introdução ao pcr reação da polimerase em cadeia outubro de 1985 (idéia em 1983) american...
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Introdução ao PCR
• Reação da Polimerase em Cadeia
• Outubro de 1985 (idéia em 1983)• American Society of Human Genetics• criado por Kary B. Mullis
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/
Características do PCR
• Amplificação de Seqüências
• Processo Cíclico– 15 a 40 ciclos– realizado por mudança de
temperatura
Produção de DNA por PCR
• Produção de 2 a 4 g DNA em 1-3 hs• específico = amplifica sequência-alvo
na presença de DNA genômico• sensível = detecta até apenas 1
sequência de molde• flexível = muitas variações da técnica
básica de PCR
Requerimentos Básicos do PCR
1. Molde - DNA ou RNA2. DNA polimerase3. dNTPs4. Iniciadores de
Oligonucleotídeos (Primers)
Função dos Iniciadores Primers
• fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de DNA
• definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado
• estabelecer especificidade
Função dos Primers
Oligos IniciadoresPrimers
• sintetizados quimicamente• tipicamente entre 15 a 25 bases • define limites de alvo a amplificar
– prévio conhecimento da sequência alvo
– tradução reversa de uma sequência de PTN
– primer de seqüências aleatórias
Ciclos de Temperatura no PCR
Anelamentodo Primer Tm
Desnaturação Extensão
94oC do Primer
72oC
Desnaturação do DNA94 a 100oC
• desnaturar DNA alvo• desnaturar produtos de ciclos
prévios• 4 a 10 min de desnaturação inicial• duração de 30 s a 1 min
Anelamento do Primer40 a 70oC
• temperatura de “hibridização”• otimização da temperatura para
cada par de primer– composição = %G+C
Tm = 81.5 + 16.6(log10([M Na+])) + 0.41*(%GC) - 600/length
– determina especificidade do produto amplificado
• tipicamente 30 s a 2 min
Anelamento do Primer%G+C• Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) -
600/comprimento– [Na] em concentração Molar {PCR usa-se KCl}– %GC em percentual– comprimento em bases
• Primer3 - 600/length• GCG - 674/length
– formamida: subtrair 65*(% formamida)
• Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR)Tm = 59,9 + 0.41*(%GC) - 675/comprimento
http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html
Extensão do Primer72oC
• Taq polimerase– faixa de atividade: 20oC a 85oC– atividade varia 100x nessa faixa
• Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado
Exponencialidade do PCR
Caso ideal:
N = No 2n
• N = número de moléculas amplificadas
• No = número inicial de moléculas
• n = número de ciclos de amplificação
Amplificação Geométrica
Ciclo Número Fita Duplas produzidas 1 0 5 8 10 256 15 8.192 20 262.144
25 8.388.608 30 268.435.456
35 8.589.934.58940 274.877.906.800
PCR
Cinética do PCR
• Fase inicial (screening)– Primers procuram o DNA molde com
sequências complementares (como sondas)– Primers em considerável excesso.
• Fase exponencial– acúmulo exponencial do fragmento de DNA– várias cópias das sequências alvos
• Fase tardia ou plateau– amplificação já é sub-ótima
Efeito “Plateau”• Desvio do ideal teórico
– reassociação do produto compete com anelamento do primer
– polimerase torna-se limitante – perda de atividade
– acúmulo de inibidores da polimerase (pirofosfato)
– Limitação de outros componentes– Competição entre produtos– Pareamento produto x molde -
amplificação não específica
DNA molde
• número de cópiastipicamente 105 a 106 moléculas-alvo
Quantidade de DNA = equivalente a 3 x 105 cópiasFONTE Genoma Haplóide (pb) QuantidadeHumano 3 x 109 1 gLevedura 2 x 107 10 ngE.coli 4 x 106 1 ngplasmídeo 3 x 103 1 pg
DNA molde• Número de cópias• DNA genômico: 50 a 250 ng
– 1 g de DNA genômico humano = 3 X 105 moléculas de um gene único
• O mesmo número de moléculas está presente em:– 10 ng de DNA genômico de levedura– 1 ng de DNA genômico de E. coli– 1-2 pg de plasmídeo– 2 pg de bacteriofago
Taq DNA Polimerase
• Proteína de 94 kDa• Temperatura ótima: 75 a 80oC• Termoestabilidade limitada• Ausência de função de edição
sem exonuclease 3’ para 5’
Concentração de enzima = 1 a 2,5 U / 100 L
Efeito da Temperatura na Taxa de Síntese de DNA
Temperatura Taxa de Síntese(nucleotídeos /seg)
22oC 0,2537oC 1,555oC 2470oC > 6075oC > 150
Estabilidade da Taq sob Altas Temperaturas
Temperatura T 1/2 (minuto)
92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5
Frequência de Erro de DNA Polimerases Termoestáveis
Enzima Taxa de Mutaçãopor 10-6 inserções de
base
Taq 300Vent (NEB) 57
Fatores Promotoresda Fidelidade da Taq e
Especificidade dos Primers
• baixar a concentração de dNTPs (menos 200 M)
• concentração de Mg++ - inversa/
[Magnésio]
• Concentração de Mg2+ afeta:– anelamento dos primers– temperatura de desnaturação do DNA
molde e dos produtos amplificados• Especifidade da reação • Formação de dímeros de primers• Atividade e fidelidade da enzima
• Usualmente – inicia com 1,5 mM
Considerações na Seleção de Primers
• Especificidade: primer deve formar duplex estável no sítio alvo específico
• Primer não forma duplex estável com si próprio ou com o outro primer
• Primer não possui sítios falsos no DNA alvo
Estabilidade dos Primers
• Comprimento - número de bases• Relação GC/AT
• Temperatura de desnaturação Tm
– análises do vizinho mais próximo– energia livre de formação de duplex
Tm x GC%
Critérios para desenho de primers
• Composição de bases: – GC% = 40 a 60%– distribuição homogênea ao longo
do primer• Comprimento:
– 18 a 25 bases do primer complementar ao molde
– Ambos primers = mesmo comprimento (até 3 bases)
Critérios para desenho de primers
•Seqüências repetidas ou auto-complementares: – Sem repetições invertidas no primer
ou seqüências auto-complementares com + 3 bases seguida
•Complementaridade entre par de primers:– 3’ de primer não pode ligar a qualquer
ponto do outro primer – Primers presentes em alta concentração e
formação de híbridos com amplificação de dímeros de primers
- Temperatura de fusão:O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC O Tm do produto amplificado não deve diferir dos valores de Tm dos “primers”em mais que 10oC.-
Temperatura de Separação de Duplexes de
DNA
Tm = 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%G + %C) - 0,65 (% formamida) - 675/comprimento - % erro de pareamento
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Especificidade dos Primers
• Teoricamente 15 bases estabelecem especificidade
1/4 15 = 1,1 x 10 -9
• Famílias de genes relacionados• Duplicações• assume toda sequência do primer
envolvida seleção de sítio-alvo
Problemas comuns no Desenho de Primers
• Auto-complementariedade• Complementariedade entre
primers• Establidade térmica excessiva
Auto Complementariedade
• Formação de alça
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT
HOTGACTTC Tm = 71oC
ACTGAA
Auto Complementariedade
• Formação de alça sem problema
GAACTACCTACGAAGATACTTCAGTOH
Tm = 24oC CTTC GAAG
Complementariedade entre Primers
• Formação de “primer dimer”
5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH
5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH
OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC
GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH
Excesso de Estabilidade Térmica em 3’OH
TTTACTTAGTCGGACGCGGC OH
CGCGGC OH
-------------GCGCCG--------------------Extremidade 3’ crucial = preferir 3’ como G ou C. Não recomendável que seja ...NNGG ou ...NNCC
-> gerar dímeros de primers
A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo = permite adicionar seqüências com
propósitos específicos na extremidade 5’
- sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais- promotores para transcrição in vitro- promotores de seqüências consenso para inicío de tradução para transcrição e tradução in vitro
Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo.
Primers com sítios para enzimas de restrição:
Estabilidade Interna
• Melhores primers possuem terminal5’ estável e terminal 3’ instável– reduz pareamento falso
• Baixa estabilidade 3’ previne a formação de DNA duplexes que podem iniciar a síntese de DNA– terminal 5’ deve parear para formar
duplex estável
Mal-pareamento pré-PCR
• Causas:– DNA fita simples complexo na
amostra molde– mistura de reação completa incubada
a temperatura com atividade da Taq
• Solução - “Hot Start”
Prevenção de Mis-priming
PCR ConvencionalMix de reação completo
20 a 25 oCTransferir para termociclador
Ciclos
Produto amplificado
PCR “Hot Start”Mix de reação completo
20 a 25 oCTransferir para termociclador
desnaturação 100 oCmanter a 80 oC
Adicionar Taq polimerase
Ciclos
Produto amplificado
Enzimas para “Hot-Start”
• AmpliTaq Gold– enzima recombinante– forma inativada - ativação 10 min
94oC
• Platinum Taq Polymerase– ligação com inibidor termolábil
contendo anticorpo monoclonal
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
http://genomics.biotech.ufl.edu/~wgf/primer/index.htm
Parâmetros dos ciclos:
1. Temperatura e Tempo de desnaturação
• Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR
• Tipicamente 94oC por 30 s
• Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima
Parâmetros dos ciclos:
2. Temperatura e Tempo de anelamento
• Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers
• Tempo de anelamento = 15 a 30 s
• Tempo de extensão função tamanho do AMPLICON– 1 minuto é suficiente 1,2 kb– Longo reduz a meia vida da enzima
A Tm do produto amplificado não deve exceder ~85oC.
Temperatura de desnaturação em PCR é definida como a temperatura na qual há separação irreversível das fitas de uma população homogênea de moléculas.
A temperatura de separação irreversível das fitas é vários graus acima do Tm
(tipicamente, 92oC para DNA com 50% de G+C).
DNA Polimerases
Sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer pela
incorporação de NTPs na direção 5’ -> 3’ tendo como orientação a
informação contida na fita molde (template).
DNA Polimerases• As DNA polimerases normalmente
têm também atividade exonuclease
• 3’ -> 5’ = atividade proof reading
• 5’ -> 3’ = atividade corretiva – necessidade de remoção de um
segmento de DNA que está a frente da enzima
DNA Polimerases Termoestáveis
• Thermos aquaticus (Taq polymerase)– 1ª descoberta e + usada– Síntese 5’-> 3’ / Exonuclease 5’-> 3’
• Thermus thermophilus (rthpol) = similar à subunidade da DNA pol-III de E. coli. – rTth pol atividade de transcriptase reversa na
presença de Mn2+
• DNA polimerases adicionam base a mais na 3’ – > adição > [Mg2+] e de [enzima].– A base a mais adicionada é quase sempre A
DNA Polimerases Termoestáveis
Thermos aquaticus (Taq polymerase)
• Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs
• A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção da polimerização.
• Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.
DNA Polimerases Termoestáveis
• Pyrococcus furiosus (Pfu) - com 2 subunidades codificadas por 2 genes de único operon– Forte atividade exonuclease 3’->5’
(atividade proof reading)
• Enzimas com atividade proof reading não adicionam A na extremidade 3’OH, independentemente do molde
DNA Polimerases Termoestáveis
Polimerases com função corretiva• Pyrococcus furiosus (Pfu)• Thermoccocus litoralis (Tli) Promega• Vent DNA polymerase = Tli
recombinante New England Biolabs– Atividade exonucleásica 3’-> 5’– Mais termoestáveis que a Taq – Meia vida de 6,7 h a 95oC)– Sintetizam fragmentos de até 13 kpb.
Variações de Taq polymerase
• AmpliTaq: Taq polimerase produzida em E. coli. Reprodutibilidade maior que enzima nativa [Applied Biosystems]
• AmpliTaq Gold: forma modificada da AmpliTaq fornecida em forma inativa. Requer aquecimento a 94-95 oC por 10 min para ser ativada
• Stoffel fragment: forma amputada da Taq sem 289 amino ácidos terminal N, sem atividade exonuclease 5’ --> 3’. Cerca de 2 vezes mais termoestável que a Taq [Applied Biosystems]
Variações de Taq polymerase
• Taq 2000 : Taq recombinate altamente purificada [Stratagene]
• AdvanTaq: sem amino ácidos N-terminais com maior termorresistência, melhor atividade em faixa ampla de [Mg] e maior afinidade pelo molde – uso concentração de DNA alvo muita baixa [Clontech]
• AGSGold DNA polymerase: maior capacidade de síntese de DNA (3 vezes mais produto que a Taq) [Hybaid]
PCR de longa distância• Mistura de enzimas = melhor que uma
única enzima para amplificar fragmentos longos– KlenTaq / Pfu (ex.: 160:1 a 640:1)– Taq / Pfu
Existem várias misturas disponíveis comercialmente• Elongase (Invitrogen)• Expand DNA Polymerase (Boehringer)• Advantage (Clontech)
Modelo de
funcionamento da
mistura de enzimas
Elongase (Invitrogen)
Taq/Pfu
