Prof. Dr. José Luis da C. SilvaProf. Dr. José Luis da C. Silva

PCR MARCADORES MOLECULARES

Histórico da PCRHistórico da PCR

Kornberg (1960) – Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento desta enzima possibilitou o desenvolvimento da síntese “in vitro” de cadeias de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a síntese de oligonucleotídeos tornaram-se rotina nos laboratórios de pesquisa;

Karl Mullis (1983) – Técnica de PCR – polymerase chain reaction – possibilita a amplificação “in vitro” de ácidos nucléicos. O advento da PCR acelerou os estudos de genomas de vários organismos, pois possibilitou a clonagem e o sequenciamento de DNA.

Karl Mullis (1987) – Patenteou a técnica e vendeu para a empresa Hoffmann-La Roche em 1991.

Kary Mullis – 1983 (Prêmio Nobel 1993)

Princípios da técnica de PCRPrincípios da técnica de PCR

Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a partir da seqüência alvo;partir da seqüência alvo;

A especificidade é dada pelo uso de primers A especificidade é dada pelo uso de primers (iniciadores) específicos para o gene ou região (iniciadores) específicos para o gene ou região do DNA de interesse;do DNA de interesse;

A utilização de dois primers delimitam o alvo e a A utilização de dois primers delimitam o alvo e a repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões de cópias do alvo.de cópias do alvo.

Amplificação de seqüências pela Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a

Taq polimerase, da bactéria Thermus

aquaticus é usada para catalisar o crescimento

a partir de primers de DNA. Pares de primers

em filamentos opostos são ampliados um em

cada direção ao outro. Após o término da

replicação do segmento entre dois primer (um

ciclo), dois novos dúplices são desnaturados

por aquecimento para gerar moldes

unifilamentares.

Etapas da PCREtapas da PCR

1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94° 1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94° C/100° C)C/100° C)

2) Anelamento (hibridização) dos primers em T° C mais 2) Anelamento (hibridização) dos primers em T° C mais baixabaixa

3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar 3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar pela Taq DNA polimerasepela Taq DNA polimerase

Repetição por 30 a 40 ciclos – animação Repetição por 30 a 40 ciclos – animação

Reação de PCR em Termociclador

Eletroforese em gel de agarose visualização dos amplicons (fragmentos amplificados)

Variações da PCRVariações da PCR

RT-PCRRT-PCR Nested-PCRNested-PCR PCR MultiplexPCR Multiplex RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Real time PCR ( PCR em tempo real)Real time PCR ( PCR em tempo real)

RT – PCR“Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction”

RT – PCR

RT – PCR

“Cycle threshold”Limiar da faseexponencial

Fluoróforos: absorvem e emitem luz em λ específico

Taq-Man (Fluoróforo + Quencher)

Taq-Man

“Molecular Beacon” : primers em estrutura secundáriaDiferentes cores

Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular

oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um

segmento específico de DNA (expresso ou não).segmento específico de DNA (expresso ou não).

Marcadores genéticos são unidades herdáveisMarcadores genéticos são unidades herdáveis

Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança

de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma

população segregante), ele pode adicionalmente ser definido população segregante), ele pode adicionalmente ser definido

como um marcador genético.como um marcador genético.

Marcadores molecularesMarcadores moleculares

A molécula de DNA sofre alterações (mutações). As mutações A molécula de DNA sofre alterações (mutações). As mutações são mais toleradas quando acontecem em regiões não-são mais toleradas quando acontecem em regiões não-codificantes, e as mutações tornam-se estáveis, sendo codificantes, e as mutações tornam-se estáveis, sendo transmitidas aos seus descentes.transmitidas aos seus descentes.

Como é muito grande a variação no número e no tipo de mutações Como é muito grande a variação no número e no tipo de mutações estáveis do DNA – fenômeno conhecido como polimorfismo estáveis do DNA – fenômeno conhecido como polimorfismo genético – é possível identificar uma pessoa com base no seu genético – é possível identificar uma pessoa com base no seu padrão de polimorfismo.padrão de polimorfismo.

Para reconhecer os locos (sítios) onde ocorrem essas mutações, Para reconhecer os locos (sítios) onde ocorrem essas mutações, há diferentes técnicashá diferentes técnicas..

marcadorescromossoma

1. Mutações pontuais - SNPsA. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA

TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI

B. ATCTCGTGATTATAGTCGTATAGAGCACTAATATCAGCAT

2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDelsA. ATCTCGTCTAGTCGTA

TAGAGCAGATCAGCAT

B. ATCTCGT---GTCGTATAGAGCA---CAGCAT

Origem do Polimorfismo MolecularOrigem do Polimorfismo Molecular

Classificação de Marcadores Classificação de Marcadores MolecularesMoleculares

Marcadores de DNA (moleculares)Marcadores de DNA (moleculares)

Vantagens:- Não é objeto de influências ambientais;- Potencialmente ilimitado em número;

Desvantagem:Maior desvantagem é a necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos.

Marcadores moleculares• Hibridação– RFLP – (Restriction Fragment Length Polymorphism)– Minissatélites – VNTR –(Variable Number of Tandem Repeats)

• Amplificação de DNA (Técnica de PCR)

– RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA)– SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)– Microssatélites –SSR (Simple Sequence Repeats)– AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)Single Nucleotide Polymorphism)

RFLPRFLP - Restriction Fragment Length - Restriction Fragment Length PolymorphismPolymorphism

RFLP examina diferença em tamanho de RFLP examina diferença em tamanho de fragmentos de restrição de DNA fragmentos de restrição de DNA específicosespecíficos

Polimorfismo deriva de mutação pontual, Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção, deleção inserção, deleção

Utiliza-se DNA celular totalUtiliza-se DNA celular total Requer DNA puro de alto peso molecularRequer DNA puro de alto peso molecular

• Polimorfismo evidenciado pela fragmentação do DNA com Polimorfismo evidenciado pela fragmentação do DNA com

enzimas de restrição e observado pela hibridização de sondas enzimas de restrição e observado pela hibridização de sondas

marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou

compostos que desencadeiam uma reação luminescência.compostos que desencadeiam uma reação luminescência.

• Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as

seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais

indivíduos comparados sejam distintas.indivíduos comparados sejam distintas.

Metodologia de RFLPMetodologia de RFLP1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos2. Separação dos fragmentos por gel 2. Separação dos fragmentos por gel

eletroforeseeletroforese3. Transferência de fragmentos de DNA para 3. Transferência de fragmentos de DNA para

filtrofiltro

Metodologia de RFLPMetodologia de RFLP

4. Visualização dos fragmentos de DNA4. Visualização dos fragmentos de DNA sondas marcadas (sondas marcadas (3232P) ou a frioP) ou a frio

5. Análise dos resultados5. Análise dos resultados bandas analisadas para alelos e/ou bandas analisadas para alelos e/ou

presença/ausênciapresença/ausência diferenças em padrão de bandas reflete diferenças em padrão de bandas reflete

diferenças genéticasdiferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição A escolha de sonda/enzima de restrição é crucialé crucial

digestão

1

1

52

34

2

543

DNA

Digestão de DNA Genômico e Digestão de DNA Genômico e Separação em GelSeparação em Gel

Separaçãoem gel

Eletroforese

Transferência para Membrana de Transferência para Membrana de Nylon ou NitroceluloseNylon ou Nitrocelulose

1

2

3

4

5

MARCAÇÃO DA SONDA (EX.: MATERIAL RADIOATIVO – [32P] γATP,[32P] αdNTP)

Hibridização com sondas radioativas Hibridização com sondas radioativas em Nylon ou Nitroceluloseem Nylon ou Nitrocelulose

Hibridização com sonda marcada Exposição em filme de Raios-X

Aplicação dos RFLPs na medicina forenseAplicação dos RFLPs na medicina forense

Interpretação de resultados

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6

Sítio alvo para sonda

Sítio de restrição

Inserção

Marcador RFLP na anemia falciforme

13

8

2

56

Análise de Diversidade e Filogenia Análise de Diversidade e Filogenia por RFLPpor RFLP

13 5 6 2 8

119

A B C

4

A B C

Kb

Utiliza um único primer ao invés de um par de primers.Utiliza um único primer ao invés de um par de primers.

O primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua seqüência O primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua seqüência

alvo é desconhecida.alvo é desconhecida.

Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato

deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância

do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e

fenótipo de um indivíduo. fenótipo de um indivíduo.

Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam

comportamento "dominante", existe a possibilidade de se comportamento "dominante", existe a possibilidade de se

amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos

os alelos de um loco. os alelos de um loco.

RAPD - Random Polymorphic DNARAPD - Random Polymorphic DNA Amplificação Randômica de DNA Polimórfico Amplificação Randômica de DNA Polimórfico

Obtenção de "fingerprinters' (impressões digitais) Obtenção de "fingerprinters' (impressões digitais)

genômicos de indivíduos, variedades e populações.genômicos de indivíduos, variedades e populações.

Análise estrutural e diversidade genética em populações Análise estrutural e diversidade genética em populações

de melhoramento e bancos de germoplasma.de melhoramento e bancos de germoplasma.

Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre

diferentes espécies.diferentes espécies.

Construção de mapas genéticos de alta cobertura Construção de mapas genéticos de alta cobertura

genômica e a localização de genes de interesse genômica e a localização de genes de interesse

econômico.econômico.

Características do RAPD:Características do RAPD:

Base genética dos marcadores RAPDBase genética dos marcadores RAPD

RAPD inter-específico de RAPD inter-específico de EimeriaEimeria

600 pb -

J-20J-20

- esc

ada

100

pb

- E. a

cerv

ulin

a- E

. ten

ella

- E

. max

ima

- E. p

raec

ox- E

. miti

s- E

. bru

netti

- E. n

ecat

rix

- Con

rrol

e

VNTR - Variable Number of Tandem RepeatsVNTR - Variable Number of Tandem RepeatsNúmero variável de repetições seriadasNúmero variável de repetições seriadas

Características do VNTR:Características do VNTR:

• Seqüências repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do Seqüências repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do

genoma.genoma.

• São constituídas por blocos cujo número de unidades São constituídas por blocos cujo número de unidades

repetitivas é variável, gerando polimorfismos. repetitivas é variável, gerando polimorfismos.

• Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locuslocus

hipervariável são conhecidas como hipervariável são conhecidas como microssatélitesmicrossatélites. Unidades . Unidades

de 5 a cerca de 100 pb são denominadas de 5 a cerca de 100 pb são denominadas minissatélitesminissatélites..

• São observados através de digestões do DNA genômico São observados através de digestões do DNA genômico

seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homólogas às seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homólogas às

regiões do minissatélite.regiões do minissatélite.

• Obtém-se um padrão de múltiplas bandas devido ao caráter Obtém-se um padrão de múltiplas bandas devido ao caráter

multilocus.multilocus.

• Os padrões de múltiplas bandas constituem os chamados “DNA Os padrões de múltiplas bandas constituem os chamados “DNA

fingerprints” e permitem discriminar indivíduos e estabelecer fingerprints” e permitem discriminar indivíduos e estabelecer

graus de parentesco e consangüinidade.graus de parentesco e consangüinidade.

Características do VNTR:Características do VNTR:

Características do VNTR:Características do VNTR:

• São obtidos através de PCR de São obtidos através de PCR de lociloci específicos. específicos.

• Cada "ilha" microssatélite, independente do elemento repetido Cada "ilha" microssatélite, independente do elemento repetido

(CA, TG, ATG etc.) constitui um loco genético altamente variável, (CA, TG, ATG etc.) constitui um loco genético altamente variável,

multialélico, de grande conteúdo informativo.multialélico, de grande conteúdo informativo.

• A análise de vários A análise de vários loci loci permite estabelecer relações de permite estabelecer relações de

paternidade e identificação personalizada, através dos alelos paternidade e identificação personalizada, através dos alelos

encontrados nos indivíduos.encontrados nos indivíduos.

• Não requerem Southern blots. A análise consiste no PCR de Não requerem Southern blots. A análise consiste no PCR de

vários vários lociloci, eletroforese em gel e interpretação., eletroforese em gel e interpretação.

Vantagens e limitações dos marcadores microssatélites

• A expressão co-dominante e o multialeslismo, os marcadores

SSR (seqüências simples repetidas = microssatélites) são os que

possuem o mais elevado conteúdo de informações de

polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares.

• Os SSR são muito mais freqüentes e distribuídos ao acaso,

permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma

eucarioto.

• A maior limitação da tecnologia microssatélite é a grande

quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento

prévio dos marcadores.

ModelosModelos

Eletroforese em gelEletroforese em gel

Análise de casos molecularesAnálise de casos moleculares

SemináriosSeminários