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U�IVERSIDADE FEDERAL DE PER�AMBUCO CE�TRO DE CIÊ�CIAS DA SAÚDE

DEPARTAME�TO DE CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS

Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis

SÍ�TESE E AVALIAÇÃO PRELIMI�AR DA ATIVIDADE A�TI�OCEPTIVA

E TOXICIDADE DE �OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZO�AS

Dissertação de Mestrado

Recife, PE

2008

Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis

SÍ�TESE E AVALIAÇÃO PRELIMI�AR DA ATIVIDADE A�TI�OCEPTIVA E TOXICIDADE DE �OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZO�AS

Orientador: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria Co-orientadora: Profa. Dra.Teresinha Gonçalves da Silva

+Bolsista da Facepe

Recife, PE

2008

Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas do

Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Reis, Silvio Leandro Gonçalves Bonfim

Síntese e avaliação preliminar da atividade antinoceptiva e toxicidade de novas isoxazolil-aril-hidrazonas / Silvio Leandro Gonçalves Bonfim Reis. – Recife : O Autor, 2008.

92 folhas. Il: fig., graf ., tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.

Inclui bibliografia e anexo.

1. Química farmacêutica. 2. Química médica. 3. Síntese química. 4. Isoxazolil-aril-hidrazonas. I. Título.

542.057 CDU (2. ed) UFPE 615.19 CDD (22.ed.) CCS2008-133

U�IVERSIDADE FEDERAL DE PER�AMBUCO

CE�TRO DE CIÊ�CIAS DA SAÚDE DEPARTAME�TO DE CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS LASOF – LABORATÓRIO DE SÍ�TESE ORGÂ�ICA APLICADA A

FÁRMACOS

SÍ�TESE E AVALIAÇÃO PRELIMI�AR DA ATIVIDADE A�TI�OCEPTIVA E TOXICIDADE DE �OVAS ISOXAZOLIL-ARIL-HIDRAZO�AS

BA�CA EXAMI�ADORA:

Presidente: Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria - UFPE

Membro Interno Titular: Prof

a.Dra. Maria do Carmo Alves de Lima - UFPE

Membro Externo Titular: Prof

a. Dra. Maria Bernadete de Sousa Maia - UFPE

(Departamento de Farmacologia)

Membros Suplentes: Prof. Dr.Dalci José Brondani – UFPE

Prof. Dr.Francisco Jaime Bezerra Mendonça Junior - UEPB

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CrENCIAS DA SAUDEDEPARTAMENTO DE CrENCIAS FARMACEUTICASPROGRAMA DE POS-GRADUA<;AO EM CIENCIASFARMACEUTICAS

Dissertayao de Mestrado defendida e APROV ADA, por decisaounanime, em 29 de agosto de 2008 e cuja Banca Examinadora foiconstituida pelos seguintes professores:

PRESIDENTE E EXAMINADOR INTERNO: Prof. D . tonioRodolfo de Faria (DeptO de Ciencias Farmaceuticas da niver idadeFederal de Pernambuco - UFPE).

EXAMINADOR INTERNO: Profa. Dra. Maria do Carmo Alves deLima (DeptOde Antibi6ticos da Universidade Federal de Pernambuco -UFPE)

Assinatura: ~ Jji?/~EXAMINADOR EXTERNO: Profa. Dra. Maria Bernadete de

Sousa Maia (DeptOFisiologia e Farmacologia da Universidade Federal

de Pernambuco - UFPE).

U�IVERSIDADE FEDERAL DE PER�AMBUCO

REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSU�TOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CE�TRO DE CIÊ�CIAS DA SAÚDE

Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro

CHEFE DO DEPARTAME�TO DE CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Jane Sheila Higino

COORDE�ADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊ�CIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Pedro José Rolim �eto

VICE-COORDE�ADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊ�CIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Beate Saegesser Santos

DEDICATÓRIA

Dedico à Débora minha noiva e a minha família, pela paciência e compreensão nos

momentos difíceis desta trajetória, minha sincera gratidão! Este trabalho não é só meu.

É, acima de tudo, de vocês!

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida e pelo fato de ser tão generoso comigo nesta

caminhada.

Ao orientador e grande amigo prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria pela

oportunidade concedida, pelos ensinamentos, pela compreensão e pelo apoio nos

momentos mais difíceis desta trajetória.

À profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva e Laudelina Magalhães do

Laboratório Bioensaios para Pesquisa de Fármacos (LBPF) do Departamento de

Antibióticos, da Universidade Federal de Pernambuco pela realização dos testes

biológicos.

Aos amigos do laboratório Gleybson, Karina, Leilane, Rafaela, Hugo,

Ronmilson, Keila, Mônica e Keila pelo convívio agradável e momentos de amizade e

descontração, em especial a Valderes pela sinsera amizade, apoio nos momentos difíceis

e grande colaboração para a realização deste trabalho.

Aos amigos da turma de pós-graduação Cleiton, Diogo, Marcos e Fred pelos

momentos divertidos e sofrimento conjunto durante a realização das disciplinas.

Aos técnicos da central analítica do DQF, em especial Ricardo e Eliete.

À Conceição, da secretaria da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo

seu apoio e paciência com nossas agonias.

A todos os professores que fazem parte do programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas.

A minha família e a minha noiva Débora, que são o que eu tenho de mais

preciosos nesta vida, pela paciência, compreensão e apoio nos momentos difíceis desta

trajetória.

A FACEPE pelo suporte financeiro.

A VIDA

A vida é uma oportunidade, aproveite-a... A vida é beleza, admire-a...

A vida é felicidade, deguste-a... A vida é um sonho, torne-o realidade... A vida é um desafio, enfrente-o... A vida é um dever, cumpra-o... A vida é um jogo, jogue-o... A vida é preciosa, cuide dela...

A vida é uma riqueza, conserve-a... A vida é amor, goze-o...

A vida é um mistério, descubra-o... A vida é promessa, cumpra-a... A vida é tristeza, supere-a... A vida é um hino, cante-o... A vida é uma luta, aceite-a... A vida é aventura, arrisque-a... A vida é alegria, mereça-a... A vida é vida, defenda-a...

(Madre Teresa de Calcutá)

SUMÁRIO

PARTE 1 – INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E OBJETIVOS

1 - Introdução.............................................................................................................2

2 - Revisão da literatura.............................................................................................6

2.1 – isoxazolinas................................................................................................. 6

2.2 – Derivados de hidrazonas ...........................................................................12

3 – Objetivos ............................................................................................................20

3.1 – Objetivos gerais .........................................................................................20

3.2 – Objetivos específicos..................................................................................20

PARTE 2 – ESTUDO QUíMICO

4 – Metodologia .......................................................................................................22

5 – Resultados e discussão .....................................................................................25

5.1 – Obtenção do éster isoxazolínico bicíclico 49.............................................25

5.1.2 – Preparação do trímero da 1-pirrolina 47..........................................25

5.1.3 – síntese do enecarbamato endocíclico N-(benziloxicarbonil)-2-

pirrolina 48...................................................................................................26

5.1.4 – Síntese do clorooximidoacetato de etila – precusor do N-óxido

de nitrila – CEFNO 56..................................................................................26

5.1.5 – Sintese do éster isoxazolínico, via reação de cicloadição 1,3-dipo

lar 49................................................................................................27

5.2 – Desproteção da amina secundária em N6................................................28

5.3 – N-benzoilação da isoxazolina 50 desprotegida com cloretos de benzoila

para substituídos .......................................................................................28

5.4 – Síntese dos álcoois isoxazolínicos 52.......................................................29

5.5 – Obtenção dos aldeídos isoxazolínicos 53 através da oxidação de Swern

dos álcoois isoxazolínicos 52....................................................................30

5.6 – Obtenção das isoxazolil-hidrazonas de 5 membros 54.............................31

6 – Procedimentos experimentais...........................................................................34

PARATE 3 – ESTUDO BIOLÓGICO

7 – Revisão da literaratura........................................................................................54

7.1 – Fisiopatologia da dor ................................................................................54

7.2 – Toxicidade aguda .....................................................................................58

8 – Avaliação da atividade biológica .......................................................................58

8.1 – Materiais ...................................................................................................59

8.2 – Animais .....................................................................................................59

8.3 – Metodologia ..............................................................................................59

8.3.1 – Nocicepção induzida por ácido acético.........................................59

8.3.2 – Toxicidade aguda..........................................................................60

9 – Resultados e discussão .....................................................................................60

9.1 – Nocicepção induzida por ácido acético ....................................................60

9.2 – toxicidade aguda........................................................................................63

PARTE 5 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

10 - Conclusões........................................................................................................65

11 - Pespectivas Futuras..........................................................................................66

PARTE 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS E ANEXOS

12 - Referências bibliográficas..................................................................................68

13 – Anexos..............................................................................................................76

13.1 – Espectros selecionados.......................................................................... 76

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 01. Obtenção do éster isoxazolínico bicíclico 49............................................25

Esquema 02. Preparação do trímero da 1-pirrolina 47 .......................................................25

Esquema 03. Síntese do enecarbamato endocíclico N-(benziloxicarbonil)-2pirrolina48....26

Esquema 04. Síntese do clorooximidoacetato de etila 56, precursor do N-óxido de

nitrila –CEFNO............................................................................................................26

Esquema 05. Síntese do éster isoxasoliníco 49, via reação de cicloadição 1,3-dipolar.....27

Esquema 06. Desproteção da amina secundária em N6....................................................28

Esquema 07. N-benzoilação da isoxazolina desprotegida 50 com cloretos de benzoila

para substituídos...................................................................................................................28

Esquema 08. Síntese dos álcoois isoxazolínicos 52...........................................................29

Esquema 09. Obtenção dos aldeídos isoxazolínicos 53, através da oxidação de swern

dos álcoois isoxazolínicos 52...............................................................................................30

Esquema 10. Obtenção de isoxazolil-hidrazonas de 5 membros 54..................................31

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Núcleos isoxazolínicos.....................................................................................03

Figura 02. Função hidrazona......................................................................................03

Figura 03. Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas......................................................06

Figura 04. Fusão do biciclo isoxazolínico com a porção hidrazônica..............................18

Figura 05. Isoxazolil-aril-hidrazonas...................................................................................22

Figura 06. Esquema sintético utilizado na preparação das isoxazoil-aril-hidrazonas........23

Figura 07.Estrutura geral das isoxazolil-aril-hidrazonas.................................................... 61

Figura 08. Gráfico do efeito das hidrazonas 54 sobre a nocicepção, induzida por ácido

acético (1%), em camundongos................................................................................................... 62

Figura 09. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52a.........................................................76

Figura 10. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 53a.........................................................77

Figura 11. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53a...............78

Figura 12. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52b..........................................................79

Figura 13. Espectro de infravermelho (janela de KBr, cm-1) do composto 52b...................80

Figura 14. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 53b...........................................................81

Figura 15. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53b................82

Figura 16. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54a..........................................................83

Figura 17. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54a.................84

Figura 18. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54b..........................................................85

Figura 19. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54b................86

Figura 20. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54c..........................................................87

Figura 21. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54c................88

Figura 22. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54d..........................................................89

Figura 23. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54d................90

Figura 24. Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54e..........................................................91

Figura 25. Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54e................92

LISTA DE TABELA

Tabela 01. Substituintes e rendimentos das N-benzoil-isoxazolinas 51............................28

Tabela 02. Substituintes e rendimentos dos álcoois isoxazolínicos 52.....................................29

Tabela 03. Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos..............................30

Tabela 04. Substituintes e rendimentos das isoxazolil-hidrazonas..................................32

Tabela 05. Percentual de inibição das hidrazonas no teste de contorções

abdominais induzidas por ácido acético (1%) em camundongos.........................................61

Título: Síntese e Avaliação Preliminar da Atividade Antinoceptiva e Toxicidade de Novas

Isoxazolil-aril-hidrazonas.

RESUMO

A Química Medicinal, através de estratégias específicas, vem para estudar as razões

moleculares da ação dos fármacos, descrevendo a relação entre a estrutura química e a

atividade farmacológica, com objetivo de planejar, sintetizar e produzir moléculas com

potenciais farmacológicos. Neste trabalho, utilizando a estratégia de hibridização molecular,

através da fusão de dois grupos farmacofóricos, chegamos a novos compostos com atividades

analgésicas potencializadas. Foi realizada a condensação do núcleo isoxazolínico com uma

porção hidrazona, pois segundo a literatura, derivados hidrazonas híbridos de vários

heterociclos têm apresentado interessantes atividades biológicas como antimicrobiana,

anticonvulsivante, antiinflamatória e analgésica. Diante dessas considerações, nosso interesse

foi voltado para a obtenção de isoxazolinas bicícliclas pirrolidínicas com modificação

molecular no radical éster do biciclo, obtendo então novos derivados híbridos (isoxazolil-aril-

hidrazonas). Este estudo possibilitou a expansão da aplicação sintética e biológica de nossa

metodologia. Em nosso trabalho, o enecarbamato �-(benzoiloxicarbonil)-2-pirrolina 48, nosso

material de partida, foi obtido a partir do trímero da 1-pirrolina. Reações de cicloadição 1,3-

dipolar do enecarbamato com o �-óxido de nitrila CEFNO resultaram no cicloaduto

isoxazolínico bicíclico 49. Após hidrogenólise do cicloaduto 49 e �-benzoilação do mesmo,

derivados isoxazolínicos, �-benzoilados 51, com função éster em C3 foram obtidos. Os

ésteres isoxazolínicos �-benzoilados 51 foram reduzidos aos respectivos álcoois 52, com

NaBH4, onde posteriormente foram oxidados aos aldeídos isoxazolínicos 53, em C3, através

do método de Swern. Por último, realizamos as reações de condensação dos aldeídos

isoxazolínicos 53 com diversas fenil-hidrazinas p-substituídas, obtendo-se assim as isoxazolil-

aril-hidrazonas puras 54 e apresentando rendimentos entre 50% e 60%. Estes novos

compostos foram submetidos a testes biológicos, onde apresentaram excelentes resultados

para testes preliminares de atividade analgésica, além de baixa toxicidade. Os Compostos 54a

e 54f apresentaram, respectivamente, 85,8% e 76% de inibição das contorções abdominais

induzidas por ácido acético sendo superior ao fármaco padrão (dipirona), o qual apresentou

59%.

Palavras-chaves: 2-isoxazolina, hidrazonas, atividade antinoceptiva

Title: Syntheses and Preliminary Evaluation of antinoceptiva activity and toxicity of novel

isoxazolyl-aryl-hydrazones.

ABSTRACT

The Medicinal Chemistry, through specific strategies, comes up with explanations for the

action of drugs, describing the relation between chemical structure and pharmacologic

activity, aiming to plan, synthesize and produce molecules with pharmacologic potential. In

this work, utilizing molecular hybridization strategy, through the combination of two

pharmacophores, we obtained novel compounds with potentiated analgesic activity. It was

realized the condensation of isoxazolinic nucleus with an hydrazone moiety, since, according

to literature, hydrazone hybrids derivative from various heterocyclic compounds have

presented interesting biological activities such as, antimicrobial, anticonvulsant, anti-

inflammatory and analgesic. Facing these considerations, our interest was the obtainment of

bicyclic pyrrolidinic isoxazolines with molecular modification on ester radical of the bicycle,

obtaining novel hybrid derivatives (isoxazolyl-aryl-hydrazones). This study allowed the

expansion of biological and synthetic application of our methodology. In our work, the

enecarbamate �-(benzyloxicarbonyl)-2-pyrroline 48, our starting material, was obtained from

1-pyrroline trimer. 1,3-dipolar cycloaddition of enecarbamate with nitrile oxide CEFNO

resulted on the aza-bicylic isoxazoline cycloaduct 49. After hydrogenolisis and �-

benzoylation of the cycloaduct 49, isoxazolinic �-benzoylated derivatives 51, with an ester

function on C3 were obtained. The isoxazolinic �-benzoylated esters 51 were reduced to the

respective alcohols 52, with NaBH4, then posteriorly were oxidized to isoxazolinic aldehydes

53, on C3, through Swern oxidation. Finally, it was realized condensation reactions of

isoxazolinic aldehydes 53 with several phenylhydrazines p-substituted, obtaining pure

isoxazolyl-aryl-hydrazones 54, presenting a yield between 50% and 60%. These novel

compounds were submitted to biological tests, in which presented excellent results for

preliminary test of analgesic activity, besides showing low toxicity. The analgesic activity of

isoxazolyl-aryl-hydrazones was performed using the acetic-induced mice abdominal

constrictions test. The compounds 54a e 54f presented, respectively, 85,8% e 76% of

inhibition on the abdominal contortions induced by acetic acid, being superior to the standard

drug (dipyrone), which presented 59%.

Keywords: 2-isoxazoline, hydrazones, antinoceptive activity

I�TRODUÇÃO

2

1- I�TRODUÇÃO

A Química Medicinal estuda as razões moleculares da ação dos fármacos de

maneira a descrever a relação entre a estrutura química e a atividade farmacológica,

hierarquizando as diferentes contribuições funcionais. 1 Com isso têm-se como objetivo

o desenvolvimento, síntese e produção de moléculas com potencial uso terapêutico. 2

No contexto inverso, inclui-se o planejamento e o desenho estrutural de novas

substâncias que possuam propriedades farmacoterapêuticas úteis, capazes de

representarem novas entidades químicas, candidatas a protótipos de novos fármacos, de

uso seguro.

De forma heurística, para a identificação de um novo composto-protótipo ou

uma nova entidade química que possa representar novo candidato a fármaco, elege-se o

melhor alvo farmacológico para aquela aplicação terapêutica e, em função do

conhecimento da estrutura disponível sobre este receptor, identifica-se a melhor

estratégia que possa construir a arquitetura molecular do novo ligante desejado.

Diversas estratégias modernas de desenho molecular de novos protótipos são

conhecidas em função do mecanismo de ação pretendido, seja inibição enzimática,

reversível ou não, ou agonismo/antagonismo, competitivo ou não, do receptor, que

dependem do nível de conhecimento de sua topografia. 3

Quando não se conhece a estrutura do biorreceptor-alvo, a estratégia mais

empregada fundamenta-se na variação da similaridade molecular do agonista natural, de

forma que se identifique um análogo ativo, reflexo de suas propriedades

farmacodinâmicas, que governam seu reconhecimento molecular pelo biorreceptor.

Uma vez comprovada a atividade farmacológica desejada do novo análogo-ativo, por

meio de protocolos farmacológicos in vivo, têm-se um novo composto-protótipo,

candidato ao novo fármaco pretendido. 4

Um dos métodos para obtenção de novos fármacos, a hibridação molecular,

propicia inúmeras vantagens, como por exemplo, obtenção de moléculas com

propriedades farmacológicas superiores; possibilidade de elucidar a relação estrutura-

atividade da molécula e emprego dos mesmos métodos de ensaios biológicos utilizados

para o protótipo dos novos derivados híbridos. Dessa forma, através da modificação

molecular é possível descobrir o grupamento farmacofórico essencial e obter fármacos

que apresentem propriedades mais desejáveis que o protótipo, em potência,

especificidade, duração de ação, menor toxicidade e maior estabilidade 5,6.

3

N

N

O

O

NH2O

H

H

R

N

N

O

R1H

HR2

12

345

6O

N12

34

5

1 2 3

Figura 01 - Núcleos isoxazolínicos

Existem relatos que muitas substâncias que possuem em suas estruturas o

núcleo 2-isoxazolina 3, apresentam inúmeras e importantes atividades biológicas, como

por exemplo, a ação antiinflamatória e analgésica. 7,8

Derivados amidas 1 (figura 1) contendo o núcleo 2-isoxazolínico aza-bicíclica,

foram obtidos em nosso laboratório e submetidos à avaliações biológicas. Excelentes

resultados foram observados, como atividade anti-inflamatória comparável à

indometacina (fármaco padrão), assim como indícios ação no Sistema Nervoso Central,

evidenciada através dos ensaios de toxicidade aguda e com provável ação analgésica. 9

Em relação à função hidrazona (figura 2), ela também tem sido bastante relatada

na literatura em processos que envolvem a hibridação molecular. Derivados híbridos de

hidrazonas, com vários heterociclos, têm apresentado interessante atividade

analgésica.10

H N

R2

R1

H

Figura 02 – Função hidrazona

4

Diante dessas considerações, nosso interesse tem se voltado para a obtenção de

isoxazolinas bicícliclas pirrolidínicas, com modificação molecular na posição “3” do

biciclo 2, visando a obtenção de novos derivados híbridos, contendo o novo

heterobiciclo 2 e a função hidrazona, com o objetivo de uma possível potencialização da

atividade analgésica ou até descoberta de novas atividades farmacológicas desses novos

compostos.

.

REVISÃO DA LITERATURA

6

2- REVISÃO DA LITERATURA

2.1- ISOXAZOLINAS

Heterociclos de 5 membros, contendo átomos de oxigênio e nitrogênio ligados

entre si, tem despertado grande interesse, devido ao grande potencial biológico que estas

substâncias apresentam.

Estes heterociclos são classificados de acordo com o grau de oxidação do anel

heterocíclico e apresentam propriedades químicas distintas, inerentes às suas estruturas:

Isoxazóis 4, totalmente oxidados e aromáticos, Isoxazolinas 3, parcialmente oxidadas e

Isoxazolidinas 5, totalmente reduzidas (fig. 3).

3a

ON

ON

ON

3c3b5

ON

42-Isoxazolina 3-Isoxazolina 4-Isoxazolina

ON

1

2

34

5

1

2

34

5

34

5

1

2

34

5

1

2

34

5

1

2

Figura 03 - Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas

Dos heterociclos descritos acima, particularmente as isoxazolinas 3a despertam

grande interesse em estratégias sintéticas, visando a obtenção de substâncias com

potenciais atividades biológicas. A seguir serão descritos e discutidos de forma

representativa relatos da literatura, sobre isoxazolinas, como por exemplo, ocorrência

natural, atividades biológicas e aplicações terapêuticas, métodos de obtenção e

aplicação sintética, ilustrando a grande importância químico-biológica das mesmas.

7

2.1.2 - OCORRÊNCIA NATURAL

A incidência natural de 2-isoxazolinas é bem restrita, sendo encontrado

basicamente em algumas espécies de esponjas marinhas, como espiro-compostos.

Alcalóides isoxazolínicos 6 e 7 foram isolados da esponja Aplisina aerophoba e

estão envolvidos no mecanismo de defesa da esponja contra peixes predadores. Estas

isoxazolinas são precursoras de substancias tóxicas formadas por catálise enzimática. 11

BrH3CO

Br

HO ON

N

O N

N

H H

BrH3CO

Br

HO ON

NH(CH2)4

O

N

O

ON

Br OCH3

Br

OH

6 7

Uma espiroisoxazolina natural 8, um alcalóide isolado da esponja Aplisina

gerardogreeni apresentou-se biologicamente ativa, com ação efetiva contra

Mycobacterium tuberculosis.12, 13

Br

OCH3

Br

HO

O

NN

O

H

NHN

OH

HO NH

O

OH

NH2

8

2.1.3 - ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊUTICA

A literatura relata vários exemplos de compostos bioativos, contendo o núcleo 2-

isoxazolina, que tem apresentado os mais diversos tipos de atividade biológica,

compreendendo desde atividade herbicida e antimicrobiana até atividade

neurotransmissora.

8

A 2-isoxazolina 9, apresentou excelente seletividade e potente atividade

herbicida contra diversas espécies de ervas daninhas, principalmente em culturas de

arroz. Os estudos de toxicidade em camundongos revelaram que 9 apresenta baixa

toxicidade, com DL50 acima de 5000 mg/Kg.14

ON

S

H3C

O

F

F

CH3

9

Penicilinas semi-sintéticas comerciais, tais como Oxacilina e Cloxacilina 10,

possuem em sua cadeia lateral o radical isoxazolila. Carbapenens 11 contendo

isoxazolinas como radical, tem apresentado potente atividade antibacteriana.15

N

S

OCOOH

N

O

O

N

R1

R1 = H - OXACILINAR1 = Cl - CLOXACILINA

11

N

O

HH

CO2H

OH

SN

O

N

H

CO2Et

10

Recentemente foi relatada uma série de heterociclos inibidores da biossíntese de

lipídios, que apresentam atividade contra bactérias Gram negativas. Estes heterociclos

tem como núcleo base uma 2-isoxazolina. O derivado mais potente desta série, a

isoxazolina 12 teve excelente atividade contra Escherichia coli. 16

MeO

NO

NHOH

O

12

Excelentes resultados foram relatados quando derivados de 2-isoxazolinas 13 e

14, tendo o anel imidazol como substituinte na posição 3 do núcleo isoxazolínico, foram

9

submetidos a testes antifúngicos, apresentando Concentração Mínima Inibitória – CMI

contra Aspergillus flavus e Fusarium moniliforme bem superior à droga antifúngica

Nistatina, usada atualmente na terapêutica17, mostrando assim o incremento da

atividade anti-fúngica, devido à introdução do núcleo da 2-isoxazolina.

NO

OH

NHN

Cl

Bu

NO

O

O

NHN

Cl

Bu

13 14

A 2-isoxazolina dissubistituída 15 apresentou atividade espermicida e anti HIV

com mais de 95% de redução do vírus. 18

ON

O

Br

Br

15

Potente atividade antiviral contra o vírus da influenza humana foi apresentada

para uma série de derivados de 2-isoxazolinas. Das substâncias estudadas, o protótipo

16 apresentou a maior atividade antiviral e uma baixa citotoxicidade. 19

O N

tBu N

O

CN

NO

H

16

Um dos protótipos da série apresentou excelente controle do vírus H1N1 para

uma dose de 3ug/mL, com atividade bastante superior à Amantadina, uma droga

antiviral comercial.

Atualmente tem se pesquisado muito sobre doenças que envolvem o processo de

adesão celular, tais como trombose, metástases e osteoporose. 20

Substâncias contendo 2-isoxazolinas em suas estruturas são relatadas como

antagonistas dos receptores da superfície celular, glicoproteína IIb/IIIa, impedindo a

10

ligação do fibrinogênio e conseqüentemente a agregação plaquetária, sendo portanto,

um atrativo representante do arsenal terapêutico no tratamento de aterosclerose e

trombose. Entre essas, estão as 2-isoxazolinas-3,5-dissubstituídas 17 e 18. 21

H2N

HN

N O O

NCO2H

H

H2N

HN

N O O

NCO2CH3

HN

O

OH

1718

Também com relação à atividade antitrombótica, recentes estudos mostraram 2-

isoxazolinas, exemplificada pela molécula 19, como potentes inibidores do fator Xa,

responsável pela catálise na produção de trombina a partir de protrombina, um dos

mecanismos envolvidos na cascata da coagulação sanguínea.22 A inibição do fator Xa

tem surgido como um alvo atrativo para aplicação terapêutica potencial no tratamento

de trombose venosa e arterial. 23

Na literatura há também muitos relatos de atividade antiinflamatória e

analgésica para sustâncias que apresentam o núcleo 2-isoxazolina.

Relatou-se recentemente drogas esteroidais, contendo o núcleo 2-isoxazolina em

sua estrutura, que apresentaram excelente atividade antiinflamatória e alta afinidade

com os glicoreceptores. As drogas esteroidais 20 e 21 apresentaram-se 5 e 5,3 vezes

respectivamante mais potente que a prednisolona, um corticosteróide usado na

terapêutica.24 Nestes exemplos, percebe-se claramente que a introdução do núcleo 2-

isoxazolina foi responsável pelo incremento da atividade antiinflamatória apresentada

pelo núcleo esteroidal.

ON

O

NSO2NH2

HN NH2

H

NN

19

11

20 21

O

O

EtO

O

ON

F

O

O

OH

EtO

O

ON

F

A fosfolipase A2 consiste em uma classe de enzimas que catalisa a hidrólise de

fosfolipídios da membrana celular no Ácido Araquidônico, este é metabolizado pelas

Ciclooxigenases 1 e 2 (COX) e Lipoxigenases, na produção dos mediadores

inflamatórios, tais como prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos etc. Substâncias

capazes de inibir o desencadeamento dos processos inflamatórios são conhecidas como

Agentes Antiinflamatórios.

Novos derivados de 2-isoxazolinas apresentaram ação inibitória da fosfolipase

A2, impedindo assim a formação do processo inflamatório. Alguns protótipos,

representados pelas substâncias 22 e 23, tiveram ação antiinflamatória bastante superior

ao padrão Ácido Ursólico. 25

NN

Bu

Cl

NO CN

NN

Bu

Cl

NO Ph

22 23

Derivados de 2-isoxazolinas, representados pela substância 24, apresentaram

atividades inibidoras de enzimas proteolíticas, envolvidas em processos inflamatórios

crônicos, como artrite reumática, enfisema pulmonar, entre outros, relatados por

Groutas et all. 26

N

O

O

O

OSO2Me

24

12

2.2 – DERIVADOS DE HIDRAZONAS

Diante de relatos da literatura derivados de hidrazonas têm mostrado que

apresentam diversos potenciais farmacológicos; como atividade antimicrobiana,

antifúngica, antiagregante, antitumoral, antiturbeculose, antiinflamatória e analgésica. 27

Nas últimas décadas a crescente prevalência de várias drogas resistentes

infecções microbianas tornou-se um grave problema de saúde. A busca de novos

agentes antimicrobianos permanecerá como uma importante e difícil tarefa para química

medicinal. 5

Uma série de compostos hidrazônicos 25 e 26 derivadas da hidrazida 1,2-

benzotiazol, foram sintetizadas por Vicini et all e a avaliação da atividade antibacteriana

e antifúngica revelou uma potente ação antimicrobiana, expressa pelos valores da

Concentração Mínima Inibitória (CMI), comprovando a importância do grupo

hidrazona para atividade. 28

N

S

O

N HC Cl

N

S

NHO

N HC

NO2

25 26

Atividade antibacteriana de hidrazidas e hidrazonas é também relatada por

vários outros autores. 29, 30

Güniz et all relatam em vários trabalhos, atividade antituberculose para várias

hidrazonas. A hidrazona 27 apresenta percentual de inibição da Mycobacterium

tuberculosis semelhante ao antibiótico rifampicina. 31

NN

H3C

O

H3C O

N

O

N O

H

H

27

13

O Composto 28 é um anti-séptico intestinal, enquanto que o 29 apresentou uma

alta atividade inibitória em ratos infectados com diferentes cepas de Mycobacterium

tuberculosis H37Rv. 32

HON N

H OH

O

NO2

28 29

N N

H OH

O

NO2

N

Uma série da arilhidrazona foi sintetizada, a fim de determinar as suas

propriedades antimicrobianas. O Composto 30 apresentou uma significativa atividade

contra o Estafilococos aureus, enquanto que 31 apresentou uma boa atividade contra o

Micobacterium fortuitum.33 Comprova com isso da importância da estrutura hidrazônica

para o incremento do potencial biológico.

�

�

�

S

�

�H

O

O

OH

�

�

�

O

�

�H

O

H

O

O

30 31

Seis Análogos do composto 32 foram sintetizados através da variação do

substituinte na posição para do grupamento benzoíla e do heteroátomo do anel

heterocíclico. Foram feitos vários testes microbiológicos e os compostos apresentaram

atividade antimicrobiana contra o Estafilococos aureus ATCC 25923, na concentração

de 0.16-63.00 µ g / mL. 34

RN

O

N

H

H

XNO2

32

14

A hidrazona 33 foi testada em diversos microorganismos e apresentou atividade,

contra o Estafilococus aureus, semelhante à ceftriaxona que é uma cefalosporina de

terceira geração, muito utilizada em infecções por microrganismos gram positivo e

negativo. 35

FN

O

N

H

H

ONO2

33

Uma série de derivados de hidrazona, sintetizada a partir de derivados do

colesterol 34, foi avaliada quanto à atividade contra diversos microorganismos

patógenos. Os derivados do Tosil-hidrazona colesterol foram os compostos que

apresentaram melhores resultados contra a Candida albicans. 36

N

NHR

34

Uma variedade de drogas antitumorais está atualmente em uso clínico. A

procura de novas drogas conduziu à descoberta de novas hidrazonas com esse potencial

biológico, como a hidrazona 35. Alguns desses novos compostos mostraram inibição

máxima de até 70% do crescimento tumoral. 37

N

N

HO

H

NO2

NO2

35

15

Outras substâncias, sintetizadas recentemente, também apresentaram atividades

antitumorais. O mais ativo dos compostos da série foi a hidrazona heterocíclica 36a, que

apresentou uma excelente inibição do crescimento tumoral, contra todas as linhagens de

células utilizadas. 38

N

N

N

N

S

CH3H

N

N

N

N

S

H

CH336a 36b

A hidrazona 37 foi testada para averiguar a atividade antitumoral. Esse

composto apresentou uma potente ação de inibição proliferativa contra diversas

linhagens celulares, apresentando uma potencia semelhante à Mercaptopurina contra os

tumores hematológicos. 39

NS

NH

O

N

HO

H

37

Um novo composto bioativo da série �-aci-lhidrazona 38 apresentou um

excelente potencial biológico para atividade cardiovascular. Esse composto 38a

apresentou-se sete vezes mais potente do que algumas drogas comerciais utilizadas para

atividades ionotrópicas e vasodilatadoras. 40

O

O

N

O

N

H

SCH3

38a

16

Os antiinflamatórios não esteróidais (AINES) têm uma ampla utilização clínica

para o tratamento de diversos tipos de patologia.

Existem duas isoformas de ciclooxigenase (COX) que é a COX1 e a COX2.

Estas enzimas são responsáveis por processos biológicos e inflamatórios do nosso

organismo. Portanto, com a inibição das COX teríamos um bloqueio na produção de

mediadores da inflamação.

A �-(2-piridinil)-hidrazona 39 apresentou uma inibição do processo inflamatório

de 79 % na dose de 80,1 µ mol / kg.

Algumas evidências sugerem que o grupamento hidrazona presentes nestes

compostos possuem um caráter farmacofórico para a inibição da COX. Os autores

também descreveram resultados relativos ao mecanismo de ação dessa série e seus

derivados na agregação plaquetária. Foi sugerido o mecanismo de complexação ao

cálcio. Por fim o composto 39 foi capaz de se complexar ao Ca+2, in vitro, na

concentração de 100 µ M. Isso é um indicativo de que a série destes compostos pode

apresentar uma atividade antiagregante plaquetária. 41

N N

H

N

H

O

39

Uma nova série de compostos, que pertencem à classe das �-acil-aril-hidrazonas

40, foram sintetizadas a partir do composto natural safrol e submetida a testes de

analgesia. Os resultados foram excelentes, apresentando potencial analgésico superior à

dipirona e indometacina, que são drogas utilizadas como padrão, para testes de

analgesia e inflamação respectivamente. 42

O

ON

O

N H

NCH3CH3

H

40

17

A atividade anti-plaquetária de derivados tricíclicos acil-hidrazona 41 foi

avaliada pela sua capacidade de inibir a agregação plaquetária do plasma de coelhos,

rico em plaquetas induzidas pelo FAP (fator de agregação plaquetária), na concentração

de 50 nM. Foi evidenciado, com os resultados, que dois derivados do composto 41, que

foram avaliados na concentraçao 10 µ M, apresentaram, respectivamente, 10,4 e 13,6%

de potencial na inibição. 43

NN N

S

NN

HAr

H

OH

OH3C

H

41

Barrreiro et all relataram a síntese de novas aril-hidrazonas 44 e acil-aril-

hidrazonas 45, sendo observados excelentes resultados para atividade analgésica. A

analgesia proporcionada pela arilhidrazona 42 foi muito próxima da obtida com a

dipirona. Já a analgesia observada com a acil-arilhidrazona 43 foi superior ao efeito da

dipirona.

NN

N

Ph

H3CHN

N

H

OCH3

NN

N

Ph

H3C

N

O

N

O

O

H

42 43

A atividade anticonvulsivante também tem sido relatada para compostos

híbridos de hidrazonas. Dimmock et all sintetizaram uma série �-acetil-hidrazonas,

onde o composto 44 apresentou uma excelente atividade anticovusivante, sendo assim

um possível candidato a um novo fármaco. Os resultados obtidos revelaram que �-

acetil-hidrazonas são mais promissoras para esta atividade. 46

18

CN

NH3C

O

H

Cl44

A hidrazona 45, obtida por Çakir et all, também apresentou atividade

anticonvulsivante significativa, sendo evidenciada a importância da porção hidrazona

para esta atividade. 47

N

S

O

O

NH N CH3

45

Sendo conhecidas as atividades farmacológicos das isoxazolinas pirrolidínicas

biciclas, sintetizadas em nosso laboratório 9, como discutido anteriormente, acreditamos

que a junção da funcionalidade hidrazona, no qual foi relatada na literatura como grupo

farmacofórico, à porção éster da isoxazolina bicíclica em C3, seja de grande

importância farmacológica para estes inéditos heterociclos.

R1Porção hidrazônica

Pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina(núcleo base das novas drogas)

N

N

O

R2

NHN

HH

H

Figura 04 – Fusão do biciclo isoxazolínico com a porção hidrazônica

OBJETIVOS

20

3- OBJETIVOS

3.1 - Objetivos Gerais

Exploração química e biológica do heterociclo 2-isoxazolina aza-bicíclica,

introduzindo o grupamento hidrazona, conhecido farmacóforo para atividade analgésica,

através da modificação molecular (hibridação).

3.2 - Objetivos específicos

• Síntese do material de partida, o enecarbamato �-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina

48.

• Síntese do éster isoxazolínico 49, através de reação de cicloadição 1,3-dipolar do

enecarbamato 48 com óxido de nitrila CEFNO.

• Redução da função éster em C3 da isoxazolina 49, ao respectivo aldeído

isoxazolínico 53.

• Condensação dos aldeídos isoxazolínicos 53 com hidrazinas aromáticas, para

produção das isoxazolil-aril-hidrazonas 54.

• Purificação e determinação de algumas propriedades físico-químicas (ponto de

fusão e Rf) e elucidação estrutural de todas as substâncias acima por

espectrometria de RMN, e IV.

• Avaliação da atividade analgésica e toxicidade dos novos híbridos isoxazolil-

aril-hidrazonas 54 sintetizados.

ESTUDO QUÍMICO

22

4 – METODOLOGIA

Como mencionado anteriormente, segundo a literatura, derivados hidrazonas

apresentam inúmeras atividades biológicas, entre elas antiinflamatória e analgésica. A

introdução dessa funcionalidade em derivados do novo heterociclo pirrolidina[3,2-d]-2-

isoxazolina, obtido em nossos estudos prévios, poderá possivelmente incrementar ou

induzir novas atividades biológicas, visto que as novas amidas isoxazolínicas 1,

contendo o novo heterociclo, se mostraram intensamente ativas no organismo vivo

(testes de atividades antiinflamatória e analgésica).

Vale salientar que a função hidrazona dos derivados descritos na literatura se

apresenta como farmacóforo dos mesmos, tendo anéis aromáticos como núcleos base.

Nossos derivados obtidos, anteriormente, não possuem núcleo aromático, mas sim uma

isoxazolina bicíclica, além de dois diferentes sítios de susbtituição (porção benzoila e

porção fenílica da hidrazona).

Diante disso, foi feita a junção do nosso núcleo (isoxazolínico) �-benzoilado

com a funcionalidade hidrazona (farmacóforo), e avaliado se houve a manutenção ou

incremento das atividades anti-inflamatória e analgésica (figura 04).

N

N

O

O

NHN

HH

H

R1

R2

hidrazonafarmacóforo(analgesia)

pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina(núcleo base das novas drogas)

benzoila

Figura 05 - Isoxazolil-aril-hidrazonas

23

Foram utilizados os derivados isoxazolínicos já estudados em nosso grupo, com

o grupamento R2 variando em posição para (Cl, F) e também hidrazinas para-

substituídas, variando-se o grupamento R1 (Cl, F, OMe).

Os substituintes “R“ variam, desde grupamentos elétron-atratores a elétron-

doadores, para averiguarmos possíveis diferenças reacionais na formação das

hidrazonas, assim como diferenças nas atividades biológicas das mesmas, devido aos

efeitos eletrônicos.

N

N

O

OO

H

HH

50

b

N

O

N

O

H

H

NHN

H

R2

R1

5453

N

O

N

O

O

H

H

H

R2

c

N

OO

48

N N

N

47

N

H

46

a

de

f

g h

N

O

N

O

H

H

OH

R2

52

N

N

O

OO

H

H

O

R2 49

N

O O

N

O

OO

H

H

51

Figura 06 - Esquema sintético utilizado na preparação das isoxazoil-aril-hidrazonas.

24

O enecarbamato 48, material de partida de nosso trabalho, foi obtido a partir da

pirrolidina 46. 48, 49 Após a cicloadição 1,3-dipolar do enecarbamato 48 com óxido de

nitrila, o cicloaduto isoxazolínico 49 foi obtido. 50

Para a introdução dos grupamentos benzoíla em N6, fez-se necessária

primeiramente, uma hidrogenólise do grupo Cbz. Os derivados �-benzoilados 51

obtidos tiveram a funcionalidade éster em C3 reduzida aos respectivos álcoois 52. 51

A oxidação de Swern, dos álcoois 52, propiciou a obtenção dos aldeídos 53, que

após condensação com algumas fenil-hidrazinas para-substituídas, levou à formação

dos compostos híbridos 54, as isoxazolil-aril-hidrazonas. 52,53,54 Seis hidrazonas 54

foram obtidas, variando-se os grupamentos R1 e R2.

25

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 - OBTENÇÃO DO ÉSTER ISOXAZOLÍNICO BICÍCLICO 49 :

N

H

N N

NN

OO

O

N

N

OO

O O

84% 67%71%

a b c

46 47 48 49

Esquema 01

Para obtenção do éster 49, material de partida de nosso trabalho, foi utilizada a

metodologia desenvolvida e amplamente dominada por nosso grupo, já relatada em

trabalhos anteriores.

O éster isoxazolínico 49 foi obtido em quantidades multi-gramas a partir do

enecarbamato endociclico 48, através de reação de cicloadição 1,3-dipolar (reação c).

5.1.2 - PREPARAÇÃO DO TRÍMERO DA 1-PIRROLI�A 47 55

N N

N

47

A ∆1-pirrolina 46a, intermediário chave na síntese dos enecarbamatos e

enamidas endocíclicas de 5 membros, foi obtida através da oxidação catalítica da

pirrolidina, pelo perssulfato de sódio, em meio básico e AgNO3 como catalisador.

26

Devido à sua grande reatividade e instabilidade, o monômero 46a trimeriza no

meio reacional, formando o respectivo trímero 47, que é isolado convenientemente. 56

N

H

N N

N

N

25%Na2S2O8

NaOH(aq)AgNO3 cat.

00CH2O

84%

46 46a 47

Esquema 02

5.1.3 - SÍNTESE DO ENECARBAMATO ENDOCÍCLICO N- (benziloxicarbonil)-2-

pirrolina 48 48, 49

N N

N

N

O O

Cloroformatode benzila

- 780CTEA

67%

4847

Esquema 03

O Enecarbamato endocíclico de 5 membros 48, utilizado neste trabalho, foi

obtido através da �-acilação da ∆1-pirrolina 46a , à -78°C. De início, foi feita a

oxidação da pirrolidina 46 comercial, em seguida, devido à intabilidade da 1-pirrolina,

seu trímero 47 foi utilizado prontamente para a obtenção do enecarbamato 48.

5.1.4 - SÍNTESE DO CLOROOXIMIDOACETATO DE ETILA 56, PRECURSOR DO N-

ÓXIDO DE NITRILA – CEFNO. 56

Cl H3N

OEt

O

EtOCl

N

O

OH

1) HCl conc.

2) NaNO2

Agitação

55 %55 56

0 0C

Esquema 04

27

O óxido de carboetoxiformonitrila (CEFNO), utilizado na reação de cicloadição

1,3-dipolar, foi obtido in situ, através do seu precursor clorooximidoacetato de etila 56.

O precursor do �-óxido de nitrila, clorooximidoacetato de etila 56, foi preparado

através da oxidação da glicina esterificada 55, por nitrito de sódio, em meio ácido (HCl

conc..).

Devido a sua grande estabilidade, ele pode ser armazenado em grandes

quantidades por longo período e utilizado conforme necessidade. O precursor do dipolo

foi obtido como cristais brancos por cristalização em hexano, com um rendimento de

55%, conforme a literatura.

5.1.5 - SÍNTESE DO ÉSTER ISOXASOLINÍCO 49, VIA REAÇÃO DE CICLOADIÇÃO

1,3-DIPOLAR 50

60a

CO2Et

C

N

O

O

N

N

OO

O O

N

OO

48 49

Clorofórmiot.a.71%

Clorooximidoacetato de etilaTEA

Esquema 05

A síntese do éster isoxazolínico 49 procedeu-se através da reação de cicloadição

1,3-dipolar do enecarbamato 48 com o óxido de nitrila CEFNO 55a, esta reação foi

desenvolvida por nosso grupo de pesquisa e relatada em trabalhos anteriores.

O cicladuto 49 foi sintetizado de forma régio e diasteroespecífica, obtendo-se o

racemato do mesmo. O �-óxido de nitrila, CEFNO 55a, é formado in situ a partir de seu

precursor clorooximidoacetato de etila.

28

5.2 - DESPROTEÇÃO DA AMINA SECUNDÁRIA EM N6.

O

N

N

H

OO

O

N

N

OO

O O

4950

t.a.

Pdº/C

MeOH

H2

Quantitativo.

Esquema 06

Esta desproteção foi realizada com intuito de não termos a necessidade de

realizarmos várias reações de cicloadição, com diversas �-benzoil-enamidas. Desta

forma, as �-benzoil-isoxazolinas poderiam ser obtidas através da �-benzoilação da

amina secundária desprotegida 50 com os respectivos cloretos de benzoila para-

substituídos. As reações de �-benzoilação são menos dispediosas e menos trabalhosas

do que as reações de síntese de diferentes enamidas.

A hidrogenólise, do grupo Cbz de 49, ocorreu de forma quantitativa, sendo o

produto 50 utilizado sem prévia purificação.

.

5.3 - N-BENZOILAÇÃO DA ISOXAZOLINA DESPROTEGIDA 50 COM CLORETOS

DE BENZOILA PARA SUBSTITUÍDOS.

O

N

N

H

OO

O

N

N

OO

O

R2

50 51

O Cl

R2

TEA(seco)

CHCl3(seco)

t.a.

Esquema 07

COMPOSTO SUBSTITUI�TE RE�DIME�TO (%)

51a R2 =Cl 85 %

51b R2 = F 78 %

Tabela 01 – Substituintes e rendimentos das N-benzoil-isoxazolinas 51

29

As �-benzoil-isoxazolinas 51a e 51b poderiam ser obtidas a partir das

respectivas �-benzoil-enamidas, através de reações de cicloadição 1,3-dipolar. No

entanto, duas enamidas deveriam ser sintetizadas, uma para cada �-benzoil-isoxazolina,

de acordo com o grupamento R2. As reações de �-benzoilação são simples, rápidas e

apresentam excelentes rendimentos.

5.4 - SÍNTESE DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 52. 51

O

N

N

OO

O

R1

00CMeOH

NaBH4

51 52

O

N

N

OH

O

R1

Esquema 08


52a R2 =Cl 77 %

52b R2 = F 86 %

Tabela 02 - Substituintes e rendimentos dos álcoois isoxazolínicos 52

Como mencionado na metodologia deste trabalho, a tentativa de redução direta

do éster em C3 ao respectivo aldeído foi infrutífera. Utilizando-se DIBAL-H ou

superhidreto [(Et3AlH)Li], o éster 51 permaneceu intacto no meio reacional. Uma

possibilidade para contornar este problema, seria a redução do éster ao respectivo álcool

52 em C3.

A utilização de um redutor forte tipo LiAlH4, seria incoveniente, pois, além do

éster em C3, a amida em C7 também seria reduzida.

Tentou-se a redução com NaBH4, no qual ocorreu a redução seletiva do éster em

C3. No entanto, dependendo da qualidade do NaBH4 utilizado, ocorria uma

transesterificação, formando o éster metílico em C3 (metanol foi utilizado como

solvente). O éster metílico, ligeiramente mais polar que o éster etílico, foi caracterizado

30

por 1H RMN. Portanto, ao utililizarmos o redutor NaBH4 de melhor procedência, o

álcool em C3 foi produzido sem maiores empecilhos.

A transesterificação, provavelmente ocorreu com NaBH4 de baixa qualidade,

devido à presença de ácido de Lewis BH3, ou alguns de seus derivados. Apesar da

redução de éster com NaBH4 ao respectivo álcool não ser tão trivial, temos verificado

em outros trabalhos de nosso grupo de pesquisa, uma reatividade bem peculiar deste

“imino-éster”, inclusive amonólise seletiva do éster em C3, quando outra

funcionalidade éster está presente na estrutura.

Durante o processo de otimização da redução, evidenciou-se a necessidade de

elevação da temperatura até a temperatura ambiente, verificando-se que após alguns

minutos de agitação nessas condições, todo o material de partida havia sido consumido.

Os hidrogênios diasteroisotópicos do grupamento hidroximetila dos álcoois 52

apresentaram-se como dubletos em 1H RMN, em 4,35 e 4,45 ppm respectivamente, com

uma constante de acoplamento de 14 Hz. Os álcoois 52 também apresentaram nos

espectros de IVFT, bandas características em torno de 3505 cm-1, relativamente finas e

intensas, caracterizando o estiramento da ligação O-H do grupamento hidroximetila em

C3, além do desaparecimento da banda intensa em 1715 cm-1, referente à carbonila do

éster em C3.

5.5 - OBTENÇÃO DOS ALDEÍDOS ISOXAZOLÍNICOS 53, ATRAVÉS DA

OXIDAÇÃO DE SWERN DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 52 52

O

N

N

OH

O

R2

53

DMSOTEA

cloreto de oxalila

CH2Cl2

-600C

52

O

N

N

H

O

R2

O

Esquema 09


53a R2 =Cl 74 %

53b R2 = F 82 %

Tabela 03 - Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos

31

A primeira tentativa de obtenção dos aldeídos isoxazolínicos, foi realizada

através da redução direta dos ésteres 51, aos aldeídos 53, utilizando-se DIBAL ou super

hidreto. Porém, nenhum desses dois redutores levou aos aldeídos desejados, o que nos

forçou a tentarmos reduzir os ésteres 51 aos respectivos álcoois 52, para uma posterior

oxidação aos aldeídos isoxazolínicos 53.

A oxidação de Swern de 52 é uma oxidação branda, que nos permitiu chegarmos

aos aldeídos isoxazolínicos 53 com ótimos rendimentos, sem a possibilidade de formar

o ácido carboxílico, o que poderia acontecer se utilizássemos outros oxidantes.

Diante do sucesso da oxidação de Swern, do álcool em C3, optou-se

definitivamente por essa rota sintética, que propiciou a obtenção dos aldeídos,

imprescindíveis para as condensações posteriores.

Utilizou-se o procedimento experimental padrão da oxidação de Swern. Foram

sintetizados dois novos aldeídos isoxazolínicos, em C3, o que propiciou,

posteriormente, nas reações de condensações com diferentes fenil-hidrazinas para-

substituídas, a obtenção das isoxazolil-hidrazonas com dois sítios distintos de

substituição.

A oxidação de Swern dos álcoois 52 foi muito bem sucedida e os respectivos

aldeídos 53 foram caracterizados, principalmente pelos sinais em 9,8 ppm e 185 ppm

nos espectros de 1H e 13C RMN, respectivamente. Em relação aos espectros no IVFT, os

aldeídos 53 apresentaram uma banda intensa em 1710 cm-1, característica do

estiramento da carbonila do aldeído, que não havia no álcool de partida.

5.6 - OBTENÇÃO DE ISOXAZOLIL-HIDRAZONAS DE 5 MEMBROS 54. 53, 54

N

H2N

H

R1

N

O

N

O

HO

R2

N

O

N

O

N

R2

H

NH

R1

EtOH

HCl

53 54

t.a.

Esquema 10

32

Tabela 04 - Substituintes e rendimentos das isoxazolil-hidrazonas

As isoxazolil-hidrazonas 54 foram obtidas a partir da condensação dos aldeídos

isoxazolínicos 53 com as fenil-hidrazinas p-substituídas. A reação se processou

rapidamente, ocorrendo precipitação da hidrazona no meio reacional em cerca de 40

minutos. Após a filtração e lavagem do precipitado, as isoxazolil-hidrazonas 54 foram

obtidas como sólidos (bege à amarelo), que foi purificado e devidamente identificado

por espectrometria de RMN e I.V.

Os rendimentos das reações de condensação apresentaram-se dentro da faixa que

é relatada na literatura 53, 54, para outras hidrazonas em torno de 50%-60%, para

condensações similares com outros aldeídos, no entanto, o composto 54f apresentou

40%, considerado um pouco abaixo do esperado. Mas isso se deve, provavelmente, ao

processo de purificação, pois durante o procedimento ocorreram algumas perdas do

produto. Esses compostos ainda podem apresentar melhores rendimentos, ao ser feito

um aprimoramento do processo de purificação.

Houve formação de um único produto de condensação, conforme CCD e análise

dos espectros de RMN. Muito provavelmente, apenas a hidrazona diasteroisomérica de

configuração “E” tenha sido formada, devido a questões cinético-termodinâmicas.

Como isoxazolil-hidrazonas ainda não foram descritas na literatura, não temos como

fazer analogia de deslocamentos químicos dos hidrogênios HC=N de outras hidrazonas,

que porventura já possuíssem sua estereoquímica relativa determinada, visto que temos

uma peculiaridade estrutural, pois a função hidrazona em nossas estruturas pertence a

uma espécie de heterodieno associado à isoxazolina. Outro fato, é que, os hidrogênios

HC=N têm seus sinais geralmente coincidentes com os sinais dos hidrogênios

aromáticos, sendo detectada a presença dos mesmos pela integração dos sinais. Diante

desses fatos, estamos tentando obter cristais das hidrazonas, para a obtenção da difração

de raio-X das mesmas, visando a confirmação da estereoquímica relativa. No entanto,

COMPOSTO SUBSTITUI�TES RE�DIME�TO (%)

54a (R1 =Cl, R2 = Cl) 54

54b (R1 =F, R2 = Cl) 52

54c (R1 = OMe, R2 = Cl ) 49

54d (R1 = Cl, R2 = F ) 56

54e (R1 =F, R2 =F) 53

54f (R1 = OMe, R2 = F ) 40

33

todas as hidrazonas isoxazolínicas 54 apresentaram um singleto próximo à 11 ppm em 1H RMN, correspondendo ao hidrogênio NN-H da função hidrazona, conforme

deslocamentos químicos descritos na literatura para NN-H, de outras hidrazonas. Com

relação aos espectros de IVFT, bandas finas e relativamente intensas, correspondentes

ao estiramento NN-H, estão presentes entre 3240-3270 cm-1, confirmando assim, a

função hidrazona nas estruturas dos híbridos 54.

A caracterização do biciclo pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina, presente no

cicloaduto 49 e também em 50, 51, 52, 53 e 54, se faz facilmente através de

espectrometria de RMN, nas quais, sinais diagnósticos da formação do cicloaduto são

evidentes, como um dubleto próximo a 6,5 ppm em 1H RMN, referente ao H6a e um

sinal próximo a 95 ppm em 13C RMN, referente ao C6a. Com exceção da isoxazolina

desprotegida 50, todos os derivados isoxazolínicos 49, 51, 52, 53 e 54 possuem uma

função amida ou carbamato em N6. Este fato fez com que os mesmos apresentassem

sinais de rotâmeros em 1H e 13C RMN. A presença de rotâmeros, devido à alta barreira

rotacional energética das ligações amídicas e carbamídicas, deixa os espectros de RMN

complexos.16 No entanto, quando os espectros foram obtidos à 60oC, ocorreu total

coalescência dos sinais de rotâmeros. Outra peculiaridade dos espectros de RMN, foi a

deformação do sinal do H6, assim como de outros hidrogênios exocíclicos do biciclo e

também baixa resolução dos sinais dos carbonos do anel bicíclico.

34

6 - PROCEDIME�TOS EXPERIME�TAIS

6.1. - MATERIAS E MÉTODOS

As reações de síntese de enecarbamatos, as de cicloadição, as de formação dos

álcoois e as de formação dos aldeídos são extremamente sensíveis à umidade e foram

realizadas sob atmosfera de argônio, em aparato previamente seco em estufa por 4h

(120°C). As reações de síntese das hidrazonas não tiveram essas precauções em relação

à umidade.

Clorofórmio e trietilamina foram tratados com hidreto de cálcio e destilados

antes do uso. Metanol foi seco com Mg°/I2. O THF foi tratado com sódio/benzofenona e

destilado imediatamente antes do uso. O DMSO foi seco sob peneira molecular 4

angstron, previamente seca em estufa por 24 h.

Nas reações de condensação dos aldeídos com as fenilhidrazinas foi utilizado o

etanol absoluto como solvente, sem necessidade de uma pré-secagem.

As reações de hidrogenólise foram realizadas sob pressão positiva de hidrogênio,

borbulhando-se o gás no meio reacional por cerca de 1 hora.

Acetato de etila e Hexano, utilizados nas colunas cromatográficas, foram

bidestilados.

A análise por cromatografia em camada fina (CCF) foi efetuada em

cromatofolhas de alumínio (gel de sílica 60), com espessura de 0,2 mm, contendo

indicador para 254 nm. A visualização das manchas foi efetuada com lâmpada de U.V.

ENF – 2400 C/F, ácido fosfomolíbdico 7% em etanol, seguido de aquecimento ou por

absorção de iodo.

As colunas cromatográficas foram empacotadas com gel de sílica 60 (230 – 400

mesh) e eluidas sob pressão (Flash).

Os produtos sólidos tiveram seu ponto de fusão aferidos em aparelhos POLAX

WRS – 1, e não foram corrigidos.

Os espectros no infravermelho (I.V.) foram obtidos em aparelhos Bruker IFS 66

(transformada de Fourier), com as freqüências de absorção sendo expressas em cm-1,

utilizando-se pastilhas ou janelas de KBr.

Os espectros de 1H RMN e 13C RMN foram obtidos em aparelhos Varia Unity

300 MHz. Os deslocamentos químicos (δ) são expressos em ppm, tendo como padrão

interno o tetrametilsilano ou clorofórmio para 1H RMN e DMSO ou CHCl3 para 13C

35

RMN. Os sinais dos espectros de 1H RMN são designados da seguinte forma:

deslocamento químico (ppm), multiplicidade (s = singleto, d = dubleto, dl = dubleto

largo, t = tripleto, tl = tripleto largo, q = quarteto, dd = duplo dubleto, dt = duplo

tripleto, ddl = duplo dubleto largo, m = multipleto, ml = multipleto largo, sl = sinal

largo), constante de acoplamento (Hz) e números de hidrogênios

6.2 - TRÍMERO DA ∆1-PIRROLI�A (ISÔMERO α) 47

�

H

� �

�

46 47

6.2.1 - Preparação do trímero da ∆1-pirrolina.

Uma solução aquosa de perssulfato de sódio 25% (33,82g; 144 mmols; 90 mL

água) foi adicionada lentamente e sob forte agitação, sobre uma solução de pirrolidina

(11,6 mL; 144 mmols), hidróxido de sódio (11,50 g; 288 mmols) e nitrato de prata

(0,118 g; 0,65 mmols) em 90 mL de água à 0°C. Ao término da adição, a solução foi

deixada em agitação por mais 1 hora a 0°C e em seguida por mais 1 hora à temperatura

ambiente.

A solução escura resultante foi extraída com diclorometano (3x40 mL). Secou-

se a fase orgânica sob sulfato de sódio anidro e após remoção do solvente obteve-se

8,1g de um líquido amarelado viscoso, correspondendo a um rendimento de 84 % do

trímero 47.

O trímero 47 é utilizado, o mais rápido possível, sem qualquer purificação

adicional, na preparação do enecarbamato �-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina, devido a

sua instabilidade.

Propriedades Físicas de 47

- Óleo amarelo viscoso;

- Sensível a solventes próticos.

36

DADOS ESPECTROMÉTRICOS

1H RM� (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.).

(parte do monômero está presente, devido ao equilíbrio).

1,75 (m); 2,28 (m); 2,50 (m); 2,99 (m); 3,82(m); 7,59 (s).

6.3 - �-(BE�ZILOXICARBO�IL)-2-PIRROLI�A 48

N N

NN

OO

47 48

A solução do trímero da 1-pirrolina 47 foi codestilada (8,1 g; 39,1 mmols; 237

mL de THF seco), recolhendo-se o destilado em um recipiente pré-resfriado à -78°C,

contendo trietilamina (10,9 mL; 78,2 mmols). Após o término da destilação, adicionou-

se lentamente, via seringa, sobre o destilado ainda à -78°C, a solução 50% cloroformato

de benzila em tolueno (26,7 mL; 78,2 mmols). Deixou-se a suspensão resultante em

agitação durante toda noite, aquecendo gradualmente à temperatura ambiente.

A suspensão foi filtrada em funil sinterizado e após remoção do solvente,

obteve-se um óleo amarelado. O cloreto de benzila, presente como subproduto, foi

removido por filtração simples em coluna cromatográfica, utilizando-se apenas hexano.

Logo após, o produto residual foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de

sílica, AcOEt/hexano 1: 9). Obteve-se 5,32 g de um líquido incolor correspondendo a

um rendimento de 67% do enecarbamato 48.


- Óleo incolor

- Rf = 0,26 (AcOEt/hexano 1: 9)

37


1H RM� (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.

2,64 (ql; J = 9,7 Hz; 2H); 3,77 (q; J = 9,1 Hz; 2H); 5,02 e 5,07 (m, 1H, rotâmeros); 5,17

(s; 2H); 6,54 e 6,63 (m, 1H, rotâmeros); 7,35 (m; 5H).

I.V. (filme, cm-1), principais sinais.

3.032, 2.956, 1.706, 1.618, 1.422, 1.342, 1.214, 1.128, 756, 698.

6.4 - CLOROOXIMIDOACETATO DE ETILA 56

E tOC l

NO H

O

C l H 3NO E t

O

55 56

Em um balão de 250 mL foi adicionado o cloridrato do éster etílico da glicina 55

(10,2g; 73 mmols), água destilada (15 mL) e ácido clorídrico concentrado (6,3 mL; 73

mmols). Em seguida resfriou-se essa solução em banho de gelo/NH4Cl. Sob forte

agitação e mantendo-se a temperatura do banho nunca acima de 0° C, adicionou-se

lentamente, via funil de adição, a solução de nitrito de sódio (5,1g; 73 mmols; 9 mL de

água). Ao término desta adição repetiu-se o processo, adicionando-se mais um

equivalente de HCl concentrado e de nitrito de sódio. Deixou-se a solução resultante

em agitação por mais 15 min à mesma temperatura. Em seguida o produto foi extraído

com clorofórmio (4 x 40 mL) e seco sob sulfato de sódio anidro.

Após remoção do solvente, ocorreu intensa precipitação de cristais brancos,

após a adição de hexano, onde esses foram lavados com hexano e secos sob vácuo.

Obteve-se 5g do produto identificado como 56, correspondendo a um rendimento de

45%.


- Ponto de Fusão 80° C, conforme literatura.

38

6.5 - ÉSTER 6-BE�ZIL-3-ETIL DO ÁCIDO 3a,4,5,6a-TETRAHIDROPIRROLO [3,2-

d]ISOXAZOL-3,6-DICARBOXÍLICO 49

O

N

N

OO

O O

N

OO

4948

A um balão de 250 ml, acoplado com funil de adição com equalizador de

pressão e agitador magnético, foi adicionado o enecarbamato 48 (4,94g; 24,33 mmols),

trietilamina (6,2 ml; 44,16 mmols, 10% de excesso em relação ao precursor do dipolo) e

clorofórmio seco (104 ml). A esta solução, sob forte agitação, foi adicionada

lentamente, durante 2h, a solução clorofórmica do clorooximidoacetato de etila 56,

precursor do dipolo 56a, (6,08g; 40,15 mmols; 34 ml de CHCl3 seco). A reação foi

acompanhada através de CCD, onde se percebeu a formação do produto, cicloaduto,

desde o início da adição do precursor 56a do �-óxido de nitrila.

Após 2 horas de reação e total consumo do material de partida, removeu-se o

solvente. O sal formado, cloreto de trietilamônio, foi filtrado em funil sinterizado,

utilizando-se uma mistura de acetato de etila/hexano a 40%. Após remoção do solvente,

obteve-se um óleo amarelo escuro e bastante viscoso. O produto bruto foi submetido à

cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 2:3). Obteve-se 5,44g do

cicloaduto 49, correspondendo a um rendimento de 71%.


- Óleo amarelo claro viscoso

- Rf = 0,47 (AcOEt/hexano 1:1)

DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1H RM� (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.

7,36 (m; 5H); 6,53 e 6,42 (d; J=7,5Hz; 1H; rotâmeros); 5,2 (m; 2H); 4,36 (m; 2H); 4,08 (m;

1H); 3,84 (m; 1H); 3,18 (dt; J= 11,1Hz; J= 11,1Hz; J=6,3; 1H); 2,23 (m; 2H); 1,37 (t; J=7,2Hz;

3H).

39

6.6 - ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 3a,4,5,6,6a-TETRAHIDROPIRROLO[3,2-

d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 50

O

N

N

H

OO

O

N

N

OO

O O

4950

A um balão de 250 mL foi adicionado o cicloaduto 49 (2,9g; 9,15 mmols),

paládio/carbono 10% (0,149g) e metanol PA (186 mL).

À mistura reacional, sob agitação vigorosa, borbulhou-se o gás hidrogênio

durante 10 minutos. Em seguida, deixou-se a mistura sob pressão positiva de H2 durante

uma hora adicional.

Após remoção do metanol, solubilizou-se o produto com clorofórmio. A solução

clorofórmica foi seca sob sulfato de sódio anidro e filtrada em funil sinterizado.

Após remoção do solvente, obteve-se 2,16g da isoxazolina �-desprotegida 50

pura, correspondendo a um rendimento quantitativo. O composto 50 foi utilizado nas

reações subseqüentes sem necessidade de purificação em coluna cromatográfica.


- Óleo incolor


DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1H RM� (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros. 1H RMN (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.). 6,07 (d; J= 6,9Hz; 1H); 4,32 (m; 2H); 3,87

(m; 1H); 3,12 (m; 1H); 2,81 (ml; 2H); 2,07 (m; 2H); 1,35 (t; J=6Hz; 3H). 13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.).

160,5 (C); 152,3 (C); 100,8 (CH); 61,9 (CH2); 49,1 (CH2); 42,8 (CH); 29,9 (CH2); 14,0

(CH3)

40

6.7 - ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 6-(4-FLUOROBE�ZOIL)-4,5,6a TETRAHIDRO-

3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 51b

O

N

N

OO

O

F

O

N

N

H

OO

50 51b

Em um balão de 250 mL foram solubilizados a isoxazolina �-desprotegida 50

(3,13 g; 17,01 mmols) e trietilamina seca (2,8 mL; 20,00 mmols), em clorofórmio seco

(200 mL). Sob vigorosa agitação, adicionou-se cloreto de 4-fluorobenzoila (2,97 g;

18,71 mmols em 4 mL de clorofórmio), que foi adicionado lentamente durante 10

minutos e sob atmosfera de argônio. A reação foi deixada em seguida sob agitação, à

temperatura ambiente, por mais uma hora adicional.

Após remoção do solvente, o produto foi purificado através de cromatografia em

coluna “flash” (gel de sílica AcOEt/hexano 2:3 no início e depois 1:1) Obteve-se assim

3,77 g do �-(benzoil)-isoxazolina 51b, correspondendo a um rendimento de 78 %.

Propriedades Físicas de 51b

- Óleo amarelo-escuro viscoso



1,38 (t; J = 7,0 Hz; 3H); 2,22 (m; 1H); 2,40 (dd; J = 6,0Hz; J = 13,5Hz; 1H); 3,20 (ml;

1H); 4,12 (t; J = 8,0Hz; 1H); 4,36 (m; 3H); 6,22 (sl; 1H); 7,12 (m; 2H); 7,69 (sl; 2H). 13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

14,08 (CH3); 27,95 (CH2); 43,53 (CH2); 51,19 (CH); 62,4 (CH2); 96,17(CH); 115,6(d; J

= 21,5Hz; CH); 130,4(CH); 164,1(d; J = 250,0Hz; C-F); 131,0(C); 152,4(C);

159,8(C=O); 168,7(C=O).

41

I.V. - FT (janela de KBr, cm-1), principais sinais.

3.030, 2.986, 2.860, 1.721, 1.652, 1.600, 1.509, 1.408, 1.270, 1.131; 931, 853.

6.8 - ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 6-(4-CLOROBE�ZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-

3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 51a

O

N

N

OO

O

Cl

O

N

N

H

OO

50 51a

Procedimento experimental idêntico ao item 6.7

Isoxazolina �-desprotegida 50 (2,96g; 4,89 mmols), trietilamina seca (2,4 mL;

17,14 mmols), clorofórmio seco (200 mL) e cloreto de 4 -clorobenzoila (2,2 mL; 17,695

mmols).

Cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOEt/hexano 2:3), forneceu

1,49g do cicloaduto 51a correspondendo a um rendimento de 92%.

Propriedades Físicas de 51a

- Óleo incolor viscoso


DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1H RM� (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) presença de rotâmeros.

1,36 (t;J = 7,0Hz; 3H); 2,19 (ml; 1H); 2,37 (ddl; J = 5,9Hz; J = 12,9Hz; 1H); 3,17 (sl;

1H); 4,07 (m;1H); 4,35(m; 3H); 6,16 (sl; 1H; rotâmero em 6,97); 7,4 (dl; J = 8,4Hz;

2H); 7,6 (ml; 2H). 13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

14,0(CH3); 27,8(CH2); 43,5(CH2); 51,1(CH); 62,3(CH2); 95,8(CH); 128,6(CH);

129,5(CH); 133,1(C); 137,0(C); 152,2(C); 159,7(C=O); 168,5(C=O).

42


2.985, 1.724, 1.650, 1.591, 1.408, 1.270, 1.180, 1.132, 1.015, 931, 836, 756.

6.9 - OBTE�ÇAO DO ÁLCOOL (4-FLUOROFE�IL)-(3-HIDROXIMETIL-3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-YL-META�O�A 52b

N

N

O

O

F

OO

N

N

O

O

F

OH

51b 52b

A uma solução do éster 51b (3,77g; 12,30 mmols) em metanol (180 mL), a 0ºC e

vigorosa agitação, adicionou-se NaBH4 (1,39; 36,92 mmols) em pequenas porções.

Após a adição, deixou-se em agitação por cerca de 1 hora à 0oC e depois 40 minutos à

t.a. A reação foi acompanhada através de CCD, onde se visualizou a formação do álcool

desde o início da adição do NaBH4. Após completo consumo do éster 51b, remoção do

metanol e solubilização do produto em 50 mL de acetato de etila, adicionou-se 30 mL

de solução saturada de NaCl. Procedeu-se a extração, utilizando-se acetato de etila

(3x40mL). As fases orgânicas foram combinadas e secas sob MgSO4 anidro. Após

filtração e remoção do solvente, obteve-se um óleo incolor bastante viscoso, no qual,

após cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 7:3), obteve-se 2,6g

do respectivo álcool puro 52b, com um rendimento de 86 %





2,06 (m, 1H); 2,27 (dd; J = 12,6; J = 5,7 Hz; 1H); 3,00 (m, 1H) rotâmero em 3,40; 4,00

– 4,20 (m, 2H); 4,24 (m, 2H); 5,39 (t; J = 6,0 Hz; 1H OH); 6,03 (d; J = 7,5 Hz; 1H);

rotâmero em 6,53; 7,33 (m; 2H); 7,67 (m; 2H).

43

13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

25,9 (CH2) rotâmero 27,3; 43,5 (CH2) rotâmero 47,4; 52,8 (CH) rotâmero 50,8; 55,2

(CH2); 92,7 (CH) rotâmero 90,1; 115,3 (d; J = 21Hz; CH); 130,3 (CH); 132,1 (C); 159,9

(C=N); 164,7 e 161,5 (d; J = 240 Hz, C); 167,9 (C=O);


3506, 3052, 2970, 2884, 1639, 1597, 1500, 1415, 1210, 1153, 845 6.10 - OBTE�ÇÃO DO ÁLCOOL (4-CLOROFE�IL)-(3-HIDROXIMETIL-3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-YL-META�O�A 52a

N

N

O

O

Cl

OO

N

N

O

O

Cl

OH

51a 52a


Éster isoxazolínico 51a (4,8g; 14,87 mmols), metanol (180 mL), NaBH4

(1,686g; 44,61 mmols).

Foi obtido um óleo incolor bastante viscoso, no qual, após cromatografia em

coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 7:3), obteve-se 3,2g do respectivo álcool

puro 52a, com um rendimento de 77 %.





2,00 – 2,20 (m, 1H); 2,30 (dd, J = 13 Hz; J = 5,7 Hz; 1H); 2,90 – 3,65 (m, 2H); 4,00 (m,

1H); 4,35 (d; J = 14,1 Hz; 1H); 4,44 (d; J = 14,1; 1H); 5,97 (d; J = 7,0 Hz; 1H) rotâmero

em 6,72; 7,40 (d; J = 8,1 Hz, 2H); 7,64 (dl; J = 8,0 Hz, 2H).

13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

44

26,7 (CH2); 43,4 (CH2) rotâmero em 47; 52,6 (CH); 56,8 (CH2); 93,3 (CH) rotâmero em

91; 128,6 (CH); 129,6 (CH); 133,3 (C); 136,9 (C); 158,9 (C=N); 169,1 (C=O).


3508, 3080, 2970, 2888, 1632, 159, 1505, 1420, 1215, 848.

6.11 - OBTE�ÇÃO DO 6-(4-CLOROBE�ZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-

PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBALDEÍDO 53a

N

N

O

O

Cl

HO

N

N

O

O

Cl

OH

52a 53a

Adicionou-se a um balão, 1,2 mL de cloreto de oxalila (14 mmols) e 26 mL de

CH2Cl2 seco e deixou-se sob agitação à temperatura de –60ºC, sob atmosfera de

argônio. Paralelamente, foram preparadas duas soluções; a primeira (solução 1)

contendo 2 mL de DMSO seco (28,1 mmols) em 6 mL de CH2Cl2 e a segunda (solução

2) contendo o álcool 52a (3,2g; 11,3 mmols) em 7 mL de CH2Cl2 . Adicionou-se a

solução 1 ao balão reacional e deixou-se em agitação por 2 minutos. Em seguida, a

solução 2 foi adicionada lentamente durante 5 minutos, deixando-se em agitação por 15

minutos adicionais. Em seguida, adicionou-se a trietilamina (8 mL; 57mmols),

deixando-se a reação em agitação por 5 minutos. Através de CCD verificou-se que todo

o álcool havia sido consumido, evidenciando-se a formação do aldeído 53a. Após

remoção do solvente, o produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash”

(gel de sílica AcOET/Hexano 1:4), no qual obteve-se 2,350 g do aldeído 53a puro,

correspondendo a um rendimento de 74%


- Sólido amorfo amarelo claro


- Ponto de fusão: 117 – 119 ºC

45


1H RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.

2,00 – 2,40 (m, 2H); 3,07 (m, 1H) rotâmero em 3,94; 4,16 (m, 2H); 6,30 (d; J = 6,6 Hz;

1 H) rotâmero em 6,81; 7,61 (sl; 4H); 9,81 (s, 1H). 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

26,2 (CH2) rotâmeros em 27,6; 43,6 (CH2) rotâmero em 46,7; 48,6 (CH) rotâmero em

47,3; 96,9 (CH) rotâmero em 94,0; 128,6 (CH); 129,6; (CH);

I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1), principais sinais.

3030, 2980, 2861, 1650, 1626, 1580, 1398, 1250, 1090, 915, 843.

6.12 - OBTE�ÇÃO DO 6-(4-FLUORBE�ZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aHPIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBALDEÍDO 53b

N

N

O

O

F

HO

N

N

O

O

F

OH

52b 53b


Cloreto de oxalila 1,2 mL (14,00 mmols), 26 mL de CH2Cl2, a primeira

(solução1): 2mL de DMSO seco (28,1 mmols) em 6 mL de CH2Cl2 , a segunda

(solução2): contendo o álcool 52b (2,86g:10,82 mmols) em 7 mL de CH2Cl2 e (7,5 mL;

53,40 mmols ) de trietilamina.

Depois da retirada da reação do banho de gelo seco, removeu-se o solvente e

procedeu-se a purificação.

Obteve-se assim 2,320g do aldeído 53b puro, após cromatografia em coluna

“flash” (gel de sílica AcOET/Hexano 1:4), correspondente a um rendimento de 82%.


- sólido amorfo amarelo claro

- Rf =0,45 (AcOEt/hexano 2:3)


46


2,10 – 2,20 (m, 2H); 3,13 (sl; 1H) rotâmero em 3,66; 4,04 (t; J= 8,1 Hz; 1H); 4,44 (sl;

1H); 6,24 (sl; 1H); 7,12 (t; J = 8,4 Hz; 2H); 7,69 (sl; 2H); 9,88 (s, 1H). 13C RM� (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

27,3 (CH2); 43,4 (CH2); 48,4 (CH); 97,1 rotâmero em 94,3; 115,6 (d; J = 21 Hz; CH);

130,5 (CH); 132,0 (C); 159,1 (C=N); 162,5 e 165,8 (d; J= 250 Hz, C); 168,6 (C=O);

185,2 (C=O).


3048, 2960, 2857, 1700, 1626, 1590, 1388, 1230, 854.

6.13 – OBTE�ÇÃO DA (4-CLOROFE�IL)-{3-[(4-CLOROFE�IL)-METILHIDRAZO�A]-3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-YL-META�O�A 53a

N

H2N

H

ClN

O

N

O

HO

Cl

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

Cl

53a 54a

Adicionou-se em um balão, 20 mL de etanol absoluto e p-clorofenil-hidrazina

(0,34g; 1,8 mmols). Após completa solubilização, sob agitação e à t.a., adicionou-se

duas gotas de HCl concentrado e em seguida, o aldeído 53a (0,5g; 1,8mmols),

solubilizado em 10 mL etanol. Deixou-se em agitação por cerca de 40 minutos, quando

através da CCD, detectou-se total consumo do material de partida, e formação da

hidrazona 54a. Adicionou-se água gelada ao balão reacional, proporcionando intensa

precipitação do produto, obtendo-se o sólido bruto após filtração em funil sinterizado. O

processo de purificação foi realizado através da solubilização das impurezas em acetato

de etila à temperatura de 60°C e sucessivas filtrações. Cada filtrado tinha um certo grau

de pureza, que foi evidenciado através da CCD. A primeira e a segunda filtrações

apresentaram uma maior quantidade de produto obtido, além de não apresentarem

47

impurezas. Após a purificação, obteve-se 0,39g da hidrazona 54a, correspondendo a um

rendimento de 54%. A hidrazona 54a foi seca em estufa à 45°C durante 24 horas.


- Sólido amorfo branco




1H RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.

2,26 (m, 1H); 2,51 (m, 1H) coincide com sinal DMSO; 3,07 (m, 1H) – rotâmero em

3,40 coincidindo com H2O do DMSO; 4,00 – 4,40 (m, 2H); 6,13 (sl; 1H) - rotâmero em

6,64; 7,03 (sl, 2H); 7,27 (sl, 2H); 7,40 – 7,80 (m, 5H); 11,0 (s, 1H). 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)

27,3 (CH2) rotâmero em 28,7; 43,5 (CH2) rotâmero em 47,5; 51,4 (CH) rotâmero em

49,5; 93,7 (CH) rotâmero em 91,1;113,8 (CH); 123,5 (CH); 127,1 (C); 128,4 (CH);

129,0 (CH); 129,6 (CH) – HC=N; 134,2 (C); 135,3 (C); 142,9 (C); 157,8 (C=N); 167,8

(C=O).


3246, 3095, 3020, 2870, 1628, 1553, 1487, 1424, 1250, 1090, 848.

6.14 - OBTE�ÇÃO DA (4-CLOROFE�IL)-{3-[(4-FLUOROFE�IL)-

METILHIDRAZO�A]-3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-YL-

META�O�A 54b

N

H2N

H

FN

O

N

O

HO

Cl

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

F

53a 54b


48

P-fluorofenil-hidrazina (0,32g; 1,83 mmols), 30 mL de etanol, aldeído 53a

(0,51g; 1,83 mmols). O produto foi submetido a processo de purificação semelhante ao

da reação anterior, obteve-se 0,368g do composto 54b, correspondendo a um

rendimento de 52%.


- Sólido amorfo amarelo claro



DADOS ESPECTROMÉTRICOS 1H RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.

2,27 (m, 1H); 2,45 (m, 1H) coincide com sinal DMSO; 3,09 (m, 1H) rotâmero em 3,41

coincidindo com H2O do DMSO; 4,00 – 4,40 (m, 2H); 6,13 (d; J= 6Hz; 1H) rotâmero

em 6,64; 6,69 – 7,40 (m, 4H); 7,45 – 8,00 (m, 5H); 10,92 (5, 1H). 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.).


49,7; 93,7 ppm (CH) rotâmero em 91,1; 113,5 (CH); 116,0 e 115,7 (d; J= 22 Hz; CH);

126,3 (CH); 128,5 (CH); 129,7 (CH) HC=N; 134,3 (C); 135,3 (C); 140,7 (C); 158,2 e

155,0 (d; J= 240 Hz, C); 157,3 (C=N); 167,9 (C=O).


3243, 3120, 3030, 2943, 1618, 1550, 1497, 1424, 1250, 1209, 1147, 856.

6.15 - OBTE�ÇÃO DA (4-CLOROFE�IL)-{3-[(4-METOXIFE�IL)-


META�O�A 54c

N

H2N

H

OMeN

O

N

O

HO

Cl

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

OMe

53a 54c

49


P-metoxifenil-hidrazina (0,348g; 1,86 mmols), 30 mL de etanol, aldeído 53a

(0,52g; 1,86 mmols).

O produto foi submetido a processo de purificação semelhante ao da reação

anterior, obteve-se 0,360g do composto 54c, correspondendo a um rendimento de 49%.

Propriedades Físicas de 54c

- Sólido amorfo beje claro




2,26 (m, 1H); 2,45 (m, 1H) coincide com DMSO; 3,07 (m, 1H) rotâmero em 3,40

coincidindo com H2O do DMSO; 3,70 (s, 3H); 4,00 – 4,40 (m, 2H); 6,11 (sl, 1H)

rotâmero em 6,61; 6,80 – 7,30 (m, 4H); 7,40 – 8,00 (m, 5H); 10,82 (s, 1H) 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)


49,8; 55,2 (CH3); 93,5 (CH) rotâmero em 90,9; 113,5 (CH); 114,7 (CH); 124,8 (CH);

128,5 (CH); 129,6 (CH) - HC=N; 134,3 (C); 135,2 (C); 137,9 (C); 153,5 (C); 158,1

(C=N); 167,9 (C=O).


3270, 3246, 3048, 2890, 2851, 1628, 1570, 1502, 1428, 1229, 853.

6.16 - OBTE�ÇÃO DA (4-FLUOROFE�IL)-{3-[(4-CLOROFE�IL)-


META�O�A 54d

N

H2N

H

ClN

O

N

O

HO

F

N

O

N

O

N

F

H

NH

Cl

53b 59d

50


P-clorofenil-hidrazina (0,364g; 1,9 mmols), 30 mL de etanol, aldeído 53b

(0,5g; 1,9 mmols).


anterior, obteve-se 0,41g do composto 54d , correspondendo a um rendimento de 56%.

Propriedades Físicas de 54d

- Sólido amorfo branco





3,46 ppm coincidindo com H2O do DMSO; 4,15 (m, 1H); 4,27 (tl, J = 8,0 Hz, 1 H);

6,15 (d: J = 6,3 Hz;1H) rotâmero em 6,65; 7,03 (d, J = 8,1 Hz,, 2H); 7,30 (m, 5H); 7,71

(sl, 2H); 11,03 (s, 1H) 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)


49,5; 93,9 (CH) rotâmero em 91,2; 113,8 (CH); 115,4 (d; J= 21 Hz; CH); 123,5 (C);

127,3 (CH); 129,1 (CH); 130,3 (CH) HC=N; 132,0 (C); 143,0 (C); 157,9 (C=N); 164,8

e 161,5 (d; J= 247 Hz, C); 167,9 (C=O)


3254, 3090, 3040, 2875, 1625, 1600, 1565, 1485, 1247, 1159, 852.

51

6.17 - OBTE�ÇÃO DA (4-FLUOROFE�IL)-{3-[(4-FLUOROFE�IL)-


META�O�A 54e

N

H2N

H

FN

O

N

O

HO

F

N

O

N

O

N

F

H

NH

F

53b 54e


P-fluorofenil-hidrazina (0,349g; 1,98 mmols), 30 mL de etanol, aldeído 53b

(0,52g; 1,98 mmols).


anterior, obteve-se 0,385g do composto 54e correspondendo a um rendimento de 53%.

Propriedades Físicas de 54e

- Sólido amorfo beje claro





3,43 coincidindo com H2O do DMSO; 4,00 – 4,40 (m, 2H); 6,14 (sl, 1H) rotâmero em

6,65; 6,90-7,50 (m, 6H); 7,70 (sl, 3H); 10,93 (s, 1H). 13C RM� (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)


49,6; 93,8 (CH) rotâmero em 91,5; 113,5 (CH); 115,4 (d; J = 22 Hz; CH); 126,4 (CH);

130,3 (HC = N); 132,0 (C); 440,7 (C); 157,8 (C = N); 164,8 e 161,5 (d; J = 247 H2; C);

167,7 (C = O).

52


3240, 3125, 3041, 2898, 1630, 15651503, 1429, 1260, 1210, 1205, 1152, 850.

6.18 - OBTE�ÇÃO DA (4-FLUOR-FE�IL)-{3-[(4-METOXI-FE�IL)-


META�O�A 54f

N

H2N

H

OMeN

O

N

O

HO

F

N

O

N

O

N

F

H

NH

OMe

53b 54f Procedimento experimental idêntico ao item 6.13

P-metoxifenil-hidrazina (0,356g; 1,9 mmols), 30 mL de etanol, aldeído 53b

(0,5g; 1,9mmols).


anterior, obteve-se 0,285g do composto 54f, correspondendo a um rendimento de 40%.

Propriedades Físicas de 54f

- Sólido amorfo bege



ESTUDO BIOLÓGICO

54

7 – REVISÃO DA LITERATURA

7.1 – Fisiopatologia da dor

A dor é uma condição complexa, muitas vezes de etiologia indefinida, com valor

biológico fundamental. Sem dor seria impossível a vida normal; ela funciona como um

mecanismo de defesa, sendo uma resposta adaptativa e protetora ao estresse ambiental.

Porém, é um sintoma desagradável e individual, causando limitações, incapacidade e

sofrimento, afetando tanto aspecto o físico como o psíquico.57,58,59

Os estímulos e as condições que causam a dor podem variar e dependem em

parte do tecido específico e da natureza, intensidade e duração do estímulo. Em geral, os

estímulos que são percebidos como dolorosos têm o potencial de causar dano aos

tecidos.60

Os principais tipos de dor

Praticamente, é necessário reconhecer dois tipos de dor: a aguda e a crônica.61

A dor aguda ou fisiológica resulta da estimulação nociva intensa ou

potencialmente injuriante, é bem localizada e tem curta duração, quando não ocorre

dano tecidual, freqüentemente esvaecendo-se sem que medidas especiais sejam

adotadas. Geralmente é causada por processos identificáveis, sejam inflamatórios,

espásticos ou isquêmicos. O papel dessa dor é simples, mas importante, como sinal de

alerta, indicando perigo, risco, já que informa ao corpo sobre o perigo potencial e, via

de regra, inicia respostas reflexas de retirada do segmento corporal da fonte do estímulo

nocivo. É funcionalmente garantida por NAPs (neurônios aferentes primários)

especializados, capazes de codificar o estímulo nocivo quanto à sua modalidade,

intensidade, duração e localização.61

Já a dor crônica, ou patológica, ocorre em resposta à lesão tecidual e é

caracterizada pela sensação de dor em resposta a estímulos normalmente inócuos ou

mesmo pela ocorrência de dor espontânea, persistindo por mais tempo do que o

esperado para a cura da lesão. Muitas vezes, apresenta etiologia incerta, não desaparece

com o emprego dos procedimentos terapêuticos convencionais e é causa de

incapacidades e inabilidades prolongadas. Representa um fenômeno de sensibilização

nociceptiva, com redução do limiar à dor (alodinia), amplificação da resposta a

estímulos nocivos (hiperalgesia) e sensação de dor prolongada após estimulação

55

(hiperpatia). Mesmo a dor crônica possui uma fase aguda, geralmente associada a dano

tecidual e inflamação. Na fase crônica, a dor está geralmente associada a alterações ou

danos ao tecido nervoso, caracterizando-se a dor neuropática, comum especialmente em

idosos. Nesta condição, a dor aparentemente perde qualquer função adaptativa e torna-

se de fato patológica.62,63,64,61

A percepção da dor (nocicepção)

A nocicepção é um fenômeno que ocorre de forma subjetiva, podendo assim

variar através das dimensões de intensidade e severidade, duração, qualidade (aguda,

sutil, em queimação, etc.), freqüência, recorrência, padrão e a localização.60 Têm-se

referido à percepção e a resposta do corpo à dor como sendo a atividade do sistema

nervoso aferente, induzida por estímulos nocivos, tanto exógenos (mecânicos, químicos,

físicos e biológicos), quanto endógenos (inflamação, aumento de peristaltismo,

isquemia tecidual). Sua recepção em nível periférico se dá em estruturas específicas

denominadas nociceptores. 61

Os nociceptores são definidos como estruturas responsáveis pela sensação

periférica inicial do fenômeno doloroso. Representam as terminações livres do axônio

periférico do NAP, e muitos deles são “silenciosos” em condições normais, sendo

ativados apenas em condições patológicas (por exemplo em processos inflamatórios).

Estão localizados em todo o corpo (superfície cutânea e mucosa), exceto no cérebro e

tecido ósseo, e existem desde o início da sexta semana de gestação, o que se pressupõe

sensações dolorosas primitivas, mesmo nos fetos no início da gestação. 65,61,66

Os receptores nervosos periféricos para a dor foram, então, se desenvolvendo ao

longo do tempo, de maneira a ampliar e facilitar a condução nervosa após estímulo de

alto limiar. Isso com o objetivo de evitar situações desagradáveis, manter as funções

fisiológicas e preservar a vida. 67

Os terminais periféricos dos NAPs (nociceptores) são sensibilizados pela ação

de substâncias químicas, denominadas algiogênicas, presentes no ambiente tecidual.

Entre elas destacam-se a bradicinina (receptores tipo B2), prostaglandinas dos tipos I2

(prostaciclinas) e E2, opióides (receptores tipos µ e δ), histamina, serotonina,

noradrenalina (receptor tipo β2), tromboxano, substância P, interleucinas e acetilcolina,

substâncias que podem ser liberadas em tecidos lesados durante a inflamação, o que

acaba por facilitar a geração local de estímulos (fenômeno de hipersensibilização ou

hiperalgesia periférica). 61,66,67

56

Os Agentes analgésicos

Vários procedimentos podem contribuir para reduzir a dor e o sofrimento. A

avaliação das características da dor é fundamental para a instalação das medidas

terapêuticas apropriadas. 68

O tratamento da dor aguda e da crônica é multimodal e envolve o uso de

intervenções farmacológicas, psíquicas, físicas, a utilização de bloqueios anestésicos

regionais e métodos neurocirúrgicos. 69

Realiza-se analgesia quando se atinge um estado em que o indivíduo não sente

mais dor, através da interrupção dos impulsos nociceptivos. 70

Várias classes de fármacos são utilizadas na prevenção e no tratamento da dor,

dependendo da intensidade, duração e da natureza do estímulo doloroso. Incluem não

apenas analgésicos opióides, mas também anestésicos locais, anestésicos gerais, AINEs

(aspirina, dipirona, acetaminofeno, ibuprofeno, etc.) e medicamentos adjuvantes. 71,72,60

Os analgésicos AINES têm propriedades analgésicas, antitérmica e

antiinflamatória, relacionadas à inibição das COX; e não apresentam o risco do vício.

São indicados para dores leves ou moderadas, associadas ou não à reação inflamatória

periférica, com a vantagem de induzir efeitos adversos menos graves que os analgésicos

opióides. 73

A inibição da atividade da COX pode resultar em acúmulo de ácido

araquidônico e desvio dessa substância para metabolismo pelas lipoxigenases e

epoxioxigenases. Isso provocaria alterações nos níveis de metabólitos não-prostanóides

que podem estar envolvidos no processo nociceptivo. Outros autores, entretanto,

sugerem que os AINEs ao aumentarem os níveis de ácido araquidônico facilitariam o

impulso nociceptivo através da liberação de neuromediadores pré-sinápticos

(glutamato). Por outro lado, a literatura relata que o aumento do 12-HPETE pode

produzir depressão sináptica e analgesia. 69

O fato de existirem agentes (como acetaminofeno) que inibem fracamente ou

não interferem na atividade das prostaglandinas, mas que possuem ação analgésica,

evitando a hiperalgesia, fortalece a hipótese de que existem outros mecanismos de ação

para os AINEs, provavelmente relacionados à inibição da hiperexcitabilidade neuronal

central e periférica durante a transmissão nociceptiva, sinérgica aos agonistas alfa-2 e

opiáceos.69,71

57

É possível, ainda, que os AINEs atuem na membrana plasmática, alterando a

viscosidade e a configuração da subunidade alfa da proteína G. Isso interfere no

processo decorrente da ação de neurotransmissores excitatórios (aspartato, glutamato,

substância P) em receptores metabotrópicos (mGlu) e a coativação de receptores

ionotrópicos (NMDA, AMPA, cainato), alterando a atuação da fosfolipase C sobre

segundos mensageiros (PIP2 – IP3 – DAG – PKC), necessários para o aumento do fluxo

intracelular de cálcio e a atuação da fosfolipase A2. A fosfolipase A2 levaria ao aumento

das prostaglandinas espinhais e NO, que iniciam e perpetuam o processo de

sensibilização medular à dor. Outra possibilidade é que os AINEs podem interferir na

beta-oxidação do ácido palmítico, competindo pela cadeia longa da acil-CoA sintetase.

O palmitoil-CoA regula a atividade da glutaminase que indiretamente modula a síntese

do glutamato. A redução da concentração do glutamato no SNC diminui a transmissão

da dor. 69

Com relação à ação sobre as vias descendentes inibitórias da dor, existem relatos

de que os AINEs provoquem analgesia devido ao aumento dos níveis centrais de

dopamina. Essa substância regularia a atividade da glutamato-alfa descarboxilase, que é

uma enzima que catalisa a formação do GABA através do glutamato, afetando, assim,

as vias gabaérgicas inibitórias. Outra possibilidade descrita para explicar a inibição da

dor a nível central seria a elevação dos níveis de serotonina e noradrenalina, agentes que

interferem na permeabilidade da membrana celular aos íons potássio e cloro. Esse efeito

é decorrente da ação competitiva dos AINEs sobre os sítios de ligação do triptofano ou

peptídeos precursores das proteínas circulantes. 69

Apesar da dipirona e do acetaminofeno (paracetamol) serem as medicações

analgésicas e antipiréticas mais populares, apresentam pouca eficácia como

antiinflamatórios nas doses terapêuticas, e seus mecanismos de ação permanecem

controversos.75,74 Alguns estudos sugerem que a inibição da COX-2 ou ainda a

sensibilidade diferenciada das enzimas em diferentes tecidos possam explicar seus

efeitos farmacológicos.76,75 Avaliando o líquor humano, foi demonstrado a redução de

tromboxano após a utilização de dipirona (derivado da pirazolona), o que poderia

explicar seu efeito analgésico e antitérmico. 77 Outros autores descreveram a COX-3,

provavelmente uma variante da COX-1, presente principalmente no córtex cerebral,

cuja inibição seletiva poderia representar o mecanismo primário central da ação

analgésica de drogas como a dipirona e o acetaminofeno.78

58

7.2 - Toxicidade Aguda

A utilização de qualquer substância considerada farmacologicamente ativa

requer uma realização de “screening” de reação comportamental quando submetidos ao

estudo “in vivo” em experimentação animal. Os efeitos ou respostas podem ocorrer

dentro de minutos ou depois de algumas horas, dias ou qualquer intervalo entre eles.79

Essas respostas referidas como reações preliminares aguda, subaguda ou crônica, estão

baseadas nos princípios de toxicologia. A intoxicação aguda se manifesta por sinais e

sintomas, que dependendo da exposição pode levar à mortalidade.80

De fato, toda substância pode ser considerada um agente tóxico; esta condição

irá depender das condições nas quais ocorrerá a interação do agente químico com o

organismo, como tempo e freqüência de exposição, dose administrada ou absorvida e

via pela qual se deu a administração.81

As interações químicas de moléculas biologicamente ativas no organismo vivo,

podem ocorrer através de uma série de mecanismos, tais como: alterações na absorção,

ligação às proteínas, biotransformação e excreção.82, 83

A toxicidade de uma substância pode ser definida como a capacidade de causar

dano grave ou morte a dado organismo, após a administração de uma dose única ou

doses múltiplas, administradas dentro de um período de 24 horas. Para que o dano

ocorra é necessário, em primeiro lugar, que o organismo seja exposto; em segundo, que

interaja com o agente intoxicante. 84, 85, 86

Os ensaios de toxicidade aguda são comumente realizados em camundongos e

ratos, embora em certos casos também sejam utilizados animais maiores, como coelhos

e cães. Recomenda-se a mesma via de administração utilizada no homem, sendo a via

oral a mais comum.87

8 - Avaliação da atividade biológica

Os ensaios biológicos foram realizados no Laboratório Bioensaios para Pesquisa

de Fármacos (LBPF) do Departamento de Antibióticos, da Universidade Federal de

Pernambuco, sob a responsabilidade da Professora Dra. Teresinha Gonçalves da Silva.

Os experimentos foram realizados de acordo com as normas aprovadas pela

Comissão de Ética para Experimentação com animais, da UFPE, (processo nº

040743/2007-19).

59

8.1 - Materiais

Para determinação da toxicidade aguda e atividade antinociceptiva das

pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina 54a-f, foram utilizados os seguintes materiais: balança

analítica; seringas descartáveis tuberculina; solução salina a 0,9%; Tween 80

(MERCK); ácido acético (VETEC), éter dietílico (VETEC); e a dipirona como fármaco

padrão.

8.2 - Animais

Foram utilizados Camundongos albinos Swiss (Mus musculus), machos, com

aproximadamente 60 dias de vida, variando de 25 ± 30 gramas, oriundos do Biotério do

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, registrado no

COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) sob no 18. Os animais foram

divididos em grupos e mantidos em caixas plásticas à temperatura 23 ± 2ºC com ciclos

claro/escuro de 12 em 12 horas, recebendo ração padrão (Purina) e água ad libitum.

Todos os animais utilizados para determinação da atividade analgésica foram mantidos

em jejum de 6 horas antes do experimento, com água ad libitum.

8.3 – Metodologia

8.3.1 - Nocicepção induzida por ácido acético 88

A atividade antinociceptiva foi verificada através do teste de contorção abdominal

induzida pelo ácido acético. Os animais foram arranjados aleatoriamente (n= 6

camundongos por grupo), pré-tratados por via intraperitoneal 60 minutos antes do teste

com as isoxazolil-aril-hidrazonas 54a-f (150 µmol/Kg) e a substância padrão dipirona

(150 µmol/Kg). O grupo controle recebeu o veículo (solução salina 0,9%). Ácido

acético 1% foi injetado dentro da cavidade peritoneal dos animais, para induzir

contrações da musculatura abdominal e/ou alongamento dos membros posteriores. Dez

minutos após a injeção do ácido acético, os camundongos foram colocados

individualmente em caixas transparentes, registrando-se o número de contorções

abdominais durante 20 minutos.

60

Os percentuais de inibição foram calculados através da fórmula: Percentagem de

inibição = (1-Vt/Vc)x100, onde Vt e Vc representam, respectivamente, a média das

contorções dos grupos tratados e a do controle.

8.3.2 - Toxicidade aguda 89

Para avaliação da toxicidade aguda, os camundongos foram separados em

grupos de 06 animais. Em seguida, foram administradas, por via intraperitoneal, as

substâncias testes 54a e 54d, na dose de 1500mg/Kg. A observação dos efeitos tóxicos

foi efetuada com os animais em livre movimentação, em superfície plana, por um

período inicial de 60 minutos. Após esse período, os animais foram ainda observados

durante 48 horas para registro do índice de mortalidade de cada grupo e durante 14 dias

para observações gerais.89

9- Resultados e discussão

9.1 - Nocicepção induzida por ácido acético

A algesia induzida por administração intraperitonial de ácido acético em

camundongos é um modelo de efeito periférico e não-específico, envolvendo a liberação

de prostaglandinas, serotonina, bradicinina, substancia P e mediadores do sistema

simpático.90

Os fármacos que produzem efeitos analgésicos podem atuar a nível periférico e

central, seja modulando ou inibindo a síntese de substâncias mediadoras da

inflamação.91

As isoxazolil-aril-hidrazonas 54a-f (150 µmol/Kg), administradas por via

intraperitoneal, inibiram significantemente as contorções abdominais induzidas por

ácido acético em relação ao controle no qual foi sumarizada na tabela 05.

61

.

N

N

O

O

NHN

HH

H

R1

R2

Figura 07: Estrutura geral das isoxazolil-aril-hidrazonas

SUBSTÂ�CIAS (150 µmol/Kg)

SUBSTITUI�TES MÉD. DE CO�TORÇÕES

PROTEÇÃO (%)

(54a) R1-C l, R2-Cl 9,8 85,8 * (54b) R1- F, R2- C l 21,0 69,6 * (54c) R1- OMe, R2- C l 19,2 72,0 * (54d) R1- Cl, R2-F 21,2 69,3 * (54e) R1-F, R2-F 23,4 66,0 * (54f) R1- OMe, R2-F 16,4 76,0 *

Dipirona (padrão) ------- 28,1 59,3 * Controle (salina) 69,1 ----

* Resultados significativos para ao nível de p<0,05 (A�OVA)

Tabela 05: Percentual de inibição das hidrazonas no teste de contorções abdominais induzidas

por ácido acético (1%) em camundongos.

A avaliação da atividade antinoceptiva foi realizada pelo método de contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético. Os resultados mostraram que na dose de 150

µmol/Kg, as isoxazolil-aril-hidrazonas (54a-f) apresentaram excelentes resultados

quando comparados à dipirona, que foi utilizada como fármaco padrão, pois esses novos

compostos, administrados por via intraperitonial, inibiram as contrações abdominais,

induzidas por ácido acético, em camundongos. A inibição das contorções abdominais é

sugestiva do bloqueio da reação dolorosa pelas substâncias administradas, através de

mecanismo periférico, da inibição da liberação de prostaglandinas e de mediadores do

simpático. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de uma atividade

depressora do Sistema Nervoso Central causada pela reação dolorosa.

62

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Média das contorções abdominais

induzidas por àcido acético (1%) Controle

Dipirona

54a

54b

54c

54d

54e

54f

C Dipirona i.p. 54a 54b 54c 54d 54e 54f

Tratamentos150 µmol/Kg

Figura 08: Efeito das hidrazonas 54 sobre a nocicepção, induzida por ácido acético (1%), em

camundongos. Cada grupo representa a média de 6 animais. Os dados representam a média ±

EPM (erro padrão da média) de n = 6. Todos os resultados apresentaram significância

estatística em relação ao grupo controle, ao nível de * p<0,05 (ANOVA).

Da série testada tivemos como destaque as (54a) e (54f), que apresentaram

respectivamente 85,8% e 76% de atividade antinoceptiva. Todos os compostos

apresentaram resultados bastante promissores, pois mostraram ser superiores ao da

dipirona, que foi utilizada como droga padrão, que apresentou 59% de eficácia

antinoceptiva. Portanto, foi confirmada a hipótese de que a fusão dos dois prováveis

grupos farmacofóricos (isoxazolina e a hidrazona) aumentaria a eficácia farmacológica

para atividade antinoceptiva, que no qual já existia nos núcleos de forma isolada. Esse

estudo preliminar de potencial biológico abre caminho para a realização de testes destes

compostos como antiinflamatório e testes específicos de analgesia, com objetivo de uma

possível elucidação futura do mecanismo de ação dessas novas drogas.

63

9.2 - Toxicidade Aguda

Todos os aspectos reacionais de uma substância no organismo vivo devem ser

considerados quanto aos sinais e sintomas de intoxicação e o percentual de mortalidade

para o cálculo de doses letais. Estes valores são calculados estatisticamente a partir de

dados obtidos experimentalmente, correlacionando as doses das substâncias e a

mortalidade dos animais. 92

Os resultados obtidos na avaliação da toxicidade aguda das hidrazonas,

derivadas da pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina 54a e 54d, revelaram possuir baixa

toxicidade na dose de 1500 µmol/Kg. Foram observados alguns efeitos depressores do

sistema nervoso central, onde foram comuns a todos os animais dos grupos pertencentes

aos experimentos, como: ptose, sonolência, abaixamento do trem posterior e diminuição

da freqüência respiratória, no entanto, nenhum animal veio a óbito na dose testada, após

o período determinado de observação.Todos sintomas evidenciados foram reversíveis

Com isso, de maneira geral, conclui-se que as novas isoxazolil-aril-hidrazonas possuem

uma baixa toxicidade, quando testadas na dose 10 vezes superior do que aquela que

apresentara uma excelente atividade antinoceptiva. Com isso abrem-se caminhos para a

realização de novos testes mais específicos de toxicidade aguda para os novos

compostos. Portanto, isso é um dos requisitos para que um novo composto ativo seja um

futuro fármaco.

64

CO�CLUSÕES E PERSPECTIVAS

65

10 - CO�CLUSÕES

Neste trabalho, exploramos química e biologicamente o novo heterobiciclo

pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina, através da aplicação sintética deste núcleo na obtenção

derivados hidrazonas. Novos aldeídos isoxazolínicos, obtidos a partir do cicloaduto da

reação de ciclodição 1,3-dipolar entre enecarbamato endocíclico e �-óxido de nitrila,

foram condensados com fenil-hidrazinas, obtendo-se novas isoxazolil-hidrazonas, que

possuem dois sítios distintos de substituição, visando a variação estrutural das mesmas.

Rendimentos ótimos foram obtidos nas etapas de síntese dos aldeídos, enquanto que, na

etapa de condensação entre os aldeídos e as fenil-hidrazinas, rendimentos moderados

foram obtidos, devido a problemas no isolamento dos produtos.

As avaliações biológicas preliminares das novas isoxazolil-aril-hidrazonas

mostraram que as mesmas possuem baixa toxicidade e excelente atividade

antinoceptiva, quando comparada ao fármaco padrão dipirona. Estes resultados são

bastante promissores e corroboram resultados anteriores, relativos à atividade biológica

do heterociclo isoxazolínico desenvolvido em nosso laboratório. Portanto, a introdução

da funcionalidade hidrazona nas estruturas isoxazolínicas, que conforme a literatura é

um grupamento farmacofórico para analgesia, propiciou excelente atividade

antinoceptiva aos derivados híbridos. Diante dos resultados obtidos, a série de

isoxazolil-hidrazonas deverá ser expandida, visando uma variação estéreo–eletrônica

das mesmas e testes específicos de atividade analgésica, para uma possível

determinação do mecanismo de ação, assim como teste antiinflamatório, entre outros,

deverão ser realizados.

Os objetivos propostos inicialmente no projeto inicial, quanto à parte química e

biológica, foram plenamente executados, apresentando resultados bastantes

satisfatórios.

Todos estes resultados todos demonstram a grande versatilidade sintética e

aplicação biológica dos novos heterociclos isoxazolínicos obtidos, o que nos incentiva a

ampliar a investigação sintética e biológica destes novos núcleos obtidos a partir de

enecarbamatos endocíclicos.

66

11 - PESPECTIVAS

• Síntese assimétrica das hidrazonas isoxazolínicas 54a e 54f. Avaliação da

atividade analgésica comparada ao racêmico ± 54.

• Estudo teórico de modelagem molecular “docking” e QSAR dos novos

derivados heterocíclicos.

• Determinação da DL50 das novas hidrazonas isoxazolínicas 54, para

determinação de outros parâmetros toxicológicos.

• Realização de testes de atividade antiinflamatória.

• Continuação dos estudos de atividade analgésica, utilizando outros modelos e

investigação do mecanismo de ação.

REFERÊ�CIAS BIBLIOGRÁFICAS E

A�EXOS

68

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72

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76

N

N

O

O

Cl

OH

52a

Figura 09: Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52a

13 – ANEXOS 13.1- Espectros selecionados:

77

N

N

O

O

Cl

HO

53a


78

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3383,8

2861,8

1626,3 1398,7

1090,2

843,3

696,8

Transmitância

Número de Onda (cm-1)

N

N

O

O

Cl

HO

53a

Figura 11: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53a

79

N

N

O

O

F

OH

52b

Figura 12: Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 52b

80

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3505,9

2884,9

1639,1 1415,4

1153,2

845,9

505,2

Transmitância


N

N

O

O

F

OH

52b

Figura 13: Espectro de infravermelho (janela de KBr, cm-1) do composto 52b

81

N

N

O

O

F

HO

53b


82

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3387,62857,9

1626,31388,4

1230,3854,9

602,9

Transmitância


N

N

O

O

F

HO

53b

Figura 15: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 53b

83

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

Cl

54a


84

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

3246,2

1627,6

1424,4

1090,2

848,5

Transmitância


Figura 17: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54a

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

Cl

54a

85

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

F

54b


86

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3243,6

1618,61424,4

1209,7

856,2

515,5

Transmitância


N

O

N

O

N

Cl

H

NH

F

54b

Figura 19: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54b

87

N

O

N

O

N

Cl

H

NH

OMe

54c

Figura 20: Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54c

88

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

3269,3

1628,9

1428,3 1229,0

853,6

523,2

Transmitância


N

O

N

O

N

Cl

H

NH

OMe

54c

Figura 21: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54c

89

N

O

N

O

N

F

H

NH

Cl

59d

Figura 22: Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54d

90

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3253,9

1625,01423,2

1159,6

852,3

599,1

Transmitância


N

O

N

O

N

F

H

NH

Cl

54d

Figura 23: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54d

91

N

O

N

O

N

F

H

NH

F

54e

Figura 24: Espectros de 1H RMN e 13C RMN de 54e

92

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

3239,8

1630,1

1429,6

1205,9

849,8

600,3

Transmitância


Figura 25: Espectro de infravermelho (pastilha de KBr, cm-1) do composto 54e

N

O

N

O

N

F

H

NH

F

54e

silvio leandro gonçalves bonfim reis - repositorio.ufpe.br · espectro de infravermelho (pastilha...

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