Avanos Recentes e Tendncias Futuras Das Tcnicas de Separao - Scientia Chromatographica

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    S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a

    ResumoO ob je ti vo de uma an li se qu mi ca a ob ten o

    de da dos qua li ta ti vos e/ou quan ti ta ti vos a res pe i to de umou mais com po nen tes de uma amos tra. Qu an do a tc ni caana l ti ca es co lhi da a cro ma to gra fia, o pro ce di men toana l ti co pode ser di vi di do em 3 eta pas: pr-cro ma to -grfica, cro ma to gr fi ca e ps-cro ma to gr fi ca. A eta papr-cro ma to gr fi ca en vol ve a amos tra gem, o trans por teda amos tra at o la bo ra t rio de an li se, e a eta pa de pre pa -ro da amos tra. Tc ni cas como LLE, SPE, SFE, ASE,SPME e ou tras so em pre ga das nes ta eta pa A eta pa cro -ma to gr fi ca visa a se pa ra o do ana li to de seus prin ci pa iscon ta mi nan tes, ge ran do os da dos ne ces s ri os para a iden -ti fi ca o e/ou quan ti fi ca o. Tc ni cas como HPLC-UV,GC-ECD, LC/MS/MS, GC/MS e ou tras so fre quen -temen te em pre ga das. A eta pa ps cro ma to gr fi ca visatratar os da dos qua li ta ti vos e quan ti ta ti vos ob ti dos.

    No presente artigo, uma reviso crtica arespeito destas 3 etapas envolvidas em uma anlisecromatogrfica incluindo os fundamentos tericos, ainstrumentao, vantagens e limitaes, e aplicaesdas principais tcnicas, apresentada e discutidacriticamente, do ponto de vista do autor.

    Contedo1. Introduo2. Tcnicas de Amostragem3. Tcnicas de Preparo de Amostras

    3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)3.2. Extrao Lquido-Slido3.3. Extrao com Fluidos Pressurizados3. 4. Tcnicas Miniaturizadas de Extrao

    4. Limpeza (Clean-up) da Amostra4.1. Cromatografia Lquida em Coluna Aberta

    em baixa presso4.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

    (HPLC ou CLAE)4.3. Cromatografia Lquida Multidimensional4.4. Outros enfoques para a limpeza de amostras

    5. Anlise Qualitativa e Quantitativa: o papel daCromatografia e Tcnicas Afim5. 1. As Tcnicas Cromatogrficas5.2. Anlise Qualitativa5.3. Anlise Quantitativa

    6. Tendncias na rea de Cromatografia e TcnicasAssociadas6.1. Preparo de Amostras6.2. Miniaturizao das colunas cromatogrficas6.3. Anlise rpidas6.4. Cromatografia multidimensional

    7. Concluses8. Referencias

    Avanos Recentes e Tendncias Futuras dasTcnicas de Separao: uma viso pessoal

    Fernando M. LanasUniversidade de So PauloInstituto de Qumica de So Carlos13560-970 So Carlos (SP)Brasilflancas@iqsc.usp.br

  • 1. IntroduoA segunda metade do sculo XX observou

    um avano sem precedentes nas tcnicas deseparao, devido aos novos desafios gerados peloaumento da populao mundial e a demanda porservios a partir do incremento tecnolgicomarcante do perodo Ps-Guerra. Contrariamentes exigncias anteriores a este perodo, quasesempre razoavelmente atendidas por mtodosfsicos simples de anlise como, por exemplo,gravimetria, a complexidade dos problemasambientais, de sade, alimentao, energia, emuitos outros, passou a exigir tcnicas de anlisemais complexas. Esta necessidade trouxe aexigncia de tcnicas mais rpidas, eficientes e,principalmente, capazes de serem automatizadasatravs de instrumentos complexos indisponveisat a dcada de 1950. A popularizao doscomputadores, graas aos preos tornados maisaccessveis, possibilitou o desenvolvimento deequipamentos totalmente comandados por umcomputador pessoal de grande capacidade deprocessar dados e armazen-los, a um custo o qual

    hoje apenas uma pequena frao do custo damaioria dos equipamentos que ele comanda .

    A complexidade analtica no reservadaapenas rea de instrumentao: mtodos maiselaborados (muitas vezes mais de um mtodousado para a mesma anlise) tem que serdesenvolvidos e ou adaptados a esta novarealidade, alm de passarem por etapas extensasde validao antes do uso para que os dados sejamreconhecidos pelas agencias governamentais asquais regulamentam a aceitao de resultados deanlises qumicas. No caso particular de mtodosanalticos para emprego na rea de SadeHumana, as exigncias quanto validao dasmetodologias so enormes, variando de um paspara outro e, muitas vezes, de um rgo para outro dentro do mesmo pas.

    Na anlise de compostos-alvo (targetcompounds) presentes em matrizes consideradas complexas como alimentos, ambientais, e fluidosbiolgicos, regra geral o objetivo analisar um oualguns compostos em uma matriz na qual estpresente em concentraes muito baixas(geralmente referida como anlise de traos).Nestes casos, usualmente necessrio, empregar

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    AbstractThe main goal when performing a chemical analysis is to obtain qualitative as well as quantitative information

    about one or more components of a sample. When the analytical technique of choice is chromatography, the analyticalprocedure might be divided into tree steps: (1) pre-chromatographic step; (2) chromatography; (3) pos-chromatographicstep. The pre-chromatographic step usually involves either the sample generation or collect (sampling), transport to thelaboratory, and sample preparation that usually involves several procedures such as extraction, clean up, derivatization,pH adjustment, and so on. Several analytical techniques are used in this step, including LLE, SPE, SFE, ASE, SPME,SBSE, among others. The chromatographic step aims the separation of the analite(s) from its natural contaminants, aswell as from the interfering species generated during the sample processing .Techniques such as HPLC-UV, GC-ECD,LC/MS/MS, GC/MS are frequently used for this purpose. Pos chromatographic step aims to treat the qualitative andquantitative data generated through the use of a proper chromatographic detector, doing all the required calculation,comparison with chromatographic data bank (retention indexes), spectral libraries (UV and MS spectra). A properselection of the best approach for each step, as well as its correct performance under an appropriate quality assurancesystem, will assure the quality of the generated results.

    In the present paper, a critical review with respct to the 3 describes steps involved in a typicalqualitative/quantitative analysis using chromatographic mehods, including theoretical background, instrumentation,advantages and limitations, and applications of the main techniques is presented and discussed.

  • uma srie de etapas, incluindo: extrao do analito da amostra, sua purificao para eliminao depotenciais contaminantes e interferentes, os quaispodem comprometer o resultado analtico, sepa-rao empregando tcnicas de separao de altaresoluo (HRGC, HPLC, CE e outros) edeteco por tcnicas ainda mais complexascomo, por exemplo, a espectrometria de massas1.

    A Figura 1 exemplifica um quadro tpicodas vrias etapas necessrias para a realizao deuma anlise tpica de um composto presente embaixas concentraes em matrizes complexas.

    O procedimento pr-analtico inicia-se jno delineamento do planejamento do proce-dimento a ser utilizado, prevendo todas as etapaspelas quais a amostra dever passar. Uma vezestabelecido o protocolo do estudo, a amos-tragem usualmente a primeira etapa doprocedimento experimental. Ela visa a seleo de alguns componentes de um universo, o qualpossa represent-lo com a mxima fidelidadepossvel. Por exemplo, no caso de um pomarcontaminado com pesticidas, na prtica seriaimpossvel analisar-se todos os frutos possivel-mente contaminados.

    A amostragem serve para assegurar que as frutas a serem avaliadas, neste exemplo,representam de maneira fidedigna o pomar como um todo. No caso de amostras de alimentos, porexemplo, o Codex Alimentarius recomendavrios guias (guidelines) para a amostragem de frutas e vegetais. Regra geral, aps a amostragem a parte selecionada para a anlise encaminhadapara o laboratrio de anlise quase semprelonge do local onde a amostragem ocorreu.Assim, o transporte e armazenagem so deextrema importncia para assegurar a integridade

    da amostra a ser analisada. Raramente a amostraj se encontra em uma forma apropriada para aanlise, requerendo que as substncias deinteresse sejam removidas da matriz original (por exemplo, para anlise de hormnios em frango necessrio inicialmente remover-se o hormnioda matriz para depois efetuar-se a anliseinstrumental por exemplo, atravs de HRGC).Esta etapa denominada preparo da amostra.

    O preparo da amostra tem como principalobjetivo isolar o(s) componente(s) de interessede outros compostos presentes na matriz os quais podero interferir posteriomente na deter-minao analtica. Muitas vezes esta etapa tambm denominada de extrao mas, em muitos casos, no necessria uma etapa de extraopara que o analito possa ser avaliado por umatcnica instrumental. Aps o isolamento doscompostos de interesse da matriz, pode sernecessria uma etapa complementar de limpeza(clean up) da amostra, particularmente em setratando de anlises complexas.

    A limpeza da amostra (clean up) quase sempre empregada na anlise de amostrasambientais, fluidos biolgicos, alimentos esimilares pois, devido a grande quantidade decompostos presentes nestas matrizes, invaria-velmente a tcnica de extrao no sersuficiente para gerar uma extrato isento decontaminantes. Muitas vezes nesta etapamuda-se o solvente original de extrao paraevitar problemas posteriores com detectores decromatografia, por exemplo, ou efetua-se aconcentrao dos compos- tos de interesse pelareduo do volume de solvente. Assim, estaetapa complementa a anterior visando apreparao da amostra o mais isento possvel de

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    Homogeinizao

    Extrao AnliseConcentraoou diluio

    Limpeza(clean-up)

    Reduo do tamanho

    Figura 1. 1.Diagrama esquemtico das principais etapas envolvidas na anlise qumica de amostras complexas.

  • compostos qumicos os quais possam interferirna tcnica instrumental de anlise. Algunsautores incluem o clean up como uma forma de preparo da amostra, outros no. O importante entender o papel de cada uma delas. Aps estaetapa, a amostra est pronta para a anliseinstrumental.

    A anlise instrumental, neste casocromatografia, visa a determinao da identidade(anlise qualitativa) e da quantidade (anlisequantitativa) do composto presente inicialmentena amostra em anlise. As tcnicas mais utilizadas para esta finalidade so a cromatografia gasosa(GC) e a cromatografia lquida (LC), acopladas atcnicas apropriadas de deteco. Outras tcnicascomo eletroforese capilar (CE), cromatografiacom fluido supercrtico (SFC), e outras, tambmtem sido utilizadas, porm em menor escala. Aidentificao dos componentes isolados geral-mente feita atravs do acoplamento entre a tcnica cromatogrfica de separao e uma tcnica deidentificao, como a espectrometria de massas(MS). A quantificao efetuada avaliando-se area ou a altura dos picos gerados nocromatograma, atravs de softwares dedicados aesta finalidade.

    Neste volume inaugural do peridicoScientia Chromatographica, cujo objetivo exata-mente discutir estas tcnicas de preparo de amostra, separao (LC, GC, SFC e outras) e identificao(Espectrometria de Massas, dentre outras), estetrabalho visa apresentar, de forma crtica e atual,segundo o ponto de vista do autor, os recentesavanos na rea e as tendncias futuras. Essesassuntos sero ampliados e discutidos em detalhesnos futuros volumes do peridico em questo,atravs das vrias sesses dedicadas s etapaspr-cromatogrficas, diferentes tcnicas deseparao e etapas ps-cromatografia.

    2. Tcnicas de AmostragemA amostragem , invariavelmente,

    considerada uma das etapas mais crticas doprocedimento analtico, uma vez que a seleoincorreta do material a ser analisado inviabiliza

    qualquer tentativa de correo posterior doproblema2. Deve ser lembrado que a amostragem visa o isolamento de uma quantidade muitopequena de uma amostra a qual faz parte de umuniverso muito maior (exemplo: alguns litros degua para representar a condio de um riointeiro!!!). Neste caso, o material orgnicopresente na gua varia de ponto a ponto tanto naextenso quanto na profundidade, dificultandosobremaneira o projeto de amostragem. Almdisso, pelo fato do rio ser um sistema dinmico eno esttico, o momento da amostragem tambm importante, o que requer o registro tambm domomento da amostragem para futuras cor-relaes. De forma anloga, a amostragem desedimentos de rio uma etapa igualmentecomplexa e difcil, ampliada pelo fato de poucosguias internacionais a este respeito (diferen-temente de gua e solo). Apesar dos esforos daComunidade Europia em normatizar as tcnicas de amostragem de solo, pouco avano foiatingido na prtica3-5. Em qualquer caso, eindependentemente da matriz e das substnciasde interesse, a anlise de matrizes complexas especialmente as naturais como ambiental,alimentos e fluidos biolgicos deve serprecedida de um plano de amostragem,preferencialmente validado.

    Todo o planejamento, execuo, inter-pretao de resultados, e redao dos relatriosde anlise devero estar dentro de um sistema dequalidade compatvel com sua finalidade6.

    3. Tcnicas de Preparo de Amostras

    Aps a etapa de amostragem, a parte isoladaa qual agora deveria ser denominada sub-amostramas que, na prtica, continua sendo denominadaamostra, deveria idealmente ir diretamente para aanlise instrumental, o que raramente feito. Issodeve-se ao fato de que em geral o produto daamostragem contm contaminantes prprios damatriz, alm de outros agregados durante oprocesso ou transporte (por exemplo, comumrecebermos no laboratrio amostras de batata, para

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    anlise de resduos de pesticidas, contendo terra).A sub-amostra, contendo os compostos deinteresse e os contaminantes, e doravantedenominada amostra por simplicidade e por refletir a nomenclatura efetivamente utilizada noslaboratrios de anlise, dever ento sertransformada para outra forma mais apropriadapara a anlise. No caso de anlise de frmacos emfluidos biolgicos, por exemplo, a presena deprotenas e outras macromolculas, assim como deoutras substncias menores, pode interferir,dediferentes maneiras, na anlise. Deve ser lembradoque estas matrizes contem centenas de compostosqumicos, a maioria em concentrao superior dofrmaco, o que dificulta ainda mais sua deter-minao qualitativa e quantitativa. Muitas vezesexiste ainda a necessidade de converter-se umasubstncia da forma na qual se encontra para outramais amena para a anlise (devido a problemas deestabilidade trmica, falta de volatilidade, ausnciade grupos funcionais adequados para detecoespectroscpica e outras), atravs de proce-dimentos de derivatizao. Este conjunto de aes,usualmente denominado genericamente de preparo de amostras, envolve diversas etapas no labora-trio, das quais a mais importante e complexa ,sem dvida, a etapa de extrao. Em muitos casosatualmente, a etapa de extrao pode sercombinada com a concentrao dos analitos,derivatizao e outros procedimentos, em umanica etapa para o preparo da amostra. Existemvrias tcnicas de extrao, dependendo do estadofsico, qumico e a complexidade da amostra e doscompostos a serem extrados, sendo as principaisdiscutidas a seguir.

    3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)Na extrao lquido-lquido (LLE, liquid-

    liquid extraction) duas fases imiscveis soempregadas: uma fase A, a qual contm o solutode interesse X, e uma fase B a qual ser colocadaem contacto com ela. Desta forma, ocorrer umadistribuio do soluto X entre as duas fases, aps o que o componente X poder ser submetido a outro processo de extrao ou encaminhado para aanlise por HPLC.

    De acordo com a teoria geral do equilbrioqumico, para um processo reversvel

    XA XB

    A constante de equilbrio pode ser expressapela lei de distribuio de Nernst como

    K[X][X]D

    B

    A

    =

    onde KD a constante de equilbrio, [X]B aconcentrao de X na fase B (numerador daexpresso), e [X]A a concentrao de X na fase A.

    A situao experimental ideal seria aquelana qual o equilbrio fosse altamente favorecido nosentido da transferncia de X para a fase B, ou seja,que o valor de KD fosse elevado. Valores pequenosde KD indicam que o processo desfavorecido eque a transferncia de X para a fase B ocorrer empequena extenso. Esta equao possui 3 restries principais, as quais so usualmente observadaspara extrao de solutos a serem analisados porLC: (1) a concentrao de X deve ser bastantebaixa em A e em B; (2) a forma molecular de Xdeve ser a mesma nas duas fases; (3) as duas fasesdevem ser imiscveis.

    Dependendo da forma com a qual as duasfases so colocadas em contacto, trs modosprincipais de extrao so possveis: batelada,contnua, e em contra-corrente.

    3.1.1. Extrao em bateladaNa extrao em batelada, um lquido

    contendo o soluto dissolvido agitado com umsegundo lquido imiscvel, em um recipientefechado, at que o equilbrio seja estabelecido.As duas fases so colocadas em repouso e, ento,separadas mecanicamente para que a fasecontendo o soluto de interesse seja usada emoutras operaes (outras extraes, ou a anliseinstrumental). Este procedimento usualmenterealizado com um simples funil de separao

    A extrao em batelada uma forma deextrao lquido-lquido bastante utilizada emlaboratrios analticos. Apresenta comoprincipais vantagens a simplicidade, pequeno

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    Figura 2. Exemplo de equipamentos empregados emextrao contnua.

    investimento na aquisio dos dispositivos devidro necessrios para a extrao, recuperaoboa do soluto se o experimento for bem projetadoe executado, e requer pequena especializao dooperador. Como principais desvantagens esto ogrande volume de solventes txicos utilizados e aexposio do operador ao contato com seusvapores; tempo de extrao geralmente longo para que uma boa transferncia do soluto ocorra deuma fase para a outra; dificuldade em informatizar a tcnica; baixa seletividade. Um grande esforofoi dispendido na ltima dcada com a inteno de contornar estas dificuldades, com algum sucesso.O desenvolvimento de micro dispositivos emchips, e de dispositivos robticos7-10 para LLE,sugere que a miniaturizao desta tcnica poder,em breve, provocar o ressurgimento de seu uso em larga escala.

    3.1.2. Extrao contnuaNesta forma de extrao um lquido

    passado continuamente, de forma dinmica,atravs de (ou sobre) um lquido estacionrio oqual contm a amostra, at que todo ocomponente desejado seja removido. As duasfases so separadas fisicamente, e a que contm o constituinte de interesse usada para outrasoperaes. Uma vez que o lquido extrator passaatravs ou sobre o material rapidamente,provavelmente na extrao contnua no sejaestabelecido um equilbrio. Entretanto, como oprocesso de extrao continua por um tempoprolongado (geralmente vrias horas) todo ocomponente de interesse pode ser extrado.Quando o valor de KD for muito pequeno para oanalito de interesse (KD < 1) e consideravelmente diferente do valor de KD dos outros componentes da amostra, muitas extraes em bateladadevero ser necessrias para a remoo docomponente de interesse da amostra.

    O projeto do equipamento utilizado naextrao contnua deve levar em conta se osolvente a ser adicionado amostra (solventeextrator) mais leve ou mais pesado do que asoluo contendo os solutos de interesse (Figura 2).

    O extrator apresentado na Figura 2a empregado quando o soluto extrator mais levedo que a soluo contendo a amostra. O solvente colocado no frasco (A), e aquecido fazendocom que os vapores passem para o topo do tubocentral (B), condensando no condensador (C).As gotas do condensado caem atravs do funil deaste longa (D) para o fundo da soluo a serextrada. As gotas do extratante sobem pelasoluo, extraindo medida em que se movem,at alcanar a superfcie. Quando o nvel dolquido extratante no tubo central atinge o braolateral (F), o extratante volta para o frasco dedestilao (A). O processo ento repetido.

    A Figura 2b mostra um esquema de umextrator empregado quando o solvente de extrao mais denso do que a soluo que contm aamostra. O solvente extrator colocado no frascode destilao (A) e aquecido; os vapores passampara a parte superior do tubo diretamente nasuperfcie da soluo a ser extrada (D) e, por serem mais densas, as gotculas atravessam a soluo ato fundo, extraindo medida em que descem. Apresso hidrosttica forar o extratante atravs do

  • brao lateral (E) e de volta para o frasco dedestilao. O processo ento repetido at que todo o soluto de interesse tenha sido removido.

    Processos de extrao contnua so,usualmente, bastante demorados (horas at dias). Avantagem desta tcnica que solutos com valores de KD pequenos, os quais dificilmente seriam extradospor processos de batelada, podem ser removidos daamostra atravs de uma extrao contnua.

    3.2. Extrao Lquido-SlidoExistem vrias tcnicas analticas empre-

    gadas na extrao dos compostos de interesse emmatrizes slidas e semi-slidas, desde simples ebaratas (porm com vrios inconvenientes) como aextrao com solvente sob agitao, at bastantesofisticadas como as tcnicas que empregamsolventes pressurizados.

    Na prtica atual, as tcnicas mais empre-gadas para este tipo de amostra empregamsolventes lquidos ou um fluido pressurizado(SFE, ASE, SWE e outras). Dentre as tcnicasque empregam solventes lquidos a ExtraoSoxhlet (Sox) e a Extrao em Fase Slida (SPE)so as mais utilizadas.

    3.2.1. Extrao SoxhletA Extrao Soxhlet, ou alguma de suas

    variaes, foi uma das tcnicas de extrao maisempregadas para amostras slidas na segundametade do sculo XX. O equipamento utilizadonesta tcnica relativamente simples (Figura 3),o que auxiliou na sua popularizao.

    O slido a ser extrado , geralmente,pulverizado e colocado em um cartucho feito depapel de filtro ou de algodo (E), no centro dacmara (A). O solvente extrator aquecido nofrasco (B) e os seus vapores sobem atravs dobrao lateral (C) at o condensador (D) onde liquefeito. O lquido permanece nesta cmaraaumentando de volume e extraindo o slido atque o nvel de lquido atinja o topo do braolateral (F). Neste ponto, a presso hidrostticadentro da cmara faz com que o solvente sejasifonado de volta ao frasco de destilao. Esteprocesso continua at que todo o soluto tenha

    sido removido do slido. Trata-se, portanto, deuma extrao contnua do tipo lquido-slido.

    A maior limitao desta tcnica o temponecessrio para obter-se um bom rendimento deextrao, usualmente muitas horas ou at dias, oque tem feito com que novas tcnicas maisrpidas e automatizadas venham sendo desen-volvidas com a inteno de substitu-la. Emmeados da dcada de 70, uma nova tcnica foiintroduzida, denominada Extrao em FaseSlida SFE (Solid Phase Extracion).

    3.2.2. Extrao em Fase Slida (SPE)A Extrao em Fase Slida (SPE) uma

    tcnica de separao lquido-slido, baseada nosmecanismos de separao da cromatografia lquida de baixa presso, tambm conhecida comocromatografia lquida clssica. Do ponto de vistaprtico, a SPE, na sua forma mais simples econhecida, comporta-se como uma cromatografialquida empregando-se uma pequena colunaaberta, usualmente denominada cartucho deextrao, a qual contm a fase slida (denominada

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    Figura 3. Extrator Soxhlet.

  • fase estacionria em cromatografia). A soluocontendo o analito de interesse colocada no toposuperior do cartucho e aspirada com pequenovcuo ou pressionada levemente com uma seringaou gs, de forma a penetrar no cartucho. Aps todaa fase lquida haver sido drenada, o analito retidono cartucho eludo com um pequeno volume desolvente de forma a coletar-se o analito em umaconcentrao j apropriada para anlise. A Figura 4ilustra um exemplo tpico de um cartucho paraextrao em fase slida, enquanto que a Figura 5mostra as principais etapas envolvidas na SPEquando o objetivo isolar um composto (ou umaclasse) presente em uma amostra complexa.

    Dentre os principais modos de operaoem SPE destacam-se11:

    Concentrao ou EnriquecimentoO objetivo principal passar-se, atravs do

    cartucho, um grande volume de amostra de forma a aprisionar-se somente o analito, deixando passar osolvente e interferentes. Em etapa seguinte, elui-seo analito de interesse com pequena quantidade desolvente, de forma que o analito coletado estarbastante mais concentrado que na amostra original. Este tipo de procedimento muito comum naanlise de amostras de interesse em qumicaambiental, nas quais usualmente o analito deinteresse encontra-se extremamente diludo(exemplo: micropoluentes em gua potvel) e suadeterminao direta por cromatografia difcil ouinvivel. Aps a etapa de concentrao, a amostra

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    Figura 5. Principais etapas empregadas em SPE visando o isolamento de um composto (ou classe de compostos).

    Figura 4. Ilustrao de um cartucho tpico empregado em Extrao em Fase Slida (SPE).

  • estar em um nvel de concentrao apropriadopara ser analisada diretamente por uma tcnicaanaltica de interesse.

    Isolamento do Analito (Clean-up)

    Neste caso o objetivo principal no o deconcentrar a amostra mas sim isolar o analito deinteresse dos interferentes da matriz. A amostraoriginal pode j ser concentrada o suficiente paraa anlise por uma tcnica apropriada, mas osconstituintes da matriz podero interferir noprocesso de anlise. Um exemplo bastante tpicode aplicao do clean-up na anlise deresduos de agrotxicos em alimentos. Uma veztratar-se de uma matriz muito complexa, comcentenas de compostos qumicos presentes, necessrio isolar-se o pesticida dos outroscomponentes presentes no extrato, antes damedida analtica. Deve ser observado que os dois procedimentos apresentados no so mutua-mente excludentes, de forma que pode-se desejar efetuar a concentrao do analito e o clean-upda amostra em um mesmo procedimento deextrao em fase slida.

    Isolamento da Matriz

    Neste procedimento o objetivo reter nafase slida os interferentes da matriz, ao invs doanalito de interesse (o qual passa direto com osolvente da amostra). O analito coletado em umfrasco para a anlise e os interferentes so retidosno cartucho o qual descartado. Este procedimento usualmente utilizado para clean-up e no para a concentrao de amostras.

    Estocagem de Amostra

    Este caso bastante empregado para aanlise de amostras as quais se encontram em localdistante do laboratrio analtico. Um exemplotpico a anlise de gua de rio/lago/mar,localizados longe do laboratrio que desenvolve oestudo. Neste caso, os cartuchos so transportadosat a fonte de gua e procede-se primeira etapa daanlise no local, a qual consiste em passar-se a gua atravs do cartucho, de forma a reter-se os analitos

    de interesse. Aps esta etapa, o cartucho contendoo analito de interesse armazenado em baixastemperaturas e transportado at o laboratrioanaltico. Uma das principais vantagens desteprocedimento evitar-se o transporte de grandesvolumes de amostra quando vrias amostras foremanalisadas, assim como na anlise de compostoslbeis e/ou volteis. importante efetuar-se umestudo preliminar para conhecer-se a estabilidadedo analito de interesse no cartucho a ser empregado (tempo de estocagem, temperatura, natureza docartucho, etc.).

    Os mecanismos de separao em SPE soos mesmos da cromatografia lquida; comoconseqncia, as fases slidas empregadas emSPE so as mesmas empregadas em cromato-grafia lquida de baixa presso. A escolha da fase slida apropriada depende da natureza do analitode interesse e da matriz na qual ele se encontra.Os principais mecanismos atualmente em uso em SPE so: adsoro; partio (fase normal e fasereversa); troca inica; excluso por tamanho.

    Estes mecanismos esto associados aprocessos qumicos e fsicos que atuam durante aseparao. Dentre as principais foras qumicasatuantes entre as molculas do analito e do sorbente (fase slida) destacam-se as foras inicas; ligaes de hidrognio, interaes do tipo dipolo-dipolo;dipolo-dipolo induzido; dipolo induzido dipoloinduzido (foras de disperso).

    3.2.3. Seleo do Formato em SPEO formato mais popular em SPE o de

    cartucho. Para tal, usualmente emprega-se ocorpo de uma seringa plstica (polipropileno)dentro do qual o material de empacotamento ficaretido entre dois discos (frits) de polietileno. Aparte inferior do cartucho afunilada e apresentauma extenso a qual encaixa em dispositivospara efetuar-se vcuo de diferentes fabricantes.Existem tambm cartuchos com o corpo de vidroou teflon, usados na tentativa de evitar-se apresena de materiais extrados do cartucho depolipropileno. De forma anloga, existem fritsfeitos de ao inox, titnio e polipropileno. Estes

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  • cuidados so particularmente importantes noscasos do uso de amostras muito diludas edetectores seletivos e sensveis como captura deeltrons e espectrometria de massas.

    A Figura 6 ilustra alguns formatosempregados em SPE. Alm destes formatos, outraspossibilidades desenvolvidas em vrios laboratriosesto sendo comercializadas, algumas com sucesso.

    O formato mais popular em SPE continuasendo, de longe, o tipo cartucho, seguido dosdiscos. Entretanto, vrios outros formatos tmsurgido recentemente com o intuito de melhorar odesempenho da SPE, principalmente facilitando a

    automao, diminuindo o tempo de anlise,permitindo custos mais baixos por anlise, maiorflexibilidade, etc. Uma destas variaes consisteem utilizar-se uma mistura de cartucho com disco(Figura 7). Neste caso, o disco colocado dentrode um cartucho de SPE, e o procedimento deanlise similar aquele usado para discos.A principal vantagem deste sistema permitir ouso dos dispositivos e de sistemas de automaoempregados para os cartuchos convencionais deSPE.

    Outro formato, particularmente interessantequando anlises rpidas so desejadas, uma vezque permite fluxos bastante elevados, o uso deum cartucho empacotado com uma camada fina departculas (mas mesmas usadas em SPE conven-cional). Assim, teremos uma situao similar anterior (Figura 7a), porm com partculas ao invs de disco (Figura 7b).

    Um dos mais recentes formatos, de grandeutilidade para indstrias farmacuticas e debiotecnologia, o de placas contendo 96 (ou mais) reservatrios (Figura 7c). Cada reservatriocontm uma coluna de SPE na forma de um discocom uma camada fina de empacotamento . Este

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    Figura 6. Formatos empregados em SPE.

    Figura 7. Formatos alternativos de SPE.

  • arranjo permite a anlise de um nmero grande deamostras, simultaneamente, sendo de particularutilidade em laboratrios onde a anlise rotineirade muitas amostras praticada. Uma dasinconvenincias neste caso a maior facilidadecom que ocorre contaminao usando esteformato. A proximidade entre os reservatrios fazcom que qualquer vazamento em um delesfacilmente contaminar o outro. Isto pode ocorrerdevido a vrios motivos, tais como o bloqueio deum dos reservatrios, usando um dispositivo devcuo, e a conseqente contaminao dereservatrios vizinho. Outra fonte comum decontaminao a base da placa .

    Quando um nmero menor de amostrasdeve ser processado, uma boa alternativa foirecentemente introduzida pela empresa AnsysDiagnostics. Ela consiste em usar-se pontasempregadas em pipetas volumtricas digitaiscontendo um disco de SPE (Figura 7d). Aprincipal vantagem deste sistema o fato dedificultar contaminao, uma vez que as pontasda pipeta so descartveis. Outra vantagem permitir o fluxo bi-direcional do solvente (paracima ou para baixo) e dispensar o uso dedispositivo de vcuo. O surgimento de outrasempresas comercializando este formato poderdar margem a uma ampliao na oferta deste tipode SPE, a custos mais acessveis.

    3.2.4. SPE empregando Disperso emMatrizes Slidas

    A tcnica denominada Disperso em MatrizSlida (Matrix Solid-Phase Dispersion) usa umsuporte slido, geralmente contendo uma fasequimicamente ligada (ex: C-18), atuando como um abrasivo para produzir uma ruptura na arquiteturada amostra, facilitando o processo de extrao. Aamostra sofre disperso na superfcie do materialsuporte - fase quimicamente ligada, formando umanova fase mista o que proporciona o isolamento deanalitos presentes em vrias matrizes12. A tcnicafoi empregada pela primeira vez em 1989 porBarker e colaboradores com o intuito de isolarresduos de drogas em tecidos. Denominadaoriginalmente disperso em fase slida13, na prtica

    ela consistia em uma modificao da SPE paraaceitar amostras slidas e semi-slidas tais comomatrizes biolgicas. Barker empregou um cartucho vazio de SPE, sendo que a amostra de tecido erapreviamente homogeneizada com C-18, uma faseslida muito empregada em SPE. Aps transferir amistura para o cartucho, a eluio era feita comoem SPE. A Figura 8 ilustra o arranjo originalutilizado por Barker13.

    Nesta tcnica, o suporte possui vriasfunes. Em primeiro lugar age como um abrasivoque promove a ruptura da arquitetura geral daamostra. Em segundo lugar, quando uma faselipoflica do tipo C-18 empregada ela age comoum solvente o qual ajuda na ruptura dasmembranas celulares. Em terceiro lugar, o materialmisturado ainda pode ser usado comoempacotamento de uma coluna e pode ser eludosequencialmente com solvente12. Esta tcnica temencontrado vrias aplicaes, principalmente naanlise de amostras biolgicas14,15.

    Na prtica, este processo pode ser dividido emduas etapas, sendo que a primeira consiste no preparodo cartucho contendo a amostra e a segunda naeluio dos analitos de interesse. A fase slida(exemplo: C-18) pesada e transferida para umrecipiente adequado para posterior triturao (a). Aamostra (exemplo: tecido animal) adicionada faseslida (b) e ambos so triturados (c) at uma pasta

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    Figura 8. Esquema do arranjo original utilizado por Barkerpara a disperso em fase slida [25].

  • homognea ser obtida (30 60 seg. tipicamente). Este sistema ir conter a amostra distribudauniformemente sobre a superfcie da fase slida,como demonstrado atravs de microscopia eletrnicade varredura12. A amostra ento colocada nocartucho (d) previamente contendo um filtro (frita)sobre o qual coloca-se (e) ento outro filtro (frita).A seguir adiciona-se o solvente (f) e procede-se aeluio com auxlio de uma pequena presso (g) paradiminuir o tempo de extrao. O extrato obtidopoder ser analisado diretamente, caso j esteja naforma, pureza e concentrao adequados, ou sofreroutras operaes como centrifugao, filtrao,derivatizao, concen- trao, dependendo da tcnicaanaltica ser empregada.

    A Figura 9 ilustra as etapas envolvidas naprocesso de disperso em fase slida.

    Apesar de ser uma tcnica relativamentenova, vrias aplicaes da Disperso em FaseSlida podem ser encontradas na literatura,ilustrando o crescimento do interesse pela tcnica.Uma de suas grande aplicaes, no momento, como uma das etapas mais importantes em umenfoque para a anlise de multi-resduos depesticidas em alimentos denominado QUECHERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe,ou seja, Rpido, Fcil, Barato, Efetivo, Robusto eSeguro)16.

    3.3. Extrao com Fluidos PressurizadosAs tcnicas de extrao empregando fluidos

    pressurizados tiveram como principal objetivo aeliminao (ou, pelo menos, a diminuio) doemprego de grandes volumes de solventesorgnicos txicos, comuns em LLE. O termo

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    Figura 9. Etapas envolvidas no processo de Disperso em Fase Slida.

  • extrao com fluidos pressurizados ou extraocom solventes pressurizados (pressurized solventextraction, PSE) tem sido empregado paraenglobar as vrias tcnicas de extrao as quaisutilizam solventes em presses superiores ambiente (> 1atm). Estas tcnicas tm sidoempregadas para a anlise de amostras slidas(alimentos, solos, polmeros) e, em menor escala,semi-slidos como sedimento de rio (e, muitoraramente, lquidos). As tcnicas mais empregadasem PSE so a extrao com fludo supercrtico(SFE), extrao com solvente sub-crtico (sub-SFE) e a extrao acelerada com solventes (ASE).Apesar de apresentarem caractersticas prprias decada tcnica, elas possuem vrios pontos emcomum. Com pequenas diferenas, devido scaractersticas individuais de cada tcnica, oesquema da Figura 10. pode englobar os principaiscomponentes de qualquer sistema para PSE.

    O solvente (lquido, fluido sub-crtico oufluido supercrtico), armazenado no reservatrio(A), bombeado atravs do sistema (B) depressurizao em direo cela de extrao (D) a qual contm a amostra. A presso monitoradapela vlvula (C) e a temperatura pelo forno (E)onde a cela de extrao instalada. Um restritorna sada do sistema (F) assegura a presso interna do sistema, sendo o extrato obtido ao passar porele direcionado para o sistema de coleta (G), oqual pode ser um frasco vazio, um frasco com um solvente apropriado, o injetor de um cromat-grafo, ou outro dispositivo de interesse.

    3.3.1. Extrao com Fluido Supercrtico (SFE)

    Um fluido supercrtico uma substnciaqumica cuja temperatura e presso se encontram,ambas, acima de seu estado crtico17-20. Estacaracterstica confere aos fluidos supercrticospropriedades diferentes dos gases e lquidos, asquais podem ser utilizadas com diversas vantagensna rea de extrao. Os fluidos supercrticosapresentam elevado poder de solvatao, servindocomo excelentes solventes, ao mesmo tempo emque sua elevada difusividade permite fcilpenetrao em matrizes complexas, auxiliando naremoo dos solutos de interesse. Apesar de quenas dcadas de 80 e 90 vrios solventes foramavaliados para atuarem como solventes em SFE(incluindo alcanos leves, alcois, SF6, freons,amnia e vrios outros), a maioria dos estudosatuais empregam o dixido de carbono, CO2 Istose deve ao conjunto favorvel de propriedades asquais incluem baixa toxicidade, facilidades de serproduzido e purificado, e condies relativamentebrandas para atingir o estado crtico (Tc = 43oC ePC = 73 bar). Devido s caractersticas ambien-talmente corretas, o CO2 no estado supercrtico considerado um solvente verde - dentro dagrande nfase atual denominada GreenChemistry Qumica Verde-, ou seja, um solventeo qual no traz problemas ao meio ambiente. Umadas limitaes do uso de CO2 sua baixapolaridade, o que dificulta a extrao de solutossemi-polares e polares. Existem duas formas

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    Figura 10. Esquema genrico de um sistema para Extrao com Fluido Pressurizado (PSE).

  • principais para contornar esta limitao: (1) o usode presses elevadas, bastante acima da crtica; (2)adio de modificadores orgnicos, os quais sosolventes polares agregados ao CO2 em pequenasconcentraes (geralmente 1-5 % v/v).

    A instrumentao tpica empregada emSFE apresentada de forma simplificada naFigura 11.

    A amostra colocada dentro da cela deextrao, a qual lacrada e instalada no fornopreviamente aquecido temperatura desejada.O CO2 pressurizado pela bomba em direo cela de extrao; aps a remoo da amostra, oscomponentes de interesse so coletados em umdispositivo apropriado, geralmente um frascocontendo um solvente.

    A SFE uma tcnica de grande utilizaoprincipalmente nas reas de alimentos, combus-tveis, sade e meio ambiente21-32. Uma vantagemdesta tcnica a facilidade com a qual pode seracoplada em linha com tcnicas cromatogrficas de anlise, permitindo acoplamentos em linha do tipoSFE-GC, SFE-LC, sFE-CE e outros33-35.

    3.3.2. Extrao Acelerada com Solventes (ASE)

    Esta tcnica bastante similar SFE, pormusualmente emprega um solvente orgnicopressurizado, no necessariamente no estadosupercrtico, ao invs de CO2. Os mais utilizadosso solventes lquidos, como o metanol, tolueno ouacetona, abaixo das condies crticas, porm em

    presses suficientemente elevadas para assegurarque estar no estado lquido durante a extrao.Esta tcnica tem sido empregada principalmente na extrao de substncias presentes em matrizesslidas, tais como solos e polmeros36-38, apresen-tando vantagens sobre seus concorrentes como aextrao Soxhlet (maior tempo de extrao) e alquido-lquido, realizada em frascos agitados(maior volume de solvente extrator). Alm disso, aescolha apropriada da temperatura e da presso dosolvente permite uma extrao seletiva de apenasdeterminados compostos de interesse. A ASE temsido tambm empregada com sucesso na extraode matrizes semi-slidas como sedimentos esimilares39.

    3.3.3. Extrao com Fluido Sub-Crtico(sub-SFE)

    O fluido sub-crtico um solvente cujatemperatura e/ou presso esto abaixo do pontocrtico. Dentre os vrios fluidos avaliados para usocomo solvente extrator, o que apresenta melhoresresultados a gua, dando origem a uma tcnicadenominada extrao com gua sub-crtica (SWE,subcritical water extraction). Esta tcnica similar SFE e ASE, sendo ambientalmentecorreta pela total excluso do uso de solventesorgnicos. A seletividade do solvente escolhidaatravs da presso e da temperatura, podendovariar desde um carter apolar at semi-polar.Apesar de ser um solvente polar nas condiesnormais de temperatura e presso, aumentando a

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    Figura 11. Esquema simplificado das principais partes de um extrator para SFE (note a semelhana com os componentes da Figura 10).

  • temperatura e mantendo-se a presso o suficientepara evitar uma mudana para o estado de vapor, aconstante dieltrica da gua muda de 80 (a 25oC)para 27 (a 25oC). Portanto, sua polaridade podeser selecionada atravs da escolha das condies de temperatura e presso40. Na prtica, devido aoaumento do poder de corroso da gua com atemperatura, as condies empregadas estosempre abaixo da condies crticas para estesolvente (PC= 220 bar; Tc= 374oC).

    O maior emprego da SWE tem sido naanlise de poluentes orgnicos em matrizesambientais, porm pode ser empregada, na maioriados casos, em amostras analisadas por SFE e ASE.

    3. 4. Tcnicas Miniaturizadas de Extrao

    3.4.1. Micro Extrao em Fase Slida (SPME)A Extrao em Fase Slida (SPE), descrita

    anteriormente, uma tcnica bastante vantajosade extrao quando comparada aos mtodosclssicos, tais como Extrao Lquido-Lquido eextrao Soxhlet, principalmente no referente economia de tempo e de solvente. Entretanto,ainda apresenta alguns problemas os quaisdevero ser eliminados para sua aceitao maior.Um deles refere-se etapa de desoro do analito aprisionado no cartucho de SPE: ou emprega-sevolumes razoveis de solvente (quantidadebastante inferiores s empregadas em LLE eSoxhlet, mas ainda considerveis) ou emprega-se a desoro trmica a qual requer umequipamento especial, geralmente de elevadocusto. Outro problema da SPE tem sido a grandevariabilidade da qualidade dos adsorventes deum fabricante para outro. Assim, a mudana demarca de fabricante, mesmo empregando omesmo tipo de fase estacionria (ex. C-18)geralmente ocasionar na necessidade de adapta- es nos volumes de solventes para que o mtodo funcione adequadamente. Ou seja, esta mudanageralmente requer uma validao do mtodo com todas as suas conseqncias (principalmenteeconmicas e de tempo). Assim, altamentedesejado o aparecimento de mtodos os quaispossam contornar estes problemas. Uma opo

    recentemente desenvolvida com tal finalidade a micro extrao em fase slida (SPME).

    A Micro Extrao em Fase Slida(SPME) uma tcnica relativamente simples doponto de vista instrumental. Na sua formaoriginal, baseia-se na absoro dos analitos poruma fibra de slica modificada quimicamente,com posterior dessoro trmica dos analitos emum cromatgrafo a gs41.42. Nesta verso, osistema SPME foi construdo a partir de umaseringa convencional para cromatografia, marcaHamilton, modelo 7000, contendo uma fibra deslica em seu interior.

    A microseringa usada para introduzir afibra no injetor do cromatgrafo a gs, e proteg-laenquanto no estiver em uso. Antes de colocar afibra dentro do mbolo, uma gota de cola do tipoepoxi colocada na fibra a qual deixadaendurecer. Isto ir manter a fibra na posioadequada na seringa. O comprimento ideal da fibravaria dependendo principalmente do injetor docromatgrafo a ser empregado; valores ao redor de10 cm so tpicos. O dimetro da fibra tambmpode variar, sendo utilizado nos experimentosiniciais um dimetro externo de 170 mcrons, e afibra no oca. Nos experimentos realizados noincio da dcada de 90, ainda durante odesenvolvimento da tcnica, Pawliszyn43 inves-tigou o uso da poliimida que reveste a slicafundida como um meio de concentrao deanalitos, e comparou o desempenho com a slicasem nenhum revestimento externo. Estudou asdiferentes variveis que influenciam o processo deextrao, incluindo o tempo de exposio dasoluo a ser analisada fibra; a linearidade datcnica; a reprodutibilidade; seletividade einterferentes. Este autor props que em SPME noocorre uma extrao exaustiva, mas sim umequilbrio entre a fase aquosa (as aplicaesapresentadas referem-se determinao de analitos em gua) e a fase orgnica estacionria.

    Pawliszyn43 mostrou haver uma relaolinear entre a quantidade sorvida na faseestacionria e a concentrao na amostra. Apesar de originalmente desenvolvida para a anlise demicropoluentes orgnicos em gua, a SPME tem

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  • encontrado aplicao em vrios campos como na anlise de aromas e flavorizantes em frutas;volteis no ar; medicamentos em urina e muitasoutras aplicaes. Um livro recente ilustra asaplicaes da SPME em vrios campos deinteresse44. A tcnica ainda continua em fase dedesenvolvimento, apesar de j estar disponvelcomercialmente.

    Os dois principais modos de operao emSPME so a extrao direta e a extrao viaheadspace (Figura 12). No modo extrao direta(Figura 12a) o recobrimento da fibra inseridodiretamente na amostra e os analitos sotransportados da amostra para a fase extratante.Para acelerar o processo emprega-se agitaomecnica para transportar os analitos do meio dasoluo para a vizinhana da fibra. Para amostrasgasosas, a conveco natural do ar suficiente parafacilitar o rpido equilbrio. Para matrizes aquosas, tcnicas mais eficientes de agitao tais comoagitao mecnica ou sonicao so necessrias. No modo headspace (Figura 12b), os analitosnecessitam ser transportados atravs da barreira dear antes de atingirem o recobrimento da fibra.

    Esta modificao serve, principalmente,para proteger a fibra de possveis danosprovocados por interferentes de elevada massamolecular, ou baixa volatilidade presente nasamostras, tais como materiais hmicos (amostras ambientais) e protenas (amostras biolgicas). Este modo de extrao permite mudanas namatriz como, por exemplo, no pH, sem danos na

    fibra. A quantidade de analito extrado na fibra(utilizando-se o mesmo frasco de amostra) noequilbrio, ser a mesma empregando-se o mododireto ou headspace, desde que o volume deheadspace e de amostra sejam iguais. Isto ocorrepelo fato de que a concentrao no equilbrio independente da localizao da fibra no sistemaamostra/headspace. Se estas condies noforem observadas, uma diferena significativaentre os modos direto e headspace serobservada para analitos bastante volteis. Poroutro lado, a cintica de extrao ser bastantedependente do modo de extrao selecionado.

    O nmero de parmetros experimentais aserem otimizados e controlados em SPME bastante superior aos do SPE e LLE. Dentre osprincipais fatores experimentais que afetam aeficincia de extrao encontram-se11: escolhado revestimento da fibra; temperatura daextrao; tempo da extrao; pH; velocidade deagitao; fora inica.

    Desoro dos analitos retidos em SPMEpara anlise por LC

    Quando o objetivo utilizar a SPMEcomo tcnica de preparo de amostra para anlisepor GC, a dessoro do analito retido na fibra feita de maneira simples, inserindo-se a mesmano injetor aquecido do cromatgrafo. Ocorrerdessoro trmica e os analitos sero direcio-nados para a coluna com a ajuda do gs dearraste. Para LC a situao infelizmente bem

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    Figura 12. Principais modos de operao em SPME.

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    mais complexa, existindo dois modos principaisde dessoro: fora de linha (off-line) e emlinha (on-line). No sistema fora de linha, apsa etapa de extrao a fibra inserida em umfrasco contendo um solvente apropriado e osanalitos so solubilizados e posteriormenteinjetados no cromatgrafo para anlise. Nosistema em linha aps a extrao a fibra introduzida em uma interface a qual conectadaa coluna de LC. Um solvente passa atravs deuma vlvula e lava a fibra, provocando dessoro dos analitos os quais so direcionados pelosolvente para a coluna de LC e analisados.Lanas e colaboradores desenvolveram vriasinterfaces para o acoplamento em linhaSPME-LC45, inclusive empregando sinergis-ticamente dessoro com solvente e aquecimento para aumentar o rendimento da extrao46.

    Alguns pesquisadores e agncias queregulamentam o uso de agentes txicos ealimentos ainda apresentam ressalvas tcnica,julgando-a semi-quantitativa e no quantitativa,o que poderia impedir de torna-se, por exemplo,um mtodo oficial da US-EPA ou US-FDA.Considerando-se o imenso interesse que a SPME tem despertado recentemente , pode-se esperarum grande avano na mesma nos prximos anostanto do ponto de vista fundamental, nainstrumentao (maior automao e novas fasesestacionrias) e aplicaes.

    In-tube SPMEUma variao do acoplamento SPME-LC,

    denominada in-tube SPME foi desenvolvida para a microextrao e pr-concentrao de solutosmenos volteis e/ou termicamente instveis. Umcapilar de slica fundida, com a superfcie interna revestida com a fase extratora (quimicamenteligada) funcionando como um dispositivo paraSPME, acoplado em linha com o sistema LC,permitindo a automao do processo de extrao, maior preciso do mtodo analtico e menortempo de anlise.

    No caso de anlise de amostras biolgicasatravs do sistema in-tube SPME, estas soinjetadas praticamente no seu estado fisiolgico,diminuindo a exposio dos analistas aos fluidosbiolgicos e minimizando perdas do soluto durante o processo de extrao. Todo o soluto extrado introduzido na coluna analtica, aumentando asensibilidade do mtodo analtico47.

    3.4.2. Extrao Sortiva em Barras de AgitaoA extrao sortiva em barra de agitao

    (SBSE), introduzida no final da dcada passadapor Baltussen et al.48, baseia-se nos princpiosestabelecidos para SPME, ou seja, equilbrio departio. Uma barra de agitao magntica (10 a20 mm de comprimento) revestida com 25-125L (0,3-1,0 mm espessura) de polidime-tilsiloxano (PDMS) tem sido utilizada nasSBSEs.

    O mecanismo de extrao dos solutos nafase PDMS baseado na absoro. Este processo de reteno mais fraco, quando comparado com a adsoro (fibras mistas SPME), o que permiterpida dessoro trmica dos solutos emtemperaturas medianas. O equilbrio de partioou capacidade de reteno de um determinadosoluto em PDMS, no influenciado pelapresena dos interferentes da matriz ou de outrossolutos, o que resulta em mtodos analticos comampla faixa de linearidade.

    A SBSE controlada pelo coeficiente departio dos solutos entre as fases, PDMS eaquosa. O coeficiente de partio tem sidocorrelacionado com o coeficiente de distribuiooctanol-gua (Ko/w). Embora no totalmentecorreto, o Ko/w tem sido utilizado para estimar aeficincia do processo SBSE para um determi-nado soluto49,50.

    Para as anlises SBSE/LC de compostostermolbeis ou de elevada massa molar, oprocesso de dessoro SBSE tem sido realizadoatravs da insero da barra SBSE em um microtubo contendo alguns L de um solvente lquido. Geralmente emprega-se como solvente dedessoro, neste caso, a prpria fase mvel ou

  • um solvente orgnico, podendo ocorrer comagitao magntica ou em banho de ultra-som, ecom ou sem controle da temperatura. Poucasreferncias bibliogrficas descrevem a tcnicaSBSE/LC empregando o processo de dessoroem fase lquida.

    Lanas e colaboradores recentementedesenvolveram uma interface similar queladesenvolvida para SPME/LC para emprego emSBSE/LC51.

    Os mtodos cromatogrficos empregandotcnicas miniaturizadas de preparo de amostrasdescritos na literatura apresentam alta sensibili-dade, seletividade, linearidade, exatido e preciso, de acordo com critrios internacionais de validao analtica. Estes mtodos tm sido aplicados paradeterminaes de diversos solutos em diferentesreas, tais como: ambiental, farmacutica, forense,alimentos, clnico, dentre outras.

    3.4.3. Extrao Dinmica em Fase Slida (SPDE)

    Apesar de que a SPME e SBSE so astcnica miniaturizadas mais empregadas nomomento para o preparo de amostras para anlise cromatogrfica, outras surgiram recentemente esero discutidas a seguir.

    A Extrao Dinmica em Fase Slida,SPDE (Solid Phase Dynamic Extraction)emprega um sistema muito similar ao da SPME,porm com o agente extrator sendo colocado naparede interna do tubo ao invs da parede externa

    como em SPME. Utiliza uma seringa comum decromatografia, dentro da qual a fibra de SPDE mantida como em SPME. A exposio da fibra,tcnicas de dessoro e demais aspectos prticos da tcnica so similares SPME; um diagramaesquemtico da mesma pode ser visto na Figura 13.

    A seringa contendo a fibra com o revesti-mento (sorvente) na parede interna inserida naamostra, e os analitos extrados. A dessoropode ser efetuada com aquecimento, ou solven-tes, como nas outras tcnicas miniaturizadas.

    A empresa que comercializa o sistemapara SPDE efetuou vrias comparaes com aSPME, tentando demonstrar a superioridadedesta tcnica. Bicchi e colaboradores em estudocomparativo ressalta os pontos positivos daSPDE52. At o presente quase todas as publi-caes nesta tcnica so da empresa a qualcomercializa os produtos para a mesma, e degrupos de pesquisa ligados a ela. Espera-se quemais trabalhos sejam publicados no futuroprximo, para que as vantagens e limitaes damesma fiquem melhor conhecidas.

    3.4.4. Micro Extrao por SorventeEmpacotado (MEPS)

    A Micro Extrao por SorventeEmpacotado, MEPS (Micro Extraction byPacked Sorbent) emprega uma seringa contendouma agulha, na forma de um pequeno cartucho,contendo um sorvente. Na prtica, uma versominiaturizada da SPE, empregando ao invs de

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    Figura 13. Extrao Dinmica em Fase Slida (SPDE).

  • cartuchos plsticos ou de vidro, discos ou outrosformatos, uma agulha empacotada com a faseslida. As etapas empregadas para o preparo deamostra por esta tcnica so similares aos descritospara SPE, e os sorventes empregados so basi-camente os mesmos.

    Abdel-Rehim publicou recentementeresultados comparando a MEPS com SPE eSPME, ressaltando as caractersticas destastcnicas, e destacando os aspectos da MEPS osquais considera favorveis tcnica53. A Tabela 1resume alguns dos principais fatores envolvidosnestas tcnicas.

    Tabela 1. Comparao entre MEPS, SPME e SPE, deacordo com Abbel-Rehim (53).

    Fator MEPS SPE SPMEQuantidade de sorvente

    0,5-2 mg 50-2.000 mg Espessura 150 mm

    Preparo da amostra

    1-2 min 10-15 min 10-40 min

    Reutilizao 1-2 min Nenhuma 50-70 extraesRecuperao Boa Boa BaixaSensibilidade Boa Boa Boa

    3.4.5. Microextrao em Fase Lquida (LPME)

    Uma alternativa s tcnicas miniaturizadasdescritas anteriormente foi desenvolvida porPedersen-Bjergaard e Rasmussen54 empregandouma fibra oca. Denominada Microextrao em FaseLquida, LPME (liquid phase microextraction),utiliza uma fibra oca constituda por uma membranacapilar porosa e hidrofbica, cujos poros soimpregnados com um solvente extrator orgnico e o seu lmen preenchido com um volume muitopequeno (microlitros) de uma fase aceptora. A faseaceptora (solvente orgnico) no entrando emcontacto direto com a fase doadora (matriz aquosa)

    Permite o uso de agitao durante o processode extrao, como empregado em SPME e SBSE.

    Esta tcnica foi motivo de recente revisona lngua portuguesa55, a qual descreve osfundamentos da tcnica, parmetros a seremotimizados na prtica (praticamente os mesmosda SPME e SBSE) e aplicaes.

    4. Limpeza (Clean-up) da AmostraA etapa de extrao no assegura que o

    composto de interesse presente no extrato possa ser diretamente introduzido em um cromatgrafo paraanlise. Usualmente, uma vez que as tcnicas deextrao no so seletivas, outros compostos almdos de interesse usualmente estaro presentes noextrato, podendo interferir na anlise cromato-grfica. A soluo mais utilizada para esteproblema efetuar-se o clean-up do extrato, oque pode ser efetuado por vrias tcnicasdependendo das caractersticas dos compostos deinteresse, da matriz e dos contaminantes que sequer excluir do extrato. Dentre as principais opes as mais empregadas atualmente so a cromato-grafia lquida, alm da extrao em fase slida(SPE), e a extrao lquido-lquido (LLE) jdiscutidas anteriormente.

    4.1. Cromatografia Lquida em ColunaAberta em baixa presso

    Apesar de muito antiga quanto concepo,a cromatografia lquida clssica ainda ampla-mente empregada no clean-up de extratosproduzidos por diferentes tcnicas, em especial naanlise de produtos naturais e resduos de pesticidasem alimentos. uma tcnica muito simples a qualpode ser conduzida em uma bureta contendo umatorneira para controlar o fluxo da fase mvel, dentroda qual coloca-se uma material slido como slica,alumina, florisil, trocadores de ons e outros, parafuncionar como fase estacio- nria. A amostra introduzida na coluna e os componentes do extratoque no forem de interesse usualmente soeliminados com solventes apropriados, deixando aamostra limpa destes componentes (clean-up). Oscompostos de interesse, retidos na fase estacionria,so depois eluidos com solventes apropriados eestaro prontos para injeo em um cromatgrafolquido ou gasoso. Uma vez que neste tipo de coluna emprega-se partculas de dimetro relativamentegrandes (usualmente maiores que 40 mcrons), neste procedimento no se objetiva a separao decompostos individuais mas uma diminuio dacomplexidade do extrato para a anlise cromato-grfica. Uma desvantagem importante desta tcnica

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    o tempo necessrio para o clean-up, usualmente vrias horas, alm do emprego de grandes volumesde solventes txicos. Esta ainda uma das tcnicasmais populares para esta finalidade devido a suasimplicidade, baixo custo operacional e pequenoinvestimento em equipamento.

    4.2. Cromatografia Lquida de AltaEficincia (HPLC ou CLAE)

    Na prtica a diferena entre alta, mdia ebaixa presso no facilmente determinada.Assim, quando uma eficincia maior no processo desejada, usualmente diminui-se o tamanho daspartculas da fase estacionria, o que acarreta umaumento da presso na coluna. Isto requer o uso depresses maiores (usualmente com ajuda de umabomba) para que a anlise possa ocorrer em umaescala de tempo razovel. Todas as formas decromatografia lquida, inclusive em presseselevadas, tm sido empregadas para o clean upde amostras. A principal vantagem do uso departculas menores (e, como conseqncia,presses mais elevadas) a maior eficincia daseparao, e o uso de equipamentos controladospor computadores, facilitando a automao total da anlise. A contra-partida o custo mais elevadotanto na aquisio da instrumentao quantooperacional para as tcnicas que empregampresses mais elevadas.

    4.3. Cromatografia LquidaMultidimensional

    Em funo da maior eficincia, as colunasde menor tamanho, com partculas menores efechadas nas duas extremidades, podem ser maisfacilmente acopladas em linha (on-line) comoutra(s) coluna(s), permitindo um arranjo instru-mental bastante verstil e poderoso usualmentedenominado cromatografia lquida multidimen-sional. Neste caso, duas ou mais colunasoperando com distintos mecanismos deseparao podem ser acopladas umas s outrasde forma a aumentar a seletividade e a eficinciada separao. Geralmente a primeira coluna empregada para uma pr-separao, ou como um

    clean-up, enquanto que a segunda a queefetivamente realiza a anlise. No exemplo deamostras de alimentos, a primeira coluna podeoperar no modo excluso por tamanho e asegunda em fase reversa, por exemplo. Aamostra introduzida na primeira coluna e asmacromolculas e outros interferentes soeliminados da coluna, enquanto que os compos-tos de interesse so retidos. A seguir uma fasemvel apropriada, com o auxlio de uma vlvulade comutao de coluna, remove os compostosde interesse da primeira coluna e os transferepara a segunda, onde a anlise ocorre. Umenfoque similar pode ser utilizado para limpezade amostras de fluidos biolgicos contendo umfrmaco de interesse, compostos quirais emdiferentes matrizes (neste caso usualmente asegunda coluna uma coluna quiral) e vriasoutras aplicaes. Este tipo de enfoque temganho bastante adeptos na ltima dcada,devendo tornar-se um importante enfoque nalimpeza de amostras complexas.

    4.4. Outros enfoques para a limpeza deamostras

    Alm das tcnicas discutidas, existem vrias outras empregadas para o clean-up de amostrasj discutidas neste trabalho, incluindo a LLE, SPE,SFE, ASE e outras. Algumas destas tcnicas, como a SPME, permitem efetuar-se extrao, clean-upe concentrao (enriquecimento) em uma nicaetapa, enquanto que outras como a SPE efetuamespecificamente a limpeza da amostra. Algumastcnicas permitem o acoplamento em linha(on-line) com uma tcnica cromatogrfica,facilitando a automao total da anlise. Nestecaso, o extrato direcionado da extrao direta-mente para a tcnica cromatogrfica ou similar,sem etapas intermedirias. Um dos trabalhospioneiros nesta rea foi efetuado no laboratrio doautor deste trabalho, atravs do acoplamento emSFE e eletroforese capilar para a extrao,concentrao e anlise de amostras complexas56.Este tipo de enfoque dever tornar-se mais popularno futuro prximo.

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    5. Anlise Qualitativa eQuantitativa: O papel daCromatografia e Tcnicas Afim

    5.1. Tcnicas CromatogrficasEstando os compostos de interesse em uma

    forma qumica apropriada para sua determinaoqualitativa e/ou quantitativa por uma tcnicainstrumental, alm de isentos de interferentes (oude grande parte deles, no caso de amostrascomplexas), e em uma concentrao apropriada, altima etapa do procedimento analtico ser aidentificao e a quantificao. Dois enfoques mais comuns so: (1) a anlise de compostos conhecidos (target), usualmente empregado em laboratrios de rotina; e (2) a anlise de desconhecidos,usualmente um desafio maior uma vez que adeterminao quantitativa depender antes daidentificao dos compostos de interesse. Dentreum largo espectro de tcnicas instrumentaisdisponveis, as cromatogrficas e relacionadas(eletroforese capilar, por exemplo) tm um papelde destaque devido velocidade de anlise,eficincia, possibilidade de processar vriasamostras atravs de amostradores automticos,

    facilidade na quantificao, e automao total doprocedimento, dentre outros recursos. Neste artigoo enfoque ser direcionado para o uso das tcnicascromatogrficas de anlise.

    As tcnicas cromatogrficas admitem vrias classificaes, a depender do enfoque do autor57. A classificao mais popular no momento, de acordocom a natureza fsica da fase mvel apresentadana Figura 14.

    Apesar de seu desenvolvimento no incio dosculo XX, as tcnicas cromatogrficas tiveram uma grande aceitao como tcnica analticaprincipalmente aps o desenvolvimento daCromatografia Gasosa (GC) durante a dcada de 50, e da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia(HPLC) no final da dcada de 60 e incio da dcadade 70. A Cromatografia com Fluido Supercrticoteve seu desenvolvimento somente na dcada de 80,com a comercializao dos primeiros equipamentos.

    A Cromatografia Gasosa (GC) considerada hoje uma tcnica madura, empregadaprincipalmente na anlise de compostos volteis,de polaridade baixa e mdia, e termicamenteestveis nas temperaturas empregadas nas anlises. Seu uso pode extrapolar estas condies, mediante

    Figura 14. Classificao das tcnicas cromatogrficas de acordo com a natureza fsica da fase mvel.

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    prvias etapas de transformao qumica (porexemplo, derivatizao de cidos; pirlise depolmeros; complexao de metais e outrasoperaes). O desenvolvimento das colunastubulares abertas (geralmente referidas comocapilares), proporcionou o aparecimento decolunas de vrios metros de comprimento, o queaumentou muito a eficincia quando comparadascom as colunas empacotadas (ou recheadas). Almdisso, por terem a parte central vazia (um filme fino depositado na parede interna) estas colunasoferecem pequena resistncia passagem do gs de arraste, permitindo o uso de colunas de at centenas de metros de comprimento. Devido enormeeficincia destas colunas (centenas de milhares depratos), o que leva a uma alta resoluo pois N um fator importante na resoluo, seu emprego temmotivado o nome de Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo (HRGC) para a tcnica.

    A Cromatografia Lquida de AltaEficincia (HPLC) teve seu desenvolvimentofavorecido pelo interesse nas anlises decompostos os quais no eram amenos GC. Asprimeiras dificuldades encontradas com o uso departculas relativamente grandes (dp>- 20microns), adaptadas da LC clssica, foramrapidamente contornadas com o desenvol-vimento de novas fases com partculas menores,mais homogneas e com menor contedo demetais, principalmente slica de novas geraes.O desenvolvimento das fases quimicamenteligadas ampliou ainda mais o espectro dasaplicaes da tcnica, em especial as fasesreversas baseadas em grupos octadecil (C-18) eoctil (C-8) quimicamente ligadas slica58. Odesenvolvimento de partculas menores, as quaismelhoraram a eficincia das colunas, trouxe umnovo desafio: o aumento significativo da pressona coluna, e a exigncia de novos desenvol-vimentos instrumentais para a nova realidade.

    A Cromatografia com Fluido Supercrtico(SFC) a mais jovem das tcnicas cromato-grficas a receber ateno em larga escala.Apesar de seu desenvolvimento na dcada de 80 haver sido bastante promissor, sua amplautilizao ainda no se confirmou, tendo alguns

    nichos especializados como na anlise defrmacos (em especial enantimeros), polme-ros, e detergentes. Inicialmente oferecida emduas verses, uma utilizando colunas empaco-tadas com partculas, similares as de HPLC, eoutra empregando colunas capilares tubularesabertas, similares s de HRGC, apenas a primeira persiste comercialmente. Considerando o grande destaque que a Qumica Verde (GreenChemistry), possui atualmente, e o fato da SFCutilizar principalmente CO2 como fase mvel, considerado um solvente ambientalmentecorreto, previsvel que seu desenvolvimento naprxima dcada seja acelerado.

    5.2. Anlise QualitativaUma vez sendo os compostos de interesse

    isolados de seus contaminantes e interferentes, poruma das tcnicas descritas, o efluente da coluna direcionado para algum tipo de sensor (detector)para que suas propriedades sejam utilizadas naidentificao do mesmo. Durante muitos anos amaior propriedade empregada na anlisequalitativa era o tempo de reteno do composto,ou seja, o tempo que ele passa na colunacromatogrfica. Associado com algum tipo deseletividade dos detectores (por exemplo o capturade eltrons para organoclorados, o de fluorescncia para hidrocarbonetos aromticos), o tempo dereteno servia como indicativo da presena de umcomposto na amostra. O aumento da complexidade dos problemas analticos, o interesse em analisar-se compostos em concen- traes mais baixas, anecessidade de melhor conhecimento depropriedades de frmacos em amostras biolgicas e outros fatores, comearam a dificultar o usosomente do tempo de reteno para estadeterminao. Mesmo empregando diversosartifcios como ndices de reteno, tcnicasquimiomtricas e outros, assim como detectoresmais seletivos como ECD, NPD e PDA, o fato que diferentes compostos podem ter o mesmotempo de reteno em dadas condiesexperimentais, dificultando a identificao dospicos, especialmente em amostras complexas e

  • desconhecidas. O desenvolvimento de detectoresmais elaborados, os quais podem fornecer tambminformaes estruturais em especial detectoresespectromtricos como espectrometria de massas trouxe um grande avano neste campo.

    O desenvolvimento do acoplamento entrecromatografia gasosa de alta resoluo eespectrometria de massas (HRGC/MS) sem anecessidade de interfaces, e a reduo do preodo equipamento, ampliou em muito o uso destatcnica na determinao de compostos volteis esemi-volteis. Apesar do acoplamento entrecromatografia lquida e MS ainda no haveratingido a simplicidade e a maturidade daGC/MS, o desenvolvimento de interfaces queoperam a presso ambiente (API), especialmente o Electrospray (ESI) e a Ionizao Qumica aPresso Ambiente (APCI), trouxeram novoalento rea58. Um reforo considervel foi aampliao da oferta de diferentes analisadores, ocorao do espectrmetro de massas. Almdos quadrupolos e ion traps, populares desde adcada de 1970 com o surgimento dos detectoresseletivos de massas (MSD), o revival dosanalisadores do tipo ToF (Time-of-Flight)ampliou as possibilidades do uso de MS commaior resoluo, a preos razoveis. O surgi-mento do GC-ToF e LC-ToF possibilitou umamelhoria considervel na identificao dos picoscromatogrficos. Analisadores ainda mais pode-rosos, como os baseados em ressonncia de onsem um cclotron (FT-ICR) ainda so poucoutilizados acoplados a cromatgrafos, devido aoelevado custo desta tecnologia, recentementesendo comercializada.

    Em algumas reas, tais como na anlise defrmacos e drogas veterinrias em matrizesbiolgicas, em qumica forense e protemica,ouso de mais de um estgio de ionizao deuorigem aos sistemas em tandem ou MS/MS,cujo acoplamento tanto com LC quanto comHRGC se mostraram de grande auxlio na anlise qualitativa (GC/MS/MS e LC/MS/MS).Sistemas hbridos,empregando uma combinaode diferentes analisadores, (como, por exemplo,o Q-ToF um sistema com dois analisadores demassas em tandem sendo um deles do tipo

    quadrupolo e o outro tempo de vo) permitem oemprego das caractersticas distintas dosanalisadores de forma a obter-se uma montagemadequada para a aplicao de interesse. Outrastcnicas espectroscpicas tais como infra-vermelho com transformada de Fourier (FT-IR)e ressonncia magntica nuclear (NMR) tambm tm sido acopladas com sucesso a tcnicascromatogrficas, devendo ampliar seu escopo deuso na prxima dcada.

    5.3. Anlise QuantitativaO advento dos computadores pessoais a um

    custo razovel, praticamente eliminou o uso deregistradores potenciomtricos e integradoreseletrnicos dos laboratrios de cromatografia.Alm da aquisio de dados, o computadorcontendo um software apropriado capaz deprocessar os dados, efetuar clculos, elaborargrficos de calibrao e imprimir relatrioscontendo os dados. tambm empregado nocomando de praticamente todas as funes docromatgrafo, desde a introduo da amostra at ascondies da coluna, fase mvel, temperatura dodetector e outros parmetros experimentais.Adicionalmente, o computador comanda osdetectores como um espectrmetro de massas,gerando espectros, comparao com bilbliotecas de dados, tempos de reteno e outras facilidades.Outros programas como pacotes quimiomtricospodem ser integrados como o software principal,ampliando o escopo de uso do sistema. Uma dasetapas crticas na anlise quantitativa, viacromatografia, o estabele- cimento de grficos decalibrao empregando padres analticos deidentidade e pureza bem conhecidos. Um softwareapropriado atualmente j contm vrias funespara a construo destes grficos, permitindo o usode tcnicas de quantificao baseadas no uso depadro interno, padro externo ou adio padro. A escolha da tcnica depende do analito, da matriz e,princi- palmente, do objetivo do trabalho. Porexemplo, para registro de produtos em rgosgoverna- mentais, as exigncias daquele rgodevem ser seguidas para que o resultado seja aceitopelo rgo para a finalidade que se prope.

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  • 6. Tendncias na rea deCromatografia e TcnicasAssociadas

    6.1. Preparo de AmostrasUma das etapas mais crticas no preparo

    de amostras, em especial amostras complexas deorigem vegetal ou animal, o isolamento doscompostos de interesse da matriz original(extrao). Apesar de que as tcnicas clssicascomo extrao lquido-lquido e extraolquido-slido continuam a serem utilizadas (eprovavelmente ainda sero por muitos anos), asubstituio destas por tcnicas que minimizamo uso de solventes orgnicos, como a SPE, etcnicas empregando fluidos pressurizados, vemocorrendo gradativamente. O grande apeloambiental observado na ltima dcada deverconduzir para tcnicas ainda mais radicais nasquais estes solventes so completamenteeliminados, incluindo a SPME, SBSE e simi-lares. Havendo surgido inicialmente com poucostipos de fibras, hoje a SPME j oferece umgrande nmero de possibilidades tanto para usoem GC quanto em HPLC. A SBSE ainda limitada pela comercializao de apenas barrasde PDMS comercialmente, porm vrios outrosmateriais tm sido empregados em difrenteslaboratrios atravs de barras construidas noprprio grupo de pesquisa59,60. Espera-se umaampliao na oferta de fibras para SPME e barras para SBSE, para uma maior aceitao destas

    tcnicas em diferentes reas de aplicao. Osurgimento de interfaces para acoplar estastcnicas com HPLC, e amostradores automticos para tcnicas miniaturizadas de preparo deamostra, sugerem uma ampliao de seu escopode aplicaes para os prximos anos.

    Outro fator importante tem sido odesenvolvimento e aprimoramento de sistemas osquais permitem integrar, em um s equipamento, opreparo de amostra, concentrao, e introduo deuma alquota no cromatgrafo de forma totalmenteautomatizada. Exemplo deste tipo de enfoque apresentado na Figura 15.

    A amostra introduzida em um cartuchode SPE atravs de um amostrador automtico; osanalitos so isolados de contaminantes econcentrados no cartucho sendo, posteriormente, dessorvidos com um solvente apropriado. Umaporo deste extrato transferida automa-ticamente para o injetor de um cromatgrafo, oqual permite a injeo de grande quantidade deamostra (at vrias centenas de microlitros).Cada composto separado tem seu espectro demassas determinado, e a anlise qualitativa equantitativa desenvolvida de acordo com oprotocolo do mtodo analtico carregado nocomputador do sistema. Este acoplamento exem- plificado pode ser simplificado como SPE-(LVI)GC-MS. Apesar de seu grande potencial,este tipo de sistema no tem sido aindaamplamente explorado, possivelmente devido ao custo ainda elevado.

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    Figura 15. Diagrama esquemtico de um acoplamento SPE-GC/MS.

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    6.2. Miniaturizao das colunascromatogrficas

    A miniaturizao das colunas cromato-grficas no traz como principal benefcioeconomia de espao, como poderia parecer aprimeira vista. Na verdade, um dos principaisbenefcios da miniaturizao a economia desolventes (em LC uma coluna capilar consomeentre 200 e 1.000 vezes menos solvente do que as convencionais de dimetro interno igual a 4,0mm) e de amostra (em uma coluna capilar de LCinjeta-se alguns nanolitros de amostra contravrios microlitros na convencional). Alm disso,vrias tcnicas espectromtricas, a exemplo daespectrometria de massas, em vrias circuns-tncias so mais facilmente acopladas cromato- grafia quando so empregadas colunas capilares.O uso de velocidades de fluxos (vazo) menorestambm melhora a deteco quando detectoresdependentes da concentrao (como UV-VIS)so empregados, devido menor diluio dossolutos na fase mvel.

    A Figura 16 mostra uma comparao emescala entre os principais dimetros de colunasempregadas em Cromatografia Gasosa nos ltimos anos, desde as convencionais de dimetro internoao redor de 4 mm at as capilares com d.i 0,1 mm.

    Nota-se na figura uma enorme diminuio no dimetro da coluna, a qual acarreta menordiminuio na quantidade de amostra e de fasemvel. Uma situao anloga verificada emCromatografia Lquida, indo das colunas tradi-cionais de 4 mm de d.i. , ainda bastante utilizadas,at as capilares (Figura 17). Entretanto, a minia-turizao em LC ainda bastante lenta, apesar deoferecer ainda mais benefcios do que em GC.Somente recentemente as empresas fabricantes deequipamento comearam a desenvolver equipa-mentos projetados especificamente para LC capilar.

    Nesta rea de miniaturizao em cromato-grafia e tcnicas relacionadas, um recente desen-volvimento o qual merece ateno na rea demicrochips utilizados para a fabricao dedispositivos para as diversas tcnicas de separao.Estes dispositivos aparentemente devero ter nichosespecficos tais como em situaes onde pequeno

    Figura 17. Comparao (em escala) entre o dimetrointerno das principais colunas empregadas emCromatografia Lquida Analtica (HPLC).

    Figura 16. Comparao (em escala) entre o dimetrointerno das principais colunas empregadas emCromatografia Gasosa.

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    espao importante (naves espaciais), anlisesespecficas, anlise em campo e outras. Entretanto,ainda ser necessrio um desen- volvimentobastante grande para que as mesmas venham asubstituir o formato atual destas tcnicas na anlisede amostras complexas (fluidos biolgicos),matrizes difceis (como sedimento de rio, extratos de plantas) e situaes nas quais centenas de compostos precisam ser separados com elevada eficincia(derivados de petrleo, lipdeos em amostrasnaturais). No momento, uma situao intermediriaentre os dois extremos, com a diminuio dadimenso das colunas e equipa- mentos, parece sermais vantajosa, especialmente enquanto osmicrochips ainda esto sendo aperfeioados com ouso de novos materiais e tcnicas de preparo. Aprxima dcada elucidar esta questo.

    6.3. Anlise rpidasExistem situaes prticas nas quais a

    eficincia no o fator preponderante mas sim arapidez da anlise como no caso da fabricao emescala industrial de um composto, bem conhecido, cujo setor de controle de qualidade precisa darresposta rpida para o setor de produo. Nestecaso, tanto empregando HRGC, HPLC ou SFC, aalternativa a miniaturizao. Em HRGC, adiminuio no dimetro interno do tubopossibilita um aumento acentuado na eficincia(N); como conseqncia, colunas de menorcomprimento podem ser utilizadas sem perdaconsidervel da resoluo cromatogrfica. Emmuitos casos, colunas de 5 metros decomprimento com um dimetro interno igual a 100 microns oumenos, podero ser suficientes para conseguirseparaes adequadas em menos de um minuto.Em LC, a melhor alternativa a diminuio dotamanho das partculas para aumentar-se aeficincia, o que possibilita diminuir ocomprimento da coluna e o tempo de anlise.Apesar de 5 microns ser hoje o tamanho padrodas partculas empregadas em LC, colunas de 1,5a 3,5 mcrons tendem a se tornar mais utilizadasna prxima dcada. Pelo fato destas anlises

    rpidas exigirem repostas mais rpidas dosequipamentos, e a diminuio do tamanho daspartculas aumentar as presses no sistema, asempresas de equipamentos tem se adequado a esta nova forma de obter-se anlises rpidas,usualmente referidas como U-HPLC (ultra highpressure liquid chromatography). Diferentesempresas tm apresentado vrias solues (emmuitos casos adaptaes nos cromatgrafosconvencionais para operarem em presses maiselevadas), com diferentes nomes. Uma alternativa a este enfoque o uso de colunas monolticas, nasquais ao invs de partculas a coluna contem ummonolito. Como a permeabilidade destas colunas bastante grande, fluxos (vazes) maiores soempregadas sem sacrifcio da eficincia,permitindo anlises rpidas (61,62). A ofertacomercial de colunas monolticas ainda limitada, e os novos avanos nesta rea deverotrazer novas propostas na prxima dcada.

    6.4. Cromatografia multidimensionalNa sua forma mais simples e tradicional, a

    cromatografia multidimensional emprega duascolunas (GC, LC ou uma de LC e outra de GC)sendo a primeira usualmente uma coluna genrica(como OV-1 em GC e C-18 em LC) e a segundauma coluna seletiva (ex. uma coluna quiral). Aamostra introduzida na primeira coluna e ao chegar o tempo de reteno do composto de interesse(exemplo, dois enantimeros) a amostra transferida da primeira para a segunda colunaatravs de uma vlvula. Assim, a primeira colunaneste exemplo serve como clean up para aamostra, eliminando compostos que poderiamdeterior a coluna quiral se fossem nela intro-duzidos. Este tipo de enfoque muito empregado naanlise de amostras complexas como resduos econtaminantes em alimentos e de frmacos emfluidos biolgicos63. Na rea petroqumica tem sidoempregado h anos para fracionar amostrascomplexas atravs do uso de duas ou mais colunas64.

    Uma das limitaes desta tcnica atransferncia de apenas parte da amostra atravs da

  • vlvula, o que vem sendo solucionado com o uso dacromatografia abrangente (comprehensive). Neste caso, usualmente emprega-se uma coluna de maiorcomprimento como a primeira coluna e uma maisrpida e menor como a segunda. O pico amostradovrias vezes na primeira coluna e as fraes sotransferidas para a segunda coluna, atravs de ummodulador (GC), ou vlvula (LC) para uma anliserpida. Um software apropriado permite otratamento dos dados e gerao de grficos bi etri-dimensionais, possibilitando a obteno demuitas informaes a respeito da amostra. deinterpretao. O acoplamento com espectrometriade massas simples, e tem sido realizado comsucesso gerando sistemas do tipo (GCxGC)-MS;(LCxLC)-MS, (SFCxSFC)-MS e outros. Esteenfoque ainda recente, e bastante promissor para aanlise de amostras complexas65-68.

    7. ConclusesA Complexidade Dos Problemas

    Analticos A Serem Solucionados Nos PrximosAnos (Matrizes Mais Complexas, CompostosEm Concentraes Mais Baixas, Aumento NaSeletividade E Outros) Requer FerramentasCada Vez Mais Sofisticadas. Desde AAmostragem, Preparo Da Amostra, IsolamentoDos Solutos De Interesse At O ProcessamentoDos Dados E Gerao Dos Relatrios, MuitasEtapas So Neces- Srias.

    Uma das tendncias atuais na rea aminiaturizao de todas as etapas, objetivando aminimizao (ou eliminao) do uso de solventesorgnicos no preparo de amostra (SPME, SBSE eoutras), diminuio da quantidade de amostra,possibilitando anlises menos evasivas em sereshumanos e animais (HRGC, micro-LC, c-SFC), eo acoplamento a tcnicas espectroscpicas asquais fornecem informaes para a identificaodos compostos de interesse (LC/NMR,GC/MS/MS, LC-PDA, LC/MS/MS).

    A integrao on-line entre preparo deamostra, clean up e separao cromatogrficacom um detector seletivo a soluo ideal,sempre que possvel (ex: SPE-GC/MS),eliminando os vrios inconvenientes existentesdurante as etapas de transferncia do analito emum mtodo analtico complexo.

    O uso de dispositivos micro-fabricadosapresentou uma evoluo importante nos ltimos 10 anos, mas parece ainda bastante distante doslaboratrios analticos de rotina. Tudo indica que na prxima dcada dever ocupar um espaomaior dentro da instrumentao analtica, emespecial na denominada bio-analtica. Enquantoisso, a minia- turizao das tcnicas de preparode amostra (SPME, SBSE, LPMS e MEPS,dentre outras), das colunas cromatogrficas, edos detectores (ex. MS), particularmente seacoplados em linha (on-line), parece ser umatendncia na rea a qual dever demorar muitasdcadas para ser totalmente substituda.

    Na perspectiva do autor, o horizonte daanlise qumica para as prximas dcadas parececada vez mais amplo e propcio para os usuriosdas tcnicas cromatogrficas e afim.

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