela 3: Enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli em salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel. 93 2,4 x105 1,1 x105 2,4x106 2,4x106

94 2,4 x105 1,1 x105 2,4x105 2,4x105

95 2,1x103 2,1x103 1,5x105 2,4x104

96 2,1x103 2,1x103 1,1x106 2,1x104

98 4,3x102 <3 1,1x108 1,1x108

99 1,1x105 1,1x104 1,5x105 2,1x104

(*) Enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC - Método 1 (Brasil, 2003). (**)Enumeração de coliformes a 35ºC e E. coli - Método 2 (FRANCO; MANTILLA, 2004).

Figura 18: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli, nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel . Figura 19: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a vácuo.

85%

15%

Ausência de E. coli Acima de 103/g

84%

16%

Ausência de E. coli Acima de 103/g

134

Figura 20: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializadas a granel. Figura 21: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo. Figura 22: Freqüência relativa (%) dos resultados obtidos na enumeração de Escherichia coli nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel.

96%

4%

Ausência de E. coli

Acima de 103/g

96%

4%


Acima de 103/g

64%

36%


Acima de 103/g

135

Nas análises bacteriológicas as determinações quantitativas apresentaram as

seguintes variações: Staphylococcus spp. coagulase positiva ≥102 a 3,8x106 UFC/g;

Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC ≥2,7x104 a 6,6x105 UFC/g; Cl. perfringens

≥2,16104 a 6,6x105 UFC/g; Coliformes a 35ºC (Enumeração de coliformes a 35ºC e

coliformes a 45ºC pelo método 1 - NMP1) ≥4,3x102 a 2,4x1010 NMP/g; Coliformes a

35º (Enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 - NMP2)

≥4,0x102 a 2,4x1011 NMP/g; Coliformes a 45ºC ≥4,3x102 a 2,4x109 NMP/g e

Escherichia coli ≥4,3x104 a 2,4x1011 NMP/g.

As estimativas de coliformes a 35ºC das amostras de salsichas “hot dog”

analisadas na enumeração de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC pelo método 1-

NMP1 (Tabela 3) foram analisados segundo o critério de ocorrência ou não

ocorrência, originando a Tabela 4.

Tabela 4: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1).

Tipos Vácuo Granel Total Tradicional 22 (3) 21 (4) 43 (7) Frango 22 (3) 14 (11) 36 (14) Total 44 (6) 35 (15) 79 (21)

O teste χ2 foi aplicado para testar a hipótese de independência entre os tipos

de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de coliformes a 35ºC na

enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC no método 1 (NMP1) e pelo

χ2calc = 0,79 verificou-se que a não ocorrência de coliformes a 35ºC independe da

embalagem em relação ao tipo de salsicha (p>0,05). Em outras palavras, não houve

influência da embalagem sobre o tipo de salsicha com relação a ocorrência de

coliformes a 35ºC no presente estudo.

Na Tabela 4.1 observa-se as percentagens de ocorrências de coliformes a

35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1

(NMP1).

136

Tabela 4.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango que ocorreram coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1).

Tipos Vácuo Granel Total Tradicional 12 16 14 Frango 12 44 28 Total 12 30 21


analisadas na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1

– NMP1 (Tabela 3) foram analisados segundo o critério de ocorrência ou não


Tabela 5: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 45ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1).

Tipos Vácuo Granel Total Tradicional 22 (3) 24 (1) 46 (4) Frango 22 (3) 15 (10) 37 (13) Total 44 (6) 39 (11) 83 (17) O teste χ2 foi aplicado para testar a hipótese de independência entre os tipos

de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de coliformes a 45ºC na

enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC no método 1 (NMP1) e pelo






45ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1

(NMP1).

Tabela 5.1. Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram coliformes a 45ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC pelo método 1 (NMP1).


137


analisadas na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2

(Tabela 3) foram analisados segundo o critério de ocorrência ou não ocorrência,

originando a Tabela 6.

Tabela 6: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2).



de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência coliformes a 35ºC na

enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli no método 2 - NMP2 e pelo






35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 –

NMP2.

Tabela 6.1. Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram coliformes a 35ºC na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2).


A estimativas de Escherichia coli das amostras de salsichas “hot dog”

analisadas na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 –

NMP2 (Tabela 3) foram analisados segundo o critério de ocorrência ou não


138

Tabela 7: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e granel que não ocorreram (ocorreram) Escherichia coli na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2).



de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de Escherichia coli na

enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli no método 2 (NMP2) e pelo

χ2calc = 1,51 verificou-se que a não ocorrência de Escherichia coli independe da



Escherichia coli no presente estudo.

Na Tabela 7.1 observa-se as percentagens de ocorrências de Escherichia coli

na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 - NMP2.

Tabela 7.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Escherichia coli na enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli pelo método 2 (NMP2).


Os dados de ocorrência de colônias típicas na contagem de Staphylococcus

spp. coagulase positiva das amostras de salsichas “hot dog” analisadas (Apêndice

9.1 - Tabela 2) foram analisados segundo o critério de ocorrência ou não ocorrência,

originando a Tabela 8.

Tabela 8: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) colônias típicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva.


de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de colônia típicas na

139

contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva e pelo χ2calc = 0,01 verificou-se

que a não ocorrência de colônias típicas independe da embalagem em relação ao

tipo de salsicha (p>0,05). Em outras palavras, não houve influência da embalagem

sobre o tipo de salsicha com relação a ocorrência de colônias típicas no presente

estudo.

Na tabela 8.1 observa-se as percentagens de ocorrências de colônias típicas

na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva.

Tabela 8.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram colônias típicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva.


Os dados de ocorrência de colônias atípicas na contagem de

Staphylococcus spp. coagulase positiva das amostras de salsichas “hot dog”

analisadas (Apêndice 9.1 - Tabela 2) foram analisados segundo o critério de

ocorrência ou não ocorrência, originando a Tabela 9.

Tabela 9: Quantidades de amostras de salsichas que não ocorreram (ocorreram) A dentro de SACP-ECP.



de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de colônias atípicas na

contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva e pelo χ2calc = 0,002 verificou-

se que a não ocorrência de colônias atípicas independe da embalagem em relação

ao tipo de salsicha (p>0,05). Em outras palavras, não houve influência da

embalagem sobre o tipo de salsicha com relação a ocorrência de colônias atípicas

no presente estudo.

Na tabela 9.1 observa-se as percentagens de ocorrências de colônias atípicas

na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva.

140

Tabela 9.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e granel que ocorreram colônias atípicas na contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva.


Os dados de Salmonella spp. na detecção de Salmonella spp. das amostras

de salsichas “hot dog” analisadas (Apêndice 9.1 - Tabela 2) foram analisados

segundo o critério de ocorrência ou não ocorrência, originando a Tabela 10.

Tabela 10: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a váuco e granel que não ocorreram (ocorreram) Salmonella spp. na detecção de Salmonella spp.


de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de Salmonella spp. na

detecção de Salmonella spp. e pelo χ2calc = 0,01 verificou-se que a não ocorrência

de Salmonella spp. independe da embalagem em relação ao tipo de salsicha

(p>0,05). Em outras palavras, não houve influência da embalagem sobre o tipo de

salsicha com relação a ocorrência de Salmonella spp. no presente estudo.

Na Tabela 10.1 observa-se as percentagens de ocorrências de Salmonella

spp. na detecção de Salmonella spp.

Tabela 10.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Salmonella spp. na detecção de Salmonella spp.


Os dados de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC na contagem de

Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens das amostras de

salsichas “hot dog” analisadas (Apêndice 9.1 - Tabela 2) foram analisados segundo

o critério de ocorrência ou não ocorrência, originando a Tabela 11.

141

Tabela 11: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) Clostridum spp. sulfito redutores a 46ºC na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens.


de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de Clostridum spp. sulfito

redutores a 46ºC na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e

Clostridium perfringens e pelo χ2calc = 0,11 verificou-se que a não ocorrência de

Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC independe da embalagem em relação ao

tipo de salsicha (p>0,05). Em outras palavras, não houve influência da embalagem

sobre o tipo de salsicha com relação a ocorrência de Clostridium spp. sulfito

redutores a 46ºC no presente estudo.

Na Tabela 11.1 observa-se as percentagens de ocorrências de Clostridium

spp. na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium

perfringens.

Tabela 11.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens.


Os dados de Clostridium perfringens na contagem de Clostridium spp. sulfito

redutores a 46ºC e Clostridium perfringens das amostras de salsichas “hot dog”

analisadas (Apêndice 9.1 - Tabela 2) foram analisados segundo o critério de

ocorrência ou não ocorrência, originando a Tabela 12.

142

Tabela 12: Quantidades de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que não ocorreram (ocorreram) Clostridium perfringens na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens.


de salsichas e embalagens com relação a não ocorrência de Clostridium perfringens

na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens.

e pelo χ2calc = 0,11 verificou-se que a não ocorrência de Clostridium perfringens

independe da embalagem em relação ao tipo de salsicha (p>0,05). Em outras

palavras, não houve influência da embalagem sobre o tipo de salsicha com relação a

ocorrência de Clostridium perfringens no presente estudo.

Na Tabela 12.1 observa-se as percentagens de ocorrências de Clostridium

perfringens na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium

perfringens.

Tabela 12.1: Percentagens de amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel que ocorreram Clostridium perfringens na contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens.


Os dados de pH das amostras de salsichas “hot dog” analisadas (Apêndice 9.1 - Tabela 2) foram submetidos à análise da variância, obtendo-se a Tabela 13. Tabela 13: Análise da variância dos valores de pH das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens.

Fontes de Variação GL SQ QM F Total 99 19,5074 Embalagens (vácuo x granel)

1 3,3051 3,3051 19,90*

Tipos (tradicional x frango)

1 0,1600 0,1600 -

Embalagens x tipos 1 0,0973 0,0973 - Erro 96 15,945 0,1661 Nota: - não significativo a 5% de probabilidade (p>0,05) (*) significativo a 1% de probabilidade (p<0,01)

143

Pela Tabela 13 verifica-se que houve efeito significativo (p<0,01) para os tipos

de embalagens, podendo-se afirmar estatisticamente (p<0,01) que o pH das

salsichas “hot dog” comercializadas a vácuo, independentemente dos tipos, têm em

média pH igual a 6,27 que foi superior ao pH médio das salsichas “hot dog”

comercializadas a granel, que foi de 5,90 (Tabela 15.1 e Figura 15.1).

Entretanto, não houve efeito significativo devido aos tipos bem como não

houve interação significativa entre embalagens e tipos (p>0,05), sendo que a média

de pH das salsichas “hot dog” tipo tradicional foi igual a 6,04 e o pH médio das

salsichas de frango foi 6,12 (Tabela 13.1 e Figura 13.1).

Tabela 13.1: Médias de pH das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens.

Tipos Vácuo Granel Média/tipo Tradicional 6,19 5,89 6,04 Frango 6,34 5,91 6,12 Média/embalagem 6,27 5,90 6,08 Figura 13.1: Médias de pH das amostras de salsichas “hot dog” segundo os tipos de embalagens.

Os dados de Aa das amostras de salsichas “hot dog” analisadas (Apêndice

9.1 - Tabela 2) foram submetidos à análise da variância, obtendo-se a Tabela 14. Tabela 14: Análise da variância dos valores de Aa das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens.

Fontes de Variação GL SQ QM F Total 99 0,1676 Embalagens (vácuo x granel)

1 0,0002 0,0002 -

Tipos (tradicional x frango)

1 0,0085 0,0085 5,67*

Embalagens x tipos 1 0,0125 0,0125 8,33** Erro 96 0,1464 0,0015 Nota: - não significativo a 5% de probabilidade(p>0,05) (*) significativo a 5% de probabilidade (p<0,05) (**) significativo a 1% de probabilidade (p<0,01)

6,27

5,9

5,6

5,8

6

6,2

6,4

Vácuo

Granel

144

Pela Tabela 14 verifica-se que não houve efeito significativo para os tipos de embalagens (p>0,05), enquanto que houve efeito significativo para os tipos de salsichas e a interação embalagens versus tipos. Assim, devido a interação ter sido significativa, optou-se para fazer um novo desmembramento da soma de quadrados de tratamentos, conforme Tabela 14.1. Tabela 14.1: Análise da variância dos valores de Aa das amostras de salsichas “hot dog’, segundo os tipos de salsichas e embalagens, com novo desdobramento da soma de quadrados de tratamentos.

Fontes de Variação GL SQ QM F Total 99 0,1676 Tipos (tradicional x frango)

1 0,0085 0,0085 5,67*

Embalagens d. tradicional 1 0,0079 0,0079 5,27* Embalagens d. frango 1 0,0048 0,0048 3,20 ns Erro 96 0,1464 0,0015 Nota: ns não significativo a 5% de probabilidade(p>0,05) (*) significativo a 5% de probabilidade (p<0,05)

Pela nova análise da variância pode-se verificar que houve efeito significativo

entre tipos de salsichas (p<0,05), onde a média de Aa (0,8850) das salsichas “hot

dog” tipo frango foi estatisticamente maior do que a média de Aa (0,8666) das

salsichas tipo tradicional, conforme Tabela 14.2 e Figura 14.2.

Nota-se, também, na análise da variância que houve efeito significativo entre

os tipos de embalagens ou formas de comercialização nas salsichas “hot dog” tipo

tradicional (p<0,05), o mesmo não ocorrendo entre os tipos de embalagens nas

salsichas “hot dog” tipo frango (p>0,05). A média de Aa da salsichas “hot dog” tipo

tradicional embaladas a vácuo foi igual a 0,8792, estatisticamente superior à média

de Aa das salsichas “hot dog” tradicional embaladas a granel, que foi 0,8540,

conforme Gráfico 14.2.

Tabela 14.2: Médias de Aa das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas e embalagens.

Tipos Vácuo Granel Média/tipo Tradicional 0,8792 0,8540 0,8666 Frango 0,8752 0,8948 0,8850 Média/embalagem 0,8772 0,8744 0,8758

145

Figura 14.1: Médias de Aa das amostras de salsichas “hot dog”, segundo os tipos de salsichas.

Figura 14.2 Médias de Aa das salsichas tradicionais entre os tipos de embalagens.

0,8666

0,8850

0,85

0,86

0,87

0,88

0,89

Tradicional

Frango

0,8792

0,8540

0,84

0,85

0,86

0,87

0,88

Vácuo

Granel

5 DISCUSSÃO Os produtos cárneos embutidos ocupam posição de destaque nas indústrias

alimentícias, além de apresentarem um grande consumo pela população em geral.

Os produtos de salsicharia são sujeitos a contaminação microbiana, o que diminui

seu prazo de validade e, através de sua ingestão, podem atuar como veículos de

patógenos. Por tal motivo, estes alimentos possuem padrões microbiológicos,

estabelecidos por lei, objetivando evitar tais acontecimentos visando a proteção da

saúde coletiva.

A enumeração de coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli nas 100

amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a

vácuo ou a granel pesquisadas, avaliadas pelos métodos 1 e 2, assim como a

contagem de Staphylococcus spp.coagulase positiva, detecção de Salmonella spp. e

a contagem de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC e Clostridium perfringens,

quando analisadas estatisticamente, não apresentaram diferenças estatísticas

significativas em relação aos tipos de salsichas nem quanto a forma de

comercialização (tipo de embalagem) quando avaliadas segundo o critério de

ocorrência ou não ocorrência, contudo os resultados encontrados são importantes

em diversos aspectos.

Os alimentos de origem animal podem desempenhar um importante papel na

veiculação de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli e seus

sorogrupos ao homem. Tem sido relatada a presença destes microrganismos em

produtos cárneos, inclusive naqueles em que a E. coli patogênica é implicada em

surtos de toxinfecção alimentar (MAGNANI et al., 2000). Em 17 amostras de

salsichas ‘hot dog”, verificou-se a presença de coliformes a 45ºC, sendo que em 15

amostras foi isolada a espécie E. coli, havendo a correspondência em 14 amostras

147

(Tabela 3). Os valores de NMP de coliformes a 45ºC ultrapassaram os limites

estabelecidos por lei em 16/17 amostras positivas, sendo três (12%) amostras de

salsichas “hot dog” tipo tradicional comercializada a vácuo (TV); três (12%) amostras

de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a vácuo (FV); uma (4%) amostra

de salsicha “hot dog” tipo tradicional comercializada a granel (TG) e nove (36%) de

salsichas “hot dog” comercializadas a granel (FG). Em todas as amostras positivas

para E. coli o limite legal foi ultrapassado, sendo quatro (16%) amostras TV; uma

(4%) amostra FV; uma (4%) amostra TG e nove (36%) amostras FG. Com base

nestes resultados pode-se enquadrar tais amostras como produtos em condições

higiênicas insatisfatórias, contudo deve-se ressaltar que conforme os resultados

encontrados nesta pesquisa a ocorrência de coliformes a 45ºC e E. coli nos

embutidos é bastante variável, pois está diretamente relacionada as condições de

higiene nas quais a matéria-prima foi obtida, o produto processado, estocado,

manipulado e comercializado. É importante ressaltar que neste estudo as amostras

foram consideradas fora dos limites estabelecidos por lei (BRASIL, 2001), de acordo

com os resultados obtidos na enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC

pelo método 1, em razão desta ser a metodologia recomendada oficialmente pela

Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003, que regulamenta os métodos

analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e água (BRASIL,

2003).

Tal variação pode ser observada a partir dos resultados obtidos em diferentes

estudos realizados no Brasil. Chaves et al. (2000), realizaram um estudo com

lingüiças frescais suínas onde 15 (75%) amostras analisadas denunciavam má

condições de higiene pela presença de coliformes a 45ºC e 13 (65%) amostras pela

presença de E. coli. Das amostras analisadas, 33% estavam fora dos limites de

tolerância para coliformes a 45ºC. Almeida Filho e Sigarini (2002), ao realizarem um

estudo comparativo entre lingüiças de frango frescais produzidas sob inspeção

federal e artesanalmente, verificaram que 11 amostras (73,33%) continham os

referidos microrganismos, onde 20% das lingüiças produzidas artesanalmente foram

consideradas impróprias para o consumo por conter coliformes a 45ºC acima dos

padrões regulamentares; das lingüiças produzidas sob inspeção nenhuma

encontrava-se fora dos limites de tolerância para o consumo humano. Guimarães,

Sousa e Pena (2004), ao analisarem 10 amostras de lingüiça tipo calabresa,

observaram que 100% das amostras continham coliformes a 45ºC, todavia todas as

148

amostras estavam dentro dos limites de tolerância permitidos para tais alimento

segundo legislação. Magnani et al. (2000), analisaram 50 amostras de salame

colonial e constataram a presença de E. coli em 84% dos salames estudados,

estando 72% das amostras em desacordo com a legislação vigente. Marques et al.

(2003), ao analisarem 20 amostras de lingüiça frescal, verificaram que, em relação

aos coliformes a 45ºC, sua presença foi verificada em 80% das amostras, sendo que

em 10 amostras (50%) foi confirmada a espécie E. coli, porém dentro do limite de

tolerância oficial. Salvatori, Bessa e Itapema (2003), realizaram um estudo com 70

embutidos frescais e 23 produtos cárneos maturados. Todos os produtos analisados

continham coliformes a 45ºC, contudo apenas cinco amostras (5,37%) de embutidos

frescais apresentaram coliformes a 45ºC acima do limite estabelecido. Convém

salientar que os estudos citados foram realizados com tipos de embutidos diferentes

daqueles analisados nesta pesquisa, e com isto alguns fatores como o

processamento tecnológico, forma de comercialização, limites legais, metodologia

analítica, entre outros itens devem ser considerados. Entretanto, a grande variação

da ocorrência destes microrganismos pode ser confirmada.

É importante salientar que mesmos aquelas amostras dentro dos padrões

microbiológicos vigentes, são passíveis de causar danos a saúde do consumidor,

uma vez que os microrganismos em questão podem ser de origem fecal, onde a sua

presença determina condições sanitárias insatisfatórias e possível presença

potencial de patógenos (JAY, 2005).

No presente trabalho, a análise das amostras de salsichas “hot dog” tipo

tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel segundo os métodos de

enumeração de coliformes a 35ºC e coliformes a 45ºC (NMP1) e enumeração de

coliformes a 35ºC e Escherichia coli (NMP2), conforme Tabela 3, estabelecem que

houve correspondência em 14 amostras, sendo três amostras TV, uma amostra FV,

duas amostras TG (apenas para coliformes totais), oito amostras FG (sendo uma

amostra apenas para coliformes totais). Entretanto, em 100% dos casos, no método

2, o NMP de coliformes totais e E. coli foi superior ao do método 1, o que pode ser

justificado pelo fato do meio de cultivo utilizado no método 2 oferecer melhores

condições nutricionais, favorecendo assim um maior crescimento microbiano. A

resolução RDC nº 12 (BRASIL, 2001) estabelece que a denominação coliformes a

45ºC é equivalente à denominação de coliformes termotolerantes e a denominação

149

de coliformes de origem fecal; recomendando que, caso seja determinada a

presença de E. coli, deva constar no laudo analítico.

Para as amostras de salsichas “hot dog” analisadas neste trabalho, esperava-

se obter um reduzido número de microrganismos, por se tratar de um produto que

sofreu tratamento térmico em sua tecnologia de produção. Entretanto, foi detectada

a presença de microrganismos patogênicos sensíveis as temperaturas usualmente

aplicadas em seu processo de fabricação, o que denuncia falhas de processamento,

contaminação cruzada, manipulação inadequada, condições de estocagem adversas

entre outras possíveis falhas. Por esta razão, espera-se que o alimento em questão

sofra cocção antes do consumo, o que eliminará ou reduzirá o perigo de transmissão

de ETA.

Nas amostras de salsichas “hot dog” tipo frango comercializadas a granel

ocorreu a maior proporção de coliformes a 45ºC e E. coli em valores acima dos

limites aceitáveis pela legislação vigente (BRASIL, 2001) o que, segundo Oliveira et

al. (2001), deixa evidente que as condições higiênicas e de manipulação destas

amostras eram precárias, podendo causar surtos de origem alimentar de grande

relevância, pois o fato de serem comercializadas a granel inclui maiores riscos de

contaminação, principalmente devido a excessiva manipulação.

Vários tipos de embutidos são extensamente consumidos no mundo podendo

ser veículos de transmissão de diferentes patógenos, o que tem sido demostrado em

diversos estudos. Siriken et al. (2005), ao avaliarem “soudjouck” um embutido

fermentado grandemente apreciado no Peru, observaram a presença de coliformes

em 11% das amostras analisadas e 5% de E. coli. Apesar dos resultados

encontrados por esses autores serem inferiores aos encontrados nesta pesquisa,

32% de coliformes e 15% de E. coli no enumeração de coliformes a 35ºC e E. coli,

deve-se levar em consideração que o tipo de amostra avaliada foi diferente, portanto

o embutido fermentado por ser submetido a um processo de maturação e

fermentação onde a população de bactérias ácido-lácticas são geralmente

superiores às encontradas em embutidos cozidos, e por esta razão exercem uma

maior função protetora a partir da acidificação e produção de bacteriocinas inibindo o

crescimento de microrganismos patogênicos, justificando a menor ocorrência dos

microrganismos estudados (DROSINOS et al., 2005). Além do fato das condições

higiênicas de sua obtenção, preparo e manipulação poderem ter sido superiores

àquelas das amostras analisadas nesta pesquisa.

150

Nas enumerações de coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e E. coli, os

valores de NMP apresentaram as seguintes variações (Tabela 3): coliformes a

35ºC(NMP1) ≥4,3x102 a 2,4x1010 NMP/g; coliformes a 45ºC (NMP1) ≥4,3x102 a

2,4x109 NMP/g; coliformes a 35ºC (NMP2) ≥4,0x102 a 2,4x1011 NMP/g; E. coli ≥

4,3x104 NMP/g. Salienta-se que para fins estatísticos o NMP < 3 foi considerado

como zero, pelo fato de tal resultado oferecer a combinação 0-0-0 na primeira, na

segunda e na terceira séries, respectivamente, significando ausência de

crescimento.

O fato que torna bastante relevante os resultados encontrados neste estudo,

em relação ao número de células viáveis encontradas nos alimentos pesquisados, é

que, de acordo com a literatura, o desenvolvimento de síndromes gastroentéricas

pela maioria dos sorogrupos de E. coli é causada a partir da ingestão de 106 a 1010

células viáveis/g de alimento. Desta forma, de acordo com os resultados observados

neste estudo, pode-se concluir que as amostras analisadas são produtos passíveis

de levar ao desenvolvimento de quadros de infecção alimentar, representando um

risco à saúde coletiva. Há, portanto, a necessidade do uso de medidas preventivas,

de forma a impedir que tais alimentos sejam comercializados colocando em risco a

saúde do consumidor.

A estimativa quantitativa, assim como a presença dos coliformes a 35ºC,

coliformes a 45ºC e E. coli mostraram-se bastante variáveis, em um estudo

comparativo entre mortadela tipo Bolonha e “imitação de mortadela”, realizado por

Fernandes e Miranda (2001). Foram encontrados os seguintes resultados na

enumeração de coliformes a 35ºC e a 45ºC: valores menores que 0,3 NMP/g para

mortadela tipo Bolonha, assim como para a maioria dos resultados das amostras de

“imitação de mortadela”, das quais uma das amostras apresentou valores de 9,3

NMP/g para coliformes a 35ºC e 0,4 NMP/g para coliformes a 45ºC. Guimarães,

Sousa e Pena (2004), avaliando lingüiças tipo calabresa encontraram NMP máximo

para coliformes a 35ºC de 2,4x10 NMP/g e para coliformes a 45ºC de 0,15x10

NMP/g. Hoffmann, Garcia-Cruz e Vinturin (1997), pesquisando coliformes a 45ºC a

partir de amostras de salame, encontraram um valor máximo no NMP/g de 2,3x10.

Apesar dos resultados acima relatados serem expressivamente inferiores aos

obtidos nesta pesquisa, deve-se levar em consideração que os tipos de amostras

analisadas são diferentes, portanto as salsichas tipo “hot dog” analisadas

promoveram um melhor crescimento dos coliformes, ou como já dito anteriormente

151

as condições de higiene de processamento e manipulação das mesmas foram

extremamente inadequadas. Porém, deve-se levar em consideração que essa

diferença nos resultados possa ser proveniente do número de amostras analisadas

e/ou metodologia empregada na análise.

De acordo com resultados encontrados nesta pesquisa, com relação a

contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva 37 amostras de salsichas “hot

dog” foram positivas. Assim, considerando-se a Resolução RDC nº 12 (BRASIL,

2001), 21 amostras encontravam-se acima do limite máximo estabelecido por lei,

apresentando-se, portanto, fora dos limites de tolerância aceitáveis e classificadas

como em condições higiênicas insatisfatórias. De acordo com Cunha Neto, Silva e

Stamford (2002), a presença de Staphylococcus spp. coagulase positiva indica a

possível presença de enterotoxina; entretanto, a ausência ou presença de pequeno

número deste microrganismo, sobretudo em alimentos processados submetidos ao

tratamento térmico, não determina que estes produtos não possam ocasionar

intoxicação alimentar.

Vários pesquisadores trabalhando com alimentos têm detectado uma

prevalência apreciável deste microrganismo principalmente naqueles produtos de

origem animal ou submetidos a intensa manipulação, o que foi confirmado com os

resultados deste estudo. Chaves et al. (2000), analisando lingüiça frescal suína

comercializada no Rio de Janeiro – RJ, observaram que 40% das amostras foram

positivas para a presença de S. aureus, sendo que apenas uma (5%) encontrava-se

acima do limite máximo estabelecido. Almeida Filho e Sigarini (2002), realizando um

estudo com lingüiças frescais produzidas artesanalmente e sob Inspeção Federal

em Cuiabá – MT, observaram que quanto às contagens de S. aureus, 60% das

amostras de origem artesanal estavam contaminadas por este patógeno e em todas

as amostras as contagens ultrapassaram o limite de tolerância oficial. Hoffmann et

al. (1996), avaliando lingüiças produzidas artesanalmente verificaram que todas as

amostras estavam positivas para S. aureus, assim como fora dos limites de

tolerância estabelecidos por lei. Hoffmann, Garcia-Cruz e Vinturin (1997),

trabalhando com salame, em São José do Rio Preto – SP, isolaram S. aureus em

todas as amostras, sendo que 50% encontraram-se em condições higiênicas

insatisfatórias. Pode-se observar que nos produtos cárneos há elevada ocorrência

de S. aureus, resultados este que são justificados pela origem ou pela manipulação

durante o processamento ou na comercialização desses alimentos.

152

Fernandes e Miranda (2001) porém, em um estudo comparativo entre

mortadela tipo Bolonha e “imitação de mortadela”, encontraram S. aureus em

valores menores que 1,0x101UFC/g de alimento, para ambos os produtos

analisados.

Das 100 amostras de salsichas “hot dog” analisadas nesta pesquisa 37 foram

Staphyloccus spp. coagulase positiva. Siriken et al. (2005), trabalhando com

embutido cárneo fermentado, observaram que 23% das suas amostras continham

Staphylococcus spp. em níveis ≥ 106 UFC/g. Contudo, diferente dos resultados

encontrados neste estudo, apenas 9% das amostras analisadas por estes autores

continham Staphylococcus spp. coagulase positiva. É universalmente referenciada a

intrínseca relação entre a produção de coagulase e a disponibilidade de S. aureus

produzir enterotoxina, assim como a produção de termonuclease e a sensibilidade a

lisostafina, que juntos constituem os indicadores mais largamente aceitos para a

presuntiva evidência desta propriedade. Mesmo nos países desenvolvidos, poucos

são os laboratórios que dispõem de condições técnicas para verificar a capacidade

enterotoxigênica de estafilococos, bem como efetuar a pesquisa de enterotoxinas no

alimento. É necessário considerar que estes fatores correlacionados com a

capacidade enterotoxigênica atêm-se a estudos basicamente dirigidos a S. aureus,

sem dúvida a espécie mais envolvida em surtos estafilocócicos. No entanto, dados

de literatura têm demonstrado a existência de enterotoxinas produzidas por

estafilococos não produtores de coagulase, e que sabidamente estas espécies

podem alcançar os alimentos, uma vez que tanto o homem como animais são

portadores usuais destas estirpes (PEREIRA et al., 2000).

Das 160 cepas de S. aureus submetidas aos testes bioquímicos (Apêndice

9.1 - Quadro 3), 54 oriundas de colônias típicas e 106 de colônias atípicas, 137

(85,6%) foram coagulase positiva, sendo 42 (77,8%) das colônias típicas e 95

(89,6%) das colônias atípicas. A alta ocorrência encontrada neste estudo vai de

encontro com o resultados obtidos por Cunha Neto, Silva e Stamford (2002) que

encontraram 100% de positividade analisando alimentos in natura e processados,

revelando uma alta prevalência de cepas produtoras de coagulase e, portanto,

consideradas potenciais causadoras de intoxicação estafilocócica.

A análise da ocorrência ou não ocorrência de colônias típicas e atípicas na

contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva versus o tipo de salsicha e a

forma de comercialização (tipo de embalagem), não foi estatisticamente significativa,

153

todavia deve-se ressaltar que a ocorrência de colônias atípicas (31%) correspondeu

ao dobro da ocorrência de colônias típicas (15%). Esta ocorrência deve servir de

alerta, pois usualmente as colônias atípicas, desprovidas de halo, não são

submetidas a testes bioquímicos confirmativos. Entretanto, estas colônias podem

corresponder às cepas de estafilococos potencialmente produtoras de enterotoxinas.

Diante deste fato, há necessidade de se testar colônias atípicas, visando a avaliação

segura de contaminação do alimento em questão (BOARI et al., 2003).

As características peculiares de cada produto cárneo, aliadas às diversidades

de processamento e condições de embalagem, determinam a microbiota capaz de

proliferar no produto. Nesta pesquisa, as contaminações por Staphylococcus spp.

coagulase positiva foram da ordem de ≥ 102 a 106 UFC/g de alimento. Chaves et al.

(2000), avaliando a contaminação de lingüiça frescal, não encontraram valores

acima de 105, deve ser enfatizado, que valores entre 103 e 104UFC/g já significam

riscos à saúde do consumidor. Almeida Filho e Sigarini (2002) analisando lingüiças

de frango produzidas artesanalmente encontraram contagens entre 104 e 106 UFC/g.

Marques et al. (2003), também exminando com lingüiça frescal, encontraram valores

máximos de 103UFC/g que já significam riscos à saúde coletiva. Desta maneira,

nota-se que o produto cárneo preparado e conservado em condições inadequadas

apresenta altas contagens de microrganismos podendo acarretar problemas na

qualidade do produto e na segurança do consumidor. É importante ressaltar que de

acordo com literatura, entre estes tipos de microrganismos, pode haver cepas

enterotoxigênicas e que contagens superiores a 105 microrganismos/g são

suficientes para ocasionar a produção de enterotoxinas. Outro ponto relevante no

que diz respeito as altas contagens observadas nas amostras analisadas, é que o

alimento sujeito à contaminação pós-processamento, com tipos enterotoxigênicos de

Staphylococcus spp., acarreta sérios riscos devido à ausência de microrganismos

competidores que poderiam inibir o desenvolvimento dos Staphylococcus spp. assim

como a produção de enterotoxinas.

Os S. aureus e a E. coli foram os microrganismos de maior prevalência nesta

pesquisa, e de acordo com Oliveira et al. (2003) são os principais responsáveis por

surtos de toxinfecção alimentar quando associados a condições higiênicas

insatisfatórias dos manipuladores e utensílios, o que pode justificar a sua maior

ocorrência nas amostras comercializadas a granel. A alimentação dentro dos

padrões higiênicos satisfatórios é uma das condições essenciais para a promoção e

154

manutenção da saúde, sendo que a deficiência nesse controle é um dos fatores

responsáveis pela ocorrência de surtos de ETA, o que leva a conclusão de que a

educação sanitária e o treinamento dos manipuladores são as melhores ferramentas

para assegurar a qualidade dos alimentos e a saúde do consumidor.

Nesta pesquisa ocorreu o crescimento de Clostridium spp. sulfito redutores a

46ºC e Clostridium perfringens em cinco amostras de salsichas “hot dog”

comercializadas a granel , sendo uma (4%) tipo tradicional e quatro (16%) tipo

frango, onde as contagens ultrapassaram o limite de tolerância aceitável,

classificando-as como amostras em condições higênico-sanitárias insatisfatórias e,

portanto, potenciais veículos de intoxicação alimentar.

Diversos pesquisadores demonstram uma freqüência variável de C.

perfringens. Chaves et al. (2000), trabalhando com lingüiça frescal comercializada

no Rio de Janeiro – RJ, verificaram a ausência de Clostridium spp. sulfito redutores

a 46ºC nas amostras avaliadas. Stagnitta, Micalizzi e Guzmán (2002), avaliando

carne e derivados cárneos em São Luis – Argentina, encontraram C. perfringens em

26,35% das 315 amostras de lingüiça frescal, em 19% das 100 amostras de

hambúrgueres e em 24% das 100 amostras de carne moída analisadas.

Vasconcelos e Iaria (1991), estudando lingüiças de frango frescal provenientes de

feiras livres municipais, em São Paulo, observaram que 83,3% das amostras foram

positivas para C. perfringens. Desta forma, apesar da grande variação de

ocorrência, os resultados desses estudos associados com os obtidos neste trabalho,

evidenciam a importância das carnes e derivados cárneos como possíveis veículos

de intoxicação alimentar por C. perfringens.

Os alimentos implicados nos surtos de intoxicação alimentar por C.

perfringens são com freqüência cozidos, onde o tratamento térmico dos alimentos é

presuntivamente insuficiente para destruir os esporos termorresistentes, de modo

que quando o alimento é requentado, os esporos germinam e multiplicam-se. Fato

este que ocorre na maioria das vezes com as amostras analisadas, pois em se

tratando de um embutido cárneo cozido, muitas das vezes é submetido apenas a um

leve aquecimento por ocasião da incorporação do molho, forma usual de consumo, o

que torna os resultados desta pesquisa importantes do ponto de vista microbiológico

e epidemiológico. Das 25 cepas de Clostridim spp. sulfito redutores a 46ºC

analisadas bioquimicamente, 23 foram confirmadas como C. perfringens, de acordo

com as características descritas (BRASIL, 2003). Além do fato de sugerirem C.

155

perfringens tipo A, que de acordo com a literatura consultada é o tipo mais

frequentemente isolado e também o mais envolvido em surtos de intoxicação

alimentar.

As cepas de C. perfringens produtoras de intoxicação alimentar vivem nos

solos, na água, nos alimentos, e no trato intestinal dos seres humanos e animais. Os

C. perfringens contaminam as carnes diretamente dos animais no momento do

abate ou posteriormente através de equipamentos, utensílios ou pelos

manipuladores, e por ser um microrganismo esporulado suporta algumas condições

adversas persistindo nas carnes e seus derivados (JAY, 2005). Neste estudo, as

amostras positivas para este microrganismo foram comercializadas a granel o que

sugere a manipulação em condições precárias de higiene como fonte de

contaminação das mesmas.

Nos embutidos cárneos é importante considerar também a contaminação

oriunda dos ingredientes, pois como destaca Oliveira, Franco e Carvalho (1992) os

embutidos cárneos recebem uma intensa carga microbiana provenientes das

especiarias adicionadas durante o seu preparo, o que foi demonstrado por Oliveira

(1983), que identificou a presença de C. perfringens em 33,3% das amostras de

pimenta desidratada, alho e pimenta branca, especiarias utilizadas em embutidos

cárneos e, por Oliveira, Franco e Carvalho (1994) que detectaram, em diferentes

condimentos vegetais, uma prevalência de 65,7% de espécies do gênero Clostridium

em 35 amostras analisadas. Ao mesmo tempo, deve-se considerar que o não

isolamento de Clostridium spp. sulfito redutores a 46ºC, o que ocorreu com a maioria

da amostras deste estudo, não significa que tais germes estejam ausentes, pois

como esclarece Labbe (2001), os meios de cultura para o isolamento destes

microrganismos são baseados no princípio de que as células presentes nas

amostras estejam viáveis, o que nem sempre ocorre, principalmente se o produto for

resfriado ou congelado por um longo período. Associado ao fato dos embutidos

cárneos cozidos serem estocados em refrigeração, tais produtos dificilmente são

veículos de Clostridium spp., pois em sua tecnologia de produção sofrem

tratamento térmico e são adicionados sais de cura que inibem tais microrganismos

(PARDI et al., 2001). O que pode justificar os resultados deste trabalho, uma vez

que as salsichas “hot dog” são mantidas em baixas temperaturas durante sua

estocagem, principalmente as comercializadas a granel que ao serem expostas nos

balcões de vendas muitas vezes se encontravam congeladas.

156

Nesta pesquisa a determinação quantitativa de Clostridium spp. sulfito

redutores a 46ºC e Clostridium perfringens nas amostras de salsichas “hot dog”

apresentou-se elevada, variando de ≥ 2,7x104 a 6,6x105 UFC/g de alimento

analisado. Fernandes e Miranda (2001), analisando embutidos cozidos, encontraram

valores abaixo de 2,0x101 UFC/g para mortadela tipo Bolonha e abaixo de 1,0x101

UFC/g para “imitação de mortadela”, classificando estes alimentos como em

condições higiênicas satisfatórias de acordo com a legislação vigente. Vasconcelos

e Iaria (1991), estudando lingüiça frescal comercializadas em feiras livres,

encontraram C. perfringens tipo A em valores que variaram de <10 a 4,0x103 UFC/g.

Por outro lado, Stagnitta, Micalizzi e Guzmán (2002), avaliando carnes e produtos

cárneos, verificaram altas contagens de C. perfringens, como as obtidas neste

trabalho, que variaram entre <10 a 105 NMP/g. De acordo com o número elevado do

microrganismo em questão as amostras foram consideradas impróprias para o

consumo, pois ofereciam risco à saúde coletiva.

A ANVISA estabelece, através da Resolução RDC nº 12 (BRASIL, 2001), a

ausência de Salmonella spp. para qualquer tipo de produto alimentício. Nesta

pesquisa detectou-se a presença de Salmonella spp. em três amostras de salsichas

“hot dog” comercializadas a granel, sendo uma (4%) tipo tradicional e duas (8%) tipo

frango. Desta forma, estas amostras foram consideradas impróprias para o

consumo, pois são passíveis de causarem graves surtos de infecções alimentares.

Bactérias como as Salmonella spp., há muito tempo são reconhecidas como

importantes patógenos causadores de intoxicações alimentares. Os embutidos são

uns dos vários tipos de alimentos responsáveis por surtos de salmonelose,

principalmente aqueles que são submetidos a condições de higiene e refrigeração

inadequadas (PARDI et al., 2001). Em diversos estudos têm sido detectada a

presença de Salmonella em embutidos reportando-se uma prevalência de

contaminação que varia de 0 a 9,1% (LITTLE et al., 1998; MATTICK et al., 2002;

SALGADO-MANCHA et al., 1999). Concordando com os resultados obtidos nesta

pesquisa, tanto na análise geral, cuja prevalência foi de 3% no total de 100

amostras de salsichas “hot dog” analisadas, como na análise dos grupos, onde

amostras de salsichas comercializadas a vácuo, de ambos os tipos pesquisados,

revelaram a ausência do microrganismo em questão. Nas amostras de salsichas “hot

dog” comercializadas a granel, encontrou-se 4% e 8% de ocorrência de Salmonella

spp., nos tipos tradicional e frango respectivamente.

157

Outros resultados corroboram com os deste trabalho. Magnani et al. (2000),

trabalhando com carne suína in natura e salame colonial em Chapecó – RS,

observaram que ambos os tipos de amostra apresentaram o mesmo percentual de

positividade para Salmonella spp. (6%), sendo importante salientar que a carne

analisada foi utilizada na formulação do produto final, onde o processo de

acidificação e fermentação próprios do salame não foram suficientes para a inibição

ou destruição da contaminação da matéria-prima. Marques et al. (2003), avaliando

lingüiça frescal em Três Corações – MG, observaram ausência de Salmonella spp.

nas 20 amostras analisadas. Rose et al. (2002), encontraram uma prevalência de

7,5% de Salmonella spp. em carne moída comercializadas em diferentes

estabelecimentos nos Estados Unidos da América – EUA. Siriken et al. (2006),

analisando embutidos pasteurizados e fermentados, observaram a presença de

Salmonella spp. em 7% das 100 amostras estudadas. A salmonelose é a

enfermidade transmitida por alimento de maior ocorrência no Brasil e em diversos

outros países. A carne de frango e seus derivados são considerados os mais

importantes reservatórios de salmonelas e frequentemente têm sido incriminados

com veículos nos surtos de salmoneloses. É importante considerar que as carnes

bovina e suína, assim como os seus derivados também apresentam altas

prevalências de Salmonella spp. (BAEUMLER; HARGIS; TSOLIS, 2000;

GIOVANNINI et al., 2004; MREMA; MPUCHANE; GASHE, 2006).

A prevalência de Salmonella spp. em carne de aves e seus derivados obtida

por diversos autores varia entre 0 e 100% (CAPITA et al., 2003; FILHO; SIGARINI,

2002; HOFFMANN et al., 1996). Deve ser mencionado que esta variação além de

estar relacionada com a sanidade dos animais, com as condições de higiene e

adequadas temperaturas das plantas de processamento durante a produção,

manipulação, estocagem e comercialização das carnes e seus derivados, outros

fatores como local de origem das amostras em estudo e metodologia aplicada

devem ser considerados (UYTTENDAELE et al., 2001). Concordando com a

assertiva acima as amostras de salsichas “hot dog” que apresentaram maior

ocorrência de salmonelas neste estudo foram as derivadas de frango tendo como

fator contribuinte o fato de serem comercializadas a granel. Sendo importante

ressaltar o papel dos portadores humanos na manipulação de alimentos, pois em

diversos relatos de surtos estes são os principais responsáveis pela ocorrência dos

158

mesmos (BARROS; PAVIA; PANETTA, 2002; CAPITA et al., 2003; PARDI et al.,

2001).

O processo de produção e comercialização de embutidos cárneos cozidos

requer sérios cuidados, principalmente no que se refere a contaminação cruzada,

uma vez que a ocorrência de salmonelas na carne crua não é considerada um risco

direto à saúde do consumidor, pois se espera que a mesma sofra o cozimento

adequado antes de ser consumida, onde o tratamento térmico seja o suficiente para

a eliminação do patógeno. A alta prevalência de salmonelas nos embutidos, que

muitas vezes supera a da matéria-prima, como descrevem Giovanini et al. (2004) e

Mrema, Mpuchane e Gashe (2006), pode ser justificada pela contaminação cruzada

durante o processo de produção e comercialização dos mesmos onde o crescimento

bacteriano ocorre durante a estocagem dos produtos, principalmente quando

ocorrem falhas na cadeia de frio, tendo como agravante o fato da microbiota de

competição ter sido em sua maioria eliminada por ocasião do tratamento térmico.

Neste estudo, detectou-se a presença de todos os microrganismos

pesquisados. É importante salientar que 2% das amostras foram positivas para três

dos quatro agentes pesquisados (Staphylococcus spp. coagulase positiva, C.

perfringens e coliformes a 45ºC) e 10% para dois agentes (oito para Staphylococcus

spp. coagulase positiva e coliformes a 45ºC e duas para Staphylococcus spp.

coagulase positiva e C. perfringens). Em 33% das amostras, constatou-se a

presença de apenas um dos patógenos investigados, sendo que em 3% a presença

de Salmonella spp., em 1% de C. perfringens, em 7% de coliformes termotolerantes

e em 25% Staphylococcus spp. coagulase positiva. Estes resultados mostram-se

semelhantes aos encontrados por Lobo et al. (2001), que avaliaram salames

comercializados em Santa Maria – RS. Embora se trate de um produto diferente, a

presença expressiva de Staphylococcus spp. coagulase positiva, em ambos os

estudos sugere uma possível participação dos manipuladores na contaminação dos

alimentos.

As salsichas tipo “hot dog”, assim como os embutidos, de maneira geral são

alimentos muito expostos a contaminações e representam um excelente meio para a

multiplicação de microrganismos. As prováveis fontes de contaminação

compreendem as carnes, as tripas, os temperos ou condimentos, bem como a água

utilizada no preparo e em todas as aplicações de sanificação, os equipamentos,

utensílios e toda planta de processamento mal higienizados, a manipulação

159

inadequada, assim como a desobediência das boas práticas de fabricação e dos

princípios de análise de perigos e pontos críticos de controle (MILANI et al., 2003).

Analisando a freqüência de isolamento dos microrganismos pesquisados,

observou-se que em relação aos tipos de comercialização, as amostras

comercializadas a granel foram as que apresentaram maior número de

contaminações, o que enfatizou ainda mais a importância da contaminação cruzada

neste produtos; pois, de acordo com Bredholt, Nebaskken e Holck (1999), a

contaminação cruzada nestes produtos pode ter sérias conseqüências, um vez que

estes produtos tiveram sua microbiota eliminada durante o seu processamento

tecnológico, principalmente aqueles que são submetidos a abusos de temperatura

de estocagem, que também deve ser considerada nos embalados a vácuo. E em

relação às comercializadas a granel soma-se o perigo da manipulação inadequada e

o fato de serem expostos em balcões de comercialização sem controle sistemático

da temperatura e em conjunto com produtos crus.

As amostras de salsichas “hot dog” analisadas estavam de acordo com os

limites de tolerância estabelecidos pela legislação vigente apresentaram um bom

estado higiênico-sanitário, provavelmente têm como justificativa, uma manipulação

higiênica e segura das matérias-primas utilizadas na elaboração do produto; correta

sanificação dos utensílios e equipamentos utilizados no processamento e

manipulação segura durante o processamento e comercialização. Para as

comercializadas a vácuo, deve-se considerar a principal função da embalagem, que

é a proteção do produto contra danos físicos, mudanças químicas, contaminação

microbiológica, além de despertar a atração do consumidor nos balcões de venda,

desde que mantidos os preceitos de boas práticas de fabricação e comercialização

(CALIL; GALANTE, 1998; GUIMARÃES; SOUSA; PENA; 2004). A manipulação dos

produtos nos pontos de venda não pode ser tomada como padrão de referência para

a qualidade, visto que em alguns casos ao comercializar-se o produto a granel, este

é exposto às temperaturas inadequadas, muitas vezes ambiente, e manipulado em

pobres condições de higiene em alguns casos pelo próprio consumidor.

Um outro fator importante a ser considerado na comercialização de produtos

a granel, é que, segundo Adams e Moss (1997), o armazenamento de produtos

cárneos refrigerados em contato com oxigênio ou recobertos com películas

permeáveis ao mesmo, origina um potencial redox na superfície do produto

apropriado ao desenvolvimento de microrganismos aeróbios, em especial os Gram-

160

negativos, que crescem rapidamente nestas condições podendo ser os responsáveis

pelas alterações que se desenvolvem.

A amostras de salsichas “hot dog” comercializadas a granel apresentaram

maiores níveis de contaminações, em relação as comercializadas a vácuo, e são as

que apresentam maior consumo, pois têm como apelo popular o custo. Por esta

razão, os resultados desta pesquisa servem de alerta, porque os microrganismos

enumerados e isolados nas amostras de salsichas “hot dog” analisadas, possibilitam

que as mesmas sirvam como veículos de transmissão de patógenos a um número

maior de indivíduos.

De acordo com os resultados desta pesquisa, as amostras de salsichas “hot

dog” tipo frango foram as que apresentaram maior prevalência dos microrganismos

pesquisados, em especial as comercializadas a granel, as quais já foram expostas

as prerrogativas para estes resultados. Todavia, diversos autores esclarecem que os

defeitos mais comuns dos embutidos de frango são de origem microbiana, devido a

excessiva adição de carne mecanicamente separada e de pele à massa que são as

maiores fontes de contaminação, especialmente por Salmonella spp. (ADAMS;

MOSS, 1997; DEUMIER; COLLIGNAN, 2003; KIM; FRANK; CRAVEN, 1996;

TERRA, 1998).

Nos últimos anos, tem sido crescente a preocupação dos profissionais de

inspeção sanitária com as condições higiênicas dos produtos cárneos e distribuídos

ao consumo. A contaminação pode ocorrer em qualquer etapa da industrialização,

comércio e consumo, e neste trabalho observou-se que as amostras de salsichas

“hot dog” comercializadas a granel e conseqüente maior manipulação apresentaram

maiores contaminações, logo a qualidade dos produtos nunca ocorre por acaso, é

sempre resultado de esforços aplicados no controle das diferentes etapas do

processamento. Os fatores tecnológico e humano afetam a qualidade de um

produto; no entanto, o indivíduo é o fator mais importante a ser considerado quando

ocorrem surtos de doenças transmitidas por alimentos.

Na fabricação de salsichas tipo “hot dog” a matéria-prima é moída, tornando-

se imprópria para o consumo muito rapidamente, pois aumenta a superfície de

exposição para contaminação e crescimento de microrganismo. Além de possuir

atividade de água (aa) e pH propícios ao desenvolvimento microbiano, o que diminui

seu prazo de validade, que está diretamente ligado à carga microbiana resultante de

diferentes contaminações, apesar da utilização do frio durante a estocagem.

161

Os valores de pH dos embutidos cozidos sofrem influência direta do pH e da

capacidade de neutralização das matérias-primas utilizadas, principalmente as

cruas. Durante o processamento tecnológico destes embutidos ocorre um acréscimo

dos valores de pH que variam de 0,0 a 0,4 unidades, em virtude do cozimento,

homogeneização da massa e a adição de ácidos ou bases à mesma (MATULIS et

al., 1995). Os valores de pH dos embutidos cozidos tendem a 6,2 e 6,3. Neste

estudo os valores de pH variaram bastante. Analisando-se os dados de pH das

amostras desta pesquisa (Tabela 15), quando submetidos à análise de variância,

verificou-se que houve efeito significativo (p<0,01) para os tipos de embalagens,

podendo-se afirmar estatisticamente (p<0,01) que o pH das amostras de salsichas

“hot dog” comercializadas a vácuo, independente dos tipos, tiveram média de pH

igual a 6,27 que foi superior ao pH médio de 5,90 das amostras comercializadas a

granel (Tabela 13.1 e Figura 13.1). Correlacionando estes resultados com o

crescimento microbiano, o menor valor de pH das amostras a granel pode ser

justificado pelo maior crescimento microbiano encontrado nas mesmas, somado ao

fato que a exposição ao oxigênio (aeração) promove melhor condição de

crescimento aos microrganismos (ADAMS; MOSS, 1997). Além disso, a ocorrência

de pH muito baixo nas amostras de salsichas “hot dog” comercializadas a granel

pode ter como justificativa o maior desenvolvimento das bactérias ácido-lácticas que

não foram pesquisadas neste estudo. Embora as amostras de salsichas hot dog”

comercializadas a granel provavelmente tenham tido maior proteção contra os

patógenos, as condições as quais as mesmas foram submetidas promoveram o

maior desenvolvimento dos microrganismos indesejáveis.

No que se refere aos valores de pH favoráveis ou não ao crescimento dos

microrganismos, Varnan e Evans (1996) citam que embora a literatura refira-se a

valores de pH, geralmente entre 4,0 e 9,0 para as bactérias analisadas neste estudo,

muitos outros fatores como temperatura, atividade de água e natureza do acidulante

interferem diretamente neste parâmetro. Verificou-se que os valores de pH e as

médias encontradas no presente estudo foram adequadas ao crescimento de todos

os microrganismos pesquisados, assim como a capacidade de crescimento em

temperaturas de refrigeração (Tabela 2 e Tabela 13.1).

Em relação aos clostrídios, ressalta-se que a temperatura é o fator mais

importante no controle do C. perfringens. O microrganismo poderá crescer em

temperaturas abaixo de 6ºC, mas o crescimento, na maioria das vezes, é escasso,

162

sendo o resfriamento uma medida de controle significante, além do fato das células

vegetativas não resistirem ao congelamento ou longos períodos de refrigeração,

porém alguns esporos podem sobreviver e encontrando condições ideais vegetarem

(LABBE, 2001), o que possivelmente justifique o baixo número de isolamentos deste

microrganismo, além de outros fatores anteriormente expostos como boas condições

de higiene da matéria-prima, do processamento, da manipulação e da metodologia

empregada na análise.

As Salmonella spp. normalmente crescem em valores de pH entre 4,5 e 9,0,

sendo o pH ótimo valores entre 6,5 e 7,5, porém estes valores interagem com outros

fatores como atividade de água, conteúdo nutricional e temperatura, no que diz

respeito ao crescimento, sobrevivência e morte das células bacterianas. A aeração,

por exemplo, é uma condição que favorece o crescimento em pH baixo, o que pode

estar relacionado à ocorrência de Salmonella spp. nas amostras de salsichas “hot

dog” comercializadas a granel com valores de pH de 5,24; 5,52 e 5,83. Analisando a

capacidade de crescimento de Salmonella spp., neste faixa de pH, em embutido

fermentado Siriken et al. (2006) isolaram Salmonella spp. de sete das 100 amostras

pesquisadas com os seguintes valores de pH: 4,76; 5,23; 5,28; 5,29; 6,16 e 6,25.

Buscando estudar a atividade de água das amostras analisadas quanto ao

tipo de embalagem (a vácuo ou a granel), tipo de amostra (tradicional ou frango); e

tipo de amostra versus tipo de embalagem, verificou-se que, na análise da

variância, não houve efeito significativo para os tipos de embalagem, enquanto que

houve efeito significativo para os tipos de salsichas (p<0,05), onde as média da Aa

(0,8850) das salsichas “hot dog” tipo frango foi estatisticamente maior que a média

da Aa (0,8666) das salsichas “hot dog” tipo tradicional (Tabela 14.2 e Figura 14.1).

Segundo Cunha Neto, Silva e Stamford (2002), a maior Aa das salsichas de frango

deriva da sua composição, onde a incorporação excessiva de carne mecanicamente

separada e de polifosfatos nos embutidos de frango, resultam num produto com

maior suculência e maciez, e também com maior conteúdo de água favorecendo o

desenvolvimento microbiano, conforme explícita os resultados desta pesquisa.

Observou-se, também, nos resultados da análise da variância, que houve

efeito significativo entre as embalagens dentro das salsichas “hot dog” tipo

tradicional (p<0,05), onde a média da Aa das salsichas “hot dog” comercializadas a

vácuo foi igual a 0,8792, sendo estatisticamente superior a média das salsichas “hot

dog” comercializadas a granel que foi de 0,8540, conforme Figura 14.2.

163

Analisando-se os resultados deste estudo verificou-se que as médias de Aa

(Tabela 14.2) encontram-se na faixa de 0,87 a 0,90, contudo observou-se o

crescimento de microrganismo em Aa inferiores às descritas como mínimas para o

crescimento da microbiota isolada (NISSEN; HOLCK, 1998; PARDI et al., 2001).

Em relação a E. coli, o nível mínimo de aa para o crescimento em condições

ótimas reportado pela maioria dos autores é de 0,95. Contudo diversos estudos

referentes à sobrevivência destes microrganismos enfocam principalmente o efeito

do NaCl, pH, temperatura e Aa, como o desenvolvido por Ryu, Deng e Deuchat

(1999), no qual os autores concluíram que a redução da aa associada ao aumento

da concentração de NaCl resultaram numa significativa redução no número de

células viáveis durante o período de estocagem. Merece ressaltar ainda que em

condições experimentais foi observado o crescimento de E. coli O157:H7 em aa de

até 0,68, o que evidencia a possibilidade de crescimento destes microrganismos nos

valores de aa observados neste estudo, que variaram de 0,82 a 0,93.

Em geral, as bactérias necessitam de maiores valores de aa para o

crescimento, com as Gram-negativas necessitando de maiores valores que as

Gram-positivas (PARDI et al., 2001). Concordando com esta assertiva, nos

resultados deste estudo registrou-se Aa mínima para Gram-negativas (coliformes) de

0, 79 e 0,80 e, para Gram-positivas ( Staphylococcus spp. coagulase positiva) de

0,75 e 0,77.

Com relação as bactérias patogênicas em alimentos, o S. aureus cresce e

produz enterotoxina até 0,86, ao passo que o seu crescimento foi demonstrado com

valores de Aa abaixo de 0,83 em condições ideais (FRANCO; LANDGRAF, 2002;

JAY, 2005; SILVA; GRANDA, 2004). No presente trabalho não foram realizadas as

análises para a verificação da produção de enterotoxinas, contudo detectou-se o

crescimento de Staphylococcus spp. coagulase positiva em valores de Aa de 0,75,

o que sugere a sua potencialidade para a produção de enterotoxina.

O C. perfringens na presença de NaCl tem como limite mínimo de aa de 0,95

a 0,96, variando os valores de acordo com o umectante presente, sendo importante

ressaltar que os valores de aa estão diretamente relacionados ao pH e a

temperatura (JAY, 2005). Pode-se , portanto considerar tal interação como

justificativa para a presença de C. perfringens nas amostras analisadas neste estudo

que apresentaram aa de 0,87; 0,88; 0,90 e 0,91.

164

De acordo com Jay (2005), as relações entre aa e temperatura são as mais

significativas, pois em alguns estudos foi observado que Aa mínima aumenta

quando a temperatura diminui e, quando tanto a temperatura quanto o pH são

desfavoráveis a aa mínima de crescimento é maior, podendo ser considerado o

ponto chave para o controle do crescimento, sobrevivência e da inativação dos

microrganismos. Estudando tal interação, Mattick et al. (2001) observaram que estes

microrganismos foram menos termorresistentes às baixas aa que às altas aa (0,65-

0,90), contudo foi observado o crescimento, corroborando com o crescimento deste

microrganismo em aa de 0,87 e 0,89 observados nesta pesquisa, embora Pardi et al.

(2001) relatem aa mínima de 0,93 para o crescimento de Salmonella spp.

Como a Aa média da maioria das amostras de salsichas “hot dog” avaliadas

encontrou-se numa faixa descrita como desfavorável ao desenvolvimento de

microrganismos patogênicos, justifica a ausência de crescimento dos

microrganismos pesquisados em 45% das amostras analisadas.

A literatura descreve que a aplicação principal da medida de Aa refere-se ao

controle do crescimento microbiano, todavia deve-se ressaltar que a redução da aa

também preserva os alimentos porque reduz as reações químicas que levam a

deterioração. Em suma, a diminuição da Aa aumenta a fase lag de crescimento dos

microrganismos, atuando sobre as atividades metabólicas dos mesmos. Entretanto,

deve-se sempre considerar que o crescimento dos microrganismos resulta de

interações entre diferentes parâmetros do meio, como pH, temperatura e o potencial

de oxi-redução, os quais devem ser devidamente observados para um controle

efetivo da qualidade microbiológica do produto.

Às indústrias competem a fabricação dos alimentos dentro dos padrões e

condições previstas na legislação específica, cabendo às inspeções federal,

estadual e municipal, de acordo com suas esferas de ações, a observância no

atendimento a todos os preceitos técnicos e higiênico-sanitários. Do mesmo modo, o

serviço de vigilância sanitária deverá atuar no comércio, de tal forma que seja

possível assegurar as condições originais do produto no momento de sua

comercialização. Apesar das normas, portarias e leis exigindo a aplicação das BPF e

dos princípios do APPCC em todas as etapas da cadeia produtiva de salsichas ‘hot

dog” e diversos outros alimentos, a aplicação dos mesmos não é uma realidade

brasileira, em especial em alguns estabelecimentos produtores e comercializadores.

Pois, a incapacidade numérica de funcionários em órgãos fiscalizadores, a

165

deficiência estrutural e financeira da vigilâncias sanitárias e epidemiológicas, a não

utilização adequada da legislação vigente, a subnotificação dos surtos de ETA,

dificultam o cumprimento da legislação na sua totalidade, refletindo um cenário

irreal.

Desta forma, conclui-se que é de fundamental valor a existência de padrões

microbiológicos para produtos como as salsichas tipo “hot dog”, por ser um alimento

de grande consumo e capaz de determinar doenças de origem alimentar, visto que

as amostras analisadas apresentaram-se contaminadas por microrganismos de

ampla importância em termos de saúde coletiva, como E. coli, S. aureus, C.

perfringens e Salmonella spp., constituindo-se em fontes potencialmente capazes de

provocarem graves surtos de ETA.

6 CONCLUSÕES De acordo com os objetivos iniciais desta pesquisa e os resultados obtidos no

presente trabalho permitiram inferir as seguintes conclusões:

• A avaliação do perfil bacteriológico das salsichas tipo “hot dog” tipo tradicional

e de frango comercializadas no mercado varejista nos municípios do Rio de

Janeiro e Niterói – RJ, frente a presença potencial de patógenos enquadram

estes alimentos como veículos potenciais de ETA;

• A partir da avaliação dos valores de pH e Aa constatou-se variações de

capacidade de crescimento dos microrganismos pesquisados quanto aos

valores descritos na literatura;

• As amostras de salsichas “hot dog” tipo frango e as comercializadas a granel

apresentaram-se mais contaminadas;

• O Staphylococcus aureus foi o microrganismo de maior ocorrência nas

amostras analisadas, denunciando provável envolvimento dos manipuladores

na contaminação dos alimentos, associado ao fato das amostras a granel

apresentarem-se mais contaminadas;

• O pH médio das salsichas “hot dog” comercializadas a vácuo (6,27) foi maior

que o pH médio das salsichas “hot dog” comercializadas a granel (5,90);

• A média de Aa das salsichas “hot dog” tipo frango (0,8850) foi maior que a

média de Aa das salsichas “hot dog” tipo tradicional (0,8666), entre as

salsichas “hot dog” tipo tradicional a média de Aa das comercializadas a

vácuo (0,8792) foi maior que a média das comercializadas a granel (0,8540).

7 SUGESTÕES De acordo com as observações expostas, sugere-se:

• Que sejam desenvolvidos estudos relativos as diferentes interações entre os

parâmetros de pH, aa, composição química e nutricional dos alimentos,

temperatura e potencial de oxi-redução, pois em relação aos valores aa foi

verificada expressiva diferença quanto ao desenvolvimento dos

microrganismos pesquisados em relação aos descritos na literatura;

• Que as inspeções federal, estadual e municipal, assim como a vigilâncias

sanitária e epidemiológica, tenham atuação mais contundente com relação à

fiscalização dos estabelecimentos que processam e comercializem os

produtos de origem animal, em especial os produtos cárneos;

• Que a educação sanitária seja vista como medida imperativa para assegurar

a qualidade dos alimentos, onde o treinamento constante dos cria um

conjunto de meios e processos mediante os quais o indivíduo é ensinado e

aperfeiçoado na execução de determinadas tarefas, para que a aplicação das

BPF e dos princípios do APPCC sejam realmente efetivos.

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9 APÊNDICES

9.1 PERFIL BACTEROLÓGICO DAS AMOSTRAS ANALISADAS Tabela 2: Perfil bacteriológico das amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel.

NMP1 SSCP CCSR PS Amostra pH Aa CT CTt T A Total CSR CP S

1* 6,61 0,84 0 0 1,0x103 0 1,0x103 0 0 0 2 5,52 0,94 0 0 0 0 0 0 0 0 3 6,42 0,82 0 0 0 0 0 0 0 0 4 6,71 0,88 2,4x1010 2,4x108 0 0 0 0 0 0 5 5,86 0,91 2,4x109 2,4x109 1,0x104 0 1,0x104 0 0 0 6 6,29 0,92 1,1x106 7,0x105 0 0 0 0 0 0 7 6,40 0,86 0 0 0 0 0 0 0 0 8 6,48 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0 9 6,26 0,86 0 0 0 1,0x102 1,0x102 0 0 0

10 5,44 0,89 0 0 0 0 0 0 0 0

181

Continuação da Tabela 2: Perfil bacteriológico das amostras de salsichas “hot dog” tipo tradicional e tipo frango comercializadas a vácuo e a granel.

11 6,04 0,90 0 0 0 0 0 0 0 0 12 5,51 0,91 0 0 0 0 0 0 0 0 13 6,41 0,83 0 0 0 1,9x103 1,9x103 0 0 0 14 5,51 0,93 0 0 0 1,0x103 1,0x103 0 0 0 15 6,40 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0 16 6,39 0,92 0 0 0 0 0 0 0 0 17 6,35 0,93 0 0 0 0 0 0 0 0 18 6,15 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0 19 5,66 0,86 0 0 0 0 0 0 0 0 20 6,51 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0 21 6,27 0,91 0 0 0 0 0 0 0 0 22 6,20 0,92 0 0 0 0 0 0 0 0 23 6,45 0,88 0 0 0 0 0 0 0 0 24 6,49 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 25 6,54 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0

26** 6,59 0,83 0 0 1,2x104 1,2x105 1,32x105 0 0 0 27 6,74 0,85 2,4x108 2,4x108 4,0x104 3,84x106 3,8x106 0 0 0 28 6,77 0,91 2,4x108 2,4x106 1,0x104 1,4x105 1,5x105 0 0 0 29 6,00 0,93 2,4x1010 2,4x109 0 0 0 0 0 0 30 6,60 0,81 0 0 0 0 0 0 0 0 31 6,76 0,89 0 0 0 0 0 0 0 0 32 6,47 0,92 0 0 0 0 0 0 0 0 33 6,20 0,93 0 0 0 0 0 0 0 0 34 6,53 0,88 0 0 0 3,0x102 3,0x102 0 0 0 35 6,39 0,90 0 0 0 1,0x104 1,0x104 0 0 0 36 6,46 0,79 0 0 0 0 0 0 0 0 37 6,01 0,91 0 0 0 3,0x102 3,0x102 0 0 0

182


38 5,91 0,92 0 0 0 2,0x102 2,0x102 0 0 0 39 6,55 0,84 0 0 0 2,4x102 2,4x102 0 0 0 40 6,50 0,80 0 0 0 1,0x104 1,0x104 0 0 0 41 6,51 0,81 0 0 0 3,6x102 3,6x102 0 0 0 42 5,94 0,86 0 0 0 0 0 0 0 0 43 6,05 0,91 0 0 0 6,4x104 6,4x104 0 0 0 44 5,70 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 45 6,39 0,88 0 0 0 0 0 0 0 0 46 6,15 0,89 0 0 0 0 0 0 0 0 47 6,49 0,86 0 0 0 0 0 0 0 0 48 6,00 0,91 0 0 0 0 0 0 0 0 49 6,37 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 50 6,35 0,91 0 0 0 0 0 0 0 0

51*** 5,82 0,75 0 0 2,4x104 1,2x105 1,4x105 0 0 0 52 6,01 0,77 0 0 0 8,0x102 8,0x102 0 0 0 53 5,91 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 54 6,17 0,88 0 0 0 0 0 0 0 0 55 5,78 0,82 0 0 0 0 0 0 0 0 56 6,59 0,90 0 0 0 1,0x102 1,0x102 0 0 0 57 6,01 0,91 0 0 2,0x102 0 0 0 0 0 58 5,81 0,77 0 0 0 0 0 0 0 0 59 6,10 0,86 0 0 0 0 0 0 0 0 60 6,04 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 61 6,15 0,89 0 0 0 0 0 0 0 0 62 6,00 0,90 0 0 0 0 0 0 0 0 63 5,44 0,84 0 0 0 0 0 0 0 0 64 5,84 0,79 0 0 0 0 0 0 0 0

183


65 5,57 0,85 0 0 0 0 0 0 0 0 66 5,83 0,87 0 0 0 0 0 0 0 + 67 5,75 0,78 0 0 0 0 0 0 0 0 68 5,55 0,87 4,3x102 0 0 0 0 0 0 0 69 5,30 0,79 4,3x102 0 9,0x104 1,1x105 2,0x105 0 0 0 70 4,85 0,90 0 0 1,0x103 1,0x103 2,0x103 0 0 0 71 6,04 0,92 0 0 0 0 0 0 0 0 72 6,66 0,87 0 0 1,0x102 0 1,0x102 0 0 0 73 5,74 0,90 1,5x103 1,5x103 0 0 0 0 0 0 74 6,17 0,88 2,1 x103 0 0 0 0 0 0 0 75 6,21 0,90 0 0 0 0 0 3,2x105 2,56x105 0

76**** 5,93 0,95 0 0 0 0 0 0 0 0 77 5,61 0,88 0 0 0 0 0 0 0 0 78 5,24 0,91 0 0 0 0 0 0 0 0 79 5,21 0,91 9,3x102 4,3x102 0 1,0x104 1,0x104 0 0 0 80 5,24 0,89 0 0 0 0 0 0 0 + 81 5,52 0,87 0 0 0 0 0 0 0 + 82 5,52 0,90 0 0 0 0 0 0 0 0 83 6,04 0,89 4,6x106 4,6x103 0 0 0 0 0 0 84 6,32 0,91 0 0 1,0x104 0 1,0x104 0 0 0 85 4,79 0,90 1,1x104 2,4x103 0 0 0 0 0 0 86 5,85 0,91 0 0 0 7,0x103 7,0x103 0 0 0 87 6,39 0,87 0 0 0 0 0 0 0 0 88 6,42 0,89 0 0 0 6,5x103 6,5x103 0 0 0 89 6,59 0,90 0 0 0 1,0x102 1,0x102 0 0 0 90 5,36 0,89 1,1x105 1,1x105 0 1,7x104 1,7x104 0 0 0 91 5,21 0,90 1,1x105 4,6x104 2,0x104 1,0x104 3,0x104 0 0 0

184


92 5,73 0,91 0 0 1,0x103 0 1,0x103 0 0 0 93 6,40 0,87 2,4x105 1,1x105 8,0x104 0 8,0x104 3,6x104 2,16x104 0 94 6,42 0,89 2,4x105 1,1x105 0 2,84x104 2,84x104 0 0 0 95 6,37 0,91 2,1x103 2,1x103 0 1,16x104 1,16x104 6,6x105 6,6x105 0 96 6,21 0,87 2,1x103 2,1x103 0 0 0 0 0 0 97 6,39 0,88 0 0 0 2,0x104 2,0x104 0 0 0 98 6,27 0,89 4,3x102 0 0 2,0x103 2,0x103 2,7x104 2,7x104 0 99 6,01 0,88 1,1x105 1,1x104 2,0x103 6,0x103 8,0x103 0 0 0

100 6,74 0,90 0 0 0 3,0x104 3,0x104 2,5x105 2,0x105 0 NMP1: enumeração de coliformes método 1; CT: coliformes totais; CTt: coliformes termotolerantes; EC: E. coli; SACP: Staphylococcus spp. coagulase positiva; CCSR: contagem de clostrídios sulfito redutores a 46oC; CSR: clostrídios sulfito redutores a 46oC; CP: Cl. perfringens; OS: pesquisa de Salmonella spp.; S: Salmonella spp. (*) Amostras 1 a 25: tipo tradicional embalada a vácuo. (**) Amostras 26 a 50: tipo frango embalada a vácuo. (***) Amostras 51 a 75: tipo tradicional a granel. (****) Amostras 76 a 100: tipo frango a granel.

185

9.2 RESULTADO DAS ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS Quadro 2: Enumeração de coliformes a 35ºC e a 45°C.

Amostras / Nº

Coliformes totais

Coliformes termotolerantes

4 2,4x1010 2,4x108

5 2,4x109 2,4x109

6 1,1x106 7x105

27 2,4x108 2,4x108

28 2,4x108 2,4x106

29 2,4x1010 2,4x109

68 4,3x102 <3 69 4,3x102 <3 73 1,5x103 1,5x103

74 2,1x103 <3 79 9,3x102 4,3x102

83 4,6x106 4,6x103

85 1,1x104 2,4x103

90 1,1x105 1,1x105

91 1,1x105 4,6x104

93 2,4x105 1,1x105

94 2,4x105 1,1x105

95 2,1x103 2,1x103

96 2,1x103 2,1x103 98 4,3x102 <3 99 1,1x105 1,1x104

Quadro 3: Enumeração de coliformes a 35ºC e Escherichia coli.

E. coli Amostras / Nº

Coliformes totais Fluorescência Kovac's Total

1 2,4x107 - - <3 3 2,4x1010 + + 1,5x109

4 1,1x1010 + + 1,5x109 5 4,6x108 + + 4,6x106

6 2,4x1010 + + 2,4x1010

7 2,4x1010 - - <3 8 2,4x1010 - - <3

12 9,0x102 - - <3 13 4,6x1010 - - <3 14 1,5x1010 - - <3 26 2,4x107 + - <3 29 2,4x1010 + + 2,4x1010 37 4,0x102 - - <3 38 4,0x102 - - <3 39 4,6x104 - - <3 40 2,3x103 - - <3 41 9,3x109 - - <3

186

Continuação do Quadro 3: Enumeração de coliformes a 35°C e Escherichia coli. 71 4,0x102 - - <3 73 2,4x104 - - <3 74 2,4x106 + + 1,1x106

84 4,0x102 - - <3 85 2,4x104 + + 2,4x104

86 4,6x104 - - <3 87 2,4x103 - - <3 88 7,5x103 + + 4,3x103

89 4,6x104 - - <3 90 4,6x105 + + 4,6x105

93 2,4x106 + + 2,4x106

94 2,4x105 + + 2,4x105

95 1,5x105 + + 2,4x104

96 1,1x106 + + 2,1x104

98 1,1x108 + + 1,1x108

99 1,5x105 + + 2,1x104

187

Quadro 4: Contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva. Testes Complementares Total

Plaqueamento Gram Coagulase DNASE Catalase S. aureus

Coagulase Positiva Amostras

/ Nº Típicas Atípicas Típicas Atípicas Típicas Atípicas Típicas Atípicas Típicas Atípicas Típicas Atípicas

1 1x103 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x103 0 5 1x104 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x104 0 9 0 1x102 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x102 13 0 1,9x103 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 1,9x103

14 0 1x103 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x103

18 0 1x103 0 BGP 0 0 0 0 0 0 0 0 19 0 1,2x104 0 BGP 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 1x104 BGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 1,2x104 3,0x105 CGP CGP +++++ ++ - - - +++++ ++ - - - +++++ ++ - - - 1,2x104 1,2x105 27 4x104 3,84x106 CGP CGP +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 4x104 3,84x106 28 1x104 1,4x105 CGP CGP +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 1x104 1,4x105 31 8x103 0 BGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 34 0 3x102 0 CGP 0 +++ 0 +++ 0 +++ 0 3x102

35 0 1x104 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x104

37 0 3x102 0 CGP 0 +++ 0 +++ 0 +++ 0 3x102

38 0 2x102 0 CGP 0 ++ 0 ++ 0 ++ 0 2x102

39 0 6x102 0 CGP 0 ++ - - - 0 +++++ 0 +++++ 0 2,4x102

40 0 1x104 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 1x104

41 0 1,8x103 0 CGP 0 + - - - - 0 +++++ 0 +++++ 0 3,6x102

43 0 6,4x104 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 6,4x104 44 0 5,12x106 0 CGP 0 0 0 +++ - - 0 +++ - - 0 0 45 1x103 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 0 0 51 6x104 1,2x105 CGP CGP ++ - - - +++++ ++ - - - +++++ ++ - - - +++++ 2,4x104 1,2x105 52 0 8x102 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 8x102 56 0 1x102 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x102

57 2x102 0 CGP 0 ++ 0 ++ 0 ++ 0 2x102 0 61 0 1x102 CGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 69 9x104 1,1x105 CGP CGP +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 9x104 1,1x105

70 1x103 1x103 CGP CGP + + + + + + 1x103 1x103

188

Continuação do Quadro 4: Contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva. 72 1x102 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x102 0 74 2x103 0 BGP 0 ++ 0 ++ 0 - - 0 0 0 78 0 4,3x105 0 CGP 0 0 0 +++++ 0 +++++ 0 0 79 1x104 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x104 0 80 1,8x103 0 CBGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 81 1,2x103 0 CBGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 82 0 1x104 CBGP 0 + 0 + 0 0 0 0 0 83 0 3x102 0 CGP 0 0 +++ 0 +++ 0 0 0 84 1x104 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x104 0 86 0 7x103 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 7x103 88 0 6,5x103 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 6,5x103 89 0 2x102 0 CGP 0 + - 0 ++ 0 ++ 0 1x102

90 0 1,7x104 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 1,7x104 91 2x104 1x104 CGP CGP ++ + ++ + ++ + 2x104 1x104

92 1x103 0 CGP 0 + 0 + 0 + 0 1x103 0 93 4x105 0 CGP 0 + - - - - 0 ++ - - - 0 ++ - - - 0 8x104 0 94 6x102 2,84x104 CGP CGP - - - - - +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ 0 2,84x104

95 0 1,16x104 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 1,16x104 96 5,3x103 0 BGP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 97 2x104 0 CGP 0 ++ 0 ++ 0 ++ 0 2x104 0 98 0 2x103 0 CGP 0 ++ 0 ++ 0 ++ 0 2x103 99 2x103 6x103 CGP CGP ++ +++++ ++ +++++ ++ +++++ 2x103 6x103

100 0 3x104 0 CGP 0 +++++ 0 +++++ 0 +++++ 0 3x104 CGP: cocos Gram positivos; BGP: bastonetes Gram positivos;+: uma cepa positiva; -: uma cepa negativa.

189

Quadro 5: Contagem de clostrídios sulfito redutores a 46ºC / Cl. perfringens.

Amostras / Nº Plaqueamento Gram Storm

Test Motilidade Nitrato Rafinose Lactose Gelatina Cl. perfringens

37 1,0x103 CGP 0 0 0 0 0 0 0 75 3,2x105 BGP ++++ - - - - ++++ ++++ ++++ ++++ 2,56x105 93 3,6x104 BGP +++++ - - - - -/+ +++++ +++++ +++++ +++ - - 2,16x104 95 6,6x105 BGP +++++ - - - - - +++++ +++++ +++++ +++++ 6,6x105 98 2,7x104 BGP +++++ - - - - - +++++ +++++ +++++ +++++ 2,7x104

100 2,5x105 BGP +++++ - - - - - +++++ +++++ +++++ ++++ - 2,0x105 CGP: cocos Gram positivos; BGP: bastonetes Gram positivos;+: uma cepa positiva; -: uma cepa negativa.

Quadro 6: Pesquisa de Salmonella spp.

Bioquímica TSI Amostras /

Nº Base Bisel H 2S

LIA Citrato H2S Indol Motilidade Uréia Fenilanina VP Oxidase Nitrato S

2 Ácida Alcalino + + - + - - + + - - + - 5 Ácida Alcalino + + - + - - - - - - + -

25 Ácida Alcalino + + + + - - + + - - + - 37 Ácida Alcalino + + - + - + - + - - + - 52 Alcalino Alcalino - - - - - - + + - - - - 54 Alcalino Alcalino + + - - - - + + - - - - 59 Ácida Ácido - + - - - - - + - - + - 61 Ácida Ácido - + + - + - + + - - + - 62 Ácida Alcalino + + + + - + - - - - + + 63 Ácida Alcalino + + + + - + - - - - + + 64 Ácida Alcalino + + - - - - + + - - + - 69 Ácida Alcalino + + + + - + - - - - + + 77 Ácida Alcalino + + - + - - + + - - + -

190

Continuação do Quadro 6: Pesquisa de Salmonella spp. 81 Ácida Alcalino + + - + - - + + - - + - 83 Ácida Ácido - + - + - - + + - - + - 85 H2S Alcalino + + - + - + + + - - + - 91 H2S Alcalino + + - + - + + + - - + - 93 H2S Alcalino + + - + - + + + - - + - 94 H2S Alcalino + + - + - + + + - - + - 95 H2S Alcalino + + - + - + + + - - + - 96 H2S Alcalino + + + + - + + + - - + - 97 H2S Alcalino + + + + - + + + - - + - 99 H2S Alcalino + + + + - + + - - - + -

100 H2S Alcalino + + + + - + + + - - + - TSI: “triple sugar iron”; H2S: sulfeto de hidrogênio; LIA: “lysine iron agar”; VP: prova de Voges-Proskauer; S: sorologia.

191

9.3 FOTOGRAFIAS Figura 23: Material para pesagem das amostras na câmara asséptica.

Figura 24: Aparelho “Stomacher” para cominuição e homogeneização das amostras.

Figura 25: Estufa de incubação a 37ºC.

192

Figura 26: Banho-maria com agitação para incubação a 45ºC ± 0,2ºC.

Figura 27: Caldo Escherichia coli (EC) e caldo verde brilhante bile lactose (VBBL) – teste confirmativo para coliformes a 45ºC e coliformes a 35ºC.

Figura 28: Caldo “Fluorocult” – teste confirmativo de coliformes a 35ºC.

193

Figura 29: Caldo “Fluorocult” – teste confirmativo de E. coli (1) fluorescência positiva; (2) Indol negativo; (3) Indol positivo.

Figura 30: Ágar Baird Parker com crescimento sugestivo de colônias atípicas de S. aureus.

Figura 31: Ágar Baird Parker com crescimento sugestivo de colônias típicas de S. aureus.

1 2 3

194

Figura 32: Esfregaço corado pelo método de Gram – presença de cocos Gram-positivos.

Figura 33: Prova da dnase positiva no ágar azul de toluidina-DNA.

Figura 34: Prova da coagulase. (1) coágulo grande e organizado ; (2) coágulo pequeno e desorganizado; (3) não formação de coágulo.

1 2 3

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Figura 35: Prova da fermentação tempestuosa do leite. (1) positivo; (2) negativo.

Figura 36: Prova da fermentação da lactose e liquefação da gelatina. (1) negativo; (2) positivo; (3) negativo para liquefação da gelatina.

Figura 37: Prova da fermentação da rafinose. (1) negativo; (2 e 3) positivos.

2 1

1 3

2

1 3 2

196

Figura 38: Caldo selenito cistina e caldo tetrationato – enriquecimento seletivo para pesquisa de Salmonella spp.

Figura 39: Ágar Hecktoen – plaqueamento seletivo para pesquisa de Salmonella spp. (presença de colônias sugestivas).

Figura 40: Ágar XLD – plaqueamento seletivo para pesquisa de Salmonella spp. (presença de colônias sugestivas).

T

SC

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