pcr (reação em cadeia da polimerase) - sequenciamento
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PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA (PPGB). Prof a . Fabiana K. Seixas. PCR (Reação em cadeia da Polimerase) - SEQUENCIAMENTO. PCR Polymerase Chain Reaction. Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA * replicação in vitro. HISTÓRIA DA PCR. Kary Mullis (1983) - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
-PCR (Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase)
-SEQUENCIAMENTO-PCR (Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase)
-SEQUENCIAMENTO
PROGRAMA DE POacuteS GRADUACcedilAtildeO EM BIOTECNOLOGIA (PPGB)PROGRAMA DE POacuteS GRADUACcedilAtildeO EM BIOTECNOLOGIA (PPGB)
Profa Fabiana K Seixas
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR Polymerase Chain Reaction
Amplificaccedilatildeo in vitro de uma sequumlecircncia especiacutefica de
DNA
replicaccedilatildeo in vitro
Kary Mullis (1983) Precircmio Nobel Quiacutemica (1993)
Revolucionou geneacutetica
pesquisa geneacutetica
medicina forense
geneacutetica molecular
HISTOacuteRIA DA PCRHISTOacuteRIA DA PCR
DNA molde
Oligonucleotiacutedeos (primer)
dNTPrsquos
DNA Polimerase
Magneacutesio
Tampatildeo
Aacutegua
COMPONENTES DA REACcedilAtildeOCOMPONENTES DA REACcedilAtildeO
Thermus aquaticus -Estaacutevel a temperaturas de 177 graus
Temperatura Oacutetima 72 graus
DNA POLIMERASEDNA POLIMERASE
Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
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PCR Polymerase Chain Reaction
PCR Polymerase Chain Reaction
Amplificaccedilatildeo in vitro de uma sequumlecircncia especiacutefica de
DNA
replicaccedilatildeo in vitro
Kary Mullis (1983) Precircmio Nobel Quiacutemica (1993)
Revolucionou geneacutetica
pesquisa geneacutetica
medicina forense
geneacutetica molecular
HISTOacuteRIA DA PCRHISTOacuteRIA DA PCR
DNA molde
Oligonucleotiacutedeos (primer)
dNTPrsquos
DNA Polimerase
Magneacutesio
Tampatildeo
Aacutegua
COMPONENTES DA REACcedilAtildeOCOMPONENTES DA REACcedilAtildeO
Thermus aquaticus -Estaacutevel a temperaturas de 177 graus
Temperatura Oacutetima 72 graus
DNA POLIMERASEDNA POLIMERASE
Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
- Slide 58
- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
Kary Mullis (1983) Precircmio Nobel Quiacutemica (1993)
Revolucionou geneacutetica
pesquisa geneacutetica
medicina forense
geneacutetica molecular
HISTOacuteRIA DA PCRHISTOacuteRIA DA PCR
DNA molde
Oligonucleotiacutedeos (primer)
dNTPrsquos
DNA Polimerase
Magneacutesio
Tampatildeo
Aacutegua
COMPONENTES DA REACcedilAtildeOCOMPONENTES DA REACcedilAtildeO
Thermus aquaticus -Estaacutevel a temperaturas de 177 graus
Temperatura Oacutetima 72 graus
DNA POLIMERASEDNA POLIMERASE
Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
- Slide 58
- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
DNA molde
Oligonucleotiacutedeos (primer)
dNTPrsquos
DNA Polimerase
Magneacutesio
Tampatildeo
Aacutegua
COMPONENTES DA REACcedilAtildeOCOMPONENTES DA REACcedilAtildeO
Thermus aquaticus -Estaacutevel a temperaturas de 177 graus
Temperatura Oacutetima 72 graus
DNA POLIMERASEDNA POLIMERASE
Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
Thermus aquaticus -Estaacutevel a temperaturas de 177 graus
Temperatura Oacutetima 72 graus
DNA POLIMERASEDNA POLIMERASE
Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Thomas D Brock no lago do ldquoYellowstone National Parkrdquode onde foi isolado o Thermus aquaticus
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
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S D
A P
CR
ETA
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DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
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CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
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- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
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- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
- Slide 58
- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
TERMOCICLADOR
EQUIPAMENTOEQUIPAMENTO
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRPCR se constitui hoje no meacutetodo de rotina para isolar
rapidamente sequecircncias especiacuteficas a partir de uma mistura
complexa de sequumlecircncias genocircmicas
ou de cDNAs
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PCRReaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
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DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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- Slide 80
-
ProgramaPrograma
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
PCRCICLOS DA PCRCICLOS DA PCR
35 ciclos
O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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O ciclo da PCR
O ciclo da PCR
ETA
PAS
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PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
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DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
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- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
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- Slide 24
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- Slide 26
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- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
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- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
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- Slide 45
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- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
- Slide 58
- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
ETA
PAS
ETA
PAS
EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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EXT
RA
CcedilAtildeO
DO
DN
AEX
TR
ACcedilAtilde
O D
O D
NA
DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
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CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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DELINEAMENTO DE PRIMERSDELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
Os iniciadores (oligos primers) satildeo a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR
-Tamanho dos primers
- Estabelecimento das temperaturas corretas
a serem utilizadas
National Center for Biotechnology Information
httpwwwncbinlmnihgovhttpwwwncbinlmnihgov
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
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Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
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- Slide 30
- Slide 31
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- Slide 40
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- Slide 54
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- Slide 56
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- Slide 62
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- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
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- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
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- Slide 74
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- Slide 79
- Slide 80
-
ANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeOANELAMENTO E POLIMERIZACcedilAtildeO
ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
PA
S D
A P
CR
DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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ETA
PA
S D
A P
CR
ETA
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DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
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CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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DESNATURACcedilAtildeODESNATURACcedilAtildeO
ANELAMENTOANELAMENTO
POLIMERIZACcedilAtildeOPOLIMERIZACcedilAtildeO
ETAPAS DA PCRETAPAS DA PCR
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
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CR
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Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
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- Slide 20
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- Slide 56
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- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
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- Slide 64
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- Slide 66
- Slide 67
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- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
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- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
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- Slide 79
- Slide 80
-
ELETROFORESEELETROFORESE
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
ELETROFORESEELETROFORESE
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
VISUALIZACcedilAtildeO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
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Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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- Slide 4
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- Slide 51
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- Slide 60
- Slide 61
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- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
Eletroforese do DNA em gel de agarose 08
RESULTADOSRESULTADOS
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
RESULTADOSRESULTADOS
bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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bull Diagnoacutestico de doenccedilas infecciosas e geneacuteticas
bull Amplificaccedilatildeo de genes para posterior clonagem
e expressatildeo
bull Determinaccedilatildeo de variabilidade geneacutetica
bull Deteccedilatildeo de OGMs
bull Sexagem de embriotildees
bull Estudo da expressatildeo gecircnica
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
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CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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- Slide 32
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- Slide 40
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- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
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- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
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- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
Construccedilatildeo do DNA Recombinante
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo circular
Clivagem com enzima de restriccedilatildeo
Moleacutecula de DNA de um plasmiacutedeo linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligaccedilatildeo covalente pela DNA ligase
Moleacutecula de DNA plasmidial contendo o inserto
Inserccedilatildeo em uma ceacutelula hospedeira
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata
Visualizaccedilatildeo do Gel em Paternidade Comprovada para um loci estudado
Trio Normal (sup Pai matildee e crianccedila) R$ 60000
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
Nest
ed
- P
CR
Nest
ed
- P
CR
Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Canadian Journal of Microbiology
2006
APLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCRAPLICACcedilOtildeES DA TEacuteCNICA DE PCR
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
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crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
- Slide 2
- Slide 3
- Slide 4
- Slide 5
- Slide 6
- Slide 7
- Slide 8
- Slide 9
- Slide 10
- Slide 11
- Slide 12
- Slide 13
- Slide 14
- Slide 15
- Slide 16
- Slide 17
- Slide 18
- Slide 19
- Slide 20
- Slide 21
- Slide 22
- Slide 23
- Slide 24
- Slide 25
- Slide 26
- Slide 27
- Slide 28
- Slide 29
- Slide 30
- Slide 31
- Slide 32
- Slide 33
- Slide 34
- Slide 35
- Slide 36
- Slide 37
- Slide 38
- Slide 39
- Slide 40
- Slide 41
- Slide 42
- Slide 43
- Slide 44
- Slide 45
- Slide 46
- Slide 47
- Slide 48
- Slide 49
- Slide 50
- Slide 51
- Slide 52
- Slide 53
- Slide 54
- Slide 55
- Slide 56
- Slide 57
- Slide 58
- Slide 59
- Slide 60
- Slide 61
- Slide 62
- Slide 63
- Slide 64
- Slide 65
- Slide 66
- Slide 67
- Slide 68
- Slide 69
- Slide 70
- Slide 71
- Slide 72
- Slide 73
- Slide 74
- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
PCR ndash LipL32PCR ndash LipL32
POSITIVO37 Sorovares patogecircnicos
NEGATIVO7 Sorovares saproacutefitas
NEGATIVO15 microorganismos
Especificidade dos Prim
ers
Cepas do CCZ- Pelotas RS
Extraccedilatildeo de DNA
- Fervura- CTAB- SDS-Proteiacutenase K
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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- Slide 80
-
PCR - LipL32
264 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Cultura diluiacuteda em
urina
200
Leptospiras
Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Nested - PCRNested - PCR
LipL32819 pb
Primer F
Primer R
Primer F2
Primer R2PCR - 264 pb
Nested PCR -183 pb
Limite de Detecccedilatildeo
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
Nested - PCRNested - PCR
10 Leptospiras
16 amostras clinicas MAT +
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
Leptospira Brucella
Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
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wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Leptospira X BrucelaLeptospira X Brucela
PCR
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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- Slide 75
- Slide 76
- Slide 77
- Slide 78
- Slide 79
- Slide 80
-
Leptospira X BrucelaLeptospira X BrucelaMultiplex PCR
Nested- PCR
TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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TAXONOMIATAXONOMIA
Leptospira interrogans Leptospira weiliiLeptospira borgpeterseniiLeptospira noguchiiLeptospira santarosaiLeptospira alexanderiLeptospira kirschneriLeptospira genospecies 1
PatogecircnicasIntermediarias
Saproacutefitas
17 espeacutecies Genocircmicas lt260 sorovares
Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachiiLeptospira genospecies 3Leptospira genospecies 4Leptospira genospecies 5
Leptospira fainei Leptospira broomiiLeptospira inadai
Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Extraccedilatildeo de DNA de L interrogansExtraccedilatildeo de DNA de L interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extraccedilatildeo de DNA
PCR
94ordmC ndash 5 min
94ordmC ndash 1 min50ordmC ndash 1 min72ordmC ndash 1 min
72ordmC ndash 7 min
30 ciclos
Gel de Agarose
VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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VNTR
Caracterizaccedilatildeo MolecularCaracterizaccedilatildeo Molecular
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
VNTR ndash IsoladosVNTR ndash Isolados
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
VNTR 4
VNTR 7
VNTR 9VNTR 10 VNTR 19
VNTR 23
Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Extraccedilatildeo do DNA da amostra eacute criacutetica
Alguns compostos podem inibir a
polimerase Condiccedilotildees especiacuteficas para cada reaccedilatildeo
Falsos resultados positivos devido a
contaminaccedilatildeo Falsos resultados negativos
Anaacutelises conduzidas em laboratoacuterios
especializados
LIMITACcedilOtildeESLIMITACcedilOtildeES
htt
p
ww
wp
crlin
ksc
om
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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crlin
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SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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MEacuteTODOS CLAacuteSSICOS
Clivagem quiacutemica ou Meacutetodo de Maxam-Gilbert (natildeo eacute mais utilizado)
Meacutetodo de Sanger de terminaccedilatildeo de cadeia com didesoxirribonucleosiacutedeo trifosfato
Manual
Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTOTECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
Pirosequenciamento
- Science 281 (1998) n 5375 363-365
- Nature 437 (2005) 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
-Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977) n 12 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb24 horas)
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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-
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Meacutetodo de Maxam-Gilbert
Clivagem de uma moleacutecula de DNA com reagentes quiacutemicos que atuam especificamente em um determinado nucleotiacutedeo
Grupo fosfato radioativo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Meacutetodo de Maxam-GilbertMeacutetodo de Maxam-Gilbert
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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bull Um dos mais utilizado eacute o chamado ldquomeacutetodo didesoxirdquo conhecido tambeacutem como de ldquoterminadores de cadeiardquo ou de ldquoSangerrdquo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Meacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
Polimerizaccedilatildeo
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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SEQUENCIAMENTO DE DNASEQUENCIAMENTO DE DNAMeacutetodo de SangerMeacutetodo de Sanger
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
2acute 3acutedidesoxirribonucleotiacutedeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo da cadeia de DNA
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
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Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Anelamento do primer
Extensatildeo do primer
Terminaccedilatildeo da siacutentese adiccedilatildeo dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferenccedila
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Sequumlenciamento Manual
Sequumlenciamento Manual
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Auto-radiogramas de um gel de sequumlenciamento de DNA
SEQUENCIAMENTO MANUALSEQUENCIAMENTO MANUAL
Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Anos 80 ndash sequumlenciador semi-automaacutetico
bull Substituiccedilatildeo das teacutecnicas de detecccedilatildeo por radioatividade pelouso de marcadores fluorescentesbullRadioisoacutetopos ndash danosos agrave sauacutede dificuldade de automaccedilatildeobullFluoroacutefos ndash sistema de detecccedilatildeo que permite a leitura automaacutetica das sequumlecircnciasbull Preparaccedilatildeo do gel e aplicaccedilatildeo das amostrasbull Utilizaccedilatildeo ddNTPs fluorescentes lidos automaticamentedurante a eletroforesebull Corantes fluorescentes ndash reaccedilotildees no mesmo poccedilo no gel
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Sequumlenciamento Manual X Automaacutetico
Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Meacutetodo de Sanger automatizado
Meacutetodo de Sanger automatizado
Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Sanger sequencingSanger sequencing
denaturaccedilatildeo
anelamento dos primers
SEQUENCIADORSEQUENCIADOR
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
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Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
bull Sequumlenciadores de capilares - duas vezes mais raacutepidoscompletamente automatizados
bull Associaccedilatildeo de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecccedilatildeo atraveacutes de fluorescecircncia confocal excitada por laser
bull Eliminaccedilatildeo da montagem da placa e preparaccedilatildeo do gel
bull Aplicaccedilatildeo das amostras por eletroinjeccedilatildeo
bull Alta velocidade e resoluccedilatildeo na separaccedilatildeo das amostras
SEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICOSEQUENCIAMENTO AUTOMAacuteTICO
Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
- Slide 1
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Regiatildeo de qualidade alta
bull Picos bem definidos e grandesbull Linha de base boabull Distacircncia entre picos anterior e posterior constante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Regiatildeo de qualidade meacutedia ndash poucas ambiguumlidades
bull Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho meacutediobull Linha de base boa a razoaacutevelbull Distacircncia entre picos anterior e posterior razoaacutevel
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regiatildeo de qualidade baixa ndash baixa confiabilidade
bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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bull Picos mal definidos e de tamanho pequenobull Linha de base confusabull Distacircncia entre picos anterior e posterior inconstante
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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ANALISANDO O CROMATOGRAMAANALISANDO O CROMATOGRAMA
NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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NOVAS TECNOLOGIASNOVAS TECNOLOGIAS
SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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SANGERSANGER Pirosequenciamento
Pirosequenciamentobull Depende de clonagem em
bacteacuteria (2 semanas de trabalho)
bull Natildeo haacute clonagem
bull Reads de ~700 bp bull Reads de ~100 bp
bull Clones de fita dupla permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees (facilita orientaccedilatildeo e montagem)
bull Fragmentos fita simples natildeo permitem sequumlenciamento em ambas direccedilotildees
SANGER X PIROSEQUENCIAMENTOSANGER X PIROSEQUENCIAMENTO
bull 25 milhotildees de bp em 4 horas (100x mais raacutepido)
bull 1 milhatildeo de pb em 24 horas
bull 6 meses de sequenciamento 24 horas por dia para sequenciar o genoma de um fungo
bull 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
Conclusatildeo a uniatildeo faz a forccedilaConclusatildeo a uniatildeo faz a forccedila
PNAS 103 (2006) 11240PNAS 103 (2006) 11240
bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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bull 1977 ndash Teacutecnica de sequumlenciamento de DNA ndash Meacutetodo de Sanger
bull 1991 ndash Projeto Genoma Humano
bull 1995 ndash Primeiro genoma sequumlenciado (Haemophylus influenzae)
bull 2001 ndash Primeiro rascunho do Genoma Humano
bull 2003 ndash Conclusatildeo do sequumlenciamento do Genoma Humano
bull 2009 ndash Mais de 1000 genomas sequumlenciados
Genocircmica - HistoacutericoGenocircmica - Histoacuterico
Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Fleischmann et al Science 269496-512 1995
Science July 28 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
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Genomas
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Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd (first genome of free-living
organism ever completely sequenced)Robert D Fleischmann Mark D Adams Owen White Rebecca A Clayton Ewen F Kirkness Anthony R Kerlavage Carol J Bult Jean-Fracois Tomb Brian A Dougherty Joseph M Merrick Keith McKenney Granger Sutton Will FitzHugh Chris Fields Jeannine D Gocayne John Scott Robert Shirley Li-Ing Liu Anna Glodek Jenny M Kelley Janice F Weidman Cheryl A Phillips Tracy Spriggs Eva Hedblom Matthew D Cotton Teresa R Utterback Michael C Hanna David T Nguyen Deborah M Saudek Rhonda C Brandon Leah D Fine Janice L Fritchman Joyce L Fuhrmann NSM Geoghagen Cheryl L Gnehm Lisa A McDonald Keith V Small Claire M Fraser Hamilton O Smith J Craig Venter
ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1830137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable The H influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism
Organism Complete Draft assembly In progress totalProkaryotes 598 396 506 1500
Archaea 48 4 29 81Bacteria 550 392 477 1419
Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
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Projetos
Genomas
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Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
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Eukaryotes 24 125 176 325Animals 5 53 83 141
Mammals 2 20 23 45Birds 1 2 3Fishes 3 6 9Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4Roundworms 1 3 13 17Amphibians 2 2
Reptiles 1 1Other animals 6 19 25
Plants 3 3 34 40Land plants 2 2 27 31Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87Ascomycetes 8 41 20 69
Basidiomycetes 1 6 4 11Other fungi 1 2 4 7
Protists 6 18 27 51Apicomplexans 1 9 6 16
Kinetoplasts 1 2 5 8Other protists 4 7 15 26
total 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised Nov 17 2007 httpwwwncbinlmnihgovgenomesstaticgpstathtml
Projetos
Genomas
Revised Out 26 2009
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
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Genomas
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Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
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SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
Tipos de projetoDNA ndash sequumlenciamento de estruturas do genoma ou de trechos destas Ex Genoma
humano
ESTs ndash sequenciamento de cDNA feitos agrave partir de bibliotecas de mRNA Ex ESTs de cana-de-accediluacutecar
SAGE ndash sequenciamento de fragmentos em torno de 20 pb do cDNA
DIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIASDIFERENCcedilAS ENTRE AS METODOLOGIAS
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de DNA feito de forma aleatoacuteria fornece
- Informaccedilotildees sobre regiotildees codantes (genes) e promotores
- Mas gera sequecircncias em regiotildees inter-gecircnicas (a princiacutepio sem nenhuma funccedilatildeo)
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
-Sequenciamento de mRNA fornece
- Informaccedilatildeo direta sobre os genes e tambeacutem sobre a expressatildeo gecircnica
- Mas genes pouco expressos satildeo mais raros de serem sequenciados por essa teacutecnica
Estrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomasEstrateacutegias empregadas no sequumlenciamento de genomas
Mapeamento preacutevio do genoma Utiliza-se uma coleccedilatildeo de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados subclonados e sequumlenciados)
DNA genocircmico eacute fragmentado em segmentos menores que satildeo
clonados e sequumlenciados
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-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
-SAGE (Serial analysis of gene expression) fornece informaccedilatildeo sobre a expressatildeo gecircnica de forma mais eficiente que ESTs (expressed sequence tags) mas eacute uacutetil apenas quando o genoma completo do organismo for conhecido
- A situaccedilatildeo ideal para um projeto genoma eacute sequenciar ambos DNA e cDNA
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