tÉcnicas para a detecÇÃo de...
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Streptococcus pneumoniaeMecanismos de resistência
Aos macrolídeos
• Produção de bombas de efluxo codificadas pelos genes mefE.
Tait-Kamradt et al., Antimicrob Agents & Chemother 41:2251, 1997.
• Produção de enzimas, metilases, codificadas pelos genes erms - S. pneumoniae gene ermAM
Agem na porção 23S rRNA. Resistência cruzada com lincosaminas e estreptograminas do grupo B (fenótip o MLSB).
Leclerq et al., Antimicrob Agents & Chemother 35:1267, 1991.
Resistência a antimicrobianos que atuam na síntese protéica:
Macrolídeos
• Alterações no RNA ribossômico impedem a ligação do antibiótico
• Alto grau de resistência• Resistência cruzada a outras drogas (grupo MLS B)• Modo de disseminação: ?
Delisle & Tomalty, Microbes in Motion
Resistência mediada por efluxo ativo
• Eliminação da droga por bombas dependentes de energia
• Baixo grau de resistência • Normalmente associado a outros mecanismos• Não respeita classe de antimicrobiano: resistência
cruzada “aleatória”• Resistência intrínseca
Lewis & Lomovskaya. In Lewis et al. Bacterial Resistance to Antimicrobials, 2002, p. 61.
PneumococoBreakpoints para macrolídeos
<0.03 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 >64
MIC (µµµµg/mL) do pneumococo
Bkptatual
Bkpt propostopara pneumonia
Populaçãosensíveis
População resistente
por efluxo - mefE
População resistente
por alt. sítiogene erm
Beta-Lactamases de Espectro Ampliado -ESBL
Escherichia coli - Klebisiella pneumoniae
�Degradam todos os beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens
� “Sensíveis” (in vitro) aos inibidores de beta-lactam ases (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)
�Não são normalmente detectadas por testes de sensibilidade
�Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis
�Derivadas das enzimas TEM-1 e SHV-1
Bush et al., AAC 39:1211, 1995
ββββ-Lactamases de Importância Clínica
Grupo 2 (ESBL ou β-lact. de espectro estendido)• Patógenos : E. coli e K. pneumoniae (40% dos BGNs)• Genética : Plasmidial não induzível
• Prevalência : E. coli: 8-10%K. pneumoniae: 40-50%
• Detecção : Difícil
Bush et al., AAC 39:1211, 1995
- Baixa correlação entre teste in vitro e resposta clínica
- Laboratório deve utilizar testes específicos para detecção de β-lact.
- Amostras produtoras de ESBL devem ser considerados R aos β-lactâmicos suscetíveis a essas enzimas
Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL
• Disco difusão ou MIC com diferentes “breakpoints” (NCCLS)
• Dupla Difusão ou Disco Aproximação
• ESBL Etest®• Adição de clavulanato em discos
Teste confirmatTeste confirmat óório da produrio da produ çãção de ESBLo de ESBL
Klebsiella spp. e Escherichia coli
ò Teste de cefotaxima e ceftazidima,
sozinhos e associados à ácido clavulânico
ò Adição de 10 µµµµL de uma solução de ácido clavulânico de 1000 µµµµg/mL a discos contendo 30 µµµµg dos antimicrobianos
ò Aumento ≥≥≥≥5mm indica produção de
ESBL
NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002
DETECDETECÇÃÇÃO DE AMOSTRAS O DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE ESBLPRODUTORAS DE ESBL
3 Etest®
β-lactâmicos associados a inibidores de β-lactamases
3 Critério de positividade
Redução ≥ 3.0 diluições
Razão TZ/TZL > 8
Razão CT/CTL> 8
Beta-lactamases Cromossômicas Induzíveis (Grupo 1, Classe C ou AmpC)
• Principais espécies que produzem essas enzimas:
Citrobacter, Enterobacter, Serratia e Providencia
• A exposição a ββββ-lactâmicos induz a produção de
grandes quantidades de enzimas � resistência às
cefalosporinas de 2a. e 3a. gerações, associações
de penicilinas com inibidores de ββββ-lactamases e
aztreonam
• A resistência poderá se manifestar durante o
tratamento - inicialmente a bactéria pode se mostrar
sensívelLivermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991
Breakpoints estabelecidos pelo NCCLS para detecção de E. coli e K. pneumoniae
produtoras de ESBL
Disco Difusão MIC
Aztreonam < 27 mm >2 µµµµg/mL
Ceftazidima < 22 mm >2 µµµµg/mL
Ceftriaxona < 25 mm >2 µµµµg/mL
Cefotaxima < 27 mm >2 µµµµg/mL
Cefpodoxima < 22 mm >2 µµµµg/mL
NCCLS 1999
PCR para detecção de metalo-ββββ-lactamase IMP-1
Acinetobacter spp - Hospital São Paulo 1993-2001λλλλ Padrão DNA 100 pb1. Controle positivo SM 320 imp-12. Controle positivo Acb 17-4 imp-13. Controle negativo Psa ATCC 278534. Acb 105078 - 1998 5. Acb 146005 - 19996. Acb A2350 - 05/20007. Acb A68 - 01/2000 8. Acb A3035 - 08/20009. Acb A3076 - 08/200010. Acb A3227 - 08/2000 11. Acb A4201 - 01/200112. Acb A4366 - 02/200113. Acb A4371 - 02/200114. Acb A4468 - 02/200115. Acb A4816 - 04/200116. Acb A4861 - 04/200117. Acb A5063 - 05/200118. Master Mix
λλλλ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12131415 1617 18 λλλλ
PCR
Ribotipagem
AcinetobacterMecanismos de resistência aos
carbapenens
• ���� Permeabilidade: Alteração nas proteínas da membrana externa
• Produção de beta-lactamases–– MetaloMetalo --enzimas: IMPenzimas: IMP --1 1 -- 22–– Enzimas do subgrupo 2f: FamEnzimas do subgrupo 2f: Fam íília Oxa lia Oxa
Plasmídios
AcinetobacterOpções terapêuticas
• Ampicilina-sulbactam• Piperacilina-tazobactam• Ceftazidima• Cefepima• Aminoglicosídeos• Quinolonas• Carbapenens
Imipenem ~ MeropenemPOLIMIXINA
S
RESISTÊNCIA
O NH −−−− NH2
C
INH
N Antagonists Efflux NAT? AhpC? DNA damage? NAD metabolism?
Mycolic acid synthesis inhA, kasA,
KatG activation
Reactive oxygen/ Organic radicals
Multiple targets
Proposed Model of INH Action in Mtb
ZHANG & TELENTI, 2000.
RAMASWAMY & MUSSER, 1998
Mutation identified in the inhA locus in INHR
and/or ETHR isolates ofM. tuberculosis
RAMASWAMY & MUSSER, 1998
Mutation in oxyR-ahpC intergenic region identified in INHR and INHS M.
tuberculosis
Genetic Polymorphisms Associated with Resistance to INH (Zhang & Telenti, 2000)
Promoter
mab-inhA (6)
Intergenic
Region
kasA (6)
katG (62)
inhA (6)
oxyR-ahpC (18)
Complete deletion
M1A
D63E
A65ins
I71N
N88R
D94A
G99E
H108E,Q
A110V
G120del
A122del
G123del W198stop
T180C
A172T
S160L
Y155S
L150A
L148A
D142A
S140N,A
A139P
N138S,H
M126I
G125ins V200stop
E217del
F252L
T262R
P275T
E289del
W30DG,stop
S302R
S315T,N,I,R,G
W328L,C
I334T
I335T
L336R L587M,P
A574V
F567S
Q525P
L521del
R515C
D513del
D511del
G485V
W477stop
L463R
I393N
A350S G593D
L617del
L619P
G629S
L634F
S700P
A710V
A714P
A717P
D735A
-81 -> g,a
-15 c -> t -17 g -> t
-16 a -> g -24 g -> t
-55 a -> g
I95P
S94AV78A
I147TI16T
I21V,T
-55 -> g
-46 g ->a
-46 ins at
-45 c -> t -34 t -> a,c
-39 c -> t
-42 t -> c
-44 t -> a -32 g -> a
-30 c -> t
-15 c -> t
-12 c -> t -4 a -> g
-6 g -> a
-9 g -> a
-10 c -> a,t +4 c -> t
+33 g -> a
D66N
R121K
G387D
F413LG312S
G269S
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• MUTAÇÕES– Modificações súbitas ou hereditárias no
conjunto gênico de um organismo que
não é explicável pela recombinação da
variabilidade genética preexistente.
– Mudanças no número de
cromossomos
– Mudanças grosseiras na estrutura dos cromossomos
– Mudanças nos genes individuais
• Algumas vezes deletérias outras não– Fonte básica de toda variabilidade
genética ⇒ Evolução– Recombinação ⇒ rearranja essa
variabilidade em combinações novas– Normal nos seres vivos ⇒
Mutações espontâneas
• Mutações induzidas– Radiação
• Ionizante• Ultravioleta
– Química• Hidroxilamina
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Mutação de Ponto ⇒ Modificação de um único par de base– Substituição (Por modificações tautoméricas) ⇒ Mais comum
– Timina e Guanina (Ceto) ⇔ enol– Adenina e Citosina (Amino) ⇔ Imino
• Transição : Purina por Purina ; Pirimidina por Pirimidina• Transversão : Purina por Pirimidina ; Pirimidina por Purina
– Adição ou Deleção ⇒ Modificam a estrutura de leitura (Frameshift Mutation)
• Mutações silenciosas• Mutações diretas (Inativam o gene)• Aplicações práticas das mutações
– Elucidar vias pelos quais processos metabólicos ocorrem– Agricultura
Sistemas Detecção de Mutação
Unknown Known etc
SSCP analysis Detecting large deletions etc
Heteroduplex analysis DNA chips
DGGE Oligo hybridisation
SSCP/HA/DGGE Oligo ligation assay
RNAse cleavage ARMS
MutS Quantitative PCR
Chemical mismatch cleavage ARCS, UHG etc
Resolvases/ Cleavase Solid-phase minisequencing
Dideoxy fingerprinting Direct Sequecing
DHPLC Classification of methods
Protein Truncation Test Types of mutations, how detected, functional significance
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Podem ser classificadas em três categorias:– aquelas que preferencialmente destroem o alelo selvagem;
– aquelas que preferencialmente amplificam o mutante ou alelo raro;
– aquelas que separam espacialmente o mutante do alelo selvagem.
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Métodos que destroem o alelo selvagem ou abundante:– PCR/RFLP:
• seqüência selvagem contêm o sítio de restrição;• mutação cria um sítio de restrição;• uma mudança de base introduzida pelo PCR cria um sítio de restrição.
• Triagem de mutações já descritas.
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES• Proteção por MutS contra a clivagem:
Denaturação e re-hibridação
T7 DNA polimerase, exonuclease
Alelo selvagem Alelo mutante
Homoduplexes Heteroduplexes
MutS
Homoduplexes selvagens foram degradados
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Métodos que amplificam seletivamente o alelo mutante ou raro:– Amplificação alelo específica:
• utiliza iniciadores que apresentam maior homologia pelos alelos mutantes
• Amplificação alelo específica usando 4 iniciadores;• PCR com bloqueador competitivo
– PNA-PCR (peptide nucleic acid-mediated PCR clamping):Amostra selvagem Amostra mutada
PNA
PCR PCR
Pouco ou nenhum produto
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Reação em cadeia pela ligase:
Amostra selvagem Amostra mutante
Várias etapas de ligação, denaturação e hidridação
Pouco ou nenhum produto formado Produto amplificado
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES• Métodos que separam espacialmente os alelos selvagens e mutantes:– SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)
Amostra padrão Amostra mutante
Denaturação
Adquire conformação espacial
Diferente migração eletroforética
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• SSCP:– Exemplo: região de gene katG que contém o códom 315 em
cepas de Mycobacterium tuberculosis
Onde:
- 1 cepa padrão
- 2 a 19 cepas resistentes
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
– Baseia-se no fato de que a desnaturação da fita de DNA ocorre em domínios acarretando diferença de mobilidade eletroforética entre um alelo normal e um mutado.
• Vantagens– Alta sensibilidade– Simples e revelação não radioativa– Fragmento no gel pode ser isolado e
usado para seqüenciar• Desvantagens
– É necessária análise computadorizada para padronizar o DGGE
– Equipamento– Iniciadores mais caros– Análise de fragmento de 100 a 400 pb– Genes ricos em CG não são facilmente
análisados por DGGE• Variações do DGGE
– TGGE– CDGE
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis):
PCR da sequência alvo
Amplicons denaturados e re-hibridizados
Homoduplexes Heteroduplexes
Dieferente migração em gel com gradiente de denaturação
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• CDCE (Constant denaturant capillary electrophoresis):– Modificação de DGGE
• CMSA (Competitive Mobility Shift Assay):– Baseia-se na especificidade de hibridização de ácidos nucleicos e na separação espacial dos híbridos formados.
PCR
PCR assimétrico
Oligonucleotídeos para selvagem e mutante (mutante marcado)
Hibridização com máxima estringência
Separação eletroforética dos híbridos
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• CFLP (Cleavase® Fragment Length Polymorphism):
Denaturação:
5’-ligadoSelvagem Mutante
Mutação pontual
Locais de clivagem
Digestão enzimática parcial
Estruturas mutantes
S M
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• CLIVAGEM QUÍMICA OU ENZIMÁTICA DE NUCLEOTÍDEOS COM ERRO DE PAREAMENTO– Química (CCM)
• Fundamenta-se no fato de que a reatividade dos nucleotídeos frente a substâncias químicas (Hidroxilamina e Tetróxido de ósmio)
• T ⇒ com T, C ou G (Tetróxido de ósmio)
• C ⇒ com A, C ou T (Hidroxilamina)
• Vantagens– Alta sensibilidade ( ap. 100%)
– Habilidade de analisar fragmentos grandes(1,6 Kb)
– Não é necessário equipamentos especiais
• Desvantagens– Uso de 32P e Hidroxilamina
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• CLIVAGEM QUÍMICA OU ENZIMÁTICA DE NUCLEOTÍDEOS COM ERRO DE PAREAMENTO
– Enzimática (ECM)
• Resolvases (T4 Endonuclease VII,
T7 Endonuclease I)
– Reconhece bases pareadas errada
em ds DNA, cortando no sítio de
pareamento errado
• Cleavases
– CFLP (Cleavase I)
• Vantagens– Sensível e rápido– Nenhum equipamento especial é
requerido– Pode-se estimar a posição da
mutação– Capaz de analisar fragmentos de
100 pb a 2 Kb– Disponível em Kit
• Desvantagens– Otimização é individual– Pode falhar na detecção de
algumas mutações– Usa 32P
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)– Método baseado na separação entre homoduplex e heteroduplex em coluna utilizando um
gradiente crescente de acetonitrila.– A absorbância é lida em 260 nm– Heteroduplex são menos estáveis e tem menor afinidade pela coluna– Tempo de retenção e a concentração de acetonitrila é menor do que o do homoduplex
– VANTAGENS• Reinjetar o material e reanalisar• Sensível• Analisa fragmentos de 200 – 500 pb
– DESVANTAGEM• Usa equipamento caro (HPLC)
• TESTE DA PROTEÍNA TRUNCADA• SEQUENCIAMENTO DO DNA
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• PESQUISA DA PRESENÇA DE MUTAÇÕES CONHECIDAS– PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
• Requerimento de que o polimorfismo altere o sítio de corte da enzima
– Teste de ligação do nucleotídeo (OLA)• Ocorre hibridização com sonda oligonucleotídica
– 2 sondas alelo específica (1 mutante e outra WT)
– 1 sonda fluorescente comum ao mutante e ao WT
– Ocorre ligação pela ligase
– Solid-phase minisequencing• Método trabalhoso, requer pessoal técnico habilitado para análise final
ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Allelic Specific Oligonucleotide(ASO)– Sondas específicas para hibridizar com o alelo normal e com o alelo
mutante
• Ligase Chain Reaction(LCR)– Explora o fato de que as extremidades das duas fitas simples do DNA
devem estar exatamente alinhadas para a ação da DNA ligase
• DNA Microarray Genotyping (DNA Chips)
• Sequenciamento
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES
• Minisequenciamento:
PCR do DNA genômico
Preparação de amostras em fita simples
Hibridização das amostras aos iniciadores
Reação de minisequenciamento
Análise do ddNTP incorporado
DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS
GENE ALVO ALVOTERAPÊUTICO
COMPOSTO ESCOLHIDO
CANDIDATOCLÍNICO
DROGANOVA
GENOMA FUNCIONALPROTEOMA
INFORMÁTICA
HTS E ENSAIO DE MECANISMOQUÍMICA DE COMBINAÇÃO E MÉDICA
DESENHO DA DROGA E ESTRUTUR BIOLÓGICABIOLOGIA CELULAR E FARMACOLOGIA
MODELO IN VIVO DE DOENÇASFARMACOCINÉTICA E METABOLISMO DE DROGA
TOXICOLOGIA PRÉ-CLÍNICA