técnicas de imunologia prof.doutor josé cabeda microscopia imunohistoquimica microscopia de...

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Microscopia

ImunohistoquimicaImunohistoquimica

Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Processamento de amostras

Amostras fixadasAmostras fixadas

FixaçãoFixação ParafinaçãoParafinação Armazenamento RTArmazenamento RT

Preparar lâmina (silano, etc)Preparar lâmina (silano, etc) Cortar 4-6Cortar 4-6mm Retirar parafinaRetirar parafina RehidratarRehidratar Recuperar AgRecuperar Ag marcarmarcar

Amostras CongeladasAmostras Congeladas

Retirar gordura e tecido conectivoRetirar gordura e tecido conectivo 1.5 cm1.5 cm22 x 0.5 cm x 0.5 cm Transportar em MEM/RPMI 4ºCTransportar em MEM/RPMI 4ºC Embeber (até 1 h pós colheita)Embeber (até 1 h pós colheita) Armazenar –70ºCArmazenar –70ºC

Preparar LâminaPreparar Lâmina Cortar 4-5Cortar 4-5mm Fixar com paraformaldeido a 1%Fixar com paraformaldeido a 1% marcarmarcar


Corte de tecidos


Fixação

FormaldeídoFormaldeído Método de eleiçãoMétodo de eleição Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve

“crosslinking”“crosslinking” Utiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutroUtiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutro Responsável por “epitope masking”Responsável por “epitope masking” Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete

e imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 he imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 h Transferir para Et-oh 70% até processarTransferir para Et-oh 70% até processar

AlcoolAlcool Muito menos utilizadoMuito menos utilizado


Congelação

Remover excesso de MEM/RPMI tocando em papelRemover excesso de MEM/RPMI tocando em papel Embeber em O.C.T. em moldeEmbeber em O.C.T. em molde Congelar durante 20 a 30 segundos em Congelar durante 20 a 30 segundos em

banho de isopentano arrefecido combanho de isopentano arrefecido com Azoto liquido (-135 a -140ºC)Azoto liquido (-135 a -140ºC) Gelo seco (-30ºC)Gelo seco (-30ºC)

Banho de congelação de tecidos (-52ºC)Banho de congelação de tecidos (-52ºC) Remover excesso de O.C.T. Com bisturiRemover excesso de O.C.T. Com bisturi Congelar a –70ºC / -80ºCCongelar a –70ºC / -80ºC


Recuperação de Antigénios Aumenta a sensibilidade da imunohistoquimicaAumenta a sensibilidade da imunohistoquimica Reverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixaçãoReverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixação Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de

“crosslinks” entre proteínas envolvendo ou não Ca“crosslinks” entre proteínas envolvendo ou não Ca2+2+

Envolve habitualmente a utilização de calor(Envolve habitualmente a utilização de calor(100ºC) durante 100ºC) durante 20 min.20 min.

Soluções:Soluções: 10 mM Tampão citrato pH 3 a 610 mM Tampão citrato pH 3 a 6 100 mM Tris-Cl pH 8 a 10 com/sem ureia100 mM Tris-Cl pH 8 a 10 com/sem ureia 1 mM EDTA pH 8.01 mM EDTA pH 8.0

Eficiente p/ nucleoEficiente p/ nucleo Causa background por recuperação biotina endógenaCausa background por recuperação biotina endógena


Tecidos control

Não existem tecidos standard para controlNão existem tecidos standard para control Tecidos control devem ser processados da Tecidos control devem ser processados da

mesma forma que os tecidos testemesma forma que os tecidos teste Em aparelhos automáticos, os tecidos Em aparelhos automáticos, os tecidos

control devem estar na mesma lâmina que o control devem estar na mesma lâmina que o testeteste


Optimização da marcação

Diluição do anticorpo primárioDiluição do anticorpo primário [] [] sensibilidade mas tb sensibilidade mas tb R.inespecíficasR.inespecíficas

Tempo de marcação do primárioTempo de marcação do primário Tipo e concentração do secundárioTipo e concentração do secundário Tampão de recuperação de AgTampão de recuperação de Ag

Utilização de EDTA Utilização de EDTA Melhora marcação com alguns Ag Melhora marcação com alguns Ag força um passo de bloqueio de biotina endógenaforça um passo de bloqueio de biotina endógena

Temperatura de incubaçãoTemperatura de incubação

Utilização de sistemas automáticos limita a escolhaUtilização de sistemas automáticos limita a escolha Gama de temperaturas limitadaGama de temperaturas limitada Anticorpos secundários e reagentes de detecção optimizados Anticorpos secundários e reagentes de detecção optimizados Tempos de incubação devem ser compatíveis entre os vários protocolosTempos de incubação devem ser compatíveis entre os vários protocolos


Sistemas de detecção (I)

Maioritáriamente baseados em Maioritáriamente baseados em ““horseradish peroxidase” horseradish peroxidase” (preferida nos marcadores automáticos)(preferida nos marcadores automáticos)

Fosfatase alcalinaFosfatase alcalina

3 passos3 passos PAP (peroxidade anti-peroxidase)PAP (peroxidade anti-peroxidase) LSAB (enzyme labelled streptavidin biotin)LSAB (enzyme labelled streptavidin biotin) ABC (Avidin biotin complex)ABC (Avidin biotin complex)


Sistemas de detecção (II)

2 passos2 passos Menos sensíveisMenos sensíveis Recentemente introduzidos os polímeros de dextran com cerca de Recentemente introduzidos os polímeros de dextran com cerca de

100 moléculas de enzima 100 moléculas de enzima sensibilidade semelhante aos métodos com 3 passossensibilidade semelhante aos métodos com 3 passos não envolve biotina, pelo que não exige o bloqueio da biotina não envolve biotina, pelo que não exige o bloqueio da biotina

endógenaendógena


Sistemas de detecção (III)

5 passos (Extremamente sensíveis, mas inespecificidade pode ser 5 passos (Extremamente sensíveis, mas inespecificidade pode ser problemática)problemática) primário;primário; sec.-biotina;sec.-biotina; ABC-peroxidase;biotinil-tiramida+H2O2;ABC-peroxidase;biotinil-tiramida+H2O2;

Peroxidase+H2O2 geram radicais livres que activam a biotinil-Peroxidase+H2O2 geram radicais livres que activam a biotinil-tiramida, a qual se liga então covalentemente a grupos amino tiramida, a qual se liga então covalentemente a grupos amino disponíveis na vizinhança, gerando um tapete de biotinadisponíveis na vizinhança, gerando um tapete de biotina

Peroxidase-estreptavidinaPeroxidase-estreptavidina A estreptavidina liga-se ao “tapete” de biotina na vizinhança A estreptavidina liga-se ao “tapete” de biotina na vizinhança

do anticorpo, revestindo-o com peroxidasedo anticorpo, revestindo-o com peroxidase CromogénioCromogénio


Sistemas de detecção (IV)

CromogénioCromogénio PeroxidasePeroxidase

3,3’-Diaminobenzidina (DAB) –castanho3,3’-Diaminobenzidina (DAB) –castanho 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) – vermelho3-amino-9-etilcarbazol (AEC) – vermelho

Fosfatase alcalinaFosfatase alcalina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato nitrobluo (BCIP/NBT) – 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato nitrobluo (BCIP/NBT) –

purpurapurpura Fast-red-naphtol (AS-TR) – vermelhoFast-red-naphtol (AS-TR) – vermelho

Escolha depende deEscolha depende de Contrastante (hematoxilina ou verde de metilo)Contrastante (hematoxilina ou verde de metilo) Tempo de incubação (DAB mais rápido que AST-TR)Tempo de incubação (DAB mais rápido que AST-TR) Segurança (DAB é carcinogénio)Segurança (DAB é carcinogénio) Duração (DAB origina marcação permanente)Duração (DAB origina marcação permanente) Contraste (AEC origina um excelente contraste)Contraste (AEC origina um excelente contraste)


Sistemas de detecção (V)


Imunohistoquímica -Utilidade


Imunofluorescência (I)


Imunofluorescência (II)

IgG

IgM

IgA

IgGIgG

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