aula microscopia

44
 Universidade Estadual de Maringá Departamento de Ciências Morfofisiológicas http://www.invivo.fiocruz.br/celula Microscopia Eletrônica de Transmissão & Microscopia Confocal MSc. Priscila de Freitas 

Upload: priscilamga

Post on 09-Jul-2015

635 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 1/44

 

 

Universidade Estadual de Maringá

Departamento de Ciências Morfofisiológicas 

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

Microscopia Eletrônica de

Transmissão

&

Microscopia Confocal

MSc. Priscila de Freitas 

Page 2: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 2/44

 

 

História do microscópio 

O objeto de cristal da rochaconhecido como lente de

Lanyard, datado de 721 a.C.,pode ter sido a primeira lente

criada pelo homem

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

Page 3: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 3/44

 

 

História do microscópio 

O modelo foi encontradona Holanda, no século

XVII

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

Zacharias Jansen e ummicroscópio que,

acredita-se, tenha sidofabricado por ele.

Page 4: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 4/44

 

 

História do microscópio 

Modelo de microscópioitaliano, possivelmente

utilizado por volta do ano1600. Os modelos

italianos eram simples epequenos

9xhttp://www.invivo.fiocruz.br/celula

Modelo de microscópioalemão, possivelmente

utilizado por volta do ano1632. Fabricado por

Antoni van Leeuwenhoek

~50-200x

Page 5: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 5/44

 

 

História do microscópio 

Esquema retratando aforma de utilização do

microscópio de projeçãosolar e um espetáculo de

projeção microscópica

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

Século XVIII- Projeçõespelo mundo inteiro.

Vários microcospistaslançavam seus modelos.

Page 6: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 6/44

 

 

História do microscópio 

Microscópio composto construído porChristopher Cock segundo desenho de Robert

Hooke, 1670. (Inglaterra, 50cm). A RobertHooke se deve a utilização do termo “célula”. 

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

Page 7: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 7/44

 Microscópios no século XIX

Século XIX : - novas técnicas para fabricação delentes ; - espelhos curvos

-Em 1840, os Estados Unidos passaram a fabricarmicroscópios

-Por volta de 1880, os chamados microscópios

ópticos atingiram a resolução de 0,2 micrômetros,limite que permanece até os dias de hoje

História do microscópio 

Microscópio com espelhose conjunto de acessórios.Modelo construído peloitaliano Giovan Battista

em 1813.

http://www.invivo.fiocruz.br/celula  

Page 8: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 8/44

 

A utilização do microscópio 

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

 Tamanhos de

células e dos

seus

componentes e

as unidades

usadas para

mensurá-las

SeresVivos  Tecidos e

Células

MICROSCÓPIOS

Histologia eBiologia Celular

  

Page 9: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 9/44

 

História do microscópio eletrônico

http://www.invivo.fiocruz.br/celula

luz e lentes de vidro

 ampliações de até um milhão de vezes 

MET    Anos 30  Ernest Ruska

feixes de elétrons e lenteseletromagnéticas

(5 mil/1 bilhão elétron-volts)

 

Page 10: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 10/44

 

 

Page 11: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 11/44

 Vantagens de um microscópio de transmissão•Definição de imagens intracelulares•Permite estudos de morfologia celular•Aspectos gerais das organelas

•Interação de parasitas com as células•Altíssima resolução (0,1nm)•(3nm) Ampliação de 400 mil x

Microscópio eletrônico de transmissão 

 

Page 12: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 12/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão 

 funcionamento 

  

Page 13: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 13/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Preparação do Material Biológico para MET 

Procedimentos: Fixação

Inclusão

Microtomia

“Coloração” 

  

Page 14: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 14/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Fixação

CritériosMetodologias: Perfusão

GotejamentoInstilaçãoImersão

  

Page 15: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 15/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Soluções Fixadoras

Fatores importantes: ConcentraçãoTempoTemperaturaOsmolaridadepH

Tampões:Fosfato = preservação das membranasCacodilato = boa preservação da matriz citoplasmática

  

Page 16: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 16/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Tipos de Fixadores utilizados em ME

Aldeídos = FIXADORES PRIMÁRIOS

Formoldeído* = NÃO RECOMENDADO PARA MET Glutaraldeído = MAIS UTILIZADOAcroleina

* Paraformaldeído = Processamento de Reações HistoquímicasFixação do SNC

Tetróxido de Ósmio (OsO4)

Acetato de Uranila

Permanganato de Potássio= preservação e coloração delipoproteínas de membranas

  

Page 17: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 17/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Fixação Seqüencial

Método mais UtilizadoGLUTARALDEÍDO + TETRÓXIDO DE ÓSMIO

OBS. Utilização de um terceiro fixador  

Page 18: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 18/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

DesidrataçãoObjetivoSoluções utilizadas: Álcool Etílico

Álcool Metílico

AcetonaOBS. Quando utilizar o álcool, é necessário a passagem do material em um fluidointermediário = Óxido de Propileno

Emblocagem

Compostos Utilizados: MetacrilatosResinas EpoxiResinas Poliésteres

Fases: - Infiltração- Inclusão = cápsulas de gelatina transparente, de plástico ou

“moldes” comerciais  

Page 19: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 19/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

MicrotomiaUltramicrótomo = cortes ultrafinos (500Å)

Preparação dos Blocos = TRIMAGEM Manual oucom equipamento Piramitome (LKB)

Face de corte

Melhor  

Page 20: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 20/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Preparo da Navalha

Utilização de Navalhas de Vidro ou de Diamante

  

Page 21: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 21/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Microtomia

Obtenção de cortes Semi-finos (0,5m) = visualização em ML

Obtenção de cortes Ultra-finos(500Å) = visualização em MET 

  

Page 22: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 22/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

ColoraçãoCortes“Bloco”: Ácido Ósmico 

Acetato de Uranila

Ácido Fosfotungstenico (PTA)Coloração de cortes de 0,5m: GiemsaAzul de ToluidinaAzul de MetilenoAzur II

Coloração de cortes de 500Å: Citrato de ChumboAcetato de Uranila 

Rotina nos Laboratórios de MET = Dupla Coloração

(Chumbo + Uranila)  

Page 23: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 23/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

AplicaçãoCÉLULA VEGETAL

  

Page 24: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 24/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Aplicação

CÉLULA ANIMAL

  

Page 25: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 25/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Aplicação – Tecido Nervoso

1- Vesículassinápticas

2- Membrana pré-sináptica

3- Fenda sináptica

4- Membrana pós-

sináptica

  

Page 26: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 26/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda:

n- corpo celular neuronal (mioentérico); p-

processo neuronal ; gl- corpo celular da glia

O principal objetivo dotrabalho foi caracterizar ultra-estruturalmente ogânglio mioentérico eseus componentes noduodeno de ratosWistar adultos.

Protocolo:

Fixador:gluataraldeído + tampão fosfato

Pós-fixado: tetróxido de ósmio

Emblocado: araldite

Cortes semi-finos: corados com azul de metileno

Cortes ultra-finos: contraste com acetato deuranila 

  

Page 27: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 27/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda: gânglio mioentérico

Seta- as vesículas sinápticas estão em todos osterminais nervosos glutamato-reativos; cabeçade seta- partículas de ouro (10nm) queidentificam o axônio que contem níveis deglutamato. Um 2º terminal (*) contem

claramente vesículas sinápticas mas poucaspartículas de ouro.

O principal objetivo do trabalho foi reportar pela primeira vez a presençade neurônios entéricosglutamatérgicos, e que o glutamato éum neurotransmissor entérico;estando seletivamente concentradoem varicosidades terminais axonais.

Protocolo:

Fixador:gluataraldeído + tampão fosfato

Pós-fixado: tetróxido de ósmio

Emblocado: epon

Cortes: técnica imunohistoquímica (anticorposecundário conjugado com ouro) + contraste comacetato de uranila

  

Page 28: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 28/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda: colon distal

Distribuição de terminais nervosos na camadamuscular circular do grupo controle. Setas :terminais dispersos na camada muscularcircular e na camada exterior da submucosa.B e C: aumento destes terminais nervosos (b– c). (*) terminações nervosas com vesículassinápticas

O principal objetivo do trabalho foi investigar a distribuição dos terminais nervosos nointestino delgado e grosso de ratos com adoença de Hirschsprung’s (o segmento ficasem ambos os plexos: submucoso emiontérico).

Protocolo:

Fixador:gluataraldeído + paraformaldeido +tampão cacodilato

Pós-fixado: tetróxido de ósmio

Emblocado: epon

Cortes: acetato de uranila

  

Page 29: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 29/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda:

Corte do córtex frontal de macaco, iPLA2imunomarcado. Densa marcação é presenteno nucleoplasma (N) e no envelope nucleardos neurônios (cabeça de seta).

O principal objetivo do trabalho foi investigar a distribuição dafosfolipase calcio-independente A2(iPLA2) no cérebro normal de macaco(Macaca fascicularis ). 

Protocolo:

O material foi desidratado em série ascendente deetanol e acetona

Emblocado: epon

Coloração: citrato de chumbo

  

Page 30: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 30/44

 

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda: amígdala medial postero-dorsal e célulaglial

Pericário com núcleo claro (Nuc); nucléolo (ncl);corpúsculo de Nissl (NB); ribossomos (R);complexo de Golgi (G); mitocôndria (M); retículo

endoplasmático liso (seta) e rugoso (duplaseta).

O principal objetivo do trabalho foidescrever a ultra-estrutura deneurônios e analisar a distribuiçãosináptica terminal na amígdalamedial póstero-dorsal de ratosmachos adultos. 

Protocolo:

Fixador:gluataraldeído + paraformaldeido + tampãofosfato

Pós-fixado: tetróxido de ósmio

Emblocado: resina

Cortes semi-finos: corados com azul de toluidina

Cortes ultra-finos: contraste com acetato de uranila

 

Page 31: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 31/44

 

http://www.invivo.fiocruz.br/celula  

Page 32: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 32/44

 

Microscópio confocal

Breve Histórico da Microscopia Confocal

•Marvin Minski – 1957

•Primeiro microscópio confocal,para visualização de células vivas•Implementação:

•De objetivas de alta performance•

De tecnologias de captura deimagem•De sistemas de digitalização

•Gravação de dados emcomputadores

  

Page 33: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 33/44

 

Microscópio confocal

Vantagens de um microscópio confocal

•Capacidade de realizar fatias ópticas

•Reconstrução 3D•Resolução excelente (0,1µm)

•Uso de comprimentos de onda

específicos

•Sensibilidade muito alta

•Imagem digital

•Controle por computador

Filtros de excitação e emissão

  

Page 34: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 34/44

 

Microscópio confocal

MICROSCOPIA CONFOCAL

biologia celular

microscopiaanálise de imagem

imagem digital

softwares

fluorescência

bioquímica

imunologia

lasers

luz

  

Page 35: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 35/44

 

Microscópio confocal

Microscópio confocal –

como funciona?

 

Page 36: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 36/44

 

Microscópio confocal

  

Page 37: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 37/44

 

Microscópio confocal

Vantagem do escaneamento pontual

  

Page 38: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 38/44

 

Microscópio confocal

Preparação do Material Biológico

• O material pode ser espesso, sem corar,

vivo ou não, pois focaliza diferentesplanos focais, obtendo-se cortes ópticos;

• A coloração do material por corantes

fluorescentes é detectada pelo

microscópio confocal, o qual é geralmente

utilizado com microscópio de

fluorescência.Corantes fluorescentes

  

Page 39: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 39/44

 

Microscópio confocal

Aplicação – Tecido Nervoso

Glia entérica

  

Page 40: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 40/44

 

Microscópio confocal

Legenda:

Imunomarcação e morfologia de neurôniosVIP-positivos e fibras no plexo submucosono íleo de ratos controle.

O principal objetivo dotrabalho foi verificar o efeitoda desnervação (BAC) sobrea população de neurôniossubmucosos que expressam

 peptídeo intestinal vasoativo(VIP)

Protocolo:

Técnica imunohistoquímica para preparados totais para detectar a presença do peptídeo intestinal vasoativo (VIP) no plexo submucoso.

 Anticorpo secundário ligado a fluoresceína. 

  

Page 41: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 41/44

 

Microscópio confocal

Legenda:

Preparado total do plexo mioentérico docolon de rato.

GFAP - glial fibrilary acidic protein, ummarcador de corpos gliais intraganglionico.

O principal objetivo do trabalho foisumarizar o conhecimento atual sobrea biologia da célula glial entérica e ospapéis que estas possam exercer emestados de saúde e de doençaintestinais.

Protocolo:

O tecido foi marcado com anticorpo policlonal contra GFPA, o qual foi visualizado com Cy2 acoplado ao anticorposecundário.

  

Page 42: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 42/44

 

Microscópio confocal

Legenda:

Duas marcações imunofluorescentes: GR (verde) eGABA (vermelho) mostram a distribuição de célulasmarcadas dentro da amígdala. Subdivisões

amígdala: B basal; C central; LAd lateral (divisãodorsal); Lvl (lateral-ventral) e Lvm (medial-ventral).

Receptor glicocorticoide (GR) tem um papelsignificativo na modulação da plasticidade

sináptica, na estrutura dendrítica e nossistemas transmissores no núcleo lateral (LA)na amígdala. Para começar a verificar como oGR pode mediar estes efeitos, o presentetrabalho examina a localização celular esubcelular do GR no LA. New York

Protocolo:

Duas imunomarcações foram utilizadas: GRexpresso em neurônios e neurônios GABA-érgicos no LA, usando anticorpo monoclonal 

contra GABA e rabbit anti-GR57.

 

Page 43: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 43/44

 

Microscópio confocal

Trabalhando com as imagens no microscópio confocal

Page 44: Aula Microscopia

5/10/2018 Aula Microscopia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/aula-microscopia-559e0316e93e5 44/44