resfriamento e congelamento de sêmen de piau

7/25/2019 Resfriamento e Congelamento de Smen de Piau

1/83

RESFRIAMENTO E CONGELAMENTO DO

SMEN DE PIAU-AULeporinus macrocephalus

GILSON FERREIRA DE MORAES

LAVRAS-MG2004


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RESFRIAMENTO E CONGELAMENTO DO SMEN DEPIAU-AULeporinus macrocephalus.

Dissertao apresentada Universidade Federalde Lavras como parte das exigncias do Curso deMestrado em Zootecnia, rea de concentrao emAqicultura, para a obteno do ttulo deMestre.

Orientadora

Profa. PhD Ana Tereza de Mendona Viveiros

LAVRASMINAS GERAIS - BRASIL

2004


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Ficha Catalogrfica Preparada pela Diviso deProcessos Tcnicos da

Biblioteca Central da UFLA

Moraes, Gilson Ferreira de

Resfriamento e congelamento do smen de piau-auLeporinus

Macrocephalus/ Gilson Ferreira de Moraes. -- Lavras:

UFLA, 2004.68 p. : il.

Orientadora: Ana Tereza de Mendona Viveiros.

Dissertao (Mestrado) UFLA.

Bibliografia.

1. Piscicultura. 2. Reproduo. 3. Smen. 4. Preservao. I. Universidade

Federal de Lavras. II. Ttulo.

CDD-639.375


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RESFRIAMENTO E CONGELAMENTO DO SMEN DEPIAU-AULeporinus macrocephalus.

Dissertao apresentada Universidade Federalde Lavras como parte das exigncias do Curso deMestrado em Zootecnia, rea de concentrao emAqicultura, para a obteno do ttulo deMestre.

APROVADA em 18 de fevereiro de 2004

Prof. Dr. Luis David Solis Murgas UFLA

Profa. Dra. Priscila Vieira Rosa Logato UFLA

Prof. PhD Hugo Pereira Godinho PUC-MG.

Profa. PhD Ana Tereza de Mendona ViveirosUFLA

(Orientadora)

LAVRASMINAS GERAIS - BRASIL


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A meus pais, in memorian, em especial

minha me, por ter me apoiado tanto no

incio desta carreira durante a graduao. E

a meu filho pelo tempo que o privei de

minha companhia para realizar este

trabalho.

Dedico


6/83

AGRADECIMENTOS

Profa .PhD Ana Tereza de Mendona Viveiros, pela orientao e

apoio.

direo da Escola Agrotcnica Federal de Machado (E.A.F.M.), pela

minha liberao para este estudo e disponibilizao de suas instalaes,

equipamento e transporte para que se realizasse este trabalho.

Ao Prof. Dr. Luis David Solis Murgas, por disponibilizar o Laboratrio de

Fisiologia e Farmacologia.Ao Prof. Dr. Rilke Tadeu Fonseca Freitas e ao Prof. Dr. Daniel Furtado, pela

ajuda estatstica durante a elaborao do projeto.

minha amiga Martha Janeth Prieto Guevara, pelo apoio e companheirismo

desde os primeiros momentos deste curso, assim como pela participao em

todas a fases desta pesquisa.

minha irm, Juveli Morais e minha cunhada, Roselene N. Morais,

pela ajuda, apoio e o grande carinho dispensado a mim e a meu filho, em todos

os momentos deste trabalho.Aos colegas Alexandre Nizio Maria, Alexmiliano V. Oliveira e Alssio

B. Miliorini, pela ajuda recebida.

A Paulo Antnio Maciel e Jos Benedito Incio, pela ajuda na realizao dos

trabalho na Escola Agrotecnica Federal de Machado.

empresa Minitub do Brasil, pela doao das palhetas usadas no

experimento de congelamento de smen.

A todos aqueles que contriburam para a realizao deste trabalho.

MUI T O OBR I GADO!!


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SUMRIO

Pgina

LISTA DE TABELAS.................................................................. ................. ....i

LISTA DE FIGURAS................................................................... ............... .....iii

RESUMO.......................................................................................................... iv

ABSTRACT........................................................................................................v

1 INTRODUO ............................................................................................01

2 OBJETIVOS .................................................................................................03

2.1 Objetivo geral..............................................................................................03

2.2 Objetivos especficos ..................................................................................03

3 REVISO DE LITERATURA. .....................................................................04

3.1Leporinus macrocephalus ...........................................................................04

3.2 Biologia reprodutiva dos peixes .................................................................05

3.3 Reproduo em cativeiro.............................................................................08

3.4 Preservao de smen de peixe ...................................................................09

3.4.1 Solues ativadoras da motilidade espermtica e diluidores de smen ...10

3.4.2 Agentes crioprotetores .............................................................................12

3.4.3 Resfriamento do smen............................................................................14

3.4.4 Congelamento de smen ..........................................................................15

3.4.5 Descongelamento.....................................................................................17

4 MATERIAL E MTODOS ..........................................................................18

4.1 Local do estudo ...........................................................................................18

4.2 Origem, captura e seleo dos reprodutores................................................18

4.3 Tratamento hormonal e coleta do smen.....................................................21

4.4 Caractersticas seminais. .............................................................................21

4.5 Experimento I - Solues ativadoras da motilidade espermtica e diluidores

de smen de smen durante o resfriamento.................................................23


8/83

4.6 Experimento II - Crioprotetores durante o resfriamento .............................25

4.7 Experimento III - Congelamento do smen..................................................264.8 Anlise estatstica..........................................................................................28

5 RESULTADOS...............................................................................................32

5.1 Caractersticas seminais.................................................................................32

5.2 Experimento I - Solues ativadoras da motilidade espermtica e

diluidores de smen durante o resfriamento.................................................34

5.3 Experimento II - Uso de crioprotetores durante o resfriamento....................38

5.4 Experimento III - Congelamento do smen...................................................43

6 DISCUSSO..................................................................................................446.1 Caractersticas seminais.................................................................................44

6.2 Solues ativadoras da motilidade espermtica............................................45

6.3 Diluidores do smen durante o resfriamento.................................................47

6.4 Agentes crioprotetores...................................................................................48

6.5 Congelamento do smen................................................................................50

7 CONCLUSES...............................................................................................53

8 REFENCIAS BIBLIOGRFIA.....................................................................54

ANEXOS.............................................................................................................61


9/83

i

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Solues de NaCl como ativadoras e diluidoras

no smen dos peixes de espcies nativas............... 11

TABELA 2 Smen in natura preservado a temperaturas entre

0,5C e 2,9C ....................................................... 15

TABELA 3 Concentrao espermtica e volume de smen,

por faixa de peso de piau-au, observados nesse

estudo.................................................................... 32

TABELA 4 Coeficiente de correlao das caractersticas

seminais de piau-au em relao ao peso

corporal (n= 47)................................................... 33

TABELA 5 Efeitos de solues de NaCl e NaHCO3 em

diferentes concentraes sobre a taxa de

motilidade espermtica expressa em

porcentagem (mdia + desvio padro) do smen

fresco de piau-au............................................. 35

TABELA 6 Efeito de ativadores sobre a taxa de motilidade

espermtica expressa em porcentagem (Mdia

desvio padro) no smen fresco de piau-

au....................................................................... 37

TABELA 7 Motilidade espermtica expressa emporcentagem (mdia desvio padro), do

smen de piau-au, diludo em diferentes

solues e incubado a 5 C - 8C por at 48

horas................................................................... 39

TABELA 8 Taxa de motilidade espermtica expressa em

porcentagem (mdia desvio padro) do smende piau-au, incubado entre 5 C - 8 C, com

diluidores acrescidos de 10% de crioprotetorpor at 48 horas................................................... 40


10/83

ii

TABELA 9 Taxa de motilidade espermtica expressa em

porcentagem (mdia desvio padro) do smen

de piau-au, incubado entre 5 C - 8C comdiluidores acrescidos de um crioprotetor por at

48 horas............................................................... 42

TABELA 10 Taxa de motilidade espermtica expressa emporcentagem (Mdia desvio padro) do smen

de piau-au, criopreservado em diferentes

solues crioprotetoras....................................... 43


11/83

iii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Exemplar adulto de piau-au Leporinus

macrocephalus...................................................... 04

FIGURA 2 Diagrama do eixo hipotalmico hipofisrio

gonadal em peixes telesteos.1hormnio

liberador de gonadotropina2hormnio

luteinizante3hormnio foilculo esimulante......... 06

FIGURA3 Escola Agrotecnica Federal de Machado. A .

Vista parcial da Estao de Piscicultura; B.Laboratrio de reproduo, caixas de contenodos reprodutores................................................... 20

FIGURA4 A. Coleta do smen; B. Material utilizado para

avaliar a motilidade espermtica.......................... 22

FIGURA5 A. Envasamento do smen; B. Tipo de raque

usadas; C. Resfriamento de paletas no botijo de

vapor de nitrognio............................................... 27

FIGURA6 Espermatozoides de piau-au observados em

microscpio de contraste de fase, ocular100x...................................................................... 33

FIGURA7 Comportamento da motilidade espermtica aps

ativao em solues de NaCl e NaHCO3 emdiferentes concentraes no smen de piau -

au........................................................................ 36


12/83

iv

RESUMO

MORAES, Gilson Ferreira. Resfriamento e congelamento dosmen de piau-au Leporinus macrocephalus. 2004. 68 p.Dissertao (Mestrado em Aqicultura) Universidade

Federal de Lavras, Lavras, MG..*

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de preservao

de smen do piau-au (Leporinus macrocephalus) atravs do processo de

resfriamento e congelamento. Os trabalhos foram realizados na Escola

Agrotcnica Federal de Machado, Machado-MG. A taxa de motilidade

espermtica foi usada como medida para avaliar a qualidade do smen. No

experimento I foram avaliadas diversas solues diluidoras e ativadoras damotlidade espermtica comumente usadas em peixe, alm de solues de NaCl e

NaHCO3 em concentraes entre 25 e 200 mM. No experimento II foram

testados DMSO, etilenoglicol, glicerol e metanol como agentes crioprotetores

durante o resfriamento do smen. No experimento III amostras de smen foram

congeladas aps diluio em Kurokura (NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM, CaCl21,4 mM, NaHCO3 2,4 mM) e NaCl 200 mM associados a 5 e 10% de

etilenoglicol e Kurokura associado a 5, 10 e 15% de metanol. A melhor soluo

ativadora da motilidade espermtica foi NaCl 25 mM. Solues salinas de

kurokura, NaCl 200 mM e Ginsburg fish Ringer (NaCl 123,2 mM, KCl 3,75

mM, CaCl23,0 mM, NaHCO32,65 mM) mantiveram a viabilidade espermtica

durante 48 horas de resfriamento. Taxas de motilidade acima de 80% foram

obtidas nas amostras diludas em Kurokura associado ou no ao metanol. Todasas amostras de smen congelado apresentaram baixas taxas de motilidade aps o

descongelamento. A maior taxa de motilidade (8%) foi observada em amostras

diludas em Kurokura com 5% de metanol.Smen de piau-au diludo em

soluo de Kurokura associada ou no ao metanol, mantm alta taxa de

motilidade espermtica aps resfriamento por 48 horas. As baixas taxas de

motilidade espermtica encontradas no smen aps descongelamento, mostram a

necessidade de realizao de novos testes com outros diluidores e crioprotetores.

* Comit Orientador: Ana Tereza Mendona Viveiros - UFLA (Orientadora), Priscila

Rosa Vieira Logato UFLA, Luis David Solis Murgas - UFLA


13/83

v

ABSTRACT

MORAES, Gilson Ferreira. Semen cool storage and cryopreservation ofpiau-au Leporinus macrocephalus. 2004. 68 p. MSc Thesis

(Aquaculture) Federal University of Lavras, Lavras, MG.*

The aim of this research was to develop a cool storage and

cryopreservation protocol for piau-au (Leporinus macrocephalus) semen.

Sperm motility rate was used to access sperm quality after treatments. On

experiment I, several solutions commonly used as extenders or sperm motility

activators of fish semen, and NaCl and NaHCO3at 25 and 200 mM were tested.

On experiment II, DMSO, ethylene glycol, glycerol and methanol were tested as

cryoprotectants during cool storage. On experiment III, semen samples werefrozen after dilution on Kurokura solution (NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM, CaCl21,4 mM, NaHCO3 2,4 mM) or NaCl 200 mM combined with 5 or 10% ethylene

glycol, and Kurokura combined with 5, 10 or 15% methanol. NaCl 25 mM

induced the highest motility rate and was used as sperm activator afterwards.

Kurokura solution, NaCl 200 mM and Ginsburg fish Ringer (NaCl 123,2 mM,

KCl 3,75 mM, CaCl23,0 mM, NaHCO32,65 mM) maintained sperm viabilityduring 48 hours of cooling storage. Semen diluted on Kurokura combined or not

with methanol produced motility rates above 80% after activation. All frozen-

thawed semen samples showed very low motility rates. The highest motility rate

(8%) was obtained with samples diluted in Kurokura solution and 5% methanol.

Piau-au semen diluted in Kurokura solution maintain high sperm motility after

48-hour cooling. Due to the very low sperm motility after thawing, it isnecessary to further investigate the effect of other cryoprotectants and extenders

on cryopreservation of piau-au semen.

*Comit Orientador: Ana Tereza Mendona Viveiros - UFLA (Orientadora),

Priscila Rosa Vieira Logato UFLA, Luis David Solis Murgas - UFLA


14/83

1

1 INTRODUO

A constante interveno do homem no ambiente natural influencia

diretamente o hbitat de algumas espcies de peixes, principalmente aquelas que

realizam migraes durante o perodo reprodutivo, conhecidas por espcies de

piracema. A construo de grandes barragens, a poluio das guas, a pesca

predatria e a preferncia do consumidor por algumas espcies tm

proporcionado um declnio das populaes de peixes nos ambientes naturais.

Nesse contexto, a preservao de material gentico em espcies nativas por

congelamento assume um papel importante. Alm disso, o desenvolvimento de

tcnicas de preservao de smen proporciona melhoria no manejo reprodutivo,

pois a reproduo artificial de peixe em cativeiro, principalmente as espcies de

piracema, no tarefa fcil, j que, em cativeiro, estes peixes no sofrem os

estimulos ambientais necessrios para a sua reproduo.

A preservao de smen apresenta aplicaes prticas e cientficas. No

meio prtico, a preservao de smen pode melhorar o aproveitamento das

instalaes dentro das estaes de reproduo, reduzindo o estoque de machos,

eliminando a assincronia no amadurecimento dos gametas entre machos e

fmeas durante o perodo reprodutivo e auxiliando a recuperao de espcie

silvestres ameaadas de extino. No meio cientfico, pode-se citar o

fornecimento de material gentico para identificao de populaes, permitindo

estudos de melhoramento gentico e facilitando trocas e transportes de material

gentico entre instituies atuantes na rea.

O resfriamento de smen uma tcnica de preservao relativamente

simples, feito por meio de refrigerao a 4C 8 C, por perodos que variam de

dias at a algumas semanas.A criopreservao, por outro lado, uma tcnica bastante complexa e

refinada e, embora conserve o smen a -196C por tempo indeterminado, a


15/83

2

tcnica que mais causa danos aos espermatozides, como excessiva desidratao

e o rompimento da membrana, causado pela formao de cristais de gelo nos

meios intra e extracelular.

A escolha do mtodo de conservao do smen (resfriamento ou

criopreservao), do diluente e do crioprotetor depende da sensibilidade

espermtica queles agentes qumicos, do uso destinado ao smen e do

equipamento disponvel. Aps o trmino da preservao, os espermatozides

devem ter integridade das membranas, apresentar uma boa motilidade e ter

capacidade de fecundao.

O piau-au (Leporinusmacrocephalus) foi escolhido para este estudo

por se tratar de uma espcie nativa de grande interesse comercial que, quando

mantida em cativeiro, apresenta problemas reprodutivos, tais como a baixa

produo de smen nos meses de piracema e a assincronia na maturao gonadal

entre machos e fmeas.


16/83

3

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Desenvolver um protocolo de preservao de smen do piau-au

(Leporinus macrocephalus) a curto prazo, atravs do processo de resfriamento e,

a longo prazo, atravs do processo de congelamento.

2.2 Objetivos especficos

Caracterizar o smen quanto concentrao espermtica, volume obtido

atravs de massagem abdominal e caractersticas macroscpicas como

colorao e viscosidade;

avaliar solues diluidoras do smen e ativadoras da motilidade espermtica;

avaliar os efeitos dos crioprotetores durante os processos de resfriamento e

congelamento.


17/83

4

3 REVISO DE LITERATURA

3.1 Leporinus macrocephalus

Famlia: Anostomidae ;

Subfamlia: Characiformes;

Gnero:Leporinus (SPIX, 1829)

Espcie:Leporinusmacrocephalus ( Garavello & Britisk , 1988 )

Nome popular: Piau-au, Piaussu, Piauu, Piavuu.

FIGURA 1. Exemplar adulto de piau-auLeporinus macrocephalus

Originrio da Bacia do Rio Paraguai, o piau-au tem como caractersticas

corporais a boca grande e terminal no protrtil, corpo curto, grosso e coberto de

escamas. A colorao cinza-escuro, principalmente por causa da borda lateral

escura das escamas e o abdome amarelo. Indivduos de menor porte (at 25

cm) apresentam trs manchas verticais alongadas no flanco, que no aparecem

em indivduos maiores (acima de 40 cm). O piau apresenta nadadeiras dorsal,

adiposa, peitoral, abdominal, anal e caudal, podendo alcanar 50cm de


18/83

5

comprimento e at 6kg de peso vivo (Garavello & Britski, 1988). um peixe

que possui hbito alimentar onvoro, alimentase de vegetais, razes, frutas,insetos e eventualmente de moluscos, alm de adaptar-se muito bem rao

(Castagnolli,1992). Realiza piracema e sua reproduo ocorre entre os meses

outubro e janeiro, apresentando desova total com ovos demersais no aderentes.

Em situao de cativeiro, apresenta pouca produo de smen. uma espcie

explorada em cativeiro com o objetivo de produo de carne e para a pesca

esportiva (Amaral, 1998).

3.2

Biologia reprodutiva dos peixes

Os peixes, assim como os demais organismos vivos, devem se adaptar ao

ambiente se pretendem sobreviver e prosperar. O ponto vital neste esforo de

sobrevivncia a capacidade de se reproduzir repetidamente e com xito durante

sua vida, acrescentando uma grande prole populao. Nesse sentido, diversas

adaptaes podem ser observadas em diferentes espcies de peixes, como idade

da primeira maturao sexual, poca de reproduo, local de reproduo ecuidados parentais.

Em peixes, assim como em aves e mamferos, todo o mecanismo

endcrino do eixo hipotlamo-hipfise-gnada, tem relao direta com os

fatores ambientais. Nos peixes, os fatores, como temperatura, fotoperodo,

chuvas, qualidade da gua, disponibilidade de alimento e possibilidade de

realizar migraes, desencadeiam o mecanismo endcrino do eixo hipotlamo-

hipfise-gnada, como est descrito na Figura 2.


19/83

6

FIGURA 2. Diagrama do eixo hipotalmico-hipofisrio-gonadal, empeixes telesteos.

1hormnio liberador de gonadotropina;

2

hormnio luteinizante;3 hormnio folculo estimulante.

Adaptado de Viveiros, 2002.


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7

Os fatores ambientais estimulam o hipotlamo por meio de rgos

sensoriais ligados ao sistema nervoso. Se a intensidade dos estmulos for

suficiente para eliminar o efeito inibitrio da dopamina, o hipotlamo libera o

hormnio liberador de gonadotropina (GnRH) que vai estimular a hipfise a

liberar o hormnio luteinizante (LH) e o hormnio folculo estimulante (FSH).

As gonadas, uma vez estimuladas pelo LH e FSH, passam a liberar hormnio

ligado maturao final dos gametas 17 , 20 dihidroxi 4-pregnen 3-ona (17

, 20P4) responsvel pela migrao nuclear e pela hidratao do citoplasma

dos ovcitos. No estgio seguinte, a ovulao caracterizada pelo

desprendimento do ovcito do folculo para o lmen do ovrio, sob o controle do

hormnio prostaglandina (Woynarovich & Horvth, 1989; Sallum, 1999)

No caso dos machos, o sistema endcrino do eixo hipotalamo-hipfise-

gnada funciona da mesma forma que nas fmeas;, entretanto os hormnios

produzidos pelas gonadas so outros. Ao serem estimuladas pelo LH, as clulas

de Leydig presentes nos testculos produzem testosterona, que estimula a

espermatogonia a dividir-se em espermatcitos dentro das clulas de Sertoli. As

clulas de Leydig ainda produzem o 11-ketotestosterona, que responsvel pelo

incio do processo da liberao dos espermatozides no lmem do testculo e

produzem o 17 , 20 P4, que induz produo do fluido seminal no ducto

espermtico e acelera a espermiao (Sallum, 1999).


21/83

8

3.3 Reproduo em cativeiro

As espcies de peixes que se reproduzem em guas paradas podem

eventualmente se reproduzir em cativeiro sem a interveno do homem. J as

espcies que necessitam de realizar migraes, como os peixes de piracema,

apresentam deficincias orgnicas com respeito reproduo, quando em

cativeiro. Nas fmeas, os ovcitos se desenvolvem, mas h um fracasso na

maturao final, ovulao e desova. Nos machos, podem reduzir a produo e a

qualidade dos espermatozides. Estes problemas reprodutivos esto relacionados

com a ausncia de estmulos ambientais como chuvas, realizar migraes e

disponibilidade de alimentos que so necessrios para estimular o hipotlamo a

liberar o GnRH (Woynarovich & Horvth, 1989; Sallum, 1999).

Para induzir artificialmente as respostas metablicas provocadas pelos

estmulos ambientais, so utilizados hormnios que atuam diretamente no

sistema hipotalmico-hipofisrio-gonadal. Vrios produtos tm sido utilizados

para este fim: injees de extrato bruto de hipfise de carpa (EBHC),

gonadotropina corinica humana (hCG), GnRH e seus anlogos, que podem

tambm ser utilizados em conjunto com antagonistas da dopamina, como

exemplo: pimozida e domperidone. A induo hormonal aumenta a quantidade

de hormnio no organismo do peixe, suprindo as deficincias de fatores

ambientais, desencadeando o processo reprodutivo, chegando maturao final

dos ovcitos (Zohar, 2001).

Os machos mantidos em cativeiro produzem pequeno volume de smen,

muitas vezes com baixa qualidade dos espermatozides, inadequados para o

processo de fertilizao artificial. O tratamento hormonal produz um aumento

passageiro no plasma seminal e pequeno incremento na produo deespermatozides, resultando na produo de um smen mais diludo, com baixo

espermatcrito. A diluio do smen um efeito desejvel, pois a alta


22/83

9

concentrao de espermatozides faz com que o smen fique muito viscoso,

dificultando sua homogeneizao na gua e, conseqentemente, diminuindo sua

capacidade de fertilizao (Takashima et al., 1984).

Em espcies nativas, como pacu-caranha (Piaractus mesopotamicus) o

tratamento com EBHC associado ao GnRH atuou efetivamente e aumentou o

volume do smen em 6 vezes e o nmero de espermatozides extrudos em 4,5

vezes. Efeito semelhante foi observado em machos de piracanjuba (Brycon

orbignyanus) quando se usou EBHC, proporcionando um aumento no volume de

duas vezes e no nmero de espermatozides de l,8 vez, quando comparado ao

smen de peixes no tratados (Bedore, 1999). Ribeiro (2003) usou com sucesso

para piau-au (Leporinus macrocephalus), dose nica de buserelina (GnRHa)

0,5 ml por kg de PV, 12 horas antes da coleta. Reidel (2002) obteve sucesso na

extrao do smen de machos de piau-au, aplicando dose nica de 2 mg kg-1

de

PV de EBHC 7 horas antes da coleta, mantendo a temperatura da gua em 25 C.

3.4 Preservao de smen de peixe

O resfriamento e o congelamento so mtodos usados na preservao de

smen de peixe. No resfriamento, o smen preservado por um perodo curto,

dias ou at semanas, estocado a baixas temperaturas de 4C a 5 C. J no

congelamento, o smen estocado temperatura de 196 C, por um perodo

indeterminado (Harvey & Kelley, 1988). Tanto no processo de resfriamento

como no de congelamento, necessrio que se dilua o smen a ser preservado,

facilitando assim o contato dos espermatozides com oxignio, no caso do

resfriamento e com os crioprotetores, no caso do congelamento. Aps o smenter sido preservado, os espermatozides devem ser ativados com uma soluo


23/83

10

ativadora no momento de sua utilizao. Portanto, fundamental determinar

solues diluidoras do smen e ativadoras dos espermatozides.

3.4.1

Solues ativadoras da motilidade espermtica e diluidores de

smen

Soluo diluidora aquela que apenas dilui o smen, mantendo os

espermatozides imveis durante o armazenamento, enquanto que as solues

ativadoras promovem a ativao da motilidade dos espermatozides. H

substncias que podem ser ativadoras ou diluidoras, alterando apenas suas

concentraes, como, por exemplo o NaHCO3e NaCl.

No smen de curimat-pacu Prochilodus marggravii,as melhores taxas

de motilidade em solues de NaCl foram obtidas em baixas concentraes,

entre 25 e 75 mM, considerando que tambm bons resultados foram obtidos em

gua (Bedore et al., 1997). Solues de NaCl com concentraes de 200 mM e

150 mM no ativam os espermatozides, enquanto que, em concentraes de

100 mM a 25 mM, as taxas de motilidade crescem gradativamente, mas so

inferiores quando comparadas com gua destilada para o smen de curimbat

(Cruz, 2001). Testando o efeito de solues de NaCl em diferentes

concentraes no smen de pacu e piracanjuba, observou-se que os

espermatozides em concentraes de 150 mM ou maiores, permanecem

imveis, e em concentraes entre 25 mM e 75 mM, apresentaram as mais altas

taxas de ativao dos espermatozides (Bedore et al., 1999).

Em bagre africano (Clarias gariepinus), a motilidade espermtica caiu

parcialmente em soluo de NaCl entre 50 mM e 100 mM e, em solues comconcentraes acima de 200 mM, a motilidade foi totalmente inibida (Mansour

et al., 2002). A soluo ativadora de NaHCO3 119 mM produziu resultados


24/83

11

significativamente superiores a NaCl 25 mM e gua destilada, quando testadas

em smen criopreservados com os crioprotetores DMSO, dimetilacetamida e

propilenoglicol, na espcie piau-au (L. macrocephalus; Ribeiro, 2003).

A soluo de NaHCO3119 mM pode ser usada satisfatoriamente como

ativadora dos espermatozides dos peixes aps o descongelamento. No entanto,

quando se faz a fertilizao, os ovos se aglutinam no fundo do recipiente,

fazendo com que a taxa de ecloso seja zero (Silveira, 2000).

Marques (2001), trabalhando com espcies nativas, testou solues de

NaCl como ativadoras e diluidoras dos espermatozides, avaliando a

porcentagem de motilidade e a durao da motilidade espermtica, como pode

ser visto na Tabela 1.

TABELA 1. Solues de NaCl como ativadoras e diluidoras no smen depeixes dos espcies nativas

EspcieSol. ativadora

NaCl (mM)

Sol. Diluidora

NaCl (mM)

MatrinchBrycon lundii 50 150

PiracanjubaBrycon orbignyanus 50 150

Pacu-caranha Piaractus mesopotamicus 50 200

PiaparaLeporinus elongatus 25 150

Piau-trs-pintasLeporinus frederici 50 150

Curimbat Prochilodus lineatus 50 100 e 150

Curimat-pacu Piaractus maggravii 50 200

Surubim Pseudoplatystoma coruscans 75 100 e 150

Fonte: Adapitado de Marques 2001

No smen de piracanjuba (B. orbignyanus), o diluidor composto por

gua de coco, dimetilsulfxido (DMSO) 10% e gema de ovo 5% apresentou


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12

melhor resultado em relao ao diluidor contendo glicose 5%, DMSO 10% e

gema de ovo 5%. Como soluo ativadora, aps o descongelamento, o NaHCO3

119 mM demonstrou melhor resultado em relao a NaHCO3 0,5% e gua

destilada (Murgas et al., 2001). A preservao do smen de curimba

(Prochilodus lineatus) resfriado a 4 C, usando o diluidor de smen de suino BTS

(beltsville thawing solution), apresentou melhor motilidade aps 168 horas,

quando se acrescentou Kl 0,16% ao diluidor, do que quando se acrescentou

citrato de sdio 1,28% (Fransciscatto et al., 2002).

Uma soluo diluente no deve ativar os espermatozides e deve ser

utilizada no processo de criopreservao para facilitar o contato do crioprotetor

com a clula espermtica, fazendo com que este atinja o interior dos

espermatozides rapidamente (Carolsfeld & Harvey, 1999).

O smen de enguia (Anguilla japonica) demonstra uma tendncia de

aumento da motilidade quando se eleva o pH para bsico, atingindo um ponto

mximo em pH de 9,2, usando-se um diluidor base de NaHCO3 em pH,

variando de 6,2 at 10,2, foi observado motilidade espermtica entre 0 at

136,6%, respectivamente, quando comparados ao controle (Tanaka et al., 2002).

3.4.2

Agentes crioprotetores

Existem dois grupos de crioprotetores: os permeveis e os

impermeveis. Os crioprotetores permeveis, tambm chamados intracelulares

so capazes de passar pela membrana celular e entrar para o interior das clulas,

podendo-se citar como exemplos o DMSO, o glicerol e o metanol. Os

crioprotetores permeveis diminuem a velocidade da formao de gelo da guaintracelular, reduzindo o efeito da mudanas do volume da clula.


26/83

13

O grupo dos crioprotetores impermeveis, tambm chamados de

extracelulares, atravessam a membrana celular, como, por exemplo, acares

(sacarose e glicose) e protenas (gema de ovo, leite desnatado, soro e outros). Os

crioprotetores impermeveis tm habilidade de abaixar o ponto de congelamento

do meio extracelular. Combinando crioprotetores impermeveis com os

permeveis ocorre uma proteo mais completa da clula. A escolha de um

crioprotetor est associada toxicidade, permeabilidade na membrana celular e

solubilidade na gua durante o congelamento (Jamieson & Leung, 1991).

Dentre os crioprotetores usados na criopreservao do smen de peixe, o

metanol o mais permeavl, sendo eficiente em algumas espcies de peixes e

txico em outras (Harvey & Carosfeld, 1993). O metanol eficiente na

criopreservao dos espermatozides de tilpia (Harvey, 1983), salmondeos

(Lahnsteiner et al., 1997), bagre africano (C. gariepinus; Viveiros et al., 2000),

bitterling japanese (Tanakia limbata; Oiita et al., 2001); piracanjuba B.

orbignyanuse surubim P. Coruscans (Carolsfeld et al., 2003). J em espcies

como dourado (S. maxillosus; Carolsfeld et al., 2003) e pacu (P.mesopotamicus;

Bedore, 1989), no foi obtido bons resultados com o metanol como crioprotetor.

A permeabilidade dos crioprotetores pela membrana dos

espermatozides inversamente proporcional ao seu peso molecular. Em baixas

temperaturas, o DMSO continua permevel, isso pode ser usado para minimizar

sua toxicidade (Renard et al., 1984). O DMSO e o polietilenoglicol em

consrcio como crioprotetores uma combinao extremamente txica, porque

induz fuso da membrana dos espermatozides (Ashwood-Smith, 1986).

O DMSO 10% e DMA (dimetilacetamida) 10% apresentaram resultados

significativamente superiores ao glicerol 20% no processo de criopreservao do

smen de Salvelinus alpinusem palhetas de 1,7 mL (Richarson et at, 2000). Nobagre africano (C. gariepinus), o DMSO, nas concentraes de 5% e 10%, no

teve efeito txico sobre a qualidade do smen na taxa de fertilizao. J nas


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14

concentraes de 15% e 20%, os nveis de ecloso caram gradativamente

(Lock, 2000).

No smen de piau-au (Leporinus macrocephalus) foi testada a

toxicidade dos crioprotetores DMSO, DMA, propilenoglicol e metanol. Foi

observado que o incremento das concentraes de crioprotetores resulta na

reduo das respectivas taxas de motilidade. A reduo da taxa de motilidade foi

observada quando houve aumento de 5% para 10% de etilenoglicol,

propilenoglicol e metanol, assim como no aumento de 10% para 15% de DMSO

e DMA (Ribeiro et al., 2003).

3.4.3

Resfriamento do smen

Por ser um mtodo bastante simples de preservao de smen, o

resfriamento pode ser utilizado nas estaes de reproduo de peixe com

sucesso, podendo ser usado para solucionar vrios problemas de manejo

reprodutivo, tais como baixa produo de smen e assincronia na maturao

gonadal entre machos e fmeas.

Varias tcnicas so usadas no processo de resfriamento. O smen de

curimat-pacu (P. marggravii) foi conservado em geladeira, estocado em

seringas de 1ml e permaneceu com motilidade de 50%, aps 24 horas da coleta,

para peixes que foram tratados com E.B.H.C., enquanto que em smen de peixes

no tratados, aps 24 horas a motilidade foi quase nula (Bedore et al., 1997). No

smen de pacu (P.mesopotamicus), as maiores taxas de motilidade espermtica

observadas em 72 e 96 horas, foi no smen resfriado a 4 C com o diluidor 10%

DMSO, 5% BTS e 0,16% de KCl em relao ao smen diluido com o mesmodiluidor acrescido de 5% de DMSO (Miliorini et al., 2002).


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15

O smen de espcies nativas apresentando motilidade inicial de 80%, foi

preservado por algumas horas, mantidos em baixas temperaturas sem o uso de

diluidores, com pode ser visto na Tabela 2.

TABELA 2. Smen in natura preservado a temperaturas entre 0,5C a 2,9 C

EspcieTempo de Preservao

(horas)

Taxa de motilidade

(%)

Matrinch (B. lundii) 14 10

Piracanjuba (B. orbignyanus) 12 25

Piapara (L.elongatus) 8 30,5

Surubim (P. Coruscans) 18 25

Curimat-pacu (P. maggravii) 12 42

Curimbat (P. lineatus) 20 24

Piau-trs-pintas (L frederic) 7 34

Pacu-caranha (P. mesopotamicus) 20 40

Marques (2001)

3.4.4

Congelamento de smen

O smen de peixe a ser congelado necessita ser previamente diludo em

solues contendo diluidor(es) e crioprotetor(es). Os diluidores fazem com que o

crioprotetor atinja o interior dos espermatozides rapidamente, ao facilitar o seu

contato com a clula espermtica (Carolsfeld & Harvey, 1999). As propores

de diluio variam entre espcies e mesmo entre pesquisadores. Assim, Coser et

al. (1984) utilizaram a diluio de 1:4 (smen : diluente) para curimbat; Coser

et al. (1987) 1:4,5 para pacu; Harvey & Kelley (1988) 1:1 para tilpia; Babiak et

al. (1997) 1:3 para carpa comum e Bedore (1999) 1:4 para pacu-caranha e

piracanjuba.


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16

O congelamento deve ser feito em uma velocidade tima, em que no se

mantnha o equilbrio osmtico, saindo uma pequena quantidade de gua da

clula. A gua remanescente dentro da clula se vitrifica e forma pequenos

cristais de gelo tolervel a um rpido processo de descongelamento, evitando a

recristalizao. A baixa velocidade de congelamento causa excessiva perda de

gua da clula para o meio externo, pelo aumento da concentrao de soluto

extracelular, causando desidratao e morte da clula. Caso o congelamento seja

muito rpido, no haver tempo suficiente para a clula perder gua para o meio

externo, permanecendo grande quantidade de gua intracelular, formando

grandes cristais de gelo (Meryman et al., 1977; Ashwood-Smith, 1986).

O ponto de congelamento de uma soluo est linearmente relacionado

com a concentrao de soluto: quanto mais soluto, menor ser a temperatura de

congelamento. A relao entre a concentrao de soluto e o ponto de

congelamento ocorre at chegar a baixas temperaturas -100 C a -120C, no

mostrando influncia da presso atmosfrica. O ponto mximo de concentrao

de soluto para o congelamento estabelecido como ponto euttico (Jamieson,

1991).

O contato direto do smen com o nitrognio lquido provoca leses na

membrana plasmtica e pea intermediria do espermatozide. J no vapor

nitrognio lquido, os espermatozides sofrem um congelamento gradativo de

forma que as estruturas no so muito danificadas, embora o aspecto da

cromatina seja consideravelmente modificado (Billard, 1983). Os maiores

prejuzos conhecidos na estrutura dos espermatozides com relao ao

congelamento e descongelamento ocorrem na temperatura crtica entre 0 C e -40

C. De forma geral, a remoo de calor e a adio de crioprotetor so as causas

de prejuzos. J de uma forma mais detalhada, pode-se citar o choque de frio, osefeitos do pH, gelo intracelular e extracelular, soluto, volume e toxicidade dos

crioprotetores (Jamieson, 1991).


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17

A temperatura do smen deve ser levada rapidamente at -50C, porm

entre -50 a -80C deve ser em uma velocidade um pouco mais lenta. A partir

deste momento, o smen pode ser transferido para nitrognio lquido e a

temperatura levada a -196C (Horvarth & Caroslsfeld, 1993). Em contraste,

Viveiros et al. (2000) usaram trs etapas no congelamento do smen de bagre

africano (C. gariepinus). Primeiramente o smen foi resfriado a -5C/min entre

5 C a -40C. O smen permaneceu 5 minutos a -40C, depois foi mergulhado em

nitrognio lquido (-196C). Caroslsfeld et al. (2003), congelando smen de

espcies tropicais, levaram a temperatura de 28C para 8 C em 1 minuto e em

seguida, fizeram um rpido congelamento at -150C a -45C/min e uma

estabilizao mais gradual at 196 C.

Cruz (2001), realizando teste de velocidade de congelamento em botijo

de vapor de nitrognio lquido (CP 300 Taylor-Wharton), observou que a taxa de

resfriamento, medida entre 0 e 60 C, oscila entre 17,9 e 52,9 C/min, atingindo

-190 C aps 7 min, usando como embalagem paletas de 0,5 ml.

3.4.5

Descongelamento

A velocidade de congelamento , teoricamente, semelhante velocidade

de descongelamento. A maioria das clulas suporta um descongelamento rpido,

mesmo que ela no se hidrate totalmente, exceto para embries de mamferos. A

rapidez no descongelamento necessria para evitar a recristalizao, ou seja, o

agrupamento de pequenos cristais de gelo em grandes cristais de gelo, letal para

a clula (Jamieson, 1991).

H uma variao entre a opinio de diversos autores a respeito do tempoe da temperatura da gua para descongelar o smen estocado em palheta de 0,5

ml por meio de banho-maria. Richarson et at (2000) descongelaram smen de


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18

Salvelinus alpinusa 4C por 30 segundos; Horvarth & Urbnyi (2000) usaram

no smen de bagre-africano (C. gariepinus)40 C por 5 segundos; Murgas et al

(2001) usaram para o smen de piracanjuba (B. orbignyanus), 60C por 5

segundos; j Ribeiro (2003) descongelou o smen de piau-au (L.

macrocephalus) a 30C por 6 segundos.


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19

4 MATERIAL E MTODOS

4.1

Local do estudo

O presente trabalho foi realizado entre os meses de outubro de 2003 e

janeiro de 2004, no Setor de Piscicultura da Escola Agrotcnica Federal de

Machado, Machado,MG (E.A.F.M.)(Figura 2A). O municpio possui uma

topografia montanhosa, sua altitude mxima atinge 1.310 metros e a mnima 835

metros, estando a sede do municpio a 871 metros. A temperatura mdia anual

de 21,2C, com mdia mxima de 27 e mdia mnima de 14,2; o ndice

pluviomtrico no ano de 2001 foi de 1.824 mm. Machado situa-se na Bacia do

Rio Grande, fazendo parte das terras alagadas pela represa de Furnas. Seu

complexo hdrico formado pelos rios Dourado, Machado, So Tom e Sapuca,

alm dos crregos de Coroado, Jacutinga e Ouvidor.

4.2

Origem, captura e seleo dos reprodutores

Machos de piau-au (Leporinus macrocephalus) foram capturados em

viveiros de terra com 300 a 3000 m2e transferidos para viveiros de alvenaria de

100 m2 e 1 m de profundidade (Figura 3A). Os peixes foram selecionados

observando-se eliminao de smen em resposta a massagem manual na parede

celomtica e emisso de grunidos, seguindo os procedimentos descritos para esta

espcie por Sato (1999) e Ribeiro (2003).

Aps a seleo, os peixes foram levados ao laboratrio de reproduo da

E.A.F.M., onde foram pesados, identificados e mantidos 3 peixes por caixa de500 L (Figura 3B). A gua foi mantida a 25 C, com uma vazo em torno de 3


33/83

20

L/min. Aps a extruso do smen, os reprodutores receberam tratamento anti-

sptico e foram devolvidos aos viveiros de alvenaria.

FIGURA 3. Escola Agrotecnica Federal de Machado.A. Vista parcialda Estao de Piscicultura; B. Laboratrio de reproduo,

caixas de conteno dos reprodutores.

A

B


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21

4.3 Tratamento hormonal e coleta do smen

Os machos receberam uma injeo de EBHC, na dose de 0,5 mg/kg de

peso corporal, 12 horas antes da coleta do smen, de acordo com o manejo de

rotina da estao.

A coleta foi feita aps limpar e enxugar a papila urogenital com toalha

de papel. Para isso foram feitas massagens manuais na parede celomtica, no

sentido crnio-caudal, tomando cuidado para que no ocorresse contaminao do

smen com fezes, urina, sangue ou mesmo gua do tanque. O smen foi coletado

em seringas graduadas e mantidas em banho de gelo (Figura 4A).

4.4

Caractersticas seminais

As seguintes caractersticas macroscpica do smen foram analisadas:

colorao, volume e viscosidade. Para a certifio de que o smen coletado no

estava contaminado, uma gota de smen foi levada ao microscpio ptico

(400X) e observada a motilidade espermtica (Figura 4B). A ausncia de

motilidade espontnea demonstra a no contaminao do smen.

O volume seminal foi medido no momento da coleta, com auxlio de

seringas de 1 ml. A concentrao espermtica foi determinada em cmara de

Neubauer, aps diluio de 1:1000 em soluo formol-salina (formol 6% e NaCl

0,9%) (Hancock, 1957). O valor obtido foi multiplicado pelo fator de correo

50000, obtendo-se o nmero de espermatozoides/mm3de smen.


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22

FIGURA 4. A. Coleta do smen; B. Material utilizado para avaliar a

motilidade espermtica.

A


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23

4.5Experimento I Solues ativadoras da motilidade espermtica e

diluidores de smen durante o resfriamento

Experimento Ia- Neste experimento foram avaliadas solues de NaCl

e NaHCO3em diferentes concentraes: 25, 50, 75, 100, 125, 150 e 200 mM. O

objetivo foi determinar a concentrao que induz s maiores taxas de motilidade

espermtica, assim como a concentrao que dilui o smen sem ativar a

motilidade espermtica, para cada uma das solues.

Foi utilizado o smen de trs diferentes peixes. De cada peixe foram

feitas trs observaes para cada tratamento. As amostras de 1L de smen

foram colocadas em lmina histolgica previamente focalizada no microscpio

optico em 400X (Figura 4B). Neste momento, as amostras receberam as

solues a serem testadas, na proporo de 1:5 (smen: soluo).

A taxa de motilidade dos espermatozides, isto , porcentagem de

espermatozides mveis em relao ao total observado, foi estimada em cada

uma destas solues. A durao da motilidade foi observada at dois minutos

aps a ativao.

Experimento Ib - O objetivo desse experimento foi avaliar vrias

solues tidas como ativadoras da motilidade espermtica.

Foram testadas as seguintes solues: NaHCO350 e 75 mM, NaCl 25

mM, gua destilada e gua in natura. Foi utilizado smen de trs peixes e de

cada peixe foram feitas trs observaes para cada tratamento. Os testes de

motilidade foram feitos seguindo-se a mesma metodologia do experimento Ia.

Experimento Ic - Este experimento teve como objetivo avaliarsolues tidas com diluidoras do smen. Foi observado motilidade espermtica

no smen diluido em varias solues. Assim um grupo maior de soluo foi


37/83

24

testado como diluidora, dividindo o experimento em duas fases. Ainda, foi

observado que o pool de smen apresentou grande queda na taxa de motilidade,

em relao ao smen analisado individualmente. Assim, nos experimentos

seguintes, optou-se por testar os diluidores no smen de cada peixe

individualmente.

Primeira fase- foram testadas as seguintes solues como diluidoras do

smen :

a) NaCl 200 mM; ( pH 7,5 ; 399,84 mOsm/L)

b)

NaHCO3150 mM; ( pH 7,5 ; 300 mOsm/L)

c) NaHCO3200 mM; ( pH 7,5; 400 mOsm/L)

d) Ohta (Ohta and Izawa, 1996 ) : NaCl 143,3 mM, KCl 15,2 mM,

CaCl21,3 mM, MgCl21,6 mM, ( pH 8,2)

e) Kurokura (KuroKura et al, 1984) : NaCl 128,4 mM, KCl 2,7 mM,

CaCl21,4 mM, NaHCO3 2,4 mM, (pH 7,6)

Segunda fase- Foram testadas as seguintes solues como diluidoras do

smen :

a)Ginsburg fish Ringer I (G.F.R.I) (Adaptado de Ginsburg, 1963): NaCl

138,88 mM, KCl 4,19 mM, CaCl23,37 Mm; NaHCO32,97 mM, pH 7,6

b) Ginsburg fish Ringer II (G.F.R.II) (Viveiros et al, 2000): NaCl 123,2

mM, KCl 3,75 mM, CaCl23,0 mM, NaHCO32,65 mM, pH 7,6

c) Ginsburg fish Ringer III (G.F.R.III) (Ginsburg, 1963): NaCl 111,11

mM, KCl 3,35 mM, CaCl22,70 mM, NaHCO32,38 mM, pH 7,6

d) Extender II (Verreth, 1999): NaCl 76,92 mM; KCl 83,15mM;

MgCl26H20 0,787 mM; CaCl2 1,49 mM, NaHCO3 2,38 mM, pH 7,8;283mOsm/L.


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25

Em cada fase foi usado o smen de trs peixes. Uma alquota de smen

foi diluda 1:6 (smen : diluidor) e mantida em geladeira a temperatura entre 5C

e 8 C. A taxa de motilidade foi avaliada 0; 0,5; 1; 2; 12; 24 e 48 horas aps a

diluio, seguindo-se a metodologia do experimento Ia, proporcionando uma

diluio final de 1:42 (smen:soluo diluidora+ativadora).

4.6 Experimento II Crioprotetores durante o resfriamento

Experimento IIa Foi feito inicialmente uma avaliao dos

crioprotetores mais usados no smen de peixe : DMSO, etilenoglicol, glicerol e

o metanol. Cada criprotetor foi adicionado na concentrao de 10% a cada um

dos trs diferentes diluidores : NaCl 200 mM, Kurokura e Ginsburg fish Ringer

II (Experimento Ic).

Utilizou-se o smen de trs peixes. Uma alquota de smen foi diluda

1:6 (smen : diluidor + crioprotetor) e mantida em geladeira, sob temperatura de

5 C a 8 C. A taxa de motilidade foi avaliada 0; 0,5; 1; 24 e 48 horas aps a

diluio, seguindo-se a metodologia do experimento Ia.

Experimeto IIb Foram testados metanol e etilenoglicol nas

concentraes de 5, 10 e 15% associados aos diluidores NaCl 200 mM e

Kurokura.

Foi utilizado o smen de trs peixes. Uma alquota de smen foi diluda

1:10 (smen: diluidor+crioprotetor) e mantida em geladeira, sob temperatura de

4 C a 8 C. A taxa de motilidade foi avaliada 0; 0,5; 1; 24 e 48 horas aps a

diluio, seguindo-se a metodologia do experimento Ia.


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26

4.7.Experimento III - Congelamento do smen

Tendo como base o experimento IIb, foram tomadas as combinaes

diluidor + crioprotetor que proporcionaram as maiores taxas de motilidade

espermtica aps 30 minutos de incubao, pressupondo que o tempo de

manipulao do smen at iniciar o congelamento no ultrapasse esse perodo.

Devido ao pouco volume de smen obtido dos dois peixes utilizados, foi

necessrio fazer uma diluio maior, na proporo de 1:100

(smen:diluidor+crioprotetor). As solues crioprotetoras testadas foram NaCl

200 mM com 5% e 10% de metanol, Kurokura com 5%, 10% e 15% de metanol

e Kurokura com 5% e 10% de etilenoglicol.

O smen diludo foi envasado em palhetas de 0,5 mL numeradas,

(gentilmente doadas pela Minitub do Brasil), vedadas com esferas plsticas

(Figura 5A), acondicionadas em raques (Figura 5B), levando em torno de 2

minutos at serem transferidas para o botijo de vapor de nitrognio lquido

(Taylor-Warton, modelo CP 300) (Figura 5C). Decorridos 10 minutos de

exposio no vapor, as raques foram transferidas para botijo de nitrognio

lquido (M.V.E., modelo Volta 34).

A temperatura interna do botijo de vapor de nitrognio lquido foi

medida introduzindo-se a ponta do sensor de um termmetro digital (Figura 4C)

dentro de uma paleta de 0,5 mL vazia e ento colocada dentro do botijo na

mesma posio em que foram colocadas posteriormente as palhetas preenchidas

com smen diludo. Foi medido o tempo que a palheta levou para se estabilizar

em -176C, a partir da temperatura ambiente de aproximadamente 23 C.


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FIGURA 5. A. Evasamento do smen; B. Tipo de raque

usadas; C. Resfriamento de paletas no botijo

de vapor de nitrogenio.

C

B


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Aps 2 horas mantidas em nitrognio lquido, as palhetas foram

descongeladas em banho-maria a 60C, por 8 segundos com base em resultados

preliminares. Aps o descongelamento, a palheta foi enxugada, a extremidade

que estava vedada com esfera foi cortada e o smen depositado em placa de

petri, temperatura ambiente.

Do smen descongelado foram retiradas amostras de 1L colocadas em

lmina e ento levadas ao microscpio para realizar a leitura da motilidade. Foi

usada a soluo de NaCl 25 mM para ativar os espermatozides.

4.8 Anlise estatstica

Caractersticas seminais

A anlise de volume de smen e de concentrao espermtica foi feita em

relao ao peso dos doadores. Para isso, foi aplicado um teste de correlao de

Pearson, com o objetivo de se determinar uma possvel correlao entre as

variveis peso do doador, concentrao espermtica e volume de smen.

Experimento Ia e Ib - Foi usado um delineamento em bloco

inteiramente casualizado (DBC), em que o bloco controla a variao entre o

smen dos diferentes peixes . As mdias foram comparadas pelo teste de Scott-

Knott, 5% de significncia.


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29

O modelo estatstico utilizado foi o seguinte:

yij = + Ai + Bj + eij

em que:

yij = valor observado no tratamento i no bloco j;

= constante associada a todas as observaes;

Ai = efeitodo tratamento i, ( Exp Ia com i = 7 e Exp.Ib com i = 5 )

Bj = efeito do bloco j, com j=1,2,3;

eij= erro experimental associado a yij.

Experimento Ic (1 e 2 fase) e experimento IIa Foi utilizado um

DBC com parcela subdividida, usando no experimento Ic, o diluidor como

parcela e o tempo na subparcela. No experimento IIa o diluidor +10% de

crioprotetor foi analisado como parcela e o tempo na subparcela. O uso do bloco

serviu para controlar a variao entre smen dos diferentes peixes. As mdias

foram comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de significncia de.

O seguinte modelo estatstico foi utilizado:

yijk = + Di + Bj + eij + Tk + DTik + ek(ij)

em que:

yijk = observao referente subparcela k, da parcela i, no bloco j;


Di = efeito do tratamento i, (Exp.Ic: 1 fase i = 6; 2 fase i = 5 e Exp.IIa i =13)

Bj = efeito do bloco j,com j=1,2,3;

eij= erro experimental associado parcela i dentro do bloco j;

Tk= efeitodo tempo k, (Exp.Ic: 1 e 2 fase com k = 7; Exp.IIa com k = 5)

DTik = efeito da interao do diluidor i com o tempo k;ek(ij) = erro associado s observaes na subparcela k, dentro da parcela i do

bloco j.


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30

Experimento IIb Para testar diluidores associados a diferetesporcentagens de crioprotetores, foi usado um DBC com um fatorial na parcela

(2 diluidores X 2 crioprotetores) subdividida no tempo (5), em que o bloco

controla a variao entre o smen dos diferentes peixes.

O modelo estatstico utilizado foi:

Ykilj = +Di+Cl+Bj+(DC)il+e(il) j+Tk +ek(j)+(TD)ki+(TC)kl+(TDC)kil+ekil(j)

em que:

yijk = observao referente ao tempo k, do diluidor i, no crioprotetor l, no bloco j;


Di= efeito do diluidor i, com i = 1,2;

Cl= efeitodo crioprotetor l, com l = 1,2;

Bj = efeito do bloco j, com j=1,2,3;

(DC)il = efeito da interao crioprotetor i com o diluidor l, na parcela;

e(il) j= erro experimental associado parcela il dentro do bloco j.

Tk = efeito do tempo k, com k = 1,2...5;

ekj = erro experimental associado a observao do tempo k no bloco j;

(TD)ki= efeito da interao do tempo k com o diluidor i;

(TC)kl= efeito da interao do tempo k com o crioprotetor l da diluio;

(TDC)kil= efeito da interao do tempo k com o diluidor i com o crioprotetor l;

ekil(j) = erro associado s observaes na subparcela k, dentro da parcela i do

bloco j (Ykilj).


44/83

31

Experimento III - Congelamento do smen

Para o teste de congelamento, foi feito um delineamento inteiramente

casualizado (DIC), com trs repeties. As mdias foram comparadas pelo teste

de Scott-Knott a 5%de significncia.

O modelo estatstico utilizado foi:

yij = + Ti + eij

em que:

yij = valor observado no tratamento i no bloco j;


Ti = efeitodo tratamento i, com i = 1,2,3,...,7;

eij= erro experimental associado ao tratamento i dentro da repetio j, com j =

1,2,3.


45/83

32

5 RESULTADOS

5.1 Caractersticas seminais

O smen de piauau, nas condies deste trabalho, apresentou-se de

colorao branca e bastante viscoso. No entanto, o volume de smen obtido foi

muito baixo, variando de 0,13 mL a 0,79 mL dentre as diferentes faixas de peso,

como pode ser observado na Tabela 3. O volume de smen apresentou uma

correlao significativa, com um valor intermedirio (0,597), com o peso

corporal do peixe, indicando uma possvel correlao linear. A concentrao

espermtica no apresentou correlao com peso corporal, nem com o volume

do smen, como pode ser visto na Tabela 4.

TABELA 3. Concentrao espermtica e volume de smen, por faixa

de peso de piau-au, observados nesse estudo

Intervalo de

peso (g)

Freqncia

absoluta (n)

Freqncia

percentual

Sptz

x109mL

-1Volume

(mL)

[ 140 - 980) 4 8,51 4,91 0,13

[980 - 1820) 40 85,11 4,80 0.22

[1820-2660) 3 6,38 3,50 0.79

Total 47 100 Mdia 4,4

Sptz: espermatozoides


46/83

33

TABELA 4. Coeficiente de correlao das caractersticas seminais depiau-au em relao ao peso corporal (n= 47).

VarivelVolume de

smenPeso

Concentrao 0,038 ns -0,072 ns

Volume de smen

-

0,597 *

(*) significativa (p0,05)

O espermatozide de piau-au apresenta cabea de forma ovide,

caracterstica morfolgica bastante primitiva, de acordo com classificao de

Billard (1970) & Jameison (1991), como pode ser visto na Figura 6.

FIGURA 6. Espermatozoides de piau-au, observao em

microscpio de contraste de fase, ocular 100x


47/83

34

5.2Experimento I - Solues ativadoras da motilidade espermtica e

diluidores de smen durante o resfriamento

Experimento Ia - O aumento da concentrao de NaCl ou NaHCO3 e o

conseqente aumento na osmolaridade das solues testadas promoveram uma

diminuio na motilidade dos espermatozides de piau-au. A soluo de NaCl

25 mM induziu a motilidade em 78% dos espermatozides; quando a

concentrao da soluo de NaCl foi aumentada para 150 mM, a motilidade foi

induzida em apenas 2% dos espermatozides, tornando-se nula em soluo de

NaCl 200 mM, como apresentado na Tabela 5. J as solues pouco

concentradas de NaHCO3 se comportaram de forma diferente. A motilidade

espermtica aumentou quando a concentrao de NaHCO3passou de 25 mM a

75 mM. A partir de 75 mM houve uma queda da taxa de motilidade at que se

tornasse nula, nas concentraes de 150 e 200 mM (Tabela 5 e Figura 7).


48/83

35

TABELA 5. Efeitos de solues de NaCl e NaHCO3 em diferentesconcentraes sobre a taxa de motilidade espermtica expressa em

porcentagem (mdia + desvio padro) do smen fresco de piau-au

( experimento Ia)

Concentrao

(mM)NaCl NaHCO3

25 78 16a

61 10c

50 62 16b

74 8b

75 29 6c

81 2a

100 15 8c

12 2d

125 6 3d

5 2e

150 2 2d

0 0f

200 0 0d

0 0f

a-fMdias com letra igual na coluna no diferem entre si pelo teste Scott-Knot

p


49/83

36

2550

75100

125150

200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

(mM)

NaHCO3 NaCl

(%Tx.

Mot

ilidade

FIGURA 7. Comportamento da motilidade espermtica aps ativao em

solues de NaCl e NaHCO3em diferentes concentraes no smen de piau-au.

Experimento Ib - A soluo de NaCl 25 mM foi significativamente

mais eficiente, como ativador da motilidade espermtica, em relao aos demais

tratamentos testados, como pode ser visto na Tabela 6. Nas solues de

NaHCO3, no foi observada diferena significativa na taxa de motilidade

espermtica quando se aumentou a concentrao de 50 para 75 mM. As menores

taxas de motilidade espermticas foram observadas aps ativao dos

espermatozides, com gua destilada e gua in natura.


50/83

37

TABELA 6. Efeito de ativadores sobre a taxa de motilidade espermticaexpressa em porcentagem (mdia desvio padro) no smenfresco de piau-au (Experimento Ib)

Ativadores Motilidade (%)

gua destilada 47 7 c

gua in natura 51 5 c

NaHCO3 50 mM 78 9b

NaHCO3 75 mM 82 4b

NaCl 25 mM 87 4 aa-cMdias com letras iguais no diferem entre si, pelo teste Scott-Knott p0,05),

mantendo-se acima de 80% at 60 minutos aps a incubao. Imediatamente

aps a diluio do smen em soluo contendo crioprotetor (tempo 0), a

motilidade espermtica caiu (p


52/83

TABELA 7. Motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro), do smen

em diferentes solues e incubado a 5C- 8C por at 48 horas.Experimento Ic 1 e 2 Perodo de incubao (horas)

Diluidor0 0,5 1 2 12 2

1 Fase

Controle 87 3a A

77 10b B

83 4a A

86 5a A

73 26b B

59

NaHCO3 200mM 80 9b A

82 11a A

84 5a A

81 13a A

8 8c B

0

NaHCO3 150 mM 86 8a A

88 3a A

91 4a A

91 5a A

7 6c B

0

NaCl 200mM 82 4a A

84 9a A

86 3a A

89 7a A

87 6a A

85

Ohta & Izawa 75 3 b B 78 7 b B 82 5 a A 85 5 a A 84 7 a A 73

Kurokura 82 2a A

81 4b A

84 5a A

87 5a A

81 7a A

83

2 Fase

Controle 84 5a A

84 3a A

83 3a A

86 4a A

26 5c B

8

Ginsburg fish Ringer I 76 8a A

80 9a A

86 6a A

83 3a A

39 18b B

14

Ginsburg fish Ringer II 80 7a A

76 8a A

77 9b A

84 7a A

69 8a A

56

Ginsburg fish Ringer III 82 4a A

80 10a A

79 12b A

80 10a A

43 9b B

17

Extender II 19 4b A

22 7b A

21 3c A

21 7b A

29 6c A

20

a-d. A-DMdias com a mesma letra (maiscula na linha, minscula na coluna) no diferem entre sipelo teste scott-Knott p


53/83

TABELA 8. Taxa de motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro)

au, incubado entre 5-8C com diluidores acrescidos de 10% de crioprotetor por atSolues Perodo de incubao (horas)

Diluidor Crioprotetor 0 0,5 1 24

Controle --------- 91 8a A

87 5a A

86 5a A

17 10b B

DMSO 88 5a A

69 17bB

68 12b B

7 5cC

Glicerol 70 17b A

63 11c A

62 10b A

3 5c B

Etilenoglicol 80 27a A

74 12b A

68 17b B

0 0c C

NaCl 200mM

Metanol 90 9a A

74 19b B

77 14a B

3 5c C

DMSO 73 5b A

39 9d B

19 12d C

0 0c D

Glicerol 73 5b A

72 10b A

80 0a A

3 5c B

Etilenoglicol 76 11b A

46 7d B

50 13c B

1 0c C

Ginsburg

fish Ringer

Metanol 82 4a A

79 4a A

81 8a A

21 32b B

DMSO 73 9b A

60 7 c B

68 8b A

0 0c C

Glicerol 54 9c A

30 0e B

20 13d C

0 0c D

Etilenoglicol 84 7a A

73 7b B

84 8a A

3 5c C

Kurokura

Metanol 92 6a A

88 4a A

92 4a A

63 10a B

a-d. A-D Mdias com mesma letra (minscula na coluna, maiscula na linha) no diferem entre

0,05)

40


54/83

41

Quando comparadas com o tempo 0 de incubao, 5 solues alm do

controle mantiveram altas taxas de motilidade espermtica aps 30 minutos deincubao: NaCl + glicerol, NaCl + tilenoglicol; G.F.R.II + glicerol, G.F.R.II +

metanol e Kurokura + metanol. As amostras de smen diluidas em G. F. R.II

acrecidas de metanol (79% de motilidade espermtica) e Kurokura acrescidas

metanol (88%) foram estatisticamente iguais ao controle (87%), aps 30 minutos

de incubao.

Aps 48 horas de incubao, o smen diludo em Ginsburg fish Ringer

II associado a metanol ainda apresentou 23% de motilidade espermtica e o

smen diludo em Kurokura associado a metanol apresentou 14% de motilidadeespermtica. As amostras diludas nas outras solues, bem como o controle,

apresentaram taxas de motilidade espermtica muito baixas (at 1%; Tabela 8).

Experimento IIb Os resultados deste experimento mostram que no

houve diferena significativa (p>0,05) na taxa de motilidade espermtica entre o

controle (84%) e as 16 combinaes de diluidor com crioprotetor, 30 minutos

aps a incubao, como apresentado na Tabela 9.

Aps 48 horas de incubao taxas de motilidade espermtica acima de50% foram observadas nas amostras de smen diludas em solues de Kurokura

com 0%, 5%, 10% e 15% de metanol e Kurokura com 0% e 5% de etilenoglicol.

importante salientar ainda que o smen diludo em Kurokura associado a 0%,

5% e 15% de metanol no sofreu efeito do tempo de incubao, mantendo taxas

de motilidade espermtica semelhantes (p>0,05) quelas registradas logo aps a

diluio (tempo 0; Tabela 9).


55/83

TABELA 9. Taxa de motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro) de s

acu, incubado entre 5 C-8C com diluidores acrescido de um crioprotetorpor at 48 horaSolues Perodo de incubao (horas)

Diluidor Crioprotetor % Crioprot. 0 0,5 1 24

Controle --------- --------- 87 6aA

84 7aA

90 1aA

42 24

0 87 5aA

82 4aA

73 13aA

31 6

5 82 8aA

81 10aA

74 12aA

42 16

10 88 4aA

84 5aA

73 15aA

40 9Metanol

15 86 5aA

79 6aA

61 20bB

20 20

0 89 3aA

76 19aA

79 9aA

54 26

5 80 9aA

72 7aA

77 10aA

27 25

10 78 8aA

69 10aA

78 15aA

2 2e

NaCl

200mM

Etilenoglico

l

15 76 5aA

61 6aA

44 27cA

1 0e

0 86 5aA

78 8aA

87 5aA

70 16

5 87 5aA

89 3aA

88 4aA

82 4

10 90 3aA

79 14aA

81 14aA

83 5Metanol

15 85 16aA

81 12aA

84 7aA

83 5

0 88 4aA

81 13aA

84 5aA

76 21

5 83 5aA

87 5aA

85 5aA

72 7

10 86 5aA

84 5aA

77 7aA

44 9

Kurokura

Etilenoglico

l

15 68 16aA

60 14aA

59 10bB

1 0e

a-e. A-D Mdias com mesma letra (minscula na coluna, maiscula na linha) no diferem entre si (

42


56/83

43

5.4 Experimento III - Congelamento do smen

No procedimento para o congelamento do smen, foi registrado o tempo

necessrio para a queda da temperatura de 23 C at -80C, de 1,16 minuto em

mdia, gerando uma velocidade de congelamento de 88,8 C min-1

. As amostras

precisaram de cerca de 7 minutos para estabilizar a temperatura a -176C, sob as

condies de trabalho com o botijo de vapor de nitrognio lquido.

As amostra de smen congelado em Kurokura acrescidas de 5% de

metanol e 5% de etilenoglicol apresentaram motilidade espermtica aps o

descogelamento de 8% e 4%, respectivamente. Smen congelado em outras

solues no apresentou motilidade aps o descongelamento (Tabela 10).

TABELA 10. Taxa de motilidade espermtica expressa em porcentagem (mdia desvio padro) do smen de piau-au, criopreservado em

diferentes solues crioprotetoras (Exp.III).

Diluidor Crioprotetor Crioprotetor (%) Motilidade (%)

5% 4 6b

Etilenoglicol10% 0 0

c

5% 8 3a

10% 0 0c

Kurokura

Metanol

15% 0 0c

5% 0 0c

NaCl Etilenoglicol10% 0 0

c

a-cMdias seguidas da mesma letra na coluna no diferem entre si, pelo teste

Scott-Knott p


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44

6 DISCUSSO

6.1 Caractersticas seminais

As caractersticas observadas no smen de piau-au, assim como o baixo

volume de smen produzido (0,13 a 0,79 mL), coincidem com o descrito para as

espcies nativas, com exceo dos peixes de couro (Godinho, 2000). Na

tentativa de contornar essa dificuldade, alguns estudos foram feitos com o smen

de piau-au, coletado diretamente do testculo com o sacrifcio do macho

(Ribeiro, 2003).

A concentrao espermtica mdia do smen de piau-au observada no

presente estudo (4,4 x 109 sptz mL

-1) mostra valores relativamente baixos

quando comparados com o smen de outras espcies. Variadas taxas de

concentraes espermtica so descritas para diferentes espcies de peixes

nativos: piapara Leporinus elongatus 7 a 16 x 109

sptz.mL-1

; pacu-caranha

Piaractusmesopotamicus 7,1 a 11,1 x 109sptz.mL

-1; dourado S. maxillosus4,3 a

10 x 109

sptz.mL-1

(Godinho & Cser, 1995); curimat-pacu Prochilodus

marggravii 19 x 109

sptz.mL-1

(Bedore et al., 1997); curimbat Prochilodus

lineatus 10,6 x 109

sptz.mL-1

(Fransciscato et al., 2002) e pacu Piaractus

mesopotamicus 18,62 x 109

sptz.mL-1

(Miliorini et al., 2002). Como se pode ver

visto, h uma grande variao na concentrao espermtica entre as diferentes

espcies de peixes e at dentre as mesmas espcies. Estas variaes podem ser

explicadas pela variabilidade gentica entre as diferentes espcies e entre

indivduos da mesma espcie, seja pela incidncia da poca de coleta do smen,

pelo manejo de manuteno dos reprodutores e pelas condies ambientais daregio em que os dados foram coletados.


58/83

45

Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que no houve

correlao entre peso do reprodutor e concentrao espermtica e nem entre ovolume de smen coletado e concentrao espermtica (p>0,05). No entanto, a

correlao entre peso corporal e volume do smen apresentou-se significativa

com um valor intermedirio (0,597), indicando uma possvel correlao linear.

Convm salientar que necessrio investigar outros fatores, tais como gentica,

alimentao, poca de coleta, etc., para confirmar a correlao entre peso

corporal e volume de smen coletado.

6.2 Solues ativadorasda motilidade espermtica

Em espcies de peixes de gua doce, a motilidade dos espermatozides

iniciada quando o smen entra em contato com a gua, pela diminuio da

osmolaridade (Inoda, 1987; Carolsfeld & Harvey, 1999). A diferena existente

entre a baixa presso osmtica da gua em relao ao plasma seminal essencial

para iniciar a motilidade espermtica nessas espcies (Godinho, 2000). O smen

de peixes de gua doce pode tolerar osmolaridades entre 0 e 300 mOsml L-1

(Dzuba, 2002). Na frica do Sul, foi observada osmolaridade do smen ao redor

de 250 mOsmol L-1em espcies de gua doce (Inoda, 1987). No presente estudo,

baixas concentraes (< 75 mM) e conseqentemente, baixa osmolaridade (Fc----------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 196.761905 2.942 0.0912TRAT. 6 2861.777778 42.794 0.0000erro 12 66.873016----------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 20 18366.666667----------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) = 29.56Mdia geral: 27.6666667 Nmero de observaes: 21----------------------------------------------------------------------------------------------

NaHCO3----------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc----------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 1220.333333 5.657 0.0186TRAT. 6 3179.269841 14.738 0.0001erro 12 215.722222------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 20 24104.952381------------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) = 43.26Mdia geral: 33.9523810 Nmero de observaes: 21------------------------------------------------------------------------------------------------


76/83

63

ANEXO 2

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES ATIVADORASDA MOTILIDADE ESPERMTICA (EXP. Ib)

-------------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc-------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 120.555556 7.041 0.0025TRAT 4 2500.555556 15.712 0.0000erro 38 59.152047-------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 44 18291.111111-------------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) = 19.28Mdia geral: 65.4444444 Nmero de observaes: 45-------------------------------------------------------------------------------------------------


77/83

64

ANEXO 3

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORAS DOSMEN (EXP. IC 1a FASE)

-------------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc-------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 1886.637566 7.402 0.0081TEMPO 6 36556.227513 143.426 0.0000erro 1 12 254.878307TRAT 5 11021.839153 250.411 0.0000TEMPO*TRAT 30 3723.357672 84.593 0.0000erro 2 322 14172.851852 44. 015068-------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 377 407151.957672-------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) = 24.40CV 2 (%) = 10.14Mdia geral: 65.4179894 Nmero de observaes: 378-------------------------------------------------------------------------------------------------


78/83

65

ANEXO 4

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORASDO SMEN (EXP. IC 2a FASE)

----------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc---------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 6291.622222 3.251 0.0744TEMPO 6 32030.980952 16.550 0.0000erro 1 12 1935.433333TRAT 4 27892.869841 16.436 0.0000TEMPO*TRAT 24 3545.999471 2.090 0.0027erro 2 266 1697.012531----------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 314 876075.130159----------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) = 82.60CV 2 (%) = 77.34Mdia geral: 53.2634921 Nmero de observaes: 315----------------------------------------------------------------------------------------------


79/83

66

ANEXO 5

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUES DILUIDORASACRESCIDAS DE 10% DE CRIOPROTETORES (EXP.IIa)

-------------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc-------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 3 076.977117 1.823 0.1711TRAT 12 7606.543875 12.876 0.0000erro 1 23 590.769168TEMPO 4 47960.494017 1817.335 0.0000TRAT*TEMPO 48 1107.281054 13.600 0.0000erro 2 494 81.416194-------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 584 793308.215385-------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) = 54.55CV 2 (%) = 20.25Mdia geral: 44.5589744 Nmero de observaes: 585-------------------------------------------------------------------------------------------------


80/83

67

ANEXO 6

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLES DILUIDORASACRESCIDAS DE CRIOPROTETORES NA PRESERVAO DO SMEN(EXP. IIb)

-------------------------------------------------------------------------------------------------FV GL QM Fc Pr>Fc-------------------------------------------------------------------------------------------------BLOCO 2 4696.236601 6.527 0.0042TRAT 16 10856.666340 15.090 0.0000erro 1 32 719.468546TEMPO 4 89507.341830 137.626 0.0000erro 2 8 650.367320TEMPO*TRAT 64 1987.534191 25.035 0.0000erro 3 638 79.388776-------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 764 747206.661438-------------------------------------------------------------------------------------------------CV 1 (%) = 43.03CV 2 (%) = 40.91CV 3 (%) = 14.29Mdia geral: 62.3359477 Nmero de observaes: 765-------------------------------------------------------------------------------------------------


81/83

68

ANEXO 7

ANLISE DE VARINCIA DO EFEITO DE SOLUESCRIOPROTETORAS NO CONGELAMENTO DO SMEN (EXP. VI)

-------------------------------------------------------------------------------------------------FV . GL SQ QM Fc Pr>Fc-------------------------------------------------------------------------------------------------Repetio . 2 75.523810 37.761905 6.961 0.0020Trat 6 579.269841 96.544974 17.798 0.0000erro 54 292.920635 5.424456------------------------------------------------------------------------------------------------Total corrigido 62 947.714286------------------------------------------------------------------------------------------------CV (%) = 128.71Mdia geral: 1.8095238 Nmero de observaes: 63------------------------------------------------------------------------------------------------


82/83
http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1http://www.livrosgratis.c

resfriamento e congelamento de sêmen de piau

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