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Scientia ChromatographicaRevista Trimestral do Instituto Internacional

de Cromatografia

2009 | Volume 1 | Número 4

ISSN 1984-4433

PILARES DA CROMATOGRAFIA

IV. O Desenvolvimento da Cromatografia em Papel .....................7Carol H. Collins

PREPARO DE AMOSTRAS

Fundamentos e avanços recentes da microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (LPME) ............11

Igor Rafael dos Santos Magalhães, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira,Pierina Sueli Bonato

CROMATOGRAFIA GASOSA (GC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Aspectos prácticos de la ionización con electrones en la obtención de espectros de masas y su interpretación .....................19

Elena E. Stashenko, Jairo René Martínez

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (LC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Estratégias para diminuição do tempo de análise em Cromatografia Líquida Moderna...........................................37

Fernando M. Lanças

QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI) / PONTO DE VISTA

A importância da metrologia química nos resultados das análises de resíduos ..............................................47

Oscar Bahia Filho

TROUBLESHOOTING (TS)

Problemas com o formato dos picos em cromatografia líquidaParte 2.......................................................................................53

Álvaro José dos Santos Neto

HPLC 2009 Meeting Report34th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques ......................61

Fernando M. Lanças

Calendário Geral .......................................................................65

Instituto Internacional de Cromatografia....................................66

Bookstore..................................................................................68

Sumário

Ao longo da última década, o Brasil tem testemunhado um significativodesenvolvimento na sua economia e, como consequência, no padrão de vida, com umaumento considerável de seu produto interno bruto. De forma análoga, a ciênciabrasileira apresentou um crescimento ímpar nesse período, em parte devido aoaumento dos investimentos estatais em seu sistema de Ciência e Tecnologia (C&T).Apesar dos valores ainda serem inferiores ao ideal, especialmente quando comparados com os investimentos feitos por países que atingiram similar ou melhor índice dedesenvolvimento, não há dúvida de que houve uma melhora acentuada quandocomparamos com nossa situação na década passada.

Olhando com maior seletividade para o desenvolvimento do conjunto dastécnicas de separação e relacionadas (considerando desde o preparo da amostra até oacoplamento com a espectrometria de massas) observa-se, novamente, umacontribuição da ciência brasileira ímpar na América Latina. Esse avanço pode serponderado empregando-se desde formas mais tradicionais de avaliação como oaumento significativo das publicações em periódicos internacionais indexados, osurgimento de volumes especiais destes mesmos periódicos dedicados a eventosocorrendo no país (a exemplo da recente publicação de um volume especial do Journal of Chromatographic Science dedicado ao COLACRO XII), até o aumentosignificativo de eventos científicos nestas áreas, notadamente o crescimentoqualitativo e quantitativo do SIMCRO e BrMass, eventos com focos complementaresrealizados no Brasil e que possuem repercussão internacional.

Estes, e muitos outros exemplos, testemunham que o investimento de recursosem ciência ocorrido na última década no país, ainda que não ideal, produziu umretorno bastante significativo para o desenvolvimento desta área. Considerando afacilidade com a qual as técnicas de separação e a espectrometria de massas atualmente permeiam a solução dos problemas mais complexos da sociedade (meio ambiente,saúde pública, combustíveis, alimentos, e muitos outros), pode-se projetar acontribuição que estas técnicas trouxeram.

Afinal, nada melhor do que os recursos investidos pela sociedade com o apoio à pesquisa científica e tecnológica retornarem para os cidadãos pagadores dos impostosna forma de benefícios. Estes incluem melhoras no controle da qualidade daalimentação, meio ambiente, medicamentos mais eficientes, combustíveisalternativos, água isenta de contaminantes e tantas outras benesses que as técnicascromatográficas e a espectrometria de massas, usualmente atuando em conjunto, sãocapazes de proporcionar.

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S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a

Editorial

Fernando M. LançasEditor

Após tentativas frustradas de separação dosaminoácidos encontrados após a hidrólise de lãusando um sistema de extração líquido-líquido, A. J.P. Martin e R. L. M. Synge conseguiram separar eidentificar os monoaminoácidos, utilizando acromatografia líquido-líquido1. Nesta técnica, acoluna empregada continha sílica gel como suporte da água, que execeu a função de fase estacionária, e oclorofórmio foi utilizado como fase móvel. No seuimportante trabalho de 19412, além de descrever este

novo tipo de cromatografia líquida em coluna, osautores também aplicaram a teoria de pratos paraindicar a eficiência da separação.

Os dois pesquisadores continuaram seusestudos e enfrentaram um novo problema: uma coluna utilizando sílica como suporte não poderia serempregada para separar aminoácidos com dois grupos carboxílicos. Estes compostos permaneceram retidosirreversivelmente na coluna. Após uma série detentativas, fitas de papel de filtro (celulose), para

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PILARES DA CROMATOGRAFIA

IV. O Desenvolvimento daCromatografia em Papel

Carol H. Collins

Universidade Estadual de CampinasInstituto de Química13083-970 – Campinas (SP)[email protected]

ResumoEste capítulo sobre os “Pilares de Cromatografia” descreve os

diversos desenvolvimentos e aplicações da cromatografia em papel,

empregando o mecanismo de partição, com importantes contribuições

do A. J. P. Martin. Alguns fatos antecedentes da cromatografia em papel

também são descritos.

AbstractThis chapter of “Pillars of Chromatography” describes the

diverse developments and applications of paper chromatography,

which employs the partition mechanism, with important contributions

from A.J.P. Martin. Some antecedents of paper chromatography are

also described.

Palavras-chave

História da cromatografia;

Cromatografia em papel;

Cromatografia líquido-líquido;

Cromatografia por partição.

Keywords

History of chromatography;

Paper chromatography;

Liquid-liquid chromatography;

Partition chromatography.

Carol H. CollinsEditora


8 www.scient iachromatographica .com

apoiar a fase estacionária aquosa, foram colocadas nacoluna e mostravam-se úteis para esta difícilseparação, porém resultaram em baixa eficiência.Martin pensou que, talvez, o papel poderia funcionarde uma forma diferente, se a amostra fosse aplicadadiretamente no papel úmido e depois passasse a fasemóvel através do papel.

Neste época, Synge defendeu sua tese dedoutorado e saiu dos laboratórios da Associação paraPesquisas das Indústrias de Lã, em Leeds. O projetode aplicar a amostra diretamente no papel foirealizado por dois novos colaboradores de Martin, A.H. Gordon e R. Consden. Os resultados deste projetoforam publicados, em 1944 (Figura 1), com o título“Qualitative Analysis of Proteins: a PartitionChromatographic Method Using Paper” (“AnáliseQualitativa de Proteínas: um Método deCromatografia por Partição Utilizando Papel”)3.

Por outro lado, esta não foi a primeirapublicação sobre cromatografia em papel. No séculodezenove, um químico industrial, Friedlieb Ferdinand Runge (1794-1867), utilizou papel de filtro paraverificar a pureza dos corantes. Runge ficou fascinado com as distribuições de cores obtidas quando ele

colocou uma ou mais substâncias no centro do papel egotejou soluções aquosas sobre a mancha. Após a suaaposentaria da indústria, ele dedicou-se a separar devárias misturas de compostos colocados no papel, que foi molhado com soluções ácidas ou básicas, obtendovários desenhos (Figura 2). Runge publicou váriostrabalhos e dois livros4,5 descrevendo e mostrandoseus desenhos, mas não apresentou nenhummecanismo para explicar o fenômeno estudado.

Em 1861, Christian Friedrich Schoenbein(1799-1868) e seu aluno/colaborador, FriedrichGoppelsroeder (1837-1919), iniciaram estudos comtiras de papel que eles colocaram em frascos contendo diversas soluções6,7. O solvente subiu nas tiras e oscomponentes da solução migraram também, comvelocidades diferentes, como indica a Figura 3,apresentada no livro de Goppelsroeder8. Estespesquisadores descreveram o processo comoenvolvendo ação capilar, da mesma maneira que aseiva sobe em um árvore. É necessário indicar quetodos os experimentos foram feitos pelo processo hoje chamado análise frontal, sempre aplicando a soluçãode solvente com seus componentes e nunca peloprocesso de eluição.

Figura 1. Título do primeiro trabalho do A.J.P. Martin e colaboradores sobre cromatografia em papel.

Figura 2. Alguns desenhos de F.F. Runge utilizando papel de filtro. (A) Soluções de CuSO4 e (NH4)H2PO4 aplicados no papel edesenvolvidos com uma solução de K4Fe(CN)6; (B) MnSO4 e FeSO4 aplicados no papel e desenvolvidos com uma solução deK3Fe(CN)6; (C) K4Fe(CN)6 aplicado no papel e desenvolvido com uma solução de CuSO4.

Na década de quarenta do século vinte, omecanismo de ação capilar para explicar a subida dosolvente e seus componentes ainda foi utilzado porRaphael Edward Liesegang (1909-1947), quepublicou dois trabalhos9,10 descrevendo o uso depapel de filtro para separações, realizadas por eluiçãoascendente em um ambiente fechado, após a aplicação à tira de papel de uma mancha, contendo os analitos.Ele também descreveu o desenvolvimento em duasdimensões, usando duas diferentes fases móveis, umprocesso que ele chamou “kreuzkapillar analyse”(análise capilar cruzada). Uma vez que estes trabahosforam publicados em uma revista alemã durante asegunda guerra mundial, os seus conteúdos não foram conhecidos por Martin e seus colaboradores antes dassuas publicações.

Em Leeds, a primeira tarefa dos novoscolaboradores de Martin foi desenvolver um processode detecção. Na coluna de cromatografialíquido-líquido, Martin e Synge utilizaram um indicador para acusar a passagem dos ácidos, permitindo coletar oeluente para futuros testes. No papel, o indicador nãodeu resultados satisfatórios; precisaria de uma reaçãoposterior à separação. Uma pesquisa bibliográficasugeriu o uso de ninidrina, que reage com gruposaminos para produzir cores de verde a violeta,facilmente visíveis. Nas primeiras separações utilizarambutanol como fase móvel, mas em experimentosposteriores utilizaram diversas fases móveis, sendo queas descritas no seu primeiro trabalho3, além do butanol,foram fenol, o-cresol, 2,4,5-trimetilpiridina (colodina),álcool tert-amil, álcool benzílico e ácido tert-butírico.

O trabalho de Martin e colaboradores3

descreveu em detalhes o sistema fechado empregadono desenvolvimento por eluição descendente (Figuras 4 e 5). Além de muitos resultados sobre as separaçõesde diversos aminoácidos, utilizando várias fasesmóveis, o trabalho apresentou a descrição dodesenvolvimento em duas dimensões (Figura 6) epropôs um método para prever uma separação emduas dimensões, graficando as distâncias de corridaobservadas nas duas fases separadamente (Figura 7).Também foi proposto um termo (RF, a razão entre adistância percorrida pela substância e a percorridapela fase móvel, ambas da linha de aplicação daamostra), ainda utilizado hoje, que permitiucomparações entre os cromatogramas. Mas, acontribuição mais importante deste trabalho deMartin e colaboradores3 foi definir o mecanismo dasseparações em cromatografia em papel como departição, a distribuição dos componentes entre doislíquidos, um sendo suportado por um sólidoestacionário e o outro em movimento contínuo.

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Figura 3. Sistema de cromatografia em papel ascendente de Goppelshroder.

Figura 4. Cuba para desenvolvimento descendente deMartin e colaboradores1.

Figura 5. Detalhe do recipiente para contato do papel molhadocom água com a fase móvel de Martin e colaboradores3.



Referências Bibliográficas1. C.H. Collins, Sci. Chromatogr. (São Carlos), 1, no. 3,

7-10 (2009).

2. A.P.J. Martin, R.L.M. Synge, Biochem. J., 35,

1358-1368 (1941).

3. R.Consden, A.H. Gordon, A.P.J. Martin, Biochem. J.,

38, 224-232 (1944).

4. F.F. Runge, “Zur Farben-Chemie. Musterbildung für

Freunde des Schönen und zum Gebrauch für Zeichner,

Maler, Verzierer und Zeugdrucker. Dargestellt durch

chemische Wechselworkung”, E. S. Mittler & Sohn,

Berlim, 1850.

5. F.F. Runge, “Der Bildungstrieb der Stoffe,

veranschaulicht in selbstständig gewachsenen Bildern

(Fortsetzung der Musterbilder”, publicado pelo autor,

Oranienburg, Alemanha, 1855.

6. C.F. Schoenbein, Verb.Naturforsch. Ges. Basel, 3,

249-255 (1861).

7. F. Goppelsroeder, Verb.Naturforsch. Ges. Basel, 3,

268-275 (1861).

8. F. Goppelsroeder, “Capillaranalyse beruhendvauf

Capillaritäts- und Adsorptionserscheinungen”, Emil

Birkhäuser Verlag, Basel, 1901.

9. R.E. Liesegang, Z. Anal Chem. 126, 172-177 (1943).

10. R.E. Liesegang, Z. Anal Chem. 126, 334-336 (1943).

Figura 6. Cromatograma em duas dimensões do trabalho de Martin e colaboradores3.

Figura 7. Gráfico proposto por Martin e colaboradores3,ilustrando como prever as separações em duas dimensões.

1. IntroduçãoApesar do excelente poder analítico das

diferentes técnicas de separação como acromatografia gasosa (GC), a cromatografia líquidade alta eficiência (HPLC) e a eletroforese capilar(CE), a determinação de compostos presentes emconcentrações reduzidas em matrizes complexasgeralmente exige uma etapa prévia de preparação dasamostras. Por exemplo, na análise de fármacos e

metabólitos em fluidos biológicos (sangue total,plasma, líquor etc.), as proteínas e outros compostosendógenos presentes nestas amostras podem seradsorvidos no material de recheio da coluna ou naparede do capilar empregado em CE, levando amudanças nos tempos de retenção/migração ediminuição da eficiência das colunas utilizadas1. Poroutro lado, os compostos endógenos eluídos dacoluna ou capilar podem interferir na determinaçãodos analitos de interesse.

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PREPARO DE AMOSTRAS

Fundamentos e avanços recentes da microextração em fase líquidaempregando membranas cilíndricas ocas (LPME)

ResumoEste artigo tem o objetivo de discutir os fundamentos da

microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas

ocas. Os avanços recentes na técnica e algumas aplicações em

diferentes áreas também são destacados.

AbstractThis article aims to discuss the fundamental aspects of hollow

fiber-liquid phase microextraction. Recent advances of this technique

and some applications in different areas are also highlighted.

Keywords

Analytical techniques,

sample preparation techniques,

liquid-phase microextraction,

LPME.

Maria Eugênia C. QueirozEditora

Igor Rafael dos Santos Magalhães, Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira,Pierina Sueli Bonato*

Universidade de São Paulo Universidade de São PauloFaculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto14040-903 – Ribeirão Preto (SP) Departamento de QuímicaBrasil. 14040-901 – Ribeirão Preto (SP)*[email protected] Brasil.

Palavras-chave

Técnicas analíticas, técnicas

de preparação de amostras,

microextração em fase líquida,

LPME.

Dentre as propriedades ideais de uma técnica depreparação de amostras, pode-se destacar asimplicidade, a rapidez, o baixo custo, a seletividade e aalta recuperação do analito de interesse2. Atualmente, astécnicas de preparação de amostras mais utilizadas são aextração líquido-líquido (LLE) e a extração em fasesólida (SPE)3. Nessas duas técnicas, os procedimentossão geralmente tediosos, caros e requerem grandeconsumo de solventes orgânicos4. Portanto, astendências recentes em técnicas de preparação deamostras apontam na direção de miniaturização,automação e uso reduzido de solventes orgânicos5.

Uma promissora técnica de extração,caracterizada pelo consumo reduzido de solventesorgânicos, foi desenvolvida recentemente e denominada microextração em fase líquida empregando membranascilíndricas ocas (Hollow fiber-liquid phasemicroextraction, LPME). Essa técnica vem sendoempregada com sucesso na análise de várias matrizesincluindo, biológicas, ambientais, alimentícias etc.

2. Histórico e fundamentos da LPME empregando membranas cilíndricas ocas

Várias tentativas foram feitas nas últimasdécadas para a miniaturização da LLE tradicional, como objetivo final de reduzir a razão solventeorgânico/fase aquosa, porém conservando ascaracterísticas desejáveis da técnica precursora. Oprimeiro relato de um procedimento empregando essaestratégia foi feito por Jeannot e Cantwell, em 1996,que desenvolveram a técnica denominadamicroextração em gota única (single dropmicroextraction – SDME)6. Nessa técnica, uma gota de solvente orgânico, suspensa em um dispositivoespecial de Teflon®, foi utilizada para a extração dosanalitos de interesse presentes na matriz aquosa. Para aextração, o dispositivo com a gota suspensa foi imersono frasco contendo a amostra e a solução foi submetidaa agitação por um tempo necessário para difusão dosanalitos da matriz aquosa para a gota de solventeorgânico. No final da extração, a gota foi recolhida para posterior análise. Logo após, um novo formato deSDME foi introduzido, o qual permite o uso demicrosseringas convencionais para a execução datécnica7,8. A SDME pode ser empregada por imersãodireta da gota na amostra ou via headspace;procedimentos baseados em duas ou três fases sãodescritos para SDME. Visto que a técnica é baseada natransferência dos analitos presentes em mililitros deamostra para alguns microlitros de solvente orgânico,

altas taxas de concentração são alcançadas no extratofinal (enriquecimento). Por outro lado, a SDMEapresenta algumas desvantagens, sendo a principaldelas relacionada à instabilidade da gota suspensa naponta da agulha da microsseringa, que pode prejudicara precisão do método e impedir o uso de períodos deextração prolongados e maiores velocidades deagitação. Além disso, a ocorrência de emulsificação noprocessamento de amostras contendo lipídios (porexemplo, plasma) dificulta a aplicação dessa técnica naárea bioanalítica. Essa técnica é considerada aprecursora do termo microextração em fase líquidapela introdução do uso de microlitros de solventeorgânico em um procedimento de extração9.

Baseados na excelente capacidade deconcentração, seletividade e baixo consumo desolventes orgânicos desta técnica, Pedersen-Bjergaarde Rasmussen propuseram uma alternativa para o uso da microextração em fase líquida10. Na técnicadesenvolvida por eles, uma membrana cilíndrica oca,porosa e hidrofóbica (Figura 1), com diâmetro interno

de 600 µm, paredes com espessura de 200 µm e poros

de 0,2 µm, é impregnada com um solvente orgânicoimiscível em água e o lúmen da mesma é preenchidocom microlitros de uma fase aceptora. As duasextremidades da membrana são conectadas a duasmicrosseringas que servem para a introdução e retiradada fase aceptora. Dessa forma, a membrana atua comouma barreira entre as fases doadora (amostra) eaceptora, permitindo a aplicação de agitação. Como amembrana empregada possui poros de tamanhoreduzido, as macromoléculas presentes na amostra nãosão extraídas. Para evitar a ocorrência de contaminação entre as análises, cada unidade de extração é utilizadauma única vez. Dentre as várias tentativas paraminiaturização da LLE, a microextração em faselíquida empregando membranas cilíndricas ocas (LPME) é a que teve maior sucesso, por combinar oconceito de extrações com membranas ao uso reduzidode razões solvente orgânico/fase aquosa, conservandoos princípios observados na LLE convencional11-14.



Figura 1. Membrana cilíndrica oca de polipropilenoutilizada na microextração em fase líquida (LPME).

A LPME pode ser utilizada nos modos deextração em duas ou três fases15, de acordo com ascaracterísticas do analito em questão, conforme podeser observado na Figura 2.

No sistema em duas fases, o analito A éextraído da amostra aquosa (fase doadora) para umsolvente orgânico imiscível em água presente nolúmen da membrana (fase aceptora), através domesmo solvente imobilizado nos poros da membrana.O equilíbrio de extração no sistema de duas fasespode ser descrito como:

A fase doadora D A fase orgânica

O equilíbrio é caracterizado pela constante dedistribuição Korg/d, que é definida como a razão daconcentração do analito A na fase orgânica (org) e nafase doadora (d). A força motriz do processo deLPME em duas fases é a diferença de solubilidade doanalito entre as fases aquosa e orgânica e, portanto,esse modo é geralmente empregado na extração decompostos com caráter neutro ou de baixa polaridade. Visto que o solvente extrator presente nos poros damembrana não é disponível para a análise, asrecuperações obtidas em duas fases são geralmentemenores que as previstas em cálculos teóricos. Comoo extrato obtido é orgânico, a fase aceptora pode serdiretamente analisada por GC ou HPLC em fasenormal.

No modo de três fases, o pH da amostra aquosa (fase doadora) é ajustado de tal forma a manter oanalito A na forma neutra, que é então extraído por um

solvente orgânico imiscível em água imobilizado nosporos da membrana, passando para uma soluçãoaquosa presente no lúmen da mesma (fase aceptora).Nesta fase, de pH oposto ao da amostra, o analito éconvertido para a forma ionizada e, desta forma,impossibilitado de retornar para o solvente orgânico.Logo, o analito deve apresentar maior solubilidade nafase aceptora aquosa do que no solvente orgânicodepositado na membrana para obtenção de taxas deenriquecimento desejáveis. Resumindo-se, oequilíbrio de extração no sistema de três fases podeser definido como:

A fase doadora D A fase orgânica D A fase aquosa

O equilíbrio é caracterizado pelas constantesde distribuição Korg/d e Ka/org . Korg/d é definida como a razão entre as concentrações do analito nas fasesorgânica (org) e doadora (d), enquanto que Ka/org é arazão entre as concentrações do analito nas fasesaceptora (a) e orgânica (org). A constante dedistribuição total entre as fases aceptora e doadorapode ser descrita por:

Ka/d = Korg/d . Ka/org

O processo em três fases é indicado paraanalitos moderadamente hidrofóbicos com gruposionizáveis (ácidos ou bases fracas) e o parâmetro mais importante no processo é a diferença de pH das fasesdoadora e aceptora. Após a extração, a fase aceptoraaquosa obtida pode ser prontamente introduzida emCE em meio aquoso ou HPLC em fase reversa.Recentemente, Bardstu et al. publicaram um trabalhorelatando algumas recomendações práticas acerca daexecução da LPME no modo de três fases16.

Outra opção disponível para LPME é oemprego de carreadores para a extração de analitosaltamente hidrofílicos e caracterizados por baixoscoeficientes de distribuição octanol-água17. Nestemodo, reagentes adicionados na fase doadora ou nosolvente orgânico possibilitam a formação de paresiônicos com o analito de interesse, reduzindo a suapolaridade e favorecendo a partição no solventeorgânico impregnado na membrana 18.

Para realização da extração, o modo estáticoou o modo dinâmico podem ser utilizados naLPME11. No modo estático, a fase aceptora presentena membrana permanece estagnada durante aextração e o frasco contendo a amostra sofre agitaçãovigorosa por diferentes meios (por exemplo,magnético), com o objetivo de permitir a renovaçãoconstante da fase doadora em contato com amembrana. Terminada a extração, a fase aceptora é

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Figura 2. Modos de extração empregados na LPME: duasfases (esquerda) e três fases (direita).

coletada e analisada conforme desejado. No mododinâmico, desenvolvido para acelerar o processo deextração e aumentar as recuperações, a fase aceptora é repetidamente injetada e retirada da membrana,possibilitando o trapeamento do analito após algunsciclos. Da mesma forma que no modo anterior, nofinal da extração a fase aceptora é separada paraanálise. Neste modo da técnica, além dos parâmetrostradicionais que devem ser otimizados em LPME,outros fatores também devem ser avaliados paraotimização do processo como, por exemplo, o número de ciclos, o tempo de permanência e a velocidade deinjeção da fase aceptora. Além disso, o mododinâmico requer o uso de instrumentação pararealização do procedimento (ex.: bombas).

Dentre as várias vantagens da LPME comotécnica de extração, destaca-se a simplicidade, visto quenenhum aparato específico é necessário paraimplantação do procedimento no laboratório. Desde apublicação do trabalho pioneiro de Pedersen-Bjergaarde Rasmussen, há exatos dez anos, vários formatos forampropostos para aplicação da técnica, inclusive umsistema idealizado em nosso laboratório (Figura 3), noqual as microsseringas utilizadas para o suporte damembrana foram substituídas por microponteiras19,20.As amostras são normalmente agitadas magneticamentecom barras (mais comum), por vortex ou usando umultrassom. Outra modificação importante na técnica foi a introdução de membranas com maior diâmetro interno(1200 µm), que possibilitam o uso de maior quantidadede fase aceptora, bem como seções do dispositivo detamanho reduzido (< 2 cm). Embora polipropileno seja o material mais popular para confecção da membrana,outros materiais vêm sendo empregados para estafinalidade (por exemplo, polissulfona21 e difluoreto depolivinilideno22).

Diferentes parâmetros devem ser otimizadosdurante o desenvolvimento do método, tais como: tipo de solvente orgânico, ajuste do pH da amostra,solução aceptora (no caso de três fases), aplicação detemperatura e agitação no sistema, tempo de extração, além da adição de modificadores orgânicos e paresiônicos14. Assim como em outras áreas da químicaanalítica, o planejamento experimental na otimizaçãodo processo de extração em LPME também tem sidousado com sucesso23. Uma descrição detalhada, emlíngua portuguesa, da influência desses parâmetros na otimização de um procedimento por LPME podem ser encontrados em De Oliveira et al.24.

3. Avanços recentes da técnicaA LPME caracteriza-se por ser uma técnica em

constante evolução desde o surgimento dos primeirosrelatos da mesma. Inicialmente, a técnica foiidealizada para extração de substâncias orgânicas. Noentanto, estudos recentes direcionados para a análisede compostos inorgânicos também começam a serdescritos. Chen et al. realizaram a determinação deperclorato em água por intermédio da formação de um par iônico com o carreador acetato de hexilamônio,com posterior análise por espectrometria de massas(MS)25. Saleh et al. promoveram a extração de selênio presente em amostras de água, urina e plasma com umprocedimento de LPME em duas fases26. Para a eficaz recuperação do analito, o metal foi complexado com o reagente fenilenodiamina, levando à formação de umproduto passível de partição no solvente orgânico. Oextrato orgânico resultante foi analisado por HPLCcom detecção por absorção no ultravioleta (UV).



Figura 3. Novo formato da LPME desenvolvido recentemente.

Com o intuito de melhorar a separaçãocromatográfica de alguns analitos, procedimentos dederivação in situ têm sido relatados. Nesse processo, areação ocorre a partir da adição do agente de derivaçãono meio contendo a amostra ou no solvente de extração impregnado na membrana. Saaid et al. relataram aextração de diferentes aminas biogênicas em amostrasde alimentos, utilizando LPME em três fasessimultaneamente à derivação desses analitos comcloreto de dansila presente na fase doadora27. HPLCfoi empregada para analisar o extrato proveniente doprocedimento de extração. Lee et al. utilizaram oreagente N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamidadissolvido em clorofórmio depositado na membranapara derivação e extração de produtos de degradaçãode diferentes agentes químicos em água, com posterioranálise por GC-MS28.

Algumas modificações técnicas foramintroduzidas na LPME com o passar dos anos.Inspirados na extração sortiva em barras de agitação(SBSE), Jiang e Lee desenvolveram um novo formato para a técnica, que emprega seções da membrana (2cm) fechadas nas duas extremidades e preenchidascom solvente orgânico (neste caso, octanol) (Figura4). Logo depois, a unidade é inserida na amostraaquosa e a extração é iniciada com o auxílio deagitação magnética. Após o tempo necessário, osolvente orgânico é coletado e analisado por GC-MS.O procedimento desenvolvido foi denominado desolvent bar microextraction (SBME)29.

Apesar de a LPME possibilitar a extração devárias amostras ao mesmo tempo pela simplicidade ebaixo custo de cada unidade de extração, o temponecessário para alcançar níveis satisfatórios derecuperação pode ser relativamente alto em algunsmétodos, especialmente quando é necessário realizaras extrações no estado de equilíbrio. Portanto, umanova modalidade de LPME foi desenvolvida com oobjetivo de melhorar essa característica. Nesseprocesso, denominado de extração eletrocinética emmembranas (electro membrane extraction - EME), atransferência do analito da amostra para a faseaceptora ocorre, principalmente, pela migraçãoeletrocinética proporcionada pela diferença depotencial entre as fases30. O formato da EME ébastante similar ao usado na LPME em três fasesporém, eletrodos são inseridos na fase doadora eaceptora para geração do campo elétrico (Figura 5).No primeiro relato da EME foram utilizadas altasvoltagens para realização do procedimento e,recentemente, Kjelsen et al. sugeriram o emprego debaixas voltagens obtidas com baterias convencionais

de 9 V31. Embora o conhecimento atual sobre EMEseja limitado, a seleção do pH da solução aceptora, dosolvente orgânico presente na membrana, do tempo de extração e do potencial elétrico aplicado no sistemasão importantes na otimização do processo32. Dessaforma, os estudos desta modalidade descritos naliteratura relatam períodos de extração menores quedez minutos33. A EME tem sido aplicada para apreparação de amostras bioanalíticas contendodiferentes fármacos34.

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Figura 4. Representação ilustrativa da solvent barmicroextraction (SBME).

Figura 5. Representação ilustrativa da extraçãoeletrocinética em membranas (EME).

Uma possível desvantagem atribuída à LPMEé a necessidade de manipulação das membranas nasetapas do procedimento. Portanto, a automação doprocesso tem sido idealizada por vários grupos depesquisa e, nos últimos anos, algumas tentativasforam descritas nesse sentido. Zhao e Lee publicaramo primeiro relato utilizando esta estratégia35. Maistarde, Hou et al. desenvolveram um sistemasemiautomatizado para injeção e retirada da faseaceptora orgânica com uma bomba de injeção emLPME dinâmica36. O procedimento idealizado foiaplicado na determinação de diferentes pesticidas emágua empregando GC-MS como técnica de análise.Müller et al. relataram o uso de um amostradoracoplado ao GC-MS para injeção do extrato obtidoapós LPME estática de alguns compostosbiologicamente ativos em água37. Em 2005, Jiang etal. reportaram um sistema otimizado de LPMEdinâmica para extração de nitrofenol de água38. Nesse trabalho, uma bomba específica também foiempregada e programada para realização dos ciclosde introdução e remoção do solvente orgânico.Procedimento semelhante foi adotado em outrotrabalho do grupo para determinação de algunsherbicidas em água utilizando LPME em três fases39.

Sistemas completamente automatizadostambém têm sido desenvolvidos para realização doprocesso de extração. Ouyang e Pawliszyn relataramo emprego de um sistema integrado ao amostradorCTC CombiPal®, que foi utilizado para análise decarbaril em amostras de vinho40. Diferentemente dosoutros trabalhos, todas as etapas da LPME (injeção eretirada da fase aceptora, agitação da amostra eintrodução no sistema analítico) são realizadas porintermédio de um programa específico. Nozal et al.descreveram o acoplamento in-line da LPME em umequipamento de CE disponível comercialmente41.Neste sistema, o dispositivo de extração foiacomodado no cartucho contendo o capilar de sílicafundida e o procedimento de extração executado porcomandos presentes no próprio programa para CE. Os autores aplicaram o método para determinação deanti-inflamatórios não esteroidais em urina.Recentemente, Pezo et al. desenvolveram um sistemaautomatizado para LPME no modo dinâmico, quepossibilita a extração de várias amostras ao mesmotempo42. Além disso, um protótipo comercial pararealização da LPME em placas de 96 poços foidesenvolvido e apresentado recentemente, e podeaumentar consideravelmente a capacidade deprocessamento das amostras da técnica bem comofacilitar a automação e conexão direta dela com osdiferentes sistemas analíticos11.

4. ConclusõesNeste trabalho, os diferentes aspectos da

LPME foram apresentados e discutidos. Fica evidente o envolvimento de diversos grupos de pesquisa nodesenvolvimento da técnica, propondo modificaçõesno intuito de sobrepor as dificuldades na extração dealgumas classes de compostos e facilitar a automaçãoda LPME. As vantagens inerentes à LPME e o grandenúmero de artigos publicados nos últimos anosrelatando o emprego da técnica sugerem que, embreve, ela poderá se tornar uma técnica de rotina emlaboratórios analíticos e bioanalíticos.

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2009 | v . 1 | n . 4 17


1. IntroducciónLa espectrometría de masas es una de las

técnicas más “antiguas” dentro del arsenal de métodosinstrumentales sofisticados para el análisis decompuestos químicos. Sus inicios se relacionan son lostrabajos de Goldstein (1886) sobre las especiespositivamente cargadas y de Wien (1898), quiendescubrió que los iones cargados positivamente sedeflexionaban en un campo magnético. Pero,

fundamentalmente el surgimiento de este método sevincula con los trabajos de Sir J. J. Thomson, a quien se le considera el padre de la espectrometría de masas. Elprimer triunfo de esta técnica fue logrado en 1913,cuando J.J. Thomson demostró experimentalmente laexistencia de isótopos de neón1. Desde el inicio delsiglo XX, la espectrometría de masas sólo hademostrado su vertiginoso desarrollo y progreso,múltiples y cada vez nuevas aplicaciones,prácticamente, en todos los campos de la ciencia, desde

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CROMATOGRAFIA GASOSA (GC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Aspectos prácticos de la ionizacióncon electrones en la obtención deespectros de masas y su interpretación

ResumenSe describen algunos aspectos prácticos de uno de los métodos

más usados, ionización con electrones, para el análisis de compuestos

volatilizables y termoestables. Este método encuentra gran aplicación

en la técnica de cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de

masas. Se discuten algunos detalles particulares para la interpretación

de los espectros de masas obtenidos por ionización con electrones.

AbstractPractical aspects of electron ionization, one of the most used

methods in the analysis of volatile and termostable organic compounds

are described. This method finds great application in the technique of

gas chromatography coupled to mass spectrometry. Particular details

of electron ionization mass spectra interpretation are discussed.

Palabras clave

Espectrometría de masas,

ionización por electrones,

isómeros

Keywords

Mass spectrometry, electron

ionization, isomers

Elena E. StashenkoEditora

Elena E. Stashenko*, Jairo René Martínez

Universidad Industrial de Santander, Escuela de Química.Centro de Investigación de Excelencia, CENIVAM, Laboratorio de Cromatografía. BucaramangaColombia* [email protected]

el estudio de nanopartículas hasta las investigacionesque se llevan a cabo en espectrómetros instalados en las naves o estaciones espaciales.

Las aplicaciones de la espectrometría de masasson incontables. Van desde el análisis de agentes dedoping en deporte, residuos de explosivos y susprecursores, estudio de metabolitos de un fármaco,determinación de biomarcadores en petróleo o gas,análisis de gases de exhalación de un paciente,detección de trazas de dioxinas o bifenilos policlorados (PCBs) en un pescado, determinación de la secuenciade aminoácidos en un péptido, revelación deadulteraciones en una muestra de propóleo,establecimiento de la composición de materialessemiconductores, estudio del proceso de fermentaciónen un biorreactor, detección de residuos de disparo enla mano de un sospechoso, determinación depotenciales de ionización de moléculas o energías deenlaces en un compuesto químico y decenas de másejemplos de sus usos, que se pueden encontrar2-14. Enrealidad, es mucho más fácil indicar dónde y cuándo no se emplea la espectrometría de masas que dónde seaplica, e.g., en química ambiental y forense, síntesisorgánica, productos naturales y petroquímica,alimentos, control de calidad de procesos y productos,entre muchas otras.

En general, las aplicaciones de laespectrometría de masas se pueden clasificar grossomodo según la naturaleza de los analitos, en: (a)moléculas inorgánicas (geoquímica, análisiselemental, análisis isotópico, caracterización demateriales y superficies, etc.)9-14; (b) moléculasorgánicas (productos de síntesis, contaminantesorgánicos ambientales, aromas, ácidos grasos,feromonas, fármacos, etc.)15,16, y (c) macromoléculas(polímeros sintéticos, biomoléculas de alto pesomolecular, e.g., proteínas, polisacáridos, etc.)2-8,17. Eldesarrollo de la espectrometría de masas siempre hasido en tres direcciones paralelas e interdependientes, a saber: (1) desarrollo de instrumentación18-22, que hoyen día se caracteriza por la miniaturización,portabilidad y automatización más completa posible de los equipos, computarización y búsquedas avanzadasde espectros, aumento de sensibilidad y de resoluciónde la técnica, entre otros aspectos; (2) desarrollo yvalidación de métodos23-25, donde se observa cada vezun mayor número de aplicaciones de espectrometría demasas en diversos campos del conocimiento, latecnología y la industria; (3) interpretación deespectros y los datos obtenidos26-28, este campo,aunque parece un poco “escolar” y hasta secundario, en realidad, resulta ser de gran importancia a la hora deaplicar la espectrometría de masas en el laboratorio,

puesto que la abrumadora mayoría de investigadoresson “consumidores” netos de los equipos de masascomerciales o de los métodos ya establecidos o en parte desarrollados, o sea, aplican los protocolossistematizados o elaborados por agencias reguladoras o por otros investigadores. Es ahí donde la correctainterpretación y la validación de resultados obtenidosempiezan a ser vitales y críticas para el análisis.

Sobra decir, que los tres campos de desarrollode la espectrometría de masas son vinculantes. Porejemplo, la necesidad de un método nuevo, mássensible, puede requerir un cambio en el hardware del equipo, mientras que los resultados obtenidos y suinterpretación se derivan de la aplicación idónea delmétodo y del uso y mantenimiento correcto de unequipo de masas y su explotación en condicionesóptimas de sensibilidad y resolución. Un hecho tantrivial como la contaminación de una cámara deionización o una fuga en el sistema pueden conducir alos llamados falsos negativos, o sea, a la no detecciónde una sustancia presente en una muestra.

La técnica de espectrometría de masas, a pesarde demostrar su gran madurez, se encuentra emperoen un cambio permanente; su evolución es intensa,sobre todo, en el área del acoplamiento sinérgico conotras técnicas, e.g., las de separación, entre ellas, lacromatografía de gases, la cromatografía líquida osupercrítica y la electroforesis capilar. Los avancesmás relevantes se destacan en el campo de desarrollode las técnicas de espectrometría de masas enbioquímica, química médica, diseño de nuevasdrogas, desciframiento de estructuras proteicas, o sea, para el análisis de biomoléculas en general. Lanecesidad de este análisis indujo cambiosfundamentales y sensibles progresos en las técnicasde ionización y separación de iones y, sobre todo,impulsó el desarrollo de las configuraciones tándem,que involucran la combinación de variosanalizadores29. El uso ampliamente difundido de laespectrometría de masas se respalda en la numerosaliteratura científica (enciclopedias, manuales,monografías, compendios, etc.)25,30-38, ello, solo paramencionar algunas referencias. Existen revistasespecializadas de espectrometría de masas39,publicaciones seriadas de analítica instrumental40 y de ciencias de separación41, con publicaciones deartículos donde se usa la espectrometría de masas; sedispone de bases de datos generales y especializadas(NIST, WILEY, EPA, pesticidas, drogas, aromas. Las publicaciones seriadas, monografías y revisiones,manuales y libros sobre la espectrometría de masaspermiten estar permanentemente actualizados en estecampo.



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En general, un arreglo “absoluto” o “único” deun espectrómetro de masas no existe: los equipos seescogen o se configuran de acuerdo con el tipo demuestras a analizar. Varias propiedades de la muestrase deben tener en consideración, entre ellas, el gradode su pureza o, al revés, de la complejidad de lamezcla, el tipo de interferencias presentes, lavolatilidad y la polaridad de los analitos y el rango desus pesos moleculares. Es por ello, que se encuentrandiferentes sistemas de aplicación de la muestra,modos de su ionización y principios que rigen laseparación de iones y su detección y sus variadascombinaciones. Consecuentemente, el costo de unespectrómetro de masas puede variar desde 50-70 mildólares hasta un millón de dólares estadounidenses.En la Tabla 1 aparecen los bloques principales deespectrómetros de masas y algunos ejemplos de lastécnicas de ionización, separación y registro de iones,más comunes.

El desarrollo tecnológico de los equipos deespectrometría de masas en los últimos 30 años esasombroso: el salto evolutivo desde aparatos de untamaño que requerían un espacio grande -casi de unahabitación entera y un equipo de ingenieros y técnicos para su calibración, manejo y mantenimiento-, hastaequipos tándem que caben sobre una mesa pequeña(bench-top), o espectrómetros portátiles. En la Figura 1se puede observar a manera de ejemplo este elocuenteavance en tecnología.

La esencia de un método espectrométrico demasas gira alrededor del proceso de ionización de lamolécula, acompañada o no de su posterior disociacióno fragmentación. En la mayoría de los casos laionización de la molécula es disociativa. Susmecanismos pueden ser varios, e.g., la substracción oadición de un electrón, reacciones de recarga,protonación o deprotonación, adición electrofílica osubstracción nucleofílica y formación de clusters, entre

Sistemas de aplicación de la muestra Modos de ionización de analitos Sistemas de separación y detección de iones

Entrada por lotes

Sonda directa con calentamiento programado

Ionización en fase vapor:

Ionización por electrones (EI)

Ionización química (CI) de iones positivos(PICI) y negativos (NICI)46

Fotoionización (PI)

Ionización por campo (FI)

Analizadores de masas de baja resolución:

Deflexión magnética (B)

Cuadrupolo (Q)19

Trampa de iones (IT)20

Tiempo de vuelo (TOF)21,22Acoplamientos:

Cromatografía de gases (GC-MS)42

Cromatografía líquida (LC-MS)43,44

Cromatografía con fluido supercrítico(SFC-MS)45

Electroforesis capilar (CE-MS)

Dispositivos externos:

Muestreador de espacio de cabeza(Headspace sampler)

Purga y trampa (P&T)

Desorción térmica

Pirolizador (Py/MS)

Ionización en fase condensada

Desorción por campo (FD)

Desorción por laser (LD)

Bombardeo con átomos acelerados (FAB)

Espectrometría de masas de iones secundarios(SIMS)

Desorción plásmica (PDMS)

Desorción por laser asistida por la matriz(MALDI)

Analizadores de masas de alta resolución:

Equipos de doble enfoque: camposelectrostático (E) y magnético (B)

Analizador de tiempo de vuelo (TOF)

Resonancia ion-ciclotrón con trasformada deFourier (FT-MS)

LC-MS

Electrospray (ESI)17

Termospray (TSI)

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

Configuraciones tándem

Triple cuadrupolo (QQQ), BEB, BEBE, BEEB

Híbridos: BEQ, BE/TOF, Q/TOF

MS/MS de un solo analizador (IT)20

Tabla 1. Resumen de los bloques principales de un espectrómetro de masas: sistemas de entrada de la muestra, modos deionización y separadores (analizadores) de iones, más comunes en espectrometría de masas*.

*Las abreviaturas están dadas por sus siglas en inglés.

algunos otros procesos conducentes a laformación de iones. Básicamente, laionización puede ocurrir en dos estados: a). enfase vapor (EI, CI, FI, PI) y requiere que losanalitos sean volatilizables y termoestables;b). en fase condensada (FD, LD, FAB, SIMS,MALDI) y permite la ionización de moléculas termolábiles, muy polares, no volátiles o dealto peso molecular. La ionización de unamolécula es un proceso que requiere energía,que puede ser suministrada por electronesacelerados (“impacto” de electrones) otérmicos (captura de electrones), por fotones(fotoionización, descarga corona, rayo láser),por átomos o iones acelerados, por ungradiente alto de campo electrostático o porimpacto térmico, entre otros mecanismos. Laseparación o el “pesaje” de los iones–productos de la ionización de la moléculaneutra y su posterior ionización disociativa ofragmentación-, se puede hacer con diferentesgrados de exactitud, según la “balanza” que seuse, i.e., analizador (separador o filtro)másico, su sensibilidad, velocidad de barrido,transmitancia de iones, la exactitud de lamedición o la resolución de las señales(corrientes iónicas).

El resultado final de un análisisespectrométrico de masas son las corrientesiónicas parciales (I) medidas en función delas masas de iones y sus cargas (m/z), lo queconstituye un espectro de masas. Éste es unespacio bidimensional basado en dosvariables obtenidas experimentalmente{m/z, I}; su representación puede ser enforma gráfica o tabular. Estas dos variables“objetivas” permiten hacer deduccionesrazonables conducentes a la elucidaciónestructural. Es ahí donde reside la magia deesta técnica analítica: a través de la ionización de lamolécula neutra desconocida, su posterior disociaciónen iones-fragmento o formación de clusters, cuyasmasas y el número de especies cargadas formadas semiden, se llega a saber cuál fue la estructura moleculardel analito analizado por masas (nombre coloquial deespectrometría de masas) y, en concreto, se obtienenlos siguientes datos: (1) masa molecular; (2) gruposfuncionales presentes; (3) composición exactaelemental (si se usan analizadores con capacidad dealta resolución) y, hasta lo más “sagrado” en ladeterminación estructural (privilegios de la RMN o dela difracción de rayos X), (4) la estereoquímica de lamolécula, la disposición espacial de los sustituyentes.

En la Figura 2 se pueden observar dosespectros de masas, obtenidos por ionización conelectrones (EI, 70 eV), de un sesquiterpenol, C15H24O(Figura 2A) y un monoterpenol, C10H18O (Figura2B). Ninguno de estos dos compuestos naturalesexhibe la señal del ion molecular en su espectro, i.e., enm/z 222 y 154, respectivamente; pero aparecen ionescaracterísticos de la deshidratación de la moléculaionizada, a saber: en m/z 204 y 136, correspondientes alos iones-fragmento (M - H2O)+ ·. La presencia de unsustituyente estructural común en ambas moléculas,HO-C(CH3)2, se pone de manifiesto en sus espectrosde masas a través de un pico de base en m/z 59,mientras que los enlaces dobles en estas moléculascondicionan la aparición de iones alílicos en m/z 41 y



Figura 1. (A) Espectrómetro de masas de deflexión magnética (inicio delos años 80 del siglo pasado). Obsérvese, entre otros bloques, la inmensabomba de vacío (bomba difusora de Hg). (B) Un analizador de masastándem, de triple cuadrupolo, que cabe sobre una pequeña mesa(bench-top).

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55. Los rasgos estructurales comunes (por ejemplo,algunos sustituyentes) en moléculas químicasdiferentes se reflejarán en la aparición en sus espectrosde las señales de los iones-fragmento comunes; perolas diferencias estructurales de las moléculas semanifestarán de inmediato a través de un patrón defragmentación distinto, que es sumamente sensible acualquier cambio, aún pequeño, en la estructura. Nohabrá dos moléculas diferentes que tenganabsolutamente idénticos sus espectros de masas: hastapara isómeros espaciales, en sus espectros de masas, senotarán diferencias cuantitativas de las señales de susiones característicos.

2. Ionización por electronesLa obtención de un espectro de masas es un

balance energético sui generis que se guarda dentrode la escala de energías involucradas en el proceso,que van desde la excitación electrónica de una

molécula (e.g., espectroscopia ultravioleta-visible)hasta su atomización (absorción o emisión atómica).Por un lado, es importante ionizar la molécula (e.g.,sustraer o adicionar un electrón, protonar odeprotonarla), lo que permitiría hallar su masamolecular o composición elemental exacta; pero, deotro lado, es necesario, que parte de las moléculasionizadas se logren disociar o fragmentar, lo quepermite saber qué grupos constituyentes integran lamolécula y en cuál combinación se unen. El métodode ionización de moléculas orgánicas más “antiguo”-pero también más difundido y con un gran número de aplicaciones (por ejemplo, en GC-MS)-, es laionización por electrones (EI), no precisamentellamado “impacto de electrones”, puesto que eltamaño y la energía de un electrón, en comparacióncon una molécula orgánica de 150-500 Da, nopermiten en realidad “impactarla”, tal como unapelota de ping-pong poco “impactaría” a unrinoceronte. La interacción de un electrón aceleradocon una molécula conduce a la excitación de

Figura 2. Espectros de masas obtenidos por ionización con electrones (EI, 70 eV) de: (A) Sesquiterpenol, C15H24O y (B)Monoterpenol, C10H18O. Obsérvese la señal en m/z 59, pico de base, correspondiente a un sustituyente común presente en ambas moléculas.



electrones moleculares y, si la energía impartida lopermite, o sea, si se alcanza la energía o potencial deionización (IP), necesaria para retirar un electrón de la molécula neutra en fase vapor, sucede la formación de un ion molecular M+ ·, cuya masa nominal es igualnuméricamente a la de la molécula, puesto que encomparación, la de un electrón es despreciable.

Los electrones son excelentes agentes paraionizar las moléculas orgánicas. En primer lugar,porque su obtención es fácil: solo hay que pasar unacorriente eléctrica por un alambre de tungsteno orenio (filamento o cátodo); y, en segundo lugar, suenergía es regulable con el voltaje aplicado entre elcátodo (termo-emisor de electrones) y el ánodo(conectado polo a tierra), siendo la energía estándarpromedio -aceptada por convención en todo elmundo-, de 70 eV. En la Figura 3 se puede observarla dependencia de la eficiencia de ionización(corrientes de iones moleculares y de iones-fragmento y corriente iónica total) de la energía de electronesbombardeantes. Para la mayoría de moléculasorgánicas, la máxima eficiencia de ionización sealcanza ya con electrones bombardeantes de 50-60 eV de energía. Los espectros de masas estándar se tomana 70 eV debido a que se logran su repetitividad yreproducibilidad más altas. Las bibliotecas deespectros de masas están formadas también con losespectros obtenidos por la ionización con electronesde 70 eV de energía. Todo esto facilita la comparación

de los espectros tomados en diferentes equipos con los de las bases de datos y entre sí.

La energía de electrones bombardeantes de 70eV supera con creces a la necesaria para ionizar lasmoléculas orgánicas. Las energías de ionización (opotenciales de ionización, IP, del inglés, IonizationPotential) para las moléculas orgánicas yacen en elintervalo de 6 a 13 eV, y dependen de su estructuramolecular. Por ejemplo, para ionizar la molécula deciclohexano se requiere la energía de 9.9 eV; parabenceno – 9.2 eV, tolueno - 8.8 eV, piridina – 8.2 eV ypara el naftaleno – 8.1 eV. La energía de ionización deuna molécula orgánica disminuye con la presencia enésta de electrones π (enlaces insaturados, anillosaromáticos) o n (heteroátomos, N, O, S) y con elaumento de la sección transversal de ionización de lamolécula. Las moléculas pequeñas como H2O, HCN,CO o CO2 poseen energías de ionización bastante altas, a saber: 12.6, 13.9, 14.0 y 13.3 eV, respectivamente (ytambién sus calores de formación son grandes).Cuando se disocian moléculas orgánicas ionizadas conlas respectivas pérdidas de 18, 27, 28 ó 44 unidadesmásicas, prácticamente, nunca estas especiesmoleculares pequeñas se registran como iones en susespectros de masas, precisamente, por poseerpotenciales de ionización más altos que los decualesquier iones-fragmento complementarios, e.g.,(M – H2O)+ ·, (M – HCN)+ ·, (M – CO)+ · o (M – CO2)

+ ·. Esto es un reflejo también de la regla de

Figura 3. La formación de iones (moleculares e iones-fragmento) en función de laenergía de electrones bombardeantes.

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Stevenson-Audier47,48, que reza que durante un proceso de fragmentación (generalmente, se refiere a la rupturasimple, pero también a algunos procesos dereordenamiento) la carga positiva queda localizadasobre aquel ion-fragmento que posea menor potencialde ionización. Algunas ilustraciones de esta regla sepueden encontrar en la Tabla 249.

La eficiencia de ionización por electrones,infortunadamente, no es muy alta, pero, en realidad, esmayor que la observada con otros métodos deionización; solo una de las 10.000-100.000 moléculasneutras se ioniza -ello depende de la estructura y latopología molecular y de condiciones experimentales-,el resto de moléculas (casi 99.99%) se evacúan delsistema por la acción de una bomba de vacío (difusorao turbomolecular). Aún así, la espectrometría de masascon ionización electrónica es un método muy sensible,sobre todo, cuando se practica el modo de adquisiciónSIM (por sus siglas en inglés, Selected Ion Monitoring– monitoreo de iones seleccionados)50, cuando selogran detectar analitos en concentraciones de algunaspocas ppb. La eficiencia de ionización depende nosolamente de la energía de electrones bombardeantes(Figura 3) y del tipo de molécula (su estructura), sinotambién de la presión en la cámara de ionización o lafuente de iones (ca. 10-5 - 10-6 Torr), así como delgrado de su contaminación. La contaminación en lafuente de iones (e.g., por el sangrado de la faseestacionaria de una columna cromatográfica enGC-MS, por las interferencias de compuestos novolatilizables presentes en la muestra, o porcompuestos o sus fragmentos re-condensados sobre las partes de la cámara de ionización, etc.) y las fugas en elsistema (aire, agua) conducen a la disminución de lasensibilidad del método debido a la reducción de laeficiencia de la ionización. A mayores presiones en lacámara de ionización, se observa más alta probabilidadde colisiones de iones con las moléculas neutras(recuérdese que gran parte de los analitos no se ioniza)

y con las moléculas del fondo (H2O, O2, N2, Ar, CO,CO2), su posible descarga o recombinaciones. En fin,muchos iones ya no formarían parte de las corrientesiónicas medidas, que se reprocesan posteriormente alos cromatogramas o espectros.

Debido a que la energía de electronesbombardeantes supera la energía (potencial) deionización de las moléculas orgánicas, gran parte de los iones moleculares resultan con exceso deenergía interna, que puede variar en el rango de 0 a20 eV (1 eV = 96.48 kJ). Algunos iones molecularesmás “calientes” pueden tener las energías internas enexceso de hasta 2000 kJ/mol, que obviamente, es unaenergía más que suficiente para la rotura de un enlacequímico. Los iones-fragmento, productos de ladisociación de iones moleculares, M+ ·, se registran enel espectro de masas cuando la energía mínimaabsorbida por la molécula neutra, en fase vapor, essuficiente tanto para su ionización, como para sufragmentación, por ruptura simple o por ladisociación acompañada de un reordenamiento. Estaenergía mínima se llama la energía de aparición (opotencial de aparición, AP, del inglés, AppearancePotential) de un ion-fragmento. La diferencia entre elpotencial de aparición de un ion-fragmento y elpotencial de ionización de una molécula que se disociapara formarlo, es muy cercana a la energía de activacióndel proceso de fragmentación, Ea ≈ (AP – IP). Debido aque los electrones bombardeantes no son“monocromáticos” (monoenergetizados) y poseen ladispersión por energía del orden de ± 5 eV,frecuentemente, para determinar energías(potenciales) de ionización o aparición se utilizanfotones, que permiten hacer mediciones con exactitudmás alta, de ± 0.1 eV, o mejor. Los datos de lospotenciales de ionización y de aparición de los ionesson útiles para los cálculos termodinámicos deenergías de formación de iones y para determinarenergías de enlace.

Compuesto AB - XY PI (AB), eV I (AB+), % PI (XY), eV I (XY+), %

HOCH2 - CH2NH2 ~7.6 2.3 6.2 100

(CH3)2CH - CH2OH 7.55 100 ~7.6 67

(CH3)3C - CH2OH 6.93 100 ~7.6 7.4

(CH3)3C - CH2NH2 6.93 7.7 6.2 100

ClCH2 - CH2OH 9.3 4.0 ~7.6 100

BrCH2 - CH2OH 8.6 15.2 ~7.6 100

Tabla 2. Potenciales de ionización (PI, eV) e intensidades relativas (I, %) de los iones-fragmento en los espectros de masas delos compuestos AB - XY.



La diversidad de iones-fragmento (cationes ycatión-radicales) que aparece en el espectro de masasse debe, en primer lugar, a su formación a partir deiones moleculares con diferentes excesos de energíainterna. Todos los iones moleculares que poseenenergías internas menores que la energía de apariciónde un ion-fragmento con la más baja energía deactivación de su formación, serán registrados en elespectro de masas como iones moleculares nodisociados. Su intensidad en el espectro dependerá dela estructura molecular y, sobre todo, de su capacidadpara deslocalizar (estabilizar) la carga positiva, quepermite que el ion M+ · exista por un tiempo mayor queel que se requiere para su detección (ca. > 10-5 s) en unespectrómetro de masas. En la Figura 4 se puedeobservar una gráfica hipotética que refleja la cantidad,[probabilidad de formación, P(E)], de ionesmoleculares en función de su energía interna en exceso.

La intensidad del ion molecular es funcióndirecta de su estructura y la capacidad para estabilizarla carga positiva. En la Figura 5 se pueden comparardos espectros de masas de un hidrocarburo alifático(decano, C10) y un hidrocarburo aromático (naftaleno, C10); se observa, que la corriente iónica total en elcaso del naftaleno está prácticamente representadapor su ion molecular, cuya fragmentación es escasa, yhasta se forman iones moleculares dicargados, M2+,puesto que el segundo potencial de ionización de lamolécula es relativamente bajo y está dentro del rango

de la energía transmitida por electrones de 70 eV en lacámara de ionización. Mientras que la molécula deldecano exhibe una serie homóloga deiones-fragmento en m/z 29, 43, 57, 71, 85, típicos para hidrocarburos alifáticos, la molécula de naftalenotiene un patrón de fragmentación “clásico” de loscompuestos aromáticos, cuya fragmentación secaracteriza por la formación de iones molecularesestables, con señales dominantes en sus espectros, que decaen con la pérdida de una o varias moléculas deacetileno, (M - C2H2)+ · , (M - 2 C2H2)+ ·.

Una de limitaciones grandes de la técnica deionización con electrones reside en el hecho de que lasmoléculas, que se ionizan, deben estar en fase vapor, osea, ser volatilizables y no experimentardescomposición térmica, previa a su ionización. Aúnasí, muchas de las moléculas volatilizables ytermoestables no exhiben iones moleculares en susespectros de masas, sólo iones-fragmento, lo que limita la obtención de información sobre su peso molecular(Véase Figura 2). En realidad, menos del 10% de todas las moléculas existentes son aptas para ser analizadaspor la espectrometría de masas con ionización porelectrones: se excluyen especies muy polares (e.g.,sales, aminoácidos), las de alto peso molecular (e.g.,proteínas, ácidos nucléicos, polímeros) y termolábiles(e.g., azúcares). En algunos casos, la derivaciónquímica de la molécula permite aumentar su volatilidad y termoestabilidad y disminuir su polaridad.

Figura 4. Distribución hipotética de la energía interna del ion molecular, M+ · y laformación a partir de él de los iones-fragmento en el espectro de masas.

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Si el ion molecular no se registra en los espectrosde masas de analitos volátiles y termoestables(alcoholes, ésteres, aminas alifáticas, hidrocarburosramificados, etc.), esto se puede explicar porque poseeuna alta labilidad y un tiempo de vida muy corto (< 10-6

s), y por la ausencia en la molécula de elementosestructurales (enlaces dobles, anillos aromáticos,heteroátomos) que le permitan estabilizarse pordiferentes mecanismos, generalmente, a través de ladeslocalización efectiva de la carga. Con la reducción de la energía de electrones bombardeantes tampoco selogrará detectar iones moleculares en el espectro: siéstos no se registran a 70 eV de energía de electrones,tampoco se detectarán a energías de electrones menores(10 - 30 eV) en los llamados espectros de bajo voltaje.Ello se debe a que la sensibilidad del método decaedramáticamente, o sea, el número de iones -moleculareso iones-fragmento-, se disminuye también con la energía de electrones, tal como se puede ver en la Figura 6,donde aparecen corrientes iónicas parciales de ionescaracterísticos en m/z 69, 219 y 502 de laperfluorotributilamina (PFTBA) -sustancia paracalibración de espectrómetros o detectores de masas debaja resolución-, obtenidas con electrones de 69.9 eV(Figura 6A) y 9.6 eV (Figura 6B) de energía,

respectivamente. Se puede observar la notoriadisminución de las corrientes iónicas parciales. Porejemplo, para el ion CF3

+ en m/z 69, esta reducción es demás de 15000 veces. Para las moléculas volátiles ytermoestables, pero lábiles, en cuyos espectros de masasno se registran iones moleculares, hay que usar métodosde ionización “suaves”, e.g., ionización química (CI) o,en algunos casos, funciona la obtención de derivadosquímicos.

La ionización con electrones sucede bajopresión reducida (vacío) de 10-5–10-6 Torr (elrecorrido libre medio es del orden de metros). Es unproceso endotérmico, acompañado de la formación de iones M+ · y su disociación monomolecular. Sinembargo, la fragmentación no es un proceso al azar.La aparición de determinados iones-fragmento(patrón de fragmentación) es un reflejo de: (1) laestructura molecular; (2) la energía de los electronesbombardeantes y (3) la energía interna en excesoadquirida por la molécula ionizada. El número deiones (corriente iónica) que se detectan sí se puedeafectar por la presión residual en el sistema, por lacontaminación de la fuente de iones o por elenvejecimiento o deterioro de las superficiesdinódicas de un electromultiplicador.

Figura 5. Espectros de masas de ionización con electrones (EI, 70 eV) de: (A) Decano y (B) Naftaleno.



En general, los procesos de ionizacióndisociativa se pueden dividir en los siguientes dosgrupos grandes: (1) reacciones de ruptura simple(homolítica o heterolítica) y (2) reacciones dereordenamiento, que pueden ser de reordenamientodel esqueleto molecular (por ejemplo, la formacióndel ion tropilio, C7H7

+) o reacciones acompañadas detransposiciones de hidrógeno, por ejemplo, el

“clásico” reordenamiento de McLafferty26. Lasreacciones de ruptura simple más comunes sonformación de cationes (por ejemplo, en cadenashidrocarbonadas), rupturas alílica y bencílica,reacción de retro-Diels-Alder (RDA) en sistemascíclicos monoinsaturados y formación de iones acilo,entre otros. Por regla general, la energía requerida(energía de activación, Eo, del proceso) para los

Figura 6. Fragmentos característicos (m/z 69, 219 y 502) de la perfluorotributilamina(PFTBA) y sus corrientes iónicas parciales, obtenidas con electrones bombardeantes dediferente energía: (A) 69.9 eV y (B) 9.6 eV.

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reordenamientos es más baja que la necesaria para laruptura simple. Los procesos de ruptura simple son,por general, menos selectivos, que los detransposiciones del esqueleto molecular o dehidrógeno, y también son menos susceptibles a losefectos estéricos en la molécula en comparación conlos procesos de reordenamiento. Los espectros demasas obtenidos con electrones de 70 eV y losespectros de bajo voltaje (10-30 eV) de la mismasustancia se diferencian notoriamente. En los últimos, prevalecen iones moleculares (aumento relativo) y“sobreviven” algunos productos, básicamente, dereordenamientos o transposiciones del hidrógeno, por requerir la energía de activación más baja.

3. Teorías de espectrometría de masascon ionización por electrones

Las teorías espectroscópicas buscan establecerlas relaciones bidireccionales entre la estructura de lamolécula y su espectro; por ejemplo, conociendo laestructura molecular, permiten “predecir” su espectro(señales, su abundancia y posición en la escala, etc.) yviceversa, con base en un espectro de masas lograrelucidar la estructura molecular. Herramientascomputacionales y diferentes métodos de mecánicamolecular, métodos cuánticos semi-empíricos y ab initiose han desarrollado y se aplican con éxito en diferentesespectroscopias (UV-Vis, IR, RMN, Rayos X, entreotras). En este sentido, la espectrometría de masas noestá privada de sus bases teóricas, matemáticamentebien desarrolladas, aún en la mitad del siglo pasado, porvarios científicos51. Estos desarrollos recibieron elnombre de la Teoría de Cuasi-Equilibrio (QET,Quasi-Equilibrium Theory, por sus siglas en inglés).Esta teoría está basada sobre varios postulados, pero susaplicaciones reales, hasta hoy en día, mostraron éxitossolo para la interpretación o “predicción” de espectros

de masas de moléculas pequeñas (alcanos). Parasistemas moleculares más complejos, se requierenrecursos computacionales de muy alto poder ycapacidad, o el uso de modelos severamentesimplificados. Además, existen incertidumbresobjetivas relacionadas con los valores reales de lasenergías de activación, las estructuras de los complejosactivados en estados de transición, estructuras de iones(padre/hijo) que se forman, y otros parámetros, sinconocimiento de los cuales se dificulta sobremanera laaplicación del aparato matemático desarrollado de laQET al cálculo y predicción de espectros de masas, asícomo a la elucidación inequívoca de las estructurasmoleculares a partir de sus espectros, y viceversa.

La QET afirma, a través de sus variospostulados, que la probabilidad de fragmentación deun ion depende de: (1) energía interna en exceso y (2)estructura molecular. La teoría busca establecer larelación entre la estructura de la molécula y el tipo deiones que se forman, así como sus abundancias(concentraciones); se aplica solo a los espectros demasas obtenidos por ionización con electrones. Lasrelaciones cuantitativas y “predicciones” se esperaestablecerlas en ambas direcciones, i.e., con base en el espectro deducir la estructura molecular y viceversa.En la Tabla 3 aparece la “escala de tiempo” delespectrómetro de masas, operado con ionización porelectrones (EI). Según el principio de Frank-Condon,la estructura del ion molecular será la misma que la dela molécula antes de su ionización con electrones,puesto que el período de vibración de un enlace esmucho más largo que el tiempo requerido para lapérdida del electrón.

Según el primer postulado de la QET, lasmoléculas ionizadas se conciben como sistemasaislados, que no intercambian ni calor, ni masa con otras moléculas o iones (para ello, está el alto vacío). Duranteca. 10-12 s, la energía adquirida por el ion (energíainterna en exceso) se distribuye uniformemente por

Proceso Tiempo, segundos

Ionización (EI) de una molécula orgánica 10-15 – 10-17

Vibración de un enlace químico 10-10 – 10-13

Tiempo de vida de un ion en el estado excitado 10-8

Tiempo de permanencia de un ion en la cámara de ionización 10-5 – 10-6

Tiempo requerido para la detección de un ion en el espectrómetro 10-4 – 10-5

Tabla 3. “Escala de tiempo” en un espectrómetro de masas con ionización por electrones (EI).

todos los enlaces químicos de la molécula, o sea, portodos los estados energéticos del ion molecular, M+ · ;i.e., en la molécula ionizada, antes de su disociación, selogra un llamado estado de cuasi-equilibrio: el ionmolecular resultante se encuentra en estado de equilibrio consigo mismo. Después de la ionización de lamolécula, los iones M+ ocurrirán en cualesquier nivelesexcitados (rotacional, vibracional, electrónico), con unadispersión de energías internas en exceso de 0 a 20 eV(Figura 3). Sin embargo, después de 10-8 s, según elsegundo postulado de la QET, los iones molecularespasarán al estado electrónico basal, con o sin emisión de un fotón (intersección de superficies de energíaspotenciales).

Si el estado vibracional excitado (energía)dentro de un estado electrónico basal resulta porencima de la energía de disociación de un enlacequímico dado, la molécula ionizada experimentará lafragmentación. Según los postulados de la QET, laconstante de la velocidad de este proceso, k(E), seráfunción tanto de (1) la energía interna en exceso delion disociante, como de (2) la energía de activacióndel proceso de su fragmentación y, obviamente, de (3) la estructura espacial del ion que se disocia. La QETconcibe los procesos de fragmentación comoreacciones monomoleculares paralelas y sucesivas. El tipo y el número de productos de estas reaccionesdependen, en primer lugar, de los factores cinéticos,no termodinámicos, debido básicamente al hecho deque las especies ionizadas gozan de un tiempo de vidamuy corto.

Los iones moleculares perduran en la cámarade ionización alrededor de 10-6 s, o sea, el 99% deltiempo de su permanencia, se encuentran en el estadoelectrónico basal. Su posterior destino dependerá delvalor de la k(E) de la reacción de fragmentación: si esmayor de 106, la disociación sucederá ya dentro de lacámara de ionización, y el tipo y la cantidad defragmentos resultantes dependerán de la energía deactivación, Eo, de los procesos de disociación, de lasenergías internas de cada ion que se forma, y delhecho de si éste seguirá o no fragmentándose. Si lak(E) es menor de 104, los iones moleculares (u otrosiones-fragmento) son suficientemente estables y seregistrarán como tales: su abundancia o intensidad enel espectro de masas dependerá, respectivamente decuántos iones moleculares se detectarán (corrientesiónicas).

Aquellos iones moleculares, cuyas k(E) dedisociación son mayores de 106, pero inferiores a 104,pueden experimentar su fragmentación fuera de lacámara de ionización y dar origen a los llamados ionesmetaestables, m*, cuya masa aparente está relacionada

con las masas del ion progenitor (ion-padre), m1, y delion-hijo, m2, así: m* = (m2)

2/m1, para un respectivoproceso de fragmentación m1 à m2 + mo (donde mo esun fragmento neutro que se desprende del ion m1

durante su disociación). Efectivamente, las masas dem* y m2 son las mismas, pero como los analizadoresmásicos, e.g., los de deflexión magnética, discriminanlos iones por sus momentos (cantidad de movimiento,mv), un ion que se disocia fuera de la cámara deionización, después de haber pasado ya la región deaceleración, generará un fragmento con la cantidad demovimiento (mv) inferior a aquella que un ion“normal” hubiera adquirido si se formara en la cámarade la ionización. Por ello, el ion-fragmento, que seforma fuera de la cámara de ionización y se detecta conuna masa aparente, fue históricamente bautizado conel nombre de ion “metaestable”. La detección de ionesmetaestables jugó un rol fundamental en laespectrometría de masas, puesto que éstos permitíanestablecer un vínculo “genético” entre losiones-fragmento e iones-padre, además de permitirhallar las energías liberadas durante los procesos defragmentación acompañados por transicionesmetaestables. Hoy en día, esta relación se estableceusando equipos de masas tándem, que permitenseleccionar un ion de interés en el primer analizador,activarlo (por ejemplo, en la cámara de colisionesactivadas) y “ver” en el segundo analizador todos losfragmentos-hijo, en los cuales el primero se disocia. Alrevés, seleccionando los iones-hijo en el segundoanalizador, se pueden -haciendo un barrido (scan) decampo magnético o radiofrecuencia en el primeranalizador (según su tipo)-, establecer cuáles son susposibles iones progenitores.

Simplificando hasta el máximo la expresiónmatemática de la QET, la constante de velocidad defragmentación de un ion en la cámara de ionizaciónpodría ser calculada con base en la siguiente ecuación:

k(E) = v[(E – Eo)/E]N-1

Donde:

k(E) - Constante de velocidad de la reacción de fragmentación

v - Factor de frecuencia de un enlace que serompe

E - Exceso de energía interna de un ion que sedisocia

Eo - Energía de activación del proceso defragmentación

N - Número de osciladores, N = (3n – 6), donden es el número de átomos en la molécula



La QET, con base en el cálculo de la constantede velocidad de fragmentación monomolecular de union dado permite hallar las concentraciones de susproductos, o sea, las intensidades de las señales(picos) de iones-fragmento (abundancias) en losespectros de masas, eso sí, a nivel de grandesaproximaciones52,53 y con éxito, hasta ahora, solopara moléculas pequeñas.

En vista de que la QET representa solo la baseteórico-matemática desarrollada, mas no unaherramienta práctica y “diaria” para la interpretaciónde espectros de masas, los investigadores, que usanesta técnica (ionización con electrones), se valen delas llamadas teorías cualitativas, basadas en losprincipios fundamentales de físico-química orgánica.La acumulación de una gran cantidad de materialempírico durante casi más de medio siglo, permiteestablecer importantes generalidades y teoríascualitativas para explicar y clasificar los procesos defragmentación de iones moleculares y sus productosen función de sus estructuras (grupos funcionales,efectos estéricos, etc.) y del tipo de ruptura simple otransposición que acontece. Para la interpretación deespectros de masas se emplean hoy en día dos teoríascualitativas, a saber: (1) teoría de localización decarga positiva y electrón desapareado y (2) teoría deestabilidad de productos de fragmentación (iones yfragmentos neutros). Ambas “teorías”, basadas en losprincipios de la físico-química orgánica comunes, enrealidad, convergen, puesto que comprenden elprincipio de cambios estructurales mínimos, quedeben acompañar cada etapa de fragmentación de union, sobre todo, en las primeras etapas de sudisociación (iones primarios y secundarios). Si alguna isomerización no acontece durante su permanencia en la cámara de ionización, la estructura del ionmolecular, M+ ·, esencialmente se concibe idéntica a la de la molécula neutra. Durante el procesoendotérmico de su fragmentación, el estado detransición va a ser más cercano a los productos dereacción monomolecular que a la molécula de partida. Luego, la estabilidad termodinámica de losiones-producto va a determinar la eficiencia y eldireccionamiento del proceso de fragmentación, cuyo“gatillo” para disparar la disociación es el sitio de la“localización” o la trampa de carga positiva o electrón desapareado, que surge en la molécula después de suionización con electrones.

La energía de enlace de átomos en la moléculaionizada es del orden de 2-4 eV, mientras que laenergía de ionización de la molécula orgánica es delorden de 6-13 eV. La energía del enlace que estáinvolucrado en la disociación es un factor relevante,

sobre todo, cuando existen procesos de competenciapara formar prevalentemente unos productos encomparación con los otros. La interpretación deespectros de masas de moléculas orgánicas, obtenidos por ionización con electrones, está basada en elestudio de su patrón de fragmentación, que dependede mecanismos de disociación de iones moleculares yde iones-fragmento.

Los esquemas de fragmentación nonecesariamente tienen carácter especulativo, porque sepueden encontrar numerosas verificacionesexperimentales de rutas de fragmentación. Entre lasherramientas experimentales “objetivas”, paraestablecer esquemas y hasta los mecanismos defragmentación, figuran diferentes métodos, a saber: (1)uso de técnicas de ionización “suave” (CI, FI); (2)derivación química; (3) marcado isotópico (e.g., con D, 15N, 18O) y marcado químico (introducción a lamolécula de sustituyentes que no se desprendendurante su fragmentación, e.g., F, OCH3, etc.); (4)espectrometría de masas de alta resolución, quepermite establecer la composición elemental de cadaion; (5) estudio de iones metaestables, para determinarla relación entre los iones padre e iones filiales; (6) usode configuraciones tándem y estudio de disociacionesde iones activadas por colisiones (CID,Collision-Induced Dissociation, por sus siglas eninglés); (7) fotoionización (PI) y determinación deenergías (potenciales) de ionización y aparición deiones; (8) cálculos mecano-cuánticos de energías deformación y estructuras de iones. Obviamente, notodas las técnicas experimentales se pueden realizar enun solo equipo de masas, pero su conjunto permitiráobtener resultados suficientes para establecercorrectamente el esquema o hasta el mecanismo defragmentación de una molécula orgánica ionizada porelectrones. En numerosas referencias bibliográficas,solo para citar algunas15,16,24-29,35-38, se puedeencontrar la información sobre fragmentación de lasmoléculas orgánicas, sus mecanismos y la clasificación de procesos de ruptura simple y de transposiciones.

4. Algunos aspectos de isomería enespectros de masas obtenidos porionización con electrones

Uno de los rasgos característicos de laespectrometría de masas de compuestos orgánicos,ionizados por electrones (EI, 70 eV), es su“susceptibilidad” a los cambios estructurales (inclusive muy pequeños) e isomerías (de posición, geométrica,estereoisomería). En la Figura 7 se pueden observar

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los espectros de masas de dos metilpiperidinas, dondela posición del grupo metilo en el anillo (2- ó 4- )engendra un cambio fuerte en sus espectros de masas.En el espectro de masas de la 2-metil-piperidina(Figura 7A) el ion, pico de base, corresponde alfragmento (M - CH3)

+ en m/z 84 (100%), producto dela ruptura α, mientras que en el espectro de su isómero,4-metilpiperidina (Figura 7B), el procesopredominante corresponde a la pérdida del hidrógeno y la formación del ion (M - H)+ en m/z 98 (100%),acompañada de su posterior disociación por la reacción de retro-Diels-Alder (RDA), con la aparición delfragmento [(M - H ) - CH2=CH-CH3]

+ en m/z 56(98%).

Otro ejemplo de la “percepción” muy sensible de un cambio estructural por la espectrometría de masas, lopresentan los espectros (EI, 70 eV) de dos isómeros demetilbenzoatos de metilo (Figura 8). En el espectro demasas del 2-metilbenzoato de metilo (Figura 8A) -junto con los mismos iones-fragmento que aparecen tambiénen el espectro del 4-metilbenzoato de metilo (Figura8B), a saber: (M - OCH3)

+ en m/z 119, (M - OCH3 -

CO)+ en m/z 91 y (M - OCH3 - CO - C2H2)+ en m/z 65-,

aparece un ion “nuevo” en m/z 118, correspondiente a lapérdida de la molécula de metanol (M - CH3OH)+ ·. Estefragmento, producto de la transposición del hidrógeno(migración del hidrógeno del grupo 2-metilo al oxígenodel grupo metoxi), es muy característico, distintivo. Suformación se debe al llamado efecto “orto”, que se ponede manifiesto gracias a la presencia de dos sustituyentesen la posición vecinal en el anillo bencénico.

La reacción de retro-Diels-Alder (RDA) esuno de los procesos de disociación muy útiles en laespectrometría de masas de compuestos orgánicoscíclicos, y permite establecer la posición de un enlacedoble en el anillo o la conjugación de dos anillos,aromático y saturado, tal como se observa en laFigura 9, que registra dos espectros demetiltetrahidronaftalenos isoméricos. En elcompuesto A, el producto de RDA es un ion (M –C2H4)+ · en m/z 118 (80%), mientras que el compuesto B se caracteriza por la formación del fragmentodiferente, (M - CH3CH=CH2)+ ·, en m/z 104 (100%).

Figura 7. Espectros de masas obtenidos por ionización con electrones (EI, 70 eV) de: (A) 2-Metilpiperidina y (B)4-Metilpiperidina.

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Figura 8. Espectros de masas obtenidos por ionización con electrones (EI, 70 eV) de: (A) 2-Metilbenzoato demetilo y (B) 4-Metilbenzoato de metilo. Obsérvese la formación del ion (M – CH3OH)+ · en m/z 118, productodel efecto “orto”, que se registra en el espectro de masas del isómero 2-metilbenzoato de metilo, pero es ausenteen el espectro de masas del 4-metilbenzoato de metilo.

Figura 9. Espectros de masas obtenidos por ionización con electrones (EI, 70 eV) de metiltetrahidronaftalenosisoméricos. Compuesto (A): el ion en m/z 118 (80%) corresponde al fragmento (M - C2H4)

+ ·, producto de lareacción retro-Diels-Alder (RDA); en el compuesto (B), el proceso de RDA conduce a la aparición del ioncaracterístico (M - CH3CH=CH2)

+ ·, pico de base en m/z 104 (100%), en su espectro de masas.



Es importante recordar, que cuando existenprocesos alternativos, acompañados de la pérdida deradicales alquílicos del ion molecular, preferiblemente, se desprenden los radicales con mayor masa, tal comose ilustra en la Figura 10, que muestra que laintensidad de los iones-fragmento crece con elaumento de tamaño del radical (R.) que se desprende,así: I(M - 29)+ < I (M - 43)+ < I(M - 57)+. En el espectro demasas de 1-cloro-3-bromopropano, la intensidad de los iones (M - Br)+ es mucho más alta que la de los iones(M - Cl)+, lo que confirma la pérdida preferencial delfragmento neutro más pesado.

Por lo general, se considera, que las energíasinvolucradas durante la ionización con electrones sonmuy altas (70 eV) y pueden “nivelar” o enmascarar las diferencias termodinámicas generadas por lascaracterísticas espaciales en las moléculas isoméricas. Sin embargo, los factores estéricos ejercen efectospronunciados sobre la estructura del complejoactivado y son más relevantes para los procesos dereordenamientos. El aumento de la energía interna delion M+· genera la disminución de productos dereordenamiento. La disminución de la energía deelectrones bombardeantes hasta 10-20 eV, permitereducir la energía interna de los iones M+· eincrementar el número de iones, productos dereordenamientos (transposiciones). Los efectosestereoisoméricos se ponen de manifiesto másnotoriamente en los espectros de masas de ionizaciónquímica o en aquellos tomados en equipos deconfiguración tándem, cuando se usan reaccionesactivadas por colisiones (CID).

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Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan

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Mass Spectrometry Bulletin

(www.rsc.org/Publishing/CurrentAwareness/msb/index.asp)

Mass Spectrometry Reviews

(www3.interscience.wiley.com/journal/49879/home)

Rapid Communications in Mass Spectrometry

(www3.interscience.wiley.com/journal/4849/home)

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que publican artículos en los cuales se emplea la

espectrometría de masas:

Analytical Chemistry

(pubs.acs.org/journal/ancham)

Analytical and Bioanalytical Chemistry

(www.springer.com/chemistry/analytical/journal/216)

Analytica Chimica Acta



Critical Reviews in Analytical Chemistry

(www.informaworld.com/smpp/title~content=t713400837)

2009 | v . 1 | n . 4 35




Fresenius’ Journal of Analytical Chemistry

(www.springerlink.com/content/110258/)

Journal of Analytical Chemistry

(www.springerlink.com/content/106287/)

International Journal of Environmental Analytical

Chemistry

(www.tandf.co.uk/journals/titles/03067319.html)

TrAC - Trends in Analytical Chemistry



The Analyst Royal Society of Chemistry

(www.rsc.org/Publishing/Journals/an/index.asp)

41. Algunas revistas especializadas en ciencias de

separación, que incluyen artículos donde se usa la

espectrometría de masas:

Journal of Separation Science

(www3.interscience.wiley.com/journal/117935715/gro

uphome/home.html)

Journal of Chromatography A y B



Journal of Chromatographic Science

(www.j-chrom-sci.com/)

Chromatographia

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Scientia Chromatographica

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (LC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Estratégias para diminuição do tempo de análise em Cromatografia Líquida Moderna

ResumoA diminuição do tempo de análise em cromatografia líquida

(LC) é uma demanda permanente das indústrias, setores da academia eórgãos reguladores. Alguns procedimentos clássicos permitem atendereste objetivo, porém quase sempre ocorrem às custas de uma acentuadadeterioração da eficiência do processo de separação. Neste trabalho sãoapresentados quatro enfoques distintos – alguns dos quais podem sercombinados – para diminuir o tempo de análise sem que ocorram perdas acentuadas no poder se separação.

AbstractDecreasing the analysis time is a permanent task in LC coming

from industries, academia and regulatory agencies. Although some

classical approaches have been used for this purpose, they occur at the

expenses of the separation efficiency. In this work we present four

different approaches – some of them being able to be combined – to

decrease the analysis time without compromising the quality of the

separation process.

Palavras-chave

Cromatografia Líquida a Pressões

Elevadas (U-HPLC); diminuição

do tamanho das partículas;

aumento da temperatura;

separações ultra-rápidas; colunas

superficialmente porosas; colunas

monolíticas.

Keywords

Ultra-High Pressure Liquid

Chromatography (U-HPLC);

decreasing particle sizes;

increasing the column

temperature; high-speed

separations; superficially porous

columns; monolitic columns.

Fernando M. Lanças

Universidade de São PauloInstituto de Química de São Carlos13560-970 – São Carlos (SP)[email protected]

Fernando M. LançasEditor

1. IntroduçãoA demanda por separações cada vez mais

rápidas, vindas dos setores industrial, acadêmico eregulatório, tem estimulado os pesquisadores adesenvolverem alternativas práticas para atender essasnecessidades, sem que haja compromisso da qualidadeda separação. Certamente a maneira mais simples parase atingir separações rápidas é a diminuição docomprimento (L) da coluna, uma vez que o tempo deretenção é diretamente proporcional a L, de acordo com:

tL

kR = +µ

( )1 (eq.1)

onde:tR = tempo de retenção;L = comprimento da coluna;µ = velocidade linear média da fase móvel;k = fator de retenção.

Entretanto, a simples diminuição do comprimento da coluna traz uma perda considerável na qualidade daseparação, uma vez que o número de pratos, N (que medea eficiência de uma coluna cromatográfica) diminui coma diminuição de L de acordo com:

NL

H= (eq. 2)

na qual:N = número de pratos;L = comprimento da coluna;H = altura de um prato.

Uma vez que o tempo de retenção, tR, de umanalito depende do tempo que ele passa na coluna, quanto menor L menor será tR (Eq.1). Como consequência dessarelação, menor será o tempo de análise. Desta forma,cria-se um dilema em relação ao comprimento da coluna,mantidas todas as outras variáveis: quanto menor L maisrápida será a análise (< tR), porém, com menor eficiência(N). Na análise de amostras simples, contendo poucoscompostos, este fator poderá não ser relevante; porémpara misturas complexas a perda de eficiência poderácomprometer a análise.

2. Estratégias para diminuir o tempo de análise, mantendo a eficiência da separação

Dentre as estratégias empregadas para se obteruma diminuição do tempo de análise sem perda deeficiência, as principais são:

• aumento da velocidade linear média da fasemóvel;

• diminuição no tamanho das partículas dafase estacionária;

• aumento na temperatura da coluna;

• aumento na permeabilidade da coluna.

A modificação nesses fatores e a implicaçãono tempo de análise e na eficiência da separação serãoanalisados individualmente a seguir.

3. Aumento na velocidade linear média da fase móvel

A equação de van Deemter1 , desenvolvidaoriginalmente para cromatografia gasosa (GC) eposteriormente adaptada para cromatografia líquida(LC) e outras técnicas de separação, relaciona aeficiência de uma coluna (medida pela altura de umprato, H ou HETP) com a velocidade linear média dafase móvel (µ). Apesar das inúmeras variações daequação e das mudanças no formato da figura geradaem função delas, o gráfico de van Deemter tem sidoamplamente utilizado na otimização das condiçõesexperimentais em LC, inclusive para avaliação daqualidade de colunas. O gráfico gerado da equação,composta de três termos a serem otimizados2, mostraa existência de uma região de compromisso entre µ eH, denominada de velocidade linear média ótima(µopt), na qual H atinge um valor mínimo (Hmin), eonde a eficiência (N) é máxima. Para partículas dafase estacionária com tamanho maior do que 5 µm, oaumento de µ geralmente acarreta um aumento de H(diminuição de N), enquanto que, para partículasmenores que este valor, um aumento em µ provocapouca variação em H.

A Figura 1 ilustra esta comparação sendo que a parte superior da figura mostra o gráfico obtido paradiversas fases estacionárias com partículas dediâmetro superior a 5 µ (parte a da figura) enquantoque a parte (b) ilustra o resultado para partículasmenores. Observa-se que para partículas menores doque 3,5 µm, H (ou HETP) torna-se praticamenteindependente de µ, ou seja, neste caso é possíveltrabalhar com velocidades lineares (proporcionais aos fluxos ou vazões da fase móvel) bastante acima dateoricamente ideal, sem perda da eficiência da coluna(N). Esta é uma das principais razões dapopularização do emprego de partículas cada vezmenores em LC: diminuir o tempo de análise semperda da eficiência da separação.



4. Diminuição no tamanho daspartículas da fase estacionária

Mantendo-se os demais parâmetros constantes,o tempo de retenção em cromatografia líquida dependelinearmente do tamanho das partículas da faseestacionária (dp), de acordo com a Equação 3:

tk Nh

DmdpR = + ⋅( )1 2

µ(eq.3)

onde:tR = tempo de retenção;k = fator de retenção; N= número de pratos; h = altura de um prato; Dm = difusão do analito na fase móvel; dp = diâmetro médio das partículas da fase

estacionária.De acordo com a Eq. 3, o tempo de retenção de

um analito e, portanto, o tempo de análise, varia com o quadrado do tamanho das partículas. Assim, uma

pequena diminuição em dp ocasionará uma acentuada diminuição no tempo de retenção. Por exemplo, umanalito que apresente tempo de retenção igual a 25minutos em uma coluna contendo partículas de 5mícrons, terá tempo de retenção de apenas 3,4minutos em uma coluna contendo partículas de 1,7mícrons, mantidas as demais condições.

Entretanto, a redução apenas no tamanho daspartículas, sem mudanças no comprimento da colunatrará como principal consequência um aumentoconsiderável na pressão do sistema, pois:

∆PL

dp= φ η

100

1(eq. 4)

onde:∆P = variação da pressão na coluna (diferença

entre a pressão de entrada e de saída)η = viscosidade da fase móveldp = diâmetro médio das partículas

Portanto, uma diminuição no tamanho daspartículas, mantidas as demais características dacoluna, acarretará um aumento na pressão do sistema,podendo tornar a mudança impraticável se ocromatógrafo não for adequado ao uso em pressõesmais elevadas.

Este enfoque não é novo, havendo sidoamplamente explorado no passado e motivo de váriasrevisões e tutoriais, tais como o livro Introduction toHigh-Speed Liquid Chromatographaphy3 publicadoem 1981 (há 28 anos!). Nesse trabalho, os autoresdiscutem em detalhes o fato de que para se obter maior velocidade na análise em LC não basta apenasdiminuir o tamanho das partículas, sendo necessáriouma adaptação do instrumento como um todo. Assim,apresentam e discutem as mudanças necessárias emtoda a instrumentação, incluindo o volume do injetor,cela de detecção, tempo de resposta do detector,sistemas rápidos para aquisição de dados e,obviamente, uma coluna apropriada a este enfoque.

A Figura 2 ilustra um exemplo de aplicaçãodesse enfoque para a separação de alquil parabénsem loção de bebê em menos de 30 segundos deanálise.

Apesar de algumas publicações na época a esterespeito, este trabalho não produziu grande impacto naindústria de cromatógrafos líquidos. Uma propostamais radical para diminuição do tamanho das partículas da fase estacionária visando o desenvolvimento deanálises mais rápidas, sem perda na eficiência, veio deum conjunto de trabalhos publicados pelo grupo de J.Jorgenson 4-7. Estudos fundamentais sobre a qualidade

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Figura 1. Variação do valor de H (inverso do número depratos N), em função da velocidade linear média da fasemóvel, para diversas fases estacionárias com partículas dediferentes tamanhos. (a) partículas com diâmetro superior a5 µm; (b) partículas com diâmetro inferior a 5 µm.



das colunas empacotadas com partículas de diâmetroinferior ao convencionalmente utilizado até o final dadécada passada (5 µm) permitiram o estabelecimentodas necessidades instrumentais para o uso destascolunas. Foram estudadas colunas contendo partículasde diâmetros bastante pequenos, até mesmo inferioresa 1 µm, resultando em eficiências muito elevadas comtempos de análise bastante curtos (Figura 3).

Entretanto, e como discutido anteriormente,pressões muito elevadas são atingidas com o uso departículas de diâmetros inferiores a 3 µm. Essa novalinha de investigação em HPLC, utilizando partículasde diâmetro inferior a 3 microns, a pressões elevadas(usualmente superiores a 10.000 psi), recebeu o nomegenérico de U-HPLC (Ultra High Pressure LiquidChromatography) 4.

O emprego de partículas de diâmetro médioinferior a 5 µm tem ocorrido tanto para colunas dediâmetro interno convencional (1,0 – 4,6 mm)quanto para colunas capilares (0,1 – 0,5 mm) ou nano (< 0,1mm). As vantagens obtidas com a diminuiçãodo diâmetro interno das colunas foi motivo detrabalho recente publicado neste periódico8.

A combinação entre partículas de diâmetropequeno empacotadas em tubos também de diâmetrointerno pequeno, conduz a colunas bastante eficientes(Figura 3), e com pequeno consumo de fase móvel eestacionária, além de facilitar o acoplamento comoutras técnicas como a espectrometria de massas9 .

Entretanto, e a despeito da versatilidade desteenfoque, o emprego de partículas muito pequenasacarreta necessidade de equipamento especial. AWaters foi a primeira empresa a comercializar umasolução completa na qual a diminuição nocomprimento da coluna foi acompanhada por umadiminuição significativa no diâmetro das partículas(do padrão 5 µm para 1,7 µm). O conceito, queenvolveu modificações significativas também nainstrumentação, foi denominado UPLC (UltraPerformance Liquid Chromatography)10. Váriasoutras empresas produzem sistemas similares nomomento, com diferentes nomes e siglas tais como:Ultra-Fast HPLC (UFLC); U-HPLC; High-Speed LC(HSLC) e vários outros. A maioria desses sistemasopera em pressões de até 15.000 psi.

Figura 2. Análise de parabéns em loção para bebê. Coluna:L = 100 mm; d.i. = 4,6 mm; dp = 3 µm; C-18. Fase móvel:ACN:H2O (65:35) a 5 mL/min. Pi = 5.000 psi; T= 45°C;UV-VIS a 254 nm. Amostra: 1 µL. Picos: 1 = metil parabén; 2 = etil parabén; 3 = n-propil parabén; 4 = n-butil parabén.Modificado da ref 3, publicada em 1981.

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Este enfoque tem se mostrado bastante atrativo para a obtenção de análises mais rápidas, sem perdassignificativas de eficiência. Entretanto, requer umequipamento novo, dimensionado para trabalhar compressões mais elevadas, ou pelo menos adaptaçõessignificativas em sistemas existentes (algumasempresas vendem “kits” para adaptação de umsistema para outro). A próxima década dirá se este é omelhor dos enfoques para este objetivo.

5. Programação de temperatura em cromatografia líquida

O controle da temperatura da coluna em LCpassou a ocorrer principalmente após odesenvolvimento das fases reversas (inicialmente C-18 e C-8). Uma vez que o mecanismo predominante nestetipo de separação é a partição, que depende dasolubilidade relativa do analito entre duas fases (e estadepende da temperatura), maior atenção passou a serdada a este parâmetro de forma a se obter melhorreprodução dos tempos de retenção. Ainda assim, umatemperatura – geralmente próxima da ambiente – erafixada e mantida durante toda a análise; raramente

temperaturas mais elevadas eram utilizadas, ainda queisso aumentasse a solubilidade do analito na fase móvel e, como consequência, diminuísse o tempo de análise.

Apesar de amplamente utilizada emcromatografia gasosa11, a programação de temperaturada coluna (modificação da temperatura durante umaanálise) ainda não atingiu popularidade em LC. Umadas principais razões é o fato de a HPLC terhistoricamente surgido para analisar compostos quenão apresentavam estabilidade térmica (ouvolatilidade) adequada para sua determinação via GC.Adicionalmente, as colunas de grande diâmetro interno (superior ou igual a 4 mm), feitas de metal, utilizadasna época, possuiam paredes muito grossas quedificultavam a transferência de calor através delas. Osurgimento de colunas capilares de sílica fundida emLC mudou este panorama e mostrou as vantagens douso de programação de temperatura em LC. Em geral,o aumento da temperatura da coluna auxilia natransferência do analito da fase estacionária para a fasemóvel, diminuindo significativamente o tempo deanálise e aumentando a eficiência das colunas e asensibilidade da detecção pelo estreitamento dasbandas cromatográficas12,13.

Figura 3. Separação rápida de uma mistura de fármacos através de UHPLC. Coluna: 14.5 cm × 50

mm i.d. capilar de sílica fundida; Fase estacionária: 1.0 µm polybutadiene-encapsulated nonporous

zirconia; pressão de entrada 22.000 psi, detecção 100 °C; 215 nm UV. Fase móvel: água (40 mMNaH2PO4, pH = 7.0)/ acetonitrilo (68:22, v/v). (1) uracil; (2) clorazepate; (3) flunitrozepam; (4)clonazepam; (5) chlordiazepoxide; (6) oxazepam; (7) clorazepate; (8) diazepam.



6. Aumento na permeabilidade da coluna

Devido às elevadas pressões necessárias para se utilizar as colunas contendo partículas menores, e aconsequente necessidade de se adquirir novosequipamentos mais apropriados para tal, um grandeesforço tem sido concentrado no desenvolvimento decolunas contendo fases estacionárias com maiorpermeabilidade. Aumentando a permeabilidade,pode-se empregar colunas mais longas (maior L) comfluxos ou vazões da fase móvel maiores. Isso resultaem análises mais rápidas, porém com menor exigênciaem relação aos equipamentos, especialmente asbombas. Em outras palavras, estas colunas podem serutilizadas em qualquer cromatógrafo líquido.

Os dois enfoques atualmente melhorsucedidos para aumento da permeabilidade são o usode colunas monolíticas e colunas superficialmenteporosas.

6.1. Colunas monolíticas

Em vez de utilizar partículas de pequenodiâmetro, como as descritas anteriomente, as colunasmonolíticas são feitas de uma única peça de sílicamonolítica. Essas colunas são biporosas: apresentammacroporos (usualmente ao redor de 2 µm dediâmetro) que permitem o uso de fluxos maiores combaixas pressões; e mesoporos (cerca de 13 nm) quefornecem uma grande área superficial para manter aeficiência 14.

As colunas monolíticas existem tanto emdimensões convencionais (diâmetro interno1,0-4,6mm) quanto capilares (d.i.< 0,5mm) podendo,também, ser preparadas com diferentes polímeros.Enquanto que as colunas monolíticas de sílica têmsido empregadas na determinação de analitospequenos, a maior aplicação das colunas poliméricastem sido na análise de macromoléculas de interessebiológico, tais como polipeptídeos e proteínas. Umgrande número de excelentes revisões foi publicadonos últimos anos destacando as vantagens e detalhesde preparação das colunas monolíticas 15-19.

Diferentes aplicações das colunas monolíticasforam recentemente descritas na literatura, incluindoa análise de fenóis, DNA, PAHs, IgG, enzimas,aminas, cloranfenicol, e várias outras classes deanalitos 20.

6.2. Colunas superficialmente porosas

As partículas empregadas no início dacromatografia líquida usualmente apresentavamtamanho médio igual ou superior a 40 µm e estruturatotalmente porosa. Uma das principais característicasdesse tipo de material era sua grande área superficialque permitia o uso de grandes quantidades de amostra(elevada capacidade). Entretanto, a existência demacroporos faz com que as moléculas permaneçamdiferentes tempos para difundir dentro e fora dosporos, ocasionando alargamento das bandas ediminuição na eficiência das colunas21.

Um dos principais avanços na direção dasolução deste problema foi o trabalho pioneiro deHorvath e Lipsky, nos anos 6022. Estes autoresrecobriram esferas não porosas (“shell cores”) taiscomo pequenas contas (esferas) de vidro com umapelícula de material sólido poroso. Nesse tipo dematerial as moléculas da amostra migram atravésdesta camada relativamente fina, resultando em picosmais estreitos do que aqueles obtidos empregandopartículas totalmente porosas. Esse tipo de materialfoi denominado de pelicular (devido à películacolocada na superfície) ou superficialmente porosas(devido às características da película).

A Figura 4 ilustra a estrutura dos materiaistotalmente porosos (esquerda) e peliculares ousuperficialmente porosos (direita) desenvolvidos noinício da cromatografia líquida moderna.

Apesar de algumas tentativas para preparaçãode partículas superficialmente porosas ou pelicularescom tamanho menor, a primeira demonstração prática desta possibilidade ocorreu no início desta década 23.Partículas de 5,0 µm de diâmetro total – incluindouma camada porosa de 0,25 µm de espessura –contendo poros de 30,0 nm foram produzidas eempregadas na separação de várias moléculas,aproveitando as pequenas distâncias de difusão desolutos de baixa difusividade. Mais recentemente,Kirkland 24 desenvolveu partículas de C-8 e C-18 com diâmetro total de 2,7 µm com uma camada porosa de0,5 µm de espessura, contendo poros de 90 Å.

A Figura 5 ilustra uma comparação entre ocaminho de difusão de uma analito em uma partículaconvencional totalmente porosa de dp= 3 µm e umapartícula do tipo superficialmente porosa com umacamada de 0,5 µm.

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Figura 5. Comparação entre o caminho disponível para difusão em uma partícula totalmente porosa(esquerda; 1,5 µm) e superficialmente porosa (direita; 0,5 µm).

Figura 4. Estrutura dos materiais empregados no início da LC moderna. (a) partículas totalmente porosas;(b) partículas superficialmente porosas ou peliculares.



A diminuição do caminho de difusão daspartículas superficialmente porosas acarreta umadiminuição da dispersão axial e, como consequência,uma diminuição no alargamento das bandas, efeitosesses mais marcantes na separação de moléculasmaiores e quando fluxos mais rápidos são empregados.

As colunas superficialmente porosas (“shellparticle columns”) têm sido comparadas com ascolunas monolíticas para se obter análises maisrápidas sem modificações no instrumentos, uma vezque não produzem pressões elevadas.

As principais aplicações das colunas do tiposuperficialmente porosas (ainda poucas até opresente) utilizam quase que exclusivamente fases dotipo C-18, apesar de outras fases já estaremdisponíveis comercialmente25-27. Apesar do grandepotencial dessas colunas, mais aplicações aindaprecisam ser desenvolvidas para uma melhoravaliação de sua aplicabilidade em análises rápidas.Do ponto de vista teórico, essas partículas podemapresentar um poder de separação (pratos teóricos)pelo menos 50% maior do que as partículastotalmente porosas equivalentes, porém operando empressões substancialmente mais baixas.

7. ConclusõesNo presente artigo quatro enfoques distintos –

alguns dos quais complementares – para se efetuaremanálises mais rápidas em LC, sem perda apreciável daeficiência de separação foram descritos. A diminuiçãodo tamanho das partículas efetivamente permiteambos, porém se não associada a outras providênciascomo, por exemplo, aumento da permeabilidade dacoluna, acarretará um aumento bastante apreciável dapressão no sistema (como no caso da UPLC, porexemplo). Nesse caso, mudanças na instrumentaçãoserão necessárias para se atingir o objetivo de análisesrápidas com eficiência. A programação de temperaturada coluna é outro enfoque que permite acelerar umaanálise sem perda da eficiência. Porém, requer o uso deum forno adequado para programação de temperaturaem LC ou micro-LC. Outra solução que temdespertado interesse recente é o aumento napermeabilidade da coluna com o emprego de novasformas de preparo das fases estacionárias. As colunasmonolíticas foram desenvolvidas há mais tempo, epossuem mais aplicações, publicações e empresas queas comercializam. Por outro lado, as denominadascolunas superficialmente porosas têm ganho

popularidade nos últimos três anos, já sendodisponibilizadas comercialmente por várias empresas.

Qualquer que seja a opção para se obteremanálises mais rápidas, e as quatro mais populares foram discutidas criticamente neste artigo, não há dúvida deque esta será uma ênfase a ser seguida na próximadécada que se iniciará dentro de poucos meses.

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2009 | v . 1 | n . 4 49


QUALIDADE EM CROMATOGRAFIA (QUALI) / PONTO DE VISTA

A importância da metrologia química nos resultados das análises de resíduos

Oscar Bahia Filho

TQW Consultoria em Química Analítica e QualidadePiracicaba (SP)[email protected]

ResumoO cumprimento do atendimento ao escopo em análise de resíduos em diversas matrizes passa,

obrigatoriamente, pela comparação do resultado obtido com um valor limite estabelecido. Este artigo visou

correlacionar as variáveis de recuperação do ensaio de fortificação de

amostra-testemunha com a substância de referência e com a da

estimativa da incerteza global do processo analítico durante a validação

do método analítico, para que os resultados medidos acrescido destes

valores não excedam a um critério de aceitabilidade do resultado. O

método de análise de doxiciclina em tecido suíno por cromatografia de

fase líquida com detector UV-Vis foi utilizado como exemplo.

AbstractCompliance with the service scope in the analysis of residues in various matrices only be done by comparing

the result to a value limit. This study aimed to correlate the parameters of the test recovery to fortify control sample

with the reference substance with the estimate of overall uncertainty of

the analytical procedure for the validation of analytical method, so that

the measured results of these increased values do not exceed a criterion

of acceptability of the result. The method of analysis of doxycline, in

pig tissue by liquid phase chromatography with UV-Vis detector was

used as an example.

Palavras-chave

Doxiclina, Análise de resíduos,

Validação de Métodos, estimativa

da incerteza, metrologia química,

BPL e ISO 17025.

Keywords

Doxycline, Residue Analysis,

Method Validation, Measurement

Uncertainty, Chemical Metrology,

GLP and ISO 17025.

Flávio LeiteEditor

1. IntroduçãoA análise de resíduos para atendimento às

exigências das agências governamentaisregulamentadoras, de fiscalização ou de registro no que tange a produtos e serviços que podem causar riscos àsaúde humana, animal ou ao meio ambiente é regidapor portarias, legislação e decisões; sempre baseadasem valor máximo permitido (VMP) ou limite máximode resíduo (LMR). Tais valores estão diretamenterelacionados à sensibilidade e a resolução dosequipamentos de medição usados no ensaio. Com aevolução da eletrônica aliada à lógica de programaçãoe controle, a sensibilidade e a resolução destesequipamentos estão constantemente sendo melhoradas, resultando em limites de detecção (LD) e,consequentemente, em limites de quantificação (LQ)cada vez melhores. Contudo, na metrologia química,tanto o LD quanto o LQ não são dependentes apenas da etapa de medição, mas também de técnicas demanipulação das amostras1. Infelizmente, a velocidadede desenvolvimento das técnicas de manipulação deamostras não é a mesma dos equipamentos de medição.

Para estabelecer os VMP´s ou LMR´s, sãoutilizados estudos de impacto ambiental outoxicológicos. As diretrizes das boas práticas delaboratório2 (BPL) recomendam que tais estudos devamser conduzidos em instalações apropriadas, por pessoalqualificado, utilizando equipamentos calibrados e,periodicamente verificados, seguindo procedimentospadronizados, rotineiramente inspecionados por pessoal independente e qualificados, fazendo com que os dadosbrutos obtidos sejam adequadamente arquivados e que o relatório final seja validado por uma auditoria dos dadosbrutos. Já as diretrizes da norma ABNT NBR ISO/IEC17025:20053 preconizam o atendimento ao cliente combase em um sistema de gestão estruturado, onde acompetência da organização associada às dasinstalações e equipamentos adequados como chave paraa rastreabilidade e a confiabilidade da estudo/ensaiorealizado. Ambas as diretrizes das normas sãoconcordantes no que se refere ao estabelecimento dacompetência da organização em executar umdeterminado estudo/ensaio e a significância dosresultados produzidos em atender exigências dosclientes4 ou refazê-los de maneira mais próximapossível, quando necessário. Nesse sentido, ametrologia química assume o importante papel depromover a confiança nas relações de consumo, de justaconcorrência, de conformidade de produtos e serviçosdisponibilizados no mercado e, sobretudo, de inibir aatuação de empresas inidôneas, esta última tem sido uma constante, pois cabem às agências governamentais o

papel fiscalizador das organizações produtoras ou deprestação de serviços em ensaios5.

Nos ensaios analíticos, os resultados sãoafetados por um grande número de fatores inerentes aoprocesso de medição. Estudos de robustez sãoutilizados para estabelecer os fatores críticos queafetam a confiabilidade dos resultados, sob pequenasvariações intencionais e a implicação destasmodificações no resultado do ensaio. No entanto, aetapa de robustez, geralmente, é feita durante odesenvolvimento/adaptação/otimização do método ouno início do processo de validação. Assim, outrosfatores que podem ocorrer em períodos mais longosnão podem ser adequadamente avaliados, dentre eles, o comportamento e a estabilidade da substância-teste nosistema-teste sendo um dos principais fatores,principalmente em sistemas orgânicos. Assim, oplanejamento e a condução do processo de validação éuma dos principais mecanismos de confiabilidade emum ensaio/estudo de resíduos. Uma das formas maisutilizadas para determinar tanto o comportamentocomo a estabilidade da substância-teste no sistemateste no processo de validação, é a adição de substância referência em amostras-teste testemunhas e a medidada recuperação da concentração adicionada contra aconcentração obtida no ensaio. Outra característicaimportante da análise/ensaio de resíduos é oestabelecimento dos LD e LQ do método validado.Como, na metrologia química, a quantificação ésempre indireta, isto é, utilizam-se vários níveis deconcentração de soluções padrão diluídas comoreferência da medida e a transformação desta porestabelecimento de algoritmo matemático queestabelece relação entre a concentração conhecida coma resposta obtida do mensurando, resultado na curvaanalítica. Na construção desta curva, recomenda-se que o LQ seja menor ou igual ao LRM ou VMP requerido.Por tratar de um modelo matemático, via de regra derelações lineares, a análise dos resíduos do modelo aolongo da faixa linear medida torna-se crítico, além desimplesmente avaliar o coeficiente de regressão (R) eos desvios padrão (DP).

A chave para a qualidade e confiabilidade dosresultados de um ensaio é a sua comparabilidade. Para serem comparáveis os resultados analíticos devem ser acompanhados da estimativa da incerteza da medição(IM) que leva em conta a propagação de erros duranteo processo analítico. Em geral, os erros dequantificação sistemática podem ser classificados emdois grupos6: (i) os que produzem resultados menoresque a quantidade realmente presente (perdas,correações, degradações,...) e (ii) os oriundos do errode medição no momento quantificação (efeitos de



matriz, as variações da matriz). Qualquer que seja aorigem dos erros, na análise de resíduo torna-se muitocrítica, pois uma determinada formulação podereceber registro por um tempo de carência que nãoseja real; ou na avaliação do impacto ambientalpodem-se emitir resultados que possam levar aconclusões ou ações inadequadas. Nesse contexto, aestimativa da incerteza associada ao intervalo deconfiança ou DPR do resultado do ensaio exibeimportância ímpar no contexto de confiabilidade. Não é difícil imaginar o resultado de análise de resíduo, em que o mensurando está presente em níveisextremamente baixos (próximos do LQ), a equação de Horwitz7 preconiza que a recuperação possa ser naordem de 50% do valor adicionado e prediz que ointervalo de confiança seja bastante amplo, na ordemde 20%. A coincidência dessas variáveis pode levar aresultados falso/negativo ou falso/positivo. Dessaforma, sugere-se que para estes ensaios um critério deaceitação baseado no conceito de limite deaceitabilidade, similar ao utilizado nos certificados decalibração de equipamentos, como fator importantepara tomada de decisões.

No presente artigo será discutido um exemploutilizando a etapa de estudo de recuperação emsistemas orgânicos utilizando-se adição de doxiciclinaem amostras-testemunhas de músculo suíno e osmecanismos de obtenção da estimativa de incertezaassociada ao processo para análise crítica do resultado.

2. Experimental

2.1. Aplicabilidade do Método

A aplicabilidade do método deve serconsiderada a partir das regras do processo devalidação, que preconizam que o método analíticovalidado seja aplicável a matriz de interesse; quecubra toda a faixa de concentração desejada e quetenha levado em conta toda a manipulação da amostraantes da medida. O atendimento ao propósito é umcomplemento onde a performance do método deveestar em conformidade com os requisitos dointeressado.

A exatidão pode ser aplicada como conceito de

limite de aceitabilidade λ. Assim, um resultadoanalítico Z pode diferir de um valor verdadeirodesconhecido T para uma faixa menor que o limite deaceitabilidade:

| |Z T− < λ

O limite de aceitabilidade depende doprocesso analítico, assim um processo pode servalidado se atender aos propósitos requeridos:

P Z(| | )− < ≥µ λ β

onde β é a probabilidade que o resultado estejadentro do limite de aceitabilidade.

Para os ensaios ou estudos onde a matriz analíticapode exercer grande influência no resultado, estudos derecuperação devem ser conduzidos para determinar apossibilidade de provável interferência. Na tentativa deaplicar o conceito de limite de aceitabilidade para ensaiosque se utilizam de etapa de fortificação, levando em contatanto a recuperação aparente como o fator de recuperaçãoe onde também se deve atender um determinado valor, épossível reescrever da seguinte forma:

LMR valor Difmedido c global≤ + +| |%Re µ

onde o valormedido é o valor real medido noensaio, DifRec% é o fator de recuperação (emconcentração) e µglobal é a estimativa da incerteza defatores previamente definidos.

2.2. Determinado o Fator de Recuperação (Difrec%)

Para a determinação o fator de recuperação,devem ser preparadas 7 réplicas (n=7) de solução-padrãodiluída no nível de LMR ou VMP e outras 7 réplicas defortificação no mesmo nível em amostras-testemunhas.Cada uma das réplicas deve ser medida em triplicata. Ovalor médio encontrado de cada conjunto deve sersubmetido ao teste de Grubbs para avaliação de valoressuspeitos e ao teste de Fischer, entre os conjuntos paraavaliação das variâncias e verificação da influência doefeito matriz. Tanto os valores da recuperação percentualcomo os DPR obtidos devem satisfazer os critérios deHorwitz. Um trabalho interessante7 preconiza o usocriterioso e cuidadoso desta equação quando se trata deanálise de baixas concentrações.

2.3. Estimando da µmétodo

Para a obtenção da estimativa da incerteza dométodo analítico foram selecionadas quatro etapasanalíticas significativas, que são o preparo da soluçãoreferência diluída (Upadrão), a construção da curvaanalítica (Ucurva), o ensaio da precisão intraensaio(Uprecisão) e o estudo da exatidão (Uexatidão). Aequação a seguir mostra a equação utilizada para ocálculo da estimativa da incerteza global:

U U U U Uglobal padrão curva precisão exatidão= + + +2 2 2 2

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2.3.1. Preparo a solução padrão de referência

A pureza da substância de referência, a massapesada da substância, a calibração da balança utilizada,os frascos volumétricos utilizados para diluição, osdispositivos de medição das alíquotas, seus certificados de calibração e repetibilidade de todas as operações,constituem as etapas críticas. As equações a seguir sãoutilizadas para o cálculo da incerteza padrão.

U upadrão1 = , com

um

padrãomi

i

=

∑ ∆2

1 2

onde ∆mi é o erro associado para a medida deum dado parâmetro, tais como peso ou alíquota; mi é o valor medido em cada uma dessas ações.

2.3.2. Curva analítica (CA)

As medidas efetuadas para todos os níveis deconcentração que compõem a faixa linear do métodovalidado são submetidas a estimativa da incerteza,utilizando as equações a seguir:

Us

xxo

2

0

= , com

ss

b m n

y y

b x xxo

y x o av

i av

=

+ +

−−

∑*

( )

* ( )

1 1 2

2 2

1 2

e

sy y

ny x

i icalc=−

−∑ ( )21 2

2

onde sxo é o DP da concentração, calculada daCA; xo é a concentração calculada da curva da CA; b é ainclinação da CA; m é o número de níveis deconcentração da CA; yo é valor experimental do ycalculado pela CA da concentração xo; yav é a média dosvalores de y; xi a concentração dos padrões (x) usados nacalibração; xav é média dos valores xi; yi é valoresexperimentais; yicalc valores calculados pela CA.

2.3.3. Precisão das medidas

Do ensaio de precisão intralaboratório, onde seutilizam seis réplicas da amostra-testemunha fortificadapreparada por analistas diferentes, dias diferentes ouequipamentos diferentes; é possível obter a incertezadesta etapa utilizando as seguintes equações:

Uu

x

p

o

3 = , com

us

np =

1 2

onde s é o dp do ensaio de precisão; n o número de ensaios.

2.3.4. Exatidão das medidas

Do ensaio de recuperação, onde se utilizamseis réplicas da amostra-testemunha fortificada e ocálculo da recuperação percentual média e o desviopadrão, é possível obter a incerteza desta etapautilizando as seguintes equações:

U uexatidão4 = , com

us

nexatidão

n=1 2

onde sn é o DPR da recuperação % média; n onúmero de ensaios.

2.4. Exemplo: Método para a determinação dedoxiciclina em músculo suíno

2.4.1. Reagentes e amostras

As amostras e as soluções padrão diluídasforam preparadas a partir de solução estoque ecolocadas em frascos âmbar, vedadas e analisadas nomesmo dia, sempre que possível. Todas as soluções eextratos foram armazenados em refrigerador antes daanálise. A doxiciclina foi adquirida da Sigma. Foramutilizados solventes acetonitrila G13C51, metanolG36E01 de grau pesticida J.T. Baker; água ultra pura(conditividade ≤ 18 uS cm-1), ácido cítrico G46C43,citrato de sódio G08C57 da J.T. Baker e ácido oxálicoG20D59 da Mallinckrodt.

2.4.2. Materiais e instrumentos

Sistema de cromatografia de fase líquidaShimadzu formado com bomba quaternária,amostrador automático e detector de UV/Vis; Colunaanalítica CROMA NST 18 (250 x 4,6 mm, 5 µm); fasemóvel com solução de Ácido oxálico 50mM (6,5:3,5água:acetonitrila); vazão de 1,0mL/min; comprimento

de onda: 351nm; injeção: 40 µL; temperatura: 30°C.



2.4.3. Manipulação da Amostra

Cerca de 1,0 g de amostra-testemuma foiagitada com 5 mL da solução tampão hidroalcoólica(8:2 metanol) de citrato 300 mM pH 4 em vórtexseguido de ultrassom e centrifugação para separaçãodo sobrenadante que foi submetido a extração em fasesólida em cartuchos SAX (3mL/60 mg) condicionadocom 2 mL de metanol e 2 mL de água:metanol (80:20) e eluição com 2 mL de solução de ácido oxálico 50mM (4:3:3 água:acetonotrila:metanol). O eluato foiseco à 40°C sob corrente de N2 e reconstituído de 1mL da solução de ácido oxálico 50 mM (6,5:3,5água:acetonitrila) em vórtex. Os extratos foramacondicionados em frascos de injeção.

3. Resultados e discussão

3.1. Validação do método

A metodologia analítica usada resultou emuma boa separação cromatográfica no tempo de 5,1minutos para o composto estudado. A linearidade foiverificada na faixa de concentração de doxiciclina; osresultados foram expressos em coeficiente dedeterminação (R2) denotando boa linearidade. Osvalores obtidos são mostrados na Tabela 1. O LD foicalculado a partir dos parâmetros da curva analítica (asoma do valor da intersecção com 3 x Sy/x (DP))conforme a equação abaixo:

LD b S y x= + ( * )3 , com

Sy y

ny x

i icalculado=−

−∑ ( )2

2

Tabela 1. Resultados dos parâmetros de validação para ocomposto doxiciclina obtidos para o método SPE – LC-UVem amostras de músculo suíno.

ParâmetrosSPE – LC_UV

Doxiciclina

Faixa de calibração (ng mL-1) 50 a 500

LQ (ng mL-1) (N=5) 25

Precisão (DPR)

- precisão intermediária (n=10)

- repetibilidade (n=5)

1,76

1,23

Exatidão (% recuperação ± DPR (n=5)) 80,16 ± 1,01

O LQ de 25 ng mL-1 confirma a adequabilidadedo método com os requisitos, pois o LMR é de 100 ngg-1. A precisão foi avaliada pelos ensaios de precisãointermediária (dez réplicas de uma amostra, preparadas em dois dias por diferentes colaboradores e medidasem triplicata) e repetibilidade (cinco réplicas commedidas em triplicata).

A exatidão foi expressa pelo estudo darecuperação analítica (razão entre o valor encontradoe o valor esperado multiplicado por 100) utilizandoadição de material certificado de referência. Para ocomposto, cinco experimentos de recuperação foramconduzidos e a concentração padrão usada foi amesma do ensaio de precisão. Os resultados foramtranscritos na tabela 1 como % de recuperação e DPR,mostram a adequabilidade do método validado (70 –120% e DPR 20%).

3.2. Estimativa da Incerteza

Para a estimativa da incerteza foi aplicado omodelo conhecido como botton-up. Neste modelo, adeterminação da incerteza global associada aoresultado produzido pelo método usado é obtidalevando-se em consideração as variadas contribuições individuais da incerteza.

A Tabela 2 mostra os resultados dos cálculosda estimativa da incerteza para as etapas consideradascríticas no processo.

Tabela 2. Incertezas relativas ao processo e as variáveiscorrespondentes.

Variável Incerteza padrão

Preparação da Solução padrão diluída - µ1 0,000701

Curva Analítica - µ2 0,143633

Precisão - µ3 0,001824

Exatidão - µ4 0,319390

Incerteza padrão global 0,350205

A incerteza padrão global encontrada foi de0,350205 para uma solução padrão de 5,0 ng mL-1,que corresponde a 7% de variação no valor medido.Das quatro fontes de contribuição usadas, acontribuição relativa ao estudo da exatidão foi a maiscrítica. A contribuição relativa destas quatro fontes édecididamente dependente das concentrações usadasna construção da curva analítica e da característica desensibilidade do instrumento de medida.

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Banerjee e colaboradores8 escreveram artigosobre validação e incerteza de vários pesticidas emuvas usando a técnica de cromatografia líquida comdetecção em espectrometria de massas. De formageral, os autores encontraram incerteza global comuma ordem de grandeza menor que a encontrada paraa doxiciclina. Isto talvez possa ser explicado peloinstrumento de medida ser mais sensível e que areprodutibilidade da recuperação não ter variado tanto como no método da doxiciclina. Já Ratola ecolaboradores9, estudando a incerteza associada aanálises de pesticidas organoclorados em águas porcromatografia de fase gasosa com detector de capturade elétrons, determinaram que a construção da curvade calibração foi a variável mais crítica nacontribuição da incerteza global, representando cercade 25% para a faixa, podendo representar até 50% se a faixa se estender até próximo do LD.

Ambos os trabalhos determinaram que para umnível de concentração de cerca de 10 ng/g foi possívelobter recuperações entre 70-120% com estimativa deincerteza global entre 10-20%. Ora, para umdeterminado composto que exibe uma recuperação de70%, se for aplicada uma correção para que o valorrepresente 100% e somarem-se os 20% da provávelincerteza da medida, o valor observado da amostrapode estar acima do LMR ou VPM definido pelocliente. Em outras palavras, se somarmos o valorencontrado para a amostra ao fator de recuperação e a

incerteza global associada ao método de ensaio, o λpode estar sendo fora do limite. Desta forma, navalidação do método, duas etapas devem serexaustivamente estudadas e metrologicamentedeterminadas: (i) recuperação do composto e a (ii)estimativa da incerteza global do método.

Considerando o método da doxiciclina, o valor obtido de recuperação foi de 80% e a estimativa daincerteza do método de 7%. Assim, o coeficiente devariação de um resultado obtido deve ser de 27%.Portanto a análise crítica de um resultado de umaamostra de 80 ng/g pode significar que ele esteja forado LMR específico

4. ConclusãoNa validação de um método para análise de

resíduos, onde os resultados dos ensaios serãoobrigatoriamente comparados a valores limites, aescolha dos solventes, processos de extração ou deisolamento que fazem parte da etapa de

recuperação devem ser exaustivamente estudados emetrologicamente determinados. O somatório dessavariável com a estimativa da incerteza global doprocesso da medida determina o intervalo deconfiança da medida efetuada usando o métodovalidado. Sempre que possível, deve ser determinadoo limite de aceitabilidade do resultado do ensaio paraverificar o atendimento ao escopo do cliente.

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2009 | v . 1 | n . 4 55


TROUBLESHOOTING (TS)

Problemas com o formato dos picos em cromatografia líquidaParte 2

ResumoNesta edição continuamos a discussão sobre os problemas que resultam em picos distorcidos em

cromatografia líquida. Distorções tais como caudas, frontes, alargamentos e picos duplos ou com ombros podem

ocorrer por diversos motivos e um detalhamento desse assunto serve de subsídio ao usuário da técnica, na busca da

solução desse tipo de problema. Assim como no artigo anterior, neste

artigo são focados assuntos que se relacionam não apenas com aspectos

físicos, mas também com aspectos químicos da separação. As

ocorrências mais comuns relacionadas ao aparecimento de picos

distorcidos serão brevemente estudadas e exemplificadas para uma

melhor compreensão, bem como as estratégias para superação desses

problemas serão apresentadas.

AbstractThis edition continues discussions about peak shape problems occurring in liquid chromatography. Peak

distortions like tailing, fronting, widening, and double peaks or peaks with shoulders may occur due to several

reasons and this matter needs to be detailed to provide chromatographic

users with background to solve these problems. Following the last

article, this one brings not only physical but also chemical aspects

related with separation. The most common contributions to peak

distortion will be briefly studied and exemplified for a better

understanding, and strategies to overcome these problems will be

presented as well.

Palavras-chave

Assimetria; picos com cauda;

picos com fronte, picos

distorcidos; CLAE; cromatografia

Keywords

Asymmetry; peak tailing; peak

fronting; peak distortions; HPLC;

liquid chromatography.

Álvaro José dos Santos Neto

Universidade Federal de AlfenasDepartamento de Ciências Exatas37130-000 – Alfenas (MG)[email protected]

Álvaro José dos Santos NetoEditor

Em nosso último artigo, fez-se uma introdução aos principais problemas que recaem sobre aaparência de um cromatograma. Em seguida, asocorrências mais comuns relacionadas a essesproblemas foram listadas e começaram a serdiscutidas. O “Uso de coluna defeituosa” e o “Uso desolvente com força inadequada para a amostra” foramdiscutidos em seções do último artigo publicado. Alista com essas ocorrências é repetida abaixo:

1. Uso de coluna defeituosa;2. Uso de solvente com força inadequada

para a amostra;3. Sobrecarga de amostra introduzida na

coluna;4. Ocorrência de efeitos extracoluna;5. Ocorrências causadoras de fronte na banda

cromatográfica;6. Existência de sítios mais fortemente retentivos;7. Existência de sítios secundários de retenção;8. Tamponamento inadequado da fase móvel;9. Outros efeitos relacionados a distorções;10. Ocorrência de pseudodistorções.

Neste presente artigo, dar-se-á sequência a essasdiscussões, a partir do terceiro tópico da lista acima.

3. Sobrecarga de amostra introduzida na coluna

Problemas com sobrecarga de amostraintroduzida na coluna são mais relacionados aoemprego da cromatografia em escala semipreparativa,entretanto, esses problemas também podem ocorrer em escala analítica, quando se trabalha com amostrasmuito concentradas. Uma sobrecarga de amostra podeser suspeita quando alguns picos do cromatograma(geralmente os mais intensos) começam a se apresentar alargados e com cauda. Outro indício geralmenteobservado, conforme cromatograma esquemático naFigura 1, é a diminuição do tempo de retenção dospicos sobrecarregados. Alterações no cromatogramadevido a sobrecarga começam a ocorrer quando aquantidade da massa do(s) analito(s) (um ou mais)ultrapassa a capacidade linear da coluna (ou, maisapropriadamente, da fase estacionária encontradadentro da coluna). Essa capacidade linear pode serdescrita de maneira simplificada como a capacidadeque a fase estacionária apresenta de interagiruniformemente com diferentes quantidades de analitointroduzidas na coluna. Obviamente, estudos maiselaborados, baseados em cálculos de isotermas e

linearizações por meio de modelos matemáticos trazem uma interpretação físico-química desses fenômenos,porém vão além do escopo deste artigo. Em síntese, nasobrecarga, maior quantidade de analito está presentena coluna do que sítios de interação estão disponíveis;dessa forma, enquanto uma parte dos “espécimes” dosanalitos interage normalmente com a fase estacionária,outra parte é eluida adiante sem encontrar sítios deretenção equivalentes.

É importante mencionar que a capacidadelinear de uma coluna vai depender das característicasintrínsecas e extrínsecas a ela, as quais vão, desde asdimensões da coluna e densidade de empacotamento,o tipo de fase estacionária, sua carga de fase ligada(quando for o caso), o tamanho das partículas e dosporos, a eficiência da coluna, o tipo de fase móvel, otipo de analito etc. Apenas para ilustrar essadependência, apresenta-se a seguinte equação quedescreve a quantidade de amostra que pode serinserida em uma coluna cilíndrica de fluxo axial.1

M A n v Kvi m m s= +( ) (eq.1)



Figura 1. Cromatograma esquemático ilustrandosobrecarga de amostra introduzida na coluna, resultando em picos alargados, com caudas e menos retidos. (A)Quantidade normal de amostra, (B) Sobrecarga de amostradevido a alta concentração, (C) Amostra diluída analisadacom proporcional aumento da sensibilidade do detector.

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Onde, Mi é a massa que pode ser introduzidana coluna, Am é uma constante para a massa daamostra, n é a eficiência da coluna, vm é o volume defase móvel por prato, vs é o volume de faseestacionária por prato, e K é o coeficiente de partiçãoentre as duas fases. Conforme pode ser observado, amassa que pode ser injetada depende de diversascaracterísticas da fase móvel, fase estacionária e dopróprio analito. Considerando-se uma coluna de 250 x 4,6 mm recheada com partículas convencionais deODS, para alguns analitos a limite de saturação podechegar até a 1 mg do composto; porém, em regra, nãose espera muito mais do que 100 µg para saturaçãodos compostos em uma coluna desse tipo, sendo quealguns analitos podem ser saturados em níveis beminferiores, da ordem de 1 a 5 µg. Dada a variabilidadeentre as colunas, analitos e métodos deve-se prestarespecial atenção à possibilidade de sobrecarga deamostra quando se trabalha com introdução dequantidades relativamente grandes de analito nacoluna cromatográfica. Evidentemente, colunasmaiores e de maior diâmetro interno apresentammaior capacidade de amostra, enquanto colunas maisdelgadas do tipo microbore, capilar ou de nanoHPLCapresentam capacidades bem menores do que aquelasinferidas acima. A Figura 2 ilustra o efeito dasobrecarga de amostra para dois compostosdiferentes, bem como a diferença no comportamentode saturação entre ambos (maior saturação dabutirofenona).

Quando se trabalha com métodos queenvolvem a calibração com concentrações crescentesdo analito fica bastante fácil a observação dofenômeno de saturação, pois distorções tais quaisaquelas apresentadas na Figura 1 começam a setornarem proeminentes conforme há o aumento daconcentração da amostra. Nesse caso, nodesenvolvimento do método deve ser observada aconcentração máxima com que se podem realizar asanálises sem o aparecimento de distorções. No caso de amostras com concentrações mais altas dos analitos(capazes de gerar saturação), essas devem ser diluídas em proporções apropriadas, geralmente com a própria fase móvel utilizada no início da corridacromatográfica.

Um cuidado adicional que deve sermencionado é a observação da capacidade de extração do método de preparo de amostras empregado,quando for o caso do seu uso. Em maneira análoga àcoluna cromatográfica, cartuchos de SPE tambémpodem apresentar saturação, bem como outrastécnicas de preparo de amostras. Nesse caso, umadiluição prévia da amostra, com a própria matriz(branco) ou com outra solução apropriada, deve serintroduzida e avaliada no desenvolvimento dométodo. A Figura 3 ilustra o intervalo de linearidade ea sua perda devido à saturação do material de extração preenchido em uma microcoluna do tipo RAM-SPEpara análise online acoplada à cromatografia líquida.2

Figura 2. Curva da capacidade de carregamento (loading capacity) dos compostosacetofenona e butirofenona em uma coluna do tipo Nucleodur® 100-20 C18 ec. Fasemóvel: acetonitrila:água (80:20, v/v), vazão de 1,0 ml/min, temperatura de 25 ºC,detecção UV.



Outro caso de problemas com a aparência docromatograma também causado por sobrecarga dosistema cromatográfico ocorre quando há saturaçãodo sistema de detecção. Essa saturação pode ocorrertanto com detectores ópticos (UV-Vis e fluorescência, por exemplo) quanto com detectores de outros tipos.Detectores UV costumam ser lineares atéaproximadamente 1 unidade de absorbância; todaviaem medidas feitas em regiões laterais das bandas dosespectros ou em comprimentos de onda mais curtos odetector pode apresentar resposta não linear mesmodentro dessa faixa. O principal sintoma de umaresposta não linear do detector é o aparecimento depicos achatados no seu topo (Figura 4). Isso ocorreporque a maior saturação se dá predominantemente na região mais concentrada do pico, ou seja, na regiãocentral onde os analitos estão menos dispersos edifundidos na fase móvel. Deve-se observar que ospicos não ficam mais largos do que o normal, porémeles perdem o aspecto gaussiano devido a umdesproporcional achatamento do seu topo. Ademais, é importante a diferenciação entre a saturação do

detector e a existência de dois compostos emcoeluição parcial. Compostos parcialmente coeluídostambém podem apresentar-se no formato de um picoachatado, porém nessa situação a diluição da amostrainjetada não melhora o perfil, tal qual ocorre quando o problema é a saturação.

Figura 3. Avaliação da capacidade de carregamento (loading capacity) de uma coluna RAM-SPE (1 cm de comprimento). Gráfico normalizado da tendência linear e máximo de carregamento proveniente dainjeção simultânea de 11 fármacos em quantidades crescentes de massa. Para maiores detalhes videreferência 2.

Figura 4. Esquema de pico achatado, típico de saturação do sinal traduzido pelo detector. OBS: o grau de achatamentodepende da falta de linearidade/saturação do detector.

Dentre outros detectores, na atualidade, faz-seimportante o cuidado com o acoplamento LC-MS (ouLC-MS/MS). Nesses detectores, a saturação podeocorrer tanto na interface de ionização quanto noanalisador, ou ainda no detector dos íons(multiplicadora de elétrons, por exemplo). Aionização por electrospray é uma das mais sensíveis àalta concentração de espécies ionizadas na solução.Nesse tipo de interface, a presença de muitos íons leva à chamada supressão da ionização, uma das principais fontes de erros devido a um preparo de amostraineficiente. O próprio analisador de massas, emalguns casos, pode causar problemas de saturação. Éreconhecido o fato de que analisadores do tipo iontrap quando preenchidos com quantidade excessivade íons apresentam o efeito de espaço-carga(space-charge effect), nesse caso há repulsão e perdade íons de mesma carga quando confinados emnúmero excessivo no pequeno espaço do analisadorion trap. O principal problema no detector de íons é asaturação da multiplicadora de elétrons, nesse caso, apartir de certo nível da contagem de íons, ela deixa deter um aumento proporcional à densidade de íons quechega para detecção. O comportamento não linear dodetector é facilmente diagnosticado pelo gráfico decalibração, pois a falta de linearidade também sereflete nas respostas analíticas das concentraçõesmais altas.

4. Ocorrência de efeitos extracolunaNos últimos anos, a cromatografia líquida tem

presenciado a introdução de novas colunas, maiscurtas, finas e preenchidas com partículas menores.Essas novas colunas têm sido utilizadas no máximodo seu desempenho porque também houve odesenvolvimento de instrumentos de HPLC capazesde atingir pressões mais altas em sistemas compequeno volume extracoluna. Geralmente, essessistemas são comercializados com a sigla UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography) quantoatingem pressões da ordem de 1000 bar ou superiores, ou ainda com a nome de “fast HPLC” quandotrabalhando com pressões inferiores a essas. Emportuguês, usam-se, respectivamente, os termosCromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE) eCromatografia Rápida.

O uso dessas colunas é desejado porque comelas são obtidas separações com picos mais estreitos ealtos (incrementando a sensibilidade), além deanálises mais rápidas e com economia de solventes.Por outro lado, essas colunas demandam um melhor

desempenho do sistema cromatográfico. Esse melhordesempenho, além da capacidade de fornecer altaspressões, inclui, também, a necessidade por umreduzido volume morto extracoluna. Durante anos, ouso de colunas com comprimento entre 150 e 250mm, com diâmetro interno de 4,6 mm e usandopartículas de 5 µm ou maiores, tornou as separaçõescromatográficas praticamente imunes às falhas naconfiguração e dimensionamento das tubulações edemais dispositivos do sistema cromatográfico.Todavia, a introdução de novas colunas,principalmente para serem usadas em sistemas jáimplantados no laboratório, pode levar a sériosproblemas relacionados ao alargamento dos picoscromatográficos e consequente perda de resolução,quando um excesso de volume extracoluna estiverpresente. Nesse caso, a combinação crítica é o excesso de volume morto – de sistemas mais antigos e maldimensionados – com o uso de colunas mais exigentes – ou seja, mais modernas e eficientes.

Diante do exposto, uma melhor compreensãodo efeito do excesso de volume extracoluna se fazimportante ainda nos dias de hoje. Para isso devemoster o entendimento de que a separação cromatográficaocorre com base em um processo físico-químico queleva à dispersão dos analitos introduzidos no sistema,ou seja, leva ao alargamento da banda que atravessa osistema, do injetor até o detector.

O número aparente de pratos (Na) expressa aeficiência do sistema cromatográfico, podendo serdescrito, em termos volumétricos, como:

NV

aR

total

=2

2σ(eq.2)

onde VR é o volume de retenção do composto e σ total2 é

a variância volumétrica total do pico eluídocorrespondente.

A variância volumétrica total expressa toda aperda de eficiência devido ao alargamento da bandaatravés de um sistema cromatográfico. Essa perdatotal corresponde às contribuições de cada parte dosistema. Como as perdas individuais são consideradas independentes, a variância volumétrica total pode serescrita como:

σ σ σtotal coluna extracoluna2 2 2= + ∑ (eq.3)

onde σ coluna2 é a variância devido ao alargamento da

banda dentro coluna, e os termos σ extracoluna2 são

relacionados com as diversas fontes de volume mortoque alargam os picos fora da coluna. Obviamente esse cálculo também pode ser feito considerando ascontribuições que cada parte envolvida na separação

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apresenta sobre o volume total do picocromatográfico (Vp total

2 ), lembrando de considerar queos termos quadráticos é que são aditivos:

V V Vp coluna extracolunatotal

2 2 2= + ∑ (eq.4)

A diferença entre N e Na deve ser evidenciada.O número de pratos (N) descreve a eficiência dacoluna, e só pode ser obtido se o alargamentoextracoluna for eliminado. Assim, a eficiência dacoluna pode ser descrita como:

NVR

coluna

=2

2σ(eq.5)

Dentre os fatores que contribuem para oalargamento extracoluna do pico cromatográficopodem-se considerar a geometria e o volume dosistema de injeção e de detecção, os tubos e peças deconexão entre o sistema de injeção e a coluna e entre acoluna e o sistema de detecção, e a própria constantede aquisição empregada pelo detector (time constant).

σ σ σ

σ σextracoluna injetor conexões

tubos e

2 2 2

2

= + +

+ + det ctor time const2 2+ σ _

(eq.6)

Dessa forma, uma adequada redução no volume de injeção, nas linhas de conexão, e no volume dedetecção, entre outros, é requerida nos casos em que aprópria contribuição da coluna ao alargamento épequena (como é o caso das colunas modernas).

Para um mais completo entendimento dosfatores relacionados com o alargamento dos picoscromatográficos e o cálculo de eficiência, algumasfórmulas importantes são apresentadas e discutidas.3,4

A eficiência em LC é baseada no número de pratos(N), e esse está relacionado com h (altura reduzida doprato), como apresentado a seguir:

NL

hdc

p

= (eq.7)

onde Lc é o comprimento da coluna e dp é o diâmetroda partícula. O volume morto da coluna (V0) pode sercalculado como:

Vd

Lcc tot0

2

4=

πε (eq.8)

onde, dc é o diâmetro interno da coluna e ε tot é aporosidade total da coluna. A velocidade linear dafase móvel (u) e a vazão da coluna (F) podem serdefinidas como a seguir:

uvD

dm

p

= (eq.9)

onde v é o termo reduzido chamado de velocidadereduzida e Dm é o coeficiente de difusão do analito nafase móvel.

Fud c tot=

2

4

πε(eq.10)

Dessa forma, o tempo de retenção de umcomposto não retido (t0) pode ser calculado comot0=Lc/u, o tempo de retenção (tR) de um analito comfator de retenção (k) como tR = (k · t0) + t0, e o volumede retenção (VR) é o produto de F e tR. A largura dopico (4σ) e o volume do pico (Vp) são apresentadosnas equações a seguir:

4 4σ =t

N

R (eq.11)

V Fp = 4σ (eq.12)

Com o conhecimento dessas consideraçõesiniciais é possível calcular o valor para o maiorvolume de injeção (Vi) que pode ser introduzidosem causar alargamento excessivo do picocromatográfico. Esse valor é:

V VK

Ni R= θ (eq.13)

onde, K é um parâmetro característico da qualidade da injeção e geralmente é assumido igual a 2,3 e θ2 definea fração aceitável para o alargamento do pico. Porexemplo, 1% de alargamento (θ2=0,01) resulta em θigual a 0,1. De maneira similar, o volume máximoaceitável de detecção (Vd) é:

VV

Nd

R=θ

(eq.14)

e o comprimento para os tubos capilares de conexão é:

LD V

NFdcap

m R

cap

=384 2 2

4

θπ

(eq.15)

Dessa forma, enquanto para colunasconvencionais (250 x 4,6 mm, 5 µm) algumas dezenas de microlitros de volume morto extracoluna não sãoum incômodo, para colunas modernas e maiseficientes alguns poucos microlitros podem significara diferença entre o sucesso e o fracasso na separaçãode dois picos adjacentes.



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Além das equações 13 e 14, uma regraempírica, geralmente um pouco mais permissiva, para a determinação do volume máximo a ser injetado ouutilizado no sistema de detecção afirma que esse nãodeve ultrapassar 15% do volume do pico emcondições ideais de análise.

Em resumo, para a correção de problemas comvolume morto extracoluna, deve-se promover aremoção de qualquer pedaço de tubo desnecessário nosistema cromatográfico, bem como substituir asconexões inapropriadas e os tubos longos e de maiordiâmetro por outros mais curtos e estreitos. Umcuidado ao se fazer essa substituição é a utilização defiltros de linha de 0,5 µm de diâmetro interno, uma vezque tubos mais estreitos são facilmente entupidos. Aescolha dos tubos dependerá do tipo de coluna a serutilizada, sendo que, atualmente, tubos com diâmetrointerno inferior a 20 µm podem ser encontrados emsistemas de nanoHPLC. Preferencialmente, tubos depelo menos 178 µm (0,007”) devem ser utilizados,quando os tubos mais estreitos não forem estritamentenecessários, de modo a prevenirem-se entupimentos.Outro ponto a ser checado na resolução dessesproblemas extracoluna é o excesso de volume deinjeção e de detecção, para tal, as equaçõesapresentadas ou a regra dos 15% são opções para severificar possíveis implicações desses fatores. Oexcesso de volume de injeção pode ser corrigidodiminuindo-se o volume injetado, ou estabelecendo-seum procedimento de focalização dos analitos nosistema cromatográfico; por outro lado, o excesso devolume de detecção deve ser resolvido pelasubstituição da célula de detecção por outra de menorvolume, ou melhoria da geometria do sistema dedetecção, seja ele qual for. Como pode ser observadopelas equações 13 e 14, os compostos mais retidos(com maior VR) são mais tolerantes a presença devolume morto extracoluna, dessa forma, outra opção

para minimizar esses efeitos é o aumento da retençãodos compostos de interesse no interior da colunacromatográfica.

Em outra oportunidade será apresentada aforma como a eficiência (N) e o total do volumeextracoluna podem ser inferidos por meio dos dadosde separação, bem como mais dados numéricos serãofornecidos para exemplificar os efeitos que causam oalargamento da banda cromatográfica fora da colunade separação.

Como apresentado na introdução deste artigo,são vários os problemas causadores de distorções nospicos cromatográficos, esses problemas foram listadose estão sendo tratados, um a um.

Referências Bibliográficas1. Scott, R.P.W., Chromatography Books Series:

Preparative Chromatography. Disponível online:

<http://www.chromatography-online.org/Preparative/

Loading-Capacity/rs2.html>, Acesso em: 02 nov. 2009.

2. Santos-Neto, A.J. Cromatografia líquida

multidimensional e espectrometria de massas em

tandem para análise direta de fármacos em fluidos

biológicos: da escala convencional à miniaturizada.

2007. 216 f. Tese de Doutorado – Instituto de Química

de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos,

2007. Disponível em: <http://www.teses.usp.br/teses/

disponiveis/75/75132/tde-15012008-114604/> Acesso

em: 02 nov. 2009.

3. Meyer, V.R. High-performance liquid chromatographic

theory for the practitioner. J. Chromatogr., v. 334, p.

197-209, 1985.

4. Kucera, P. Microcolumn high-performance liquid

chromatography. Amsterdam: Elsevier, 1984 (Journal

of chromatography library 28)

A trigéssima quarta versão do maior evento domundo dedicado exclusivamente às Técnicas deSeparação em Fase Líquida (basicamente apenas aHPLC) foi realizada em Dresden, Alemanha, no final do mês de junho e início do mês de julho deste ano. Oevento, presidido por Christian Huber, contou com maisde 1.000 participantes de dezenas de países e envolveudiferentes formatos de apresentação (oral, pôsteres,sessão de discussão etc.). Um número reduzido deConferências Plenárias foi apresentado; entretanto,várias sessões foram montadas com apresentações orais, cobrindo os assuntos mais importantes da atualidade.

O primeiro dia do evento, domingo dia 28 dejunho, foi reservado exclusivamente aos cursos decurta duração (8 em paralelo) e à Sessão de Abertura.Os cursos foram realizados das 12:00 às 16:30 (4horas e meia de curso!!!) e foram seguidos da Sessãode Abertura às 16:45.

A Cerimônia de Abertura foi Presidida porChristian Huber e contou com várias premiações. Amedalha A.J.P. Martin foi entregue a WolfgangLindner; a medalha do Jubileu foi entregue a GerdDesmet e o prêmio Michael Widner para Gunter Fuhr.

A Palestra de abertura foi apresentada por PatSandra (Universidade de Gent e Research Institute for Chromatography, Gent, Bélgica) abordando o assunto “Present State-of-the-Art and Future Challenges ofFluid-Based Separations for the Pharmaceutical andChemical Industries” (Figura 1). A palestra de

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HPLC 2009 Meeting Report34th International Symposium on High-PerformanceLiquid Phase Separations and Related TechniquesDresden, Alemanha, 28 de Junho – 2 de Julho, 2009.

Fernando M. Lanças

Universidade de São PauloInstituto de Química de São Carlos13560-970 – São Carlos (SP)[email protected]

Figura 1. Palestra de abertura do HPLC 2009 proferidapelo Prof. Dr. Pat Sandra da Universidade de Gent, Bélgica.

abertura foi seguida de duas outras, na mesma sessão:“Present State-of-the-Art and Future Challenges ofLC-MS in Metabolomics-driven System Biology”, por T. Henkemeier (Leiden, NL) e “Dynamic Behavior ofSingle DNA Molecules at ChromatographicSurfaces” por E.S. Yeung (Ames, USA).

No dia seguinte, 29 de junho, segunda-feira,foram apresentas duas Palestras Plenárias a partir das9 horas: “Current Role and Future Perspectives ofLC-MS in Clinical and Forensic Toxicology”, porH.H. Maurer (Saar, D) e “State-of-the-Art and FutureChallenges of HPLC-MS in Drugs and MetabolitesAnalysis”, por G. Hopfgartner (University of Geneva, Switzerland).

A sessão foi seguida por 3 sessões orais,ocorridas em paralelo. A primeira, presidida porGeorge Guiochon (denominada Session 1.Fundamental Aspects) iniciou com uma “KeynoteLecture” apresentada por A. Felinger (Pécs,Hungary), que será o Presidente do HPLC 2011, e foiseguida por 3 apresentações orais. A primeira palestra foi apresentada por Fernando Lanças, Brasil, sobre otema “Temperature-Programmed Capillary LiquidChromatography”, e foi seguida por “TransportPhenomena in Packed Microships” por U. Tallarek e“When Does the Ideal Model of GradientChromatography Apply?” por J. Stahlberg(Mariefred, S). Duas outras sessões orais ocorreramnesse mesmo dia, em paralelo: Session 2 (Microscale

Analysis) e Session 3 (Electroseparations 1). No total, durante o HPLC 2009 foram apresentadas 30 sessõesorais. No período da tarde, foram apresentadosseminários técnicos pelas empresas participantes daexposição (“Vendor Seminars”), Tutoriais (3 nototal), uma sessão de Pôsteres dividida em váriosassuntos e locais (durante os 4 dias do evento foramapresentados cerca de 600 Pôsteres), e uma exposiçãode equipamentos, acessórios, consumíveis e literaturapara HPLC e áreas relacionadas (Figura 2).

Uma intensa programação social ocorreudurante todo o evento, no período noturno. Dentre osvários eventos, deve ser destacado o recital de órgão naKreuzkirche Church me Dresden pelo organista HolgerGehring que incluiu no programa J.S.Bach,Mendelssohon, Liszt e outros. Os convidados daComissão Organizadora foram brindados com um jantar típico no antigo castelo Schloss Eckberg, em Dresden,Alemanha (Figura 3), que possibilitou intensa interaçãoentre os participantes de diferentes continentes, umaoportunidade para rever os antigos amigos (Figura 4) eestabelecer novas colaborações científicas.

O programa científico dos dias 30 de junho, 1 e2 de julho foi, basicamente, o mesmo, com pequenasalterações como uma Sessão Plenária no encerramentodo evento dia 2 de julho às 15 horas. Nessa sessão,foram apresentadas as seguintes palestras:“Hyphenated Techniques in Biomedical Research”,por P.J. Oefner (Rogensburg/D); “20 Years of Lab on a



Figura 2. Vista parcial da Exposição de equipamentos, acessórios e literatura.

Chip – Why Bother?” por A. Manz (Freiburg/D) e“Multidimensional Liquid Chromatography: AnEnabling Methodology for Complex BiologicalAnalysis” por S.A. Cohen (Milford, USA).

Após a sessão, houve entrega de premiações eo encerramento do HPLC 2009, com a divulgação doHPLC 2010 a ser realizado em Boston, USA, epresidido por S.A. Cohen.

Sob todos os aspectos a serem considerados, oHPLC 2009 foi um excelente evento e consistiu em

grande sucesso de público (mais de 1.000 participantes). Considerando o número de participantes, pôsteresapresentados, e exposição, numericamente o evento foisimilar ao COLACRO XII realizado em Florianópolisem 2008, e que foi um dos maiores eventos da área nomundo, naquele ano1. O HPLC 2010 a ser realizado emBoston, USA, deverá repetir este sucesso e constituir-seem uma oportunidade única para os interessados nastécnicas de separação em fase líquida.

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Figura 3. Foto oficial dos convidados e Comissão Organizadora do HPLC 2009. Sentado, Prof. Dr.George Guiochon.

Figura 4. Momento de descontração durante o jantar oferecido aosconvidados. Da esquerda para a direita: Martine Sandra, Pat Sandra,Maria Inês Lanças e Fernando Lanças.

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Este Departamento tem como objetivo divulgar eventos da área decromatografia e técnicas relacionadas, tanto no Brasil quanto em outros países.

2009Outubro

Evento: XVI Congresso Brasileiro de ToxicologiaData: 10-14Local: Belo HorizonteInformações: http://www.sbtox.org.br/pages/detail.php?item_id=102

Dezembro

Evento: BrMassData: 12-15Local: The Royal Palm Plaza, Campinas - SPInformações: http://www.brmass.com.br/congresso

2010

Evento: Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afim (SIMCRO 2010)

Data: 14-16 de setembroLocal: "Arts and Convention Center", Campos do Jordão - SP - BrasilInformações: www.simcro.org; [email protected]

Evento: XIII COLACROLocal: ChileInformações: www.colacro.org

Calendário Geral

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) é parte da AssociaçãoInternacional de Cromatografia, entidade de direito privado, sem fins lucrativos.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dosusuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria deMassas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar umequipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelosDiretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipetécnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pós-graduados nosmelhores centros do país na área, e pós-graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores édisponibilizada no website do IIC.

O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC.Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (data

show-computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursosinstrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slidesapresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em várioscursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. Amaior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciadono folheto explicativo de cada curso.

Calendário de Cursos IIC para 2010

Mês Curso

Fevereiro Sistemas de Gestão da Qualidade (SGQ) em Laboratórios

Validação de Métodos Cromatográficos de Análise

Março Cromatografia Líquida Básica (HPLC ou CLAE) - Teoria e Prática

Cromatografia Gasosa Básica (HRGC ou CG) - Teoria e Prática

Abril Auditoria em Sistemas da Qualidade de Laboratórios

ISO 17025

Acoplamento LC/MS(MS) - Teoria e Prática



Instituto Internacional de Cromatografia

Mês Curso

Maio Cromatografia Líquida Moderna - Teoria e Prática

Cromatografia Gasosa Moderna - Teoria e Prática

Junho Cromatografia Líquida Básica - Teoria e Prática

Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas (GC/MS)Teoria e Prática

Julho Análise de Fármacos em medicamentos, tecidos e fluidos biológicos

Cromatografia Líquida Moderna - Teoria e Prática

Agosto Validação de Métodos Cromatográficos de Análise

Setembro Acoplamento LC/MS(MS)*

Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas (GC/MS)*

Avanços Recentes no Preparo de Amostras*

Tópicos Atuais e HPLC*

* Obs: Cursos a serem ministrados durante o SIMCRO 2010, no Centro de Convenções de Campos doJordão (SP), dia 13 de setembro de 2010.

Outubro Preparo de Amostras para Análise Cromatográfica (Teoria e Prática)

Novembro Como Desenvolver e Otimizar um Método em HPLC (CLAE)Teoria e Prática

Como prever, evitar e resolver problemas em Cromatografia Líquida:“Troubleshooting” - Teoria e Prática

Dezembro Cromatografia Líquida Básica (HPLC/CLAE) - Teoria e Prática

• O I.I.C. oferece também cursos "in-house" ("in-company"). Interessadosnesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria)todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo deinscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitadopara melhor aproveitamento dos participantes

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações

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O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido peloIIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas dedivulgação dos materiais por ele produzido. Esses materiais podem ser adquiridos doIIC através do website www.iicweb.or/bookstore.

LANÇAMENTO

Cromatografia Líquida ModernaFernando M. Lanças

Livro publicado pela Editora Átomo emmaio de 2009, aborda de forma simples e didáticaos principais assuntos relacionados àCromatografia Líquida Moderna (HPLC ouCLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas,Detectores, até aspectos da Validação, Preparo daAmostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos osinteressados em iniciar-se ou atualizar-se nestatécnica.

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Cromatografia em Fase GasosaFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação,análise qualitativa e quantitativa, detectores emuitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.Altamente recomendado para os iniciantes natécnica, os quais encontrarão explicaçõesdetalhadas e simples a respeito da maior parte dosfundamentos básicos da técnica.



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Validação de Métodos CromatográficosFernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, descreve os princípios da validação de métodos cromatográficoscom detalhes. Enfoque também a validação deinstrumentação e a adequação dos sistemas (“system suitability”) frente aos requisitos dos órgãosregulamentadores de resultados analíticos. O livro éacompanhado de um software, denominadoValidate – versão demonstração – desenvolvido emcolaboração com o Dr. Vitor Hugo P. Pacces, o qualauxilia no processo de validação.

Extração em Fase SólidaFernando M. Lanças

De autoria do Prof. Lanças, este livroapresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássicaempregando cartuchos até as mais atuais comodiscos, placas, ponteiras, e outras. Também discuteos princípios da micro extração em fase sólida(SPME) e da extração por sorção em barras deagitação (SBSE).

O Scientia Chromatographica é o primeiroperiódico da América Latina dedicadoexclusivamente às técnicas Cromatográficas erelacionadas ( preparo de amostras, espectrometriade massas, técnicas eletroforéticas e outras). Editado pelo Instituto Internacional de Cromatografia, operiódico conta com um corpo de co-editores comlarga experiência na área, respaldado por um grupode consultores ("advisory board") de grande renome internacional.

2009 | v . 1 | n . 4 71


scichro v1n4 final - iicweb.org · em ciência ocorrido na última década no país, ... coluna...

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