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Departamento de Qumica e Bioqumica

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Bioqumica Analtica 2011/2012Licenciatura em Bioqumica/FCUL

Srie de Problemas #4Respostas

y = -0,058x + 2,121

y = -0,158x + 2,216

y = -0,234x + 2,313

y = -0,772x + 3,489

y = -0,24x + 2,285

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

2,5 3,0 3,5 4,0

log10Rf

%T

Grfico de Ferguson

lcool desidrogenase

Apoferritina

Tiroglobulina

Proteassoma 26S

Proteassoma 20 S

y = 0,0003x + 0,028

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 1000 2000 3000

Kr

Mr/ KDa

Kr em funo da Mr

Alexandra Salvado, n 40267 e Andreia Sousa, n 40261

Questo 4.1.

Para determinar aproximadamente a massa molecular relativa do Proteassoma 20S,

pode recorrer-se ao grfico de Ferguson. Obtm-se este grfico representando emfuno da concentrao do gel expressa em %T (figura 1).

Atravs das rectas de calibrao obtm-se o Kr (medida do efeito de retardao que a

migrao da protenas sofreu pelo gel), sendo que este corresponde ao declive das rectas.

Atravs do quadro seguinte (quadro 1) elaborou-se um grfico de Kr em funo da massa

molecular relativa (figura 2).

Quadro 1. Valores de Kr e de Mr para as diferentesprotenas.

Como o Kr do proteassoma 20 S 0,240, atravs da

recta de calibrao da figura 2 possvel determinar a

sua massa molecular relativa:

Questo 4.2.

A tcnica referida nesta questo de duas dimenses: inicialmente separam-se os

tripptidos por cromatografia em papel e depois ao cromatograma obtido aplica-se uma

electroforese em papel.

Na cromatografia em papel a separao efectuada em funo da polaridade dos solutos

presentes na amostra. Neste caso, a fase mvel apolar (mistura de solventes orgnicos:gua/butanol/cido actico, pH 4,5) e a fase estacionria polar.(gua adsorvida no papel).

Kr Mr /KDalcool Desidrogenase 0,058 150

Apoferritina 0,158 443Tiroglobulina 0,234 669

Proteossoma 26S 0,772 2600Proteossoma 20 S 0,240 ?

Figura 2.Representao grfica de Kr em funo de Mr

Figura 1. Grfico de Ferguson.

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Srie de Problemas #4Respostas

Na electroforese em papel, pelo facto das protenas possurem diferentes cargas globais a

um dado pH, permite que misturas das mesmas sejam separadas por electroforese. Protenas

com carga global negativa migram para o nodo (plo positivo); protenas com carga global

positiva migram para o ctodo (plo negativo)

Atendendo s caractersticas dos tripptidos elaborou-se o quadro seguinte:

Quadro 2. Resumo das propriedades (carga e polaridade) dos pptidos e dos aminocidos que os constituem, a pH 6,5.

Tripptido

A B C D E

Asn

Arg

Lys

Asn

Leu

Phe

Asn

His

Phe

Asp

Leu

Phe

Val

Leu

Phe

Carga dos resduosde aminocidos

+1 +1 0 +1 0 -1 +1 0 -1 0 0 -1 +1 0 -1

Polaridade dos

resduos deaminocidos Polar

Po

lar

Po

lar

Po

lar

Apolar

Apolar

Po

lar

Po

lar

Apolar

Po

lar

Apolar

Apolar

Apolar

Apolar

Apolar

Carga Global +2 0 0 -1 0Polaridade global Polar (+++) Apolar (++) Polar (++) Apolar (++) Apolar (+++)

Atravs do quadro anterior retira-se que na cromatografia em papel o factor de

retardao (), por ordem crescente ser:

Na electroforese em papel, B, C e E no migram, D migra para o nodo (+) e A migra

para o ctodo (-). O resultado esperado do mapa peptdico est representado na figura abaixo.

Figura 3. 1. Cromatograma da electroforese em papel;

2. Mapa peptdico (cromatograma seguida de

electroforese)

Questo 4.3.

A amostra de protenas inicialmente sujeita a focagem isoelctrica (riscas verticais)

e posteriormente a SDS-PAGE (riscas horizontais). Na focagem isoelctrica, as protenas

so separadas com base no seu pI. No SDS-PAGE as protenas so separadas com base na sua

massa molecular relativa.

comum encontrar riscas verticais com vrias protenas alinhadas, pois a um dado pH

existem muitas protenas com o mesmo pI (e diferentes massas moleculares). No entanto,

raro encontrar riscas horizontais, com vrias protenas alinhadas porque raro existiremprotenas com a mesma massa molecular relativa.