Avanços Recentes e Tendências Futuras Das Técnicas de Separação - Scientia Chromatographica

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<ul><li><p>2008 | v . 0 | n . 0 17</p><p>S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a</p><p>ResumoO ob je ti vo de uma an li se qu mi ca a ob ten o</p><p>de da dos qua li ta ti vos e/ou quan ti ta ti vos a res pe i to de umou mais com po nen tes de uma amos tra. Qu an do a tc ni caana l ti ca es co lhi da a cro ma to gra fia, o pro ce di men toana l ti co pode ser di vi di do em 3 eta pas: pr-cro ma to -grfica, cro ma to gr fi ca e ps-cro ma to gr fi ca. A eta papr-cro ma to gr fi ca en vol ve a amos tra gem, o trans por teda amos tra at o la bo ra t rio de an li se, e a eta pa de pre pa -ro da amos tra. Tc ni cas como LLE, SPE, SFE, ASE,SPME e ou tras so em pre ga das nes ta eta pa A eta pa cro -ma to gr fi ca visa a se pa ra o do ana li to de seus prin ci pa iscon ta mi nan tes, ge ran do os da dos ne ces s ri os para a iden -ti fi ca o e/ou quan ti fi ca o. Tc ni cas como HPLC-UV,GC-ECD, LC/MS/MS, GC/MS e ou tras so fre quen -temen te em pre ga das. A eta pa ps cro ma to gr fi ca visatratar os da dos qua li ta ti vos e quan ti ta ti vos ob ti dos.</p><p>No presente artigo, uma reviso crtica arespeito destas 3 etapas envolvidas em uma anlisecromatogrfica incluindo os fundamentos tericos, ainstrumentao, vantagens e limitaes, e aplicaesdas principais tcnicas, apresentada e discutidacriticamente, do ponto de vista do autor.</p><p>Contedo1. Introduo2. Tcnicas de Amostragem3. Tcnicas de Preparo de Amostras</p><p>3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)3.2. Extrao Lquido-Slido3.3. Extrao com Fluidos Pressurizados3. 4. Tcnicas Miniaturizadas de Extrao</p><p>4. Limpeza (Clean-up) da Amostra4.1. Cromatografia Lquida em Coluna Aberta</p><p>em baixa presso4.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia</p><p>(HPLC ou CLAE)4.3. Cromatografia Lquida Multidimensional4.4. Outros enfoques para a limpeza de amostras</p><p>5. Anlise Qualitativa e Quantitativa: o papel daCromatografia e Tcnicas Afim5. 1. As Tcnicas Cromatogrficas5.2. Anlise Qualitativa5.3. Anlise Quantitativa</p><p>6. Tendncias na rea de Cromatografia e TcnicasAssociadas6.1. Preparo de Amostras6.2. Miniaturizao das colunas cromatogrficas6.3. Anlise rpidas6.4. Cromatografia multidimensional</p><p>7. Concluses8. Referencias</p><p>Avanos Recentes e Tendncias Futuras dasTcnicas de Separao: uma viso pessoal</p><p>Fernando M. LanasUniversidade de So PauloInstituto de Qumica de So Carlos13560-970 So Carlos (SP)Brasilflancas@iqsc.usp.br</p></li><li><p>1. IntroduoA segunda metade do sculo XX observou</p><p>um avano sem precedentes nas tcnicas deseparao, devido aos novos desafios gerados peloaumento da populao mundial e a demanda porservios a partir do incremento tecnolgicomarcante do perodo Ps-Guerra. Contrariamentes exigncias anteriores a este perodo, quasesempre razoavelmente atendidas por mtodosfsicos simples de anlise como, por exemplo,gravimetria, a complexidade dos problemasambientais, de sade, alimentao, energia, emuitos outros, passou a exigir tcnicas de anlisemais complexas. Esta necessidade trouxe aexigncia de tcnicas mais rpidas, eficientes e,principalmente, capazes de serem automatizadasatravs de instrumentos complexos indisponveisat a dcada de 1950. A popularizao doscomputadores, graas aos preos tornados maisaccessveis, possibilitou o desenvolvimento deequipamentos totalmente comandados por umcomputador pessoal de grande capacidade deprocessar dados e armazen-los, a um custo o qual</p><p> hoje apenas uma pequena frao do custo damaioria dos equipamentos que ele comanda .</p><p>A complexidade analtica no reservadaapenas rea de instrumentao: mtodos maiselaborados (muitas vezes mais de um mtodousado para a mesma anlise) tem que serdesenvolvidos e ou adaptados a esta novarealidade, alm de passarem por etapas extensasde validao antes do uso para que os dados sejamreconhecidos pelas agencias governamentais asquais regulamentam a aceitao de resultados deanlises qumicas. No caso particular de mtodosanalticos para emprego na rea de SadeHumana, as exigncias quanto validao dasmetodologias so enormes, variando de um paspara outro e, muitas vezes, de um rgo para outro dentro do mesmo pas.</p><p>Na anlise de compostos-alvo (targetcompounds) presentes em matrizes consideradas complexas como alimentos, ambientais, e fluidosbiolgicos, regra geral o objetivo analisar um oualguns compostos em uma matriz na qual estpresente em concentraes muito baixas(geralmente referida como anlise de traos).Nestes casos, usualmente necessrio, empregar</p><p>S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a</p><p>18 www.scient iachromatographica .com</p><p>AbstractThe main goal when performing a chemical analysis is to obtain qualitative as well as quantitative information</p><p>about one or more components of a sample. When the analytical technique of choice is chromatography, the analyticalprocedure might be divided into tree steps: (1) pre-chromatographic step; (2) chromatography; (3) pos-chromatographicstep. The pre-chromatographic step usually involves either the sample generation or collect (sampling), transport to thelaboratory, and sample preparation that usually involves several procedures such as extraction, clean up, derivatization,pH adjustment, and so on. Several analytical techniques are used in this step, including LLE, SPE, SFE, ASE, SPME,SBSE, among others. The chromatographic step aims the separation of the analite(s) from its natural contaminants, aswell as from the interfering species generated during the sample processing .Techniques such as HPLC-UV, GC-ECD,LC/MS/MS, GC/MS are frequently used for this purpose. Pos chromatographic step aims to treat the qualitative andquantitative data generated through the use of a proper chromatographic detector, doing all the required calculation,comparison with chromatographic data bank (retention indexes), spectral libraries (UV and MS spectra). A properselection of the best approach for each step, as well as its correct performance under an appropriate quality assurancesystem, will assure the quality of the generated results. </p><p>In the present paper, a critical review with respct to the 3 describes steps involved in a typicalqualitative/quantitative analysis using chromatographic mehods, including theoretical background, instrumentation,advantages and limitations, and applications of the main techniques is presented and discussed.</p></li><li><p>uma srie de etapas, incluindo: extrao do analito da amostra, sua purificao para eliminao depotenciais contaminantes e interferentes, os quaispodem comprometer o resultado analtico, sepa-rao empregando tcnicas de separao de altaresoluo (HRGC, HPLC, CE e outros) edeteco por tcnicas ainda mais complexascomo, por exemplo, a espectrometria de massas1.</p><p>A Figura 1 exemplifica um quadro tpicodas vrias etapas necessrias para a realizao deuma anlise tpica de um composto presente embaixas concentraes em matrizes complexas.</p><p>O procedimento pr-analtico inicia-se jno delineamento do planejamento do proce-dimento a ser utilizado, prevendo todas as etapaspelas quais a amostra dever passar. Uma vezestabelecido o protocolo do estudo, a amos-tragem usualmente a primeira etapa doprocedimento experimental. Ela visa a seleo de alguns componentes de um universo, o qualpossa represent-lo com a mxima fidelidadepossvel. Por exemplo, no caso de um pomarcontaminado com pesticidas, na prtica seriaimpossvel analisar-se todos os frutos possivel-mente contaminados. </p><p>A amostragem serve para assegurar que as frutas a serem avaliadas, neste exemplo,representam de maneira fidedigna o pomar como um todo. No caso de amostras de alimentos, porexemplo, o Codex Alimentarius recomendavrios guias (guidelines) para a amostragem de frutas e vegetais. Regra geral, aps a amostragem a parte selecionada para a anlise encaminhadapara o laboratrio de anlise quase semprelonge do local onde a amostragem ocorreu.Assim, o transporte e armazenagem so deextrema importncia para assegurar a integridade </p><p>da amostra a ser analisada. Raramente a amostraj se encontra em uma forma apropriada para aanlise, requerendo que as substncias deinteresse sejam removidas da matriz original (por exemplo, para anlise de hormnios em frango necessrio inicialmente remover-se o hormnioda matriz para depois efetuar-se a anliseinstrumental por exemplo, atravs de HRGC).Esta etapa denominada preparo da amostra.</p><p>O preparo da amostra tem como principalobjetivo isolar o(s) componente(s) de interessede outros compostos presentes na matriz os quais podero interferir posteriomente na deter-minao analtica. Muitas vezes esta etapa tambm denominada de extrao mas, em muitos casos, no necessria uma etapa de extraopara que o analito possa ser avaliado por umatcnica instrumental. Aps o isolamento doscompostos de interesse da matriz, pode sernecessria uma etapa complementar de limpeza(clean up) da amostra, particularmente em setratando de anlises complexas. </p><p>A limpeza da amostra (clean up) quase sempre empregada na anlise de amostrasambientais, fluidos biolgicos, alimentos esimilares pois, devido a grande quantidade decompostos presentes nestas matrizes, invaria-velmente a tcnica de extrao no sersuficiente para gerar uma extrato isento decontaminantes. Muitas vezes nesta etapamuda-se o solvente original de extrao paraevitar problemas posteriores com detectores decromatografia, por exemplo, ou efetua-se aconcentrao dos compos- tos de interesse pelareduo do volume de solvente. Assim, estaetapa complementa a anterior visando apreparao da amostra o mais isento possvel de</p><p>2008 | v . 0 | n . 0 19</p><p>S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a</p><p>Homogeinizao</p><p>Extrao AnliseConcentraoou diluio</p><p>Limpeza(clean-up)</p><p>Reduo do tamanho</p><p>Figura 1. 1.Diagrama esquemtico das principais etapas envolvidas na anlise qumica de amostras complexas.</p></li><li><p>compostos qumicos os quais possam interferirna tcnica instrumental de anlise. Algunsautores incluem o clean up como uma forma de preparo da amostra, outros no. O importante entender o papel de cada uma delas. Aps estaetapa, a amostra est pronta para a anliseinstrumental.</p><p>A anlise instrumental, neste casocromatografia, visa a determinao da identidade(anlise qualitativa) e da quantidade (anlisequantitativa) do composto presente inicialmentena amostra em anlise. As tcnicas mais utilizadas para esta finalidade so a cromatografia gasosa(GC) e a cromatografia lquida (LC), acopladas atcnicas apropriadas de deteco. Outras tcnicascomo eletroforese capilar (CE), cromatografiacom fluido supercrtico (SFC), e outras, tambmtem sido utilizadas, porm em menor escala. Aidentificao dos componentes isolados geral-mente feita atravs do acoplamento entre a tcnica cromatogrfica de separao e uma tcnica deidentificao, como a espectrometria de massas(MS). A quantificao efetuada avaliando-se area ou a altura dos picos gerados nocromatograma, atravs de softwares dedicados aesta finalidade. </p><p>Neste volume inaugural do peridicoScientia Chromatographica, cujo objetivo exata-mente discutir estas tcnicas de preparo de amostra, separao (LC, GC, SFC e outras) e identificao(Espectrometria de Massas, dentre outras), estetrabalho visa apresentar, de forma crtica e atual,segundo o ponto de vista do autor, os recentesavanos na rea e as tendncias futuras. Essesassuntos sero ampliados e discutidos em detalhesnos futuros volumes do peridico em questo,atravs das vrias sesses dedicadas s etapaspr-cromatogrficas, diferentes tcnicas deseparao e etapas ps-cromatografia.</p><p>2. Tcnicas de AmostragemA amostragem , invariavelmente,</p><p>considerada uma das etapas mais crticas doprocedimento analtico, uma vez que a seleoincorreta do material a ser analisado inviabiliza</p><p>qualquer tentativa de correo posterior doproblema2. Deve ser lembrado que a amostragem visa o isolamento de uma quantidade muitopequena de uma amostra a qual faz parte de umuniverso muito maior (exemplo: alguns litros degua para representar a condio de um riointeiro!!!). Neste caso, o material orgnicopresente na gua varia de ponto a ponto tanto naextenso quanto na profundidade, dificultandosobremaneira o projeto de amostragem. Almdisso, pelo fato do rio ser um sistema dinmico eno esttico, o momento da amostragem tambm importante, o que requer o registro tambm domomento da amostragem para futuras cor-relaes. De forma anloga, a amostragem desedimentos de rio uma etapa igualmentecomplexa e difcil, ampliada pelo fato de poucosguias internacionais a este respeito (diferen-temente de gua e solo). Apesar dos esforos daComunidade Europia em normatizar as tcnicas de amostragem de solo, pouco avano foiatingido na prtica3-5. Em qualquer caso, eindependentemente da matriz e das substnciasde interesse, a anlise de matrizes complexas especialmente as naturais como ambiental,alimentos e fluidos biolgicos deve serprecedida de um plano de amostragem,preferencialmente validado.</p><p>Todo o planejamento, execuo, inter-pretao de resultados, e redao dos relatriosde anlise devero estar dentro de um sistema dequalidade compatvel com sua finalidade6. </p><p>3. Tcnicas de Preparo de Amostras</p><p>Aps a etapa de amostragem, a parte isoladaa qual agora deveria ser denominada sub-amostramas que, na prtica, continua sendo denominadaamostra, deveria idealmente ir diretamente para aanlise instrumental, o que raramente feito. Issodeve-se ao fato de que em geral o produto daamostragem contm contaminantes prprios damatriz, alm de outros agregados durante oprocesso ou transporte (por exemplo, comumrecebermos no laboratrio amostras de batata, para</p><p>S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a</p><p>20 www.scient iachromatographica .com</p></li><li><p>2008 | v . 0 | n . 0 21</p><p>S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a</p><p>anlise de resduos de pesticidas, contendo terra).A sub-amostra, contendo os compostos deinteresse e os contaminantes, e doravantedenominada amostra por simplicidade e por refletir a nomenclatura efetivamente utilizada noslaboratrios de anlise, dever ento sertransformada para outra forma mais apropriadapara a anlise. No caso de anlise de frmacos emfluidos biolgicos, por exemplo, a presena deprotenas e outras macromolculas, assim como deoutras substncias menores, pode interferir,dediferentes maneiras, na anlise. Deve ser lembradoque estas matrizes contem centenas de compostosqumicos, a maioria em concentrao superior dofrmaco, o que dificulta ainda mais sua deter-minao qualitativa e quantitativa. Muitas vezesexiste ainda a necessidade de converter-se umasubstncia da forma na qual se encontra para outramais amena para a anlise (devido a problemas deestabilidade trmica, falta de volatilidade, ausnciade grupos funcionais adequados para detecoespectroscpica e outras), atravs de proce-dimentos de derivatizao. Este conjunto de aes,usualmente denominado genericamente de preparo de amostras, envolve diversas etapas no labora-trio, das quais a mais importante e complexa ,sem dvida, a etapa de extrao. Em muitos casosatualmente, a etapa de extrao pode sercombinada com a concentrao dos analitos,derivatizao e outros procedimentos, em umanica etapa para o preparo da amostra. Existemvrias tcnicas de extrao, dependendo do estadofsico, qumico e a complexidade da amostra e doscompostos a serem extrados, sendo as principaisdiscutidas a seguir.</p><p>3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)Na extrao lqui...</p></li></ul>

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