Sexagem de Sêmen e Embriões

Dezembro, 2012

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Manipulação de Gametas e Embriões

Prof. Tiago Collares

Profa. Priscila M. M. de Leon

Histórico:

• Década de 80: pesquisadores da Califórnia desenvolveram a tecnologia do

sêmen sexado por citometria de fluxo;

• 1989: sexagem de embriões humanos por PCR;

• 1990: sexagem de embriões bovinos por biópsia e PCR;

• 1998: primeiro potro sexado;

• 1999: primeiro terneiro utilizando sptz sexado e congelado de IA;

• 2001: cordeiro nascido utilizando sêmen sexado e congelado;

• 2003: comercialização de sêmen sexado nos EUA;

• 2004: comercialização de sêmen sexado no Brasil;

Sexagem

• Rentabilidade na produção de carne;

• Especialização da criação leiteira;

• Comercialização especializada: “planejar” os nascimentos de

machos e fêmeas de acordo com as necessidades do rebanho

e de mercado;

• Produção e seleção genética específica;

• Síndromes relacionadas ao sexo;

Aplicações gerais da Sexagem

Sexagem de Sêmen

• Moruzzi, 1979: deu especial atenção ao DNA, ao evidenciar diferenças entre os espermatozoides X e Y;

• Gorus & Pipeleers, 1981: utilização da técnica de Percoll, consistiu na centrifugação de espermatozoides em um gradiente de densidade contínuo, cujo princípio se baseou na diferença de massa entre as populações de espermatozoides X e Y;

• PINKEL et al., 1982: construção do citômetro de fluxo com alta resolução, usado para mostrar a diferença de 3,2% no conteúdo de DNA do núcleo de espermatozoides de camundongos;

• JOHNSON et al., 1989: coelhos nascidos de sêmen sexado por citometria de fluxo;

Sexagem de Sêmen

• Atualmente: sexagem do sêmen é feita através da tecnologia de

separação por fluxo, a única técnica confiável para separar

espermatozoides femininos dos masculinos, utilizando um aparelho

chamado Citômetro de Fluxo;

• Técnica é baseada na detecção de 3 a 4% a mais no conteúdo do

DNA nos espermatozoides femininos.;

Sexagem de Sêmen

• 1º passo : é diluir o ejaculado a uma concentração pequena;

• 2º passo: corá-los com fluorófo que se ligue em DNA (Hoechst 33342);

• 3º passo: este conteúdo será levado ao Citômetro de Fluxo, e quando os espermatozoides passam pelo raio lazer, a fluorescência é identificada;

→ Como o cromossomo X é maior, os espermatozoides femininos emitem maior quantidade de luz que os espermatozoides masculinos;

• Os detectores medem a quantidade de fluorescência emitida e detectam cargas + e – em cada gota contendo 1 só espermatozoide;

• 4º passo: este fluxo é logo separado em três recipientes eletromagnéticos:

– partículas com carga (+), contendo 1 esperma feminino

– partículas com carga (-) com 1 esperma masculino

– partículas sem definição

* Este processo separa espermatozoides de ambos os sexos com 90% de acerto.

Sexagem de Sêmen

X Y

- Espermatozóides X possuem mais DNA (3-4%)

- Espermatozóides X com mais corante ligado ao DNA

Hoechst 33342

Sexagem de Sêmen

Sexagem por Citometria de Fluxo

* Capacidade de sexagem: 3.000 a 5.000 sptz/segundo

Sexagem por Citometria de Fluxo

Sexagem de Sêmen

Segundo JOHNSON e WELCH (1999) a variação no conteúdo de DNA entre os espermatozoides X e Y é a seguinte:

• 2,8% no homem;

• 3,0% no coelho;

• 3,6% no suíno;

• 3,7% no garanhão;

• 3,8% no bovino;

• 3,9% no cão;

• 4,2% nos ovinos.

Cromossomo Y e Cromossomo X

*GARNER, 2006: existem diferenças relacionadas às características do cromossomo Y entre espermatozoides de raças de bovinos, determinando resultados variáveis na eficiência do processo de separação dos espermatozóides X e Y, assim como nos resultados de prenhez após a utilização de sêmen sexado de raças taurinas e zebuínas.

• Principal limitação: redução da taxa de concepção, pois sexar espermatozoides é um processo que impacta negativamente na viabilidade celular;

→ Em rebanhos: 60 a 65% de concepção em novilhas com sêmen convencional, enquanto que, 45 a 55% de concepção com sêmen sexado;

• somente 30% dos espermatozoides se orientam corretamente, ou seja, apenas 15% dos espermatozoides que entram na máquina são comercializados como sexados;

• São comercializadas palhetas com 2 milhões de sptz sexados;

→ custo do citômetro + mão de obra especializada + diminuição da viabilidade celular = alto custo do sêmen sexado

• se recomenda que o sêmen sexado seja usado somente em rebanhos bem manejados e com novilhas altamente férteis;

Limitantes da Sexagem de Sêmen

Resultados utilizando sêmen sexado

GARNER, 2006:

Resultados utilizando sêmen sexado

GARNER, 2006:

Pureza do sêmen sexado (90% a 85%);

Alguns touros não é possível sexar devido a baixa qualidade espermática;

Fertilidade é diminuída tanto na Inseminação Artificial como na FIV;

Equinos não é possível sexar sêmen comercialmente;

Técnica de sexagem de espermatozoides depende de equipamento de citometria de fluxo;

Desvantagens da Sexagem de Espermatozoides

Sexagem de Embriões

Sexagem de Embriões

Biotencologia relacionada a Produção in vitro e a Transferência de embriões;

Criador escolhe o sexo do embrião a ser transferido;

Realizada através da análise do DNA embrionário;

Ferramenta que permite intensificar e acelerar o melhoramento genético de animais de alto valor zootécnico;

Contribuindo diretamente para otimização da eficiência reprodutiva e lucratividade nos rebanhos;

Conceito: a Sexagem de Embriões é um avanço tecnológico que nos permite identificar o sexo do embrião antes da

transferência para a receptora.

• Bovinocultura de Corte x Leite

• Produção de carne e Abate • Comercialização de Touros

• Reposição de Matrizes • Reprodução • Comercialização de Fêmeas

• Produção de Leite • Reposição de Matrizes • Reprodução • Comercialização de Fêmeas

• Comercialização de Touros

Aplicação Comercial de Embriões Sexados

Aplicação Comercial de Embriões Sexados

• A maior frequência de machos nos produtos provenientes da PIV é altamente indesejável;

• O número de machos com alto potencial zootécnico necessário em um rebanho é bem menor em relação às fêmeas;

• A probabilidade de um terneiro tornar-se doador de sêmen é baixa, causando a desvalorização dos produtos;

• Toda a fêmeas oriunda de um acasalamento bem planejado é potencialmente uma doadora;

X

• Maior aproveitamento de receptoras;

• Menor custo com tratamentos hormonais e sincronização;

• Manejo simplificado;

• Menor locação de espaço na propriedade;

• A possibilidade de se ter um rebanho de matrizes aptas a produzirem cada vez mais e num curto espaço de tempo se multiplica;

• Estudos mostram um desvio na proporção macho/fêmea de embriões produzidos in vitro (↑ % de machos)

uma vaca que, em toda sua vida útil teria em média 4 a 5 crias, produziria com a transferência de embriões, de 30 a 40 crias

Vantagens da Sexagem de Embriões

Optar pela implantação ou congelamento dos "embriões fêmeas” e descartando os "machos" :

Economizando os custos altos das gestações, aumentando ainda mais o número de fêmeas, filhas de suas melhores matrizes, com possibilidade de atingir o seu equilíbrio de produção rapidamente (Melhora do Plantel é otimizada).

Vai ocorrer a diminuição dos custos de imediato pela simples redução pela metade do número de receptoras necessárias.

Vantagens da Sexagem de Embriões

Não invasivas: mantém a integridade do embrião;

1. Métodos imunológicos: detecção de um antígeno de superfície celular antígeno H-Y

Citotoxicidade:

• Em ensaios citotóxicos os embriões que expressam esse antígeno apresentam lise celular ou cessam o desenvolvimento, sendo classificados como macho;

• Eficiência de 80-86%;

• Desvantagem: inviabilidade do machos;

Imunofluorescência indireta (IFI):

• são utilizados anticorpos anti-H-Y, monoclonais ou policlonais, conjugados com o isotiocianato de fluoresceína;

• Visualização por meio de microscopia de fluorescência;

• 49-70% de acurácia

• Desvantagem: diminui viabilidade embrionária (59% de degeneração)

Técnicas de Sexagem de Embriões

Não invasivas: 2. Métodos bioquímicos: maior atividade enzimática relacionada ao

cromossomo X em fêmeas

Atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase:

• Eficiência de 64%;

• Alta taxa de Mortalidade Embrionária: inviabiliza a aplicação comercial dos métodos bioquímicos, sugerindo toxicidade da reação para os embriões

Técnicas de Sexagem de Embriões

Invasivas:

• Os métodos mais precisos para a determinação do sexo;

• requerem biópsia de células dos embriões;

1. Métodos Citogenéticos: visualização da cromatina sexual

Visualização da cromatina sexual:

• 1ª técnica utilizada para a identificação do sexo.

• Baixo sucesso;

Cariotipagem:

• identificação de XX ou XY na fase de metáfase;

• Eficiência de 9% em mórulas;

Técnicas de Sexagem de Embriões

Invasivas:

2. Métodos Moleculares: sondas de DNA específicas para a determinação do sexo de embriões pré-transferência

Hibridização in situ:

• localização de sequências Y-específicas por meio de marcação radioativa;

• 57% de eficiência e 95% de acurácia;

Hibridização in situ fluorescente (FISH):

• marcadores sondas não-radioativas;

• Pouca informação sobre sua eficiência;

• Complexidade (muitas etapas) inviabiliza a aplicação;

Técnicas de Sexagem de Embriões

Invasivas:

2. Métodos Moleculares:

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

• HANDYSIDE et al. (1989) em embriões humanos;

• A PCR amplifica exponencialmente pequenos fragmentos de DNA de regiões Y-específicas;

• Alto grau de eficiência e Acurácia;

• Procedimento rápido e de fácil realização;

Técnicas de Sexagem de Embriões

• Estágio:

– Mórula compacta (D5)

• Biópsia não tem orientação

– Blastocisto expandido (D7)

• Biópsia do trofoblasto, massa celular deve permanecer intacta

• Qualidade:

– Excelente (G1)

– Boa (G2 e G3)

Estágio e Qualidade Embrionária

• Embriões produzidos in vitro ou provenientes de coleta in vivo;

1º ) Biópsia Embrionária:

• é utilizado um micromanipulador;

• Porção de 6 a 10 células são removidas para extração do DNA → representando de 10-30% da massa celular;

• Embriões de 5 a 7 dias;

• Conservação do material a -196°C;

2ª) Extração do DNA genômico:

• Células são lisadas na Proteinase K (6 µg);

• Incubação a 37°C/60 minutos;

• Incubados a 98°C/10 minutos para inativação da enzima;

A Técnica de Sexagem de Embriões

3º ) Amplificação por PCR:

• PCR Multiplex:

• Primer para região do Y (SRY);

• Primer para região controle (microssatélite 1.715 ou SRX);

• 40 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão;

4º) Visualização em Gel:

• Gel de Agarose 0,8% a 1,5%;

• Corado com GelRed ou Brometo de Etídeo;

A técnica mais utilizada consiste na punção por micromanipulação do embrião de 7 dias, retirando-se um fragmento cujo código de DNA evidenciará ou não a amplificação do Y (SRY) por PCR e seguido de eletroforese

A Técnica de Sexagem de Embriões

1ª Etapa: Biópsia Embrionária

2ª Etapa: Extração do DNA

• 37°C /60 minutos

• 98ºC /10 minutos

3ª Etapa: Amplificação por PCR

Multiplex PCR:

• Primer SRY:

F 5’ ATC AGT GCA GGG ACC GAG ATG 3’

R 5’ AAG CAG CCG ATA AAC ACT CCT T 3’

• Primer 1.715:

F 5’ TGG AAG CAA AGA ACC CCG CT 3’

R 5’ TCG TGA GAA ACC GCA CAC TG 3’

• Volume da reação de 15 - 50µl

• 40 ciclos

M = Controle positivo com DNA de macho bovino F = Controle positivo com DNA de fêmea bovina No = Controle Negativo (sem DNA)

Embriões machos (XY), apresentam 2 bandas → 1, 3 e 5 Embriões fêmeas (XX), apresentam 1 banda → 2 e 6

4ª Etapa: Visualização por eletroforese

Apenas o sexo masculino é detectado;

Quando não houver a presença de banda não é possível

identificar o sexo do embrião;

10% de mortalidade embrionária com a biopsia;

Mortalidade ligada a qualidade embrionária;

Limitantes da Sexagem de Embriões

• PCR se observa uma eficiência de 90-95% e acurácia de 93-98%;

• Ramalho et al. (2004): 80% de identificação correta entre mórulas e blastocistos;

• Os embriões sexados podem ser congelados com sucesso;

• Taxa de prenhes não é alterada;

A rapidez na execução da técnica e a possibilidade da determinação do sexo de embriões bovinos frescos, sem a necessidade de criopreservação, é uma das principais vantagens da utilização da PCR em laboratórios de PIV de embriões bovinos.

Resultados Obtidos com a Sexagem de Embriões

Sexagem em Humanos

• Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (DGP);

• Ferramenta de diagnóstico pré-natal para casais com alto risco de transmissão de doenças genéticas;

• Doenças como: Síndrome do X frágil, Distrofia muscular Duchenne, Hemofilia são evitadas com transferência de meninas;

• Dilema bioético: transferência de embriões não doentes, mas portadores de genes, cuja chance de transmissão para a prole futura é de 50%.

• Sociedade Européia: Equilíbrio de gênero → equilíbrio familiar e mesmo número de transferência masculinas e femininas por clínica

usado para determinação do sexo do embrião em casos de doenças genéticas ligadas ao cromossomo X

Equine ccffDNA

• Objetivos:

Detecção da presença do ccffDNA no plasma de éguas prenhas e determinação do sexo fetal através de SRY-PCR

Realizar um estudo de validação pré-desenvolvimento de um teste de laboratório

• População em estudo: – 20 éguas prenhas

– 2 éguas vazias

– 2 éguas virgens

– DNA genômico de 10 fêmeas

– DNA genômico de 10 machos

• Coleta e preparação da amostra: – Sangue venoso é coletado e processado (centrifugações) dentro de 15

mim

• Extração do ccffDNA – 1mL de plasma

– QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) (Akolekar et al., 2010)

Material e Métodos:

Equine ccffDNA

• Sexagem Molecular: – Padronizada com DNA genômico de macho e fêmea

– Sequenciamento

– Detecção do SRY (182 bp)

– Controle com GAPDH (150 bp)

– 10µL como template da reação de PCR

• Controles: – NTC (no-template control )

– Controle negativo (DNA genômico de fêmea)

– Controle positivo (2% de DNA genômico de macho)

* Confirmação do sexo fetal no nascimento

Material e Métodos:

Equine ccffDNA

Equine ccffDNA

Resultados:

• Padronização do SRY-PCR

SRY-PCR SRY- Sequenciamento

Resultados:

Equine ccffDNA

Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDDNA).

Samples SRY PCR % (n/total)

GAPDH PCR % (n/total)

SRY 2nd-PCR* % (n/total)

GAPDH 2nd-PCR % (n/total)

SRY qPCR % (n/total)

GAPDH qPCR % (n/total)

ccffDNA

Male pregnancy 72.7 (8/11)

100 (11/11)

90.9 (10/11)

100 (11/11)

90.9 (10/11)

100 (11/11)

Female pregmancy 0 (0/9)

100 (9/9)

0 (0/9)

100 (9/9)

0 (0/9)

100 (9/9)

Control Genomic DNA

Male 100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

Female 0 (0/10)

100 (10/10)

0 (0/10)

100 (10/10)

0 (0/10)

100 (10/10)

Control mares

ccffDNA non-pregnant 0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

ccffDNA virgin 0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

SRY/PCR: Acurácia 85% (17/20)

SRY/2nd-PCR e qPCR : Acurácia 95% (19/20)