taq dna polimerase (recombinante) · taq dna polimerase (recombinante) tampão de reação sem mgcl...
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Taq DNA Polimerase
(recombinante)
Cat. No. 0300.0004.0100 100 unidades
Cat. No. 0300.0004.0500 500 unidades
Tampão de Reação sem MgCL2
incluindo 5X GC-rich Solution (para amplificação
de regiões de DNA ricas em bases GC)
ARMAZENAR A - 20oC.
Produto estável por 10 dias a 37oC.
Transportar a temperatura ambiente.
Descrição
Taq DNA Polimerase é uma enzima termoestável isolada
da bactéria termofílica Thermus aquaticus e expressa em
bactérias Escherichia coli. Esta enzima recombinante é
constituída por uma cadeia polipeptídica com o peso
molecular de aproximadamente 94 kDa apresentando as
atividades de 5’→3’ DNA polimerase e 5´→3´ exonuclease.
Não possui atividade 3'→5' exonuclease (proofreading).
A forma recombinante da enzima Taq DNA Polimerase é
ideal para uso em reações de PCR para amplificação de
fragmentos de DNA até 5 kb.
Produto composto por um frasco com solução líquida
contendo 500 unidades (5.000 U/mL correspondente a
5 U/µL) da enzima recombinante Taq DNA polimerase,
dois frascos com 10X Tampão de Reação sem MgCl2 e um
frasco contendo 50 mM MgCl2. Prazo de validade de,
no mínimo, 12 meses após a entrega. Cada produto
contém número de lote, data de fabricação, validade,
composição e procedência.
Componentes do Produto
Cat. No. 0300.0004.0100 100 unidades
AMOSTRA
500 µL 10X Tampão de Reação de PCR
TAMPA AZUL
500 µL 50 mM MgCl2 TAMPA
TRANSPARENTE
200 µL 5X GC-rich Solution TAMPA
AMARELA
20 µL Taq DNA
Polimerase 5U/µL TAMPA
VERMELHA
Cat. No. 0300.0004.0500 500 unidades
2 x 1,25 mL 10X Tampão de Reação de PCR
TAMPA AZUL
1000 µL 50 mM MgCl2 TAMPA
TRANSPARENTE
1000 µL 5X GC-rich Solution TAMPA
AMARELA
100 µL Taq DNA
Polimerase 5U/µL TAMPA
VERMELHA
Composição do 10X Tampão de Reação de PCR:
100 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C), 500 mM KCl, 0.8% (v/v)
Nonidet P40
Instruções para Uso
1. Descongelar e misturar vigorosamente os reagentes
10X Tampão de Reação de PCR, 50 mM MgCl2 e 5X GC-rich
Solution (opcional).
2. Para realizar várias reações de PCR e minimizar a
possibilidade de erros de pipetagem, preparar uma
mistura de amplificação (Mastermix) adicionando Água
para Biologia Molecular, 10X Tampão de Reação, MgCl2,
dNTPs, primers e Taq DNA Polimerase.
Devido à perda de volume durante a pipetagem da
Mastermix, calcular o número de reações adicionando
uma reação extra para cada 10 reações de PCR.
Por exemplo: para 20 reações de PCR, adicionar 2 reações
extras.
Após a preparação, distribuir a Mastermix nos microtubos
individuais de PCR e a seguir, adicionar o DNA alvo ou
controle negativo.
A tabela a seguir apresenta as quantidades para uma
reação de PCR padrão de volume final de 50 µL.
As quantidades de Água para Biologia Molecular e DNA
Alvo ou controle negativo podem ser ajustadas para
completarem o volume final de 50 µL da reação de PCR:
Taq DNA Polimerase
(recombinante)
Tampão de Reação sem MgCL2
Componente da Reação de PCR
Volume Concentração
Final
Água para Biologia Molecular
até 50 µL
5X GC-rich Solution (opcional)*
12 µL 1,2X
10X Tampão de Reação de PCR
5 µL 1X
50 mM MgCl2** 1,5 µL 1,5 mM
10 mM dNTP Mix 1 µL 0,2 mM
10 µM Primer Forward 2,5 µL 0,5 µM
10 µM Primer Reverse 2,5 µL 0,5 µM
Taq DNA Polimerase 5U/µL***
0,25 µL 1,25 U
DNA alvo ou controle negativo
variável 10 pg a 500 ng
*5X GC-rich Solution é uma solução contendo 5M de
betaine. A betaine é um dos mais efetivos aditivos para a
reação de PCR indicados para regiões de DNA ricas em
bases GC que apresentam um alto grau de estruturas
secundárias.
A betaine também aumenta a processividade da Taq DNA
Polimerase reduzindo pausas na polimerização causadas
pela presença de estruturas secundárias que podem
induzir a dissociação da polimerase do alvo de DNA.
O uso de betaine em reações de PCR pode ser facilmente
avaliado da seguinte forma:
1a Reação de PCR: adicionar 12 µL de Água
2a Reação de PCR: adicionar 12 µL de 5X GC-rich Solution
Adicionar os demais componentes da reação de PCR e
completar o volume para 50 µL.
** A concentração final de 1,5 mM de MgCl2 funciona para
a maioria dos alvos de DNA. Porém, caso seja necessário
padronizar a reação de PCR, adicionar um volume da
solução 50 mM MgCl2 para concentrações finais de MgCl2
variando entre 1 mM e 4 mM.
Para a amplificação de regiões de DNA ricas em bases GC,
recomendamos o uso de 1,2X GC-rich Solution e 4 mM
MgCl2.
*** Para alvos longos (fragmentos de DNA > 3 kb), utilizar
2,5 U de Taq DNA Polimerase.
3. Realizar a reação de PCR conforme as seguintes
condições de ciclagem térmica:
Temp Tempo Ciclos
Denaturação Inicial
95oC 3 minutos
Desnaturação 95oC 30 segundos
25 a 40 ciclos
Pareamento 55oC* 30 segundos
Extensão 72oC 1 min/kb
Extensão Final 72oC 10 minutos
* Depende do Tm dos primers. Geralmente, Tm - 5 oC.
4. Analisar 10 µL da reação de PCR em eletroforese em gel
de agarose.
Neste caso, utilizar a reação de PCR imediatamente em
aplicações de Biologia Molecular ou armazenar a - 20oC.
Controle de Qualidade (Certificado de Análise)
Cada lote da enzima Taq DNA Polimerase é
extensivamente purificado para garantir um grau de
pureza próximo de 100% analisado pela técnica de
eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
A análise funcional da enzima é realizada em reações de
PCR (95oC por 3 minutos, 35 ciclos de 95oC por
30 segundos, 55oC por 15 segundos e 72oC por 60
segundos) para a amplificação de um fragmento de 2 kb
do gene de beta-globina humano partir de 50 ng de DNA
genômico humano utilizando os seguintes primers:
2kb_Forward (5’ TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC 3’)
2kb_ Reverse (5’ TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A 3’)
Nota: Os primers para a Reação de PCR podem ser
desenhados utilizando o software Primer-BLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Taq DNA Polimerase (Tampão de Reação sem MgCL2)
Rev.2
Produto para uso em pesquisas científicas
Fabricado no Brasil por:
DNA Express Biotecnologia LTDA
CNPJ 12.958.000/0001-88
Rua João Batista Nogueira 500 Módulo 29
Vila Nova Cumbica, Guarulhos, SP
SAC (11) 2303 7133 / 2303 743
[email protected] www.dnabrasil.ind.br