técnicas de imunologia prof.doutor josé cabeda técnicas de imunologia citometria de fluxo:...
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Técnicas de Imunologia
Citometria de Fluxo:Citometria de Fluxo:
AplicaçõesAplicações
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Identificação Celular por Dispersão FS e SS
GranulócitosGranulócitos
LinfócitosLinfócitos
MonócitosMonócitos
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Imunofenotipagem
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IOTest 3 Combinations List 2424 Relevant Tubes Relevant Tubes
2 2 ControlsControls
One tube is for intra-cellular testingOne tube is for intra-cellular testing
Kappa & Lambda polyclonals from DakoKappa & Lambda polyclonals from Dako
FITC- and PE-conjugations performed at IOTFITC- and PE-conjugations performed at IOT
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IOTest 3 Combinations List + Target DiseasesPN FITC PE ECD TARGET DISEASE
IM3464 cMPO cCD79a cCD3 ACUTE CLASSIFICATION
IM3465 Kappa Lambda CD19 B-CLL,
IM3466 CD5 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES
IM3467 CD20 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES
IM3468 FMC7 CD23 CD19 B-CLL, MANTLE CELL
IM3469 CD5 CD23 CD19 T vs. B CLL, Mantle Cell
IM3470 CD25 CD11c CD19 HCL
IM3471 CD103 CD11c CD19 HCL
IM3472 CD19 CD10 CD45 B-ALL
IM3473 CD38 CD56 CD45 MM, Plasma Cells
IM3474 CD14 CD16 CD45MYELOID CLASSIFICATION INCLUDING IMMATURE GRANULOCYTES
(CD16dim)
IM3475 CD71 CD33 CD45 MYELOID, ERYTHROID, DIFF
IM3476 CD34 CD33 CD45 AML
IM3477 CD34 CD117 CD45 IMMATURE MYELOID
IM3478 HLA-DR CD34 CD45 AML vs ALL
IM3479 HLA-DR CD13 CD45 AML
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PN FITC PE ECD TARGET DISEASE
IM3480 CD15 CD33 CD45 AML, APL, CML
IM3481 CD14 CD13 CD45 AMML
IM3482 CD41 Glyco A CD45ACUTE MEGALO, DIFF, M7,
MYELODISPLASIA
IM3483 HLA-DR CD7 CD45 T-ALL
IM3484 CD5 CD7 CD3 T-CLL
IM3485 CD8 CD4 CD3 T-CLL
IM3486 CD25 CD4 CD3 HTLV, SEZARY SYNDROME
IM3487 CD16 CD56 CD3 LGLL
IM3488 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. Neg. Ctrl.
IM3489 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. CD45
IOTest 3 Combinations List + Target Diseases
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Quantificação antigénica
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Quantificação de antigénios emQuantificação de antigénios emCitometria de FluxoCitometria de Fluxo
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BioCytex MARQUIS TECHNIQUE
Beads contain calibrated amounts of anti-Beads contain calibrated amounts of anti-mouse IgG molecules.mouse IgG molecules.
Size mimics size of target molecule/receptor.Size mimics size of target molecule/receptor. Amount of molecules on beads reflects Amount of molecules on beads reflects
expression level of target molecule/receptor.expression level of target molecule/receptor.
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CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit-Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure
Calibration BeadsCalibration Beads
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CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure
Negative ControlNegative Control
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CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure
CD38 Positive SampleCD38 Positive Sample
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CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit
-Data Analysis Procedure-Data Analysis Procedure
100
1.000
10.000
100.000
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
MFI
MA
b m
ole
cu
les
1.8 80.0
610
29,777
Fig. 7
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Pesquisa de populações raras
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Time (Seconds)0 36 72 108 144 180
RAT
IO [s
hort
/long
]0
200
400
600
800
1000
StimulationStimulation
Calcium Flux - Indo-1
Estudos Cinéticos
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Análise de Ciclo Celular
GG22
MM
GG00
GG11
SS
Count
0 200 400 600 800 1000
GG00 /G/G11
SSGG22 /M/M
DNA content
2N2N 4N4N
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Apoptose
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Separação Celular Separação Celular
Formação de gotículasFormação de gotículas
Tempo Tempo
Coincidência - Pureza Coincidência - Pureza
e Eficiênciae Eficiência
488 nm laser Sensor FsSensor Fs
Detectores de Detectores de FluorescênciasFluorescências
+Placas CarregadasPlacas Carregadas
Tubos para Recolha do Produto Tubos para Recolha do Produto SeparadoSeparado
-
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QC Workflow
Alignment Check
Basic Elements of Daily QC
Fluorescent Standard
Color Compensation
Process/ Method Control
Run Patient
Obtain Results
Generate Report
Patient Analysis
TroubleshootMaintenance
FAIL
PASS
Call Service
Fix Problem
Test Reimbursement
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AUTOMATIZAÇÃO
TQ-Prep™ PrepPlusQ-Prep™
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TQ-Prep / ImmunoPrep Reagent
Sistema automático de lisis de Sistema automático de lisis de eritrocitoseritrocitos
No requiere lavadoNo requiere lavado Preserva la morfologíaPreserva la morfología Utiliza carruseles compatibles Utiliza carruseles compatibles
con XL-MCL, FC500, PrepPlus con XL-MCL, FC500, PrepPlus y CellPrepy CellPrep
TQ-PREP
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PrepPlus – TQ-Prep Sistema automático de Sistema automático de
carga de muestra y carga de muestra y reactivos para citometría reactivos para citometría de flujode flujo
Utiliza tubos primarios Utiliza tubos primarios de cualquier marcade cualquier marca
Rack de hasta 24 tubos Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación primarios con agitación para homogeneizar la para homogeneizar la muestramuestra
Controlado por el TQ-Controlado por el TQ-PrepPrep
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PrepPlus – TQ-Prep Posibilidad de carga desde Posibilidad de carga desde
tubo abiertotubo abierto 3 soportes diferentes para 3 soportes diferentes para
reactivosreactivos Puede cargar anticuepos Puede cargar anticuepos
monoclonales, FlowCount y monoclonales, FlowCount y reactivos de control de calidadreactivos de control de calidad
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CellPrep
Sistema de lavado celular por Sistema de lavado celular por fibra huecafibra hueca
Sustituye a la centrifugaciónSustituye a la centrifugación Mantiene la viabilidad celularMantiene la viabilidad celular Mantiene la morfología y Mantiene la morfología y
preserva células lábilespreserva células lábiles No activa ni destruye plaquetasNo activa ni destruye plaquetas Utiliza sangre entera, sangre Utiliza sangre entera, sangre
lisada y cualquier suspensión lisada y cualquier suspensión celularcelular
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CellPrep
Fibras huecas con poros de Fibras huecas con poros de 0.650.65 µmµm, que permiten la salida , que permiten la salida de moléculas y líquido de la de moléculas y líquido de la suspensión originalsuspensión original
Permite la concentración final Permite la concentración final de la muestrade la muestra
Diferentes programas Diferentes programas pregrabados, así como pregrabados, así como posibilidad de crear programas posibilidad de crear programas propiospropios
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Citometria de Imagem:Citometria de Imagem:Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia
PatológicaPatológica
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Tipos de amostras possiveis de analisar Tipos de amostras possiveis de analisar por Citometria de Imagem:por Citometria de Imagem:
EtanolEtanol Glutaraldeido
Glutaraldeido
Tecido fixadoTecido fixadoTecido a “fresco”Tecido a “fresco”
Tecido “criopreservado
”
Tecido “criopreservado
”
Tecido sólidoTecido sólido Tecido líquidoTecido líquido
Sem preservação
Sem preservação
Com preservaçãoCom preservação
Tecido a “fresco” congelado
Tecido a “fresco” congelado
Paraformaldeido
Paraformaldeido
FormaldeidoFormaldeido
e incluído em parafinae incluído em parafina
AmostraAmostra
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Parâmetros possíveis de analisar Parâmetros possíveis de analisar por Citometria de Imagem:por Citometria de Imagem:
• Total de partículas• Forma• Tamanho• Área• Diâmetro• Perímetro• “Perfeição”• Irregularidade
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Requisitos Básicos num Requisitos Básicos num Citómetro de Imagem:Citómetro de Imagem:
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Captação dos Parâmetros de Captação dos Parâmetros de Análise:Análise:
0
20
40
60
80
100
Tamanho
DOI
0
20
40
60
80
100
Tamanho
DOI
0
20
40
60
80
100
Tamanho
DOI
NúcleoMarcado
Branco
Preto
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Citometria de Citometria de Imagem:Imagem:
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Protocolo para Protocolo para Citometria de Imagem:Citometria de Imagem:
Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, processado e incluído em parafina.processado e incluído em parafina.
Corte a 8Corte a 8m, extensão em lâminas de gelatinam, extensão em lâminas de gelatina Desparafinar Desparafinar Pós fixar com fixador de BohmPós fixar com fixador de Bohm Hidratar Hidratar Efectuar uma Hidrólise ÁcidaEfectuar uma Hidrólise Ácida Marcar as células com reagente de ShiffMarcar as células com reagente de Shiff Lavar com SO2Lavar com SO2 Desidratar Desidratar MontarMontar Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de
ImagemImagem
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MetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - concept
• microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps
• objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded
• microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps
• objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded
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MetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - concept
• on screen review of on screen review of analyzed cellsanalyzed cells
• false positives can be false positives can be rejectedrejected
• cells suitable for analysis cells suitable for analysis are preselected with a are preselected with a mouse clickmouse click
• preselected objects can preselected objects can be automatically be automatically relocated atrelocated at100x to capture high100x to capture highresolution images for resolution images for analysisanalysis
• on screen review of on screen review of analyzed cellsanalyzed cells
• false positives can be false positives can be rejectedrejected
• cells suitable for analysis cells suitable for analysis are preselected with a are preselected with a mouse clickmouse click
• preselected objects can preselected objects can be automatically be automatically relocated atrelocated at100x to capture high100x to capture highresolution images for resolution images for analysisanalysis
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MetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - concept
• histogram or scatter histogram or scatter plot display of plot display of measured featuresmeasured features
• gating for selection of gating for selection of subpopulationssubpopulations
• relocation of cells relocation of cells detected in a previous detected in a previous scan after re-stainingscan after re-staining
• histogram or scatter histogram or scatter plot display of plot display of measured featuresmeasured features
• gating for selection of gating for selection of subpopulationssubpopulations
• relocation of cells relocation of cells detected in a previous detected in a previous scan after re-stainingscan after re-staining
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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MetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - concept
Motorized microscope (z)Motorized microscope (z)
MotorizedMotorizedstage (x,y)stage (x,y)
CCD CameraCCD Camera
MetaCyte
PC Win 9x/NTPC Win 9x/NT
image analysisimage analysismicroscope controlmicroscope control