qualidade do sêmen fresco e criopreservado de touros

LUIS EDUARDO SENRA E SILVA

Qualidade do sêmen fresco e criopreservado de touros Pantaneiros: efeito da época

do ano e antioxidantes

Cuiabá

2014

LUIS EDUARDO SENRA E SILVA

Qualidade do sêmen fresco e criopreservado de touros Pantaneiros: efeito da época

do ano e antioxidantes

Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.

Área de Concentração: Manejo Reprodutivo Orientadora: Profª. Drª. Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis Co-orientador: Joanis Tilemahos Zervoudakis Co-orientador: Alexandre Floriani Ramos

Cuiabá

2014

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aluno: Luis Eduardo Senra e Silva

Título: QUALIDADE DO SÊMEN FRESCO E CRIOPRESERVADO DE TOUROS

PANTANEIROS: EFEITO DA ÉPOCA DO ANO E ANTIOXIDANTES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.

Aprovado em: 02/04/2014

Banca Examinadora:

Profa. Dra.: Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis

Instituição: PGCA/UFMT Assinatura:__________________________________

Prof. Dr.: Joanis Tilemahos Zeuvoudakis

Instituição: PGCA/UFMT Assinatura:__________________________________

Dr.: Alexandre Floriani Ramos

Instituição: EMBRAPA/CENARGEN Assinatura:___________________________

Dedicatória

À Deus

Aos meus pais Carlos Eduardo in memoriam e Jane

Ao meu irmão Luis Fernando

Aos meus amigos

Agradecimentos

Agradeço primeiramente à Deus pela vida, saúde e paz.

À minha mãe Jane Ferreira Senra e Silva, pela educação, carinho, esforço para que

meu sonho se tornasse possível. Ao meu pai Carlos Eduardo da Silva, por ter me

ensinado que a graça da vida é ter sonhos, realiza-los e comemorar com um bom

samba e a presença dos amigos e que mesmo não estando mais aqui entre nós, sei

que está lá cima muito feliz por esta conquista. Ao meu irmão Luis Fernando Senra e

Silva, pelo companheirismo, amizade e por compartilhar os momentos bons e ruins.

Aos meus avós pelo carinho, sabedoria e dedicação.

Aos professores, Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis e Joanis Tilemahos

Zervoudakis, pelo conhecimento e por me fazerem entender que apenas os bons

chegarão a grandes lugares e farão a diferença no mundo em que vivem.

Ao professor Dr. Alexandre Floriani Ramos por aceitar participar da minha banca e

por trazer suas contribuições e ao professor Richard por ceder gentilmente o

microscópio de contraste de fase do laboratório de Biologia Molecular.

Aos amigos do NERP e ao professor Daniel de Paula Sousa, por me ensinarem ao

não ficar parado no tempo e que para chegar à lugares onde ninguém ainda chegou

é preciso fazer algo que ninguém ainda fez.

Ao grupo de samba, pescaria, churrasco e futebol Canarinhos: Japa, Renato, Samu

(Gordines), Breno (Mussum), Bieh, Murilo, Prof. Edivaldo (Major), Cara de Gato,

Endy, Gutão e as respectivas canarinhas.

Aos companheiros de sala Adriano (Shrek), Wagner (Cinquentinha) e Gessy pelas

risadas, aprendizados, aflições, enfim, pelos momentos juntos.

À equipe do Labra: Moacir, Pedro, Larissa, Fabiana, Ana, Rodrigo, Thiago, Ceará,

Lívia, Zepinha e Juliana pela ajuda durante a execução do experimento e por serem

mais que companheiros de pós-graduação ou estagiários e se tornarem verdadeiros

amigos.

Ao Thomas Horton e sua família por ceder a fazenda e os animais, bem como, todo

o apoio para realização do experimento.

Ao CNPq pela bolsa de estudos e ao Programa de Pós Graduação em Ciência

Animal pela estrutura oferecida.

Sumário

Lista de Tabelas .................................................................................................................................. 5

Lista de Figuras .................................................................................................................................. 6

Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos .................................................................................... 7

Resumo .................................................................................................................................................. 9

Abstract ................................................................................................................................................ 11

1. Introdução .................................................................................................................................. 13

2. Hipótese ...................................................................................................................................... 14

3. Revisão Bibliográfica .............................................................................................................. 14

3.1. Bovino Pantaneiro............................................................................................................ 14

3.2. Estresse térmico e fertilidade de machos ................................................................. 17

3.3. Criopreservação de sêmen ............................................................................................ 19

3.4. Estresse oxidativo............................................................................................................ 20

3.5. Estresse oxidativo e infertilidade em reprodutores bovinos ............................... 22

3.6. Espécies reativas de oxigênio ...................................................................................... 22

3.6.1. Ânion superóxido (O2) ............................................................................................. 23

3.6.2. Peróxido de Hidrogênio (H2O2) ............................................................................. 24

3.6.3. Radical Hidroxila (OH-) ............................................................................................ 24

3.7. Mecanismo antioxidante ................................................................................................ 25

3.7.1. Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) ............. 25

3.7.2. Ácido ascórbico ........................................................................................................ 26

3.8. Vitaminas x Ruminantes ................................................................................................. 26

4. Considerações Finais.............................................................................................................. 28

5. Referências Bibliográficas ..................................................................................................... 29

5

Lista de Tabelas

Tabela 1. Caracterização fenotípica dos bovinos Pantaneiros..................... 16

Tabela 2. Médias e valores de P de variáveis analisadas em função da

raça (Nelore x Pantaneiro), estação (verão x inverno) e a

interação entre eles....................................................................... 47

Tabela 3. Médias, desvio padrão dos valores de motilidade (MOT), vigor

(VIG), viabilidade (VIAB) e integridade de membrana

acrossomal (IMA) e valor de P para raça (Nelore x Pantaneiro)

estação (verão x inverno) e a interação entre eles....................... 47

Tabela 4. Atividade citoquímica mitocondrial de touros Pantaneiro e

Nelore em diferentes estações do ano.......................................... 48

Tabela 5. Média e desvio padrão de variáveis relacionadas à função

espermática de acordo com a suplementação do meio diluidor... 58

Tabela 6. Atividade citoquímica mitocondrial de acordo com a adição ou

não de vitamina C, Trolox ou a interação entre eles..................... 61

6

Lista de Figuras

Figura 1. Formação de espécies reativas de oxigênio (EROs).................... 23

Figura 2.

Efeito da raça e estação do ano sobre a porcentagem de

defeitos menores, maiores e totais (topo da coluna) do sêmen

fresco de touros Pantaneiro e Nelore............................................ 46

Figura 3.

Porcentagem de células com membrana íntegra e viáveis de

acordo com os antioxidantes no meio diluidor.............................. 60

7

Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos

ASBIA Associação Brasileira de Inseminação Artificial

ATP Adenosina Trifosfato

C Celcius

CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

cm Centímetro

cv Cultivar

DAB Diaminobenzidina

DNA Ácido Desoxirribonucleico

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

Fe2+ Ferro Bivalente

Fe3+ Ferro Trivalente

g grama

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia Estatística

IMEA Instituto Matogrossense de Economia Agropecuária Aplicada

Kg Quilograma

LOO- Radical Peroxil

m Metros

M Molar

MDA Malondialdeído

mg Miligrama

min Minuto

mL Mililitros

mm Milímetro

mM Milimolar

MS Mato Grosso do Sul

n Número

NaOH Hidróxido de Sódio

nm Nanômetro

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato

O2 Oxigênio

O2- Ânion Superóxido

8

OH- Radical Hidroxila

p Página

P Probabilidade

PBS Solução Salina Fosfatada Tamponada

SAS Statistical Analysis System

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TCA Ácido Tricloroacético

UI Unidade Internacional

v Volume

vs Versus

µg Micrograma

μL Microlitros

% Porcentagem

± Mais ou menos

α Alfa

º Graus

9

Resumo

O estresse térmico normalmente leva a degeneração testicular em reprodutores

bovinos e entre eles os Bos taurus são menos resistentes às alterações. Embora

sejam de origem europeia os animais da raça Pantaneiro estão adaptados à

região do Pantanal, e desse modo não se sabe qual a sua suscetibilidade as

altas temperaturas e a influência em relação à qualidade seminal. No que diz

respeito à criopreservação de sêmen, sabe-se que uma das principais causas da

redução da sua qualidade é o estresse oxidativo, embora muitas pesquisas

tenham sido feitas no sentido de fornecer agentes antioxidantes aos animais e

diminuir a peroxidação dos lipídios causadas pelos radicais livres, resultados

contraditórios tem sido encontrados e poucos pesquisadores têm levado em

conta o estado fisiológico dos animais. Neste contexto, nosso objetivo foi avaliar

a sazonalidade sobre a qualidade espermática de touros Pantaneiros, bem como,

identificar o efeito da adição de antioxidantes ao diluidor seminal em épocas de

características climáticas distintas. No experimento 1 foram utilizados 7

reprodutores Pantaneiros e 3 Nelore, a coleta de sêmen foi feita em Janeiro e

Julho de 2013 e foram avaliados, circunferência e consistência testicular,

motilidade, vigor, viabilidade, concentração, integridade de membrana

acrossomal, morfologia espermática, atividade citoquímica mitocondrial e a

quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. O experimento foi

conduzido em delineamento inteiramente casualizado, e arranjo fatorial 2x2 (2

raças e 2 estações do ano). A integridade da membrana plasmática foi menor na

estação de inverno (95,76 ± 1,77% vs. 87,07 ± 4,78% P=0,03), os animais da

raça Nelore tiveram maior quantidade de defeito menor no verão (2,16 ± 1,09%

vs. 0,57 ± 0,31%; P=0,02), maior porcentagem de defeito maior (61,91 ± 5,92%

vs. 26 ± 3,83% P=0,01) e defeitos totais (62,58 ± 5,63% vs. 27,33 ± 3,91%

P=0,03) no inverno. O do sêmen congelado não sofreu influencia da raça,

estação do ano ou interação entre eles. Os resultados encontrados podem ser

explicados pela adaptação dos animais Pantaneiros ao Pantanal deste modo,

nesta região, reprodutores Pantaneiros são mais indicados, uma vez que sua

qualidade seminal não é afetada negativamente pela estação do ano. No

experimento 2 foram utilizados os mesmo animais, porém no momento da

diluição do sêmen foi adicionado 10 mM de Trolox/20x106 espermatozoides; ou

2,25 mg de ácido ascórbico/20x106 de espermatozoides; ou ainda a combinação

10

entre eles. Após a descongelação foi realizada a análise de motilidade, vigor,

viabilidade espermática, integridade de membrana acrossomal, atividade

citoquímica mitocondrial e peroxidação lipídica espontânea. O experimento foi

conduzido em delineamento inteiramente casualizado, e arranjo fatorial 2x2x4 (2

raças e 2 estações do ano e 4 tratamentos antioxidantes). Nenhuma das

variáveis apresentou diferença significativa. A motilidade, vigor, integridade

acrossomal e atividade mitocondrial foram reduzidas com a adição de

antioxidantes (P<0,05) em especial a interação entre vitamina C e Trolox. Ainda,

a adição de antioxidantes não mudou o nível de lipoperoxidação (P.0,05). Os

resultados podem ser explicados pela diminuição dos níveis de espécies reativas

de oxigênio causada pelos antioxidantes e uma possível inibição da sinalização

para eventos como movimento do espermatozoide e atividade das mitocôndrias,

dessa forma, pode-se inferir que os animais utilizados não apresentavam

deficiência de vitaminas e a sua demanda, especialmente de vitamina E, foi

atendida pela alimentação.

Palavras-chave: antioxidantes, estresse oxidativo, sazonalidade

11

Abstract

Heat stress usually leads to testicular degeneration in cattle breeding and Bos

taurus are less resistant to alterations. Although the Pantaneiro breed is

European origin the animals are adapted to Pantanal region, and thus it is unclear

what their susceptibility to high temperatures and influence in relation to semen

quality. Regarding the cryopreservation of semen , it is known that a major cause

of the reduction in quality is oxidative stress, although many investigations have

been made to provide antioxidants agents to animals and decrease the lipid

peroxidation caused by radical free, contradictory results have been found and

many researchers have taken into account the physiological status of the animals.

In this context, our objective was to evaluate the seasonality on sperm quality

Pantaneiro bulls, as well as identify the effect of adding antioxidants to semen

extender in times of different climatic conditions. In experiment 1, 7 Pantaneiro

breeding and 3 Nellore were used, semen collection was taken in January and

July 2013 were evaluated, circumference and testicular consistency, motility,

vigor, viability, concentration, acrosomal membrane integrity, sperm morphology,

activity mitochondrial cytochemistry and the amount of thiobarbituric acid reactive

substances. The experiment was conducted in a completely randomized design

and a 2x2 factorial arrangement (2 breeds and 2 seasons). The membrane

integrity was lower in the winter season (95.76% ± 1.77 vs. 87.07% ± 4.78,

P = 0.03 ), the Nelore breed had higher amount of minor defect in summer (2.16%

± 1.09 vs. 0.57% ± 0.31; P= 0.02 ), higher percentage of larger defect (61.91% ±

5.92 vs. 26% ± 3.83 P= 0.01) and total defects (62.58% ± 5.63 vs. 27.33% ± 3.91

P= 0.03) in winter. The frozen semen was not affected by breed, season or

interaction between them. These results can be explained by the adaptation of

animals Pantaneiro to the Pantanal region, breeding Pantaneiro are more

suitable, since his seminal quality is not adversely affected by the season. In

experiment 2, the same animals were used, but at the time of dilution of semen

was added 10 mM Trolox/20x106 sperm, or 2.25 mg of ascorbic acid/20x106

sperm, or even a combination of them. After thawing the analysis of motility,

viability, sperm viability, acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity

cytochemical and spontaneous lipid peroxidation was performed. The experiment

was conducted in a completely randomized design, and 2x2x4 factorial

arrangement (2 breeds and 2 seasons and 4 antioxidants treatments). The

12

motility, viability, acrosome integrity and mitochondrial activity were reduced with

the addition of antioxidants (P<0,05) in particular the interaction between vitamin

C and Trolox. Although the addition of antioxidants did not change the level of

lipoperoxidation. The results can be explained by decreased levels of reactive

oxygen species caused by antioxidants and a possible inhibition of signaling

events such as sperm movement and activity of mitochondria, thus we can infer

that the animals had not used vitamin deficiency and their demand, especially

vitamin E, was met by supply.

Key words: antioxidant, oxidative stress, seasonality

13

1. Introdução

O Brasil possui o segundo maior rebanho bovino do mundo com cerca de 209

milhões de cabeças, das quais 80% são zebuínos (Bos indicus), que por sua vez

têm 90% desta fatia representada pela raça Nelore (IBGE, 2012). Dentre os estados

brasileiros, o que mais contribui para este efetivo é Mato Grosso, que em 2013

abateu 6,04 milhões de cabeças, 9,33% a mais que o ano anterior, sendo que neste

estado os animais de origem indiana também são maioria (IMEA, 2014).

Contudo, a raça Nelore nem sempre foi responsável pela maior parte de animais

no estado, até 1930 os bovinos hoje conhecidos como da raça Pantaneiro e outrora

chamados de Tucura, Jofreano ou Cuiabano, eram maioria principalmente na região

do Pantanal, onde se adaptaram bem, mesmo com as condições adversas

(Primo, 1992).

Sendo assim, levando em consideração a região do Pantanal, onde o emprego de

tecnologia como pastagens cultivadas é limitado e a exploração pecuária restringe-

se basicamente a fase de cria, o bovino Pantaneiro se consolidou no fornecimento

de bezerros para outras regiões de Mato Grosso e do Brasil que tinham maiores

condições de realizar a recria e engorda (Abreu et al., 2000).

Entretanto, esse sistema era, e em muitos casos ainda é, praticado de maneira

extensiva, apresentando taxa de natalidade, desmame e mortalidade de bezerros ao

redor de 58, 42 e 15% respectivamente, idade à primeira cria média de

47,78 meses, sem uso de estação de monta ou conhecimento da fertilidade dos

reprodutores (Abreu et al., 2000; 2008), e este é um dos gargalos da produção de

bezerros principalmente em condições tropicais e sistemas de produção extensivos

(Kumi-Diaka et al., 1981).

Além disso, já foi demonstrado, que touros europeus (Bos taurus) submetidos às

condições tropicais apresentam fertilidade reduzida em comparação aos animais de

origem indiana (Nichi et al., 2006). Porém, ainda não se sabe qual a influência da

sazonalidade no potencial fértil de reprodutores da raça Pantaneiro.

Além dos touros de campo, o mercado também recebe animais oriundos de

biotecnologias como a inseminação artificial, transferência de embrião e produção

in vitro de embriões que devido a sua considerável difusão nos últimos anos,

aumentou largamente a demanda por sêmen congelado (Asbia, 2012).

14

No ano de 2012, entre nacionais e importadas, foram comercializadas no Brasil

pouco mais que 12 milhões de doses de sêmen, o que representa um crescimento

de aproximadamente 27% em relação à 2010 (Asbia, 2012).

Contudo, os processos de resfriamento e criopreservação propriamente ditos têm

se mostrado deletérios à qualidade seminal, que após estes processos perde em

torno de 50% dos parâmetros relacionados à sua fertilidade (Watson, 2000). Isto se

dá, entre outros fatores, devido a injúrias por oxidação e lesão das biomembranas e

DNA do espermatozoide (Chatterjee e Gagnon, 2001).

Neste sentido, a adição de antioxidantes ao meio de congelação já foi

demonstrada como uma forma de diminuir os danos causados à célula espermática

em gatos (Thuwanut et al., 2008), cães (Michael et al., 2008), bovinos

(Hu et al., 2010), equinos (Silva, et al., 2009) e ovinos (Maia et al., 2009).

Ainda em relação a criopreservação, ela é uma ferramenta extremamente

interessante para formação do Banco de Germoplasma da raça Pantaneiro, visto

que o número de exemplares encontra-se reduzido e a raça é ameaçada pelo

processo de absorção por outros grupos genéticos (Mariante et al., 2011).

Contudo, pouco ainda se sabe sobre a fertilidade dos Pantaneiros, protocolos de

congelação específicos para raça, e visto que têm origem europeia (Bos taurus) se

apesar de ser uma raça adaptada as condições edafo-climáticas da região eles

sofrem alteração na fertilidade seminal em função da época do ano. Desta forma,

objetivou-se estudar o efeito da sazonalidade, bem como a adição de antioxidantes

sobre a qualidade seminal de touros Pantaneiros criados na mesma condição.

2. Hipótese

As hipóteses testadas foram de que a qualidade seminal de touros Pantaneiros

sofre decréscimo no verão e que a adição de antioxidantes previne o aparecimento

dessas alterações e diminui os prejuízos causados ao sêmen fresco e

criopreservado.

3. Revisão Bibliográfica

3.1. Bovino Pantaneiro

A importância do gado bovino para o Brasil se da praticamente desde a sua

descoberta e povoamento pelos povos portugueses e espanhóis

(Marques Júnior et al., 2012). Os primeiros bovinos aqui chegados datam de 1530 a

15

1554 e tratavam principalmente de raças advindas da Península Ibérica

(Sereno, 2002b).

Aos poucos os animais trazidos da Espanha e Portugal foram sofrendo

adaptações e deram origem às raças naturalizadas ou crioulas, sendo o Caracu,

Crioulo Lageano, Curraleiro, Mocho Nacional e Pantaneiro as principais

(Serrano et al., 2004).

Dessa maneira, os animais se espalharam pelas capitanias e contribuíram para a

expansão do território nacional. Até o início do século XX o gado encontrado no

Brasil era predominantemente ibérico (Assis, 2007), e à medida que escravos

africanos foram sendo trazidos, houve também uma introdução dos zebuínos

(Santos, 1993).

O estado de Goiás foi a principal passagem do atual bovino Pantaneiro para

chegar em Mato Grosso (Primo, 1992). Estes animais passaram por quase três

séculos de adaptação à região pantaneira e hoje a raça se destaca principalmente

por estar totalmente adaptada a condições adversas como altas temperaturas,

regiões alagadas, baixa qualidade da forragem nativa, endo e ectoparasitas que

afetam o desempenho produtivo e reprodutivo (Juliano et al., 2011).

Ao longo desse período, o gado Pantaneiro passou a representar muito mais que

importância econômica, mas também se tornou responsável por compor a

identidade cultural dos moradores e pecuaristas da região (Mazza et al., 1992).

Contudo nas últimas décadas houve uma forte introdução, principalmente da raça

Nelore, na região do Pantanal, uma vez que os bezerros do cruzamento entre

Pantaneiro e Nelore agradou os pecuaristas locais e o mérito deste produto foi

somente atribuído aos zebuínos (Santos et al, 2005), desta forma, embora haja

alguns núcleos de conservação in situ, esta raça corre risco iminente de

desaparecer (Abreu et al., 2007).

Na região Pantaneira, estima-se que existam 3 milhões de bovino, sendo que

deste total 95% é representado por zebuínos, em especial a raça Nelore e apenas

10 mil animais da raça Pantaneiro, aproximadamente, deste modo a raça é

considerada vulnerável (Sereno, 2002a).

Nesse sentido, existem ainda poucos rebanhos de gado Pantaneiro e estima-se

que 90% destes estejam no Pantanal de Mato Grosso, onde o processo de absorção

por outras raças foi minimizado em virtude da identificação dos criadores com a raça

(Mazza et al., 1992).

16

Na tentativa de conservar os exemplares ainda existentes e desta forma preservar

o recurso genético da raça, em 1984 foi criado o primeiro Núcleo de Conservação “in

situ” do bovino Pantaneiro, localizado na fazenda Nhumirim, propriedade da

Embrapa, sub-região da Nhecolândia, Corumbá-MS, que em um primeiro momento

fez estudos no sentido caracterizar a raça sob o ponto de vista genético e zootécnico

(Tabela 1) e neste momento toma medidas para aumentar o efetivo e melhorar

geneticamente o rebanho (Mariante et al., 2011).

Tabela 1. Caracterização fenotípica dos bovinos Pantaneiros

Características Descrição

Cabeça

Nas fêmeas é leve e pequena; tem coloração

amarelada a avermelhada. Nos macho, são pesadas

e pequenas, frequentemente pretas com tufos de pelo

na marrafa.

Perfil Predominância do subconvexo (79%), com alguns

casos de retilíneo.

Focinho Cor negra, com alta frequência (73%) de anel branco

ao seu redor.

Olhos Em alguns animais (44%), são escuros, com presença

de anel claro em seu entorno.

Orelhas Pequenas, arredondadas, com saída horizontal;

presença de pelos claros na parte interna.

Chifre

Marrom-esverdeado na base, claro no meio e negro

na ponta; forma arredondada, saindo lateralmente

para cima e para frente.

Corpo Pequeno a médio, com linha dorso-lombar geralmente

reta.

Pelagem

Predominância da cor amarelo-avermelhada (79%),

com presença de tonalidade mais escura nas

extremidades, principalmente nos machos; pelos

brancos na porção ventral. O pêlo é curto e sedoso.

Cauda Fina, com inserção alta.

Temperamento Dócil e calmo, com manejo constante, tornando-se

bravio quando mantido isolado.

17

Fonte: Mazza et al. (1992).

De maneira geral as raças bovinas podem ser dividas de acordo com seu porte

em: pequenas, médias e grandes (Alberti et al., 2008), nesse sentido,

Abreu et al. (2004) relatam que os animais da raça Pantaneiro são de pequeno porte

e que por este motivo têm exigência nutricional menor o que facilitou sua adaptação

ao ambiente do Pantanal, onde ocorrem períodos críticos de disponibilidade de

alimentos.

Outro ponto a ser destacado é a precocidade da raça, uma vez que

Juliano et al. (2011) verificaram que tourinhos Pantaneiros criados na região central

do Brasil e submetidos à coleta de sêmen a partir dos 10 meses de idade se

tornaram púberes aos 17,20 ± 0,786. Cabe lembrar que os animais foram

considerados púberes quando atingiram 50 milhões de espermatozoides por mL,

com pelo menos 10% de motilidade (Wolf et al., 1965).

Em condições de pastejo a puberdade em machos da raça Nelore varia entre 12 a

18 meses (Castro et al., 1989; Unanian et al., 2000), contudo estudos mais

aprofundados com diferentes raças no ambiente do Pantanal são necessários para

estabelecer melhores comparações.

Contudo, em relação a fêmeas, estudos têm mostrado que novilhas Pantaneiras

têm idade ao primeiro parto entre 40 (Abreu et al., 2007) e 42 meses

(Sereno et al., 2001) e são mais precoces que matrizes aneloradas típicas da região

do Pantanal, que dão a luz ao primeiro bezerro com 47 meses em média

(Abreu et al., 2000).

Nesse sentido, a raça Pantaneiro mostra-se como uma excelente opção para a

produção de carne de maneira sustentável na região do Pantanal

(Mariante et al., 2009). Além de poder ser utilizado em programas de melhoramento

genético e cruzamento industrial (Rangel et al., 2004).

3.2. Estresse térmico e fertilidade de machos

Os testículos da maioria das espécies domésticas são mantidos 4-5° C abaixo da

temperatura corporal (Kastelic et al., 1995). Deste modo, o efeito de temperaturas

estressantes, seja calor (Nichi et al., 2006) ou frio (Mcentee, 1990) em bovinos de

origem indiana (Fernandes et al., 2008) ou europeia (Meyerhoeffer, et al., 1985), tem

sido estudado e demonstrado por vários autores.

18

Nesse sentido, tem sido verificado que, principalmente, temperaturas elevadas

afetam os parâmetros reprodutivos de reprodutores bovinos, sendo que animais Bos

indicus são mais resistentes que os Bos taurus a estas alterações

(Kumi-Diaka et al., 1981; Oliveira et al., 2006).

Segundo Brito et al. (2003) essa resistência se deve ao fato de que animais de

origem indiana têm maior superfície de pele em relação ao tamanho corporal, bem

como, mais glândulas sudoríparas e maior suprimento sanguíneo ao testículo, que

conferem aos Bos indicus maior capacidade de termorregulação.

As principais alterações encontradas no ejaculado de touros submetidos ao

estresse térmico pelo calor são: diminuição do vigor e motilidade; aumento de

defeitos menores, maiores e totais (Oliveira et al., 2006), diminuição da porcentagem

de células vivas e concentração espermática (Kumi-Diaka et al., 1981), aumento da

peroxidação lipídica (Nichi et al., 2006).

Este estresse térmico pode levar a lesões reversíveis ou irreversíveis, dependo

do grau e da extensão da lesão. Neste contexto, Johnston et al. (1963), observaram

que touros europeus tiveram redução do potencial fértil quando submetidos a

temperatura de 40°C e ainda, que eles levaram mais tempo para recuperação da

qualidade seminal e não recuperaram no mesmo grau que os animais cruzados.

Além disso, a senilidade pode induzir a degeneração testicular em touros, bem

como, torná-los mais sensíveis a ela, por outros motivos. Kumi-Diaka et al. (1981)

observaram que bovinos com mais de 7,5 anos apresentaram um quadro

degenerativo mais severo, diminuição da produção de espermatozoides e perda de

qualidade quando comparados com animais mais jovens.

A indução da degeneração testicular experimentalmente, em trabalhos mais

antigos era feita usando câmaras com temperatura e umidade controlada

(Johnston et al., 1963; Meyerhoeffer et al., 1985). Contudo, os experimentos atuais

fazem o uso de bolsas colocadas nos testículos, método este que é chamado de

insulação escrotal (Brito et al., 2003).

Deste modo, estudos com insulação escrotal não observaram diferença no tempo

do ciclo no epitélio seminífero tampouco no trânsito epididimário

(Ross e Entwistle, 1979) nos animais insulados. Contudo as células germinativas

parecem ter sensibilidade variada ao aumento da temperatura, de modo que

espermatócitos e espermátides são mais sensíveis que as espermatogônias

(Setchell, 1998).

19

Adicionalmente, a degeneração testicular por insulação escrotal parece provocar

o aparecimento de defeitos espermáticos específicos como: Knobbed, contornos

anormais da cabeça (cabeça piriforme e microcefalia), defeitos de peça intermediária

e gota citoplasmática proximal (Brito et al., 2003; Barth e Oko, 1989).

O aumento da temperatura testicular, seja qual for o motivo, aumenta o

metabolismo e a demanda de oxigênio pelo tecido testicular, contudo a artéria

testicular não é calibrosa o suficiente para fornecer o aporte demandado. Sendo

assim, ocorre hipóxia testicular e formação de espécies reativas de oxigênio que

levam a produção de espermatozoides anormais (Setchell, 1998).

Diante do exposto, o estresse térmico é uma importante via de redução da

fertilidade em bovinos, especialmente de origem europeia, contudo ainda não se

sabe qual o seu impacto em touros da raça Pantaneiro.

3.3. Criopreservação de sêmen

A congelação ou criopreservação é o método pelo qual o sêmen é mantido

congelado em nitrogênio líquido a -196⁰C por tempo indeterminado, o que permite

seu transporte para qualquer distância, sendo este método a forma de

armazenamento de eleição para a constituição de Banco de Recursos Genéticos

(Reichenbach et al., 2008).

A preservação espermática por congelação compreende o período entre a

suspensão da motilidade espermática e o processo que demarca a continuidade das

reações que eventualmente levam à fertilização. Para uma conservação efetiva de

sêmen no estado congelado é necessário uma completa interrupção no metabolismo

dos espermatozoides (Watson, 1995).

Os protocolos de congelação de sêmen da maioria das espécies compreendem

as fases de resfriamento, pré-congelação e congelação propriamente dita. Na

primeira delas o sêmen diluído deve atingir a temperatura de 4-5°C

(Squires et al., 1999), contudo a velocidade e consequentemente a taxa de

resfriamento com que isso ocorre varia de acordo com o protocolo, ficando entre 2 e

4 horas. Nesta fase a célula espermática já começa a sofrer injúrias, uma vez que

ocorre a transição da membrana plasmática do estado líquido para o estado de gel

(Graham, 1996), porém uma quantidade de espermatozoides vivos próxima à inicial

ainda pode ser encontrada (Bispo et al., 2011).

20

Sem sombra de dúvida o pré-congelação é a etapa mais crítica à

criopreservação, isso porque o sêmen atravessa a barreira crítica de -5 a -60°C

quando em contato com o vapor de nitrogênio, nesta faixa de temperatura ocorre a

formação de cristais de gelo fora da célula, e por este motivo uma concentração dos

solutos no fluido extracelular, assim sendo, acontece a passagem de água do meio

intracelular para fora e o espermatozoide perde viabilidade (Holt, 2000). Contudo,

pode haver também a formação de cristais de gelo intracelulares que, na maioria

das vezes, culmina com perda da integridade da membrana espermática

(Denvireddy et al., 2002).

A perda de água e formação de cristais de gelo extracelulares ocorre quando o

processo de congelação é lento. Por outro lado a congelação rápida demais, não

permite a saída de água da célula e cristais de gelo são formados dentro do

espermatozoide (Mazur, 1985).

Ao fim do resfriamento (4-5°C) a água intra e extracelular ainda não está

cristalizada, sob a faixa de temperatura entre -5 e -10°C começam a serem

formados os cristais de gelo no meio extracelular e troca de água para manter o

equilíbrio osmótico, neste momento a curva de congelação deve ser lenta o

suficiente para evitar a congelação da água intracelular e rápida o bastante para

evitar que o espermatozoide perca água em excesso ao meio externo

hiperconcentrado (Medeiros et al., 2002). Por fim, na congelação propriamente dita,

as palhetas são mergulhadas em nitrogênio líquido e conservadas a -196°C.

Da mesma forma, a descongelação é importante para o equilíbrio osmótico do

meio. Espermatozoides congelados em curvas moderadas necessitam de curvas

moderadas de descongelação, neste caso, o gelo extracelular descongela

lentamente e diluirá o soluto aos poucos, o que permite a entrada lenta de água na

célula até atingir a concentração adequada. Ao contrário, se o espermatozoide é

descongelado rapidamente, a água entrará de forma rápida na célula danificando o

espermatozoide (Graham, 1996).

3.4. Estresse oxidativo

A criopreservação de sêmen bovino aumenta a taxa de anormalidades

espermáticas, reduzindo a longevidade dos gametas. Estima-se que durante o

processo de criopreservação, a fertilidade espermática avaliada através da

21

motilidade, vigor e integridade de suas membranas sejam reduzidas em 50%

(Ohashi, 2001).

Essas perdas podem ser ocasionadas por mudança na temperatura, formação de

cristais de gelo, alterações nas membranas plasmática e mitocondrial e lesões no

DNA (Ball e Vo, 2001). Contudo, segundo Beconi et al. (1991) o principal

responsável pelos danos causados ao espermatozoide se devem ao estresse

oxidativo.

Por sua vez, esse estresse é causado por excessiva presença de espécies

reativas de oxigênio (EROS) e/ou atuação ineficiente do sistema antioxidante em

removê-las, deste modo, pode ocorrer lesões às biomoléculas principalmente DNA,

lipídios, proteínas e carboidratos. Por isso, em humanos e animais, é considerada

uma importante causa de infertilidade ou subfertilidade (Pasqualotto et al., 2001;

Aitken et al., 1989; Nichi et al., 2006; Said et al., 2004.

O organismo produz EROS naturalmente em vários tecidos, como subprodutos da

respiração aeróbia e da síntese de estruturas mais complexas. Baixas

concentrações de EROS são importantes para processos bioquímicos normais como

na sinalização e controle do crescimento celular, no ataque de patógenos invasores,

na síntese enzimática e na detoxificação de substâncias, além de eventos como

capacitação espermática e reação acrossômica (Bauber et al., 2003), uma vez que a

concentração de oxigênio no sistema reprodutor feminino é reduzida exceto no

momento da ovulação (De Lamirande et al., 1997).

Porém, quando sua produção ocorre em quantidade superior à capacidade de

neutralização pelas células e seus antioxidantes, o metabolismo energético,

motilidade, viabilidade e integridade das membranas e DNA podem ser afetados

(Bilodeau et al., 2002).

Segundo Sikka (1996) as EROS que apresentam implicações na biologia

reprodutiva são: ânion superóxido (O2ˉ), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical

peroxil (LOOˉ) e o radical hidroxila (OHˉ).

Trabalhos anteriores verificaram que o espermatozoide é especialmente sensível

ao estresse oxidativo, pelo fato de que possui citoplasma reduzido e pouca

capacidade de armazenar antioxidantes intracelulares (Vernet et al., 2004;

Aitken e Baker, 2002).

Além disso, membrana citoplasmática do espermatozoide é rica em ácidos graxos

poli-insaturados essa característica é importante, pois confere fluidez e facilita a

22

fusão para que ocorra a fertilização (Agarwal et al., 2003). Contudo estas moléculas

são especialmente sensíveis ao dano oxidativo causado pelas EROs

(Jones e Mann, 1977).

Esta oxidação dos lipídios celulares é conhecida como lipoperoxidação ou

peroxidação lipídica, este fenômeno gera uma substância conhecida com

malondialdeído (MDA), quando em contato com o ácido tiobarbitúrico (TBA) formam

uma coloração rósea que pode ser mensura por espectrofotometria

(Ohkawa et al., 1979). Contudo, como não se tem certeza de que toda a coloração

lida no espectrofotômetro é somente MDA, dá-se o nome de substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS).

3.5. Estresse oxidativo e infertilidade em reprodutores bovinos

O espermatozoide de bovinos em situações fisiológicas não é facilmente

peroxidado quando comparado com humanos, equinos e caprinos

(O’Flaherty et al., 1997). No entanto após os processos de resfriamento e

criopreservação observa-se diminuição significativa na motilidade, velocidade,

linearidade e frequência de batimento da cauda, além de aumento no nível de

peroxidação lipídica (Chatterjee e Gagnon, 2001).

Todavia, mesmo em sêmen fresco (Nichi et al., 2006) correlacionaram

positivamente a quantidade de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

com a porcentagem espermatozoides anormais em touros Simental em épocas mais

quentes do ano, sugerindo um efeito do estresse oxidativo sobre a morfologia

espermática.

Beconi et al. (1991) observaram correlação negativa entre o nível de TBARS e

porcentagem de espermatozoides com acrossoma e membrana plasmática íntegros

em touros holandeses.

Sendo assim, estes resultados indicam que o estresse oxidativo é uma das

causas de redução da qualidade do sêmen fresco e criopreservado em bovinos.

3.6. Espécies reativas de oxigênio

Radical livre é definido por um grupo de autores como, espécies que possuem

um ou mais elétrons desemparelhados (Halliwell e Gutteridge, 1990). Sendo que as

espécies reativas de oxigênio (EROs) incluem radicais livres e outras espécies que

não possuem elétrons desemparelhados, mas que devido sua reatividade,

23

atravessam com facilidade as membranas biológicas e causam lesões oxidativas

(Ribeiro et al., 2005).

O oxigênio é um elemento essencial à vida, contudo o seu metabolismo nos

meios biológicos leva a produção de radicais livres, que embora sejam essenciais

em algumas vias de sinalização celular (Haddad, 2002), podem levar a efeitos

deletérios em vários tecidos vivos (Ferreira e Matsubara, 1997).

A molécula de oxigênio (O2) sofre reações de oxidação (perde um elétron) ou

redução (ganha um elétron) constantemente. Em condições fisiológicas de

respiração aeróbia, 95 a 98% do O2 sofre redução tetravalente na mitocôndria, ou

seja, aceita quatro elétrons, o que resulta em uma molécula de H2O. Os 2 a 5%

restantes dão origem ao ânion superóxido que por sua vez desencadeia a formação

das demais espécies reativas de oxigênio (Ferreira e Matsubara, 1997).

Basicamente, a formação das três principais EROs pode ser explicada no

esquema de Chabot et al. (1998; Figura 1). Os elétrons (e-) adquiridos pela molécula

de oxigênio (O2) e seus metabólitos dão às espécies reativas de oxigênio a

necessidade de estabilização do elétron desemparelhado.

e- e- e- e-

O2 O2

- H2O2 OH- H2O

2H+ H+ H2O H+

Figura 1. Formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Adaptado de Chabot et

al. (1998).

3.6.1. Ânion superóxido (O2)

Após a primeira redução do O2 acontece a formação ânion superóxido ou radical

superóxido (Figura 1), essa produção acontece em praticamente todas as células

aeróbias (Ferreira e Matsubara, 1997; Halliwell e Gutteridge, 1986).

A formação do O2- acontece em ambientes ricos em elétrons e aeróbios, essa

característica é encontrada próximo à membrana mitocondrial interna, uma vez que

ocorre o “vazamento” de elétrons da cadeia respiratória (Nordeberg e Arnér, 2001).

O O2- pode agir como um agente antioxidante ou redutor e sua formação pode

ser catalisada pela enzima xantina oxidase, que cataboliza as purinas para formação

de ácido úrico, nessa situação o O2- (Ribeiro et al., 2005).

24

Embora seja considerado pouco reativo, devido a sua incapacidade de

atravessar membranas lipídicas e ficar restrito ao compartimento onde foi produzido

(Nordeberg e Arnér, 2001), já foi observado lesões relacionadas à sua presença

(Ferreira e Matsubara, 1997), contudo a importância do ânion superóxido se deve ao

fato de que ele contribui para origem ao peróxido de hidrogênio este sim com alta

reatividade (Chabot et al., 1998).

Outra via de formação do O2- é pelos neutrófilos, monócitos, macrófagos

eosinófilos que dão origem ao ácido hipocloroso que possui propriedade bactericida,

esta reação é catalisada pela NADPH oxidase e frequentemente dá início a

formação de EROs (Ribeiro et al., 2005).

3.6.2. Peróxido de Hidrogênio (H2O2)

Após a formação do O2- se ocorrer a incorporação de dois hidrogênios

carregados positivamente é formado o peróxido de hidrogênio (Figura 1). Apesar de

não ser um radical livre, pois não possui elétrons desemparelhados, é extremamente

deletério, uma vez que atravessa com facilidade as membranas lipídicas

(Ferreira e Matsubara, 1997).

Esta molécula possui uma habilidade particular em reagir com metais em

transição, principalmente o Fe2+ e consequentemente produzir o radical hidroxila,

este processo é chamado de reação de Fenton (Aitken et al., 1993).

De acordo com Armstrong et al. (2001) o H2O2 diminui os níveis intracelulares de

ATP, o que reflete diretamente na motilidade espermática. Lozano et al. (2009)

notaram que espermatozoides humanos em contato com o peróxido de hidrogênio

ativaram a enzima caspase 3 que culmina em apoptose celular.

3.6.3. Radical Hidroxila (OH-)

O radical hidroxila é considerado a ERO mais reativa, uma vez que reage quase

que instantaneamente com metais e outros radicais no próprio sítio onde foi

produzido. Deste modo, se for produzido próximo ao DNA por exemplo, pode ocorrer

mudanças nas bases purínicas e pirimidínicas levando a inativação ou mutação do

DNA (Ferreira e Matsubara, 1997).

A reação de Fenton tem sido proposta como o principal meio de produção do OH-

(Halliwell, 1991). Esta reação é mediada principalmente pelo Fe2+, nesse sentido

25

Halliwell e Gutteridge (1990) adicionando a enzima superóxido dismutase,

demostraram que a redução do Fe2+ a Fe3+ impede a formação do radical hidroxila.

3.7. Mecanismo antioxidante

Durante a espermatogênese o espermatozoide perde praticamente todo o seu

citoplasma e desta forma a quantidade de enzimas antioxidantes intracelulares

também é relativamente baixa (Iwasaki e Gagnon, 1992).

A gota citoplasmática distal é um resquício de citoplasma que não foi

completamente expulso durante o transito epididimário (Barth e Oko, 1989). Além

disso, segundo Nichi et al. (2007), correlação negativa foi encontrada entre a

porcentagem de gota citoplasmática distal e o nível de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS), ainda segundo estes autores, os antioxidantes presentes na

gota previnem a oxidação dos lipídios espermáticos.

Para compensar a falta de antioxidantes intracitoplasmáticos, o espermatozoide

conta com antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos presentes em seu plasma

seminal (Maia e Bicudo, 2009), e desta forma garantir equilíbrio entre agentes

antioxidantes e EROs e o perfeito funcionamento das células espermáticas

(Ferreira e Matsubara, 1997).

Os principais antioxidantes enzimáticos presentes no plasma seminal são:

superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidade (Sikka et al., 1995). Por

outro lado, os antioxidantes não enzimáticos são representados pelas vitaminas C e

E (Fraga et al., 1991).

O nome vitamina (vita: vida, amina: grupo de composto nitrogenado) foi dado

para indicar as substâncias orgânicas essenciais dieteticamente, distintas das

proteínas, dos glicídios e lipídios. Posteriormente foi descoberto que nem todas as

vitaminas eram formadas pelo grupamento amina, mas apesar do erro o nome se

manteve, uma vez que o termo já era convencionalmente empregado

(Mendonça Júnior et al., 2010).

3.7.1. Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)

A vitamina E é lipossolúvel e advém de várias formas da natureza, os compostos

existentes nas plantas com atividade biológica de vitamina E são os derivados do

tocol, sendo o α-tocoferol a forma ativa mais abundante (Zeoula e Geron, 2006).

26

Comprovada interação entre vitamina E e selênio tem sido observada na ação

antioxidante em vários tecidos, dentre eles se destaca o a proteção aos macrófagos

e leucócitos durante a fagocitose e lise de bactérias (Zeoula e Geron, 2006).

Em todos os tecidos há um estoque mínimo de α-tocoferol, porém ele é mais

intensamente reservado nos tecidos hepático e adiposo


Várias formas de vitamina E têm sido empregadas no estudo da preservação

seminal. Seja a forma lipossolúvel (α-tocoferol) (Cerolini et al., 2000) ou um análogo

hidrossolúvel (Trolox) (Peña et al., 2003).

O Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) é um análogo

da vitamina E (α-tocoferol) hidrossolúvel e apresenta elevada atividade antioxidante,

além de maior facilidade na diluição e preparo de soluções (Wu et al., 1991).

Tem sido verificado efeito antioxidante em sua adição ao meio diluidor, sendo

refletido em aumento da motilidade pós descongelação e diminuição de estresse

oxidativo induzido com a adição de ferro e ácido ascórbico (Maia et al., 2010;

Sicherle et al., 2011; Ondei et al., 2009).

3.7.2. Ácido ascórbico

O ácido ascórbico é um antioxidante não enzimático hidrossolúvel e, portanto

potencialmente envolvido na proteção das células contra estresse oxidativo

(Anane e Creppy, 2001; Sierens et al., 2001) na síntese de colágeno e carnitina


Estudos relatam o efeito da deficiência de vitamina C na fertilidade masculina.

Foram encontrados desempenho reprodutivo insatisfatório em bovinos (redução da

concentração e motilidade e aumento dos defeitos espermáticos

(Dawson et al., 1990), bem como degeneração testicular em cobaias (Luck, 1994).

Beconi et al. (1993) afirmam que a presença de 5mM ácido ascórbico no meio de

congelação exerceu um efeito antioxidante durante a congelação e descongelação

do sêmen bovino proporcionando melhora na qualidade seminal.

3.8. Vitaminas x Ruminantes

As vitaminas são compostos orgânicos necessários em pequenas quantidades

no organismo, entretanto são indispensáveis para a vida. Elas participam de reações

27

metabólicas do interior da célula, crescimento e manutenção da saúde animal


Estas se encaixam em dois grandes grupos, as lipossolúveis as quais têm

grande capacidade de armazenamento no organismo e lenta liberação, e as

hidrossolúveis que ao contrário praticamente não são armazedas


Os ruminantes obtem as vitaminas basicamente pela alimentação (vitamina E),

esta é mais abundantes em forragens frescas e grãos integrais, ou pela síntese dos

microrganismos (McDowell, 2001).

Entretanto, a vitamina C adquirida pela dieta, no caso de ruminantes é quase

totalmente destruída pelos microrganismos, em contrapartida ocorre a síntese

endógena pelo fígado, para isto são utilizados a glicose e a galactose como

substratos (Mendonça Júnior et al., 2010). Sendo assim, exceto em condições de

estresse ou doenças a suplementação com vitamina C não é necessária

(McDowell, 2001).

Os ruminantes adquirem a vitamina E através da ingestão de vegetais, no

entanto, a concentração de α-tocoferol nestes alimentos é extremamente variável e

difícil de quantificar, Ballet et al. (2000) constataram variação de 22% no nível de

vitamina E em quatro variedades de alfafa, além disso a idade da planta, relação

folha:colmo e temperatura sob a qual ela é cultivada podem afetar a concentração

de vitamina E. No que diz respeito a forragens conservadas, o método de

conservação tempo de estocagem interferem na proporção de vitaminas


Estudos em relação a degradação da vitamina E no rúmen tem encontrado que

ao contrário dos não-ruminantes apenas uma pequena parte da vitamina E ingerida

chega ao intestino delgado. Nesse sentido, segundo Shin e Owens, (1990) de 39 a

52% da vitamina E é degradada no rúmen e que em torno de 40% desaparece no

intestino delgado de novilhos em confinamento. Estes autores ainda verificaram que

a absorção intestinal foi maior em novilhos jovens, sugerindo maior exigência desta

categoria.

Os microrganismos ruminais necessitam de vitaminas para o seu metabolismo e

crescimento, principalmente aquelas que por eles não são sintetizadas, sendo a

vitamina E uma delas (Mendonça Júnior et al., 2010).

28

Já Alderson et al. (1971) encontraram que o desaparecimento da vitamina E

aumentou de 8 para 42% quando a proporção de milho na dieta passou de 20 a

80%. Ainda neste estudo, não foi observado aumento de vitamina E na

concentração sanguínea, sugerindo que não houve absorção significativa.

Porém, segundo Mendonça Júnior et al. (2010), a absorção de vitaminas

lipossolúveis depende das micelas formadas pelos ácidos biliares e após a absorção

no intestino delgado elas vão para a linfa, dessa maneira a mensuração no sangue

pode não trazer resultados fidedignos.

4. Considerações Finais

Diante do exposto sabe-se que o estresse térmico é uma importante forma de

queda da fertilidade principalmente em touros de origem europeia, contudo, em

relação aos animais da raça Pantaneiro, sua suscetibilidade às condições tropicais

ainda precisa ser estudada.

Adicionalmente, a ação de vitaminas no diluidor seminal tem ocasionado

resultados controversos na prevenção do estresse oxidativo, dessa forma, pesquisas

elucidando a interação entre o estado fisiológico dos animais e a condição

nutricional necessitam ser realizados.

O artigo “Sazonalidade e antioxidantes na qualidade seminal de touros

Pantaneiros” foi elaborado segundo as normas da revista Animal Reproduction

Science qualis A2.

29

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39

Capítulo 1

Sazonalidade e qualidade do sêmen fresco e criopreservado de touros

Pantaneiro e Nelore

Resumo

Objetivou-se avaliar o efeito da estação do ano sobre a fertilidade do sêmen fresco e

criopreservado de reprodutores da raça Pantaneiro (Bos taurus) criados em

condições tropicais. Foram utilizados 7 touros Pantaneiros e 3 Nelore, dos quais foi

coletado sêmen e realizada análise de motilidade, vigor, defeitos menores, maiores

e totais, concentração, viabilidade espermática e integridade de membrana

acrossomal. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente

casualizado, e arranjo fatorial 2x2 (2 raças e 2 estações do ano). A integridade da

membrana plasmática foi menor na estação de inverno (95,76 ± 1,77% vs. 87,07 ±

4,78% P=0,03), os animais da raça Nelore tiveram maior quantidade de

espermatozoides com defeito menor no verão (2,16 ± 1,09% vs. 0,57 ± 0,31%;

P=0,02), maior porcentagem de defeito maior (61,91 ± 5,92% vs. 26 ± 3,83%

P=0,01) e defeitos totais (62,58 ± 5,63% vs. 27,33 ± 3,91% P=0,03) no inverno. Os

parâmetros do sêmen congelado não foram influenciados nem pela raça nem

estação do ano. Portanto, nas condições edafoclimáticas encontradas na região do

Pantanal reprodutores Pantaneiros são mais indicados, uma vez que sua qualidade

seminal não é afetada negativamente pela estação do ano.

Palavras-chave: degeneração testicular, estresse térmico, bovino

Seasonality and quality of fresh and frozen bull semen Pantaneiro and Nelore

Abstract

The objective of this study was to evaluate the effect of season on fertility of fresh

and cryopreserved semen of breed Pantaneiro (Bos taurus) raised in tropical

conditions. Were used 7 Pantaneiro and 3 Nelore bulls, which were collected and

semen analysis performed motility, vigor, minor, major and total defects,

concentration, sperm viability and acrosomal membrane integrity. The experiment

was conducted in a completely randomized design and 2x2 factorial arrangement (2

breeds and 2 seasons). The membrane integrity was lower in the winter season

(95.76 ± 1.77% vs. 87.07 ± 4.78% P = 0.03), the Nelore breed had higher amount of

sperm with lower defect in summer (2.16 ± 1.09% vs. 0.57 ± 0.31%; P = 0.02), higher

percentage of major defect (61.91 ± 5.92 vs. 26 ± 3.83%.% P = 0.01), and total

40

defect (62.58 ± 5.63% vs. 27.33 ± 3.91% P = 0.03) in winter. The frozen semen

parameters were no influenced by treatments. Therefore, at conditions found in the

Pantanal region, Pantaneiro breed are indicated, since his seminal quality is not

adversely affected by the season.

Key words: testicular degeneration, heat stress, bovine

Introdução

A qualidade do sêmen fresco e criopreservado é influenciada pela saúde, estado

nutricional e condições edafoclimáticas as quais os animais doadores estão

submetidos. Sabe-se que touros europeus, em condições tropicais, têm fertilidade

reduzida quando comparados a animais zebuínos. Principalmente devido ao

mecanismo de hipóxia testicular, que por sua vez leva a maiores níveis de estresse

oxidativo no ejaculado (Nichi et al., 2006).

A raça Pantaneiro (Bos taurus) é de origem europeia e hoje está completamente

adaptada a região Centro Oeste do Brasil, sendo considerada uma raça naturalizada

e excelente opção para a manutenção da pecuária sustentável no Pantanal,

suportando áreas alagadas e oferta de forragem nativa que em muitos casos tem

baixa disponibilidade e qualidade (Mariante et al., 2009).

Contudo, pouco ainda se sabe sobre a fertilidade dos seus reprodutores, bem

como o ambiente da região central do Brasil pode influenciar a sua qualidade

seminal e o potencial de criopreservação (Santos et al., 2006).

Além disso, a partir da década de 1930 houve uma forte introdução

principalmente da raça Nelore na região do Pantanal, o que provocou diminuição do

contingente do bovino Pantaneiro, desse modo, a criopreservação de sêmen é uma

das melhores maneiras de conservar este recurso genético e disseminá-lo com o

uso de biotecnologias (Mariante et al., 2011).

Sendo assim, objetivou-se avaliar a qualidade do sêmen fresco e congelado de

touros Pantaneiros (Bos taurus) no verão e inverno em comparação aos animais

Nelore (Bos indicus) criados nas mesmas condições.

Material e Métodos

41

Local, animais e coleta

Foram utilizados 7 reprodutores da raça Pantaneiro (Bos taurus) e 3 da raça

Nelore (Bos indicus) com idade média de 48 meses e peso vivo médio de 606,1 ±

92,09 Kg, mantidos em pasto de Brachiaria brizantha cv.Marandu, com suplemento

proteico-energético nas águas e proteico na seca e água ad libitum, provenientes da

Fazenda Santo Augusto, município de Rochedo–MS, que está situado a 260 m

acima do nível do mar, a aproximadamente 19° sul e 54° oeste, o clima da região é

tropical, caracterizado por verão com altas temperaturas e inverno com temperaturas

amenas, a mínima, máxima e média são 10, 35 e 24°C respectivamente. A

precipitação pluviométrica anual varia entre 1500 a 1750 mm, sendo que acontece

predominantemente no verão.

As coletas e congelamentos do sêmen foram realizados a campo nos meses de

janeiro e junho de 2013 e a análise das amostras foi realizada nos laboratórios de

Biotecnologia e Reprodução Animal e Biologia Molecular da Universidade Federal de

Mato Grosso, campus Cuiabá.

Pouco antes da coleta foi mensurada a circunferência escrotal através de fita

métrica e consistência testicular por meio da palpação. O sêmen foi obtido pelo

método de eletroejaculação e imediatamente após, foi realizado as análises

imediatas: motilidade (MOT) e vigor (VIG) espermáticos sob microscopia óptica em

aumento de 400x (CBRA, 1998), uma alíquota de cada amostra foi diluída em formol

salino na proporção de 1:200 para análise de concentração do ejaculado (CONC)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31

Tem

per

atu

ra (

°C)

Dias do Mês

Temp. Max. Janeiro

Temp. Min. Janeiro

Temp. Máx. Julho

Temp. Min. Julho

42

em câmara de Neubauer (CBRA, 1998) e morfologia espermática em microscopia de

contraste de fase (Barth & Oko, 1989), foram contadas 200 células e classificadas

em defeitos maiores (DEFMA) e menores (DEFME) (Blom, 1973). Além disso, foi

feito o preparo de lâminas para a avaliação de viabilidade espermática (VIAB)

(WHO, 1992) e integridade da membrana acrossomal (IMA) (POPE et al., 1991).

Após avaliação imediata, cada ejaculado foi diluído em extensor tris-gema

(3,187g TRIS-hidroximetil amino metano; 1,78g ácido cítrico monohidratado; 1,316g

frutose; 80 mL água destilada; 20 mL gema de ovo; 100000µg de estreptomicina;

100000UI de penicilina; 5 mL de glicerol para cada 100 mL de diluidor; Rota et al.,

1995) em fração única na concentração de 40x106 espermatozoides/mL, envasado

em palhetas de 0,5 mL e submetido à seguinte curva de congelamento: 2 horas de

resfriamento (4°C); 15 minutos em contato com o vapor de nitrogênio (a 5 cm do

nitrogênio líquido); em seguida submergidas em nitrogênio líquido e por fim

armazenadas em botijão criogênico.

Análises

As amostras foram descongeladas a 35-37 Cº durante 30 segundos e 10 µL

foram utilizados para análise de motilidade e vigor espermáticos em lâmina e

lamínula em microscopia óptica sob o aumento de 400x (CBRA, 1998). Foram

avaliados ainda viabilidade espermática (WHO, 1992) e integridade acrossomal

(Pope et al., 1991) em microscopia óptica sob o aumento de 1000x, com 200 células

contadas em ambos.

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (Tbars)

O estresse oxidativo espontâneo (TBARS espontâneo) foi calculado segundo a

metodologia de Buege e Aust (1978). Após a descongelação, a amostra de sêmen

foi com a finalidade de remover os resquícios de diluidor, isto foi feito com a adição

de 1600µL de PBS e posterior centrifugação (800 × g, 10 min), por fim foi retirado

1600µL sobrenadantes. Logo após, os 500μL de sêmen restante foi misturado a

1000μL de uma solução a 10% de ácido tricloroacético gelado (TCA 10%),

homogeneizados e centrifugados (18,000 × g, 15 min, 15 °C) para a precipitação de

proteínas. Após centrifugação uma alíquota do sobrenadante (500μL) foi misturado

com 500μL de ácido tiobarbitúrico a 1% (TBA 1%, diluído em 0,05N de NaOH) em

tubos e incubado em água fervente (90 a 100 °C) por 15 min. Após este período, os

43

tubos contendo a mistura foram imediatamente resfriados em banho de gelo (0 °C)

para parar a reação (Ohkawa et al., 1979). A absorbância das amostras foi então

quantificada utilizando-se um espectrofotômetro em comprimento de onda de 532

nm. Os resultados foram comparados a uma curva padrão previamente preparada

com uma solução padrão de MDA (malondialdeído). A concentração de TBARS foi

determinada utilizando um valor de 1.56 × 105 M/mL com o coeficiente de extinção

molar do MDA. O índice de peroxidação lipídica foi descrito em nanogramas de

TBARS por 106 espermatozoides (Buege e Aust, 1978).

Atividade citoquímica mitocondrial

A atividade citoquímica mitocondrial foi realizada de acordo com a metodologia

de Hrudka (1987), onde uma alíquota de 25 μL de sêmen foi incubada com 25 μL de

DAB (3,3'-diaminobenzidina) (1mg/mL PBS) a 37°C (banho maria), em condições de

luminosidade reduzida, durante uma hora. Após a incubação foram realizadas

extensões em lâmina, e fixadas em formaldeído a 10% por 10 minutos e secos ao ar

protegidas de luz. A avaliação foi realizada em microscopia de contraste de fase sob

aumento de 1000x, em imersão. Foram avaliados 100 espermatozoides por amostra,

e classificados segundo a atividade mitocondrial da peça intermediária, obedecendo

a escala de quatro classes propostas por Hrudka (1987), onde: classe I (todas as

mitocôndrias ativas, células espermáticas com peça intermediária totalmente

corada), classe II (células espermáticas com segmentos ativos e inativos com

predominância dos ativos, corados, indicando atividade mitocondrial média a alta),

classe III (espermatozoides com menos da metade da bainha mitocondrial ativa),

classe IV (espermatozoides completamente inativos com peça intermediária

totalmente descorada).

Delineamento experimental e análise estatística

O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em

arranjo fatorial 2x2 (2 raças e 2 estações) e as médias foram analisados através da

ANOVA e comparados pelo teste de média de Tukey com nível de significância de

5%, o programa estatístico utilizado foi o SAS (versão 9.2).

44

Resultados e Discussão

A raça, estação do ano ou a interação entre eles, não alteraram

significativamente as médias de circunferência escrotal, consistência testicular,

motilidade, vigor, concentração e integridade de membrana acrossomal. Contudo a

viabilidade espermática sofreu influência da estação do ano e foi maior no verão

(Tabela 2).

Houve interação significativa (raça x estação) para a média de defeitos menores,

sendo que a raça Nelore apresentou maior porcentagem de espermatozoides com

defeitos menores no verão em relação à raça Pantaneiro (2,16% ± 1,09 vs. 0,57% ±

0,31; P=0,02). Os reprodutores da raça Nelore tiveram ainda, maior proporção de

defeitos maiores e totais no inverno (61,91% ± 5,92 vs. 26,0% ± 3,83; P=0,01;

62,58% ± 5,63 vs. 27,33% ± 3,91 respectivamente; P=0,03; Figura 2).

Segundo a metodologia proposta por Blom et al. (1973), são classificados como

espermatozoides com defeitos menores, aqueles que apresentam alguma alteração

que dificulte mas não impeça a fecundação. Além disso, mesmo havendo maior

proporção de defeitos menores no verão para os animais da raça Nelore, o nível

encontrado foi relativamente baixo (2,16%) o que provavelmente não trás prejuízos à

sua fertilidade.

Em um estudo semelhante, Nichi et al. (2006), encontraram maior porcentagem

de defeitos maiores no verão, no ejaculado de touros Simental (Bos taurus) em

comparação aos Nelore (Bos indicus) criados em condições tropicais do centro

oeste brasileiro.

Tabela 2. Médias e valores de P de variáveis analisadas em função da raça (Nelore x Pantaneiro), estação (verão x inverno) e a interação entre eles.

Variáveisa Verão

Inverno

Probabilidade (P)

Nelore Pantaneiro

Nelore Pantaneiro

Rb Ec R x E

CE 38,33±0,88 38,07±1,04

37,33±1,30 36,78±1,50

0,7942 0,4648 0,9266

CONSIST 3,00±0,00 3,00±0,00

3,33±0,33 2,85±0,14

0,1334 0,536 0,1334

MOT 75,00±7,63 70,71±3,99

76,66±4,40 65,83±4,90

0,1894 0,7741 0,5605

VIG 3,00±0,00 2,85±0,14

3,33±0,33 3,08±0,20

0,3663 0,2044 0,8029

CONC 545±142 572±448

497±119 488±872

0,7463 0,2575 0,6125

VIAB 94,16±2,45 96,44±1,10

89,50±5,77 85,62±3,80

0,8078 0,0308 0,3558

45

IMA 92,86±2,15 97,31±1,13

92,00±4,33 92,84±2,34

0,2903 0,2875 0,4668

DEFME 2,16±1,09 0,57±0,31

0,66±0,33 1,33±0,16

0,3266 0,4328 0,026

DEFMA 12,5±5,5 18,14±3,53

61,91±5,92 26,00±3,83

0,3306 0,0005 0,0163

DEFTO 14,66±6,05 18,71±3,71

62,58±5,63 27,33±3,91

0,2491 0,0008 0,0354

TBARS 90,24±16,17 120,22±16,32

121,32±26,91 178,3±20,22

0,3934 0,3424 0,6442

aCE, circunferência escrotal; CONSIST, consistência testicular; MOT, motilidade; VIG, vigor; CONC,

concentração; VIAB, viabilidade; IMA, integridade de membrana acrossomal; DEFME, defeitos

menores; DEFMA, maiores; DEFTO, totais; TBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

Estes resultados podem ser explicados pelo mecanismo de degeneração

testicular, que é iniciado quando ocorre hipóxia no parênquima do testículo, dentre

outras causas, por vasoconstrição, seja ela causada pela temperatura ambiental

(Igboeli & Rakha, 1971), insulação escrotal induzida ou aplicação de dexametasona

(Barth & Bowman, 1994).

Nesse sentido, uma série de estudos tem sido feita correlacionando a

degeneração testicular com alteração da consistência do testículo, aumento de

defeitos espermáticos e peroxidação lipídica por ocasião do estresse térmico

(Brito et al., 2004).

Contudo, neste trabalho embora tenha sido utilizados reprodutores Pantaneiros

(Bos taurus), a raça foi introduzida na região à aproximadamente 300 anos e durante

este período sofreu adaptação ao clima da região pantaneira (Mazza et al., 1992).

Deste modo, os animais provavelmente se tornaram mais resistentes à degeneração

testicular causada pelo estresse térmico.

Além disso, nas condições extensivas praticadas no Pantanal onde os touros

permanecem com as vacas durante todo ano (Abreu et al., 2008), os animais da

raça Pantaneiro tem maior potencial fértil quando comparados com os Nelore, uma

vez que não sofrem influencia da estação do ano.

Por outro lado, embora existam poucos dados na literatura, a degeneração

testicular também pode ocorrer por estresse térmico causado pelo frio e

provavelmente raças zebuínas são mais sensíveis a ele, uma vez que estão mais

adaptadas ao clima tropical (Mcentee, 1990). Isto pode explicar o maior nível de

defeitos maiores e totais encontrados em touros Nelore no inverno.

46

Figura 2. Efeito da raça e estação do ano sobre a porcentagem de defeitos menores, maiores e totais (topo da coluna) do sêmen fresco de touros Pantaneiro e Nelore.

Teixeira et al. (2011) encontraram diminuição do comprimento e volume testicular

de touros Curraleiros (raça naturalizada) criados no centro oeste brasileiro nos

meses de abril e maio. Segundo Johnson et al. (2000) a diminuição do parênquima

testicular leva a redução do volume e concentração espermática e pode estar

relacionada com baixa disponibilidade e qualidade de alimentos.

Neste estudo, a circunferência escrotal e consistência testicular não sofreram

alteração em função da estação do ano, este talvez seja mais um indício de

adaptação da raça à essas condições.

Adicionalmente, a baixa ingestão de proteína pode afetar a taxa de crescimento

corporal, volume testicular e características físicas do ejaculado, como volume e

concentração (Abi Saab et al., 1997). Nesse sentido, sabe-se que a proteína

fornecida pelo pasto na época seca do ano é limitada (Van Soest, 1994) o que pode

0

10

20

30

40

50

60

70

Nelore Pantaneiro Nelore Pantaneiro

Verão Inverno

Defeito Maior

Defeito Menor

47

impactar em parâmetros reprodutivos. No presente estudo, embora os animais

tenham sido suplementados, os reprodutores Nelore obtiveram resultados pouco

satisfatórios na época seca do ano, o que nos permite especular que a quantidade

de nutrientes ofertada pode não ter sido suficiente para prevenir a queda da

qualidade seminal.

Além disso, os animais da raça Pantaneiro, mesmo submetidos às mesmas

condições não reduziram significativamente sua qualidade seminal. Abreu et al.

(2004) relatam que o bovino Pantaneiro, ao longo de sua adaptação, diminuiu seu

porte e consequentemente sua exigência de mantença, essa pode ser considerada

uma estratégia de sobrevivência para condições de baixa oferta de alimentos,

comumente encontradas na região pantaneira, sendo que o excedente à energia

demandada para funções vitais pode ser desviado à reprodução.

Tabela 3. Médias, desvio padrão dos valores de motilidade (MOT), vigor (VIG), viabilidade (VIAB) e integridade de membrana acrossomal (IMA) e valor de P para raça (Nelore x Pantaneiro) estação (verão x inverno) e a interação entre eles.

Variáveisa Verão Inverno Valor de P

Nelore Pantaneiro

Nelore Pantaneiro

Rb Ec R x E

MOT (%) 11,66±1,66 19,28±3,99

13,33%±1,66 17,00+7,00

0,5332 0,7489 0,2867

VIG (0-5) 1,33±0,33 2,14±0,14

2,00±0 2,00+0,31

0,1306 0,3164 0,1306

VIAB (%) 21,81±10,87 27,78±3,18

24,75±6,49 20,23±7,96

0,9223 0,757 0,4847

IMA (%) 94,66±1,16 97,42±0,66

97,25+0,72 96,33+0,76

0,3098 0,4099 0,0535

TBARS

(ng/ml) 90,24±16,17 120,22±16,32 121,32±26,91 178,3±20,22 0,3934 0,3424 0,6442

aMOT, motilidade; VIG, vigor; VIAB, viabilidade, IMA, integridade de membrana acrossomal;

TBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; bRaça;

cEstação do ano; médias seguidas de

letras minúsculas diferentes na mesma linha, diferem estatisticamente entre si (P<0,05)

A motilidade, vigor, viabilidade, integridade de membrana acrossomal,

concentração de TBARS (Tabela 3) e porcentagem de células classificadas em DAB

1,2,3 ou 4 (Tabela 4) após o descongelamento não foram afetadas pela raça,

estação do ano ou a interação entre eles.

48

De acordo com o CBRA (1998), o sêmen descongelado deve apresentar pelo

menos 30% de motilidade e vigor 3. Embora os resultados encontrados neste estudo

estejam aquém dos supracitados, principalmente em relação à raça Pantaneiro,

mais estudos devem ser feitos a fim de encontrar protocolos de criopreservação e

meios diluidores que melhor se adaptem à raça.

Em relação a quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS), frequentemente trabalhos têm comprovado seu aumento no ejaculado de

reprodutores bovinos em situações de alta temperatura, sendo as raças de origem

europeia mais sensíveis (Meyerhoeffer et al., 1985; Nichi et al., 2006), isto se deve

ao fato de que os Bos indicus são mais eficientes em realizar a termorregulação,

(Brito et al., 2003), apesar de ser um Bos taurus a raça Pantaneiro parece ter

aumentado sua capacidade de troca de calor.

Além disso, muitas vezes o estresse oxidativo é correlacionado com a presença

de defeitos espermáticos, isso porque espermatozoides com patologias têm maior

capacidade de geração de EROs, por outro lado o estresse oxidativo pode levar a

formação de espermatozoides defeituosos (Oliveira et al., 2006), neste experimento,

embora tenha sido encontrado maior proporção de espermatozoides com defeitos

maiores no inverno não foi possível observar aumento da lipoperoxidação.

Tabela 4. Atividade citoquímica mitocondrial de touros Pantaneiro e Nelore em diferentes estações do ano.

Variáveisa Verão Inverno Valor de P

Nelore Pantaneiro

Nelore Pantaneiro

Rb Ec R x E

DAB 1 74,66±6,11 70,57±9,75

65,33±15,30 72,00±9,28

0,9129 0,7371 0,6481

DAB 2 12,33±3,38 17,00±3,41

21,33±12,41 12,00±4,39

0,6928 0,7347 0,2457

DAB 3 3,66±3,17 8,28±5,36

10,33±1,45 7,16±3,32

0,8891 0,596 0,4589

DAB 4 9,33±2,84 4,14±1,58 3,00±1,52 8,83±3,74 0,9186 0,7942 0,0951

aDAB, 3,3'-diaminobenzidina (atividade citoquímica mitocondrial);

bRaça;

cEstação do ano; médias

seguidas de letras minúsculas diferentes na mesma linha, diferem estatisticamente entre si (P<0,05).

Conclusões

Nas condições edafoclimáticas encontradas no Pantanal os reprodutores da raça

Pantaneiro são mais indicados para serem utilizados durante todo ano, visto que sua

qualidade seminal à fresco e após a criopreservação não foi influenciada pela

49

estação do ano. Contudo mais estudos são necessários para padronizar a técnica

de criopreservação na raça e obter doses com qualidade suficiente para serem

aplicadas em biotecnologias.

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52

Capítulo 2

Antioxidantes na criopreservação de sêmen de touros Pantaneiro e Nelore

Resumo

Objetivou-se avaliar o efeito da adição de vitamina C e Trolox (análogo hidrossolúvel

da vitamina E) sobre parâmetros relacionados à fertilidade do sêmen criopreservado

de touros da raça Pantaneiro (Bos taurus) e Nelore (Bos indicus) criados na região

central do Brasil em épocas de condições climática distintas. Foram utilizados 7

touros Pantaneiros e 3 Nelore, dos quais foi coletado sêmen e no momento da

diluição adicionado 10 mM de Trolox/20x106 espermatozoides; ou 2,25 mg de ácido

ascórbico/20x106 de espermatozoides; ou ainda a combinação entre eles. Após o

descongelamento foi realizada a análise de motilidade, vigor, viabilidade

espermática, integridade de membrana acrossomal, atividade citoquímica

mitocondrial e peroxidação lipídica espontânea. O experimento foi conduzido em

delineamento inteiramente casualizado, e arranjo fatorial 2x2x4 (2 raças e 2

estações do ano e 4 antioxidantes). Nenhuma das interações estudadas apresentou

diferença significativa. A motilidade, vigor, integridade acrossomal e atividade

mitocondrial foram reduzidas com a adição de antioxidantes em especial a interação

entre vitamina C e Trolox. Ainda, a adição de antioxidantes não foi impactou no nível

de lipoperoxidação. Os antioxidantes usados podem ter diminuído os níveis de

espécies reativas de oxigênio a ponto de inibir a sinalização para eventos como

movimento do espermatozoide e atividade das mitocôndrias, dessa forma, com os

resultados encontrados pode-se inferir que a necessidade de vitaminas,

especialmente a vitamina E, foi atendida pela alimentação a qual os animais

estavam submetidos, deste modo, a suplementação do meio diluidor não trouxe

benefícios ao potencial fértil das amostras de sêmen.

Introdução

O sêmen criopreservado é indispensável para a utilização em larga escala das

biotecnologias aplicadas à reprodução. Contudo o processo de criopreservação

comumente causa perdas na ordem de 50% sobre parâmetros relacionados à sua

fertilidade (Watson, 2000).

Sendo assim, sabe-se que guardadas as devidas proporções, o estresse

oxidativo é um dos principais mecanismos que leva à redução da fertilidade da

amostra de sêmen. Isso porque durante a congelação e descongelação há a

formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) que podem levar a peroxidação

dos lipídios presentes na membrana plasmática do espermatozoide

(Maia e Bicudo, 2009).

53

Em contrapartida, a célula espermática tem dificuldade em remover o excesso de

metabólitos do oxigênio, uma vez que, praticamente não tem citoplasma e seu

estoque de antioxidantes fica restrito ao plasma seminal.

Desta forma, uma série de pesquisadores tem buscado estudar a inclusão de

antioxidantes enzimáticos ou não enzimáticos ao sistema vivo animal, seja ele por

suplementação oral (Xavier et al., 2008), administração parenteral ou adição ao

diluidor (Hu et al., 2010; Peña et al., 2003).

Contudo, resultados controversos têm sido encontrados, em função raça,

condições ambientais, dose utilizada. Deste modo, o objetivo foi verificar a influência

da adição de vitamina C e/ou Trolox ao meio diluidor do sêmen de bovinos da raça

Pantaneiro e Nelore criados sob clima tropical.

Material e Métodos

Local, animais e coleta

Foram utilizados 7 reprodutores da raça Pantaneiro (Bos taurus) e 3 da raça

Nelore (Bos indicus) com idade média de 48 meses e peso vivo médio de 606,1 ±

92,09 Kg, mantidos em pasto de Brachiaria brizantha cv.Marandu, com suplemento

proteico-energético nas águas e proteico na seca e água ad libitum, provenientes da

Fazenda Santo Augusto, município de Rochedo–MS.

As coletas foram feitas pelo método de eletroejaculação e os congelamentos do

sêmen foram realizados em dois meses de características climáticas diferentes. A

análise das amostras foi realizada nos laboratórios de Biotecnologia e Reprodução

Animal e Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso, campus

Cuiabá.

Tratamentos

Cada ejaculado foi diluído em extensor tris-gema (3,187g TRIS-hidroximetil

amino metano; 1,78g ácido cítrico monohidratado; 1,316g frutose; 80 mL água

destilada; 20 mL gema de ovo; 100000µg de estreptomicina; 100000UI de penicilina;

5 mL de glicerol para cada 100 mL de diluidor; Rota et al., 1995) em fração única na

concentração de 40x106 espermatozoides/mL, envasado em palhetas de 0,5 mL.

Após a adição deste, as amostras foram divididas em quatro partes iguais e

receberam T1 Controle: apenas o diluente; T2: 10 mM de Trolox por palheta. T3:

54

2,25 mg de ácido ascórbico/palheta e T4: 10 mM de Trolox + 2.25 mg de ácido

ascórbico/palheta.

A curva de congelamento usada foi a seguinte: 2 horas de resfriamento (4°C); 15

minutos em contato com o vapor de nitrogênio (a 5 cm do nitrogênio líquido); em

seguida submergidas em nitrogênio líquido e por fim armazenadas em botijão

criogênico.

Análises

As amostras foram descongeladas a 35-37 Cº durante 30 segundos e 10 µL

foram utilizados para análise de motilidade e vigor espermáticos em lâmina e

lamínula em microscopia óptica sob o aumento de 400x (CBRA, 1998). Foram

avaliados ainda viabilidade espermática (WHO, 1992) e integridade acrossomal

(Pope et al., 1991) em microscopia óptica sob o aumento de 1000x, com 200 células

contadas em ambos.

Substâncias reativas ao ácidos tiobarbitúricos (Tbars)

Após a descongelação, foi adicionado à amostra de sêmen 1600µL de PBS e

posterior centrifugação (800 × g, 10 min), em seguida foi retirado 1600µL

sobrenadantes para que fosse removido os resquícios de diluidor. Logo após, foi

misturado aos 500μL de sêmen restantes, 1000μL de ácido tricloroacético gelado a

10% (TCA 10%), homogeneizados e centrifugados (18,000 × g, 15 min, 15 °C) para

a precipitação de proteínas. Após centrifugação uma alíquota do sobrenadante

(500μL) foi misturado com 500μL de ácido tiobarbitúrico a 1% (TBA 1%, diluído em

0,05N de NaOH) em tubos e incubado em água fervente (90 a 100 °C) por 15 min.

Após este período, os tubos contendo a mistura foram imediatamente resfriados em

banho de gelo (0 °C) para parar a reação (Ohkawa et al. 1979). A absorbância das

amostras foi então quantificada utilizando-se um espectrofotômetro em comprimento

de onda de 532 nm. Os resultados foram comparados a uma curva padrão

previamente preparada com uma solução padrão de MDA (malondialdeído). A

concentração de TBARS foi determinada utilizando um valor de 1.56 × 105 M/mL

com o coeficiente de extinção molar do MDA. O índice de peroxidação lipídica foi

descrito em nanogramas de TBARS por 106 espermatozoides (Buege e Aust, 1978).

Atividade citoquímica mitocondrial

55

A análise da atividade citoquímica mitocondrial foi realizada de acordo com a

metodologia de Hrudka (1987), onde uma alíquota de 25 μL de sêmen foi incubada

com 25 μL de DAB (3,3'-diaminobenzidina) (1mg/mL PBS) a 37°C (banho maria), em

condições de luminosidade reduzida, durante uma hora. Após a incubação foram

realizadas extensões em lâmina, e fixadas em formaldeído a 10% por 10 minutos e

secos ao ar protegidas de luz. A avaliação foi realizada em microscopia de contraste

de fase sob aumento de 1000x, em imersão. Foram avaliados 100 espermatozoides

por amostra, e classificados segundo a atividade mitocondrial da peça intermediária,

obedecendo a escala de quatro classes propostas por Hrudka (1987), onde: classe I

(todas as mitocôndrias ativas, células espermáticas com peça intermediária

totalmente corada), classe II (células espermáticas com segmentos ativos e inativos

com predominância dos ativos, corados, indicando atividade mitocondrial média a

alta), classe III (espermatozoides com menos da metade da bainha mitocondrial

ativa), classe IV (espermatozoides completamente inativos com peça intermediária

totalmente descorada).

Delineamento experimental e análise estatística

O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em

arranjo fatorial 2x2x4 (2 raças, 2 estações e 4 antioxidantes) e as médias foram

analisados através da ANOVA e comparados pelo teste de média de Tukey com

nível de significância de 5%, o programa estatístico utilizado foi o SAS (versão 9.2).

Resultados e Discussão

Nenhuma das variáveis estudadas obteve interação estatística entre raça,

estação do ano e adição de antioxidantes ao meio diluidor ou entre raça e estação

do ano. Deste modo, os dados serão apresentados e discutidos apenas comparando

a ação de antioxidantes no extensor.

Tabela 5. Média e desvio padrão de variáveis relacionadas à função espermática de acordo com a suplementação do meio diluidor.

Variáveisa Controle Vit C Trolox Vit C + Trolox

56

Motilidade 15,57±2,45a 7,36±2,05b 3,31±0,89b 1,84±0,59b

Vigor 1,89±0,13a 1,52±0,17a 0,94±0,16b 0,73±0,10b

TBARS 130,32±10,08 153,22±29,58 98,42±12,95 91,06±11,29

aTBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, médias seguidas de letras minúsculas

diferentes na mesma linha, diferem estatisticamente entre si (P<0,05).

A adição de antioxidantes ao diluidor alterou significativamente as médias de

motilidade e vigor no presente estudo, porém não apresentou efeito sobre a

quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS; Tabela 4), cabe

lembrar que as concentrações utilizadas foram 10 mM de Trolox/20x106

espermatozoides e 2,25 mg de ácido ascórbico/20x106 de espermatozoides.

Trabalhando com diferentes concentrações de Trolox (50, 100, 150 e 200 mM

Trolox/108 de espermatozoides) no diluidor, Sicherle et al. (2006) encontraram efeito

deletério sobre a motilidade progressiva na concentração de 150 mM. A razão para

isto pode ser que pequenos níveis de EROs são indispensáveis para a sinalização

de eventos como hiperativação e fecundação (O’Flaherty et al., 1999).

Proporcionalmente, a dose utilizada neste experimento foi 3 vezes menor que a

aquela usada por Sicherle et al. (2003) que provocou efeitos deletérios sobre a

motilidade, contudo ela pode ter sido alta o suficiente para inibir a sinalização de

eventos envolvidos com a movimentação do espermatozoide.

Em outro experimento da mesma equipe não foi possível observar efeito

significativo da adição de 100 mM Trolox/108 espermatozoides sobre motilidade

progressiva, peroxidação lipídica, produção de peróxido de hidrogênio (H2O2),

capacitação espermática e reação acrossômica (Sicherle et al., 2011).

O nível de TBARS em ng/mL encontrado no presente estudo foi menor que em

estudos com sêmen bovino criopreservado (Nichi et al., 2006). Maia et al. (2010) e

Sicherle et al. (2011) verificaram que o nível de peroxidação lipídica espontânea não

foi reduzido quando adicionado Trolox ao meio diluidor na concentração de

100µM/108 espermatozoides. Porém, quando a lipoperoxidação foi induzida com a

adição de ferro e vitamina C, menores níveis de TBARS (substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico) foram encontrados nas amostras cujos meios foram

suplementados. Indicando que a adição de Trolox ao diluidor torna-se necessária em

situações onde o estresse oxidativo é estimulado (Ondei et al., 2009).

57

Nos experimentos feitos por Maia et al. (2010) e Sicherle et al. (2011) os

ejaculados foram avaliados imediatamente após a coleta e só foram processados

aqueles com valores mínimos de motilidade e concentração estipulados pelos

autores, havendo assim, uma seleção dos melhores ejaculados.

Como demonstrado por Colagar et al. (2013) existe uma correlação positiva entre

parâmetros espermáticos e lipoperoxidação, já que espermatozoides anormais são

potenciais geradores de EROs provavelmente por este motivo, não foi encontrado

efeito da adição de Trolox sobre a peroxidação lipídica espontânea nos

experimentos de Maia et al. (2010) e Sicherle et al. (2011). No presente estudo,

embora não tenha sido feita esta seleção, a motilidade média do sêmen fresco dos

animais foi de 72,05%, valor considerado adequado para a espécie bovina

(CBRA, 1998).

Figura 3. Porcentagem de células com membrana íntegra e viáveis de acordo com os antioxidantes no meio diluidor.

O uso de antioxidantes não afetou a viabilidade espermática, porém a interação

entre vitamina C e Trolox diminuiu a porcentagem de espermatozoides com

acrossoma íntegro (Figura 3).

Silva et al. (2012) não encontraram diferença na integridade de membrana

acrossomal com a adição de 30, 60 e 120 µM ao sêmen ovino, entretanto o método

usado para esta mensuração foi o uso da sonda fluorescente (FITC-PNA), diferente

do método usado neste experimento.

0

20

40

60

80

100

120

Integridade MembranaAcrossomal

Viabilidade

Po

rce

nta

gem

Controle

Vit C

Trolox

Vit C + Trolox

a ab ab b

NS

58

Adicionando 5 µM de Trolox ao sêmen de gatos (Thuwanut et al., 2008),

detectaram maior número de células com membrana plasmática íntegra. Sabe que a

membrana dos espermatozoides é rica em ácidos graxos poli-insaturados, que por

sua vez são extremamente sensíveis a oxidação por espécies reativas de oxigênio

(Aitken et al., 2006), porém o nível de TBARS encontrado por nós foi relativamente

baixo se comparado a outros estudos (Nichi et al., 2006), e provavelmente não foi

capaz de causar lesões oxidativas na membrana citoplasmática.

Tabela 6. Atividade citoquímica mitocondrial de acordo com a adição ou não de vitamina C, Trolox ou a interação entre eles.

Variáveisa Controle Vit C Trolox Vit C + Trolox

DAB 1 70,84±4,94a 40,1±4,68b 67,05±4,57a 24,52±4,29b

DAB 2 15,36±2,58b 31,84±2,15a 21,00±3,04b 31,10±2,89a

DAB 3 7,52±2,21b 20,21±4,55a 5,57±1,44b 29,47±3,74a

DAB 4 6,26±1,45b 7,84±1,44b 6,36±1,40b 14,89±2,18a

aDAB, 3,3'-diaminobenzidina (atividade citoquímica mitocondrial), médias seguidas de letras

minúsculas diferentes na mesma linha, diferem estatisticamente entre si (P<0,05).

A porcentagem de células classificadas em DAB 1 foi reduzida com a adição de

vitamina C e a interação entre vitamina C e Trolox, os mesmos tratamentos

aumentaram o número de espermatozoides DAB 2 e 3. E a proporção de células

DAB 4 aumentou no sêmen criopreservado com a interação entre vitamina C e

Trolox. Esta alteração não foi encontrada por Silva et al. (2012), onde a atividade

mitocondrial permaneceu igual apesar da adição de 30, 60 e 120 µM de Trolox.

Segundo (Koppers et al., 2008), a maior fonte de geração de EROs nas células

somáticas, é a mitocôndria, já que 2% do O2 consumido é convertido a em O2-, que

comumente é contrabalanceada por antioxidantes presentes na própria matriz

mitocondrial (Andreyev et al., 2005).

Na metodologia descrita por Hrudka, (1987), o 3,3’ diaminibenzidina (DAB) é

oxidado pelo complexo enzimático citocromo C oxidase presente nas mitocôndrias,

nesta reação o reagente é polimerizado e depositado no local da reação, e pode ser

identificado em microscopia óptica.

De Lamirande et al. (1997) discutem que as EROs além de serem importantes

para a movimentação do espermatozoide, agem estimulando o aumento do seu

59

metabolismo a ativação de enzimas, o que provavelmente esta relacionado com o

aumento da atividade mitocondrial.

No presente experimento a adição de antioxidantes foi prejudicial à atividade

mitocondrial, provavelmente porque eles neutralizaram as EROs que por sua vez

não tiveram concentração suficiente para estimular o metabolismo e a atividade das

mitocôndrias do espermatozoide.

Além disso, no tratamento com interação entre vitamina C e Trolox a queda de

atividade mitocondrial foi ainda maior. De acordo com Monteiro et al. (2005), a

vitamina E é regenerada pela vitamina C, sendo assim, a interação entre elas pode

ter potencializado o efeito antioxidante e a inibição das enzimas mitocondriais.

Com base no NRC, (1996) o requerimento de vitamina E para bovinos adultos

varia entre 50 a 100 UI/dia, ainda segundo esta fonte, os níveis desse nutriente nas

forragens é insignificante.

Todavia, as forragens são uma fonte importante de vitamina E para ruminantes,

uma vez que a concentração de α-tocoferol encontrada na carne de bovinos

produzidos em confinamento esta em cerca de 2 µg/g de músculo, enquanto a

mesma grama de tecido muscular de um boi produzido em pastejo varia entre 5 a

9,3 µg, (Yang et al., 2002). Desta forma, tem sido cada vez mais usado o

fornecimento de vitamina E dietética no fim do confinamento, já que este

componente em alimentos conservados sofre oxidação (Cusack et al., 2009).

Alguns autores demonstraram que a vitamina E é largamente destruída no rúmen

(Shin e Owens, 1990), porém estudos in vitro Han e Owens, (1999) demonstraram

que o líquido ruminal de animais alimentados com dietas ricas em concentrado ou

volumoso, incubados com α-tocoferol não resultou em desaparecimento significativo

desta substância.

Em experimento feito por Arguello, (2009) o suplemento forneceu 58 UI de

vitamina E, em contrapartida no presente experimento, os suplementos proteico e

proteico-energético fornecidos na época seca e chuvosa respectivamente, não

tinham concentrações significativas de vitaminas, contudo a demanda de α-tocoferol

para ação antioxidante no sêmen pode ter sido atingida apenas com a forragem.

Nesse sentido, mais estudos precisam ser realizados para elucidar o

metabolismo e absorção de vitaminas lipossolúveis no rúmen, bem como a

exigência delas para atividade antioxidante específica em cada tecido, dentre eles o

plasma seminal.

60

Conclusões

Portanto a adição de antioxidantes ao meio de criopreservação nas condições

estudadas não trouxe benefícios à oxidação dos lipídios espermáticos e ainda piorou

características como motilidade, vigor, integridade de membrana acrossomal e

atividade mitocondrial. Contudo, cabe lembrar que a demanda de vitaminas,

principalmente a vitamina E, pode ter sido suprida pela forragem consumida, nesse

sentido a suplementação do diluidor com antioxidantes tem potencial para ser usada

em situações de restrição alimentar.

61

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