Termociclador

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Técnica que permite a amplificação

da quantidade de DNA específico

utilizando a enzima Taq DNA

polimerase, sequências iniciadoras

específicas (primers) e variações de

temperatura controladas.

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

Taq polimerasePrimers TampãoÁgua

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

Taq DNA polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

Taq DNA polimerase

Termoestabilidade limitada

Temperatura T 1/2 (minuto)

92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5

Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida

durante 45 minutos a 95°C.

• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que

cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de

incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.

• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U

(0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.

• É importante deixar claro que o excesso de enzima

também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo

inclusive inibi-la.

Taq DNA polimerase

• Os primers (forward e reverse) devem ser

construídos de acordo com a conveniência do

investigador, de modo que esses possuam

seqüências complementares a determinadas

regiões do DNA que limitam os segmentos a

serem amplificados.

Seqüências dos primers

Problemas comuns no Desenho de Primers

• Auto-complementariedade

• Complementariedade entre primers

Auto Complementariedade

• Formação de alça

GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC Tm = 71oC

ACTGAA

Complementariedade entre Primers

• Formação de “primer dimer”

5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’

5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH3’

3’OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC

GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’

• São as bases nitrogenadas que constituirão as

novas cadeias de DNA.

• Sua concentração numa reação pode variar de

20 a 200 uM sendo importante que as quatro

devam variar em concentrações equivalentes.

• Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou

todos) podem ocorrer erros de incorporação de

bases, gerando cópias alteradas

Desoxinucleotídios trifosfatados (dNTP)

• O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase.

• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a maioria das necessidades.

- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto

- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”.

Íon magnésio

Smear

PCR “Requerimentos”

• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM

• Tampão: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polimerase: 1-2.5 units

• DNA Alvo: 1 µg

Taq polimerasePrimers TampãoÁgua

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

Taq polimerasePrimers TampãoÁgua

94ºC

DENATURAÇÃO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas(Termociclador)

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

Taq polimerasePrimers TampãoÁgua

94ºC

DENATURAÇÃO

57ºC

ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR

1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas(Termociclador)

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

Taq polimerasePrimers TampãoÁgua

94ºC

DENATURAÇÃO

72ºC

EXTENSÃO

57ºC

ANELAMENTO

ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas(Termociclador)

25-40 (35) CICLOS

DNA

dATPdCTPdGTPdTTP

(nucleotideos)

http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

94ºC

DENATURAÇÃO

57ºC

ANELAMENTO

Primer forward Primer reverse

72ºC

EXTENSÃO

Taq

DNA polimerase

Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C e G, de modo que quanto maior for o número dessas bases, a temperatura de hibridização tende a aumentar.

• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios contendo 50 a 60% de G + C são adequados. • Para se calcular a TM (temperatura média de hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplica-se a seguinte formula:

4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM

Temperatura média (Tm) de Anelamento

Ponte de Hidrogênio

fosfatopentose

Citosina

Guanina

Timidina

Adenina

Ponte de Hidrogênio

fosfatopentose

Citosina

Guanina

Timidina

Adenina

• Esse fator depende do comprimento do

segmento a ser amplificado e da concentração do

DNA molde utilizado na reação.

• A temperatura ótima de extensão dos primers é

de 72°C (temperatura ótima de atividade da

polimerase) e o tempo de extensão de 1 minuto

é considerado suficiente para estender produtos de

aproximadamente 1.250 pb (em condições ideais).

Tempo de extensão dos primers

• As condições de desnaturação utilizadas normalmente são de 95°C por 5 minutos (desnaturação inicial) e por 30 segundos (desnaturação na ciclagem), sendo que temperaturas mais altas podem ser utilizadas quando se trabalha com seqüências moldes

ricas em G+C.

• Temperaturas muito altas e tempos longos de desnaturação levam a perda de atividade da

enzima

Tempo e temperatura de denaturação

Amplificação de DNA(exponencial)

Log [DNA]Log [DNA]

X ciclosX ciclos

GeométricaGeométrica

PlateauPlateauLinearLinear

Gel EtBrGel EtBr

y = 2y = 2XX

Amplificação de DNA(Platô)

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: 1.580.000.000

Análisedos dados

Reação:DNA

Enzima TaqPrimer

NucleotídeosTampão

Água

Análisedos dados

Termociclador

Reação:DNA

Enzima TaqPrimer

NucleotídeosTampão

Água

Análisedos dados

Termociclador

Reação:DNA

Enzima TaqPrimer

NucleotídeosTampão

Água

Reaçãode PCR

+Tampão Corado

(Loading Buffer)

Análisedos dados

Eletroforeseem gel de agarose

+Brometo de Etídeo

Termociclador

Reação:DNA

Enzima TaqPrimer

NucleotídeosTampão

Água

Reaçãode PCR

+Tampão Corado

(Loading Buffer)

Análisedos dados

Luz Ultravioleta

Fotodocumentação

Termociclador

Reação:DNA

Enzima TaqPrimer

NucleotídeosTampão

Água

Eletroforeseem gel de agarose

+Brometo de Etídeo

Reaçãode PCR

+Tampão Corado

(Loading Buffer)

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2%

REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO

COM LUZ ULTRAVIOLETA

Marcadorde paresde base

(pb)

300

200

100

400

500600600

14001400

13001300

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%

UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

Marcadorde paresde base

(pb)

300

200

100

400

500600600

14001400

13001300

400 400 400

600 600

100 100 100 100

FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%

UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb

TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE

DNA AMPLIFICADOS

- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm,

construindo cópias complementares de DNA (cDNA).

- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação

de carga viral.

- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa

frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).

Variações da técnica de PCR

• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como

a sua especificidade, nos permite amplificar uma

seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo

grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o

que torna o método viável não só para a pesquisa

básica mas também para a pesquisa aplicada.

Aplicações do PCR

Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes

utilidades/ aplicações:

1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela

geração de produtos amplificados que apresentam

alterações em seu tamanho.

2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de

bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos

genéticos podem ser determinadas pela ação das

enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.

Aplicações do PCR

3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional

(particularmente para doenças herdadas).

4. Na tipagem para transplantes de órgãos e

susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas

(detecção de polimorfismo para HLA).

5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem

genética, como o câncer, através do estudo dos genes

relacionados a essas doenças.

6. Na medicina forense (DNA fingerprint).

7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes

patogênicos diversos

Aplicações do PCR