scichro v1n1 novo formato · o scientia chromatographica é o primeiro periódico concebido,...

Scientia ChromatographicaRevista Trimestral do Instituto Internacional

de Cromatografia

2009 | Volume 1 | Número 1

PILARES DA CROMATOGRAFIA

I. Michael Tswett e o “nascimento” da Cromatografia......................................................7

Carol H. Collins

PREPARO DE AMOSTRAS

Extração sortiva em barra de agitação (SBSE): Fundamentos teóricos e fases seletivas ...........................................21

Maria Eugênia C. Queiroz

CROMATOGRAFIA GASOSA (GC)

Cromatografia Gasosa Bidimensional ...........................................31Cláudia Alcaraz Zini

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (LC)

Como economizar (ou eliminar o uso de) acetonitrila em tempos de “crise”?..................................................51

Fernando M. Lanças

QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI)

Rastreabilidade...........................................................................61Flávio Leite

Cromatografía de gases como herramienta de estudio de lacomposición química y capacidad antioxidante de especies vegetales ricas en timol y carvacrol, cultivadas en Colombia..............67

Amner Muñoz-Acevedo, Jairo R. Martínez y Elena E. Stashenko

“COLACRO XII MEETING REPORT”12º Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas.........................................79

Fernando M. Lanças

Calendário Geral ........................................................................87

Instituto Internacional de Cromatografia.......................................91

Bookstore ..................................................................................93

Sumário

O Scientia Chromatographica é o primeiro periódico concebido,editado, impresso e distribuído na América Latina dedicado exclusivamente às técnicas cromatográficas e relacionadas (preparo de amostras, espectrometriade massas, eletroforese capilar, questões de qualidade e outras).

A intenção do periódico é ter um escopo bastante amplo, de maneira aabranger os diferentes interesses dos cromatografistas (considerando,inclusive, o fato de muitos migrarem com o tempo de uma forma para outra).

Neste contexto entendemos por técnicas relacionadas todas aquelas asquais possam estar vinculadas a ela ou que influenciem na separaçãocromatográfica, abrangendo (mas não limitando a):

• Técnicas cromatográficas em todas as suas formas (líquida, gasosa,fluido supercrítico), modos (planar – TLC, PC –, coluna, ), variações(acopladas ou não, com fluidez realçada, unificada, abrangente) edimensões (capilares, analíticas, preparativas etc.)

• Técnicas relacionadas, tais como as técnicas as quais utilizamaplicação de voltagens baixas, médias ou elevadas (eletroforesecapilar em todas as suas formas, cromatografia eletroforética micelar, eletrocromatografia e variações)

• Técnicas hifenadas as quais utilizem a cromatografia como forma deseparação (HPLC-AAS, HPLC-ICP, e outras)

• Técnicas de preparo de amostras para análise cromatográfica(extração líquido-líquido, SPE, SPME, SBSE e outras)

• Técnicas de identificação e quantificação de picos cromatográficos,quando conectadas a uma das formas de cromatografia ou técnicasrelacionadas (GC|MS, LC|MS|MS, GC|AES, SFC|MS, e outras)

• Técnicas multidimensionais (column switching, abrangente e outras)• Assuntos teóricos e educacionais de interesse da área.

O objetivo principal do periódico é manter o leitor atualizado na área decromatografia e técnicas relacionadas, abordando assuntos práticos e teóricosde interesse geral dos leitores.

Os artigos publicados neste periódico envolverão inicialmente assuntosfocalizados na forma de sessões, tratando de assuntos específicos (LC, GC,Preparo de Amostras, Qualidade e outras), artigos convidados, assim comosessões informativas como Calendário|Agenda, Novidades da área, Livros eassuntos relacionados (“Bookstore”) e outros.

As sugestões visando ao aprimoramento do periódico, assim como detópicos de interesse dos leitores, serão muito bem recebidas pelos Editores.

2009 | v . 1 | n . 1 5

S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a

Editorial

Fernando M. LançasEditor

Vários autores têm chamado o século 20“o século da cromatografia”, uma vez que essatécnica foi altamente importante nodesenvolvimento de várias áreas das ciênciasfísicas e biológicas durante todo este século. Nomomento, existem indicações que ascromatografias e as suas técnicas relacionadastambém proporcionarão relevantes contribuições neste século 21.

Porém, uma indagação que surge destacolocação é se a cromatografia teve início somente no século 20. A resposta a essa pergunta é sim e não, sendo que respostas mais definitivasserão descritas paulatinamente, em maiorprofundidade, em uma série de artigos que serãopublicados na seção Pilares da Cromatografia.

Os métodos de separação têm sidoempregados durante quase toda a história dahumanidade. Atividades como remoção de

2009 | v . 1 | n . 1 7


I. Michael Tswett e o “nascimento” da Cromatografia

Carol H. Collins

Universidade Estadual de CampinasInstituto de Química13083-970 – Campinas (SP)Brasil

ResumoEste capítulo de "Pilares de Cromatografia" sumariza a vida do

M.S. Tswett e as suas contribuições ao conceito de cromatografia e às

origens das palavras "cromatografia" e "cromatograma".

AbstractThis chapter of "Pillars of Chromatography" summarizes the life

of M.S. Tswett and his contributions to the concept of column liquid

chromatography and to the origin of the words "chromatography" and

"chromatogram".

Palavras-chave

História da cromatografia, M.S.

Tswett, Cromatografia líquida,

Cromatografia em coluna.

Keywords

History of chromatography, M.S.

Tswett, Liquid chromatography,

Column chromatography.

contaminantes por filtração em areias ou deexcesso de sal por contato com certas folhasencontram-se descritas na Bíblia e em trabalhosgregos e egípcios antigos. Outros métodos deseparação, como destilação, extração porsolvente e amalgamação, foram empregadospelos alquimistas. Os efeitos resultantes da“adsorção” foram descritos no século 16 para um processo de preparação de vinho branco a partirde vinho tinto. No século 19, alguns cientistasaplicaram diferentes sólidos para “filtração”,remoção de algumas componentes oufracionamento de líquidos, enquanto outrosfizeram esses fracionamentos em papel.

As separações realizadas em papel comdesenvolvimento no modo circular para aidentificação da “composição” de saisinorgânicos foram iniciadas por F.F. Runge em1834. A sua grande obra foi um livro publicado

em 18551 (Figura 1). Também no meio do século19, C.F. Schönbein2 e F. Goppelscröder3

introduziram separações feitas em tiras de papel,aplicando um tipo de desenvolvimentoascendente (Figura 2) e supuseram que a subidaobservada foi devido à “ação capilar”, similar àascendência de seiva em um árvore. Asseparações aplicando o desenvolvimento circular com água e uma camada de gelatina espalhadasobre uma placa de vidro foram descritas em1889 por Beyerlink4 e um tipo de troca iônica, naqual amônia era substituída por íons potássiodurante a passagem de urina de vacas através deum zeólito natural, foi descrito,independentemente, por Thompson5 e por Way6

em trabalhos publicados em 1850. Umadescrição de separações de sais inorgânicos queocorreram devido à passagem de um líquidoatravés de um sólido disposto em uma coluna foipublicado por Reed, em 1893, utilizando caulimcomo fase estacionária e água como fase móvel7.Day, nos EUA8, e Engler e Albrecht, naAlemanha9, utilizaram colunas de fuller´s earth(barra de pisoeiro, um produto natural de silicatode alumínio e magnésio) e soluções de petróleoem éter de petróleo (de ponto de ebulição baixo)para fracionar petróleo, em um processo que hoje é chamado “análise frontal”. Estes últimospesquisadores também utilizaram odesenvolvimento ascendente (Figura 3), mascontinuaram o processo até coletar as fraçõesseparadas, o que permitiu distinguir as diferentes fontes das amostras de petróleo.


8 www.scient iachromatographica .com

Figura 1. Capa do livro de Runge (1855).Figura 2. Sistema para separações em papel utilizado porSchönbein e por Goppelscröder.

Essas separações ocorreram comoconsequência de um dos mecanismos hojeconsagrado em cromatografia, mas os processosenvolvidos não foram apropriadamentereconhecidos nesses experimentos do século 19.Este reconhecimento somente aconteceu noinício do século 20 com os trabalhos publicadospelo russo Michael Semenovich Tswett, queidentificou o mecanismo do seu processo daseparação como o de adsorção e introduziu apalavra cromatografia ao mundo da ciência.

Michael Tswett nasceu em 14 de maio de1872 em Asti, no norte da Itália. Seu pai, o russoSemen Nikolaevich Tswett, era um oficial dasecretaria de finanças do governo russo. Suamãe, Maria Dorozza, nasceu na Turquia, porémtinha descendência italiana. Ela foi para a Rússiatrabalhar e casou-se com o Sr. Semem Tswett. As responsabilidades do Sr. Semen Tswett faziamcom que ele viajasse muito e a sua esposa quasesempre o acompanhava. Após um período emGênova, o casal planejou férias ao norte da Itália. Infelizmente, Maria Dorozza Tswett ficoudoente, deu à luz prematuramente a um meninoe, logo depois, faleceu. O pai junto com o filho euma “enfermeira lactante” foi para Lausanne, naSuíça. Lá ele deixou o seu filho, ainda bebê, aoscuidados de uma família e voltou para o seu

trabalho na Rússia, visitando o seu primeiro filho com certa frequência. A educação primária esecundária de Michael Tswett ocorreu emLausanne e a sua primeira língua foi o francês,aprendendo, mais tarde, o alemão e o inglês naescola. Em 1882, o Sr. Semen Tswett com a suafamília (o seu segundo casamento deu-lhe maiscinco filhos) mudaram-se para Genebra na Suíçaa mando do seu serviço na Rússia Imperial.Michael mudou-se de Lausanne para Genebrapara viver com a sua família e, com ela, começoua aprender russo.

Após completar o colégio em Genebra,Michael iniciou seus estudos universitários naUniversidade de Genebra. Obteve seubacharelado em ciências com ênfase em botânica em 1893. Pela sua monografia de bacharelado,desenvolvido com o Prof. Chodat, ele recebeu oprêmio “H.Davy” em 1894.

Em 1893 Michael Tswett começou os seus estudos de doutorado na Universidade deGenebra no Laboratório de Botânica Geral doProf. Marc Thury. O seu co-orientador foi Dr.John Briquet, um “assistente” do Prof. Thury. Asua tese de doutorado, aprovada em 1896,descreveu a estrutura da célula, o movimento doprotoplasma dentro da célula e a estrutura decloroplastos. Parte dessa tese indicou aimportância da clorofila e sua contribuição àassimilação da energia solar pela planta, o quemarcou o início de um assunto que ocuparia orestante da sua vida.

Após obter o seu doutorado, MichaelTswett (Figura 4), com 24 anos de idade, viajoupara Rússia para tentar um emprego, pois seu paie a sua família haviam voltado, em 1895, para acidade de Simferopol. A Rússia era um lugaronde Michael Tswett nunca tinha morado epossuía uma língua que ele mal falava. Apósalgumas tentativas decepcionantes de conseguirum emprego em uma área relacionada à botânicae tendo descoberto que um doutorado no“exterior” não era reconhecido pelas autoridadesrussas, Michael Tswett resolveu iniciar um outroprojeto de pós-graduação, um mestrado, em SãoPetersburgo, trabalhando como assistente delaboratório e dando aulas à noite. A suadissertação de mestrado foi desenvolvida no

2009 | v . 1 | n . 1 9


Figura 3. Sistema para separações em coluna utilizado porEngler e Albrecht.

laboratório do Prof. F. Lesgaft e tratou daestrutura físico-química do grão da clorofila. Elafoi defendida em 1901 na Universidade de Kazan (Figura 5). Após o sucesso da sua defesa domestrado, Tswett tentou uma posição nessauniversidade. Ele recebeu uma indicação, mas avaga demorou a ser aberta e Tswett aceitou oconvite de um dos seus professores de SãoPetersburgo, Prof. D.I. Ivanovskii, recentementeindicado para ser o catedrático de botânica naUniversidade de Varsóvia, para acompanhá-lo.

Desta forma, em janeiro de 1902, Tswettmudou para Varsóvia, na parte da Polôniaocupada pela Rússia Imperial, para trabalharcomo instrutor de laboratório no Departamentode Anatomia e Fisiologia de Plantas daUniversidade de Varsóvia. É importante indicarque a Universidade de Varsóvia foi consideradauma das universidades do sistema russo, comaulas em russo. Outras universidades, na parteoeste da Polônia ocupada pelos alemães,mantiveram as aulas em polonês.

Em 1902, Tswett foi promovido aprofessor assistente e lhe foi permitido ministraraulas teóricas. Em 1907, ele foi nomeado“Lecturer” (equivalente a professor assistentedoutor) no Instituto Veterinário da universidade.Em 1908, Tswett transferiu-se para o InstitutoPolitécnico de Varsóvia, onde foi nomeado“Senior Lecturer” (professor associado) embotânica e agricultura. Casou-se com HelenaTrusiewicz, de origem checa, em 1907 (Figura 6).

Durante a pesquisa para seu mestrado emSão Petersburgo, Tswett observou que anéis com cores diferentes apareciam quando ele filtravaum extrato de clorofila em certo tipo de papel.Ele concluiu que o extrato não continha umaúnica substância, mas vários compostos. Assim,quando iniciou a sua pesquisa em Varsóvia coma intenção de escrever uma nova tese dedoutorado, Tswett fez alguns experimentos natentativa de separar esses possíveis componentes presentes em extratos da clorofila.

A primeira etapa dos experimentos deTswett consistiu na obtenção de um extrato defolhas de diversas plantas. Para isso, ele testouvários solventes orgânicos e notou que cadasolvente mostrou um comportamento diferente:



Figura 4. Michael Semenovich Tswett em Genebra, naépoca da defesa do seu doutorado obtido na suíça em 1896.

Figura 5. Michael Semenovich Tswett em São Petersburgo, naépoca da defesa do seu mestrado no São Petersburgo em 1901.

Figura 6. A senhora Helena Trusiewicz Tswett.

etanol e acetona extraíam uma quantidaderelativamente grande de substâncias, enquantoque dois tipos de éter de petróleo, isto é, fraçõesde hidrocarbonetos com pontos de ebuliçãodiferentes, extraíam quantidades bem maisreduzidas. Por outro lado, uma vez extraída poretanol, todo o extrato também era solúvel noséteres de petróleo. Essa observação não foiinédita, pois seus predecessores já tinhamrelatado este comportamento e tinhaminterpretado como resultante da transformaçãodo “composto” extraído. A consideração deTswett foi que se tratava de uma série decompostos diferentes e que alguns destes erammais retidos pela estrutura da planta,requisitando um solvente mais forte paraextraí-los. Por outro lado, uma vez removido daplanta, esta “força” que mantinha o composto naplanta se extinguia e a solubilidade dependia docomposto isolado e não do complexo com aplanta. Hoje é reconhecido que essainterpretação estava correta.

A próxima etapa foi separar essescompostos. Nos experimentos iniciais, Tswettadicionou diversos tipos de sólidos orgânicos einorgânicos a uma série de frascos contendo oextrato dissolvido na fração de éter de petróleocom ponto de ebulição mais alto e observou quecada sólido retirou uma parte do extrato.Realmente, essa série de etapas com um extratorevelou a presença de diversas substâncias.

Ele descreveu esses experimentos eapresentou as suas conclusões preliminares emuma reunião da Sociedade de Naturalistas daUniversidade de Varsóvia em março de 1903para uma plateia de aproximadamente 40pessoas, sendo alguns botânicos e químicos. Umrelatório dessa apresentação indicou que Tswettmostrou vários diagramas, porém, como eracomum naquela época, quando estes resultadosforam publicados (em russo) na revista dasociedade em 1905 (Figura 7)10, nenhumdiagrama foi incluído na versão impressa. Emum trabalho recente11, um diagrama (Figura 8)foi feito baseado na descrição das etapas contidano trabalho publicado em 1905 e ele confirmou a

descontinuidade das etapas de separaçãoenvolvidas no processo que Tswett chamou“absorção por precipitação”.

Neste trabalho publicado em 190510,Tswett também indicou que frações poderiam ser obtidas por um processo que ele denominou“adsorção por filtração”, realizado em papel defiltro contendo uma camada de sólido. Algumaspessoas consideram esta a primeira “descrição”

2009 | v . 1 | n . 1 11


Figura 7. Primeira página do trabalho de M. Tswett de 1903 em Tr. Protok. Varshav. Obshch. Estertvoispyt. Otd. Biol.1903, 14, 20-39 (data de publicação: 1905).

Figura 8. Esquema do sistema de extração descrito pelo Tswettna sua apresentação em 1903 11. Y = amarelo; G = verde.

da “cromatografia”. Entretanto, esse trabalho de1905 não continha a palavra “cromatografia” e adescrição da “adsorção por filtração” estavamenos clara que as descrições apresentadas nostrabalhos dos pesquisadores que “filtravam”petróleo.

Em 1905, Tswett publicou um outrotrabalho12 no qual ele criticou os resultadospublicados recentemente por um dos professoresmais renomados da sua área13, o Prof. HansMolisch, professor catedrático do Instituto deFisiologia de Plantas da Universidade de Praga.No seu trabalho, o Prof. Molisch descreveu ospigmentos extraídos de algas marrons, obtidospelo processo de cristalização. Com esseprocesso, o componente majoritário foi isoladona forma sólida e os componentes emquantidades menores foram desprezados. Comisso, foram identificadas várias clorofilasdiferentes, originadas de diferentes algas, queforam correlacionadas com suas origens.

Tswett havia iniciado um estudo com algasem uma das suas frequentes viagens ao norte daAlemanha e discordou dos resultados do Prof.Molisch, indicando que ele havia desenvolvido“um novo e confiável” método de analisarextratos e que esse método indicou a presença demais de uma “clorofila” no extrato de umaespécie, sem entrar em detalhe sobre esse novométodo. A resposta de Molisch foi imediata14,rejeitando os comentários de Tswett e indicandoque não deveria ser permitido publicar umtrabalho sem apresentar dados, ponto de vista estetambém defendido por Kohl15.

Em resposta, em 1906, Tswett publicoudois trabalhos detalhados no Berichte derDeutschen Botanischen Gesellschaft16,17, arevista mais importante da sua área de atuação,apresentando uma descrição do seu método e osresultados obtidos com extratos contendoclorofila (Figura 9). Na descrição minuciosa dassuas pesquisas (mas ainda sem figuras oudiagramas) Tswett indicou que usou um tubo devidro contendo um sólido, orgânico ouinorgânico, tendo sido testados mais de cemsólidos, dos quais os melhores foram carbonato

de cálcio, inulina (um polissacarídeo) e alumina,para a separação dos pigmentos extraídos dasfolhas de plantas. A separação aconteceu pelapassagem, descendente, da solução do extratoem um líquido apolar e que, na sua interpretação,as substâncias mais atraídas pelo sólido forçaram as menos atraídas a percorrerem maioresdistâncias dentro da coluna.

Tswett descreveu um processo que, hoje, é chamado cromatografia líquido-sólido emcoluna seca, na qual a solução da amostra écolocada no topo de um sólido seco (novocabulário de hoje, uma fase estacionária)contido dentro de um tubo de vidro.Aparentemente, nesses experimentos de Tswett,a solução inicial, contendo a amostra,encontrava-se relativamente diluída, poisalgumas bandas distintas já eram evidentessomente com a passagem dessa solução. Após apassagem do solvente no qual a amostra estavadissolvida, iniciou-se a passagem do solventepuro (no vocabulário de hoje, uma fase móvel).Várias fases móveis apolares foram testadas e amelhor foi o dissulfeto de carbono. A separaçãofoi sinalizada pelas bandas de diferentes coresque apareceram e a passagem da fase móvel foicessada quando as substâncias se separaram, sem serem eluídas da coluna. Nenhum dos trabalhosde Tswett descreveu a etapa de eluição como otermo é empregado hoje. O isolamento dassubstâncias separadas foi feito empurrando osólido para fora da coluna, separando as bandasde cor diferente com uma espátula, e extraindocom um solvente adequado a(s) substância(s)



Figura 9. Títulos dos artigos publicados em 1906: (a) M.Tswett, Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1906, 24, 316-32316; (b) M. Tswett, Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1906, 24, 384-39317.

contida(s) nas bandas, para obter o seu espectrode absorbância no UV-visível.

É importante salientar que o próprioTswett considerou as separações realizadas poresse novo método como uma ferramenta quepermitiu estudos de diferentes pigmentosextraídos das plantas, sendo que o alvo de seusestudos foi identificar os diversos compostos que constituíam os seus extratos, comparando asdistâncias percorridas e as cores das bandas umas com as outras, na tentativa de descobrirsubstâncias comuns a todas as plantas e as quepoderiam ser específicas de uma ou outra planta.

Para a história da ciência de separação, ostrabalhos de 190616,17 são considerados de altaimportância porque neles Tswett atribuiu,corretamente, o mecanismo envolvido naseparação, que se baseia na adsorção diferencialdos componentes da amostra pelo sólido (faseestacionária) contido na coluna, ocorrendo odesenvolvimento pela passagem do solvente (fasemóvel), o qual carregava os compostos menosatraídos pelo sólido para distâncias maioresdentro da coluna. Tswett cuidadosamentedistinguiu a “adsorção” que ocorria quando a fasemóvel era descendente do processo de “açãocapilar” das separações ascendente de Schönbein2

e Goppelscröder3, implicando que o mecanismoera diferente. Porém, em trabalhos subsequentes,Tswett admitiu que ambos os processos poderiamacontecer por um mecanismo similar, o deadsorção.

De igual ou maior importância para asseparações, esses trabalhos16,17 introduziram,pela primeira vez, a palavra “cromatografia”,para denominar o processo que estava ocorrendo(ver esta palavra no título do segundo trabalho,Figura 9b). Nesses trabalhos encontram-se, alémdo nome da técnica, a palavra “cromatograma”, para descrever um desenho das bandas separadas na coluna; o cromatograma registrado por Tswett era visualizado dentro da própria coluna devidro, similar ao que acontece hoje emcromatografia planar.

A origem das palavras utilizadas porTswett também é polêmica. A palavra “cromo”vem do grego chroma, com o significado de cor,e a “grafia” também vem do grego graphe,

significando escrever. Entretanto, Tswett, nostrabalhos de 1906 nos quais usou as palavras pela primeira vez16,17, cuidadosamente indicou que aseparação não dependia da cor, mas sim dasinterações das substâncias, coloridas ou não,com a fase estacionária, aplicando o mecanismode adsorção. Entretanto, a palavra chromapoderia ter outra origem: a palavra russa tsvet (amais apropriada transliteração do seu nome russo para o inglês, sendo que “tswett” encontra-se naortografia alemã) também significa cor. Pareceque Tswett utilizou a palavra de origem grega doseu próprio nome para denominar a“descoberta” dessa “nova” técnica. Emconsideração a esse fato, alguns usuários da nova técnica, nas décadas seguintes, a chamaram“Tswettography”.

Um aluno de pós-graduação daUniversidade de Berlim, Gottfried Kränzlin, apósler os dois trabalhos de 1906, decidiu adotar essanova técnica na sua tese na área de botânica. Oobjetivo do seu trabalho foi realizar um estudo deplantas com folhas listradas, um fenômeno quepode ser natural ou induzido por uma infecção.Ele estudou 17 plantas, descrevendo suasanatomias e as presenças de certos íonsinorgânicos, e aplicou a técnica de Tswett paraseparar os constituintes orgânicos. Para as suasextrações, ele utilizou etanol na primeira etapa deextração das folhas, evaporou esse solvente ereextraiu o sólido com dissulfeto de carbono,aplicando essa solução em uma coluna decarbonato de cálcio contido em um tubo de vidrode 100 mm x 1,5 mm (a fase estacionária era de 50 mm). Quando todo o dissulfeto de carbono passou através da coluna, as posições e as cores dasbandas foram registradas e, a seguir, umaquantidade de benzeno foi adicionada ao tubo e asmudanças nas posições e nas cores foramnovamente registradas e comparadas. Osdiagramas resultantes, dois cromatogramas, são,provavelmente, os primeiros cromatogramas comeluição por gradiente em etapas (Figura 10).Finalmente, o sólido foi removido da coluna e asbandas separadas foram extraídas. Essas soluçõesforam então caracterizadas pela absorbânciaespectroscópica. A tese de Kränzlin18 comparouos cromatogramas obtidos por ele com os dados

2009 | v . 1 | n . 1 13


apresentados por Tswett nos trabalhos de190616,17 e com um outro trabalho de Tswetdatado de 190719, confirmando as conclusões deTswett sobre a variedade de compostos extraídosdas folhas, porém discordando de uma dasidentificações. A segunda eluição com benzenoseparou uma banda em duas.

Após a defesa da sua tese em fevereiro de1908, Kränzlin publicou um trabalho20 sobre aaplicação da nova técnica de cromatografia.Infelizmente, este trabalho, que confirmou autilidade da cromatografia para estudos deextratos, não teve qualquer repercussão entre amaioria dos químicos e biólogos da época.

Como de hábito, nos períodos entre asaulas, Tswett e sua esposa viajaram para o oesteda Europa. Ele utilizou o seu tempo de férias emvisitas aos diversos laboratórios e bibliotecas epara coletar amostras. Em maio e junho de 1907,ele participou de duas reuniões da SociedadeAlemã de Botânica e demonstrou a sua novatécnica. O aluno de pós-graduação Kränzlinassistiu a uma dessas apresentações e discutiu asseparações de clorofilas com Tswett. Após a

defesa, Kränzlin enviou uma cópia da sua tesepara o Tswett, que estava começando a escrever a sua mais importante obra, um livro que serviriapara obter um doutorado na Rússia Imperial.

A tese de Tswett, sobre as clorofilas nomundo das plantas e dos animais, foi submetida àpublicação no fim de 1908 como um livro, que era o requisito das autoridades russas e, finalmente,publicada em 1910 (Figura 11). A sua defesa detese, com uma banca composta pelos ProfessoresD. Ivanovskii e W. Chmielewski, da botânica, epelo Professor B.Kurilov, de química, ocorreu nodia 28 de novembro de 1910, conferindo o títulode Doutor em Ciências ao Tswett. Em 1911 olivro ganhou um prêmio, o Prêmio Akhmatov, eTswett recebeu uma quantia significativa dedinheiro, da Academia de Ciências da RússiaImperial (Figura 12).

O objetivo principal da tese foi comparar as substâncias relacionadas às clorofilas, àsxantofilas e aos carotenóides encontrados emdiferentes plantas e animais, empregando acromatografia. Além da anotação da posição dabanda colorida no cromatograma, ele retirou a



Figura 10.: Três pares de cromatogramas de GottfriedKränzlin. (a) após a primeira eluição com dissulfeto decarbono; (b) após a segunda eluição com benzeno. III =extrato das folhas de Pinus aucaparia fol. luteo variegatia; X = extrato das partes amarelas das folhas de Abutilon spec. Erfurter Glocke; XV = extrato das partes amarelas dasfolhas de Evonymus Japonicus fol. aweomarginatis.

Figura 11. Capa do livro de M.S. Tswett, publicado em 1910,apresentado como sua tese de doutorado na Rússia Imperial.

fase estacionária da coluna, separou as bandas,extraiu o composto com solvente e registrou oespectro UV-visível. Pela técnica cromatográfica,ele “identificou” vários compostos constituintesde seus extratos. É importante indicar que Tswettqueria conseguir um número máximo decompostos para realizar essas comparações, emvez de tentar obter somente um composto puro,após uma série de etapas envolvendo extraçõescom diferentes solventes, como foi a prática naépoca. Por outro lado, ele não tentou estabelecer

outras propriedades dessas substâncias e, por isso, foi criticado pelos químicos e botânicostradicionais que acreditavam que, mesmoapresentando comportamento reprodutível emvárias etapas, um composto não pode serconsiderado puro se não se apresentar em umaforma cristalina, com ponto de fusão definido.Essa polêmica continuou por quase duas décadasapós a publicação do livro de Tswett, que foitraduzido para o francês e o alemão, e fez com que houvesse uma certa demora na aceitação datécnica cromatográfica.

No livro, foram apresentadas figurasilustrando o “equipamento” utilizado peloTswett (Figura 13). Nas suas descrições, Tswettindicou que o desenvolvimento docromatograma (tubo com bandas na partesuperior direita da Figura 13) pode ser feito semnenhuma ajuda ou aplicando pressão (ver obulbo de borracha que pode pressurizar omanifold, o qual suporta vários tubos deseparação e o manômetro de mercúrio. Omanifold continha parafusos de aperto –destaque na parte superior centro da Figura 13 –para fechar um ou mais dos tubos) ou vácuo deum aspirador de água (ver o kitassato na partesuperior esquerda da Figura 13). A maioria das

2009 | v . 1 | n . 1 15


Figura 12. Dr. Michael Tswett em Varsóvia, 1911.

Figura 13. Alguns dos equipamentos utilizados por Tswett na sua tese.

suas separações foi realizada em tubo de 1,5 mmde diâmetro interno, mas Tswett também indicou que tubos de até alguns centímetros de diâmetrointerno mostraram comportamentos similares.

Após a defesa, Tswett continuou publicando trabalhos sobre as clorofilas, as xantofilas e oscarotenóides (o currículo dele inclui mais de 50trabalhos publicados, a maioria em francês oualemão – um fato curioso é que nunca teve umcoautor). Três deles são importantesconsiderando-se a controvérsia/polêmica sobre omelhor método de realizar purificações de extratos, cristalização – o método de Willstätter (professortitular no Instituto Politécnico de Zürich naquelaépoca, mais tarde catedrático do Instituo deQuímica Kaiser Wilhem em Berlim-Dahlem, queganhou o Prêmio Nobel de 1915 por suascontribuições aos estudos de carotenóides) e devários outros pesquisadores – ou a cromatografia,tendo até aquele momento Tswett como seupromotor. Três trabalhos trataram da identificaçãodas clorofilas21-23. Tswett indicou que duasclorofilas distintas podem ser separadas pelométodo de cromatografia e que esses doiscompostos apresentaram espectros no visívelcaracterísticos e diferentes. Por outro lado, mesmoadmitindo que poderia existir mais de umaclorofila, uma vez que, após uma longa extraçãopor Soxhlet, eles também encontraram um segundo composto pelo método de cristalização,considerado um artefato causado pelo calor, ogrupo de Prof. Willstätter, que tinha uma traduçãopara o alemão do livro de Tswett, acreditou que oprocesso cromatográfico, isto é, as interações coma fase estacionária causaram modificações nasestruturas da clorofila da planta24.

Uma controvérsia similar ocorreu com asxantofilas. Tswett relatou a presença de quatroxantofilas distintas. Novamente, Prof. Willstätter e alguns outros pesquisadores acreditavam queexistia somente um composto nas plantas e queos solventes ou o sólido utilizados para aseparação induziam a presença dos demaiscompotos. Um aluno do grupo do Prof.Willstätter “comprovou” essa hipótese aocolocar uma xantofila purificada porcristalização em uma coluna de carbonato decálcio e eluír com álcool. Mais de uma banda foi

observada e o Prof. Willstätter considerou-ascomo degradação na coluna. Por outro lado,Tswett já tinha mencionado, nos trabalhos de1906 e em outros subsequentes, que um certocuidado deveria ser tomado com alguns doscomponentes extraídos das plantas, devido àssuas instabilidades, e indicou a combinação decarbonato de cálcio ou alumina com álcool comouma das catalisadoras dessa ocorrência.

Os trabalhos polêmicos dessespesquisadores estimularam dois alunos de Prof.Charles Dhéré, da Universidade de Fribourgo(Suíça) a investigar essas substâncias comcuidado. O primeiro destes alunos, WladyslawFranciszek de Rogowski, um polonês deVarsóvia, iniciou seus estudos com o Prof. Dhéré em 1911. É possível que Rogowski tenhachegado a Fribourgo com uma cópia do livro doTswett. Muito provavelmente ele e seu professorbasearam as suas pesquisas nos trabalhospublicados por Tswett. O projeto de Rogowskifoi comparar as “clorofilas” obtidas pelos doismétodos, a cromatografia e a cristalização.Resultados preliminares foram apresentados àAcademia de Ciências da França (e publicadosna ata da reunião25) em 1912. A publicaçãoindicou que a realização dos experimentos pelosdois métodos seguiu as etapas da relevanteliteratura e que a cromatografia, utilizando ométodo do Tswett, resultou em dois compostos,hoje chamados clorofila a e clorofila b, comespectros ultravioleta e de fluorescênciadistintos, enquanto que somente um dos doiscompostos obtidos por cristalização pareciapuro, pois o outro apresentou um espectro deabsorbância no ultravioleta com as bandas dosdois compostos separados pelo método deTswett.

A tese de doutorado do Rogowski26

continha um desenho do aparelho que eleutilizou para a cromatografia (Figura 14). Emvez da constrição que dificultava a remoção dafase estacionária no sistema de Tswett após odesenvolvimento do cromatograma dentro dacoluna, o final da coluna possuía uma cortiçaperfurada. Similar aos trabalhos de Tswett, asseparações de Rogowski utilizaram carbonato de cálcio como fase estacionária e dissulfeto de



carbono como fase móvel e a passagem da fasemóvel era assistida por vácuo.

O segundo aluno de Prof. Dhéré foiGuglielmo Vegezzi, um suíço que começou suapesquisa em 1912. Entretanto, a prestação deserviço no exército suíço, durante a PrimeraGuerra Mundial, impediu que ele defendesse a sua tese antes de 1916. Vegezzi, em sua pesquisa,aplicou a técnica cromatográfica para determinarpigmentos em invertebrados, maisespecificamente em fígado de um tipo de lesma eem ovos de um tipo de caranguejo. Seus estudosresultaram em seis trabalhos publicados27-32. Asua tese33 mostrou um sistema cromatográfico(Figura 15) descrito como um aprimoramento domodelo de Rogowski, sendo que toda a faseestacionária pôde ser vista, permitindo assim ummelhor controle do desenvolvimento docromatograma com respeito aos compostos maisretidos.

Nesse período (1912-1916), o Prof. Dhérétambém publicou vários outros trabalhos, porémnenhum aplicando a cromatografia. Após 1916,as responsabilidades administrativas do Prof.Dhéré ocasionaram uma redução das suasatividades de pesquisas e nenhum outro trabalhoaplicando a cromatografia foi feito. Por outrolado, uma das primeiras biografias de Tswett foide autoria do Dhéré34.

Os trabalhos de Tswett tambémdespertaram o interesse de pelo menos umpesquisador que residia no outro lado do OceanoAtlântico. Leroy Sheldon Palmer, um engenheiroquímico, iniciou uma pesquisa para obter umdoutorado com Prof. Henry Eckles, daUniversidade de Missouri, nos Estados Unidos e,após ler os trabalhos publicados nas revistasalemães, também resolveu testar ambos osmétodos para a desenvolvimentos decarotenóides. O seu objetivo foi investigar oscarotenóides extraídos de diversos produtos de

2009 | v . 1 | n . 1 17


Figura 14. Sistema cromatográfico utilizado porRogowski, aluno de Dhéré. (a) coluna cromatográfica de

vidro, 250 mm × 20 mm d.i.; (b) cortiça com múltiplasperfurações, 10 mm de altura; (c,d) peça de madeira paraempurrar a fase estacionária fora da coluna; (e) tubo devidro de proteção; (f) rolhas de borracha; (g) disco deporcelana perfurado; (l) frasco de vidro; (m) funil; (w)aspirador de água.

Figura 15. Sistema cromatográfico utilizado por Vegezzi,outro aluno de Dhéré. (t) coluna cromatográfica de vidro,

350 mm × 16 mm d.i.; (m) tubo de vidro de proteção; (v) lãde vidro com 5 mm de altura; (l) cortiça com múltiplasperfurações; (d) disco de porcelana perfurado; (s) rolhas deborracha; (w) saída para o aspirador de água.

origem animal e tentar verificar se existia umacorrelação entre a dieta dos animais e o leite ou acarne produzidos. Logo depois de ter iniciado asua pesquisa, Palmer decidiu focalizar nacromatografia, utilizando inulina ou sacarosecomo fase estacionária e dissulfeto de carbonocomo fase móvel (Figura 16). Ele realizou osexperimentos da mesma maneira que a escrita porTswett, começando com a coluna seca,adicionando uma solução relativamente diluídado seu extrato e parando quando as bandascoloridas tivessem sido separadas para registrar ocromatograma (Figura 17). Entretanto, em vez deretirar a fase estacionária da coluna, como foi feito em todos os trabalhos de Tswett, Palmer resolveucontinuar a eluição, após já ter registrados oscromatogramas, coletando as bandas eluídas paraa obtenção dos seus espectros UV-visível. A suatese35 indicou, entre outros resultados, que tanto oleite como a manteiga da vaca apresentaramcomposições relativas e absolutas diferentes doscarotenóides, dependendo se a vaca se alimentoude pastagem ou de feno seco, estabelecendo assim uma relação direta entre a comida da vaca e oscomponentes presentes no leite. Após a defesa datese, Palmer continuou na Universidade deMissouri como professor assistente doutor,transferindo-se para a Universidade de Minnesota

em 1919 como professor associado. Em 1922, foipromovido a professor titular. A sua linha depesquisa continuou relacionada aos carotenóidese um livro definitivo sobre o assunto, contendoum capítulo detalhado sobre como realizar acromatografia líquido-sólido, foi publicado em192236.

Uma vez completado o doutorado, requisitodas autoridades russas para desfrutar de umaposição de direção, Tswett dedicou umaconsiderável parte do seu tempo na tentativa de conseguir uma cadeira universitária, sem sucessoimediato. Isso não deveria ser consideradosurpreendente, uma vez que na Rússia Imperialhavia somente nove grandes universidades nasquais uma posição de catedrático podia serconseguida; entretanto nem todas essasuniversidades possuíam um jardim botânico, comoele desejava. Para complicar o seu futuro, a suasaúde começou a deteriorar – aparentemente elesofria de problemas cardíacos – e os eventos naEuropa, fora da universidade, também interferiram.

Em 1908, antes da defesa da sua tese,Tswett saiu da Universidade de Varsóvia paraatuar como professor associado no InstitutoPolitécnico de Varsóvia, onde ele continuouapós a defesa. Os alunos consideravam que eleapresentava aulas excelentes e, devido a isso, as



Figura 16. Sistema cromatográficoutilizado por Palmer.

Figura 17. Dois cromatogramas da tese de Palmer: (a) extrato de cenoura; (b) extratode feno seco.

suas disciplinas eram muito procuradas.Entretanto, a preparação e a apresentação dasaulas causavam-lhe muito desgaste e eleprecisava solicitar licenças saúde comfrequência. Em 1915, durante a Primeira GuerraMundial, com as tropas alemães avançando paraVarsóvia, ele, junto com os outros professores ealguns alunos do Instituto Politécnico,transferiram-se para Nizhnii Novgorod, ondefundaram o Instituto Agronômico de Gorkii.

Em 1917, Tswett finalmente recebeu a tãodesejada indicação para uma cadeira decatedrático, na Universidade de Ture’ev (naépoca, parte da Rússia Imperial, hoje a cidade deTartu, capital de Estônia). Lá ele lecionou pormenos de um semestre quando, novamente, foinecessário transferir-se, pois as tropas alemãescomeçaram a ocupar a cidade. Tswett mudou-seem fevereiro de 1918 para Voronezh, onde elefoi indicado para a cadeira de botânica em umanova universidade estadual que estava sendocriada. Porém, o seu estado de saúde continuou apiorar e ele faleceu em Voronezh em 26 de junhode 1919. O seu corpo foi enterrado no cemitériodo monastério de Alekseev, que foi destruído naSegunda Guerra Mundial.

Os trabalhos de Michael Tswettfocalizaram-se nas identificações das clorofilase, mais tarde, dos carotenóides. Ele considerou acromatografia uma técnica que lhe permitiu fazer as identificações com maior confiabilidade, umaconclusão que não foi aceita por um númerosignificativo dos pesquisadores da área declorofilas e carotenóides enquanto ele estavavivo. Por outro lado, ele recebeu indicação para o Prêmio Nobel de 1918 por seus trabalhos com asclorofilas, não pela “invenção” da técnicacromatográfica, sendo um dos nove candidatos.Porém o Prêmio Nobel em Química de 1918 foidado ao Prof. Fritz Haber do InstitutoKaiser-Wilhelm em Berlim-Dahlem, devido aodesenvolvimento da síntese de amônia, umaimportante etapa na produção de fertilizantes, e o falecimento de Tswett em 1919 impediu que elepudesse ser considerado em outra oportunidade.

Desse relato, hoje é possível indicar que onascimento da palavra cromatografia ocorreuem 1906 e o “pai” é o russo Michael SemenovichTswett. Além disso, os vários trabalhos de Tswettdescrevendo a aplicação da técnica dacromatografia líquido-sólido certamenteinfluenciaram outros pesquisadores a testaremesse método de separação nas décadas a seguir.Entretanto, somente alguns poucos pesquisadoresadotaram a cromatografia líquido-sólido durante a sua primeira década, talvez devido àscontrovérsias que o próprio Tswett se envolveu.Em outras palavras, a sua influência em introduzir essa técnica no arsenal dos cientistas do mundo éhoje reconhecida, mesmo não tendo ocorrido essereconhecimento durante a sua vida.

Por outro lado, a data das primeirasseparações empregando um dos processos quehoje compõem as técnicas chamadas“cromatografia”, nas quais se aplica umaamostra com seus diversos componentesdissolvidos em uma fase móvel e percolá-aatravés de uma fase estacionária, ocorrendo aseparação devido à migração diferencial,encontra-se realmente perdida na Antiguidade.

Referências Bibliográficas*

1. Runge, F.R., Zur Farben-Chemie. Musterbildung für

Freeunde des Schönen und zum Gebrauch für Zeichner,

Maler, Verzierer und Zeugdrucker. Dargestellt durch

chemische Wechselworkung. Berlim: Smittler & Sohn,

1855.

2. Schönbein, C.F., Verb. Naturforsch. Ges. Basel, 1861, 3, 249.

3. Goppelscröder, F., Verb. Naturforsch. Ges. Basel,

1861, 3, 268.

4. Beyerlink, M.W., Z. physik. Chem., 1889, 3, 110.

5. Thompson, H.S., J. Roy. Agric. Soc. Engl. 1850, 11, 68.

6. Way, J.T., J. Roy. Agric. Soc. Engl. 1850, 11, 313.

7. Reed, L., Proc. Chem. Soc, 1893, 9, 123.

8. Day, D.T., Proc. Am. Phil. Soc,1897, 36, 112.

9. Engler, C., Albrecht, E., Z. angew. Chem. 1901, 14, 889.

10. Tswett, M.S., Tr. Protok. Varshav. Obshch. Estertvoispyt.

Otd. Biol. 1903, 14, 20 (data de publicação: 1905).

2009 | v . 1 | n . 1 19


* Nota da autora: A maioria das informações sobre a vida e a obra do Prof. Dr. Michael S. Tswett baseou-se em uma série de artigos publicadospelo Prof. K. Sakodynskii (na época do Karpov Institute of Physical Chemistry, Moscou) na revista Journal of Chromatography [1970, 49,2-17; 1972,, 73, 305-360; 1981, 220, 1-28], completado por informações que constam do livro do Prof. Dr. Leslie S. Ettre [“Chapters in theEvolution of Chromatography”, J.V. Hinshaw, Ed. Imperial College Press, London. 2008].

11. Ettre, L.S., LC-GC, 2003, 21, 458.

12. Tswett, M. Bot. Z. 1905, 64, 273.

13. Molisch, H., Bot. Z. 1905, 64, 131.

14. Molisch, H., Bot. Z. 1905, 64, 369.

15. Kohl, F.G., Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1906, 24, 124.

16. Tswett, M. Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1906, 24, 316.

17. Tswett, M., Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1906, 24, 384.

18. Kränzlin, G. Anatomische und Farbostoffanalytische

Untersuchungen an panaschierten Pflanzen, Tese

(doutorado), Universidade Friedrich-Wilhelms, Berlim,

1908.

19. Tswett, M., Ber. Deutsch. Bot. Ges., 1907, 25, 137.

20. Kränzlin, G., Z. Pflanzenkrankheiten, 1908, 193.

21. M. Tswett, Biochem. Z., 1908, 44, 414.

22. M.Tswett, Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1910, 43, 3139.

23. M. Tswett, Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1911, 45, 1124.

24. R.Willstätter, A. Stoll, Untersüchungen über Chlorophyll:

Methoden und Ergebnisse, Berlin: Springer-Verlag, 1913.

25. C. Dhéré, W de Rogowski, C.R. Acad. Sci. Paris, 1912,

155, 653.

26. W. de Rogowski, Recherches sur lês Spectres

d’Adsorption Ultra-Violets et sur lês Spectres d’Emission

par Fluorescence dês Pigment Chlorophyliens. Tese

(doutorado), Universidade de Fribourgo, 1914 (a data na

capa de tese é 1914; a data de submissão é 1912 e o CV do

Rogowski indica um doutorado em 1912).

27. C. Dhéré, G. Vegezzi, C.R. Acad. Sci. Paris, 1916, 163, 18.




31. C. Dhéré, G. Vegezzi, J. Physiol. Pathol. Gèn, 1917, 44.

32. C. Dhéré, G. Vegezzi, J. Physiol. Pathol. Gèn, 1917, 55.

33. G. Vegezzi, Recherches sur Quelques Pigmentos des

Invertébrés: Héliocorubine, Hépatochlororophylle,

Tétronérythine. Tese (doutorado), Universidade de

Fribourgo, 1916.

34. C. Dhéré, Condellea (Genève), 1943, 10, 23-73.

35. L.S. Palmer, A Study of the Natural Pigment of the Fat

of Cow’s Milk. Tese (doutorado), Universidade de

Missouri, Columbia, MO, 1913.

36. L.S. Palmer, Carotenoids and Related Pigments. The

Chromolipids, New York: Chemical Catalog Co., 1922.



2009 | v . 1 | n . 1 21


Extração sortiva em barra de agitação (SBSE):Fundamentos teóricos e fases seletivas

Maria Eugênia C. Queiroz

Universidade de São PauloFaculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto14040-901 – Ribeirão Preto (SP)[email protected]

ResumoA extração sortiva em barra de agitação (SBSE) integra a extração e concentração do soluto em etapa única e

em um dispositivo extrator reutilizável, o qual pode ser introduzido no cromatógrafo a gás, reduzindo a perda do

soluto e o tempo da análise. A eficiência da SBSE está relacionada ao coeficiente de partição do soluto entre as fases

presentes no sistema analítico, ao caráter hidrofóbico do soluto (logaritmo do coeficiente de partição octanol-água), ao

volume da amostra e às dimensões da barra. O polímero PDMS (apolar) é a única fase SBSE disponível no comércio.

Neste artigo são descritos os fundamentos teóricos, o processo SBSE, a dessorção térmica e em fase líquida, assim

como o desenvolvimento e aplicações das novas barras SBSE lab-made, com fases extratoras mais seletivas para

compostos polares (fases de PDMS/β-ciclodextrina, poliuretana, PDMS/material adsorvente), com absorvente de

acesso restrito que permitiu a extração dos solutos (C18, octadecilsilano) e

exclusão das macromoléculas (superfície hidrofílica biocompatível, diol)

e fases mistas (PDMS/material adsorvente e PDMS/polipirrol) que

apresentaram extrações baseadas nos processos de adsorção e absorção,

favorecendo a sensibilidade analítica do método.

AbstractStir Bar Sorptive Extraction (SBSE) is a sample preparation technique that integrates the sample extraction

and solute concentration in one step, employing a re-utilizable probe. After all, the stir bar containing the

concentrated solute(s) is introduced in a chromatograph, decreasing solute losses and analysis time. The SBSE

efficiency is related to the partition coefficient of the solute between the phases, the hydrophobic character of the

solute (logarithm of the octanol-water partition coefficient), the sample volume, and the stir bar dimensions. PDMS

(non-polar) is the only SBSE phase available in the market. In this

article, we describe the fundamental theory, the SBSE process, thermal

desorption, liquid desorption, as well as the development and

application of new lab-made SBSE bars. These bars are coated with

phases that are more selective for polar compounds (such as PDMS/

Palavras-chave

Extração sortiva em barra de agitação,

SBSE processo, dessorção térmica,

dessorção líquida, fases seletivas.

Keywords

Stir bar sorptive extraction, SBSE

process, thermal desorption, liquid

desorption, selective phases.

1. IntroduçãoEm razão da complexidade da maioria das

amostras, estas não podem ser introduzidas emsistemas cromatográficos no estado bruto, poisapresentam interferentes que podem coeluir comos solutos, durante a separação cromatográfica, ou adsorverem de forma irreversível junto à colunaanalítica, modificando a retenção dos solutos ediminuindo o tempo de vida da coluna analítica.

O preparo da amostra tem sido uma etapaimportante, requerida no desenvolvimento demétodos cromatográficos, para aumentar aseletividade e sensibilidade analítica do métodocromatográfico, através da remoção dosinterferentes da amostra e concentração dos solutos,quase sempre presentes em níveis de traços.

A química analítica moderna tem sidodirecionada para a simplificação através dahifenação de técnicas, miniaturização dossistemas analíticos, minimização do consumo desolvente orgânico e do volume da amostra. Neste contexto, podemos destacar as técnicas demicroextração, as quais não utilizam solventeorgânico. Essas técnicas integram a extração econcentração do soluto em única etapa epermitem a introdução do soluto extraído nosistema cromatográfico, utilizando o mesmodispositivo empregado na extração, reduzindo aperda do soluto e o tempo da análise.

A microextração é definida como técnicade preparo de amostra, em que o volume da faseextratora é bem menor quando comparado aovolume da amostra, apenas uma pequena fraçãodo soluto presente na amostra é extraída. Aextração é baseada no processo de partição(solubilidade) do soluto entre a fase aquosa(amostra) e a fase extratora. A extração não é umprocesso exaustivo, ou seja, quando o equilíbriode partição do soluto entre as fases é atingido, oaumento no tempo de extração não resulta noaumento da massa de soluto extraída. Quanto

maior o coeficiente de partição do soluto,semelhança entre as propriedades físico-químicasdo soluto com a fase extratora, maior será aquantidade de soluto extraído1.

2. SBSE: Fundamentos Teóricos2-4

A extração sortiva em barra de agitação(SBSE), introduzida em 1999 por Baltussen etal.2, baseia-se no equilíbrio de partição do solutonas distintas fases presentes no sistema analítico.No processo SBSE é utilizada uma barra deagitação magnética (pequeno tubo magnéticoencapsulado com vidro, 10 a 20 mm de

comprimento) revestida com 25-125 µL (0,3-1,0mm espessura) de polidimetilsiloxano (PDMS),Figura 1. Para evitar a decomposição da fasepolimérica em contato direto com o tubo metálico, este é encapsulado com vidro. As extremidades da barra não são revestidas com o polímero.

O PDMS foi selecionado como faseextratora para SBSE, em razão de característicasespecíficas, tais como boa estabilidade térmica, os fragmentos de massas da degradação do polímerosão característicos do silicone, os quais podem serfacilmente discernidos com o uso de detector demassas, o mecanismo de extração dos solutos ébaseado na absorção (processo de partição), ouseja, os solutos são solubilizados na fasepolimérica. A força de retenção, no processo deabsorção, é mais fraca, quando comparada àobservada no processo de adsorção, o que permiterápida dessorção térmica dos solutos emtemperaturas medianas, minimizando a perda de



Figura 1. Barra SBSE. 1: tubo magnético, 2: revestimentode vidro, 3: fase PDMS.

β-cyclodextrine, poliurethane, PDMS/adsorvent material); restrict access medium (RAM) material containing both

octadecilsiloxane (C-18) and macromolecules showing exclusion behavior (hydrophilic biocompatible surface,

diol); and mixed phases (PDMS/adsorbent and PDMS/polypyrrole) where the extraction is based on adsorption and

absorption process, favoring the sensibility and selectivity enhancement of the analytical method.

solutos termolábeis. O equilíbrio de partição oucapacidade de retenção de um determinado solutoem PDMS não é influenciado pela presença deoutros solutos, ou interferentes da matriz. Ossolutos apresentam diferentes equilíbrios departição (constante de partição) com a fasePDMS, não ocorrem competição oudeslocamento dos solutos (que apresentam menorconstante de partição) da fase extratora, o queresulta em métodos analíticos com ampla faixa delinearidade. Nas fases absorventes, a degradaçãode solutos instáveis é menor ou ausente.

A SBSE é controlada pelo coeficiente departição dos solutos entre as fases, PDMS e aquosa. O coeficiente de partição tem sido correlacionadocom o coeficiente de distribuição octanol/água(Ko/w). Embora não totalmente correto, o Ko/w temsido utilizado para estimar a eficiência do processoSBSE para um determinado soluto.

O coeficiente de partição do soluto entreas fases PDMS e amostra aquosa (KPDMS/w) édeterminado através da razão entre aconcentração do soluto na fase de PDMS(CPDMS) e a concentração do soluto na amostraaquosa (Cw), após atingir o equilíbrio departição. Essa razão corresponde ao produto doquociente entre as massas do soluto na fasePDMS (mPDMS) e na fase aquosa (mw) e β, onde βé igual à razão entre o volume da amostra evolume da fase extratora (β = Vw/ VPDMS). Essascorrelações são ilustradas na equação 1.

K KC

C

m

m

V

V

m

m

o w PDMS w

PDMS

w

PDMS

w

w

PDMS

PDMS

w

/ /≈ = =

= ⋅ = ⋅β

(eq.1)

A taxa de recuperação do processo SBSE é expressa através da razão entre a quantidade desoluto extraído (mPDMS) pela fase PDMS e aquantidade de soluto inicial na amostra (mo =mPDMS + mw) que corresponde às correlaçõesentre KPDMS/w e β, como ilustra a equação 2.

m

m

K

KPDMS

w

PDMS w

PDMS w

=+

/

/

β

β1

(eq.2)

Segundo a equação 2, as taxas derecuperação do soluto nas extrações (SBSE) estãorelacionadas diretamente aos valores de KPDMS/w e β, ou seja, quanto maior o volume de PDMS(menor o valor β), maior será a quantidade desoluto extraído. Uma vez que o valor de KPDMS/w é

similar ao valor de Ko/w (Equação 1), K

PDMS w/

β

pode ser representado por K

o w/

β.

Segundo Baltussen et al.2, para processo

SBSE que apresenta K

o w/

β = 1, a recuperação do

soluto será de 50%, e em valores de K

o w/

βsuperiores a 5, a extração é consideradaquantitativa. O valor de β, ou seja, a razão entre osvolumes da amostra e da fase PDMS, deverá serotimizado para cada aplicação, na qual o tempo daextração também deverá ser considerado. Oaumento do volume da amostra e de PDMSresultará em maior tempo de extração para atingir o equilíbrio de partição. David e Sandra3 descrevemque para solutos apolares (log Ko/w > 3), o aumentoda quantidade de soluto extraído é proporcional aoaumento do volume da amostra.

3. Processo SBSE2-7

A barra SBSE requer condicionamentoanterior às extrações: 300°C por 4 horas para asdeterminações por dessorção térmica ecromatografia gasosa (TD-GC), ou em solventeorgânico em determinações por dessorçãolíquida e cromatografia líquida (LD-LC).

Para extrações SBSE, a barra de agitaçãomagnética revestida com PDMS tem sidoinserida diretamente na amostra (DI) ou noheadspace do frasco e agitada até atingir oequilíbrio de partição dos solutos entre a amostrae fase PDMS. Nas extrações DI, o frasco extrator(com tampa rosca) tem sido colocado sobre oagitador magnético e a amostra agitada cerca de30 a 240 minutos, dependendo do volume deamostra. Após o processo de extração, a barra dePDMS é retirada do frasco, com o auxilio de uma pinça ou de uma haste metálica, enxaguada

2009 | v . 1 | n . 1 23


levemente com água pura e cuidadosamente secacom um lenço de papel macio, para remoção depossíveis moléculas de água, açúcares, proteínasou outros componentes da amostra não voláteis.Para extrações no headspace de compostosvoláteis de amostras sólidas ou líquidas, a barraSBSE tem sido colocada no headspace do frascocom auxílio de um suporte especial.

As barras SBSE, dependendo dacomplexidade da amostra e cuidados do analista,têm sido reutilizadas de 20 a 100 vezes.

Os solutos voláteis e semi-voláteis têmsido termicamente dessorvidos no injetor de umcromatógrafo a gás, resultando em uma técnicasimples e de alta sensibilidade analítica. Para adessorção térmica, a barra SBSE é transferidapara um tubo capilar de vidro (4 mm d.i. e 187mm comprimento) Figura 2, o qual é inserido nosistema de dessorção térmica SBSE, ou injetorespecial do cromatógrafo gasoso.

O sistema de dessorção térmica consiste dedois injetores (vaporizadores) (TSD-2) em sériecom temperatura programada (PTV), no primeiroinjetor, os solutos da barra SBSE são termicamentedessorvidos (exemplo: 40°C – 50°C/min – 250°C), já no segundo injetor (CIS-4, PTV) ocorre areconcentração criogênica dos solutos dessorvidostermicamente. Durante a rápida dessorção térmica(vazão superior 100 mL/min), o módulo CIS-4 émantido a temperaturas negativas (abaixo de-150°C) com nitrogênio líquido. Para análises desolutos muito voláteis, o liner do injetor CIS-4 temsido empacotado com material adsorvente(geralmente, Tenax TA), para eficientereconcentração dos solutos. Após completar oprograma de dessorção térmica, a temperatura do

CIS-4 é aumentada rapidamente a altos valores

(exemplo: 10°C/s até 250°C). Os solutos sãotransferidos do TSD-2 para CIS-4, geralmente nomodo de injeção splitless, para a coluna analítica,Figura 2.

Para as análises SBSE/LC de compostostermolábeis ou de alta massa molar, o processode dessorção SBSE tem sido realizado através dainserção da barra SBSE em um micro tubocontendo alguns µL de fase líquida, fase móvelou solvente orgânico, com agitação magnética ou em banho de ultra-som, com ou sem controle datemperatura. Poucas referências bibliográficasdescrevem a técnica SBSE/LC, empregando oprocesso de dessorção em fase líquida.

As reações de derivatização pré-extração, insitu, ou durante o processo de dessorção térmica,com a introdução do reagente derivatizante no tubo capilar de vidro tem ampliado as áreas deaplicações da técnica SBSE/TD-GC, para a análisede compostos polares. Para os processos dederivatização in situ, os ácidos e aminas têm sidoderivatizados com cloroformiato de etila e osgrupos hidroxil (fenóis) acilados com anidridoacético 3. O reagente de sililação, N, O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida, em razão de suaalta volatilidade, tem sido utilizado nos processosde derivatização no tubo capilar durante adessorção térmica. Para aumentar a estabilidade dareação, lã de quartz tem sido adicionada ao tubo dedessorção térmica4, Figura 3.

Segundo normas internacionais devalidação analítica, os métodos cromatográficosSBSE/TD-GC e SBSE/LD-LC descritos naliteratura para determinações de solutos (apolares,polares, voláteis ou não voláteis) em amostras, nasua maioria complexas, apresentaram sensibilidade analítica adequada para aplicações em diferentesáreas: ambiental, farmacêutica, forense, alimentose clínico2-7.



Figura 2. Sistema de dessorção térmica SBSE.

Figura 3. Esquema do processo de derivatização no capilar, durante a dessorção térmica.

4. Fases SeletivasO polímero PDMS (apolar) é a única fase

SBSE disponível no comércio. Recentemente,várias barras SBSE lab-made com fases extratoras seletivas, mais polares, biocompatíveis ou comfases mistas, em que são observados diferentesmecanismos de extração, têm sido desenvolvidas.

Lambert et al.8 revestiram uma barra devidro, contendo magneto, com a fase de acessorestrito, a qual possui uma superfície hidrofílicabiocompatível (diol) na parte externa ehidrofóbica (octadecilsilano) no interior dos poros da partícula do sorvente. As macromoléculas, taiscomo as proteínas do plasma, não penetraram nosporos (barreira física) e foram excluídasrapidamente, enquanto as moléculas pequenasentraram nos poros e foram retidas, através doprocesso de partição. A dessorção dos solutos foirealizada com agitação da barra SBSE em solução acetonitrila/água (3:1, v/v).

A barra absorvente biocompatível(C18-diol) permitiu realizar mais de 50 extraçõesdiretas de cafeína e metabólitos em amostras deplasma, sem perda significativa na eficiência daextração8. O método SBSE/LD-LC apresentoulimite de detecção de 25 ng/mL para adeterminação de cafeína em amostras deplasma de rato8. Os cromatogramasSBSE (C18-diol)/LC, quandocomparados com os obtidos após análises PPT/LC (precipitação de proteínas comacetonitrila), apresentaram picos iniciaisdos compostos endógenos do plasmacom menor sinal analítico.

A barra sortiva de PDMShidroxilado entrecruzado em cadeiasol-gel foi utilizada para análises SBSE/TD-GC de n-alcanos, hidrocarbonetosaromáticos policíclicos e pesticidasorganofosforados em amostras aquosas.A barra desenvolvida apresentou boaestabilidade térmica e adequação para asanálises SBSE-GC de compostos polarese apolares, com limites de detecção emníveis de ng/mL9.

O processo sol-gel iniciou-se coma hidrólise do sol-gel precursor, seguido

pela policondensação do produto hidrolizado.Durante esta etapa, o PDMS hidroxilado(PDMS-OH) foi parcialmente ligado à cadeia, em

razão da alta massa molecular (≥ 40.000). A maiorparte de PDMS-OH foi fisicamente incorporado eemaranhado na cadeia polimérica sol-gel. Opolímero sol-gel foi ligado aos grupos silanóis nasuperfície da barra de vidro, Figura 4A. Asuperfície da cadeia polimérica foi desativada compoli(metilhidrosiloxane), (PMHS), paracapeamento dos grupos silanóis residuais, Figura4B9.

A técnica sol-gel foi utilizada para preparar

a fase de polidimetilsiloxano/β-ciclodextrina

(PDMS/β-CD) para análises SBSE/LC. A barra

SBSE revestida com PDMS/β-CD apresentousuperfície homogênea, boa estabilidade térmica,resistência mecânica na presença do solvente dedessorção e melhor seletividade para compostospolares, quando comparada com a barra PDMS. Os

métodos SBSE- PDMS/β-CD/LC padronizadosapresentaram limites de quantificação em níveis deµg/L (detector UV) nas determinações deestrogênios e ng/L nas determinações de bisfenóis(detector de fluorescência)10.

2009 | v . 1 | n . 1 25


Figura 4. Processo sol-gel. A: O polímero sol-gel foi ligado aos grupossilanóis na superfície da barra de vidro. B: superfície da cadeia poliméricafoi desativada com poli(metilhidrosiloxane),(PMHS).

A fase extratora de PDMS/poli(vinil álcool)foi desenvolvida (processo sol-gel) para análisesSBSE com dessorção líquida e injeção de grandevolume de amostra no GC com detectorfotométrico de chama, para a determinação decinco pesticidas organofosforados em amostras demel. O método desenvolvido apresentou limites de

quantificação de 0,013 a 0,081 µg/mL e precisãocom coeficientes de variação de 5,3 a 14,2%11.

Bicchi et al.12,13 desenvolveram barrasSBSE com fases mistas, as quais consistem depequenos tubos de PDMS com as extremidadesfechadas com magnetos e interiores empacotadoscom diferentes materiais (ad)sorventes: Tenax GC,copolímero de bisfenol-PDMS, carbopack

revestido com 5% de carbowax e β-ciclodextrina12. Em geral, nas extrações sortivas no headspace, asbarras SBSE mistas, quando comparadas àconvencional de PDMS, apresentaram maiorestaxas de recuperação para compostos voláteis emais polares, em matrizes sólidas ou líquidas (cafétorrado, folhas secas de sálvia e amostra aquosateste contendo compostos com diferentessolubilidades em água, acidez, polaridades). Asextrações sortivas no headspace foram baseadas na capacidade de adsorção dos analitos no materialadsorvente e na difusão destes através do PDMS13.

Nogueira et al.14 avaliaram a poliuretanapura ou como fase mista com adição de materialadsorvente como fase extratora para SBSE, comdessorção líquida para análise por LC com odetector de arranjo de diodos ou injeção de grande volume por GC-MS na determinação de atrazine,2,3,4,5-tetraclorofenol e fluorene em amostrasaquosas em níveis de traços. A poliuretana comadição de material adsorvente não apresentouvantagens quando comparada com o polímeropuro. Os autores destacaram a poliuretana comopromissora fase para SBSE para a determinaçãode compostos mais polares em níveis de traços em amostras aquosas, outras vantagens são tambémdescritas, tais como alta estabilidade térmica, altaresistência mecânica na presença de solventesorgânicos, polímero barato e fácil síntese.

As poliuretanas geralmente são obtidasatravés da reação de poliol, poliéster ou poliéter,com isocianato aromático ou alifático,bifuncional ou polifuncional, na presença de

catalisador e surfactante. A natureza química dapoliuretana, assim como sua funcionalidade,números de grupos ativos por molécula dosreagentes, podem ser estabelecidos de acordocom a aplicação, Figura 5.

A fase polimérica de poliuretana foitambém utilizada nas análises SBSE/LC comdessorção líquida e detecção no detector dearranjo de diodos para determinação de fármacos ácidos e reguladores de lipídios em amostrasaquosas ambientais. O método padronizadoapresentou limites de quantificação de 1,5 a 5,8

µg/L e precisão com coeficientes de variaçãomenores que 15%15.

As barras SBSE revestidas com fasemonolítica foram utilizadas em análisesSBSE/LC de amostras de água do marenriquecidas com hidrocarbonetos aromáticospolicíclicos (PAHs) e amostras de urinaenriquecidas com anabolizantes esteróides. Ométodo padronizado com a fase monolíticaapresentou limites de detecção de 1,8 a 6,6pg/mL para os PAHs, e 62 a 212 pg/mL paraanabolizantes, demonstrando que a fasemonolítica é adequada para análises SBSE/LCde compostos polares e apolares 16, 17.

O material monolítico foi obtido atravésda copolimerização in situ de metacrilato deoctilo e dimetacrilato de etileno na presença desolventes porogênicos (1-propanolol, 1, 4butanodiol e água). A influência dos parâmetrosda polimerização (diferentes concentrações dosmonômeros e de pirogênio) e da espessura domaterial (1,0 -2,0 mm), na eficiência dosprocessos de adsorção e dessorção líquida, foiavaliada16,17.

O material monolítico poli (vinilpiridina-etileno dimetacrilato) foi sintetizado eutilizado como fase extratora nas análisesSBSE/LC para determinação de fenóis emamostras de água com limites de quantificação

de 3,2 a 8,5 µg/L18.



Figura 5. Síntese da poliuretana.

O polipirrol em razão da permeabilidade(estrutura porosa) e das interaçõesintermoleculares do polímero com os solutos foiavaliado como fase para SBSE. A fase poliméricamista de PDMS e polipirrol (PPY) foidesenvolvida para análises SBSE/LD-LC-UV deantidepressivos em amostras de plasma. Arobustez da barra PDMS/PPY foi confirmada,após a reutilização desta em mais de 40 extrações,

com perda mínima da eficiência. O métodopadronizado apresentou limites de quantificaçãode 20 ng mL-1 a 50 ng mL-1, adequados paraanálise de antidepressivos em amostras de plasmade pacientes idosos no intervalo terapêutico. Asextrações foram baseadas nos processos deadsorção (PPY) e absorção (PDMS)19.

A Tabela 1 sumariza as aplicações datécnica SBSE com barras lab-made.

2009 | v . 1 | n . 1 27


Tabela 1. Aplicações da técnica SBSE com barras lab-made.

Solutos Amostras Condições SBSE Sistema analítico Referências

n-alcanos, PHAs,pesticidas

organofosforados

Aquosas Fase: PDMS hidroxilado -30 µm15 min

TD/GC-MSLOD: 0,7 - 7,4 ng/mL

Guan et al.2004 9

Compostosvoláteis e polares

Café torrado, sálvia,whisky

Fase: PDMS/material adsorventeCafé (50 mg) e sálvia (5 mg)

HD, 1 h, 50°CWhisky (1mL + 9 mL água)

DI, 1 h, 1000 rpm

TD/GC-MS Bicchi et al.2005 12,13

Cafeína e metabólitos Plasma de ratoFase: C18 – ADS

Adição 10% metanol, 30 min, 1000 rpmDessorção acetonitrila/água

20 min, 1000 rpm

LC-DADLOD: 25 ng/mL cafeína

Lambert et al.2005 8

PHAS e esteróidesanabolizantes

PHAS – água de marAnabolizan-tes - urina

Fase: Poli(ácido metacrilato de esteariléster-etileno dimetilacrilato)

2 h, 600 rpmDessorção: 10 mL metanol, 2h

LC-DAD

LOD: 1,8 - 6,6 pg/mL

Huang e Yuan

et al 200716

Estrógenos e bisfenol Água de rio e lago

Fase: PDMS-β-ciclodextrinaEstrógenos

NaCl, 45°C, 40 min, 1000 rpmBisfenóis: 40 min

Dessorção

100 µL de metanol

LC-UV

LOD: 0,04 - 0,11 µg/L(estrógenos)

(LC-fluorescência) LOD: 8 ng/mL Bisfenol

Li et al. 2007 10

Fármacos Ácidos eFármacos reguladores

de lipídiosAmbientais (aquosas)

Fase: Poliuretana60 min, 750 rpm, pH 2,0

DessorçãoACN, 15 min

LC-DAD

LOQ: 1,5 - 5,8 µg/L

Nogueira et al.2008 15

AntidepressivosPlasma de pacientes

idosos

Fase: PPY/PDMS40 min, pH 9,0, 40°C

DessorçãoFase móvel, 15 min

LC-UVLOQ: 20 - 50 ng/mL

Queiroz et al.2008 19

Fenóis Água de mar e rioFase: poli (vinil piridina-etileno

dimetacrilato)2h, pH 8,0

Dessorção: 3 mL ACN, 2h

LC-DAD

(LOQ 3,2 - 8,5 µg/L)

Huang et al.2008 18

Hormônios sexuais Urina

Fase: Poli(ácido metacrilato de esteariléster-etileno dimetilacrilato)

1,5 h, pH 4,0, 600 rpmDessorção

5 mL metanol, 1,5 h

LC-DADLOQ: 0,2 - 1,2 ng/mL

Huang et al2008 17

Pesticidasorganofosforados

MelPDMS/poli(vinil alcohol)

25% NaCL, 600 rpm, 15 min

Dessorção: 50 µL ACN, 20 min

GC-FPDLOD: 0,013 - 0,081

µg/mL

Yu e Hu 2009 11

PHAs: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, DI: introdução direta da amostra, HD: headspace, LC-DAD: cromatografia líquida comdetector de arranjo de diodos, LC-UV: cromatografia líquida com detector ultravioleta, ACN: acetonitrila, GC-FPD: cromatografia gasosa comdetector fotométrico de chama, LOD: limite de detecção, LOQ: limite de quantificação, TD/GC-MS: dessorção térmica/cromatografia gasosacom detector de espectrometria de massas.

5. ConclusãoA SBSE, quando comparada aos métodos

convencionais de extração, apresenta uma sériede vantagens, tais como, não utiliza solventeorgânico, integra a extração e concentração dosoluto em etapa única e em um dispositivoextrator reutilizável e permite a introdução destedispositivo no sistema analítico (SBSE/TD-GC). Embora seja um processo não exaustivo, como amicroextração em fase sólida (SPME), permiteanálises quantitativas ou seja, extrações comtaxas de recuperação acima de 80%, paraprocessos SBSE que apresentam Ko/w/βsuperiores a 5.

A eficiência da SBSE está relacionada aocoeficiente de partição do soluto entre as fasespresentes no sistema analítico, ao caráterhidrofóbico do soluto (logaritmo do coeficientede partição octanol-água), ao volume da amostra, às dimensões da barra. O polímero PDMS(apolar) é a única fase SBSE disponível nocomércio.

As reações de derivatização pré-extração,in situ, ou durante o processo de dessorçãotérmica, com a introdução do reagentederivatizante no tubo capilar de vidro têmampliado as áreas de aplicações da técnicaSBSE/TD-GC para a análise de compostospolares.

As várias barras lab-made desenvolvidas,quando comparadas à convencional de PDMS,apresentaram vantagens, tais como, maiorseletividade para compostos polares (fases de

PDMS/β-ciclodextrina, poliuretana, PDMS/material adsorvente), extração fracionada, a faseabsorvente biocompatível (C-18, ADS) permitiuextração dos solutos (octadecilsilano) e exclusãodas macromoléculas (superfície hidrofílicabiocompatível, diol), diferentes mecanismos deextração, as fases mistas PDMS/materialadsorvente e PPY/PDMS apresentaramextrações baseadas nos processos de adsorção eabsorção, favorecendo a sensibilidade analíticado método.

Referências Bibliográficas1. H. Lord, J. Pawliszyn. Microextraction of drugs. J.

Chromatogr. A 902 (2000) 17–63.

2. E. Baltussen, P. Sandra, Frank D., C. Cramers. Stir Bar

Sorptive Extraction(SBSE), a Novel Extraction

Technique for Aqueous Samples: Theory and

Principles. J. Microcol. Sep. 11 (1999) 737-747.

3. F. David, P. Sandra. Stir bar sorptive extraction for trace

analysis. J. Chromatogr. A, 1152 (2007) 54–69.

4. M. Kawaguchi, R. Ito, K. Saito, H. Nakazawa. Novel

stir bar sorptive extraction methods for environmental

and biomedical analysis. Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis 40 (2006) 500–508.

5. E. Baltussen, F. David, P. Sandra, H. G. Janssen, C. A.

Cramers. Sorption Tubes Packed with

Polydimethylsiloxane: A New and Promising Technique

for the Preconcentration of Volatiles and Semi-Volatiles

from Air and Gaseous Samples. J. High Resol.

Chromatogr 21 (1998) 332-340.

6. B. Tienpont, F. David, T. Benijts, Pat Sandra. Stir bar

sorptive extraction-thermal desorption-capillary GC/MS

for profiling and target component analysis of

pharmaceutical drugs in urine. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32 (2003)

569-579.

7. B. Tienpont · F. David · K. Desmet · P. Sandra Stir bar

sorptive extraction–thermal desorption–capillary

GC–MS applied to biological fluids. Anal Bioanal

Chem 373 (2002) 46–55.

8. J.P. Lambert, W.M. Mullet, E. Kwong, D. Lubda. Stir

bar sorptive extraction based on restricted access

material for the direct extraction of caffeine and

metabolites in biological fluids. J. Chromatogr. A, 1075

(2005) 43-49.

9. W. Liu, H. Wang, Y. Guan. Preparation of stir bars for

sorptive extraction using sol-gel technology. J.

Chromatogr A 1045 (2004) 15-22.

10. Y. Hu, Y. Zheng, F. Zhu, G. Li. Sol–gel coated

polydimethylsiloxane/β-cyclodextrin as novel stationary

phase for stir bar sorptive extraction and its application to

analysis of estrogens and bisphenol A. J Chromatogr A,

1148 (2007) 16–22.

11. C. Yu, B. Hu. Sol-gel polydimethylsiloxane/

poly(vinylalcohol)-coated stir bar sorptive extraction of

organophosphorus pesticides in honey and their

determination by large volume injection GC. J. Sep. Sci.

32 (2009) in press.

12. C. Bicchi, C. Cordero, E. Liberto, P. Rubiolo, B.

Sgorbini, F. David, P. Sandra. Dual-phase twisters: A



new approach to headspace sorptive extraction and stir

sorptive extraction. J. Chromatogr A 1094 (2005) 9-16.

13. C. Bicchi, C. Cordero, E. Liberto, B. Sgorbini, F. David,

P. Sandra, P. Rubiolo. Influence of polydimethylsiloxane

outer coating and packing material on analyte recovery

in dual-phase headspace sorptive extraction J.

Chromatogr. A, 1164 (2007) 33–39.

14. N.R. Neng, M.L. Pinto, J. Pires, P.M. Marcos and

J.M.F. Nogueira. Development, optimisation and

application of polyurethane foams as new polymeric

phases for stir bar sorptive extraction. J Chromatogr A

1171 (2007) 8-14.

15. A. R. M. Silva, F. C. M. Portugal, J.M.F. Nogueira.

Advances in stir bar sorptive extraction for the

determination of acidic pharmaceuticals in

environmental water matrices Comparison between

polyurethane and polydimethylsiloxane polymeric

phases J Chromatogr A 1209 (2008) 10-6.

16. X. Huang, D. Yuan. Preparation of stir bars for sorptive

extraction based on monolithic material. J. Chromatogr

A 1154 (2007) 152-157.

17. X. Huang, D. Yuan, B. Huang. Determination of steroid

sex hormones in urine matrix by stir bar sorptive

extraction based on monolithic material and liquid

chromatography with diode array detection. Talanta 75

(2008) 172–177.

18. X. Huang, N. Qiu, D. Yuan. Direct enrichment of

phenols in lake and sea water by stir bar sorptive

extraction based on poly (vinylpyridine-ethylene

dimethacrylate)monolithic material and liquid

chromatographic analysis. J Chromatogr A, 1194

(2008) 134–138.

19. L. P. Melo, A.M. Nogueira, F. M. Lanças, M. E. C.

Queiroz. Polydimethylsiloxane/polypyrrole stir bar

sorptive extraction and liquid chromatography

(SBSE/LC-UV) analysis of antidepressants in plasma

samples. Anal Chim Acta, 633 (2009) 57-64.

2009 | v . 1 | n . 1 29


2009 | v . 1 | n . 1 31


Cromatografia Gasosa Bidimensional

ResumoEste artigo apresenta uma visão geral da cromatografia gasosa bidimensional, ilustrando diferenças e

semelhanças entre a cromatografia gasosa bidimensional de frações parciais ou de “heartcut” (GC-GC) e a

cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC). Uma abordagem simplificada do histórico da

cromatografia gasosa bidimensional, seus fundamentos teóricos e questões relacionadas à instrumentação,

conjunto de colunas e detectores são apresentados. O uso da GC×GC tem se mostrado bastante conveniente para

matrizes complexas como as provenientes da área da petroquímica,

alimentos, aromas e fragrâncias, forense, ambiental etc. Quando

comparada à GC-GC, seu potencial traduz-se em menor tempo de

análise, maior capacidade de pico, maior sensibilidade e na obtenção de

cromatogramas estruturados, permitindo uma investigação mais

detalhada da complexidade das matrizes investigadas, especialmente

quando associada a detector de espectrometria de massas por

tempo-de-voo.

AbstractThis article presents an overview of two-dimensional gas chromatography, pointing to similarities and

differences between heartcut (GC-GC) and comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC×GC). A

simplified approach of the history of two-dimensional gas chromatography, its theoretical basis and issues related

to instrumentation, columns sets, modulators and detectors are presented. GC×GC has been regarded as a

convenient technique for complex matrices, such as petrochemicals,

food and beverage, flavour and fragrance, environmental samples,

forensic samples, etc. A comparison of both two-dimensional

techniques shows that GC×GC provides shorter analysis times, higher

peak capacity, sensitivity and chromatographic structure, allowing a

deeper investigation of the complexity of investigated matrices,

especially when associated with time-of-flight mass spectrometry.

Palavras-chave

Cromatografia gasosa bidimensional

abrangente, Cromatografia gasosa

bidimensional de frações parciais ou

de “heartcut”.

Cláudia Alcaraz Zini

Universidade Federal do Rio Grande do SulInstituto de QuímicaLAAO, Laboratório de Química Analítica Ambiental e Oleoquímica91501-970 – Porto Alegre (RS)[email protected]

Keywords

Comprehensive two-dimensional

gas chromatography, heartcut two-

dimensional gas chromatography

1. IntroduçãoA cromatografia gasosa (GC, “gas

chromatography”) é uma técnica que atingiu suamaturidade e oferece alta capacidade deseparação, tendo sua eficiência complementadapor detectores, hardware e software adequadospara sua aplicação em diferentes áreas. Nãoobstante, amostras como petróleo e derivados,aromas naturais, alimentos e amostrasambientais são, frequentemente, muitocomplexas para que se possa atingir a separaçãode seus componentes em uma só faseestacionária. Em amostras provenientes dematrizes como perfumes, óleos essenciais oubebidas alcoólicas o problema pode serexacerbado, nos casos em que o componente quecontribui para o aroma ou sabor encontra-se emquantidades traço. Nesses casos, a coeluiçãodesses traços com compostos que se encontramem grandes quantidades na amostra representaum problema real para detecção, identificação equantificação desses compostos de interesse. Oemprego de detectores específicos pode auxiliar,contudo, a obtenção de um espectro de massassem qualquer interferência para um determinadoanalito continua sendo um desafio.

A resolução (Rs) em cromatografia édescrita como:

RN k

ks =

−

+

4

1

1

αα

(eq.1)

Onde N é o número de pratos teóricos, α éo fator de separação de um dado par de solutosque descreve a seletividade da fase estacionária e k é o fator de retenção do soluto mais retido1.

Uma forma comum de se buscar umamelhor resolução é empregar uma colunacromatográfica mais longa, contudo, esteaumento no comprimento da coluna deve sersignificativo pois Rs depende da raiz quadrada de N. Esta estratégia tem como consequência umindesejável aumento do tempo de análise,podendo resultar também em alargamento depicos e, consequentemente, em limites dedetecção mais altos. Em uma coluna de 450 m,com mais de 1,3 milhões de pratos efetivos, foi

possível separar 970 componentes de umaamostra de gasolina em aproximadamente 11horas de análise. Apesar de toda a capacidadedessa coluna, ela ainda se mostrou insuficientepara separar todos os componentes dessaamostra2. Outra estratégia empregada é diminuiro diâmetro da coluna. A associação de pequenosdiâmetros de coluna com elevadas vazões de gásde arraste e rápido aquecimento do forno tornoupossível o emprego da cromatografia gasosarápida (“fast GC”)3 O uso da “fast GC”,geralmente, resulta em um cromatogramaequivalente em um tempo reduzido; nãoobstante, essa abordagem raramente ofereceganhos à separação cromatográfica4,5. Assim,uma maneira mais eficiente de melhorar aresolução é alterar o valor do fator de separação.Isso pode ser alcançado através de cromatografia gasosa multidimensional, usando-se fasesestacionárias distintas.

As técnicas de separaçãomultidimensional são definidas por duascondições: (1) os componentes da amostra sãosujeitos a dois ou mais processos de separação(mecanismos), que são independentes ou quaseindependentes um do outro e (2) os componentespermanecem separados até o final do processo6-8. Os primeiros experimentos que envolveramcromatografia multidimensional foramreportados por Consden e colaboradores e amaior parte do trabalho foi realizada no modoplanar, em que a amostra é eluída em duasdimensões, uma perpendicular a outra8. O focodeste trabalho, no entanto, restringe-se àcromatografia gasosa bidimensional. Nacromatografia gasosa bidimensional de fraçõesparciais ou de “heartcut” ou com “heartcutting”(GC-GC), apenas algumas partes do efluente daprimeira dimensão são introduzidas na segundadimensão. Por outro lado, a cromatografiagasosa bidimensional abrangente (GC×GC) éassim designada, pois todo o efluente da primeira dimensão, ou uma parte suficientementerepresentativa do mesmo, é introduzida nasegunda dimensão, mantendo-se ascaracterísticas da separação ocorrida na primeiradimensão9.



2. HistóricoA primeira tentativa de utilizar uma

separação bidimensional foi realizada porSimmons e Snyder em 195810. Este e outrostrabalhos mais antigos de GC-GC empregavamsistemas à base de válvulas para conectar as duascolunas e fracionar o efluente da primeira coluna, transferindo-o para a segunda. Alguns problemas estavam associados a esses sistemas, como porexemplo atividade catalítica de partes metálicasdas mesmas e alargamento de banda devido aovolume morto e à sorção de componentes nassuperfícies das válvulas.

Em 1968, Deans introduziu um novodispositivo para a transferência das frações,chamado inversor de Deans (“Deans switch”)que não utiliza válvulas, mas sim um balançopneumático de pressão11. A concepção dosistema proposto tornou claras as desvantagensdas conexões à válvula, mas também apresentoudesafios relativos à estabilização da pressão dogás de arraste no sistema. Posteriormente, váriosinstrumentos comerciais baseados no princípiode Deans foram introduzidos no mercado.Gordon e colaboradores publicaram uma revisãoem que abordaram vários desses sistemasutilizados para a análise de amostrascomplexas12. O funcionamento dos mesmos eraadequado para o fracionamento de amostrascomplexas, mas a sua operação se mostravaainda bastante complexa e manual, o que ostornou pouco práticos para serem incorporados àrotina dos laboratórios de cromatografia. Oproblema central consistia na dificuldade técnica de reproduzirem-se os tempos de retenção e,consequentemente, os cortes das fraçõesdesejadas. Atualmente, esses problemas podemser resolvidos através do uso de dispositivoseletrônicos que controlam fluxo e pressão13.Avanços significativos também ocorreram noque se refere à desativação do aço inoxidável dasválvulas empregadas em sistemas GC-GC, asquais tiveram seus volumes reduzidos.Entretanto, os dados e discussões apresentadospela literatura científica a respeito dos méritos edeméritos dos sistemas do tipo inversor de Deans ou daqueles que empregam válvulas são

inconclusivos e cada desafio analítico deve seravaliado dentro do seu próprio contexto para aescolha do sistema mais conveniente8.

Nas duas décadas anteriores aosurgimento da GC×GC, pouco progresso foiobservado na área da cromatografia gasosabidimensional no que diz respeito àinstrumentação e ao desenvolvimento detécnicas, quando comparado a outras áreas dacromatografia. Entre as muitas razões para isso,destaca-se o crescente uso de cromatografiagasosa com detector de espectrometria de massas (GC/MS, MS, “mass specrometry”), aliado asoftwares de gerenciamento que tornaram aoperação do GC/MS (especialmente os debancada) uma tarefa simples, mesmo paraanalistas pouco afeitos aos aspectos maisintrincados da cromatografia. Além disso, o usode um detector que pode ser empregado comodetector universal e seletivo auxilia imensamente em situações nas quais não se consegue obter aseparação cromatográfica dos analitos. Bertschdestaca três áreas principais de aplicação daGC-GC: petroquímica, a área ambiental e dealimentos, especialmente no que tange àquantificação de substâncias quirais8.

Em 1991, nasceu a cromatografia gasosabidimensional abrangente (GC×GC) através dacontribuição genial do professor John Phillips eseu grupo de pesquisa14. Apesar dos poucos anosde vida da técnica GC×GC, esta já temexperimentado várias fases de desenvolvimento.Em um momento inicial, houve certa resistênciaà aceitação da GC×GC, o que levou a um lentodesenvolvimento nos primeiros anos. Algunsfatores que contribuíram para isso podem sercitados, como a fragilidade das primeirasinterfaces, informações sobre os analitosfornecidas apenas pelo uso de detectores deionização em chama (FID, “flame ionizationdetector”), o grande número de dados geradospor esta técnica a cada análise e a dificuldade detratamento manual dos mesmos. Inicialmente, osprincípios, a teoria básica e a instrumentaçãonecessária para o emprego da técnica foramdiscutidos. Logo a seguir, a interface das duascolunas cromatográficas tornou-se o tópico maisimportante e algumas aplicações foram

2009 | v . 1 | n . 1 33


reportadas. Contudo, até o final da década de1990, o uso da técnica foi bastante restrito, masao final da mesma os moduladores em uso já semostravam mais robustos e confiáveis. A maiorparte dessas aplicações estava relacionada àpetroquímica e fez uso de detectores deionização em chama. Essas etapas dedesenvolvimento da técnica são reportadas emartigos de revisão8,15-21. Nos anos que seseguiram, o progresso experimentado pelaGC×GC pode ser visto em aplicações da mesmaa diversas áreas, além da petroquímica22-24, como análises de alimentos e matrizes ambientais. Issofoi amplamente demonstrado por Dallüge ecolaboradores em publicação que cobriu mais de100 artigos científicos até o ano de 200224. Aespectrometria de massas por tempo de voo(TOFMS, “time-of-flight mass spectrometry”)tem se tornado a opção preferencial de sistema de detecção, sendo as estratégias de identificação ede quantificação de analitos também um dosfocos da atenção dos pesquisadores nessaárea25,26. Três anos depois, mais 150 artigos quediscutiam a técnica e seu uso foram publicados eno ano passado outro trabalho de revisão sobre as aplicações da GC×GC menciona a publicação deaproximadamente 80 artigos entre 2007 e200819,27-30. Este rápido aumento no número depublicações mostra o sucesso da aplicação daGC×GC às mais variadas matrizes complexas.Entretanto, o uso generalizado da GC×GC aindanão é uma realidade entre os usuários decromatografia gasosa. Pode-se apontar algumasrazões para isso, entre elas o alto custo dosequipamentos, a complexidade dos métodosGC×GC quando comparados aos de 1D-GC, olento desenvolvimento de softwares queproporcionem uma interpretação mais fácil dosdados GC×GC e o grande volume de dadosgerados pela técnica para amostras complexas31.

3. FundamentosExistem várias teorias diferentes para uma

descrição exata do processo cromatográfico queenvolve a separação de componentes individuaisde misturas complexas. Dentre elas, destaca-se omodelo estatístico de sobreposição de

componente (SMO, “statistical model ofcomponent overlap”) de Giddings, o qual foiposteriormente estendido por vários estudosrealizados por Davis e seu grupo de pesquisa32.Outras abordagens podem ser citadas como a que está baseada na teoria da informação33 e a queemprega funções de entropia34. Contudo, aapresentação das mesmas em profundidadeencontra-se fora do escopo desta revisão, vistoque implicam grande complexidade detratamento matemático, tornando sua totalcompreensão e aplicação mais adequadas paratrabalhos relacionados especificamente à teoriada cromatografia. Neste texto nos restringiremosa uma interpretação simplificada dos fenômenoscromatográficos envolvidos na cromatografiabidimensional. Um ponto forte da SMO é que acompreensão de seus conceitos e das soluçõesdela derivadas é relativamente fácil, embora seutratamento matemático seja bastante complexo.Uma de suas falhas principais reside nadificuldade de interpretação de picos distorcidose distúrbios cromatográficos, incluindo ruído.Entretanto, diversas melhorias têm sido feitasnesta teoria, as quais foram testadas usando-sesimulação computacional e amostra reais35. ASMO explica as causas fundamentais dasobreposição de picos e sugere soluções paraesses fenômenos. Depreende-se da SMO que,para amostras complexas, é necessária umacapacidade de pico muito grande ou a amostradeve sofrer um pré-tratamento antes da análisecromatográfica para que seja possível reduzir onúmero de picos a serem separados. Entretanto,esses métodos de pré-tratamento são trabalhosose tediosos, especialmente quando todos oscomponentes da amostra são de interesse.Anteriormente, já demonstramos que o aumentodo comprimento da coluna não é a melhorestratégia para melhorar a capacidade de pico dosistema, contudo, reduzir o diâmetro interno damesma pode resultar em melhor resolução. Umefeito adverso desse procedimento é um aumento de pressão no sistema, o qual pode limitar ocomprimento da coluna a ser usada36. Umexemplo ilustrativo é o do emprego de umacoluna de 60 m e 0,15 mm de diâmetro internopara a separação de uma mistura complexa de



bifenilas cloradas, o qual não resultou naseparação total dos 209 congêneros37. Em umasituação como esta, a utilização da cromatografia gasosa multidimensional pode ser umasolução19. A literatura científica apresenta váriasopções para utilização de GC-GC e algumasdestas estão indicadas na Figura 1. As diversasaplicações e o potencial desta técnica tambémestão reportados na literatura científica8,38.

A Figura 1A apresenta a GC-GCconvencional, na qual frações discretas doefluente são desviadas para a coluna secundária.Nesse arranjo, diferentes cortes do efluentepodem se misturar na segunda coluna,impedindo uma correlação clara dos

componentes separados na primeira e segundadimensões. Uma maneira de contornar esseproblema é a utilização de armadilhascriogênicas, que atuam como pontos dearmazenagem de cortes de efluente da primeiradimensão (Figura 1B). A liberação das bandascromatográficas de cada armadilha criogênica éfeita de modo que os cromatogramas gerados nasegunda coluna possam ser diretamenterelacionados a um corte específico de efluente da primeira dimensão. Para a identificaçãocompleta dos componentes de uma amostracomplexa pode ser necessário o emprego de umacoluna secundária dedicada para cada fração(Figura 1C). Colunas acopladas em série também

2009 | v . 1 | n . 1 35


Figura 1. Representação simplificada de alguns arranjos básicos em 2D-GC. (A)GC-GC convencional; (B) GC-GC com três armadilhas criogênicas; (C) GC-GC comtrês colunas em paralelo e seus respectivos detectores; (D) GC×GC. (adaptado deBertsch8). I: injetor; C: coluna; D: detector; M: modulador.

podem ser empregadas, contudo este tipo deacoplamento não propicia uma separaçãobidimensional, pois se assemelha ao emprego deuma coluna do mesmo comprimento, cuja faseestacionária seria um misto das fases das duascolunas empregadas8. Neste caso, o que seobserva é que os analitos separados na primeiracoluna podem recombinar-se na segunda; oupode ocorrer uma inversão na ordem de eluiçãodos mesmos. Isso destruiria a separaçãoalcançada na primeira dimensão, violando umadas condições para uma análise bidimensional. A principal limitação da GC-GC é que ela permiteque, no máximo, algumas pequenas fraçõeseluídas da primeira dimensão sejam transferidaspara a segunda coluna. Este tipo de abordagem éconveniente quando se pretende analisar um (oualguns) composto(s) alvo. Por outro lado,quando é necessária a análise de uma amostracomo um todo, a GC-GC se torna muitodemorada e complicada. Gordon e colaboradores demonstraram que foi possível analisar 23 cortesdo efluente da primeira dimensão de óleoessencial de tabaco em um total de 48 h de uso do equipamento. Não obstante, não foi possívelmanter a separação obtida na primeira dimensão,visto que o tamanho dos cortes de efluente foirelativamente grande39. Tal fato está de acordocom o modelo estatístico de sobreposição decomponente, que prevê que o aumento da regiãode corte (“heartcut”) do efluente da primeiradimensão pode resultar em perda da separaçãoobtida na primeira coluna. Uma aplicação dessemodelo a aromas e fragrâncias mostrou que aseparação raramente se completa na segundadimensão nos casos em que cortes da primeiradimensão, que contenham 10 ou mais picos, sãotransferidos para a segunda coluna40.

Uma abordagem mais rápida e eficiente para a total caracterização de amostras complexas é acromatografia gasosa bidimensional abrangente(GC×GC). Nesta, as frações do efluente daprimeira coluna são focadas pelo modulador etransferidas para a coluna secundária, que é umacoluna curta que proporciona rápida eluição(Figura 1D)30. Uma descrição mais detalhada destatécnica encontra-se no item 4.

Quando se trata de separação de misturascomplexas, a atenção deve ser focadapreferencialmente no número total de zonas depicos separáveis ao invés de focá-la na resoluçãode pares de picos. Neste caso, emprega-se umparâmetro distinto, que é a capacidade de pico,nc. O conceito de capacidade de pico foiintroduzido por Giddings em 1967 e implica onúmero máximo de compostos que podem sercolocados lado a lado em um espaço deseparação (cromatograma) com uma dadaresolução em um determinado intervalo detempo41,42.

nL

Rc

s

=ω

(eq.2)

Onde L é o comprimento da coluna

cromatográfica, ω é a largura do pico na sua basee Rs é a resolução.

A capacidade de pico teórica de umsistema equivale à soma das capacidades de picoindividuais de cada coluna. Caso sejamefetuados vários cortes do efluente, acontribuição de cada análise na colunasecundária deve ser considerada. Assim, acapacidade de pico total, ntot, de um sistemaGC-GC é dada por:

n n m nc c ctot i≅ = ×∑ (eq.3)

Onde ni representa a capacidade de pico de cada coluna individual ou estágios de separação;m é o número de colunas empregado e n é acapacidade de pico média das colunas.

Para um sistema GC×GC, a capacidade depico é aproximadamente o produto dascapacidades de pico das colunas individuais:

n n nc c D c Dtot≅ ×1 1 (eq.4)

A Figura 2 traz uma representação dascapacidades teóricas de pico para uma únicacoluna (Figura 2A), para um sistemabidimensional de “heartcut” com duas colunasna segunda dimensão (Figura 2B) e para umsistema bidimensional abrangente7. A ilustraçãoda Figura 2 juntamente com a equação 4 deixamclaro que a capacidade de pico de um sistemaGC×GC é maior do que a de qualquer outroarranjo bidimensional. Contudo, este potencialmáximo só pode ser atingido quando não há



perdas de resolução no processo de transferênciada banda cromatográfica e quando não existecorrelação entre os dois mecanismos deseparação. Na prática, nc tot

será sempre menor doque o máximo possível. De acordo comconsiderações estatísticas, a capacidade de picode um sistema de separação bidimensional(2D-GC) é utilizada com menor eficiência doque a de um sistema monodimensional (1D-GC), pois, naquele caso, a superposição de picos podeocorrer nas duas dimensões. Não obstante estabaixa eficiência, os sistemas GC×GC oferecemmaiores capacidades de pico e, eventualmente,pode-se inclusive sacrificar parcialmente aeficiência de separação na segunda dimensão

para encurtar o tempo de análise43. Quando asaturação da primeira coluna é baixa e a segundacoluna apresenta uma alta capacidade de pico, aprobabilidade de obter-se uma separaçãocompleta dos analitos é maior7,44.

4. Cromatografia GasosaBidimensional Abrangente

Da mesma forma que a GC-GC, acromatografia gasosa bidimensional abrangente(GC×GC) também é caracterizada pelo uso deduas colunas, cujos mecanismos sãoindependentes ou quase independentes um dooutro (ortogonais), sendo preservada a separação

2009 | v . 1 | n . 1 37


Figura 2. Ilustração representativa de capacidades teóricas de pico: (A) 1D-GC; (B)GC-GC convencional com duas transferências independentes de frações do efluenteda primeira coluna; (B) GC×GC. (adaptado de Giddings7)

de cada coluna individual até o final doprocesso21. No caso da GC×GC, a primeiracoluna apresenta dimensões convencionais e aoutra é mais curta (do tipo de coluna usada emcromatografia rápida), havendo um moduladorentre elas. A modulação é a chave do processo de GC×GC. O sistema de modulação entre as duascolunas promove a amostragem da bandacromatográfica que elui da primeira dimensão(1D), sendo esta banda direcionada para umarápida separação na segunda dimensão (2D) 17. AFigura 3A apresenta um esquema representativode um sistema GC×GC e a Figura 3B ilustra umprocesso de modulação.

Inicialmente, a amostra é submetida àseparação na primeira coluna, após ter sidoinjetada no pórtico aquecido do injetor. Oefluente da primeira coluna ingressa nomodulador, o qual coleta material por umperíodo pré-determinado (Figura 3B1). NessaFigura, um modulador do tipo criogênico deduplo jato foi escolhido para ilustrar o processode modulação. Assim, quando o modulador éacionado (Figura 3B1), um jato de gás nitrogênio refrigerado ou de dióxido de carbono líquido é

projetado sobre uma pequena área do modulador. Durante certo período, a banda cromatográficasofre um efeito de compressão/estreitamentodevido à ação da baixa temperatura do fluidorefrigerante, de forma que os analitos sãoconcentrados neste local da coluna. Em ummomento seguinte, a incidência de fluidocriogênico sobre o capilar cessa e o moduladorlibera a banda cromatográfica anteriormenteamostrada e focalizada criogenicamente, deforma que esta é introduzida na segunda colunacomo um pulso cromatográfico curto (Figura3B2). Essa liberação pode ocorrer pelaincidência de um jato quente na mesma regiãoonde anteriormente foi projetado o jato de fluidocriogênico, ou simplesmente pela ausência dejato frio e transferência de calor do ar no interiordo cromatógrafo para o capilar. O processo deamostragem de uma nova fração que elui da 1D(o efluente da primeira dimensão eluicontinuamente) começa a ocorrer, enquanto afração anteriormente amostrada é submetida àseparação na coluna da segunda dimensão. Esteprocesso de amostragem, focalização e liberaçãoda banda cromatográfica para a segunda coluna



Figura 3. Esquema representativo de um sistema GC×GC e ilustração do processo criogênico de modulaçãocom duplo jato. I: injetor; D: Detector; M: modulador; C1: coluna da primeira dimensão; C2: coluna dasegunda dimensão (adaptado de Dallüge e colaboradores24).

ocorre durante toda a análise em um sistemaGC×GC. O tempo de um ciclo completo demodulação corresponde ao período demodulação (PM). A separação na segundadimensão ocorre de forma independente daquelaem processo na primeira coluna e o período deduração de cada análise na segunda dimensão éigual ao período de modulação. Ao final, omaterial que elui da segunda coluna passa pelodetector, de onde se obtém uma série decromatogramas curtos de segunda dimensão.Neste processo, todo o efluente da primeiracoluna é transferido para a segunda e, por isso, atécnica é chamada de “abrangente”, sendo que asanálises da primeira e segunda dimensão seprocessam simultaneamente e o tempo total deanálise equivale ao tempo empregado para umaanálise monodimensional. Explicaçõespertinentes à nomenclatura da área de GC×GCna língua portuguesa, bem como de algunsconceitos, podem ser encontradas em artigorecentemente publicado45.

Para que a separação da primeiradimensão seja mantida, as frações amostradaspelo modulador não devem ser maiores do que ¼da largura dos picos cromatográficos naqueladimensão46,47. A largura dos picoscromatográficos na 1D é, tipicamente, de 5 a 30 se, portanto, deve-se ter 3 a 4 modulações porpico. Consequentemente, os tempos de análisena 2D serão curtos, da ordem de 2 a 8 s, o quetorna a 2D uma separação essencialmenteisotérmica. Em contraponto, os tempos deretenção na 1D correspondem à duração de umaanálise convencional em cromatografiamonodimensional (1D-GC), de 30 a 120 min.

A primeira dimensão (1D) consistetipicamente em uma coluna de 15 a 30 m, com0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno (1dc) e 0,1 a 1

µm de espessura de fase estacionária (1df). Para asegunda coluna (2D), as dimensões típicas são0,5 a 2 m de comprimento, 0,1 a 0,18 mm de

diâmetro interno (2dc) e 0,1 µm de espessura defilme (2df). Geralmente, a coluna da 1D é apolar ea da 2D é polar. Esse arranjo é chamado deconjunto convencional de colunas. Nos casos em que uma coluna polar é empregada na 1D e umaapolar na 2D, o conjunto de colunas é designado

como inverso. As duas colunas podem estar nomesmo forno ou a segunda coluna pode estarlocalizada dentro de um segundo forno, o quepossibilita maior flexibilidade no controle datemperatura desta. A velocidade de aquecimentopara a primeira coluna é geralmente baixa (1 a

5°C min-1), a fim de que seja possível atingir-seum período de modulação que proporcione três aquatro modulações por pico da 1D, de forma anão prejudicar, posteriormente, a separaçãorealizada na primeira coluna. Se a largura dospicos da 1D é, por exemplo, 18 s, o período demodulação não deve ser maior do que 6 s19,47. Na2D, a largura na base dos picos será tipicamentede 50 a 600 ms, o que exigirá frequência deaquisição de dados de no mínimo 50 a 100 Hzpor parte dos detectores empregados48-50.

A Figura 4 indica como ocorre o processo de aquisição de dados durante uma análise porGC×GC e apresenta também algumas das formasde visualização dos resultados. O resultado de umaanálise de GC×GC é um grande número decromatogramas curtos obtidos nas análises dasegunda dimensão (etapa 1. Modulação). Noexemplo da Figura 4, um pico largo, composto detrês componentes não separados na 1D, passa peloprocesso de modulação e obtém-se umcromatograma bruto correspondente ao somatóriode todos os cromatogramas obtidos na 2D. Atransformação dos dados brutos em umcromatograma bidimensional (1tR vs. 2tR) érealizada através de software (etapa 2.Transformação). O registro desses cromatogramas, associado ao período de modulação e ao tempo deinício do processo de modulação permite quesejam construídos gráficos tridimensionais com osinal do detector, o tempo de retenção na 1D (1tR) eo tempo de retenção (2tR) na 2D. A visualização dosresultados na Figura 4 (etapa 3. Visualização) podeser verificada no cromatograma tridimensional. Aprojeção dos picos do diagrama tridimensional noplano formado pelos eixos correspondentes a 1tR e2tR gera diagramas bidimensionais como odiagrama de cores ou de contorno. No diagrama decores, estas mostram a intensidade do sinalcromatográfico e no diagrama de contorno, cadalinha representa uma intensidade específica dosinal cromatográfico e o somatório de várias linhas

2009 | v . 1 | n . 1 39


apresenta-se como curvas de nívelmonocromáticas. A Figura 4 também ilustra comclareza o estreitamento das bandas cromatográficas devido à ação do modulador. Esse fenômenoresulta em picos mais intensos e estreitos, queaumentam a relação sinal/ruído e, portanto, adetectabilidade.

Algumas das características e vantagensda GC×GC relativamente à 1D-GC e à GC-GCno que tange a amostras e/ou matrizes complexas são: (a) aumento da capacidade de pico, o qualimplica a melhora da separação cromatográficaentre os analitos e também entre analitos einterferentes da matriz21; (b) aumento dadetectabilidade devido ao estreitamento dasbandas cromatográficas decorrente do processode modulação; (c) toda a amostra é submetidaaos dois processos de separação; (d) o tempopara completar o processo de separação nas duascolunas é o mesmo necessário para a análise daamostra na primeira dimensão; (e) a estruturaçãode cromatogramas obtidos por GC×GC podeauxiliar na identificação de componentesdesconhecidos e facilitar na identificação decompostos pertencentes a determinadas classesquímicas. A estrutura cromatográfica tambémpode ser uma ferramenta na identificação deamostras através da análise da impressão digital

de amostras consideradas padrão(“fingerprinting”), isto é, comparação decromatogramas de amostras desconhecidas comoutros de amostras padrão; (f) cada componenteanalisado por GC×GC apresenta dois tempos deretenção, o que confere maior confiabilidade naidentificação dos compostos do que a 1D-GCproporciona. Disso tudo, depreende-se que aquantidade de informação obtida sobre osconstituintes de amostras complexas quando seutiliza GC×GC é bem maior do que aquelaalcançada pelo uso da GC-GC, sendo o tempo deanálise reduzido.

A literatura científica é pródiga em artigosde revisão sobre a técnica de GC×GC, algunsdeles focados nos conceitos básicos, nosdesenvolvimentos instrumentais, tratamentoteórico, tratamento de dados, quimiometria edetectores. Além desses, as aplicações nas maisdiversas áreas têm sido reportadas na literaturacientífica: petroquímica, forense, ambiental,alimentos, óleos e graxas, aromas e fragrâncias,óleos essenciais etc. 4,8,15-19,21,22,24-30,38,50-56. Oleitor interessado em investigar em maiorprofundidade alguns dos tópicos mencionadosneste artigo pode dirigir-se a alguma dessasfontes.



Figura 4. Ilustração esquemática do processo de geração e visualização dos cromatogramas em GC×GC (adaptado de Dallüge e colaboradores24).

4.1. Moduladores

O modulador é considerado o coração deum sistema GC×GC. A introdução de ummodulador entre as duas colunas faz com que oefluente da 1D seja introduzido na 2Dperiodicamente, preservando-se a separaçãoalcançada na 1D. Existem dois tipos básicos deinterfaces: os moduladores térmicos e osmoduladores à base de válvulas. Os térmicos sedividem em dois grupos: aqueles baseados emaquecimento e os criogênicos50.

O primeiro modulador é da categoria dosmoduladores térmicos e foi introduzido por JohnPhilips em 1991. Esse pesquisador empregou umsegmento do início da segunda coluna, quecontinha uma fase estacionária mais espessa,recoberto com uma camada de tinta à base deouro, que podia ser aquecido através de umcircuito elétrico. O ingresso de uma bandacromatográfica no segmento onde o filme eramais espesso resultava na interação dos analitoscom a fase estacionária e na redução davelocidade desses analitos, de maneira queocorresse um efeito de concentração econsequente estreitamento desta banda. Apassagem de corrente elétrica por este segmentodo capilar provocava rápido aquecimento e aremobilização da banda cromatográficaconcentrada para a fase móvel, de forma que amesma era transferida para a segunda coluna. Ainterrupção da corrente elétrica através doreferido segmento capilar (modulador) davainício ao processo de amostragem de uma novabanda cromatográfica14. Durante o intervalo detempo em que o modulador se encontravaaquecido, ocorria passagem de quaisquercompostos através desse segmento do capilar, sem que houvesse a focalização dos mesmos, e issoresultava em alargamento das bandas que eramintroduzidas na segunda dimensão. Esseproblema foi contornado com o moduladortérmico de dessorção de dois estágios (“two stagethermal desorption modulator”), nos quais osegmento capilar em que ocorre a modulação éoperado em dois estágios. No primeiro estágio, osanalitos que eluem da primeira coluna sãosorvidos no segmento inicial do modulador –segmento a1 – (1º estágio na Figura 5A). Quando

2009 | v . 1 | n . 1 41


Figura 5. Desenho esquemático de três tipos demoduladores: (A) modulador térmico de dessorção de doisestágios. As flechas representam o período em que o setorindicado não está sendo aquecido. a1: primeiro segmento domodulador; a2: segundo segmento do modulador (B)modulador térmico de varredura ou “Sweeper” (modificado de Philips e colaboradores57) (C) sistema criogênicolongitudinalmente modulado, LMCS (adaptado de Marriotte colaboradores92) C: posição do modulador no qual ocorrea concentração dos analitos; L: posição do modulador emque ocorre a liberação dos analitos; C1: coluna da primeiradimensão; C2: coluna da segunda dimensão; I: injetor; D:detector.

este primeiro setor do modulador é aquecido, oconteúdo que havia sido retido nele é liberadopara o segundo setor do modulador – segmento a2. Quaisquer outros materiais que eluem da primeiracoluna, enquanto o setor a1 está aquecido, passamatravés deste sem serem retidos. Todo estematerial é concentrado no setor a2 (2º estágio naFigura 5A) até o momento em que esse setortambém é aquecido, introduzindo-se a bandacromatográfica focalizada na coluna da segundadimensão. As flechas na Figura 5A representam operíodo em que o setor designado não está sendoaquecido. Simultaneamente, o setor a1 já resfriado inicia novamente o processo de sorção dosanalitos que eluem da primeira coluna. O fato deum dos setores do modulador atuar comoconcentrador da banda cromatográfica, enquantoo outro libera a passagem dos analitos poraquecimento faz com que não ocorra escapeindesejado de componentes, de forma a minimizar efeitos de alargamento de banda. Este tipo deinterface apresentou problemas quanto àreprodutibilidade do recobrimento do capilar e,além disso, esse modulador se mostrou frágil parao tipo de operação proposta9. Contudo, o emprego desta interface foi um ponto de partida para odesenvolvimento de outros moduladores, tendodemonstrado que a GC×GC era possível50.

A primeira versão comercial de modulador(Figura 5B) – modulador térmico de varredura(“thermal sweeper modulator” ou “Sweeper”) –baseia-se no conceito anteriormente explanado.Um capilar conectado entre as duas colunas,contendo uma fase estacionária mais espessa,promove o estreitamento da bandacromatográfica, enquanto o movimento rotatóriode um aquecedor dessorve continuamente osanalitos ao longo desse capilar, introduzindo-osna segunda dimensão57. A dificuldade emconcentrar bandas cromatográficas de analitosvoláteis nas temperaturas do fornocromatográfico é a principal desvantagem dessemodulador. Além disso, o movimento doaquecedor muito próximo ao capilar e umainstalação não muito simples também sãodesvantagens desta interface.

Philip Marriott desenvolveu um modulador criogênico denominado sistema criogênico

longitudinalmente modulado (LMCS,“longitudinally modulated cryogenic system”),que se encontra representado no diagrama daFigura 5C. Uma camisa de refrigeração feita deaço é resfriada pela passagem de dióxido decarbono líquido e se movimenta verticalmentesobre um trilho instalado no interior docromatógrafo, atuando como uma armadilhacriogênica. A camisa envolve a parte inicial dasegunda coluna e fica na extremidade inferior dotrilho, resfriando aquele setor da 2D (posição C –coleta ou amostragem). Neste ponto, a baixatemperatura proporcionada pela camisa promovea coleta e concentração da banda cromatográficapor resfriamento e/ou partição, de acordo com aspropriedades físico-químicas dos analitos. Aseguir, a camisa se move rapidamente para cima(posição L - liberação) e o setor anteriormenteresfriado é aquecido pelo ar quente do forno,liberando rapidamente a banda cromatográficaanteriormente amostrada e concentrada. O localda 2D para onde a camisa se moveu passa a sofrera ação do fluido criogênico e ocorre estreitamentoda banda cromatográfica nesta nova posição.Posteriormente, a camisa retorna à posição inicial, liberando a banda cromatográfica reconcentradapara a segunda coluna, enquanto uma nova bandacromatográfica é amostrada/concentrada naposição inferior da 2D, completando o ciclo demodulação. O LMCS representou um avançorelativamente aos moduladores existentes,entretanto, o resfriamento indireto com dióxido de carbono líquido pode não ser suficiente para quesejam retidos compostos muito voláteis. Umavantagem desse modulador em relação aos seusantecessores é que, na etapa de liberação da bandacromatográfica, não é necessário aquecimento,pois a temperatura no interior do forno é suficiente para provocar a remobilização dos analitos para afase móvel. O emprego deste tipo de interface semostrou confiável e a mesma tem sido usada porvários anos por diversos pesquisadores.

Posteriormente, outros moduladorescriogênicos que não apresentam partes móveis nasua configuração foram idealizados. Ofuncionamento desse tipo de modulador empregajatos de fluido criogênico e está ilustrado naFigura 3B. Os jatos resfriadores podem ser de



dióxido de carbono líquido ou com gás nitrogênioresfriado por nitrogênio líquido e o número dejatos pode variar entre quatro (dois jatos frios paracoleta e dois jatos quentes para remobilização dabanda cromatográfica)58, dois59 ou um60. Autilização de dióxido de carbono líquido é bemmais simples do que a do nitrogênio líquido,contudo o resfriamento proporcionado pelodióxido de carbono não é suficiente para amostrare concentrar analitos muito voláteis. A ausênciade partes móveis nestes moduladores é a suaprincipal vantagem. A eficiência de algumasdessas interfaces foi testada para uma mistura den-alcanos, alcanos clorados, bifenilas policloradas e hidrocarbonetos poliaromáticos policíclicos,verificando-se que os moduladores investigadosmostraram-se adequados para análise decompostos de alto ponto de ebulição61. Entretanto, quando o objetivo é a análise de compostos muitovoláteis (pontos de ebulição abaixo do hexano), énecessário empregar gás nitrogênio resfriado, sobpena de perda desses compostos30.

As primeiras tentativas de emprego deválvulas diversoras com comando eletrônico epneumático foram feitas por Bruckner ecolaboradores62. Este tipo de moduladorproporciona a transferência de apenas uma partedo efluente da primeira dimensão, e,consequentemente, confere menor sensibilidadeao método18. Esta limitação foi parcialmentecontornada por Seeley e colaboradores, através de uma nova configuração, em que a amostra éfisicamente comprimida antes de ser transferidapara a segunda coluna, resultando na transferência de 80 % do efluente da primeira coluna46. Acompressão da banda cromatográfica proporciona um aumento de sensibilidade, mas esse aumentonão se iguala àquele alcançado através do uso demoduladores criogênicos. Duas grandesvantagens dos moduladores à válvula são que osmesmos dispensam o custo adicional dos líquidoscriogênicos e são convenientes para análise decompostos voláteis, sem que ocorram perdas. Eles também resultam em análises rápidas na 2D (1 s ou menos) devido aos curtos intervalos de tempo dealteração de fluxo propiciados pelas válvulas,gerando bandas estreitas na segunda dimensão.Entretanto, a principal desvantagem quanto ao

uso das válvulas no interior de um cromatógrafo éque estas não podem ser aquecidas a temperaturasque permitam que compostos menos voláteispassem através das mesmas sem ficarem sorvidos. Outro modulador proposto por Seeley ecolaboradores, que emprega duas alças deamostragem e um sistema pneumático decontrole, procura contornar esta limitação, deforma que a válvula pode ser colocada fora docromatógrafo. O efluente coletado por uma dasalças de amostragem é encaminhado para asegunda dimensão, permitindo que, durante estatransferência, a fração seguinte de efluente da 1Dseja coletada pela outra alça de amostragem paraposterior transferência. Assim, todo o efluente daprimeira dimensão é transferido para a segunda.Entretanto, na medida em que fluxos ou o períodode modulação são alterados, as dimensões dasalças de amostragem também devem sermodificadas, o que torna este sistema bastanteinflexível e trabalhoso no que tange à suaoperação50.

Atualmente, os moduladores criogênicossão os mais empregados, entretanto, não existeum único modelo de modulador que sejaconsiderado o melhor para todas as aplicações. A escolha de um modulador depende da naturezadas amostras e dos analitos a serem investigados.Por exemplo, compostos extremamente voláteiscontidos em amostras de ar ambiente poderiamser submetidos com sucesso à modulaçãocriogênica com nitrogênio líquido, contudo ummodulador térmico de varredura não seria umaboa escolha para este tipo de analito, pois haveria perdas durante as análises.

4.2. Colunas e Ortogonalidade

Em princípio, qualquer fase estacionáriapode ser empregada na primeira dimensão de umsistema GC×GC. Contudo, as fases apolares sãogeralmente as mais empregadas, visto queexistem dados disponíveis na literatura sobre ocomportamento de um grande número decompostos neste tipo de fase em 1D-GC.Idealmente, as duas fases estacionárias devemproporcionar mecanismos de separaçãodiferentes, independentes um do outro(ortogonais), a fim de que se alcance o melhor

2009 | v . 1 | n . 1 43


resultado ao final do processo cromatográfico63.Assim, se na primeira dimensão for empregadauma coluna apolar, os componentes serãoseparados de acordo com sua volatilidade. Nestecaso, o leque de possibilidades para a escolha dafase estacionária da segunda dimensão incluicolunas polares ou medianamente polares, cujaseletividade se baseia primordialmente em

interações do tipo π − π, pontes de hidrogênio,efeitos estéricos etc. Entretanto, mesmo que omecanismo predominante para todas essas outras fases estacionárias não seja a volatilidade, esteparâmetro também contribui para a separaçãodos compostos. Assim, a condição deortogonalidade não poderia ser alcançada, poisexiste uma relação entre os mecanismos das duas colunas. Não obstante, como as análises de cadafração individual proveniente da 1D, na segundadimensão, são rápidas, elas podem serconsideradas como isotérmicas, onde não há acontribuição da volatilidade dos compostos noprocesso de separação. Isso significa que apenasas interações específicas características dacoluna polar predominarão como mecanismo deseparação na 2D e teremos, portanto, um sistema

ortogonal. Um dos principais benefícios dasseparações ortogonais é a obtenção de umcromatograma no qual os analitos se agrupam em bandas ou clusters no espaço de separação, deacordo com suas estruturas moleculares, efeitoeste chamado de estrutura cromatográfica. Estefenômeno de estruturação cromatográfica é umaferramenta valiosa para identificação decompostos desconhecidos ou para suaclassificação dentro de algum grupamentoquímico, visto que compostos cujas propriedades físico-químicas são semelhantes se localizam em regiões próximas no espaço de separação. Umcaso particular de estrutura cromatográfica é oefeito telhado, o qual definido como oagrupamento de uma classe de compostosquimicamente relacionados em um espaço deseparação, o qual se repete quando o número decarbonos desses compostos aumenta ou diminui,de forma a causar uma impressão de “telhado” no gráfico bidimensional. Este tipo de estruturacromatográfica pode ser facilmente observadaem análises de derivados de petróleo45,54,64. Umoutro exemplo de estruturação cromatográficapode ser observado na Figura 6.



Figura 6. Diagrama de cores obtido em um GC×GC/TOF-MS para óleo essencial deEucalyptus dunnii, mostrando a distribuição das diferentes classes de compostos em diferentesregiões do espaço de separação. Conjunto de colunas: na 1D BPX5 phase (5% phenyl

polysilphenylene-siloxane) 30 m × 0,25 mm (1dc), 0.25 µm (1df) e na 2D uma BP20 (Wax) phase

(polyethylene glycol) 1,5m × 0,1mm (2dc), 0.1 µm (1df). (A) alcoóis lineares; (B) aldeídos; (C)acetatos; (D) hidrocarbonetos monoterpênicos; (E) alcoóis monoterpênicos; (F) acetatosmonoterpênicos; (G) hidrocarbonetos sesquiterpênicos; (H) sesquiterpenos oxigenados55.

Nessa figura é possível verificar oitoregiões no diagrama de cores do óleo essencialde Eucalyptus dunnii, em que ocorre oagrupamento de compostos por semelhançasestruturais. Como exemplo, pode-se observar oposicionamento dos sesquiterpenos oxigenadosna região H, que eluem em longos tempos deretenção tanto na 1D, como na 2D, visto que sãocompostos menos voláteis e mais polares do queos demais55. Entretanto, um conjunto de colunasque satisfaz a condição de ortogonalidade nãoresulta automaticamente em diagramasestruturados. Duas condições precisam sercumpridas: (a) a amostra deve conter um grandenúmero de compostos estruturalmenteassemelhados (isômeros, homólogos oucongêneros) e (b) a segunda coluna deve serescolhida de acordo com as propriedadesfísico-químicas dos analitos. Assim, aortogonalidade não é um fim em si mesma. Oimportante é que o espaço de separação sejautilizado ao máximo e que se verifique umaestrutura cromatográfica na distribuição dosanalitos65. A despeito de várias aplicações desistemas ortogonais66-68, um exemplointeressante e bem-sucedido de nãoortogonalidade envolve a análise de uma amostra de óleo diesel tanto em um conjunto de colunasconvencional (apolar x polar), como em umconjunto de colunas inverso (polar xmedianamente polar). Os vários grupos decompostos (alcanos, mono-aromáticos,di-aromáticos) foram separados nos doisconjuntos de colunas e apresentaram estruturacromatográfica em ambos os casos, sendo que no conjunto inverso, a ordem de eluição foiobviamente, diversa daquela observada noconjunto convencional69. Trabalhos posterioresmostraram que maiores vantagens são obtidas naconfiguração inversa, quando a amostra emestudo contém compostos polares65,70-72.Entretanto, cabe observar que o uso de fasesestacionárias cujo mecanismo de separação ésemelhante pode resultar em uma separação queé essencialmente monodimensional e os analitosestarão dispostos ao longo de uma diagonal noplano 2D. O uso do espaço de separação, nestecaso, é mínimo. Este fenômeno foi verificado na

prática por Ryan e colaboradores66 em um estudo feito com dez compostos teste, no qual váriasfases estacionárias foram testadas e foi preditoteoricamente por Giddings65.

Um fenômeno que pode perturbar adistribuição ordenada de compostosassemelhados em grupamentos no espaço 2D é aocorrência de picos fora de ciclo (“wraparoundpeaks”). Um pico fora de ciclo corresponde a umcomposto cujo tempo de retenção na segundacoluna é maior do que o período de modulação.Consequentemente, esse pico irá eluir na 2D emum tempo de retenção aparente que será inferiorao tempo de retenção real. O tempo de retençãoaparente é uma informação fornecida pelodiagrama bidimensional. O valor real do seutempo de retenção será o somatório do tempo deretenção aparente e do tempo que elepermaneceu dentro da segunda coluna (númerode ciclos de modulação x período demodulação). Os picos fora de ciclo podem ser um problema quando coeluem com outroscomponentes de interesse ou com interferentes.Pelo fato de eluírem em um tempo de retençãoaparente diferente do tempo de retenção real,podem influenciar negativamente a estruturacromatográfica. Entretanto, quando os picos fora de ciclo não influenciam na estruturacromatográfica e eluem em uma região do espaço de separação que não está ocupada por nenhumoutro componente, não existe qualquer problema quanto à sua ocorrência. Nestes casos, elespodem contribuir para o bom aproveitamento doespaço de separação. Uma explicação maisdetalhada sobre picos fora de ciclo pode serencontrada em outros trabalhos científicos24,45.

Outro aspecto importante da escolha deconjuntos de colunas para a aplicação da GC×GCa amostras complexas reais é, não somente aseparação entre os analitos ou entre grupos deanalitos, mas sim a separação de compostos deinteresse dos interferentes da matriz. Em algunscasos, mesmo quando o número de analitos épequeno, a GC×GC pode apresentar grandevantagem analítica na separação de componentesde interferentes da matriz. Um exemplo dissopode ser visto no emprego das colunas DB5-ms eDB17-ms a um extrato de sedimento de rio

2009 | v . 1 | n . 1 45


enriquecido com nove agrotóxicos comumenteempregados na orizicultura. A Figura 7 apresentaclaramente a coeluição de interferentes da matrizcom os agrotóxicos tricloroguaiacol, propanil,fipronil, propiconazol I e II, caso fosse empregada apenas a 1D-GC.

4.3. Detectores

As bandas cromatográficas são de 10 a 50vezes mais estreitas na segunda dimensão do queem 1D-GC, resultando em larguras de pico daordem de 100 ms ou menos, o que requer umaalta velocidade de aquisição de dados. Essavelocidade de aquisição de dados depende doprocesso físico-químico envolvido na detecção etambém dos sistemas eletrônicos de conversãode sinal, que devem ser compatíveis com asexigências do sistema GC×GC73.

O detector de ionização em chama (FID)apresenta uma posição especial como detector emGC×GC, pois seu volume interno é desprezível esua frequência de aquisição varia de 50 a 200 Hz73,tendo sido o primeiro detector a ser utilizado emGC×GC14. Ele é empregado para finsquantitativos74 associado ou não a GC×GC/MS75

ou GC×GC/TOFMS76. Este detector também podeser usado para identificação de picos, devido aoposicionamento de um determinado componenteno espaço de separação relativamente a outrosgrupamentos químicos distribuídos no diagrama2D26.

O micro detector de captura de elétrons

(µ−ECD, “micro electron capture detector”) éuma miniaturização do ECD, o qual teve seudesign alterado, tornando-se mais compatívelpara uso em GC×GC. Dentre as várias



Figura 7. Diagrama de cores de extrato de sedimento de rio enriquecido com oito agrotóxicos 1:triclorfom; 2: tricloroguaiacol; 3: propanil; 4: fipronil; 5: propiconazol I e II; 6: trifloxistrobina; 7:permetrina cis e trans; 8: difenoconazol I e II; 9: azoxistrobina. Conjunto de colunas empregado

em um GC×GC-µECD: DB-5ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm e DB-17ms (1,70 m x 0,18 mm x

0,18 µm). As flechas indicam os locais no espaço de separação, onde haveria coeluição entre osanalitos e interferentes da matriz.

características do novo modelo, algumas podemser destacadas: menor volume na zona de

detecção (150 µL), maior sensibilidade, anodoisolado, “liner” removível e frequência deaquisição de dados de 5 a 50 Hz77. Esse detectortem sido usado com sucesso na análise decompostos organohalogenados por GC×GC,sendo recomendável operá-lo com altos fluxosde gás de “makeup” e frequências de aquisiçãode 50 Hz61,78. Em um estudo realizado paraavaliação de seis diferentes moduladores e três

µ−ECD, concluiu-se que, apesar do pequenovolume interno do detector, ainda se observaalargamento de banda comparativamente aoFID. Os altos fluxos de gás de “makeup” podemprovocar um efeito de diluição no sinal,reduzindo a intensidade do mesmo. Essas

constatações mostram que, embora o µ−ECDseja uma ótima alternativa para análise deorganohalogenados por GC×GC, ainda hámelhorias a serem feitas para aprimorar suaeficiência61.

Alguns outros detectores seletivos têm sidoutilizados em GC×GC, como por exemplo odetector de quimioluminescência de enxofre (SCD, “sulphur chemiluminescence detector”)79,80,detector de quimioluminescência de nitrogênio(NCD, “nitrogen chemiluminescence detector)81,82, detector de nitrogênio e fósforo (NPD, “nitrogenphosphorous detector”)83,84, e inclusive o detectorde emissão atômica (AED, “atomic emissiondetection”)85. Uma descrição mais abrangentesobre FID e detectores seletivos usados emGC×GC pode ser consultada para um maiordetalhamento sobre este assunto26.

O uso de um detector de espectrometria demassas, que possibilita a obtenção deinformações estruturais para a identificação dosmuitos compostos separados por GC×GC, éindispensável. A frequência de aquisição de umespectrômetro de massas por tempo-de-voo vaide 50 Hz a 500 Hz (resolução unitária), o que otorna o detector ideal para a investigação deinformações estruturais sobre os compostos,proporcionando a construção dos picos rápidosda segunda dimensão. Além disso, pode-seempregar software comercial (como porexemplo o ChromaTOF da Leco) que possibilita

a deconvolução de picos sobrepostos e alocalização de determinados íons de interesse,bem como a apresentação de cromatogramas 2Dde corrente iônica total (TIC, “total ion current”)e de cromatogramas 2D de íon extraído.Entretanto, os arquivos adquiridos nestesequipamentos para amostras complexas sãograndes e o tratamento de dados é uma tarefacomplexa e demorada48,86.

A dificuldade de uso dos detectores deespectrometria de massas quadrupolares (qMS,“quadrupole mass spectrometer”) reside na baixa velocidade de varredura desses equipamentos(~20 Hz), o que resulta em três a cinco pontos deleitura ao longo dos picos da segunda dimensão,comprometendo seriamente a qualidade dosprocessos de quantificação e identificação. Oemprego do modo de monitoramento de íonseletivo (SIM, “selective ion monitoring”)permite uma frequência de varredura deaproximadamente 30 Hz, o que leva a umnúmero maior de pontos de leitura ao longo dospicos da segunda dimensão (cinco a seispontos)87.

Atualmente, existem três detectorescomerciais quadrupolares de espectrometria demassas de varredura rápida (rapid scanning qMS,“rapid scanning quadrupole mass spectrometer):Clarus 500 da Perkin Elmer, QP2010 daShimadzu e Trace DSQ da Thermo ElectronCorporation. Trabalhos publicados indicameficiência semelhante para esses trêsequipamentos, sendo esta ligeiramente superior àdo qMS convencional88-91. Em suma, o qMS devarredura rápida é uma alternativa útil paraaplicações cujo intervalo de massas restringe-se auma faixa entre 100 e 300 Da. Quando a faixa demassas dos compostos de interesse vai além disso, é necessário empregar TOFMS30. Recentemente,Mondello e colaboradores publicaram um artigode revisão sobre o uso de GC×GC/MS25.

Existem várias abordagens para o processode quantificação em GC×GC. A mais comum ésemelhante à empregada em 1D-GC, exceto que,ao invés de efetivar-se a integração de um pico para um único analito, existem muitos picos para cadaanalito. Para calcular a área total de um composto,os picos em cada cromatograma da segunda

2009 | v . 1 | n . 1 47


dimensão são integrados separadamente e suasáreas são somadas. Beens e colaboradoresintroduziram técnicas para quantificação de dadosem GC×GC73. As abordagens quimiométricas têmse mostrado uma estratégia extremamentepromissora, entretanto a discussão deste assuntonão é algo simples por causa da complexidadematemática envolvida, distante do dia-a-dia damaior parte dos profissionais que trabalha comcromatografia. As duas principais técnicasempregadas para deconvolução e /ou quantificação em GC×GC estão baseadas na análise dos fatoresparalelos (PARAFAC, “parallel factor analysis”).Adachour apresenta uma discussão sobre esteassunto em recente artigo de revisão, no qualconclui que a aplicação do PARAFAC aindaencontra-se em estágio de desenvolvimento e noâmbito dos quimiometristas30.

Referências Bibliográficas1. D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Princípios de

Análise Instrumental. Editora Bookman, 2002.

2. T.A. Berger, Chromatographia 42 (1996) 63.

3. E. Matisova, M. Dömötörová, J. Chromatogr. A 1000

(2003) 199–221.

4. R. Shellie, P. J.Marriott, Flavour Fragr. J. 18 (2003) 179.

5. C.A. Cramers, H.-G. Janssen, M.M.v. Deursen, P.A.

Leclercq, J. Chromatogr. A 856 (1999) 315–329.

6. J.C. Giddings, Anal. Chem. 56 (1984) 1258A.

7. J.C. Giddings, J. High Resol. Chromatogr. &

Chromatogr. Communications 10 (1987) 319.

8. W. Bertsch, J. High Resol. Chromatogr. 22 (1999) 647.

9. Z. Liu, S.R. Sirimanne, D.G.P. Jr., L.L. Needham,

Analytical Chemistry 66 (1994) 3086.

10. M.C. Simmons, L.R. Snyder, Anal. Chem. 30 (1958) 32.

11. D.R. Deans, Chromatographia 1 (1968) 18.

12. B.M. Gordon, C.E. Rix, M.F. Borgerding, J.

Chromatogr. Sci. 23 (1985) 51.

13. K. MacNamara, R. Leardi, A. Hoffmann, LC-GC N.

Am. 22 (2004) 166.

14. Z. Liu, J.B. Philips, J. Chromatogr. Sci. 29 (1991) 227.

15. W. Bertsch, J. High Resol. Chromatogr. 23 (2000)

167–181.

16. R.C.Y. Ong, P.J. Marriott, J. Chromatogr. Sci. 40

(2002) 276.

17. P.J. Marriott, R. Shellie, Trends Anal. Chem. 21 (2002) 573.

18. M. Pursch, K. Sun, B. Winniford, H. Cortes, A. Weber, T.

McCabe, J. Luong, Anal. Bioanal. Chem. 373 (2002) 356.

19. M. Adahchour, J. Beens, R.J.J. Vreuls, U.A.T.

Brinkman, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 438.

20. J. Beens, U.A.T. Brinkman, Trends Anal. Chem. 19

(2000) 260.

21. J.B. Phillips, J. Beens, J. Chromatogr. A 856 (1999) 331.

22. R.B. Gaines, G.S. Frysinger, M.S. Hendrick-Smith,

J.D. Stuart, Environ. Sci. & Technol. 33 (1999) 2106.

23. P.J. Schoenmakers, J.L.M.M. Oomen, J. Blomberg, W.

Genuit, G.v. Velzen, J. Chromatogr. A 892 (2000) 29.

24. J. Dallüge, J. Beens, U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr.

A 1000 (2003) 69.

25. L. Mondello, P.Q. Tranchida, P. Dugo, G. Dugo, Mass

Spectrometry Reviews 27 (2008) 101.

26. C. vonMühlen, W. Khummueng, C.A. Zini, E.B.

Caramão, P.J. Marriott, J. Sep. Sci. 29 (2006) 1909.







30. M. Adahchour, J. Beens, U.A.T. Brinkmann, J.

Chromatogr. A 1186 (2008) 67.

31. P.J. Marriott, T. Massil, H. Hügel, J. Sep. Sci. 27 (2004)

1273–1284.

32. J.M. Davis, J.C. Giddings, Anal. Chem. 55 (1983) 418.

33. P.J. Slonecker, X. Li, T.H. Ridgway, J.G. Dorsey, Anal.

Chem. 68 (1996) 682.

34. F. Dondi, A. Bassi, A. Cavazzini, M.C. Pietrogrande,

Anal. Chem. 70 (1998) 766.

35. K. Rowe, D. Bowlin, M. Zou, J.M. Davis, Anal. Chem.

67 (1995) 2994.

36. J.d. Boer, Q.T. Dao, J. High Resolut. Chromatogr. 12

(1989) 755.

37. J.d. Boer, Q.T. Dao, R. Dortmund, J. High Resolut.

Chromatogr. 15 (1992) 249.

38. H.J. de Geus, J. Boer, U.A.T. Brinkman, Trends Anal.

Chem. 15 (1996) 168.

39. B.M. Gordon, M.S. Uhrig, M.F. Borderging, H.L.

Chung, W.M. Coleman, J.F. Elder, J.A. Giles, D.S.

Moore, C.E. Rix, E.L. White, J. Chromatogr. Science

26 (1988) 174.

40. C. Samuel, J.M. Davis, Anal. Chem. 74 (2002) 2293.

41. J.C. Giddings, Anal. Chem. 39 (1967) 1027.

42. J.C. Giddings, Unified Separation Science, John Wiley

& Sons, New York, 1991.

43. J.M. Davis, Anal. Chem. 63 (1991) 2141.



44. M. Peters, J.M. Davis, American Lab. 30 (1998) 32C.

45. C. vonMühlen, C.A. Zini, E.B. Caramão, P.J. Marriott,

Quim. Nova 30 (2007) 682.

46. J.V. Seeley, F. Kramp, C.J. Hicks, J. Chromatogr. A

962 (2002) 21–27.

47. R.E. Murphy, M.R. Schure, J.P. Foley, Anal. Chem. 70

(1998) 1585.

48. J. Dallüge, R.J.J. Vreuls, J. Beens, U.A.T. Brinkman, J.

Sep. Sci. 25 (2002) 201.

49. A.L. Lee, A.C. Lewis, K.D. Bartle, J.B. McQuaid, P.J.

Marriott, J. Microcol. Sep. 12 (2000) 187.

50. T. Gorecki, J. Harynuk, O. Panic, J. Sep. Sci. 27 (2004) 359.

51. S.E. Reichenbach, M. Ni, V. Kottapalli, A. Visvanathan,

Chemom. Intell. Lab. Syst. 71 (2004) 107.

52. J.B. Phillips, J. Xu, J. Chromatogr. A 703 (1995) 327.

53. J. Beens, U.A.T. Brinkman, The Analyst 130 (2005) 123.


Quim. Nova 29 (2006) 765.


J. Chromatogr. A 1200 (2008) 34–42.

56. P.J. Marriott, P. Haglund, O.C.Y. Ong, Clin. Chim. Acta

328 (2003) 1.

57. J.B. Phillips, R.B. Gaines, J. Blomberg, F.W.M.v.d.

Wielen, J.-M. Dimandja, V. Green, J. Granger, D.

Patterson, L. Racovalis, H.-J.d. Geus, J.d. Boer, P.

Haglund, J. Lipsky, V. Sinha, J. Edward B. Ledford, J,

High Resol. Chromatogr. 22 (1999) 3.

58. J. Edward B. Ledford, in Riva del Garda, 2000.

59. J. Beens, M. Adahchour, R.J.J. Vreuls, K.v. Altena,

U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr. A 919 (2001) 127.

60. M. Adahchour, J. Beens, U.A.T. Brinkman, The Analyst

128 (2003) 213.

61. E.M. Kristenson, P. Korytár, C. Danielsson, M. Kallio,

M. Brandt, J. Mäkelä, R.J.J. Vreuls, J. Beens, U.A.T.

Brinkman, J. Chromatogr. A 1019 (2003) 65.

62. C.A. Bruckner, B.J. Prazen, R.E. Synovec, Anal. Chem.

70 (1998) 2796.

63. C.J. Venkatramani, J. Xu, J.B. Phillips, Anal. Chem. 68

(1996) 1486.

64. J. Beens, J. Blomberg, P.J. Schoenmakers, J. High

Resol. Chromatogr. 23 (2000) 182.

65. J.C. Giddings, J. Chromatogr. A 703 (1995) 3.

66. D. Ryan, P. Morrison, P. Marriot, J. Chromatogr. A

1071 (2005) 47.

67. P. Korytar, P.E.G. Leonards, J.d. Boer, U.A.T.


68. P. Korytár, C. Danielsson, P.E.G. Leonards, P. Haglund, J.

Boer, U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr. A 1038 (2004) 189.

69. M. Adahchour, J. Beens, R.J.J. Vreuls, A.M. Batenburg,


70. R. Mayadunne, T.-T. Nguyen, P.J. Marriott, Anal.

Bioanal. Chem. 382 (2005) 836.

71. D. Ryan, R. Shellie, P. Tranchida, A. Casilli, L.

Mondello, P. Marriott, J. Chromatogr. A 1054 (2004) 57.

72. T.C. Tran, G.A. Logan, E. Grosjean, J. Harynuk, D.

Ryan, P. Marriott, Org. Geochem. 37 (2006) 1190–1194.

73. J. Beens, H. Boelens, R. Tijssen, J. Blomberg, J. High

Resol.Chromatogr. 21 (1998) 47.

74. C.G. Fraga, B.J. Prazen, R.E. Synovec, J. High Resol.

Chromatogr. 23 (2000) 215–224.

75. M. Kallio, T. Hyötyläinen, M. Lehtonen, M. Jussila, K.

Hartonen, M. Shimmo, M.-L. Riekkola, J. Chromatogr.

A 1019 (2003) 251.

76. S. Zhu, L. X, L. Dong, J. Xing, J. Chromatogr. A 1086

(2005) 107.

77. M.S. Klee, M.D. Williams, I. Chang, J.J. Murphy, J.

High Resolut. Chromatogr. 22 (1999) 24.

78. P. Korytár, P.E.G. Leonards, J.d. Boer, U.A.T.

Brinkmanb, J. Chromatogr. A 958 (2002) 203.

79. F.C.-Y. Wang, W.K. Robbins, F.P.D. Sanzo, F.C.

McElroy, J. Chromatogr. Sci. 41 (2003) 519.

80. R. Hua, J. Wang, H. Kong, J. Liu, X. Lu, G. Xu, J. Sep.

Sci. 27 (2004) 691.

81. F.C.-Y. Wang, W.K. Robbins, M.A. Greaney, J. Sep.

Sci. 27 (2004) 468.

82. F. Adam, F. Bertoncini, N. Brodusch, E. Durand, D.

Thiébaut, D. Espinat, M.-C. Hennion, J. Chromatogr. A

1148 (2007) 55–64.

83. C. vonMühlen, E.C. Oliveira, P.D. Morrison, C.A. Zini,

E.B. Caramão, P.J. Marriott, J. Sep. Sci. 30 (2007) 3223.

84. D. Ryan, P. Watkins, J. Smith, M. Allen, P. Marriott, J.

Sep. Sci. 28 (2005) 1075.

85. L.L.P. vanStee, J. Beens, R.J.J. Vreuls, U.A.T.


86. J. Dallüge, L.L.P.v. Stee, X. Xu, J. Williams, J. Beens,

R.J.J. Vreuls, U.A.T. Brinkman., J. Chromatogr. A 974

(2002) 169.

87. C. Debonneville, A. Chaintreau, J. Chromatogr. A 1027

(2004) 109.

88. C. Cordero, C. Bicchi, D. Joulain, P. Rubiolo, J.

Chromatogr. A 1150 (2007) 37.

89. H.V.D. Weghe, G. Vanermen, J. Gemoets, R.

Lookman, D. Bertels, J. Chromatogr. A 1137 (2006) 91.

90. M. Adahchour, M. Brandt, H.-U. Baier, R.J.J. Vreuls,

A.M. Batenburg, U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr. A

1067 (2005) 245.

91. P. Korytár, J. Parera, P.E.G. Leonards, J.d. Boer,


92. P.J. Marriott, R.M. Kinghorn, Anal. Chem. 69 (1997) 2582.

2009 | v . 1 | n . 1 49


2009 | v . 1 | n . 1 51


Como economizar (ou eliminar o uso de)acetonitrila em tempos de “crise”?

Fernando M. Lanças

Universidade de São PauloInstituto de Química de São Carlos13560-970 – São Carlos (SP)[email protected]

ResumoO solvente orgânico mais utilizado atualmente em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE)

é a acetonitrila ou cianeto de metila. A partir de outubro de 2008, a disponibilidade deste solvente foi drasticamente

reduzida, enquanto que seu preço elevou-se acima de patamares considerados aceitáveis para este tipo de solvente.

Várias razões têm sido apontadas para explicar tais fatos, sendo as principais os problemas decorrentes do

fechamento (ainda que temporário) de empresas Chinesas que purificam este solvente em larga escala, e a

diminuição internacional da demanda de acrilonitrila, devido à denominada “crise”, durante cuja fabricação a

acetonitrila é um dos subprodutos. Qualquer que seja a razão real para esta nova situação, o desafio para encontrar

mecanismos para minimizar, substituir, ou eliminar o uso de acetonitrila

tem sido grande e a busca imperativa. No presente trabalho são

discutidas dez opções para otimizar/minimizar/eliminar o uso de

acetonitrila em HPLC, alguns envolvendo simples mudanças na fase

móvel até outras mais radicais que requerem mudanças profundas na

instrumentação utilizada.

AbstractAcetonitrile is nowadays by far the major organic solvent used as móbile phase in HPLC. Starting the second

semester in 2008, the availability of this solvent decreased at the same time that its cost jumped to values considered

well above reasonable for this kind of solvent. Several explanations has been invoked to explain this new situation .

The most accepted ones the closing of Chinese large acetonitrile purification units, and the actual international

financial “crisis” which lowered the demand for the production of acrilonitrile, of whose fabrication acetonitrile is a

by-product. Independently of the reason, the new situation demands the

search for alternatives to decrease or even eliminate the use of this

solvent in HPLC. In the present work, we suggest 10 different ways to

optimize/minimize/eliminate the use of acetonitrile in HPLC methods.

Some methods requires just small changes, while some others demands

larger instrument modification.

Palavras-chave

Acetonitrila, eluente, HPLC,

otimização da fase móvel.

Keywords

Aacetonitrile, eluent, HPLC,

móbile phase optimization.

1. O problemaAcetonitrila, (Figura 1), comumente

abreviada como ACN, é um líquido incolor àtemperatura ambiente, de fórmula químicaCH3CN, amplamente utilizado como solventeem várias áreas da química e suas múltiplasaplicações. ACN é um bom solvente, tendo umpoder de dissolução razoavelmente bom, mascom ponto de ebulição relativamente baixo (82ºC) . Misturas contendo acetonitrila/água, nasmais diversas proporções, são amplamenteutilizadas em química analítica, em especial nosmétodos de separação, principalmente emcromatografia líquida em escalas analítica epreparativa. A cromatografia líquida em fasereversa é o modo mais empregado, sendo a fasemóvel mais popular nesta modalidade de HPLCuma mistura acetonitrila:água, em diversasproporções.

A acetonitrila é um subproduto daprodução de acrilonitrila (Figura 2); apesar daACN poder ser produzida a partir de outras rotas, estas não têm interesse comercial no presente.

Os quatro maiores produtores deacetonitrila nos Estados Unidos são a Ineos,Dupont, J.T. Baker e a Sterling Chemicals, as

quais distribuem o produto através de uma malha internacional.

A partir do segundo semestre de 2008,principalmente a partir de outubro, iniciou-se um processo de diminuição internacional da ofertade ACN. Existem várias possíveis explicaçõespara o fato, sendo uma delas a diminuição deprodução na China no ano de 2008 devido aosJogos Olímpicos, assim como os danos causadosa uma fábrica americana devido ao furacão Ilke.Ninguém exclui também o fato de que aacetonitrila, sendo um subproduto da preparaçãode acrilonitrila, sofreu uma enorme queda deprodução devido à diminuição da atividadeeconômica (recessão? crise?) em todo o mundo apartir desse mesmo período. Uma das principaisaplicações da acrilonitrila é na produção deplásticos amplamente utilizados na indústriaautomobilística, dentre outras.

Independentemente da razão, ou doconjunto delas, é fato que a partir de outubro de2008 houve uma diminuição drástica da oferta de acetonitrila em todo o mundo, acompanhada deum aumento brutal em seu custo. Existemregistros de aumentos de até 10 vezes no preçodo ACN quando se compara o primeiro semestrede 2008 com janeiro de 2009. Fato ainda maisgrave é que as perspectivas para o ano 2009 sãoainda menos animadoras, sem previsão demelhora do quadro a curto prazo. Algumasempresas internacionais de grande porte jácomeçaram a racionar a venda de ACN1 e, aindaassim, para seus clientes (usualmente com cotasbaseadas no histórico de compra). Desta forma, a melhor alternativa na atual situação seriaminimizar o uso de ACN, encontrar outrosolvente para substituí-lo (exemplo: metanol), ou mudar para outra técnica cromatográfica como ocromatografia com fluido supercrítico (SFC).

O objetivo deste trabalho é examinar asvárias possibilidades de convivermos com o fatode que a diminuição e incerteza na oferta, assimcomo o aumento de custo do ACN, requeremurgentemente uma mudança de atitude da maiorparte dos usuários de cromatografia líquida,assegurando a continuidade de seus trabalhos.



Figura 1. Fórmula química (a) e modelo (b) da acetonitrila[nome IUPAC].

Figura 2. Fórmula química (a) e modelo (b) daacrilonitrila[nome IUPAC: etenilnitrila].

2. Diminuição no diâmetro interno da coluna (di)

Esta é a forma mais visível através da qualse pode economizar mais de 90% de acetonitrilasem modificar o cromatograma obtido, e semgrandes modificações no método de análise. AFigura 3 ilustra, em escala, a diminuição dodiâmetro interno das colunas em LC, enquantoque a Tabela 1 apresenta o consumo típico deuma coluna em função do diâmetro interno.

Tabela 1. Consumo de solvente em função do volume deuma coluna de HPLC (k=6)

Dimensõesda coluna

Volume da coluna

Consumode solvente

9.0 x 250 mm 10,0 mL 80,0 mL

4.6 x 250 mm 2,5 mL 19,0 mL

4.6 x 150 mm 1,5 mL 12,0 mL

4.0 x 80 mm 0,5 mL 4,5 mL

2.1 x 150 mm 0,3 mL 2,5 mL

Observa-se que o volume de solvente paraeluir um pico da coluna, com o mesmo valor de k, depende muito das dimensões da mesma. Issoocorre porque a mudança no diâmetro interno dacoluna faz com que a velocidade linear média

ótima (µ ótimo) e, portanto, o fluxo ou vazão dafase móvel, varie com as dimensões da coluna(Tabela 2).

Tabela 2. Fluxos típicos empregados nas colunas de LC(Fc) em função do diâmetro interno (d.i.)

Denominaçãoda Coluna

Dimensões(d.i.) Fluxo (Fc) típico

Tubulares abertas < 25 µm < 25 nL/min

Nanobore 25 µm a 100 µm 25 - 4.000 nL/min

Capilar 100 µm a 1 mm 0,5 - 200 µL/min

Microbore 1 mm a 2,0 mm 50 - 1.000 µL/min

Narrowbore 2,0 mm a 4,0 mm 0,2 - 2,0 mL/min

Padrão 4,0 mm a 4,6 mm 1,0 - 5,0 mL/min

Semi-preparativas 4,6 mm a 10 mm 5,0 - 40 mL/min

Preparativas > 10 mm > 20 mL/min

Este efeito é ainda mais pronunciadoquando se utilizam colunas capilares ou comdimensões nano, para as quais fluxos (vazões) da ordem de 0,1 a 10 microlitros/minuto são ideais.Assim, em uma análise típica empregando-seuma coluna “padrão” de HPLC (L=15 cm; di=4mm; dp= 5 microns) a um fluxo(vazão) de 1mL/min, ao longo de 8 horas (480 minutos) detrabalho o consumo de solvente será de cerca de meio litro de solvente. Assumindo-se 20 dias detrabalho/mês neste ritmo, o consumo destecromatógrafo será de 10 litros de solvente./mês(ou mais de 100 litros/ano). A mesma separaçãopoderá ser obtida empregando-se uma coluna demicro-LC( L=15 cm; di=0,2mm; dp=5 microns)operando a um fluxo de 1 µL/min. Isso daria umconsumo de 60 microlitros/h; ou 500 microlitros(0,5mL)/dia; ou 10 mL/mês; ou 100 mL/ano.Assim, esta última coluna operaria ao longo deum ano empregando apenas 0,1 Litro desolvente, mil vezes menos do que a anterior, semmodificar o solvente. Em empresasfarmacêuticas, as quais empregam várioscromatógrafos líquidos para controle dequalidade, P&D, estudos de bioequivalência eequivalência farmacêutica, dentre outros, aeconomia de solvente pode ser significativa, semalteração nos cromatogramas obtidos. Regrageral, a redução do diâmetro interno da colunapermite uma redução no uso de solvente eamostra a qual é proporcional ao quadrado do

2009 | v . 1 | n . 1 53


Figura 3. Comparação entre o diâmetro interno de colunasde HPLC, em escala.

inverso do d.i.(Tabela 3). Por exemplo,comparando-se uma coluna com d.i. 4,6 mm com outra coluna de d.i. 2,1 mm de mesmocomprimento, a economia em solvente e amostraserá de aproximadamente 5 vezes, ou seja:

(4,6 / 2,1 ) 2 = 4,8.

Mantendo-se a mesma velocidade linearmédia para as duas colunas, o tempo de retençãodos compostos não será afetado.

Tabela 3. Efeito do diâmetro interno da coluna (di) noconsumo de fase móvel

D.I. Fluxo TípicoFluxoempregado

ConsumoRelativo deFase Móvel

4,6 mm 1 - 2 mL/min 1,0 mL/min 1,0

3,0 mm 0,3 - 1 mL/min 0,4 mL/min 0,4

2,1 mm 0,2 - 0,4 mL/min 0,2 mL/min 0,2

1,0 mm 50 - 200 µL/min 0,05 mL/min 0,05

0,5 mm 10 - 30 µL/min 0,01 mL/min 0,01

0,32 mm 5 - 10 µL/min 0,005 mL/min 0,005

0,20 mm 1 - 5 µL/min 0,001 mL/min 0,001

50 µm 0,1 - 0,2 µL/min 0,0001 mL/min 0,0001

Apesar de conceitualmente muito simples, a mudança de HPLC para micro-LC pode darinicialmente um certo trabalho pelo fato de aminiaturização da coluna exigir maioresatenções com o equipamento. Uma vez que amaior parte dos equipamentos em operação noslaboratórios foi projetada para trabalhar comHPLC (alguns “adaptados” na própria fábricapara aceitar colunas micro), os volumes dosistema de injeção, cela de detecção, e dastubulações empregadas para conectar as partes,especialmente entre o injetor e a coluna, e entreesta e o detector, são muito superiores aosadequados para o sistema micro-LC. Assim, uma redução drástica no diâmetro interno ecomprimento dos tubos empregados emconexões, no volume interno da cela de detecção(no caso de detectores espectrofotométricos oprojeto da cela é igualmente importante) e nosistema de introdução da amostra é mandatóriopara se obterem picos com a qualidade esperada.Equipamentos não apropriados para micro-LCtendem a apresentar picos largos, falta dereprodutibilidade no tempo de retenção devido a

flutuações no fluxo (vazão) da bomba oumudanças de pressão no caso de bombas do tiposeringa, além de outros problemas quedeterioram a forma dos picos. Portanto, as reaisvantagens das colunas de micro-LC somentepodem ser obtidas empregando-se equipamentoapropriado para as mesmas.

3. Diminuição no comprimento do tubo (L)

Uma vez que o tempo de retenção de umcomposto depende do tempo em que ele passa nacoluna, quanto menor o comprimento da coluna(menor L) menor será também o tempo deretenção. Assim, empregando-se colunas maiscurtas, obtém-se análise mais rápidas com menor consumo de solvente. Entretanto, quanto menoro comprimento da coluna, mantidas as outrasdimensões (di e dp) menor será a eficiência damesma (N). A maneira de obter-se uma boaeficiência, análise rápida, e pouco consumo desolvente, consiste em diminuir-se o tamanho daspartículas da fase estacionária.

4. Diminuição do tamanho daspartículas da fase estacionária (df)

A variação do tempo de retenção de umanalito em função do tamanho das partículas dafase estacionária, mantendo-se os demaisparâmetros fixos, é dada por:

tk Nh

Ddp

Rm

=+

⋅( )1 2

µ

onde tR é o tempo de retenção; k= fator deretenção; N= número de pratos da coluna; h=altura de um prato; Dm = difusão do analito na

fase móvel; µ= velocidade linear da fase móvel.Observa-se que o tR e, portanto o tempo deanálise, diminuirá com o quadrado do tamanhodas partículas.

Em cromatografia líquida “clássica”(antecedeu o desenvolvimento da HPLC) otamanho das partículas era tipicamente entre 60 e 200 mícrons. Desde os princípios dodesenvolvimento da HPLC, era conhecido o fatode que uma diminuição no tamanho das



partículas ocasionaria uma dramática mudançano tempo de retenção e, como consequência, notempo de análise e volume de solventeempregado. Entretanto, era já também conhecido que a diminuição no diâmetro das partículasacarretava um aumento na pressão do sistema, de acordo com:

∆PL

dp=

φ η100 2

onde ∆P é a variação da pressão na coluna(entrada e saída), também conhecida como queda da pressão na coluna.

A maneira ideal encontrada para balancear todos estes parâmetros foi diminuir-se o tamanho das partículas (dp) e do comprimento da coluna(L), mantendo-se as pressões dentro de valoresrazoáveis e obtendo-se análises mais rápidas ecom menor consumo de solventes. A Tabela 4ilustra uma relação entre estes vários parâmetrospara colunas de HPLC. Torna-se evidente que amelhor alternativa para economia de tempo esolvente é diminuir-se L e dp. Até o início doséculo XXI, o padrão de dimensão das colunaspara HPLC era L = 25 cm; di = 4,6 mm; dp = 5mícrons. Um grande esforço foi feito no final doséculo passado e primeira década deste, paraadequar estes valores ao discutido anteriormente.

Tabela 4. Relação entre o tamanho de partículas (dp),variação de pressão na coluna (∆P), comprimento da coluna(L) e o tempo de retenção (tR).

Tamanho departículas(dp, µm)

Queda depressão(∆P, psi)

Comprimento(L, cm)

Tempo deretenção(tR, min)

10 1.000 25 10

5 2.000 12.5 5

2 5.000 5 2

Com base na teoria já conhecida, e odesenvolvimento de instrumentos maisapropriados para trabalhar com partículasmenores, desenvolveu-se uma forma maisinteligente de aproveitar-se o potencial daHPLC. Partículas com dp = 3 mícrons e,

posteriormente, dp ≅ 1,5 µícrons, passaram a sercomercializadas em tubos mais curtos (L =3-10cm), gerando colunas tão eficientes quantoas anteriores porém com análises muito mais

rápidas e com menor consumo de solvente. Nomomento, este enfoque tem sido o preferido,principalmente pelas indústrias farmacêuticas.Observando este rápido desenvolvimento daspartículas de dp menores, a indústria deequipamentos e colunas rapidamente adaptou-seá novidade e praticamente todos os grandesnomes da área oferecem esta solução, comdiferentes fabricantes. Deve-se ter em mente queassim como a diminuição no diâmetro interno dacoluna requer mudanças na instrumentação,conforme discutido no item 1, a diminuição dodp também requer um aperfeiçoamento dosequipamentos convencionais de forma a seaproveitar ao máximo as vantagens destascolunas.

5. Eliminando a ACN como eluente

Em muitas situações práticas, aacetonitrila pode ser totalmente substituída poroutro solvente como metanol, etanol ou THF,ajustando-se a composição da nova faseestacionária. Geralmente utiliza-se para tal asérie eluotrópica e valores do índice depolaridade (P’) dos solventes2. A relação entreP´e k é dada por:

( )k

k

P P2

1

2102 1'

'=

−

onde k1 e k2 representam os fatores deretenção do analito nas duas fases móveis. Oíndice de polaridade de uma fase móvel pode serdeterminado pelo conhecimento do índice depolaridade de cada solvente e a composição dafase móvel através de:

P = X1P1 + X2P2 + ...

A título de exemplo, deseja-se avaliar apossibilidade de substituir uma fase móvelconstituída por acetonitrila: água (50:50), poroutra contendo metanol: água. Qual será acomposição da nova fase para ser “equivalente”? Os valores dos índices de polaridade são P’ACN =5,8; P’ MeOH = 5,1. Substituindo-se os valoresna equação acima, encontraremos que acomposição da nova fase deverá ser 56% MeOH

2009 | v . 1 | n . 1 55


e 44% H2O para ter a força de eluiçãoequivalente à da mistura 50% ACN:50% H2O.Com frequência, a adição de um terceiro solvente (exemplo THF) pode ser necessária para obter-se a separação desejada2. A porcentagem necessária dos principais solventes usados em HPLC paraobter-se fases móveis similares àquelasempregando ACN é mostrada na Figura 4.Deve-se observar que as diferentes viscosidadesdos solventes ocasionam fases móveis queprovocam diferentes quedas de pressão nacoluna. Assim, os valores da Figura 4, assimcomo os obtidos pelas equações anteriores,devem ser vistos como um guia e não como umresultado final para a substituição das fases.

Considerando a atual escassez de ACN nomercado internacional, essa substituição podeser uma boa opção econômica.

6. Mudando os hábitos: a “Green Chemistry”

Várias tentativas (inclusive quando o preço internacional da ACN ainda era “razoável”) foram efetuadas nos últimos 20 anos para substituir-se os solventes orgânicos empregados em HPLC poroutros ambientalmente (e toxicologicamente)corretos. Dentre eles, o de maior sucesso (aindaque modesto até o presente) tem sido o uso defluidos no estado supercrítico, notadamente odióxido de carbono como fase móvel. Apesar de

que nessa técnica se empregam praticamente osmesmos instrumentos e colunas da HPLC, desdeseu surgimento tem sido tratada como uma técnica separada, denominada Cromatografia com FluidoSupercrítico (SFC). Um fluido supercrítico équalquer composto cuja temperatura e pressãoencontram-se, ambos, acima da pressão crítica eda temperatura crítica3. Apresenta propriedadesintermediárias entre os gases e os líquidos, e umaseletividade diferente de ambos. Muitos dosmétodos que empregam solventes orgânicos emHPLC têm sido transformados para SFC, comvantagens. Uma das principais aplicações destatécnica, no presente, é na área farmacêutica,principalmente na separação de isômeros ópticosem que a seletividade e tempo de análise sãobastante mais satisfatórios que a HPLC. Uma vezque o solvente “universal” da técnica é o CO2,além de ambiental e toxicologicamente correto,esta técnica não requer o uso de ACN. Algumasvariações desse método têm sido o uso de água noestado subcrítico4 e o uso de CO2 misturado comsolventes orgânicos, na técnica denominadaCromatografia Líquida com Fluidez Aumentada,EFLC5.

O impacto crescente dos compostosorgânicos no meio ambiente (pesticidas,compostos fluorados, descarga de medicamentos,e muitos outros) tem desenvolvido, ainda que demodo devagar, uma nova consciência a respeitoda preservação do meio ambiente. É a denominda“Química Verde” (“Green Chemistry”), a qualpoderá ter um papel preponderante nos próximosanos. Seguindo esta vertente, a SFC e métodosrelacionados significam um grande avanço daquímica verde nos métodos de separação.

7. Reciclando o solventeDesde o início da HPLC existe uma

preocupação de efetuar o reciclo (reuso) dosolvente, especialmente em operações nas quais osolvente não muda de composição durante aanálise, ou seja, em uma situação isocrática. Nosprimódios da técnica, o efluente saindo da colunaia para o detector e, ao sair deste, erasimplesmente redirecionado para o frasco deeluente, e utilizado como tal. Uma vez que a



Figura 4. Porcentagem necessária de um solvente (MeOH,THF, EtOH, i-Prop, DMSO) necessária para obter-se umafase móvel com força de eluição similar.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Com

pone

nte

Alte

rnat

ivo

(%)

Acetonitrila (%)

% metanol

THF

etanol

i-propanol

DMSO

quantidade de analito que saía do detector eramuito pequena, comparada com a quantidade desolvente, os contaminantes estariam na fase móvel em concentrações da ordem de ppb, o que não era determinado pelos detectores então empregadosem HPLC. O desenvolvimento dos detectoresmais sensíveis, e o acoplamento comespectrometria de massas (LC/MS), juntamentecom a exigência de menores limites dequantificação (LOQ), fizeram com que acontaminação se tornasse indesejável, motivandoo desenvolvimento de sistemas de reciclo da fasemóvel. Os primeiros sistemas eram baseados notempo de retenção dos analitos presentes naamostra. À medida que a corrida se aproximavado tempo de retenção de um analito, a fase móvelque saía da coluna era direcionada para o lixo;passado o tempo de retenção do analito, ela eradirecionada para o frasco da fase móvel. Apesarde executados de forma automática, estessistemas, os quais aparecerem no início da décadade 1970, apresentavam como maior problema ofato de o tempo de retenção poder mudar duranteuma análise devido a vários motivos, incluindomudanças na temperatura da coluna, falta dereprodutibilidade da bomba; entupimento dacoluna e muitos outros. A alternativa existente eraestabelecer uma janela de segurança na coleta dosolvente ao sair do detector, geralmente ao redorde 10 a 15 %, o que acarretava uma diminuiçãoconsiderável na economia de fase móvel. Ageração seguinte de sistemas de reciclo erabaseada em um limite estabelecido para a alturado pico (“threshold”): se o pico do analito saindodo detector fosse superior ao limite estabelecido, o solvente era descartado, e se fosse inferior(portanto a contaminação seria pequena),retornaria ao frasco da fase móvel. A atualgeração de sistemas de reciclo baseia-se emalgoritmos desenvolvidos inicialmente para osintegradores eletrônicos, posteriormenteutilizados nos atuais sistemas de detecção equantificação de picos existentes nos atuaissoftwares de aquisição e tratamento de dados. Osistema é capaz de reconhecer em tempo real queum pico cromatográfico está atingindo o detectore de automaticamente autuar uma válvula paradesviar o efluente da coluna para o descarte. Tão

logo a inclinação do pico chegue a um valorpré-determinado pelo software, indicando que aeluição do componente está concluindo, a válvulade reciclo é novamente acionada e o solvente –isento do analito – é enviado para o frasco da fasemóvel. Neste caso, se o cromatograma apresentamuitos picos, a economia de solvente é bastantemenor, uma vez que parte considerável dosolvente será enviada para descarte juntamentecom os analitos separados. O reciclo de solventestambém não é recomendável para técnicas comoexclusão por tamanho e troca iônica, assim comopara micro-LC, a qual já significa per se umaeconomia substancial de fase móvel, nãojustificando a compra do sistema de reciclo paratal.

8. Aumentando a temperatura em LC

O efeito da programação da temperatura émuito conhecido em cromatografia gasosa,sendo hoje parte essencial de maioria dosmétodos empregados em HRGC (cromatografiagasosa de alta resolução). Em cromatografialíquida, entretanto, este efeito é ainda muitopouco utilizado pelo fato de a otimização dasseparações ser geralmente efetuada comprogramação da fase móvel (ou gradiente da fasemóvel). No início da HPLC observou-se aimportância do controle da temperatura dacoluna, de forma a manter o tempo de retençãoreprodutível. Isso era particularmente importante empregando-se cromatografia líquida em fasereversa, cujo mecanismo de separação é baseadoem processos de partição, os quais pordependerem da solubilidade relativa do analitoentre as fases estacionárias e móvel requerem um controle da temperatura. Posteriormente foiobservado que um aumento na temperatura dacoluna usualmente facilita a solubilização doanalito na fase móvel, encurtando o tempo deretenção e, como consequência, a economia defase móvel. Como regra geral, um aumento de10oC na temperatura de uma coluna operando em fase reversa diminui o tempo de retenção para ametade do valor inicial. Lembrar que o aumentoda temperatura provoca uma diminuição da

2009 | v . 1 | n . 1 57


constante dielétrica (“polaridade”) da água como fase móvel, o que permite seletividades únicasem temperaturas elevadas. Alguns métodosutilizam água pura como eluente, emtemperaturas elevadas, com sucesso. O uso detemperaturas superiores a 80oC deve ser feitocom cautela, pois dependendo da qualidade dafase suas propriedades poderão mudar (consulteseu fornecedor de colunas).

9. Programando a temperatura emCromatografia Líquida

As primeiras tentativas de efetuar-seprogramação de temperatura em cromatografialíquida, na década 1970, falharam porque aespessura do tubo de metal utilizado parapreparar as colunas era muito grande e adistribuição do calor não era unifome, comtemperaturas distintas na parede externa dacoluna (aplicada), na parede interna do tubo deaço e no meio da fase estacionária. No início dadécada de 1980, empregando-se colunas dediâmetro interno 1 mm, denominadas microborena época, foi possível ilustrar-se as primeirasaplicações da programação de temperatura emLC. Atualmente, com o desenvolvimento dascolunas capilares de sílica fundida, de diâmetromuito menor e feitas de material que conduz bem o calor, a programação de temperatura pode serrealizada com maior simplicidade e vantagens. A Figura 5 mostra um exemplo do efeito daprogramação de temperatura em cromatografialíquida capilar, e o resultado na diminuição notempo de retenção do analito (e, como

consequência, economia de solvente). Estudosrecentes empregando colunas convencionais deHPLC (di= 2 a 4,6 mm) sugerem que aprogramação de temperatura pode também serempregada com sucesso para essas colunas6. Aeconomia de solvente será ainda mais críticaneste caso.

10. Mudando características da fase estacionária

Outra maneira de economizar fase móvel é otimizar-se a escolha da fase estacionária demaneira a minimizar o tempo de retenção dosanalitos, mantendo a separação desejada, o quepode ser obtido de diferentes formas.

Diminuindo o comprimento da cadeiaalquílica ancorada na sílica em cromatografia em fase reversa, ou seja, utilizando uma fase menoshidrofóbica, diminuirá o tempo de retenção dosanalitos e, como consequência, o consumo defase móvel. De forma análoga, o tempo deretenção pode ser mantido o mesmo,diminuindo-se a força de eluição da fase móvel,o que pode ser feito diminuindo-se a quantidadedo solvente orgânico na mesma (e, novamente,economizando solvente). Assim, por exemplo, se em uma separação a coluna contémoctadecilsilano (ODS, C-18 ou RP-18), comofase estacionária, mudando-se para octilsilano(C-8 ou RP-8) o tempo de retenção dos analitosdeverá diminuir. Alternativamente, fases comcadeias ainda mais curtas como C-4, C-3 emesmo C-1 são disponíveis comercialmente(lembrar que, diminuindo o tamanho da cadeia



Figura 5. Separação de estatinas por Cromatografia Líquida Capilar com programação detemperatura. Composição da fase móvel 48% ACN e 52% água acidificada com 0,5% de ácidoacético. Programação de temperatura: 1 minuto em 40°C e então 20°C/min até 80°C

permanecendo nesta temperatura até o final da análise. Fluxo da fase móvel: 3 µL/min.7

lateral, a superfície da sílica fica mais exposta einterações como por exemplo com grupossilanóis fica mais fácil, o que pode mudar aseletividade da fase).

Diminuindo a área superficial da faseestacionária (em HPLC esse valor variageralmente entre 90 e 300 m2/g) também é umaforma de diminuir o tempo de retenção eaumentar a economia de fase móvel. A retençãode um analito em cromatografia é proporcional àquantidade de fase estacionária disponível parainteração com o mesmo. Diminuindo a áreasuperficial diminui-se também a quantidade defase estacionária disponível para o analito namesma coluna. Na prática, a maneira maiscomum de diminuir a área superficial é utilizarpartículas com poros maiores (300 A ao invés de100 A, por exemplo).

11. Dicas adicionaisUma forma de diminuir o tempo de

retenção (e economizar fase móvel) é alterar opH da fase móvel, especialmente se oscompostos de interesse tiverem caráter ácido oubásico e fase reversa estiver sendo utilizada(neste modo os compostos de caráter neutro nãosão afetados por mudanças no pH da fase móvel). Caso a idéia seja manter o tempo de retençãocom a mudança de pH, um ajuste, diminuindo aquantidade do solvente orgânico da fase móvel,deve ser executado. É necessária cautela quandoda alteração do pH para valores muito ácidos oumuito básicos, pois certas fases estacionárias não suportam grandes variações de pH e sedeterioram irreversivelmente. Verifique adocumentação fornecida com a coluna, ouconsulte o fabricante da mesma antes de mudardrasticamente o pH da fase móvel.

Muitas vezes o tempo de análise equantidade de fase móvel usadas podem serbastante reduzidos, trocando-se o modocromatográfico. Por exemplo, muitas separaçõesdifíceis de serem realizadas por troca iônicapodem ser obtidas com sucesso, empregando-secromatografia em fase reversa comemparelhamento de íons. Muitos fármacos sãomelhor separados por cromatografia em fase

normal do que em fase reversa, apesar de que esta última opção continua sendo a mais empregada emuitos analistas sequer tentam o uso de fasenormal – a qual evita por completo o uso deacetonitrila.

12. ConclusõesAcetonitrila é o solvente orgânico mais

empregado em cromatografia líquidaatualmente. A grande maioria dos métodos queoperam com fase reversa foram desenvolvidos, evalidados, empregando acetonitrila como parteda fase móvel. Fatores contextuais internacionais recentemente elevaram o preço da ACN nomercado internacional a valores muito elevados,juntamente com a imposição de racionamento dacompra do mesmo. Portanto, urgem novasmedidas para enfrentar a nova situação (no sitede uma grande empresa americana de peptídeos,eles anunciam que uma grande equipe estárealizando um combate contra a escassez deacetonitrila). Neste artigo são sugeridas dezalternativas para conseguir-se diminuir oumesmo eliminar o uso de ACN , através dediferentes enfoques. Um dos mais populares nomomento está sendo um novo salto, similar aoque ocorreu no desenvolvimento da HPLC, oqual recomenda uma miniaturização da colunacromatográfica: diminuição no diâmetro internoda coluna (micro-LC ou nano-LC) com imensaeconomia de solvente, ou no comprimento dotubo (fast-LC, UHPLC, UPLC, e outros nomes)com consequente diminuição no diâmetro médiodas partículas para valores entre 1,5 e 1,8mícrons. Esta última opção permite umaeconomia menor de fase móvel quandocomparada com a micro-LC, porém permiteeconomia de tempo de análise maior. Essasopções implicam mudanças no equipamento eaquisição de novas colunas. Outra alternativaapresentada é a substituição da ACN por outroseluentes; um grande esforço tem sido feito parauso de metanol na substituição. Essa alternativanão exige mudanças no instrumento, nem decoluna. Aumento na temperatura de eluição emudanças no pH da fase móvel são tambémalternativas interessantes, porém o usuário deve

2009 | v . 1 | n . 1 59


consultar antes a documentação de sua coluna,pois a maioria das colunas de HPLC foramprojetadas para operar em temperaturas baixas edentro de uma faixa estreita de valores de pH.

Independentemente da alternativa, ousuário de ACN como fase móvel para HPLCdeve estar atento para o fato de que o custo dosolvente aumentou muito, inclusive no Brasil,sua disponibilidade diminuiu bastante, e aprojeção de melhora dessa situação a curto emédio prazo parece fora de cogitação. É omomento de os cromatografistas aprenderem autilizar as ferramentas disponíveis, e entenderem que a acetonitrila não é a única fase móvel paracromatografia líquida. Mãos à obra, faça suaescolha, e sucesso.

Referencias Bibliográficas1. Sigma-Aldrich. Availability of acetonitrile. Disponível

em: <http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs

/Sigma-Aldrich/General_Information/acetonitrile_shor

tage.Par.0001.File.tmp/acetonitrile_shortage.pdf>.

2. Lanças, F.M. Cromatografia Líquida Moderna, Editora

Átomo, Campinas (SP), 2009.

3. Lanças, F.M., Supercritical Fluids; Dekker

Encyclopedia of Chromatography, J.. Cazes (Ed.),

Marcel Dekker, USA (2001).

4. Lanças, F.M., J.S. Pinto, J. Braz. Chem. Soc. [online].

2006, v. 17, n. 1, pp. 85-89.

5. Olesik, S.V. J. Chromatogr. A, 1037, 405-410 (2004).

6. Vanhoenacker, G, Pat Sandra, J. Sep. Sci.,1822 – 1835

(2006).

7. Monteiro, A.M., Coutinho, L., Santos Neto, A.J.,

Lanças, F.M., resultados não publicados, 2008.



1. IntroduçãoNa língua portuguesa, “rastrear” deriva de

“rastejar”, a qual tem como significado seguir(alguém ou algum animal) pelo rasto, tambémencontramos palavras como inquirir, investigar,aproximar-se de, entre outras1.

Segundo os padrões internacionais (ISO8402), rastreabilidade é definida como ahabilidade de descrever a história, aplicação,processos ou eventos e localização, de umproduto, a uma determinada organização, pormeios de registros e identificação. De um modomais simples, rastrear é manter os registros

2009 | v . 1 | n . 1 61


Rastreabilidade

Flávio Leite

Diretor-Proprietário da T& E AnalíticaCampinas (SP)Brasil

ResumoA Rastreabilidade é uma ferramenta do analista (um ser humano), para encontrar erros analíticos, reduzir

tempos, avaliar a ação dos reagentes, avaliar o desenvolvimento etc. A

Rastreabilidade é um ponto importante da análise e não se deve permitir

que seja transformada em um instrumento contra o resultado, o produto

e a instituição. O objetivo deste artigo é mostrar que a Rastreabilidade

deve existir, mas, não deve chegar aos extremos do racional ou da

confiança.

AbstractTraceability is a tool that belongs to the analyst (a Human being) used to find analytical mistakes, reduce

analysis time, to evaluate the reagents action, and so on. Traceability is a

very important aspect of the whole analysis and should not be

transformed into a tool against the result, the production and the

Institution. The main goal of this paper is to show that Traceability has

to exist but it should not achieve the extremes of the rational as well as

the confidence.

Palavras-chave

Rastreabilidade, erros analíticos,

garantia da qualidade, acreditação.

Keywords

Traceability, analytical errors,

quality assurance, accreditation.



necessários para identificar e informar os dadosrelativos à origem e ao destino de um produto.Em outras palavras, rastrear é campear algumacoisa para saber o máximo sobre ela (o que é, deonde veio, como foi feito e para onde foi) e,assim, prosear com segurança sobre o assuntosem medo de errar. A rastreabilidade tornou-semoda no final da década de 1990, mas já era feita, ainda que de modo incompleto, há bastantetempo na produção animal brasileira e mundial.As fichas de acompanhamento dos lotes defrangos de corte, poedeiras e suínos é, naverdade, uma forma de rastreabilidade. Com opassar do tempo, as informações nelas contidasse tornaram insuficientes para abranger oprocesso na sua totalidade. A formação de blocos econômicos como o EU, Nafta, o Mercosul eoutros; o desenvolvimento dos estudos sobre asaúde pública; o controle regional de algumasdoenças e etc. geraram o aumento das exigênciasdos consumidores sobre as informações dosprodutos que eles adquirem. Assim, por motivoseconômicos, sanitários e políticos, produtores,países e organizações desenvolveram e praticamos processos de rastreamento para oferecer asinformações exigidas e assegurar as suasparticipações nos mercados local, regional eglobal2.

Quando o assunto é Rastreabilidade emquímica, a sigla CITAC (Cooperation onInternational Traceability in AnalyticalChemistry) deve ser pesquisada, pois éconsiderada a mais importante instituiçãointernacional de rastreabilidade em QuímicaAnalítica. A CITAC (http://www.citac.cc), nosúltimos anos, tem procurado alinhar ao máximoos padrões e materiais de referência em química,desta forma criando unificação em nível global.

Há várias citações de uso deRastreabilidade como, por exemplo, as períciasde acidentes de trânsito, ou ainda de crimescontra a pessoa; a Rastreabilidade é encontradano cruzamento das evidências. A cena de umacidente ou de um crime contra a pessoa deve serpreservada, pois qualquer modificação podelevar a conclusões não pertinentes, e o fato ficadesacreditado. Na metrologia, para calibração de equipamentos de medidas, a Rastreabilidade épadronizada em seus limites, devido à existência

de referências reais com parâmetros muitas vezes internacionais, como o metro, o grama etc. Narealidade, a Rastreabilidade tem seu início naorganização de pesquisas científicas, nos quaisos passos são sempre acompanhados de registrosprecisos, tendo em vista que um fato podeocorrer e a necessidade de saber qual o momentoé fundamental; como exemplo, a pesquisa sobreum novo polímero, em que a massa adicionada, aenergia de agitação, a temperatura, aluminosidade, o material de sustentação, asmatérias-primas, os tempos, a sequência deadições e as observações constantes são osprincipais parâmetros para poder voltar econseguir entender e reproduzir o fato.

Atualmente, em Análise Química, existemdois tipos de entendimento sobre a Rastreabilidade.

a. De Referência: Diz respeito aolaboratório estar utilizando referênciaspadronizadas ou confiáveis para aanálise de identificação e quantificação, para os resultados obtidos por qualquerprocedimento analítico, da mesmaforma, garantir que calibraçõesreduzam os erros dos equipamentos demedidas. As auditorias verificam aexistência das referências, a capacidadede fazer, validades, validações,armazenamentos, calibrações entreoutras. Enfim o laboratório, como umtodo, tem a acreditação.

b. Da Investigativa Comprobatória: Dizrespeito à comprovação de a análise ter sidorealizada, ou seja, sobre os diferentesmomentos entre a análise do ativo e acomprovação da análise desse ativo. Oaspecto científico é praticamente restrito aodesenvolvimento e validação dametodologia. Após a conclusão dessasetapas, vem o controle de fabricação doproduto, denominado de controle dequalidade. A partir desse momento ocorreum desequilíbrio na balança da análise, naqual a formação do profissional na busca damelhor condição analítica (pesquisa edesenvolvimento) entra em choque com acomprovação de a análise ter sido realizada.

Se imaginarmos restrições ou barreirascomerciais, ou ainda, para desacreditar de ouacreditar em um resultado, basta aumentar o grau de verificação de fatos registrados sobredeterminada análise. Quando se busca aRastreabilidade, sem limites racionaispré-estabelecidos, a probabilidade será maiorpara a desacreditação da análise.

2. Situações práticasSaindo do filosófico, para exemplos

práticos, considere-se uma titulação do tipoácido-base na qual se busca determinar aconcentração de um ácido. Para realizar essaanálise, precisa-se de água, de uma base, de umindicador e vidrarias.

Pensando na água (se achar interessante,extrapolar para outro tipo de análise), com amelhor das intenções analíticas, há de se garantirque ela esteja sob controle. Portanto, a origem damesma, a filtração, a presença demicroorganismos, a quantidade de orgânicos, aquantidade de ametais, de semi metais, demetais, a acidez, enfim análises que levam aoconhecimento de potabilidade ou deultra-pureza, sobre qualquer desses parâmetros,devem ser efetuadas uma vez que podemlevantar dúvidas sobre o quanto um constituinteinterferirá na análise.

Imaginemos uma auditoria, considerada“normal” (Quadro 1), e uma outra considerada“crítica “(Quadro 2).

QUESTIONAMENTOS RESPOSTAS

1-Qual a origem desta água? Rede pública

2-Há filtração? Sim, antes do equipamento

3-Após a filtração qual o tratamento?

Destilação

4-Há microorganismos? 100 UFC

5-Como é armazenada esta água? Em garrafões de vidro

6-Quanto tempo fica armazenada esta água?

1 mês

7- Qual o pH da água? 6,5

8-Qual o uso desta água? Enchimento da pisseta epreparação da amostra.

Quadro 1. Simulação de uma auditoria “normal”.

QUESTIONAMENTOS RESPOSTAS

1-Qual a origem desta água? Rede pública

2-Foi realizada análise baseado na Port.518?

Não, pois é rede pública

3-Há filtração? Sim, antes do equipamento

4-Quantos e quais os tipos de filtros?

Dois filtros e filtros de porcelana

5-Após a filtração qual o tratamento?

Destilação

6-Houve tratamento sobreresinas tipo para ultrapurificação?

Não, pois não é necessáriopara análise ora realizada

7-Há microorganismos? 100 UFC

8- Foram identificados asespécies de microorganismos?

Não, pois se acreditou naágua proveniente da redepública e com baixo teor

9-Como é armazenada esta água? Em garrafões de vidro

10-Como o garrafão é lavado ecom qual periodicidade?

Lavado por esfregão decepilho e água destiladarecente. Lavagem mensal.

11-Quanto tempo ficaarmazenada esta água?

1 mês

12-Durante o período dearmazenagem é feito análisesmicrobiológicas?

Não.

13- Há contato água-ar dolaboratório?

Existe a possibilidade

14- Qual o pH da água? 6,5

15- O pHmetro foi calibrado?Quando?

Sim. É verificada comsoluções, sempre naprimeira medida do dia.

16-Qual o uso desta água? Enchimento da pisseta epreparação da amostra.

Quadro 2. Simulação de uma auditoria “crítica”.

Pode-se ter um item a, por exemplo, maiscrítico que o item b; talvez um item d, maiscrítico que o item c que comece a aumentar aproporção de não atendimento das perguntas.Pode-se também iniciar questionamentosarbitrários levando dúvidas à validade da análise, como exemplo: sendo uma titulação ácido base,foram neutralizados os 10 mL de água dediluição da amostra? Foi analisado o parâmetroradioatividade da portaria 518? Osmicroorganismos poderiam decompor o ácidoorgânico?

Além da água, temos o reagente da base,que poderá receber solicitação de verificaçãoanalítica dos itens que constam do rótulo, pormetodologias referenciadas, validadas ou aindacovalidadas, cadeias de custódia etc. Sem

2009 | v . 1 | n . 1 63


alongar em exemplos, nesta mesma análise, há oindicador, a solução etanólica do indicador, asvidrarias e suas calibração, a temperatura dolaboratório, o termômetro deverá estar calibrado, preferencialmente via RBC (Rede Brasileira deCalibração).

Para evitar suspeitas ou que a análise sejainvalidada, toda uma equipe de qualidade,juntamente com os analistas deverão criarmecanismos para que as informações sejam fiéis.

Se considerada confiável, pode-se iniciara análise. Entre um e dois minutos obtém-se a“viragem” titulométrica. O valor deve serimediatamente registrado na folha de dadosbrutos, juntamente com os anteriormenteanotados, massas, identificação da amostra, dolocal, dos códigos etc. com todas as passagens decálculo, estas escritas didaticamente, para queoutra pessoa possa entender o raciocínio passo apasso.

Com toda a documentação comprobatóriaem ordem cronológica, para que os tempos desde a compra dos reagentes até a realização daanálise estejam em sequência, faz-se o boletimanalítico em uma folha A4 contendo nome doativo e valor encontrado. Após, a emissão doboletim a UGQ (unidade de garantia dequalidade) verificará, em dupla conferência, toda a documentação em suas devidas conformidadese firmará sua assinatura junto com as demais. Secompararmos os tempos, dedicou-se muito maisà comprovação do que à análise. Notar que nãofoi levantada a questão da amostragem ou darecepção da amostra no laboratório. O custoanalítico cresce proporcionalmente ao grau decontrole aplicado.

3. Considerações FinaisO objetivo deste trabalho, no que concerne

à análise química, não é criticar e nem darferramentas para a Rastreabilidade. Talvez emsua avaliação esteja exagerado ou faltarammedidas. O objetivo é mostrar que aRastreabilidade deve existir, mas, não devechegar aos extremos do racional ou da confiança. A Rastreabilidade é uma ferramenta do analista(um ser humano), para encontrar erros analíticos, reduzir tempos, avaliar a ação dos reagentes,avaliar o desenvolvimento etc. A Rastreabilidade é um ponto importante da análise e não se devepermitir que seja transformada em uminstrumento contra o resultado, o produto e ainstituição.

Em conclusão, dar limites eresponsabilidades bem definidos para o sistemaRastreabilidade é garantir que as credibilidadesconquistadas com tanto esforço não se destruam.Rastreabilidade total é utopia1.

Referências bibliográficas1. Leite, F. Validação em Análise Química, Editora

Átomo, Campinas (SP), 5ª. edição (2008).

2. FATEC S. A. Rastreabilidade. Disponível em:

<www.fatec.com.br/rastreabilidade.html.>



2009 | v . 1 | n . 1 67


Cromatografía de gases como herramienta deestudio de la composición química y capacidad antioxidante de especies vegetales ricas entimol y carvacrol, cultivadas en Colombia

Amner Muñoz-Acevedo, Jairo R. Martínez y Elena E. Stashenko*

Laboratorio de Cromatografía, Centro de Investigación en Biomoléculas – CIBIMOLCentro de Investigación de Excelencia – CENIVAM, Carrera 27 calle 9. [email protected]

ResumenSe determinó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) la composición química

de extractos y aceites esenciales (AE) aislados por destilación-extracción simultánea con solvente (SDE), extracción con

fluido supercrítico (SFE) e hidrodestilación asistida por la radiación de microondas (MWHD), de especies vegetales

pertenecientes a las familias Lamiaceae (Thymus vulgaris, Plectranthus amboinicus, Satureja brownei y Origanum

majorana) y Verbenaceae (Lippia origanoides y Lippia micromera). La capacidad antioxidante de los aceites esenciales

con alto contenido de timol y carvacrol, de las especies T. vulgaris, P. amboinicus, L. origanoides y L. micromera, se

determinó usando los ensayos de decoloramiento del catión-radical ABTS+. por metodologías convencional y con

dilución en microplacas, y el de oxidación del ácido linoleico, inducida por

Fe+2 en presencia de O2. La capacidad de atrapamiento de radicales medida

en el ensayo con ABTS+. fue mayor para los aceites esenciales que

contenían carvacrol, como constituyente mayoritario (P. amboinicus ≥ L.

origanoides), que para los aceites que ricos en timol (T. vulgaris > L.

micromera). Tanto los compuestos puros como los aceites esenciales

evaluados mostraron tendencias similares en los resultados de los dos tipos

de ensayo de capacidad antioxidante empleados.

AbstractThe chemical composition of both extracts and essential oils

isolated from Lamiaceae (Thymus vulgaris, Plectranthus amboinicus,

Satureja brownei and Origanum majorana) and Verbenaceae (Lippia

origanoides and Lippia micromera) families by Distillation-Solvent

Extraction (SDE), Supercritical Fluid Extraction (SFE), and

Microwave Assisted Hidrodistillation (MWHD) was determined by

Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC/MS)

Palabras clave

GC-MS, GC-ECD, MWHD, SDE,

SFE, timol, carvacrol, aceites

esenciales, Lamiaceae, Verbenaceae,

oxidación del ácido linoleico, ensayo

ABTS+.

Keywords

GC-MS, GC-ECD, MWHD, SDE,

SFE, timaol, carvacrol, essential oils,

Lamiaceae, Verbenaceae, linolei

acid oxidation, analysis, ABTS.

* Los autores agradecen la financiación del trabajo a través del Contrato RC-432-2004 Colciencias -CENIVAM. A.M.A. agradece aColciencias por su apoyo económico a través de una beca doctoral.

1. IntroducciónLa familia Lamiaceae comprende unos

210 géneros y alrededor de 3.500 especies, queincluyen hierbas perennes y algunos subarbustosque contienen aceite esencial distribuido entodas las partes de la planta1. Los génerosThymus, Origanum, Satureja, Thymbra, hacenparte de esta familia, siendo el género Origanumel que provee la fuente más conocida de especiesde orégano – tipos griego y turco2. Por otro lado,la familia Verbenaceae, distribuidaprincipalmente en los trópicos, subtrópicos yalgunas zonas templadas, consta de 86 géneros y1.900 especies, con un gran número de plantas de interés económico, que proporcionan maderas(Tectona grandis, géneros Melina, Vitex, etc.),aceites o frutos comestibles (Verbena officinalis,Aloysia citrodora), poseen un valor ornamental(Lantana sp., Duranta sp.) y jardinería y además, gozan de diversas propiedades medicinales3,4.

Los fenoles naturales timol y carvacrol,han sido identificados como componentesprincipales en muchos de los aceites y extractosaislados de las especies pertenecientes a losgéneros Origanum, Lippia, Satureja y Thymus,con variaciones en su contenido4. Tanto los dosfenoles monoterpénicos como los aceitesesenciales y extractos que los contienen, handemostrado propiedades biológicas notablescomo agentes antifúngicos, antibacteriales yantioxidantes5, lo que abre la posibilidad deemplearlos como conservantes para alimentos ycosméticos6, por lo menos, donde su uso no estéafectado por sus características organolépticas.Debido a la relación existente entre timol ycarvacrol y sus potenciales actividades, muchosestudios se han enfocado en la determinación dela composición química de especiespertenecientes a los géneros Thymus, Origanum,Satureja, Thymbra, etc.

La búsqueda de antioxidantes de origennatural es un tema actual, debido a que estassustancias se usan ampliamente en alimentos ycomo ingredientes de muchos preparadosfarmacéuticos y permiten reemplazar losantioxidantes sintéticos debido a las restricciones

generadas por la posible carcinogenicidad deestos últimos7. Diversas especies autóctonas, ricas en timol y carvacrol, son interesantes comoposibles fuentes de extractos y aceites esencialescon propiedades biológicas beneficiosas, entreellas, antioxidantes8.

En este trabajo, se aislaron por métodosextractivos (SDE y SFE) y destilativos (MWHD) e identificaron por GC-MS, los metabolitossecundarios volatiles de seis especies vegetales,ricas en timol y carvacrol, cultivadas en la granjaexperimental del Centro de Investigación deExcelencia CENIVAM. Se evaluó la capacidadantioxidante in vitro de los aceites esenciales deL. origanoides, L. micromera, P. amboinicus yT. vulgaris, ricos en timol o carvacrol, usandodos métodos: el ensayo de decoloración delcatión radical ABTS+. en modos convencional yen microplacas, y el monitoreo de la oxidacióndel ácido linoleico por medio de la cuantificación del hexanal (derivación y análisis GC-ECD),producto final de su degradación oxidativainducida por Fe+2 en presencia de O2.

2. Experimental

2.1. Reactivos

Los patrones certificados utilizadosfueron Trolox® (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico; 97%,), ABTS (ácido 2,2`-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico; 99%), α-tocoferol (97%), BHA(99%), BHT (99%), timol (99%), carvacrol(99%), pentaflúorfenilhidracina, PFPH (97%),hexanal (98%), acido linoleico (97%) adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU.).Persulfato de potasio (97%), sulfato de hierro(98%), dodecilsulfato de sodio (98 %), Tris,cloruro de potasio y n-tetradecano fueroncomprados a Merck (Darmstadt, Alemania).Gases especiales para cromatografía seobuvieron de Aga-Fano S.A. (99,995-99,999%,Bogotá, Colombia). Todos los solventes(metanol, etanol, hexano, agua) fueron gradoHPLC de Mallinckrodt Baker Inc. (J.T. Baker,Phillipsburg, EE.UU.).



2.2. Material vegetal

Las hojas de T. vulgaris, P. amboinicus, L. origanoides, L. micromera, S. brownei y O.majorana se obtuvieron de plantas frescas,cultivadas en el Complejo Agroindustrial PilotoCENIVAM en la Universidad Industrial deSantander, de la ciudad de Bucaramanga(Colombia). La identificación taxonómica demuestras botánicas se llevó a cabo en el Institutode Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias,Universidad Nacional de Colombia (Bogotá).Los pliegos testigo de cada planta quedarondepositados como muestra permanente en elHerbario Nacional Colombiano (COL, Bogotá),así: Lippia origanoides (Nº COL 512270),Lippia micromera Schauer (Nº COL 519797),Plectrantus amboinicus (Lour.) Spreng (Nº COL 523701) y Satureja brownei (Sw.) Briqn (NºCOL 519796). Las plantas fueron identificadaspor el doctor J.L. Fernández, a quien los autoresexpresan su agradecimiento. O. majorana y T.vulgaris fueron cultivadas en la granjaexperimental de CENIVAM a partir de semillascertificadas (Fercon Ltda., Cali, Colombia).

2.3. Métodos

2.3.1. Destilación-extracción simultánea con solvente (SDE)

Los metabolitos secundarios de lasespecies se extrajeron utilizando un equipo tipoLikens & Nickerson a microescala, modificadopor Godefroot para solventes de alta densidad9.Se utilizaron 10 g de material vegetal finamentepicado y como solvente de extracción,diclorometano (2 mL), durante un tiempo de 1 h20 min para el aislamiento de los volátiles. Delextracto obtenido se inyectó 1 µL directamente al GC-MS.

2.3.2. Extracción con fluido supercrítico (SFE)

Para la obtención de los componentes demediana a baja volatilidad presentes en lasplantas de interés se utilizó un extractor Soxhletde alta presión (J & W Scientific, Folsom, CA,EE.UU.), con base en la metodología descritapor Stashenko et al.10 y se utilizó el materialvegetal (10 g ) junto con hielo seco (300 g) (CO2)

como fuente de fluido supercrítico. La extracción se llevó a cabo entre 45-50°C durante 2 h, a unapresión de 1100 psi. El extracto obtenido sedisolvió en diclorometano (2 mL) y un 1 µL de lasolución se inyectó al GC-MS.

2.3.3. Hidrodestilación asistida por la radiación de microondas (MWHD)

Se realizó en un equipo de destilación tipoClevenger con reservorio de destilaciónDean-Stark usando como fuente de calor unhorno microondas (Kendo, modelo MO-124,2450 MHz, 700 W). El material vegetal (300 g)se introdujo en un balón (1L) con agua (300 mL). Se realizaron 3 extracciones consecutivas con untiempo de extracción individual de 20 min. Elaceite esencial se separó del agua pordecantación y una alícuota del aceite (50 µL) sediluyó en diclorometano (1 mL) para el análisiscromatográfico. Todas las extracciones serealizaron por triplicado y los datos de cantidadrelativa de cada compuesto en la mezcla sepresentan como el promedio de tres extracciones.

2.4. Ensayos de capacidad antioxidante

2.4.1. Decoloramiento del catión-radical ABTS+.

La capacidad de atrapamiento delcatión-radical ABTS+ se llevó a cabo por lametodología descrita por Re et al11, medianteespectroscopía VIS (espectrofotómetro Genesys20, Thermospectronic, Waltham, EE.UU.) a 734nm. Se preparó una solución de ABTS+. (7 mM)con persulfato de potasio (2,45 mM) disueltos enagua (5 mL) grado HPLC, dejándose reaccionardurante 16 h a temperatura ambiente y enausencia de luz, y ajustando la absorbancia hasta0,700±0,02. Las muestras fueron diluidas hastaque la adición de 30 µL de ellas a 3 mL de lasolución de ABTS+., resultara en una inhibiciónentre el 20 y el 80 % del blanco de la absorbancia. El porcentaje de inhibición medido a los 6 min se graficó como una función de la concentraciónevaluada. La respuesta-concentración de lassustancias, como porcentaje de la absorbanciadel catión-radical ABTS+. sin inhibir se calculóde acuerdo con la Ecuación 1.

2009 | v . 1 | n . 1 69


Inhibición de A734 (%) =(eq.1)

= (1-Af/Ao) x 100

Donde Ao es la absorbancia delcatión-radical sin inhibir y Af es la absorbanciamedida a los 6 min después de la adición delantioxidante. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se utilizaron Trolox® (sustancia dereferencia) y sustancias “control” α-tocoferol(vitamina E), BHT y BHA. Para estas sustanciasse determinó la actividad antioxidante total TAA(mmol de Trolox®/kg sustancia evaluada).

2.4.2. Medición en microplacas

La solución del catión-radical ABTS+. sepreparó de la forma descrita en el Numeral 2.4.1,pero las diluciones y las mediciones se realizaron en microplacas (Versamax, Molecular Devices,Sunnyvale, EE.UU.). Para las sustanciasevaluadas, se prepararon soluciones stock de1x10-3 M, las cuales se diluyeron hasta que,después de introducir alícuotas de 10 µL de estassoluciones a las nuevas soluciones de ABTS+

(200 ?L), se produjeran inhibiciones entre el 20 y 80% de la absorbancia del blanco. El porcentajede inhibición medido a los 30 min se graficócomo una función de la concentración evaluada.La respuesta-concentración se calculó con baseen la Ecuación 1. Todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado y para el cálculo del TAA seutilizó la relación entre las concentracionesinhibitorias al 50% (IC50) de Trolox® y lassustancias evaluadas.

2.4.3. Inhibición de la oxidación del ácido linoleico

Para el ensayo in vitro de la oxidación delácido linoleico se siguió la metodología descritapor Tamura y Yamagami12. El ácido linoleico(8,9 mM) se diluyó con solución buffer deTrizma (0,25 mM, pH 7,4), compuesta de KCl(0,75 mM) y dodecilsulfato de sodios (2000ppm). La peroxidación lipídica se indujo poriones Fe+2 [sulfato de hierro (20 mM) enpresencia de oxígeno]. Seguidamente, se leañadió la solución antioxidante (AE, sustanciasde referencia y patrones) en concentraciones de10,0 g/L (0,5 mL). La incubación se efectuó a37°C durante 16 h en un cuarto oscuro y se

detuvo la reacción adicionando una soluciónalcohólica de BHT (90,8 mM).

El hexanal, producto final principal de ladegradación oxidativa del ácido linoleico, se utilizó como marcador del avance del proceso, para lo cual éste se derivó con pentaflúorfenilhidracina (PFPH)en hexano (6800 ppm) seguido de la extracciónlíquido-líquido en fase condensada, según lametodología descrita por Stashenko et al.13. Cadasolución se inyectó luego al GC-ECD para suanálisis cromatográfico.

Los efectos protectores de los aceitesesenciales y las sustancias de referencia ypatrones se determinaron mediante la Ecuación2, usando el valor del área del pico del derivadodel hexanal, en los cromatogramas de losproductos de oxidación del ácido linoleico(derivatizados con PFPH).

Efecto protector (%) =(eq.2)

= (ABlanco - ASustancia/ABlanco) x 100

ABlanco: Área del derivado del hexanaldeterminada en el sistema sometido aperoxidación sin antioxidante (blanco); ASustancia: Área del derivado del hexanal determinada en elsistema sometido a peroxidación en la presenciade antioxidante.

2.5. Análisis cromatográfico

2.5.1. GC-MS

El análisis cromatográfico de los extractos y aceites se realizó en dos equipos:

Equipo I – Cromatógrafo de gases AgilentTechnologies 6890 Plus (Agilent Technologies,Palo Alto, CA, EE.UU.) acoplado a un detectorselectivo de masas Agilent Technologies MSD5973 (EI, 70 eV), con una columna capilar apolarDB-5MS (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 60 m (L) x 0,25 mm (D.I.) x 0,25 ?m (df), confase estacionaria de 5%-fenil-poli(metilsiloxano).Se utilizó helio como gas de arrastre (99,999%,Aga-Fano S.A., Bogotá, Colombia), presión deentrada en la cabeza de la columna de 30 psi y unavelocidad lineal de 26 cm/s. Volumen deinyección fue de 1 µL, la inyección se realizó enmodo split (1:30). La rampa de calentamiento delhorno fue de 45ºC durante 5 min, @ 4ºC/minhasta 150ºC (2 min), @ 5ºC/min hasta 250ºC (5



min) y @ 10ºC/min hasta 275ºC (15 min). Lastemperaturas del inyector, la cámara de ionización y la línea de transferencia se mantuvieron en 250,230 y 285°C, respectivamente. Los datoscromatográficos se procesaron con el programaMS ChemStation (Version 1.05).

Equipo II – Cromatógrafo AgilentTechnologies 6890 Network Series GC System(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) ydetector selectivo de masas (MS) AgilentTechnologies 5975 (EI, 70 eV), con columnacapilar polar DB-Wax (J & W Scientific, Folsom,CA, EE.UU.), de 60 m (L) x 0,25 mm (D.I.) x 0,25 µm (df), con fase estacionaria entrecruzada einmovilizada de poli(etilenglicol). Laprogramación de la temperatura del horno fue de45ºC (5 min) hasta 150ºC (3 min) @ 3ºC/min, yhasta 220ºC (5 min) @ 4ºC/min. Presión deentrada en la cabeza de la columna de 30 psi y unavelocidad lineal de 26 cm/s. Volumen deinyección fue de 1 µL, la inyección se realizó enmodo split (1:30). Las temperaturas del inyector,la cámara de ionización y la línea de transferenciase mantuvieron en 250, 230 y 250°C,respectivamente. Los datos cromatográficos seprocesaron con el programa MS ChemStation(Version D.02.00.275).

Los índices de retención se calcularonusando datos de GC de una serie homóloga dehidrocarburos alifáticos saturados C10–C25,analizados bajo las mismas condiciones usadas enGC (Equipos 1 y 2) para cada aceite o extracto. Laidentificación de los compuestos presentes en losaceites y extractos se realizó por comparación delos espectros de masas con los de las bases dedatos Wiley138K, Adams 2004 y NIST 2002 ypor comparación de los índices de retención yespectros de masas reportados en la literatura14,15,así como con los obtenidos con sustancias patrón.

2.5.2. GC-ECD

La determinación del hexanal en forma desu derivado hidrazónico, C6-PFPH, se llevó caboen un cromatógrafo de gases HP5890A Series II,(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) coninyector split/splitless (relación split 1:10),equipado con un detector de captura deelectrones 63Ni (ECD), operado a 280°C, con gas

auxiliar Ar/CH4 (mezcla 10:1, flujo de 10mL/min). Se usó una columna capilar HP-5[5%-fenil-poli(metilsiloxano)] de 30 m x 0,25mm (D.I.) y con un espesor de fase estacionariade 0,25 µm. El gas de arrastre fue helio(Aga-Fano S. A., 99.995%, Bogotá, Colombia)con presión de entrada de 15 psi y un flujo de 1mL/min. La programación de la temperatura delhorno fue desde 100°C con una rampa de10°C/min, hasta 250°C mL durante 5min.

3. Resultados y discusión

3.1. Composición química

Con el fin de seleccionar las especies ricasen timol y carvacrol, se seleccionaron losextractos obtenidos por SDE, con base en lascantidades relativas de estos dos componentes deinterés. Se encontró que O. majorana y S. browneicontenían los dos fenoles a nivel de trazas y comoconstituyentes minoritarios (<3%). Entre loscomponentes mayoritarios identificados en losextractos obtenidos por SDE de las 6 especiesreportadas, se encontraron el carvacrol, timol,mentona, pulegona y terpinen-4-ol en cantidadesrelativas entre 25-62%. El terpinen-4-ol fue elconstituyente principal para O. majorana;mientras que, mentona y pulegona lo fueron paraS. brownei. Las otras cuatro especies (L.micromera, L. origanoides, T. vulgaris y P.amboinicus), sí contuvieron a timol y carvacrolcomo componentes principales (>30%). Laclasificación, con base en familias de compuestosy contenido de timol y carvacrol, de los aceites yextractos de las especies vegetales obtenidos porMWHD, SDE y SFE se presenta en la Tabla 1.

En general, en los extractos obtenidos porSDE y SFE y en los aceites esenciales de lasespecies L. micromera, L. origanoides, T.vulgaris y P. amboinicus, se encontraron timol ycarvacrol como componentes principales; sinembargo, para el extracto SFE de P. amboinicus,los hidrocarburos no terpénicos, C20 – C30,fueron los constituyentes más abundantes(63,5%). En ningún otro extracto SDE y aceitesesenciales de las plantas bajo estudio, sedetectaron hidrocarburos no terpénicos. Por otro

2009 | v . 1 | n . 1 71




Tabla 1. Clasificación de los aceites y extractos estudiados, por familias de compuestos y contenido de timol y carvacrol.

Planta Parte usadaRendimientoaceite (p/p)

Familia de compuestos, cantidad relativa (%)

Constituyentes SDE MWHD SFE

L. micromera Hojas 16%

Timol 341 258 328

Carvacrol 10 35 15

Monoterpenoides 388 366 287

Sesquiterpenoides 53 100 115

Otros compuestos* 144 165 140

Hidrocarburos** ---------- ---------- 25

L. origanoides

Flores ----------

Timol 69 ---------- ----------

Carvacrol 423 ---------- ----------

Monoterpenoides 311 ---------- ----------

Sesquiterpenoides 78 ---------- ----------

Otros compuestos* 39 ---------- ----------

Hojas 23%

Timol 106 143 88

Carvacrol 426 444 518




Hidrocarburos** ---------- ---------- 34

O. majorana Hojas ----------

Timol tr ---------- ----------

Carvacrol ---------- ---------- ----------



Otros compuestos* ---------- ---------- ----------

P. amboinicus Hojas 1%

Timol 9 8 ----------

Carvacrol 620 537 142



Otros compuestos* 25 ---------- 147

Hidrocarburos** ---------- ---------- 635

S. brownei Hojas ----------

Timol 20 ---------- ----------

Carvacrol 9 ---------- ----------



Otros compuestos* 78 ---------- ----------

T. vulgaris Hojas 2%

Timol 363 347 208

Carvacrol 43 64 31




Hidrocarburos** ---------- ---------- 339

*Alcoholes, cetonas y éteres**Hidrocarburos no terpénicos

2009 | v . 1 | n . 1 73


Tabla 2. Identificación y cantidad relativa (%) de los metabolitos secundarios volátiles, obtenidos por diferentes métodos de

extracción de S. brownei, O. majorana, L. origanoides, L. micromera, P. amboinicus y T. vulgaris.

No.Pico

Compuesto

IR CANTIDAD RELATIVA, %

DB-5 DB-Wax

S.brownei

O.major

anaL. origanoides L. micromera P. amboinicus T. vulgaris

SDE SDE SDEFSDEH HD SFE SDE HD SFE SDE HD SFE SDE HD SFE

1 trans-3-Hexen-1-ol 849 1386 --- tr tr 6 tr --- tr --- --- 8 --- --- 7 tr ---

2 α-Tujeno 925 1023 tr 8 16 15 13 tr 18 21 9 5 tr --- 18 13 tr

3 α-Pineno* 935 1018 11 9 4 tr tr tr 9 8 Tr tr tr --- 11 9 tr

4 Canfeno* 952 1061 --- tr tr tr tr --- tr tr --- --- tr --- 7 9 ---

5 Sabineno 976 1118 5 58 tr tr tr --- 16 tr 4 --- tr --- tr tr ---

6 β-Pineno* 980 1103 8 6 tr tr tr --- tr tr tr --- tr --- 5 5 tr

7 1-Octen-3-ol* 982 1395 --- --- tr tr tr --- tr --- --- 17 tr --- 12 13 tr

8 3-Octanona* 986 1254 7 --- --- --- --- --- --- --- --- --- tr --- tr tr ---

9 β-Mirceno* 990 1162 5 21 24 24 22 15 22 21 15 8 9 --- 19 15 tr

10 α-Felandreno 1011 1025 tr tr 4 tr 5 tr tr tr tr tr tr --- tr tr ---

11 α-Terpineno 1022 1176 4 81 28 27 26 tr 22 18 9 18 22 --- 19 14 tr

12 p-Cimeno* 1030 1269 9 26 98 101 95 88 63 192 77 75 86 9 195 177 46

13 Limoneno* 1034 1195 4 21 4 7 tr tr 9 6 5 tr 8 --- 6 5 tr

14 Eucaliptol* 1038 1208 5 22 11 tr 5 tr 66 28 22 --- --- --- 7 7 tr

15 γ-Terpineno 1063 1244 22 116 89 82 100 69 96 48 114 95 106 15 97 68 6

16 trans-4-Tujanol 1079 1553 tr 27 tr 4 5 tr 5 5 tr --- 12 --- 9 16 tr

17 α-Terpinoleno 1092 1179 tr 37 tr tr tr --- tr tr tr tr tr --- tr tr ---

18 Linalol* 1104 1547 4 42 4 tr tr tr tr tr tr --- tr --- 19 27 4

19 cis-4-Tujanol 1114 1553 tr 61 tr tr tr tr tr 5 tr --- tr --- tr 4 tr

20 cis-p-Ment-2-en-1-ol 1135 1570 --- 39 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- tr tr ---

21trans-p-Ment-2-en-

1-ol1159 1636 --- 17 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

22 Alcanfor* 1158 1526 --- --- --- --- --- --- tr 4 --- --- --- --- 6 12 tr

23 Ipsdienol 1162 1680 --- --- 6 7 6 tr --- --- --- --- --- --- --- --- ---

24 Mentona 1171 1472 360 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

25 iso-Mentona 1177 1498 41 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

26 Mentol 1180 1602 20 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

27 Borneol 1184 1712 --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- tr --- 8 12 4

Butirato detrans-3-hexenilo

1188 1462 --- --- tr tr --- tr --- --- --- --- --- --- 8 13 tr

28 iso-Pulegona 1186 1592 10 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

iso-Mentol 1188 1646 5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

29 Terpinen-4-ol* 1191 1615 tr 259 15 16 8 5 16 14 tr 10 8 --- 16 13 tr

30 α-Terpineol 1201 1702 tr 45 tr --- tr --- 6 tr tr --- tr --- tr tr ---

31 Estragol* 1211 1675 tr --- --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- tr --- 5

32 cis-Piperitol 1212 1682 --- 15 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

33 trans-Piperitol 1222 1682 --- 10 --- tr --- --- tr --- --- --- --- --- tr tr ---

34 Metil-timil-éter 1237 1595 20 --- 28 17 16 10 138 165 124 --- --- --- 33 12 tr

35 Carvacril-metil-éter 1244 1607 --- --- 4 4 tr tr --- --- --- --- --- --- 21 9 tr

36 Acetato de linalilo 1253 1558 --- 7 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

37 Pulegona 1254 1662 335 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

38Acetato de

trans-4-tujanilo1258 1534 --- 4 --- --- --- --- 6 --- --- --- --- --- --- --- ---

39 Piperitona 1264 1739 4 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

402-Isopropil-4-metil-

fenol1282 2168 --- --- tr tr tr tr tr 11 tr tr tr --- 5 7 tr

* Se usaron sustancias patrón. ** Identificado tentativamente tr: < 0,4%



Tabla 2. Continuación.

No.Pico

Compuesto

IR CANTIDAD RELATIVA, %

DB-5 DB-Wax

S.brownei

O.major

anaL. origanoides L. micromera P. amboinicus T. vulgaris

SDE SDE SDEFSDEH HD SFE SDE HD SFE SDE HD SFE SDE HD SFE

41 Timol* 1291 2186 20 tr 69 106 143 88 341 247 328 9 9 --- 358 340 208

trans-Anetol* 1293 1834 40 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

42 Carvacrol* 1295 2223 9 --- 423 426 444 518 10 35 15 620 537 142 43 64 31

43Acetato de

terpinen-4-ilo1302 1623 --- 6 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

44 Acetato de timilo 1348 1855 tr --- tr tr tr --- 34 tr 25 --- --- --- tr tr ---

45Acetato decarvacrilo

1375 1880 --- --- 24 9 9 --- tr --- --- --- --- --- --- --- ---

46 trans-β-Cariofileno* 1434 1607 16 21 40 34 27 35 33 45 62 47 66 25 17 28 10

47 trans-α-Bergamoteno 1443 1591 --- --- 6 8 4 5 tr 4 tr 23 37 15 --- tr ---

482,6-Dihidroxi-3-met

ilacetofenona**1445 --- --- --- --- --- --- 8 6 --- 11 --- --- --- --- --- 54

49 Aromadendreno 1453 1650 --- --- --- --- --- --- tr 4 tr --- --- --- --- --- ---

50 trans-β-Farneseno 1454 1668 --- --- tr tr tr tr --- --- --- tr tr --- tr tr 5

51 α-Humuleno* 1474 1682 tr tr 25 20 15 18 7 8 8 15 25 6 tr tr ---

524,6-Dihidroxi-2,3-dimetilacetofenona**

1481 2455 --- --- 11 23 13 24 tr --- --- --- --- --- --- --- ---

53 γ-Muuroleno 1486 1699 --- --- --- --- --- --- tr 5 tr --- --- --- --- tr ---

54 Germacreno D 1495 1723 tr --- tr tr tr --- 13 7 31 --- --- --- tr 5 tr

55 Viridifloreno 1503 1697 --- --- --- --- --- --- tr 4 tr --- --- --- --- --- ---

56 Biciclogermacreno 1511 1748 --- 12 --- tr 7 --- tr 5 8 --- --- --- --- tr ---

57 β-Bisaboleno 1516 1733 --- --- 7 7 --- 6 --- --- --- tr --- --- --- --- ---

58 γ-Cadineno 1525 1772 --- --- tr tr tr --- tr 5 6 --- --- --- tr 6 tr

59 Espatulenol 1593 2143 --- tr --- --- --- --- tr 5 tr --- --- --- --- tr ---

60Óxido de

cariofileno1598 2013 --- tr tr tr tr tr tr 20 tr 12 18 tr tr 12 8

61Epóxido dehumuleno**

1628 2011 --- --- tr tr tr tr tr tr --- tr 5 --- --- tr ---

62 τ-Cadinol 1656 2136 --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- --- --- tr 6 tr

6314-Hidroxi-9-epi-trans-β-cariofileno**

1686 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 4 8 --- --- --- ---

64 Acido palmítico 1958 --- --- --- --- --- --- tr --- --- 5 --- --- --- --- --- 36

65 Fitol 2112 --- --- --- --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- --- --- 20

66 Acido linoleico 2131 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 7

67 Ácido linolénico 2138 --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- --- --- --- --- --- 42

68 Ácido esteárico 2158 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 11

69 Tricosano 2299 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 6

70 α-Tocoferol 2394 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 65 --- --- ---

71 Hexacosano 2610 --- --- --- --- --- --- --- --- --- tr tr --- --- --- --- 8

72 Tetracosanal 2655 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 8

73 Heptacosano 2738 --- --- --- --- --- --- tr --- --- 4 tr --- --- --- --- 19

74 Octacosano 2894 --- --- --- --- --- --- --- --- --- tr --- --- --- --- --- 8

75 Escualeno 2919 --- --- --- --- --- --- 5 --- --- tr --- --- 9 --- --- 27

76 Hexacosanal** 2963 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 11

77 Nonacosano 3083 --- --- --- --- --- --- 4 --- --- 25 --- --- 11 --- --- 148

78 γ-Sitosterol 3108 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 73 --- --- ---

Hidrocarburo,C20-C30

--- --- --- --- --- --- 29 --- --- --- --- --- 615 --- --- 123

* Se usaron sustancias patrón. ** Identificado tentativamente tr: < 0,4%

lado, para S. brownei y O. majorana losmonoterpenoides fueron los constituyentesmayoritarios con cantidades relativas de 84,7 y90,5%, respectivamente; se observó muy bajocontenido de timol y carvacrol, razón por la cualestas dos plantas se excluyeron de los ensayos deactividad antioxidante.

La Tabla 2 registra los compuestosidentificados y las cantidades relativas (%) de los aceites y extractos obtenidos por MWHD, SDE y SFE, de las plantas de los géneros Plectranthus,Satureja, Lippia, Thymus y Origanumestudiados. Por cada método de extracción, sedetectaron por GC-MS entre 20-84 componentes en cantidades relativas >0,4%, de los cuales seidentificaron positivamente 87-97%, con base en los índices de retención (en columnas polar yno-polar), espectros de masas (EI, 70 eV) yusando algunas sustancias patrón.

La Figura 1 presenta los perfilescromatográficos (corrientes iónicas totalesreconstruidas) típicos de los aceites esenciales de T. vulgaris (A.), L. origanoides (B.) P.amboinicus (C.) y L. micromera (D.), ricos entimol y carvacrol, aislados por MWHD.

Según la composición dada para losaceites esenciales de las especies estudiadas, seencontró que P. amboinicus presentó el

contenido de carvacrol más alto (~54%);mientras que T. vulgaris posee el más altocontenido de timol (34%).

La composición química de los aceitesesenciales y extractos de cada especie, obtenidospor MWHD y SDE, respectivamente, fue muysimilar; mientras que los extractos, aislados porSFE, para las especies T. vulgaris y P. amboinicus,sí presentaron diferencias composicionales.

3.2. Evaluación de la capacidadantioxidante de aceites esenciales

La exactitud del método ABTS+. se estimócon base en los resultados obtenido paraα-tocoferol, BHT y BHA en concentraciones entre5x10-6 a 4x10-5 M. La capacidad antioxidanteestimada por el método convencionalespectroscópico de decoloración del ABTS+.

presentó valores de actividad antioxidante totalTAA (mmol de Trolox®/kg de AE) de 2040 ± 21,890 ± 32, 800 ± 24, 670 ± 24 para L. origanoides,P. amboinicius, T. vulgaris y L. micromera,respectivamente (Tabla 3). La capacidadantioxidante medida por este método mostró quelos AE evaluados presentaron una menor actividadcomparada con las de los antioxidantes BHA (7000 ± 487) y α-tocoferol (2590 ± 33). Sin embargo, tres de estas especies presentaron capacidad

2009 | v . 1 | n . 1 75


41

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, %

1

2

3

47

911

12

15

14 16

18

27

34

35

42

istd46

29

A.41

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, %

1

2

3

47

911

12

15

14 16

18

27

34

35

42

istd46

29

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, %

1

2

3

57

911

1215

14

1618 29

34

35

42

41

istd

46

44

45

47

51

5752

B.

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, %

1

2

3

57

911

1215

14

1618 29

34

35

42

41

istd

46

44

45

47

51

5752

0min

100

I, %

1 23

79

11

12 15

29 41

42

istd 46

C.

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

4751

60

0min

100

I, %

1 23

79

11

12 15

29 41

42

istd 46

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

4751

60

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, %

D.

2

3 5

9

11

12 15

14

17 29

34

42

41

istd

30

46

44 51

54

15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.000

min

100

I, % 2

3 5

9

11

12 15

14

17 29

34

42

41

istd

30

46

44 51

54

Figura 1. Corrientes iónicas totales reconstruidas (cromatogramas) obtenidas por GC-MS (DB-5, 60 m; EI, 70 eV) de los aceites esenciales ricos en timol y carvacrol, aislados por MWHD de A. Thymus vulgaris, B. Lippia origanoides, C. Plectranthusamboinicus y D. Lippia micromera.

antirradicalaria cercana a la del BHT (990 ± 31);para el aceite de L. origanoides, el valor de TAAfue más alto que el del BHT.

La realización del ensayo ABTS+.

convencional tiene varios inconvenientes; entreellos figuran: es muy laborioso, la cantidad demuestra y disolvente requerida es muy grande yhay diferencias sustanciales en los valores deTAA16 para las muestras que tienen una cinéticade reacción muy lenta o múltiple cinética17,debido a la presencia de más de un grupofuncional reactivo en la molécula, o en el caso delos extractos de origen natural, debido a lacomplejidad de la composición de éstos18,19. Poresta razón, se implementó el ensayo de ABTS+.

con dilución en microplacas para así mejorar lametodología existente y ampliar el número demuestras analizadas por unidad de tiempo;además, fue necesario incrementar el tiempo deensayo de 6 a 30 min para permitir que lareacción entre el antioxidante y el catión-radicalalcanzara condiciones cercanas al equilibrio y así no se subestimara la capacidad antioxidantetotal16.

Por otro lado, los valores de TAAobtenidos por el método microescalado para lasmismas especies vegetales disminuyeron así:5000 ± 198 (P. amboinicus) > 4800 ± 337 (L.origanoides) > 3100 ± 84 (T. vulgaris) > 1840 ±3 (L. micromera). El atrapamiento de radicalespor el método microescalado evidenció que losAE evaluados presentaron una menor actividad

comparada con la de los antioxidantes BHT(21000 ± 308) y BHA (8000 ± 184). Sinembargo, T. vulgaris exhibió capacidadantiradicalaria cercana a la del α-tocoferol (3300± 47) y P. amboinicus, junto con L. origanoides,exhibieron valores de TAA superiores al delα-tocoferol.

Cuando se considera la composición de losaceites y la actividad de compuestos individuales,timol (6200 ± 43) y del carvacrol (6100 ± 69), ladiferencia con la capacidad antioxidante de estosaceites puede atribuirse a los contenidos diferentesde estos dos componentes en dichos aceites20. Elcarvacrol constituye aproximadamente el 54% delaceite de P. amboinicus, mientras que,(timol+carvacrol) conforman ca. 28% del aceite deL. micromera. Sin embargo, quizá lo másinteresante es la supuesta falta de actividad de loscomponentes restantes de los aceites (46 y 72%,respectivamente). Por esta razón los AE, en sutotalidad mostraron valores inferiores a los de suscomponentes principales individuales, timol ycarvacrol, lo que podría atribuirse a un posibleefecto antagónico20, 21 entre los constituyentesmayoritarios y minoritarios en estos AE.

Los ensayos de peroxidación lipídica serealizaron empleando 5 mg de las sustancias. Los AE de las 4 especies vegetales mostraron unefecto protector mayor que la vitamina E yTrolox® siendo los más activos P. amboinicus yL. origanoides, seguidos de L. micromera y T.vulgaris.



Tabla 3. Valores de TAA y del efecto protector (%) para las sustancias de referencia, de control y aceites esenciales, obtenidosen los e\nsayos de decoloramiento de ABTS+ e inhibición del ácido linoleico.

Sustancia evaluada

Inhibición ABTS+.

TAA (mmol Trolox®/kg muestra)Inhibición ácido linoleico

Tiempo, 6 minTiempo, 30 min

(multipozo)Efecto protector, %

(5 mg de antioxidante)

Vitamina E 2590 ± 33 3300 ± 47 39,8 ± 0,7

Trolox® -------- -------- 60 ± 3

BHA 6900 ± 487 8000 ± 184 90 ± 4

BHT 990 ± 31 21000 ± 308 80 ± 2

Carvacrol -------- 6100 ± 69 70 ± 5

Timol -------- 6200 ± 43 64,2 ± 0,2

L. micromera 670 ± 24 1840 ± 3 70 ± 6

P. amboinicus 800 ± 24 5000 ± 198 80 ± 8

L. origanoides 2040 ± 21 4800 ± 337 80 ± 5

T. vulgaris 890 ± 32 3100 ± 84 70 ± 6

Al comparar los valores de inhibición delos componentes mayoritarios individuales conlos de AE obtenidos por este método, seencuentra que no hay una diferenciasignificativa; siendo la inhibición de los AE igual o mayor a la del timol y el carvacrol, lo quepodría presumir un posible efecto sinérgico entre todos los constituyentes.

La confrontación de los resultados delensayo de decoloración de ABTS+. y los de laoxidación del ácido linoleico mostró similitudes, sin embargo, los mecanismos de acciónantioxidante son diferentes, con lo cual se podríaconsiderar que: 1. Debido a la presencia defenoles en los AE, éstos presentarían la habilidad de atrapamiento de radicales por transferencia de un electrón y/o un hidrógeno22, 23; 2. Los otrosconstituyentes presentes i.e. hidrocarburosinsaturados, activan otro mecanismo deprotección, e.g. a través del “sacrificio” demoléculas que se oxidan más rápidamente que elácido linoleico24,25, que puede obstruir lapropagación en cadena de la peroxidaciónlipídica.

4. ConclusionesLa identificación y la cuantificación de

componentes de mezclas naturales y deproductos de oxidación lipídica, posibilitadaspor los métodos basados en GC-MS y enGC-ECD fueron el soporte de este estudiocomparativo y constituyen la base paraposteriores investigaciones que busquenrelacionar la composición química con laactividad biológica. De los seis aceitesesenciales estudiados, se encontró que T.vulgaris posee el contenido de timol más alto(34%), mientras que el carvacrol fue elcomponente mayoritario (~54%) en el AE de P.amboinicus, siendo este aceite una fuenteimportante de este compuesto.

La comparación de los valores TAA entreel ensayo ABTS+, bajo las metodologíasconvencional y la modificación empleandomicroplacas, permitió encontrar diferenciassignificativas. El valor TAA se subestima en elensayo convencional debido a que bajo las

condiciones en que se realiza, la reacción entre la mayoría de antioxidantes fenólicos y elcatión-radical es incompleta.

Los dos métodos mostraron que los AEevaluados presentaron actividad antioxidanteinferior a la de los antioxidantes “control”,vitamina E, BHT y BHA. El potencial inhibitorio de ABTS+. presentado por los AE disminuyó enel siguiente orden: P. amboinicus > L.origanoides > T. vulgaris > L. micromera.

Referencias1. B.H. García. Flora medicinal de Colombia. Vol. III,

Bogotá: Tercer Mundo, 1992, 507 p.

2. S.E. Kintzios. Oregano. In: Handbook of herbs and

spices. Vol 2. Cambridge: Woodhead Publishing Ltd.,

2004, pp. 536-50.

3. G.A. López González. Guía de los árboles y arbustos de

la península ibérica y baleares. 2a ed. Madrid: Mundi

Prensa, 2004, p. 749.

4. H. Baydar, O. Sagdiç, G. Özkan and T. Karadogan.

Antibacterial activity and composition of essential oils

from Origanum, Thymbra and Satureja species with

commercial importance in Turkey. Food Control, 15:

169–172 (2004).

5. M. Lahlou. Methods to study the phytochemistry and

bioactivity of essential oils. Phytother. Res., 18:

435-436 (2004).

6. M.T. Baratta, H.J.D. Dorman, S.G. Deans, A.C.

Figueiredo, J.G. Barroso and G. Ruberto. Antimicrobial

and antioxidant properties of some commercial

essential oils. Flavour Fragr. J., 13: 235-244 (1998).

7. R.S. Lanigan and T.A. Yamarik. Final report on the

safety assessment of BHT. Int. J. Toxicol., 21(Suppl. 2):

19-94 (2002).

8. W. Zheng and S. Wang. Antioxidant activity and

phenolic compounds in selected herbs. J. Agric. Food

Chem., 49: 5165-5170 (2001).

9. M. Godefroot, P. Sandra and M. Verzele. New method

for quantitative essential oil analysis. J. Chromatogr.,

203: 325-335 (1981).

10. E.E. Stashenko, R. Acosta and J.R. Martínez.

High-resolution gas-chromatographic analysis of the

secondary metabolites obtained by subcritical-fluid

extraction from Colombian rue (Ruta graveolens L.). J.

Biochem. Biophys. Methods, 43: 379-390 (2000).

11. R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M.

Yang, and C. Rice-Evans. Antioxidant activity applying

2009 | v . 1 | n . 1 77


an improved ABTS radical cation decolorization assay.

Free Rad. Biol. Med., 26: 1231-1237 (1999).

12. H. Tamura and A. Yamagami. Antioxidative activity of

monoacylated anthocyanins isolated from muscat bailey

a grape. J. Agric. Food Chem., 42: 1612-1615 (1994).

13. E.E. Stashenko, M.C. Ferreira, L.G. Sequeda, J.R.

Martínez, and J.W. Wong. Comparison of extraction

methods and detection systems in the gas

chromatographic analysis of volatile carbonyl

compounds. J. Chromatogr. A, 779: 360-369 (1997).

14. R. Adams. Identification of essential oils components

by gas chromatography/quadrupole mass spectroscopy.

Carol Stream, Illinois: Allured Publishing Corporation.

2004, 456 p.

15. N.W. Davies. Gas chromatographic retention indices of

monoterpenes and sesquiterpenes on methyl silicone

and carbowax 20M phases. J. Chromatogr., 503: 1-24

(1990).

16. M.J.T.J. Arts, J.S. Dallinga, H.P. Voss, G.R.M.M.

Haenen, and A. Bast. A new approach to assess the total

antioxidant capacity using the TEAC assay. Food

Chem., 88: 567-570 (2004).

17. M.J.T.J. Arts, G.R.M.M. Haenen, H.P. Voss, and A.

Bast. Antioxidant capacity of reaction products limit

the applicability of the trolox equivalent antioxidant

capacity (TEAC) assay. Food Chem. Toxicol., 42:

45-49 (2004).

18. R. van den Berg, G.R.M.M. Haenen, H. van den Berg,

and A. Bast. Applicability of an improved Trolox

equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay for

evaluation of antioxidant capacity measurements of

mixtures. Food Chem., 66: 511-517 (1999).

19. M. Ozgen, R.N. Reese, A.Z. Tulio Jr, J.C. Sheerens, and

A.R. Miller. Modified 2,2-azino-bis-3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) method

to measure antioxidant capacity of selected small fruits

and comparison to ferric reducing antioxidant power

(FRAP) and 2,2´-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

methods. J. Agric. Food Chem., 54: 1151-1157 (2006).

20. H.J.D. Dorman, A.C. Figueiredo, J.G. Barroso, and

S.G. Deans. In vitro evaluation of antioxidant activity

of essential oils and their components. Flavour Fragr.

J., 15: 12-16 (2000).

21. A.E. Edris. Pharmaceutical and therapeutic potentials of

essential oils and their individual volatile constituents: a

review. Phytother. Res., 21: 308-323 (2007).

22. N. Nenadis, L.F. Wang, M. Tsimidou, and H.Y Zhang.

Estimation of scavenging activity of phenolic

compounds using the ABTS+. assay. J. Agric. Food

Chem., 52: 4669-4674 (2004).

23. N.V. Yanishlieva, E.M. Marinova, M.H. Gordon, and

V.G. Raneva. Antioxidant activity and mechanism of

action of thymol and carvacrol in two lipid systemas.

Food Chem., 64: 59-66 (1999).

24. M.C. Foti and K.U. Ingold. Mechanism of inhibition of

lipid peroxidation by γ-terpinene, and unusual and

potentially useful hydrocarbons antioxidant. J. Agric.

Food Chem., 51: 2758-2765 (2003).

25. G. Ruberto and M.T. Baratta. Antioxidant activity of

selected essential oil components in two lipid model

systems. Food Chem., 69: 167-174 (2000).



IntroduçãoEntre 28 e 30 de outubro de 2008

foi realizado no Centro de Convençõesde Florianópolis (SC) o 12º. CongressoLatino- Americano de Cromatografia eTécnicas Relacionadas (COLACROXII). Mais de 1.000 pessoas seinscreveram neste que foi o maiorevento já realizado na América Latinadedicado exclusivamente àcromatografia e técnicas relacionadas.

Promovido pelo InstitutoInternacional de Cromatografia (IIC)em conjunto com o ComitêLatino-Americano de Cromatografia,o evento contou com representantes de mais de 20 países diferentes, compredominância do Brasil, seguido pelos demaispaíses da América Latina.

Cinco cursos de curta duração(“short-courses”), oferecidos antes da aberturado congresso, e cobrindo diferentes aspectos dastécnicas de separação, foram organizados,coordenados e ministrados por líderes nacionaise internacionais em suas especialidades. Mais de100 pessoas participaram nos 5 cursos.

Nove Conferências Plenárias foramapresentadas por líderes internacionais em suasrespectivas áreas de atuação: Harold McNair,Virginia Tech,USA; Luigi Mondello, Universityof Messina, Italy; Kiyokatsu. Jinno, ToyohashiUniversity of Technology, Japan; Daniel.Armstrong, University of Texas at Arlington,USA; Frank. Svec Molecular Foundry of theLawrence Berkeley National Laboratory, USA;

2009 | v . 1 | n . 1 79


“COLACRO XII MEETING REPORT”12º Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas

Fernando M. Lanças

Universidade de São PauloInstituto de Química de São Carlos13560-970 – São Carlos (SP)[email protected]

Figura 1. Centro de Convenções de Florianópolis

Elena Stashenko UniversidadIndustrial de Santander, Colômbia;M. Novotny University of Indiana,USA; Carlo Bicchi University ofTurin, Italy; J. Pawliszyn University of Waterloo, Canadá.

Vinte e seis SemináriosTécnicos foram organizados eapresentados pelas empresaspatrocinadoras do evento, contandocom enorme participação do público presente.

Doze Simpósios Satélites,coordenados por pesquisadores dedestaque na área, trataram dos maisimportantes temas da atualidade, debiodiesel à proteômica; da análisede alimentos e bebidas a assuntosregulatórios; da análise ambiental àde fármacos em fluidos biológicos, dentre outrostemas que atraíram um grande público. Osseminários foram apresentados por váriosparticipantes, com mais de 60 apresentaçõesorais nos 12 simpósios, permitindo ao públicopresente uma visão única e atual de váriastendências em cada área de aplicação.

Quase oitocentos pôsteres foram aceitospela comissão científica (dentre mais de 1.000submetidos) para apresentação no eventocolocando, juntamente com os demais dadosdescritos neste relatório, o COLACRO dentre os3 maiores eventos do mundo na área dedicado à cromatografia e demaistécnicas da separação.

A Exposição contou comquase oitenta unidades de exposição (stands) com empresas de diferentes atuações no mercado decromatografia e outras técnicas deseparação, desde instrumentação,acessórios, software, literatura,serviços e outras. Deve-se destacarque 3 empresas americanas, líderesmundiais em suas áreas de atuação,e ainda sem representantes noBrasil, estiveram presentes comoexpositores no evento. Tanto osexpositores quanto os participantes

do evento relataram que a visitaçãoà Exposição superou em muitoambas as partes. O grande interessepela exposição superou asexpectativas dos expositores,enquanto que a qualidade damontagem, o conteúdo técnico e opessoal atendendo os participantesagradaram em cheio e em nadaficaram devendo para as maioresexposições em eventosinternacionais na área.

Um volume especial doperiódico Journal of SeparationScience, será dedicado aos trabalhos apresentados no COLACRO XII eselecionados pelos avaliadores doperiódico para publicação.

Cursos Pré-Congresso(“short-courses”)

O evento contou com várias atividades emparalelo, iniciando com 5 cursos de curtaduração no dia ( segunda-feira, 27 de outubro)anterior à abertura do COLACRO XII. Os cursos de um dia de duração tiveram como principalobjetivo discutir com os participantes oestado-da-arte das técnicas em questão, do pontode vista de especialistas envolvidos nodesenvolvimento das mesmas.



Figura 2. Diploma conferindo aMedalha COLACRO ao Prof.Dr. Luigi Mondello daUniversidade de Messina, Itáliapela sua importante contribuição no desenvolvimento e divulgação da cromatografia.

Figura 3. Área de Inscrições.

O curso de CromatografiaLíquida acoplada à Espectrometria deMassas (LC/MS/MS), coordenado pelo Prof. Fernando Lanças da USP-IQSC,foi o que atraiu o maior número deinscritos, seguido pelo curso sobreHPLC coordenado pelo Prof. HaroldMcNair do Virginia Tech, USA. Ocurso versando sobre o acoplamentoentre Cromatografia Gasosa eEspectrometria de Massas (GC/MS) foi coordenado pela Profa. ElenaStashenko da Universidade Industrialde Santander, Colômbia, enquanto queo curso de Preparo de Amostras teve acoordenação da Profa. Maria Eugêniade Queiroz, da FFCLRP-USP. Umgrupo de pesquisadores americanos,liderados pelo Prof. Larry Taylor daVirginia Tech, ministraram um curso arespeito do uso de fluidos supercríticospara extração (SFE) e cromatografia (SFC). Maisde 100 pessoas se inscreveram e participaram doscinco cursos, cujos objetivos foram plenamenteatingidos.

Terça-feira, 28 de outubro

Sessão de Abertura do COLACRO XII

A sessão de abertura foi realizada no dia 28de outubro, quarta-feira, às 8:30 horas, com apresença dos membros do Comitê CientíficoPermanente do COLACRO, Prof. Fernando M.Lanças (Presidente), Prof. Harold M. McNair,Prof. Kiyokatsu Jinno e Prof. Luigi Mondello eDr. Guilherme Henrique Pereira, Secretário deDesenvolvimento Tecnológico e Inovação –SETEC, representando o Sr. Ministro da Ciência e Tecnologia. Nesta sessão, o Prof. FernandoLanças anunciou a abertura do COLACRO XII,passando a palavra para o Prof. Harold McNair, oqual apresentou a palestra de aberturadenominada “50 Years of Chromatography”. Opróximo palestrante foi o Dr. Guilherme Pereira,do Ministério da Ciência e da Tecnologia, MCT, o qual apresentou os principais programas de apoioà Ciência e Tecnologia em desenvolvimento

naquele ministério. A seguir, o Prof. Lançasapresentou o ganhador da prestigiosa MedalhaCOLACRO, a qual foi entregue, por escolhaunânime, ao Prof. Luigi Mondello, daUniversidade de Messina, Itália. Esta sessão foiencerrada e os presentes convidados aparticiparem da abertura da Exposição deEquipamentos, Acessórios e Literatura, onde foiservido café e acompanhamentos.

A Exposição mostrou um crescimentosuperior a 25% em relação ao COLACRO X,realizado no Brasil em 2004. O número deempresas expositoras aumentou, o número médiode stands de cada empresa e a qualidade também.O público presente mostrou-se bastante satisfeitocom a qualidade de Exposição, na qual asprincipais empresas da área de cromatografia,espectrometria de massas e técnicas relacionadas,apresentaram seus últimos lançamentos para umpúblico especializado e interessado em conhecernovas opções de equipamentos e acessórios. Das10:30 às 12:30 foram apresentados 10 semináriostécnicos, organizados pelas empresaspatrocinadoras do evento. Os seminários, semprecom boa audiência, foram apresentados pelosespecialistas das empresas, muitos dos quaisprovenientes dos Estados Unidos e Europa.

2009 | v . 1 | n . 1 81


Figura 4. Sessão de abertura do COLACRO XII. Da direira para a esquerda,Dr. Fernando M. Lanças (em pé); Dr. Kyiokatsu Jinnho e Dr. Harold McNair, membros do Comitê Científico, e Dr. Guilherme H. Pereira, Secretário deDesenvolvimento Tecnológico e Inovação do MCT. Ao fundo, Prof. LuigiMondello.

No período da tarde quatro Simpósios,denominados Simpósios Satélite, ocorrendo emparalelo, foram organizados e coordenados porlíderes nacionais e internacionais em suas áreas deatuação. O seminário “I. Biofuels and Fossil FuelAnalysis” foi coordenado por Fátima Dutra, doCENPES/ Petrobrás, enquanto que “II.Chromatographic Analysis of Natural Products/Phytotherapics” teve como coordenador o Prof.Norberto Peporine, da FCFRP USP. O Prof. LarryTaylor do Virginia Tech (USA) coordenou oseminário “III. Supercritical Fluid Chromatography(SFC) in Pharmaceutical Analysis” e o Prof. Marcos Eberlin do da UNICAMP-IQ coordenou o “IV.Coupled Techniques: Chromatography/MassSpectrometry”. A excelente audiência, e retornopositivo dos participantes atestam que a idéia dosSeminários Técnicos, iniciada no SIMCRO 2006,foi uma iniciativa feliz e que deverá continuar nospróximos eventos promovidos pelo IIC.

O período da tarde contou ainda com quatroconferencias orais, em papalelo. O Prof. CarloBicchi, da Universidade de Turino, Itália,apresentou a palestra “Sample Preparation inVapour Phase”, enquanto que o Prof. Álvaro S.Neto da UNIFAL apresentou o tema “CapillaryColumn Switching Restricted-AccessMedia-Liquid Chromatography-ElectrosprayIonization-Tandem Mass Spectrometry System for Simultaneous and Direct Analysis of Drugs inBiofluids.” O Prof. Larry Taylor do Virginia Tech,USA apresentou o tema “Normal PhaseChromatography of Polar Analytes Facilitated with Supercritical Mobile Phases”, e o Dr. Jaap deZeeuw, da Restek, “Application of IntegratedRetention Gaps in Metal Capillary ColumnsEliminating Column Coupling in HighTemperature Biodiesel Analysis”.

Os pôsteres ficaram em exposição durantetodo o dia, sendo que das 17:00 as 18:00 horasocorreu uma sessão de discussão dos mesmos,com os autores presentes. As sessões forammuito bem concorridas, com bastante discussão e troca de informações entre os presentes. Estasessão é uma das mais relevantes do evento, umavez que possibilita aos interessados entrarem emcontato direto com os autores dos trabalhos de

seu interesse e trocar informações a respeito dosmesmos com quem os desenvolveu. Um comitêinternacional selecionou os melhores pôsteres de cada dia, os quais receberam vários prêmios naSessão de Encerramento do evento. Às 18:30 asatividades técnicas do dia foram encerradas.

Com patrocínio da Shimadzu e da SINCdo Brasil, foi realizado no Foripa Music Hall,uma das mais belas casas noturnas do sul do país, um jantar de confraternização entre osparticipantes do evento. Cerca de 800 pessoaspuderam ter a continuidade de suas interaçõesem um ambiente descontraído, com excelentecomida fornecida pelo Buffet Casa das Tortas ecom a música da banda Zawajus, deFlorianópolis(SC). Esta foi uma forma especialde a Comissão Organizadora, juntamente com aShimadzu e a SINC do Brasil darem as boasvindas a todos os participantes do COLACROXII, encerrando as atividades do dia.



Figura 5. Vista parcial da Exposição do COLACRO XII, amaior Feira dedicada exclusivamente às Técnicas deSeparação e Relacionadas das Américas.

Quarta-feira, 29 de outubroA manhã do dia 29 começou com a

apresentação de Conferências Plenárias emparalelo. Na sala Joaquina houve apresentação dotítulo “Comprehensive LC x LC coupled toIT-TOF MassSpectrometry for Exact MassMeasurement.” pelo Prof. Luigi Mondello,University of Messina, Italy, seguido de“Miniaturized Sample Preparation TechniquesinVarious Analytical Situations.” pelo Prof.K.Jinno da Toyohashi University of Technology,Japan. Em paralelo, na sala Jurerê , oProf D. Armstrong, da University ofTexas at Arlington, USA apresentou a palestra“Ionic Liquids in Separationsand MassSpectrometry: a NewFrontier”, sendo seguido por“Microfluidic Applications of PorousPolymer Monoliths” apresentada porF. Svec do Molecular Foundry of theLawrence Berkeley NationalLaboratory, USA. Após esta sessãode Conferências Plenárias, houve umintervalo quando foram servidos cafée complementos na área daExposição. Os Pôsteres do segundodia já estavam devidamentecolocados nos painéis e abertos à

visitação, assim permanecendo até ofinal da tarde onde uma Sessão deDiscussão foi apresentada. OitoSeminários Técnicos, ocorrendo emparalelo, foram produzidos eapresentados por Patrocinadores doevento, encerrando as atividadesdesta manhã.

As atividades do período datarde deste dia se iniciaram comquatro Simpósios Satélite emparalelo: “V. ElectrodrivenSeparation Techniques” coordenado por Marina Tavares, IQ-USP,Br.;“VI. Recent Trends in Food/Beverage Analysis”, coordenado por Shirley Abrantes, INCQS,Br.; “VII.Enviromental Analysis” coordenado

por R. Zanella, UFSM, Br; e “VIII. BrazilianProgram on Food Residue Analysis: PanelDiscution” coordenado por F. M. Lanças,IQSC-USP, Br. Todos os simpósios foram muitobem atendidos, suscitando muitas perguntas egrande participação da platéia, um dos objetivosdo evento. Esta sessão foi seguida por umintervalo para café e visita à Exposição, após oque ocorreu a sessão de apresentações orais.Quatro conferências foram apresentadas emparalelo : “Care and Maintenance of GCCapillary Columns”, por S. Reese da Restek,USA; “Parameter Interactions and

2009 | v . 1 | n . 1 83


Figura 6. Jantar de confraternização no Floripa Music Hall.

Figura 7. Sessão de seminários técnicos.

Optimization in HPLC and SFC” por T. Chester da Procter & Gamble,USA, “The use of HPLC in theidentification of selective enzymaticligands” por Q. Cass UFSCAR,Brasil e “Considerations inHigh-Throughput andHigh-Resolution HPLC” por R.Majors, Agilent, USA.

Esta sessão foi seguida daDiscussão dos Pôsteres, com osautores presentes, a qual mais umavez foi uma sessão extremamenteconcorrida e com grande troca deexperiência entre os participantes.Às 18:00 horas as atividades técnicas do dia foram encerradas.

Quinta-feira, 30 de outubroO último dia de atividades técnicas do

COLACRO XII iniciou-se com quatroConferências Plenárias ocorrendo em paralelo:na sala Joaquina, E. Stashenko da UniversidadIndustrial de Santander, Colômbia apresentou apalestra “Chromatography as a Tool forBiodiversity Studies”, seguida de M. Novotny daUniversity of Indiana, USA o qual apresentou otema “Molecular Profiling of Biological Fluidsand Tissues:New Instrumental Variations on Old Ideas?””. Em paralelo, na sala Jurerê, Carlo

Bicchi da University of Turin, Italy discorreusobre “A General Overview on the Most RecentAspects Related to Enantioselective GC withCyclodextrinStationary Phases, o qual foiseguido por J. Pawliszyn da University ofWaterloo, Canada falando sobre o tema “NewDevelopments in SPME Techniques”. Durante ointervalo para café e complementos, houveintensa visitação à Exposição e à Sessão dePôsteres, na qual novos painéis foram fixados, de acordo com a programação do dia, e estiveramabertos à visitação até o final da tarde quandouma Sessão de Discussão foi realizada. A seguir,

oito seminários técnicos foramorganizados e ministrados porempresas patrocinadoras, até ohorário do almoço.

Iniciando as atividades doperíodo da tarde, quatro SimpósiosSatélites abordando temas de grandeatualidade ocorreram em paralelo:Room A” IX. Regulatory Issues:GLP, ISO 17025, Validation….”coordenado por I. Olivares,IQSC-USP; “X. MiniaturizedHeadspace Analysis of VolatileCompounds” coordenado por FábioAugusto, UNICAMP; “XI. Analysisof Human & VeterinarianDrugs andMetabolites in Biological Fluids”coordenado por Pierina Bonato -



Figura 8. Simpósio Satélite.

Figura 9. Sessão de Pôsteres.

FCFRP-USP e Maria EugêniaQueiroz, FFCLRP-USP; e “XII.Omics/Bioanalytical: Proteomics/Genomics/ Metabolomics”,coordenada por Carlos Bloch,EMBRAPA-Brasília.

Após o intervalo, quatroapresentações orais ocorreram emparalelo: “HPLC Applications forCharacterization of Wines andBerries”, por D. von Baer da University of Concepcion, Chile;“Chromatography and RelatedTechniques in Support ofPharmaceutical Development: RecentProgress and Current Challenges” porC. Welch da Merck, USA.; “ModernATD-GC Techniques Used in theDetermination of VOCs in AmbientAir” por A. Tipler da Perkin Elmer,USA. e “Abordagens e Desafios naDeterminação de Multirresíduo de Agrotóxicos"apresentada por Isabel C.S.F. Jardim daUNICAMP, Brasil. Estas apresentações foramseguidas da Sessão de Discussão dos Pôsteres dodia, a qual encerrou as atividades técnicas do evento.

Sessão de Encerramento do COLACRO XII

A Sessão de Encerramento se iniciou às18:15 com a presença dos membros do ComitêCientífico Permanente na mesa diretora (F.Lanças, H. McNair, L. Mondello e K.Jinno).

Após as informações a respeito dosnúmeros de participantes do evento, superior a1.000, e agradecimentos aos patrocinadores eórgãos de fomento pelo auxílio que apoiaram ocongresso, o Prof. Lanças anunciou ospremiados como melhores pôsteres de cada diado evento, havendo sido distribuídos prêmiosofertados pela Springer Verlag (Suíça), NotíciasTécnicas do Laboratório (Alemanha); NanoSeparation Technologies, NST (Brasil). Aseguir, foi anunciado que o COLACRO XIII será realizado no Chile, ano 2010, em local e data aserem ainda definidos. Ao mesmo tempo, o IICanunciou que o Simpósio Brasileiro de

Cromatografia (SIMCRO 2010) será realizadono segundo semestre de 2010, em data e local aserem divulgados. O IIC convida a todos osinteressados na área a visitarem o website doCOLACRO (www.colacro.org) e do SIMCRO(www.simcro.com.br) para se manterematualizados a respeito das datas e programas.

O encerramento do evento ocorreu comum coquetel de vinhos e queijos, o qual contoucom um número expressivo de participantes, emuma festa de confraternização a qual coroou osucesso do evento científico e tecnológicorealizado.

2009 | v . 1 | n . 1 85


Figura 10. Membros do Comitê Científico do COLACRO XII durante oencerramento do COLACRO XII e anúncio do COLACRO XIII no Chile,2010. Da esquerda para a direita: Luigi Mondello, Fernando Lanças, HaroldMcNair e Kyiokatsu Jinno.

Figura 11. Sessão de encerramento do COLACRO XII.

• PerkinElmer• SINC do Brasil• TEDIA Brazil• ANALITICA• Merck• Restek• Varian• Allcrom• Applied Biosystems• Dionex• Hexis• LECO• Sigma-Aldrich• Waters Brasil

• Agilent• Eppendorf• GlobalLab• Linde Gases• Metrohm Pensalab• Micronal• Instrulab• Permution• Polymicro• Shimadzu• Shodex• Veolia• NST• IIC



AgradecimentosOs organizadores do COLACRO XII agradecem o apoio financeiro recebido da FAPESP, CNPq e

CAPES, assim como a ajuda de várias pessoas – muitas para serem listadas aqui. Agradece também aimportante participação das empresas de equipamentos, acessórios, consumíveis, como Patrocinadores eExpositores do evento.

Patrocinadores do COLACRO XII

Expositores

Calendário Geral

Este Departamento tem como objetivo divulgar eventos da área decromatografia e técnicas relacionadas, tanto no Brasil quanto em outros países.

2009Janeiro

Evento: Arab Lab, Expo 2009Data: 10-13Local: Dubai, United Arab EmiratesInformações: http://www.arablab.com/

Evento: IFPAC-09 Annual MeetingData: 25-28Local: Baltimore, MD, USAInformações: http://www.ifpac.com/

Evento: 22nd Conference of the Australian & New Zealand Society for Mass Spectrometry ( ANZSMS 22)

Data: 27-30Local: Sidney, AustraliaInformações: http://www.mmb.usyd.edu.au/ANZSMS22/

Fevereiro

Evento: 3ª. Escola de Química VerdeData: 1-6Local: Instituto de Química, USP (São Paulo)Informações: www.usp.br/quimicaverde

Evento: 23rd. International Symposium on Microscale BioseparationsData: 1-5Local: San Francisco, CA, USAInformações: http://www.casss.org/

2009 | v . 1 | n . 1 87


Março

Evento: 60th Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy ( Pittcon 2009)

Data: 8-13Local: Chicago, IL, USA

Abril

Evento: 2º. Simpósio Nacional sobre BiocombustívelData: 16 e 17Local: UFPE, RecifeInformações: http://www.abq.org.br/biocom/

Maio

Evento: XXXVIII Reunião Anual da SBBqData: 16 a 19Local: Hotel Monte Real Resort, Águas de Lindóia (SP)Informações: http://www.sbbq.org.br/v2/

Evento: 33rd International Symposium on Capillary Chromatography & Electrophoresis

Data: 17-23Local: Portland, OR, USAInformações: http://www.casss.org/

Evento: 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ)Data: 29 de maio a 2 de junhoLocal: Fortaleza (CE)Informações: http://www.sbq.org.br/32ra/

Junho

Evento: 57th ASMS Conference on Mass SpectrometryData: 31 Maio – 4 JunhoLocal: Philadelphia, PAInformações: http://www.asms.org/

Evento: HPLC 2009 Data: 28 Junho – 2 de JulhoLocal: Dresden, GermanyInformações: http://www.hplc2009.com/



Agosto

Evento: Ninth International Symposium on Mass Spectrometry in the Health and Life Sciences: Molecular and Cellular Proteomics

Data: 23-27Local: San Francisco, CA, USAInformações: http://donatello.ucsf.edu/symposium/

Evento: 18th International Mass Spectrometry ConferenceData: 30 Agosto – 4 SetembroLocal: Bremen, GermanyInformações: http://www.imsc-bremen-2009.de/

Setembro

Evento: 6th. Symposium on the Practical Applications of Mass Spectrometry (Mass Spec 2009)

Data: 15-17Local: Philadelphia, USAInformações: http://www.casss.org/

Evento: 32nd. International Ion Chromatography SymposiumData: 19-23Local: Malahide, IrelandInformações: http://www.casss.org/

Outubro

Evento: XVI Congresso Brasileiro de ToxicologiaData: 10-14 OutubroLocal: Belo HorizonteInformações: http://www.sbtox.org.br/pages/detail.php?item_id=102

2010

Evento: Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afim (SIMCRO 2010)

Informações: www.simcro.org; [email protected]

Evento: XIII COLACROLocal: ChileInformações: www.colacro.org

2009 | v . 1 | n . 1 89


O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) é parte da AssociaçãoInternacional de Cromatografia, entidade de direito privado, sem finslucrativos.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo deAmostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras),tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é : “ ao invés de ensinar apenas comooperar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (comopescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenadospelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por umaequipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentespós-graduados nos melhores centros do país na área, e pós-graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, umarelação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC.

O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC.

Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuaismodernos (data show-computador; vídeos, demonstrações, resolução deproblemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livretocontendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além dematerial bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidoslivros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursostambém tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folhetoexplicativo de cada curso.



Instituto Internacional de Cromatografia

Calendário IIC - 2º semestre 2009

GC/MS e GC/MS/MS

LC/MS e LC/MS/MS

ISO 17015

BPL/GLP

Espectometria de Massas

Preparo de Amostras

Gestão de Qualidade

Validação de Métodos Cromatográficos

2009 | v . 1 | n . 1 91


Setembro

Outubro

Novembro

Agosto

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzidopelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outrasformas de divulgação dos materiais por ele produzido. Esses materiais podemser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.or/bookstore.

LANÇAMENTO

Cromatografia Líquida ModernaFernando M. Lanças

Livro publicado pela Editora Átomo emoutubro de 2008, aborda de forma simples edidática os principais assuntos relacionados àCromatografia Líquida Moderna (HPLC ouCLAE), desde a Teoria, Instrumentação,Colunas, Detectores, até aspectos da Validação,Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos osinteressados em iniciar-se ou atualizar-se nestatécnica.

BOOKSTORE

Cromatografia em Fase GasosaFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças,abordando todos os princípios básicos:instrumentação, análise qualitativa equantitativa, detectores e muitos outros aspectosda Cromatografia Gasosa. Altamenterecomendado para os iniciantes na técnica, osquais encontrarão explicações detalhadas esimples a respeito da maior parte dosfundamentos básicos da técnica.

2009 | v . 1 | n . 1 93


Bookstore

Validação de Métodos CromatográficosFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, descreveos princípios da validação de métodoscromatográficos com detalhes. Enfoque também a validação de instrumentação e a adequação dossistemas (“system suitability”) frente aosrequisitos dos órgãos regulamentadores deresultados analíticos. O livro é acompanhado deum software, denominado Validate – versãodemonstração – desenvolvido em colaboraçãocom o Dr. Vitor Hugo P. Pacces, o qual auxilia noprocesso de validação.

Extração em Fase SólidaFernando M. Lanças

De autoria do Prof. Lanças, este livroapresenta e discute as várias formas de extraçãoem fase sólida (SPE), desde a mais clássicaempregando cartuchos até as mais atuais comodiscos, placas, ponteiras, e outras. Tambémdiscute os princípios da micro extração em fasesólida (SPME) e da extração por sorção embarras de agitação (SBSE).



scichro v1n1 novo formato · o scientia chromatographica é o primeiro periódico concebido,...

Documents