aula microscopia
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Universidade Estadual de Maringá
Departamento de Ciências Morfofisiológicas
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Microscopia Eletrônica de
Transmissão
&
Microscopia Confocal
MSc. Priscila de Freitas
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História do microscópio
O objeto de cristal da rochaconhecido como lente de
Lanyard, datado de 721 a.C.,pode ter sido a primeira lente
criada pelo homem
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História do microscópio
O modelo foi encontradona Holanda, no século
XVII
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Zacharias Jansen e ummicroscópio que,
acredita-se, tenha sidofabricado por ele.
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História do microscópio
Modelo de microscópioitaliano, possivelmente
utilizado por volta do ano1600. Os modelos
italianos eram simples epequenos
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Modelo de microscópioalemão, possivelmente
utilizado por volta do ano1632. Fabricado por
Antoni van Leeuwenhoek
~50-200x
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História do microscópio
Esquema retratando aforma de utilização do
microscópio de projeçãosolar e um espetáculo de
projeção microscópica
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Século XVIII- Projeçõespelo mundo inteiro.
Vários microcospistaslançavam seus modelos.
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História do microscópio
Microscópio composto construído porChristopher Cock segundo desenho de Robert
Hooke, 1670. (Inglaterra, 50cm). A RobertHooke se deve a utilização do termo “célula”.
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Microscópios no século XIX
Século XIX : - novas técnicas para fabricação delentes ; - espelhos curvos
-Em 1840, os Estados Unidos passaram a fabricarmicroscópios
-Por volta de 1880, os chamados microscópios
ópticos atingiram a resolução de 0,2 micrômetros,limite que permanece até os dias de hoje
História do microscópio
Microscópio com espelhose conjunto de acessórios.Modelo construído peloitaliano Giovan Battista
em 1813.
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A utilização do microscópio
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Tamanhos de
células e dos
seus
componentes e
as unidades
usadas para
mensurá-las
SeresVivos Tecidos e
Células
MICROSCÓPIOS
Histologia eBiologia Celular
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História do microscópio eletrônico
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luz e lentes de vidro
ampliações de até um milhão de vezes
MET Anos 30 Ernest Ruska
feixes de elétrons e lenteseletromagnéticas
(5 mil/1 bilhão elétron-volts)
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Vantagens de um microscópio de transmissão•Definição de imagens intracelulares•Permite estudos de morfologia celular•Aspectos gerais das organelas
•Interação de parasitas com as células•Altíssima resolução (0,1nm)•(3nm) Ampliação de 400 mil x
Microscópio eletrônico de transmissão
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Microscópio eletrônico de transmissão
funcionamento
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Microscópio eletrônico de transmissão
Preparação do Material Biológico para MET
Procedimentos: Fixação
Inclusão
Microtomia
“Coloração”
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Microscópio eletrônico de transmissão
Fixação
CritériosMetodologias: Perfusão
GotejamentoInstilaçãoImersão
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Microscópio eletrônico de transmissão
Soluções Fixadoras
Fatores importantes: ConcentraçãoTempoTemperaturaOsmolaridadepH
Tampões:Fosfato = preservação das membranasCacodilato = boa preservação da matriz citoplasmática
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Microscópio eletrônico de transmissão
Tipos de Fixadores utilizados em ME
Aldeídos = FIXADORES PRIMÁRIOS
Formoldeído* = NÃO RECOMENDADO PARA MET Glutaraldeído = MAIS UTILIZADOAcroleina
* Paraformaldeído = Processamento de Reações HistoquímicasFixação do SNC
Tetróxido de Ósmio (OsO4)
Acetato de Uranila
Permanganato de Potássio= preservação e coloração delipoproteínas de membranas
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Microscópio eletrônico de transmissão
Fixação Seqüencial
Método mais UtilizadoGLUTARALDEÍDO + TETRÓXIDO DE ÓSMIO
OBS. Utilização de um terceiro fixador
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Microscópio eletrônico de transmissão
DesidrataçãoObjetivoSoluções utilizadas: Álcool Etílico
Álcool Metílico
AcetonaOBS. Quando utilizar o álcool, é necessário a passagem do material em um fluidointermediário = Óxido de Propileno
Emblocagem
Compostos Utilizados: MetacrilatosResinas EpoxiResinas Poliésteres
Fases: - Infiltração- Inclusão = cápsulas de gelatina transparente, de plástico ou
“moldes” comerciais
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Microscópio eletrônico de transmissão
MicrotomiaUltramicrótomo = cortes ultrafinos (500Å)
Preparação dos Blocos = TRIMAGEM Manual oucom equipamento Piramitome (LKB)
Face de corte
Melhor
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Microscópio eletrônico de transmissão
Preparo da Navalha
Utilização de Navalhas de Vidro ou de Diamante
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Microscópio eletrônico de transmissão
Microtomia
Obtenção de cortes Semi-finos (0,5m) = visualização em ML
Obtenção de cortes Ultra-finos(500Å) = visualização em MET
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Microscópio eletrônico de transmissão
ColoraçãoCortes“Bloco”: Ácido Ósmico
Acetato de Uranila
Ácido Fosfotungstenico (PTA)Coloração de cortes de 0,5m: GiemsaAzul de ToluidinaAzul de MetilenoAzur II
Coloração de cortes de 500Å: Citrato de ChumboAcetato de Uranila
Rotina nos Laboratórios de MET = Dupla Coloração
(Chumbo + Uranila)
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Microscópio eletrônico de transmissão
AplicaçãoCÉLULA VEGETAL
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Microscópio eletrônico de transmissão
Aplicação
CÉLULA ANIMAL
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Microscópio eletrônico de transmissão
Aplicação – Tecido Nervoso
1- Vesículassinápticas
2- Membrana pré-sináptica
3- Fenda sináptica
4- Membrana pós-
sináptica
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Microscópio eletrônico de transmissão
Legenda:
n- corpo celular neuronal (mioentérico); p-
processo neuronal ; gl- corpo celular da glia
O principal objetivo dotrabalho foi caracterizar ultra-estruturalmente ogânglio mioentérico eseus componentes noduodeno de ratosWistar adultos.
Protocolo:
Fixador:gluataraldeído + tampão fosfato
Pós-fixado: tetróxido de ósmio
Emblocado: araldite
Cortes semi-finos: corados com azul de metileno
Cortes ultra-finos: contraste com acetato deuranila
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Microscópio eletrônico de transmissão
Legenda: gânglio mioentérico
Seta- as vesículas sinápticas estão em todos osterminais nervosos glutamato-reativos; cabeçade seta- partículas de ouro (10nm) queidentificam o axônio que contem níveis deglutamato. Um 2º terminal (*) contem
claramente vesículas sinápticas mas poucaspartículas de ouro.
O principal objetivo do trabalho foi reportar pela primeira vez a presençade neurônios entéricosglutamatérgicos, e que o glutamato éum neurotransmissor entérico;estando seletivamente concentradoem varicosidades terminais axonais.
Protocolo:
Fixador:gluataraldeído + tampão fosfato
Pós-fixado: tetróxido de ósmio
Emblocado: epon
Cortes: técnica imunohistoquímica (anticorposecundário conjugado com ouro) + contraste comacetato de uranila
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Microscópio eletrônico de transmissão
Legenda: colon distal
Distribuição de terminais nervosos na camadamuscular circular do grupo controle. Setas :terminais dispersos na camada muscularcircular e na camada exterior da submucosa.B e C: aumento destes terminais nervosos (b– c). (*) terminações nervosas com vesículassinápticas
O principal objetivo do trabalho foi investigar a distribuição dos terminais nervosos nointestino delgado e grosso de ratos com adoença de Hirschsprung’s (o segmento ficasem ambos os plexos: submucoso emiontérico).
Protocolo:
Fixador:gluataraldeído + paraformaldeido +tampão cacodilato
Pós-fixado: tetróxido de ósmio
Emblocado: epon
Cortes: acetato de uranila
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Microscópio eletrônico de transmissão
Legenda:
Corte do córtex frontal de macaco, iPLA2imunomarcado. Densa marcação é presenteno nucleoplasma (N) e no envelope nucleardos neurônios (cabeça de seta).
O principal objetivo do trabalho foi investigar a distribuição dafosfolipase calcio-independente A2(iPLA2) no cérebro normal de macaco(Macaca fascicularis ).
Protocolo:
O material foi desidratado em série ascendente deetanol e acetona
Emblocado: epon
Coloração: citrato de chumbo
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Microscópio eletrônico de transmissão
Legenda: amígdala medial postero-dorsal e célulaglial
Pericário com núcleo claro (Nuc); nucléolo (ncl);corpúsculo de Nissl (NB); ribossomos (R);complexo de Golgi (G); mitocôndria (M); retículo
endoplasmático liso (seta) e rugoso (duplaseta).
O principal objetivo do trabalho foidescrever a ultra-estrutura deneurônios e analisar a distribuiçãosináptica terminal na amígdalamedial póstero-dorsal de ratosmachos adultos.
Protocolo:
Fixador:gluataraldeído + paraformaldeido + tampãofosfato
Pós-fixado: tetróxido de ósmio
Emblocado: resina
Cortes semi-finos: corados com azul de toluidina
Cortes ultra-finos: contraste com acetato de uranila
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Microscópio confocal
Breve Histórico da Microscopia Confocal
•Marvin Minski – 1957
•Primeiro microscópio confocal,para visualização de células vivas•Implementação:
•De objetivas de alta performance•
De tecnologias de captura deimagem•De sistemas de digitalização
•Gravação de dados emcomputadores
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Microscópio confocal
Vantagens de um microscópio confocal
•Capacidade de realizar fatias ópticas
•Reconstrução 3D•Resolução excelente (0,1µm)
•Uso de comprimentos de onda
específicos
•Sensibilidade muito alta
•Imagem digital
•Controle por computador
Filtros de excitação e emissão
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Microscópio confocal
MICROSCOPIA CONFOCAL
biologia celular
microscopiaanálise de imagem
imagem digital
softwares
fluorescência
bioquímica
imunologia
lasers
luz
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Microscópio confocal
Microscópio confocal –
como funciona?
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Microscópio confocal
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Microscópio confocal
Vantagem do escaneamento pontual
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Microscópio confocal
Preparação do Material Biológico
• O material pode ser espesso, sem corar,
vivo ou não, pois focaliza diferentesplanos focais, obtendo-se cortes ópticos;
• A coloração do material por corantes
fluorescentes é detectada pelo
microscópio confocal, o qual é geralmente
utilizado com microscópio de
fluorescência.Corantes fluorescentes
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Microscópio confocal
Aplicação – Tecido Nervoso
Glia entérica
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Microscópio confocal
Legenda:
Imunomarcação e morfologia de neurôniosVIP-positivos e fibras no plexo submucosono íleo de ratos controle.
O principal objetivo dotrabalho foi verificar o efeitoda desnervação (BAC) sobrea população de neurôniossubmucosos que expressam
peptídeo intestinal vasoativo(VIP)
Protocolo:
Técnica imunohistoquímica para preparados totais para detectar a presença do peptídeo intestinal vasoativo (VIP) no plexo submucoso.
Anticorpo secundário ligado a fluoresceína.
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Microscópio confocal
Legenda:
Preparado total do plexo mioentérico docolon de rato.
GFAP - glial fibrilary acidic protein, ummarcador de corpos gliais intraganglionico.
O principal objetivo do trabalho foisumarizar o conhecimento atual sobrea biologia da célula glial entérica e ospapéis que estas possam exercer emestados de saúde e de doençaintestinais.
Protocolo:
O tecido foi marcado com anticorpo policlonal contra GFPA, o qual foi visualizado com Cy2 acoplado ao anticorposecundário.
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Microscópio confocal
Legenda:
Duas marcações imunofluorescentes: GR (verde) eGABA (vermelho) mostram a distribuição de célulasmarcadas dentro da amígdala. Subdivisões
amígdala: B basal; C central; LAd lateral (divisãodorsal); Lvl (lateral-ventral) e Lvm (medial-ventral).
Receptor glicocorticoide (GR) tem um papelsignificativo na modulação da plasticidade
sináptica, na estrutura dendrítica e nossistemas transmissores no núcleo lateral (LA)na amígdala. Para começar a verificar como oGR pode mediar estes efeitos, o presentetrabalho examina a localização celular esubcelular do GR no LA. New York
Protocolo:
Duas imunomarcações foram utilizadas: GRexpresso em neurônios e neurônios GABA-érgicos no LA, usando anticorpo monoclonal
contra GABA e rabbit anti-GR57.
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Microscópio confocal
Trabalhando com as imagens no microscópio confocal
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