ASSOCIAÇÃO TERESINESE DE ENSINO

FACULDADE SANTO AGOSTINHO

COORDENAÇÃO DE FISIOTERAPIA

CURSO: BACHARELADO EM FISIOTERAPIA

DISCIPLINA: BIOQUÍMICA

ROTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

Prof(a): MSc. Fernanda Cerqueira Barroso de Carvalho

Teresina-PI

2

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

NOÇÕES ELEMENTARES

1) Mantenha seu local de trabalho sempre limpo e em ordem;

2) Jogue os sólidos nas latas de lixo e nunca nas pias. Lave os resíduos líquidos nas pias

com bastante água. Ácidos, bases e sais de prata e mercúrio são corrosivos e podem

danificar encanamentos;

3) Leia com atenção os rótulos dos frascos de reagentes antes de usar o produto;

4) Nunca fumar no laboratório;

5) Usar sempre bata ou jaleco.

MANIPULAÇÃO DOS REAGENTES

1) Manipular todos os reagentes que produzem vapores tóxicos, corrosivos, etc, na capela;

2) Pesar reagentes secos usando vidro de relógio ou papel limpo. Regantes líquidos são

covenientemente medidos, utilizando cilindros graduados;

3) Evitar contato direto com reagentes orgânicos. Muitos são tóxicos e são absorvidos pela

pele;

4) Não provar reagentes, muitos são venenosos;

5) Não deixar frascos de reagentes destampados. Podem cair impurezas e contaminá-los.

PROTEÇÃO AOS OLHOS

1) Usar óculos de segurança quando manipular reagentes perigosos. Não é recomendado o

uso de lentes de contato no laboratório;

2) Nunca olhar diretamente através da abertura de um frasco, ou de um tubo teste caso ele

contenha uma mistura de reação;

3) Evitar medir volumes de soluções fortemente ácidas aou alcalinas com cilindro graduado

mantido ao nível dos olhos. Mantenha o cilindro sobre sua bancada, adicione o líquido

perigoso em pequenas porções, inspecionando a mistura a cada adição.

RECOMENDAÇÕES GERAIS

1) Não pipetar produto nenhum com a boca;

2) Não usar produto algum que não esteja devidamente rotulado;

3) Não levar as mão à boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos químicos;

4) Verificar sempre a toxidez e a inflamabilidade dos produtos utilizados;

5) Discutir sempre com o professor a experiência que será feita;

6) Em espécie alguma efetuar um trabalho sem o consentimento do professor.

3

1-REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS Os carboidratos podem ser definidos como: polihidroxialdeídos ou polihidroxicetonas (monossacarídeos), seus polímeros (oligossacarídeos polissacarídeos), seus produtos de redução, oxidação e seus produtos de substituição. A função mais importante dos carboidratos no organismo é servir como combustível, fornecendo a fonte principal de energia, graças a sua oxidação a CO2 e H2O, através de uma via complexa, de importância fundamental no metabolismo de todos os compo-nentes da célula animal. Para um completo entendimento de muitas reações que se processam com os car-boidratos nos seres vivos, é indispensável o conhecimento de suas estruturas, suas reações e de que maneira eles são isolados e identificados no laboratório. Apresentaremos a seguir uma série de rea-ções clássicas, geralmente reações coloridas que apesar do advento da técnica de cromatografia ainda são muito utilizadas para identificação dos diversos tipos de carboidratos. 1. TESTE DE MOLISH - Reação geral para carboidratos Os ácidos concentrados causam a desidratação de um monossacarídeo. Se um oligossacarí-deo ou polissacarídeo estiver presente, eles são primeiro hidrolisados aos seus monossacarídeos constituintes os quais então são desidratados. As pentoses dão o furfural e as hexoses o hidroximetil furfural. Vários compostos fenólicos tais como: timol, alfa-naftol condensam com furfural ou seus derivados para dar compostos coloridos de estruturas ainda pouco conhecidas. Hexose 5 hidroximetilfurfural produto de condensação colorido. Pentose furfural produto de condensação colorido. O teste de Molish é considerado uma reação geral para carboidratos quer livre, quer combinados, embora não sendo específica, pois se processa com outras substâncias. A reação sendo positiva não indica necessariamente presença de um carboidrato, mas se a reação for negativa indica segura-mente sua ausência. TÉCNICA: Pipeta num tubo marcado 2 mL de glicose 1%, junte 5 gotas de solução de reagente de Moli-sh, em seguida incline o tubo e com cuidado deixe escoar bem lentamente pelas paredes, sem agitar 2 mL de ácido sulfúrico concentrado. Recoloque o tubo na estante. O que observou? 2. TESTE DE BENEDICT - Reação para carboidratos redutores Os monossacarídeos possuem na sua estrutura um grupamento aldeído livre ou em potencial o qual poderá reduzir certos íons metálicos. Reagentes alcalinos de sais de cobre são muito usados para pesquisas de açucares redutores. O reativo de Benedict contém sulfato cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio. Tem-se assim hidróxido e cuprocitrato. Sob a ação de um agente redutor, o hidróxido cúprico é reduzido a hidróxido cuproso que por aquecimento passa a óxido cuproso. 2Cu(OH)2 2 Cu(OH) + H2O Cu2O (óxido cuproso) TÉCNICA: Tubo 1- 0.5 mL de glicose 1% + 3ml de benedict Tubo 2- 0.5 mL de sacarose 1% + 3 ml de benedict Tubo 3- 0.5 mL de água destilada + 3 ml de benedict Banho-maria 100 graus 3 minutos. Anotar o resultado.

H2SO4

-3 H20

Alfa-naftol

Alfa-naftol

- H20

H2SO4

- 3H2O

4

3. TESTE DE SELIWANOFF - distinção entre aldoses e cetoses.

O mecanismo desta reação é semelhante a reação de Molish. As cetohexoses sob a ação de ácidos concentrados formam mais derivados do 5-hidroximetilfurfural do que as aldohexoses. Certos reagentes como resorcinol se condensam com altas concentrações dos derivados formados a partir de cetohexoses, mas não com quantidade menor formado a partir de aldohexoses. TÉCNICA: Tubo 1. 1 mL de água destilada + 5 mL de reativo de Seliwanoff (resorcinol+ HCl) Tubo 2. 1 mL de glicose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff Tubo 3. 1 mL de frutose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff Leve os tubos ao banho-maria fervente por três minutos. Observe os resultados. Em qual tubo a reação é mais rápida e mais intensa? 4. TESTE DO LUGOL (IODO) PARA POLISSACARÍDEOS O lugol reage com a amilose (fração não ramificada do amido) para dar um complexo de cor azul escuro característico. O glicogênio e as dextrinas se coram de um marrom avermelhado devido a sua estrutura muito ramificada (semelhante a amilopectina). TÉCNICA: Coloque num tubo 3 mL de amido 1% e junte uma gota de solução de lugol. O que observou? 5. HIDRÓLISE DA SACAROSE A sacarose é formada pela união entre uma molécula de alfa D - glicose e uma de beta fruto-se em ligação glicosídica 1,2 (o que explica sua propriedade de açúcar não redutor). Atuando um ácido sobre a sacarose haverá liberação dos seus monossacarídeos constituintes e o hidrolisado torna-se redutor. TÉCNICA: Tubo 1. 2mL de sacarose 1% Tubo 2. 2 mL de sacarose 1% + 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado Coloque os tubos no banho-maria fervente por 3 minutos. Adicione então aos tubos 3 mL de reativo de Benedict, agite. Recoloque-os no banho fervente e aguarde 3 a 5 minutos. Retire. Explique.

1)- Teste de Molish

Para carboidratos em geral

D-Glicose

H2SO

4

+ 3H2O

5-Hidroximetilfurfural

alfa-Naftol

Composto de cor violeta

OHCH

CH

CH

CH

O

OH

OH

CH OH

CH2OH

C

CHCH

CO

CH2 C

H

O

OH

5

2)- Reação de Seliwanoff - Para cetoses

CH2

C

CH

O

OH

OH

CH OH

CH OH

CH2OH

D-Frutose

HClC

CHCH

CO

CH2 C

H

O

OH + 3H2O

5-Hidroximetilfurfural

Resorcicnol

Composto de cor rosa

3) Teste de Benedict- reação para açúcar redutor

O

CH2

H

H

OH

H

OH

OH

H

H

OH

OH

+ 2Cu(OH)2

2CuOH

-H2O

Cu2O

Ácido D-glicônico+

Ptt vermelho-

tijolo

-H2O

4)-Hidrólise da sacarose

2

1

+

H2SO4

H2O

1

2

a D-Glicopiranose

Sacarose (a 1-2)

bD-Frutofuranose

Na sacarose, o carbonos 1 da glicose e o carbono 2 da frutose

estão ligados entre si pela ligação glicosídica (a1-2). Portanto,

a sacarose não tem poder redutor, mas após hidrólise, a mistura

de D-glicose e D-frutose resultante tem ação redutora porque

possuem um carbono anomérico livre.

O

CH2

H

H

OH

H

OH

OH

H

H

OH

O

OCH2

H

OH

H

H

OHCH

2OH

OH

OCH2

H

OH

H

H

OHCH

2OH

OH OH

O

CH2

H

H

OH

H

OH

OH

H

H

OH

OH

6

2-REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS LIPÍDIOS

Os lipídios constituem uma classe de compostos de grande interesse bioquímico que

se caracterizam fisicamente, por que são pouco solúveis na água e solúveis nos chamados solventes

orgânicos (éter, benzeno, clorofórmio, acetona, etc.), e quimicamente porque na maioria são ésteres

de ácidos graxos. Função principal dos lipídios no organismo é a de reserva energética atuando tam-

bém como isolante térmico, mecânico e como veículo de vitaminas. Fazendo parte dos lipídios encon-

tramos os óleos e gorduras (triglicerídeos e as cêras, os fosfolipídios, os cerebrosídeos) as substân-

cias derivadas dos lipidios (esteróides, compostos isoprenóides). Quase todos estes compostos tem

ácidos graxos nas suas estruturas, dentre estes ácidos podemos citar: o ácido butírico, ácido caprói-

co, e todos os outros ácidos graxos saturados. Entre os insaturados temos os ácidos: palmitoleico,

oleico, linoleico, linolênico. Nossas experiências sobre lipídios incluem o estudo das propriedades

gerais dos óleos e gorduras.

PROPRIEDADES GERAIS DOS ÓLEOS E GORDURAS

1 - SAPONIFICAÇÃO - Hidrólise alcalina de Triglicerídios.

TÉCNICA:

Em um béquer de 50 ml, colocar aproximadamente 10 gramas de margarina, 10 mL de solu-

ção alcoólica de KOH 10%. Aquecer em banho-maria fervente durante 10 minutos. Os triglicerídios

são saponificados, obtendo-se uma solução de sais alcalinos de ácidos graxos, isto é: sabões. Con-

serve o tubo em banho-maria. Escreva a equação de saponificação de um triglicerídio.

2 - SEPARAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

Retire o tubo de banho-maria. Adicione ao mesmo 1 mL de ácido clorídrico concentrado, gota

a gota, agitando o tubo. Coloque novamente no banho-maria e deixe-o lá até separação de uma ca-

mada oleosa na superfície do líquido. Deixe então o tubo esfriar num béquer com água gelada. O que

observou? Isole os produtos obtidos, decantando o líquido do tubo cuidadosamente. Guarde os pro-

dutos obtidos para experiências posteriores.

3 - SOLUBILIDADE NOS SOLVENTES Retire com o bastão uma pequena quantidade dos ácidos graxos obtidos na experiência ante-rior e distribua em 3 tubos de ensaio. Acrescente 2mL de éter ao 1° tubo, 2mL de água destilada ao 2° e 2mL de álcool ao 3°. Agite. O que observou? Explique. 4 - FORMAÇÃO DE SABÕES POR REDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS Adicione ao tubo que contém os ácidos graxos obtidos na experiência 2, 10 ml de água desti-lada e 6 ml de solução de KOH 0,5N. Aqueça no banho-maria por 5 minutos, agite e observe. Guarde o tubo para a experiência seguinte. 5 - SEPARAÇÃO DOS SABÕES POR SALIFICAÇÃO Coloque em uma proveta 3 mL de solução de sabão da experiência 4. Junte água destilada

7

até a marca de 20 mL. Adicione cloreto de sódio, misturando até saturar (o cloreto de sódio não mais se dissolve). Note que pelo aumento da tensão superficial os sabões abandonam a fase líquida, flocu-lam e devido a sua menor densidade, flutuam. 6 - FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS Pipete em 2 tubos, 2 mL de solução de sabões obtidos na experiência 4. Adicione ao 1°, 10 gotas de solução de CaCl2 5%, ao 2° 10 gotas de acetato de chumbo a 5%. Observe e explique a formação de precipitado. Escreva as equações.

+ +

3 HCl

3 Ácidos graxos livres

Reações de Caracterização de Lipídios

1-Saponificação

Glicerol

+ +

KOH

Sais de ácidos graxos

ou sabões

Triacilglicerol

D

KR

KOH

KOH

DK

R

KR

2- Separação dos ácidos graxos por acidificação

K

K

R

KR

R

Sais de ácidos graxos

ou sabões

R

R

R

3 KCl

3- Solubilidade dos ácidos graxos em solventes

a- Ácido Graxo + éter ---- solúvel

c- Ácido graxo + água---- insolúvel

b- Ácido graxo + etanol---- pouco solúvel

4- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos

3 KOH D

R

R

R

+

3 Ácidos graxos livres

Ácidos graxos

K

K

K

Sais de ácidos graxos

ou sabões

R

R

R

+ 3 H2O

Cloreto de

potássio

COH

O

OHCH2

OHCH

OHCH2

CO

O

CO

O

R3CH2

COO

R1CH

CO

O

R2CH2

CO

O

CO

O

COH

O

COH

O

CO

O

CO

O

CO

O

COH

O

COH

O

COH

O

CO

O

CO

O

CO

O

+ +

3 HCl

3 Ácidos graxos livres

Reações de Caracterização de Lipídios

COH

O

1-Saponificação

OHCH2

OHCH

OHCH2

Glicerol

+

CO

O

+

KOH

Sais de ácidos graxos

ou sabões

Triacilglicerol

CO

O

R3CH2

COO

R1CH

CO

O

R2CH2

D

KR

KOH

KOH

DC

O

O

K

R

CO

O

KR

COH

O

COH

O

2- Separação dos ácidos graxos por acidificação

CO

O

K

CO

O

K

R

CO

O

KR

R

Sais de ácidos graxos

ou sabões

R

R

R

3 KCl

3- Solubilidade dos ácidos graxos em solventes

a- Ácido Graxo + éter ---- solúvel

c- Ácido graxo + água---- insolúvel

b- Ácido graxo + etanol---- pouco solúvel

4- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos

3 KOH COH

O

D

COH

O

COH

O

R

R

R

+

3 Ácidos graxos livres

Ácidos graxos

CO

O

K

CO

O

K

CO

O

K

Sais de ácidos graxos

ou sabões

R

R

R

+ 3 H2O

Cloreto de

potássio

8

5 - Separação dos sabões por salificação

Coloque numa proveta 3mL da solução de sabão obtida no ítem 4 mais H2O destilada

até a marca de 20 mL. Adicione NaCl, misturando até saturar. Observe que pelo aumento da

tensão superficial, os sabões deixam a fase líquida e floculam. A menor densidade permite

que os sabões flutuem.

6 - Formação de sabões insolúveis

CO

O

KR

CH3COO)2Pb

Sabões de potássio

solúveis

2 + C

O

O

CO

O

RR

Ca +

Sabões de cálcio

insolúveis

2 KCl

Cloreto de Cálcio Cloreto de

potássio

CO

O

K

Sabões de potássio

solúveis

2 + CO

O

CO

O

+

Sabões de chumbo

insolúveis

Acetato de chumbo Acetato de

potássio

R

CaCl2

Pb RR CH3COO)2K

9

4-DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS AMINOÁCIDOS As proteínas são substâncias orgânicas de alto peso molecular formadas por um grande nú-

mero de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. As células de todos o organismo vivas

contêm uma variedade de proteínas com funções diferentes. As membranas que circundam as célu-

las são proteínas, as reações metabólicas que se dão no interior das células são catalisadas por en-

zimas que são proteínas. A reprodução das células e a transmissão das características hereditárias

dependem das proteínas. Certos hormônios são proteínas, e os anticorpos que defendem o corpo

são proteínas. Quando as proteínas são hidrolisadas, elas são convertidas numa mistura de aminoá-

cidos. São conhecidos cerca de 20 aminoácidos obtidos a partir de proteínas. O propósito das experi-

ências descritas é o de distingui-las uma das outras. A molécula protéica é tão complexa que às ve-

zes é difícil interpretar o seu comportamento químico. Proteína de um modo geral refletirá as proprie-

dades químicas de seus aminoácidos. Muitas das reações coloridas das proteínas dependem da pre-

sença de um determinado aminoácido.

1 - REAÇÃO DO BIURETO

As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham mais de duas ligações peptídicas

dão este teste positivo. É chamada reação de Biureto, porque um composto chamado Biureto dá a

mesma reação. Reativo de Biureto - sulfato de cobre, tartarato de sódio e potássio, hidróxido de só-

dio.

TÉCNICA:

Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de biureto

Tubo 2. 2 mL de água destilada + 3 mL de biureto

Tubo 3. 2 mL de solução de gelatina 1% + 3 mL de biureto

Agite e anote o resultado. Houve alguma diferença entre os tubos?

2 - REAÇÃO DE NINHIDRINA

A reação é devida aos grupos amina, dando positiva para as proteínas, os peptídios, os ami-

noácidos, aminas primárias e amônia. Esta reação é importante na revelação e dosagem de proteí-

nas. Quando uma solução de ninhidrina é aquecida com uma solução de aminoácido, peptídio ou

proteína, desenvolve-se uma coloração azul violeta.

TÉCNICA:

Pipete em um tubo 10 gotas da solução de ninhidrina a 0,1%, junte 1mL da solução de ovoal-

bumina e ferva durante 2 minutos. Observe, explique e equacione a reação.

3 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS

Os metais pesados precipitam as proteínas devido à formação de sais insolúveis de metal

com as proteínas negativamente carregadas, forma em que se encontram em meio alcalino.

10

TÉCNICA

Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 7 gotas de HgCl2 5%

Tubo 2. 2 mL de solução de ovoalbumina + 5 gotas de acetato de chumbo 10%.

Explique.

4 - PRECIPITAÇÃO PELOS ÁCIDOS METAIS FORTES

Estes ácidos desnaturam as proteínas transformando-as em metaproteínas insolúveis.

TÉCNICA:

Pipete num tubo, 1 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de água destilada, incline o tubo e

acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de ácido nítrico concentrado. Não agite. O que obser-

vou?

5 - REAÇÃO XANTOPROTEICA: Tirosina e Triptófano

Esta reação é devido à presença na molécula protéica do grupo fenil – C6H5 com o qual o

ácido nítrico forma nitroderivados que são fortemente coloridos em meio alcalino. Os componentes da

proteína responsáveis por esta reação são: tirosina e triptófano. A fenilalanina que também contém o

anel benzênico não dá este teste nas condições descritas, somente utilizando um agente de nitração

mais enérgico.

TÉCNICA:

Num tubo pipete 1 mL de solução de ovoalbumina, junte 10 gotas de ácido nítrico concentra-

do. Ferva por 3 min, acrescente 4 mL de solução NaOH 2N. O que observou?

6 – REAÇÃO DO GRUPO SULFIDRILA – CISTINA E CISTEÍNA

Cistina e cisteína quando são aquecidos com álcali forte, em presença de acetato de chumbo,

há formação de um precipitado de sulfeto de chumbo.

TÉCNICA:

Coloque num tubo uma pequena quantidade de cabelo, junte 5 gotas de solução de acetato de

chumbo 5% e 2 mL de solução NaOH 50%. Ferva durante 5 minutos. O que observou.

11

Determinação qualitativa de proteínas e aminoácidos

1- Reação do Biureto

2-Reação da Ninidrina

+RCHO + CO

2 + +NH3D

Ninidrina oxidada

Aldeído+ H

+

Ninidrina reduzida

hidridantina

Produto púrpura

ou Púrpura de Ruhemann's

D

+

+3H2O

2a. Ninidrina oxidada

3- Precipitação com sais de metais pesados

OOH

2 + HgCl2

2NaOH

OO-

Hg

OO-

++ 2NaCl 2H2O

proteínas

Cloreto de

mercúrio

Sal insolúvel

do metal

Cloreto de

sódio

P

C

NH2

C

O

O

N C

O

O

P

C

NH2

P

C

NH2

C O

NH

CH R1

C O

NH

CHR2

H

OH

O

O

CO

NH

CHR1

CO

NH

CHR2

Cu

OH

OH

O

O

NH3

+C

C

O OH

H

R1

OH

OH

O

O

NH3

+

12

4-Precipitação pelos ácidos minerais fortes

+

CH3COO

CH3COO

Pb

Acetato de

chumbo

2NaOH

OO-

+ 2CH3COONa 2H

2O

Sal insolúvel

do metal

OO-

Pb

OOH

2+

Acetato de

sódioProteínas

Proteína + HNO3 Metaproteína

5- Reação de Millon- Presença de tirosina

Ácido nítrico

concentrado

2 + Hg++

Tirosina

HNO3

D

Fenolato de Mercúrio

+ 2CH3CHCOOH

Alanina

6- Reação do grupo Sulfidrila - Presença de cisteína e cistina

OOH + 2NaOH Na2S + OOH + H

2O

Cisteína

Hidróxido

de sódio

DSulfeto

de sódio Serina

7- Reação xantoprotéica - Presença de tirosina e triptofano

Na2S +

CH3COO

CH3COO

PbD

Sulfeto

de sódioAcetato de

chumbo

PbS +

Sulfeto de

chumbo

2CH3COONa

Acetato de

sódio

Tirosina

H2O

DHNO3+

- OOH OOH

O2

Nitroderivado

Amarelo

NaOH

Amarelo

intenso

NH2

C C

H

CH2

OH

NH2

C

H

CCH2

OH

N

P

C

NH2

O Hg O

P

C

NH2

P

C

NH2

NH2

C

O

OH

H

CCH2

OH

NH2

NH2

C C

H

CH2

SH

NH2

C

H

CCH2

OH

13

5-PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO LEITE

I - EXTRAÇÕES

01 - Adicionar 50 ml de água destilada morna a 50 ml de leite em béquer de 250 ml.

02 - Acrescentar solução de ácido acético 10% gota a gota, agitando, até que o leite se coagule

(queijo).

03 - Deixar em repouso cerca de 5 minutos.

04 - Decantar o líquido sobrenadante sobre o papel de filtro, recolhendo o filtrado no erlenmeyer

de 125 ml. Guardar o precipitado.

05 - Transferir o filtrado para o béquer de 250 ml. Aquecê-lo diretamente na chama até ebulição.

Baixar a chama e deixar fervendo até reduzir o volume a mais ou menos 40 ml. Soprar na superfície

quando houver formação de espuma.

06 - Filtrar e deixar esfriar. Esta solução será utilizada para os testes de alguns constituintes quí-

micos.

07 - Colocar o precipitado obtido no item 4 num béquer de 100 ml.

08 - Adicionar 10 ml de álcool e amassar com o bastão. Decantar e desprezar o sobre-nadante na

pia.

09 - Adicionar novamente cerca de 10 ml de álcool e repetir a operação anterior.

10 - Adicionar cerca de 5 ml de éter e fazer a extração com auxílio do bastão.

11 - Passar o líquido sobrenadante para uma placa de Petri. Deixar evaporar o éter à temperatura

ambiente, e observar o resíduo.

12 - Recolher o precipitado lavado pelo éter em papel de filtro e deixar evaporar o éter restante à

temperatura ambiente.

13 - Interprete o resultado.

II - RECONHECIMENTO DA PORÇÃO PROTEICA DO LEITE - Teste do Biureto

01 - Colocar um pequeno fragmento do precipitado em um tubo de ensaio.

02 - Adicionar 3 mL do reagente de biureto.

03 - Agitar.

04 - O aparecimento de uma coloração violeta indica reação positiva.

05 - Interprete o resultado.

III - PESQUISA DE AÇÚCAR REDUTOR - Teste de Benedict

01 - Colocar 2 mL do reagente de Benedict num tubo de ensaio.

02 - Adicionar 1 mL do filtrado obtido no item I - 6. Misturar.

03 - Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente.

14

04 - Interpretar o resultado.

IV - PESQUISA DE CÁLCIO

01 - Colocar 2 mL de filtrado em um tubo de ensaio.

02 - Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até aparecimento de uma turvação ou

um precipitado branco.

03 - Interpretar o resultado.

V - PESQUISA DE CLORETOS

01 - Colocar 2 mL do filtrado em um tubo de ensaio.

02 - Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado.

03 - Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado.

04 - Interprete o resultado.

15

6-PROPRIEDADES DA UREASE

1 - REAÇÃO DA UREASE COM O BIURETO

TÉCNICA

Tubo 1. 3 gotas de solução de urease + 1 mL de biureto

Tubo 2. 1 mL de biureto

Comparar as cores dos dois tubos. Explicar.

2 - TESTE DE ATIVIDADE

Pela ação da urease a uréia se converte em amônia e ácido carbônico

CO (NH2)2 + 2 H2O H2CO3 + NH3

H2 CO3 H2O + CO2

A ação enzimática da urease pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de

uréia fracamente tamponada a pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol (amarelo 7,0 8,6

vermelho). Sob a ação da enzima formará amônia suficiente par sobrepujar a ação do tampão e o pH

subirá. A cor da solução então mudará de amarelo para vermelho.

TÉCNICA

Pipetar 1,5 mL de solução de uréia (0,4M, pH 7,0) num tubo de ensaio e adicionar 3 gotas de

solução de urease. Misturar. Observar a mudança de coloração após 3 minutos.

3 - ESPECIFICIDADE

A urease é especificada pelo seu substrato, a uréia. Podemos demonstrar isso, reagindo-a

com derivados da uréia, como exemplo tem a tiouréia (NH2 - CS – NH2).

TÉCNICA

Em um tubo adicione 1,5 mL de solução de tiouréia (0,4M, pH 7,0) + 3 gotas de solução de

urease e compare com o tubo do teste de atividade (reação 2). Explicar o que ocorreu.

4 - DESNATURAÇÃO PELO CALOR

TÉCNICA

Misturar num tubo de ensaio 1 mL de água destilada com 3 gotas de solução de urease. Le-

var ao banho-maria a 100°C durante 5 minutos. Pipetar em outro tubo 1,5 mL de solução de uréia e

adicione 0,5 mL da solução de urease fervida. Aguardar 5 minutos. Comparar com o tubo do teste de

Urease

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atividade (reação 2). Explicar.

5 - INIBIÇÃO POR SAIS DE MERCÚRIO

Os grupos (-SH) sulfidrílicos são essenciais para a atividade da urease. Eles podem manter

ou talvez constitua parte do centro ativo da enzima. Se forem oxidados a enzima se tornará inativa.

2(-SH) + HgCl2 S - Hg - S + 2HCl

Realizar os testes abaixo: TUBOS UREASE ÁGUA HgCl2 5% URÉIA COLORAÇÃO

1 3 gotas 1 mL 1,5 mL 2 3 gotas 1 mL 5 gotas 1,5 mL

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7-IDENTIFICAÇÃO DA ACIDEZ DAS SUBSTÂNCIAS DO NOSSO COTIDIANO

Um dos fatores que determina a qualidade dos alimentos é a sua acidez. Então muitas des-sas substâncias que nos rodeiam podem ter caráter ácido ou básico e também contêm em sua com-posição carboidratos e/ou proteínas. Por exemplo, o leite fresco é levemente ácido (acidez natural), devido à presença da caseína, fosfatos albumina, dióxido de carbono e citratos. A acidez pode au-mentar através da hidrólise da lactose por enzimas microbianas (fermentação), que leva à formação de ácido lático. Se essa acidez desenvolvida for muito elevada, o leite é impróprio para o consumo, pois ela indica alta atividade microbiana. AMOSTRAS

1. Leite longa vida 2. Leite pasteurizado 3. Achocolatado 4. Vinagre 5. Suco de laranja 6. Suco de uva 7. Suco de maracujá 8. Suco de Acerola 9. Gelatina 10. Água Sanitária

PROCEDIMENTO:

1. Coloque com o auxílio de uma pipeta 10 ml de leite, em um erlenmeyer de 50 ml ou 100 ml. 2. Meça o pH da substância com o papel de pH universal e anote o resultado. 3. Depois adicione 10 ml de água. 4. Adicione 7 gotas de fenolftaleína. 5. Encha uma bureta de 25 ou 50 ml com a solução de NaOH 5%. 6. Proceda a titulação gotejando gota-a-gota da solução de NaOH 5% no erlenmeyer com leite,

até que ele adquira uma coloração rósea persistente por cerca de um minuto. 7. Anote o volume que gastou de NaOH 5% para titular o leite. 8. Faça este procedimento para todas as amostras acima. 9. Produza um gráfico mostrando a acidez das substâncias. 10. Faça uma discussão dos resultados ressaltando suas características químicas e bioquímicas.

Explicando qual grupamento químico e que compostos especificamente conferiram a ela essa acidez ou basicidade.

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8-BIOQUÍMICA DE SUBSTÂNCIAS LIGHT, DIET E NORMAL

A população ainda não está totalmente esclarecida quanto aos produtos diet e light que exis-tem nomercado. O que sabemos é que produto diet, a rigor é aquele que não contém açúcar, mas tem uma quantidade grande de carboidrato na sua composição. O exemplo que damos é dos pães. Todos têm farinha que é rica em carboidrato. Só que são anunciados como não contendo açúcar ou gordura. Achocolatados também anunciam que não têm açúcar, mas têm carboidratos. Uma especial atenção deve ser dada ao chocolate que se diz diet. Ele realmente não contém açúcar, mas a quanti-dade de gordura é muito grande. Para emagrecer não é indicado, porque uma grama de gordura tem nove calorias e uma grama de açúcar tem quatro calorias. A pessoa estará ingerindo mais que o do-bro das calorias que teria na proporção de gordura e açúcar. Os alimentos diet e light podem ser usa-dos na alimentação de quem está emagrecendo de forma balanceada e sempre complementando o cardápio em substituição a outro alimento. Tendo cuidado para não ingerir demais.

1. Identificação de proteínas 1. Sprite normal 2. Leite 3. Gelatina incolor 4. Suco de fruta

Coloque 2 ml de cada substância em tubos de ensaios e adicione 2 ml de biureto. Expli-que o que aconteceu.

2. Identificação do amido 1. Amido 2. Gelatina incolor 3. Sprirte normal 4. Suco de fruta

Coloque 2 ml de cada substância em tubos de ensaio e adicione 2 gotas de lugol. Aqueça e explique o que aconteceu.

3. Reação de Seliwanoff 1. Frutose 2. Glicose 3. Suco de fruta 4. Leite 5. Sprite Zero 6. Sprite normal

Coloque 1 ml de cada substância em tubos de ensaio e 5 ml de reativo de Seliwanoff. Aqueça por 3 min e explique o que aconteceu.

4. Identificação de açúcar redutor 1. Glicose 2. Gelatina normal 3. Sprite normal 4. Sprite Zero 5. Leite 6. Sacarose 7. Amido

Coloque 2 ml de cada substância em tubos de ensaio e adicione 1,5 ml de Benedict. A-queça por 3 min e explique o que aconteceu.

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REFERÊNCIAS NEPOMUCENO, M. de F; RUGIIERO, A. C.; Manual de Bioquímica: roteiro de análises bioquímicas qualitativas e quantitativas. Ribeirão Preto: Tecmedd, 2004. Disponível em http: www.bioq.unb.br/htm/praticas. Acessado em 27/01/2009.