80869935 manual bioquimica

Lançamento 2007

ISBN: 9788521204060

Páginas: 1216

Formato: 21x28 cm

Peso: 2.948 kg

Thomas M. Devlin

Manual de Bioquímica com Correlações Clínicas

Tradução da6ª Edição

Americana

CONTEÚDO | VII

RESUMO DO CONTEÚDO

PARTE I | ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS

1 Estrutura da Célula Eucariótica, 1 2 DNA e RNA: Composição e Estrutura, 23 3 Proteínas I: Composição e Estrutura, 73

PARTE II | TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

4 Replicação, Recombinação e Reparo do DNA, 1325 RNA: Transcrição e Processamento, 1726 Síntese de Proteínas: Tradução e Modificações

Pós-Tradução, 1977 DNA Recombinante e Biotecnologia, 2418 Regulação da Expressão Gênica, 287

PARTE III | FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

9 Proteínas II: Relações Estrutura-Função em Famílias de Proteínas, 315

10 Enzimas: Classificação, Cinética e Controle, 35811 Citocromos P450 e Óxido Nítrico Sintases, 40712 Membranas Biológicas: Estruturas e Transporte

em Membranas, 43613 Fundamentos da Transdução de Sinal, 483

PARTE IV | VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

14 Bioenergética e Metabolismo Oxidativo, 52115 Metabolismo de Carboidratos I: Principais Vias

Metabólicas e Seu Controle, 57216 Metabolismo de Carboidratos II: Vias Especiais

e Glicoconjugados, 62617 Metabolismo de Lipídeos I: Síntese, Armazena-

mento e Utilização de ácidos Graxos e Triacilgli-ceróis, 650

18 Metabolismo de Lipídeos II: Vias do Metabolis-mo de Lipídeos Especiais, 683

19 Metabolismo de aminoácidos, 72520 Metabolismo de Purina e Pirimidina Nucletíde-

os, 77021 Metabolismo do Heme e do Ferro, 80322 Inter-Relações Metabólicas, 829

PARTE V | PROCESSOS FISIOLÓGICOS

23 Bioquímica de Hormônios, 87024 Biologia Molecular das Células, 92525 Ciclo Celular, Morte Celular Programada e Cân-

cer, 98726 Digestão e Absorção de Constituintes Nutricio-

nais Básicos, 100927 Princípios de Nutrição I: Macronutrientes, 104328 Princípios de Nutrição II: Micronutrientes, 1063

APÊNDICE REVISÃO DE QUÍMICA ORGÂNICA, 1094GLOSSÁRIO, 1107ÍNDICE, 1134

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CONTEÚDO | IX

CONTEÚDO

PREFÁCIO, XXIPREFÁCIO PARA A EDIÇÃO BRASILEIRA, XXIIIAGRADECIMENTOS, XXVTRADUTOR E CO-AUTORES, XXVII

PARTE I | ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS

1 | ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA, 1

1.1 VISÃO GERAL: CÉLULAS E COMPARTI- MENTOS CELULARES, 2 1.2 ÁGUA, PH E SOLUTOS: O AMBIENTE AQUOSO DAS CÉLULAS, 3 1.3 COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS EUCARIÓTI- CAS: PAPÉIS FUNCIONAIS DE ORGANE- LAS SUBCELULARES E SISTEMAS DE MEMBRANAS, 11 1.4 INTEGRAÇÃO E CONTROLE DAS FUN- ÇÕES CELURES, 19 BIBLIOGRAFIA, 20 QUESTÕES E RESPOSTAS, 20 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 1.1 Concentração Sangüínea de Bicar- bonato na Acidose Metabólica, 10 1.2 Doenças Mitocondriais, 15 1.3 Enzimas Lisossomais e Gota, 16 1.4 Deficiência de Lipase Ácida Lisossomal, 18 1.5 Doenças da Biogênese de Peroxis- somos (PBDs), 19

2 | DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA, 23

2.1 VISÃO GERAL, 24 2.2 COMPONENTES ESTRUTURAIS DOS ÁCI- DOS NUCLÉICOS: NUCLEOBASES, NU- CLEOSÍDEOS E NUCLEOTÍDEOS, 26 2.3 ESTRUTURA DO DNA, 28 2.4 ORDEM SUPERIOR DA ESTRUTURA DO DNA, 47 2.5 SEQÜÊNCIA E FUNÇÃO DO DNA, 57 2.6 ESTRUTURA DO RNA, 61 2.7 TIPOS DE RNA, 64

BIBLIOGRAFIA, 69 QUESTÕES E RESPOSTAS, 70 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 2.1 Vacinas de DNA, 25 2.2 Uso Diagnóstico de Matrizes (Ar- rays) de DNA em Medicina e Gené- tica, 38 2.3 Antibióticos Antitumorais que Mu- dam a Forma do DNA, 42 2.4 Persistência Hereditária de Hemo- globina Fetal, 45 2.5 Telomerase como Alvo para Agen- tes Anticâncer, 46 2.6 Expansão de Tripletes de DNA re- petitivos em Doença Humana, 48 2.7 Topoisomerases no Tratamento de Doença, 52 2.8 Resistência de Staphylococcus à Eritromicina, 65

3 | PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA, 73

3.1 PAPÉIS FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS NO HOMEM, 74 3.2 COMPOSIÇÃO EM AMINOÁCIDOS DE PROTEÍNAS, 75 3.3 PROPRIEDADES DE CARGAS E QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS, 81 3.4 ESTRUTURA PRIMÁRIA DE PROTEÍNAS, 88 3.5 NÍVEIS SUPERIORES DE ORGANIZAÇÃO PROTEÍCA, 90 3.6 OUTROS TIPOS DE PROTEÍNAS, 97 3.7 DOBRAMENTO (FOLDING) DE PROTEÍ- NAS DE ESTRUTURAS ALEATÓRIAS PARA SINGULARES: ESTABILIDADE DA PROTEÍNA, 108 3.8 ASPECTOS DINÂMICOS DA ESTRUTURA DE PROTEÍNAS, 115 3.9 CARACTERIZAÇÃO, PURIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA E OR- GANIZAÇÃO DE PROTEÍNAS, 116 BIBLIOGRAFIA, 128 QUESTÕES E RESPOSTAS, 129 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 3.1 Proteínas Plasmáticas no Diagnósti- co de Doenças, 86

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X | CONTEÚDO

3.2 Diferenças em Insulinas Usadas em Tratamento de Diabetes Mellitus, 89 3.3 Uma Mutação Não-Conservativa Ocorre em Anemia Falciforme, 90 3.4 Doenças de síntese de Colágeno, 98 3.5 Hiperlipidemias, 103 3.6 Hipolipoproteinemias, 105 3.7 Hemoglobina Glicosilada, HbA1c, 108 3.8 Proteínas Como Agentes Infeccio- sos: Príons e Encefalopatias Espon- giformes Transmissíveis Humanas (TSEs), 110 3.9 Uso de Análise de Aminoácidos em Diagnóstico de Doenças, 121

PARTE II | TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

4 | REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO DO DNA, 132

4.1 CARACTERÍSTICAS COMUNS DA REPLI- CAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO, 133 4.2 REPLICAÇÃO DO DNA, 133 4.3 RECOMBINAÇÃO, 151 4.4 REPARO, 156 BIBLIOGRAFIA, 169 QUESTÕES E RESPOSTAS, 169 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 4.1 Quimioterapia Pode Ter Como Al- vos Precursores da Síntese do DNA, 135 4.2 Topoisomerases Como Alvos Para Drogas, 144 4.3 Câncer e o Ciclo Celular, 149 4.4 Análogos de Nucleosídeos e Resis- tência a Drogas na Terapia do HIV, 149 4.5 Terapia Gênica, 156 4.6 Quimioterapia, Lesão do DNA e Reparo, 157 4.7 Análogos de Nucleosídeos Como Drogas: Tiopurinas, 158 4.8 Medicina Individualizada, 159 4.9 Xeroderma Pigmentoso, 162 4.10 Reparo de Pareamento Errado e Câncer, 164

5 | RNA: TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO, 172

5.1 VISÃO GERAL, 173 5.2 MECANISMOS DE TRANSCRIÇÃO, 173 5.3 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS, 178 5.4 PROCESSAMENTO DE RNA, 184 5.5 EXPORTAÇÃO DO RNA E CONTROLE DE QUALIDADE, 191 5.6 RNAs PEQUENOS INIBITÓRIOS, 192 5.7 REPARO DO DNA ACOPLADO À TRANS- CRIÇÃO, 192 5.8 NUCLEASES E TURNOVER DO RNA, 193 BIBLIOGRAFIA, 194 QUESTÕES E RESPOSTAS, 195 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 5.1 Antibióticos e Toxinas Que Têm RNA Polimerase Como Alvo, 176 5.2 Síndrome do X Frágil: Uma Doença de RNA-Cromatina?, 179 5.3 Envolvimento de Fatores Transcrip- cionais em Carcinogênese, 182 5.4 Talassemia Devido a Defeitos na Síntese de RNA Mensageiro, 188 5.5 Auto-Imunidade em Doença do Tecico Conjuntivo, 189 5.6 Síndrome de Cockayne, 193

6 | SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO, 197

6.1 VISÃO GERAL, 198 6.2 COMPONENTES DO APARELHO DE TRA- DUÇÃO, 198 6.3 BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS, 209 6.4 AMADURECIMENTO DE PROTEÍNAS: DOBRAMENTO, MODIFICAÇÃO, SECRE- ÇÃO E DIRECIONAMENTO, 218 6.5 DIRECIONAMENTO PARA MEMBRANA E ORGANELAS, 224 6.6 MAIS MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO, 227 6.7 REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO, 234 6.8 DEGRADAÇÃO E TURNOVER DE PROTEÍ- NAS, 235 BIBLIOGRAFIA, 237 QUESTÕES E RESPOSTAS, 239 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 6.1 Mutações Com Sentido Errado: Hemoglobina, 202 6.2 Mutação Gerando Códon de Ter- minação, 202 6.3 α-Talassemia, 203 6.4 Mudança na Fase de Leitura (Fra- meshifting) Programada na Bios- síntese das Proteínas de HIV, 204

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CONTEÚDO | XI

6.5 Mutação em RNA Ribossômico Mitocondrial Resulta em Surdez Induzida por Antibiótico, 217 6.6 Deleção de um Códon, Modifica- ção Pós-Tradução Incorreta e de Gradação Prematura de Proteína: Fibrose Cística, 219 6.7 Dobramento Errado e Agregação de Proteína: Doença de Creuz- feldt-Jacob, Doença da Vaca Lou- ca, Doença de Alzheimer e Doen- ça de Huntington, 220 6.8 Doenças de Função de Lisosso- mos, 226 6.9 Hiperproinsulinemia Familiar, 229 6.10 Ausência de modificação Pós-Tra- dução: Deficiência Múltipla de Sulfatases, 230 6.11 Defeitos na Síntese de Colágeno, 233

7 | DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA, 241

7.1 VISÃO GERAL, 242 7.2 A REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA

(POLYMERASE CHAIN REACTION), 243 7.3 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO E

MAPAS DE RESTRIÇÃO, 243 7.4 SEQÜENCIAMENTO DE DNA, 245 7.5 DNA RECOMBINANTE E CLONAGEM,

248 7.6 SELEÇÃO DE UM DNA ESPECÍFICO

CLONADO EM BIBLIOTECAS, 252 7.7 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE

ÁCIDOS NUCLÉICOS E PROTEÍNAS QUE LIGAM DNA, 254

7.8 DNA COMPLEMENTAR E BIBLIOTECAS DE DNA COMPLEMENTAR, 260

7.9 BACTERIÓFAGO, COSMÍDEO E VETORES DE CLONAGEM EM LEVEDURA, 262

7.10 ANÁLISE DE LONGAS SEQÜÊNCIAS DE DNA, 265

7.11 VETORES DE EXPRESSÃO E PROTEÍNAS DE FUSÃO, 265

7.12 VETORES DE EXPRESSÃO EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS, 267

7.13 MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA, 269 7.14 APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA

RECOMBINANTE, 272 7.15 GENÔMICA, PROTEÔMICA E ANÁLISE

MICROARRAY, 279 BIBLIOGRAFIA, 283 QUESTÕES E RESPOSTAS, 284 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 7.1 Reação de Polimerase em Cadeia

(Polymerase Chain Reaction), 245

7.2 Mapas de Restrição e Evolução, 246 7.3 Seqüenciamento Direto de DNA

para o Diagnóstico de Doenças Genéticas, 248

7.4 Análise por PCR Multiplex de Defeitos no Gene de HGPRTase na Síndrome de Lesch-Nyhan, 252

7.5 Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição Determina a Origem Clonal de Tumores, 257

7.6 Polimorfismo de Conformação de Cadeia-Única para Detecção de Mutações Espontâneas que Podem Levar a SIDS, 259

7.7 Mutagênese Sítio-Dirigida de HSV IgD, 271 7.8 Inibição de HIV Mediada por RNA,

274 7.9 Terapia Gênica: Genes Normais

Podem Ser Introduzidos em Células com Genes Defectivos, 276

7.10 Modelos de Animais Transgênicos, 277

7.11 Camundongos Knockout para Definir um Papel para o Purinoceptor P2Y1, 279

7.12 Análise por Microarray de Câncer de Mama, 280

8 | REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA, 287

8.1 VISÃO GERAL, 288 8.2 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO EM

BACTÉRIAS: O OPERON, 288 8.3 OPERON LACTOSE DE E. COLI, 288 8.4 OPERON TRIPTOFANO DE E. COLI, 293 8.5 OUTROS OPERONS BACTERIANOS, 297 8.6 TRANSPOSONS BACTERIANOS, 299 8.7 EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS,

300 8.8 COMPLEXO DE PRÉ-INICIAÇÃO EM EUCARIOTOS: FATORES DE TRANSCRI-

ÇÃO, RNA POLIMERASE II E DNA, 303 8.9 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

EUCARIÓTICA, 308 BIBLIOGRAFIA, 312 QUESTÕES E RESPOSTAS, 312 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 8.1 Resistência Transmissível a Múltiplas

Drogas, 300 8.2 Síndrome de Rubstein-Taybi, 302 8.3 Tamoxifeno e Receptor de

Estrógeno como Alvo, 309 8.4 Fatores de Transcrição e Doença

Cardiovascular, 310

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XII | CONTEÚDO

PARTE III | FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

9 | PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA- FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNAS, 315

9.1 VISÃO GERAL, 316 9.2 MOLÉCULAS DE ANTICORPOS:

SUPERFAMÍLIA DE PROTEÍNAS IMUNOGLOBULINAS, 316

9.3 PROTEÍNAS COM UM MECANISMO CATALÍTICO COMUM: SERINO PROTEASES, 324

9.4 HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA, 334 9.5 O COMPLEXO PROTÉICO DA LÂMINA

BASAL, 347 BIBLIOGRAFIA, 355 QUESTÕES E RESPOSTAS, 355 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 9.1 As Proteínas do Complemento, 319 9.2 Funções de Diferentes Classes de

Anticorpos, 319 9.3 Imunização, 320 9.4 Formação de Fibrina em um Infarto do Miocárdio e Uso de Ativador de

Plasminogênio Tecidual Recombinante (rt-PA), 326

9.5 Envolvimento de Serino Proteases em Metástase de Células Tumorais, 326

9.6 Hemoglobinopatias, 335

10 | ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE, 358

10.1 VISÃO GERAL, 359 10.2 CLASSIFICAÇÃO DE ENZIMAS, 360 10.3 CONCEITOS GERAIS DE MECANISMOS

ENZIMÁTICOS, 363 10.4 SÍTIO ATIVO DE UMA ENZIMA, 368 10.5 COENZIMAS, CO-SUBSTRATOS E

COFATORES, 371 10.6 CINÉTICA DE REAÇÕES QUÍMICAS, 376 10.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA DE REAÇÕES DE

UM SUBSTRATO, 379 10.8 CINÉTICA DE REAÇÕES DE DOIS

SUBSTRATOS, 387 10.9 INIBIDORES, 388 10.10 REGULAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁ-

TICA, 394 10.11 REGULAÇÃO DE VIAS METABÓLICAS,

398 10.12 APLICAÇÕES CLÍNICAS DE ENZIMAS, 399 BIBLIOGRAFIA, 404 QUESTÕES E RESPOSTAS, 404

CORRELAÇÕES CLÍNICAS 10.1 Mutação de um Sítio de Ligação de

Coenzima Resulta em Doença Clínica, 371

10.2 Um Caso de Gota Demonstra Duas Fases no Mecanismo de Ação Enzimática, 382

10.3 Efeito Fisiológico de Mudanças nos Valores de Km de Enzimas, 383

10.4 Labilidade Térmica da Glicose-6- Fosfato Desidrogenase Resulta em Anemia Hemolítica, 386

10.5 Isoenzimas da Álcool Desidrogenase com Diferentes pHs Ótimos, 386

10.6 Inibidores de Xantina Oxidase Isolados de Plantas, 388

10.7 Planejamento de um Inibidor Seletivo, 390

10.8 Um Caso de Envenenamento, 393 10.9 Cogumelos e Metabolismo de Álcool,

393 10.10 Um Caso de Gota Demonstra a Dife-

rença entre um Sítio Alostérico e um Sítio de Ligação de Substrato, 394 10.11 Identificação e Tratamento de uma

Deficiência Enzimática, 400 10.12 Ambigüidade no Ensaio de Enzimas

Mutadas, 401

11 | CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES, 407

11.1 VISÃO GERAL, 408 11.2 CITOCROMOS P450: PROPRIEDADES E

FUNÇÃO, 408 11.3 CICLO DE REAÇÃO DO CITOCROMO

P450, 409 11.4 SISTEMAS DE TRANSPORTE DE

ELÉTRONS DOS CITOCROMOS P450, 410 11.5 CITOCROMO P450: NOMENCLATURA E

ISOFORMAS, 412 11.6 CITOCROMOS P450: SUBSTRATOS E

FUNÇÕES FISIOLÓGICAS, 413 11.7 CITOCROMOS P450 PARTICIPAM DE

SÍNTESE DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES E DE OXIGENAÇÃO DE COMPOSTOS ENDÓGENOS, 414

11.8 INDUÇÃO E INIBIÇÃO DE CITOCROMO P450, 423

11.9 AS ÓXIDO NÍTRICO SINTASES: PROPRIEDADES E FUNÇÃO, 425

11.10 ISOFORMAS DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASES E FUNÇÕES FISIOLÓGICAS 428

BIBLIOGRAFIA, 432 QUESTÕES E RESPOSTAS, 434

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CONTEÚDO | XIII

CORRELAÇÕES CLÍNICAS 11.1 Hiperplasia Adrenal Congênita:

Deficiência de CYP21A2, 416 11.2 Produção de Hormônios Esteróides

Durante a Gestação, 418 11.3 Inibição de Citocromo P450:

Interações Droga-Droga e Efeitos Adversos, 420

11.4 Papel de CYP2E1 em Toxicidade Hepática Induzida por Acetaminofen, 422

11.5 Indução de Citocromo P450: Interações Droga-Droga e Efeitos Adversos, 423

11.6 Polimorfismos Genéticos das Enzimas P450, 426

11.7 Mecanismo de Ação de Sildenafil, 430

11.8 Aspectos Clínicos da Produção de Óxido Nítrico, 431

11.9 História da Nitroglicerina, 432

12 | MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA E TRANSPORTE EM MEMBRANAS, 436

12.1 VISÃO GERAL, 437 12.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE

MEMBRANAS, 438 12.3 MICELAS, BICAMADAS LIPÍDICAS E

LIPOSSOMOS, 445 12.4 ESTRUTURA DE MEMBRANAS

BIOLÓGICAS, 447 12.5 MOVIMENTO DE MOLÉCULAS ATRAVÉS

DE MEMBRANAS, 456 12.6 CANAIS DE MEMBRANAS, 458 12.7 TRANSPORTADORES DE MEMBRANA,

466 12.8 TRANSPORTE PASSIVO, 468 12.9 TRANSPORTE ATIVO, 469 12.10 IONÓFOROS, 478 BIBLIOGRAFIA, 479 QUESTÕES E RESPOSTAS, 480 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 12.1 Lipossomos como Carregadores de

Drogas e Enzimas, 447 12.2 Anomalias na Fluidez de

Membranas Celulares em Doenças, 454

12.3 Fibrose Cística e o Canal de Cl–, 460 12.4 O Rim de Mamíferos e

Aquaporinas, 462 12.5 Doenças Envolvendo a Superfamília

de Transportadores ABC, 475 12.6 Doenças que se Devem à Perda de Sistemas de Transporte de

Membranas, 476

13 | FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL, 483

13.1 VISÃO GERAL, 484 13.2 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTERCELULAR,

485 13.3 RECEPTORES PARA MOLÉCULAS

SECRETADAS, 487 13.4 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTRACELULAR

POR RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR, 488

13.5 RECEPTORES CANAIS IÔNICOS LIGANTE- DEPENDENTES, 493

13.6 RECEPTORES LIGADOS A ENZIMAS, 496 13.7 RECEPTORES DE CITOCINAS, 500 13.8 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA

G, 500 13.9 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM

AMP CÍCLICO, 506 13.10 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM

GMP CÍCLICO, 509 13.11 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM

CÁLCIO, 512 13.12 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM

FOSFOLIPÍDEOS, 514 BIBLIOGRAFIA, 517 QUESTÕES E RESPOSTAS, 518 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 13.1 Família de Receptores Tirosina

Quinases ErbB/HER como Alvos para Quimioterapia do Câncer, 498

13.2 Receptores de Quimiocinas Acoplados a Proteína G como Alvos para o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), 502

13.3 Mutações em Proteína G Gsα em Tumores de Glândula Pituitária e Doenças Endócrinas, 504

13.4 Alterações em Proteínas Sinalizadoras de Receptor β- Adrenérgico em Insuficiência Cardíaca Congestiva, 507

13.5 Eixos Sinalizadores Óxido Nítrico/ cGMP como Alvos Terapêuticos em Doenças Cardíacas e Vasculares, 511

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XIV | CONTEÚDO

PARTE IV | VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

14 | BIOENERGÉTICA E METABOLISMO OXIDATIVO, 521

14.1 SISTEMAS DE PRODUÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DE ENERGIA, 522

14.2 RELAÇÕES TERMODINÂMICAS E COMPONENTES RICOS EM ENERGIA, 524

14.3 FONTES E DESTINOS DA ACETIL- COENZIMA A, 529

14.4 CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS, 534

14.5 ESTRUTURA E COMPARTIMENTALI- ZAÇÃO POR MEMBRANAS MITOCON- DRIAIS, 540

14.6 CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS, 542

14.7 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA, 553 14.8 MEMBRANA MITOCONDRIAL INTERNA

CONTÉM SISTEMAS DE TRANSPORTE DE SUBSTRATO 559

14.9 GENES MITOCONDRIAIS E DOENÇAS, 563

14.10 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS), 565

BIBLIOGRAFIA, 568 QUESTÕES E RESPOSTAS, 569 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 14.1 Deficiência de Piruvato

Desidrogenase, 533 14.2 Deficiência de Fumarase, 537 14.3 Envenenamento por Cianeto, 552 14.4 Neuropatia Óptica Hereditária de

Leber, 564 14.5 Miopatias Mitocondriais Devido a

Mutações em Genes de tRNA, 564 14.6 Intolerância a Exercício

em Pacientes com Mutações no Citocromo b, 565

14.7 Lesão por Isquemia/Reperfusão, 567

15 | METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE, 572

15.1 VISÃO GERAL, 573 15.2 GLICÓLISE, 574 15.3 VIA GLICOLÍTICA, 577 15.4 REGULAÇÃO DA GLICÓLISE, 584 15.5 GLUCONEOGÊNESE, 597

15.6 GLICOGENÓLISE E GLICOGÊNESE, 609 BIBLIOGRAFIA, 623 QUESTÕES E RESPOSTAS, 623 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 15.1 Álcool e Barbituratos, 584 15.2 Envenenamento por Arsênico, 585 15.3 Intolerância à Frutose, 587 15.4 Diabetes Mellitus, 589 15.5 Acidose Láctica, 591 15.6 “Picles” de Porco e Hipertermia

Maligna, 592 15.7 Angina Pectoris e Infarto do

Miocárdio, 593 15.8 Deficiência de Piruvato Quinase e

Anemia Hemolítica, 598 15.9 Hipoglicemia e Crianças Prematu-

ras, 599 15.10 Hipoglicemia e Intoxicação

Alcoólica, 608 15.11 Doenças de Armazenamento de

Glicogênio, 612

16 | METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS, 626

16.1 VISÃO GERAL, 627 16.2 VIA DAS PENTOSES FOSFATO, 627 16.3 INTERCONVERSÕES DE AÇÚCARES

E FORMAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO- AÇÚCAR, 631

16.4 BIOSSÍNTESE DE CARBOIDRATOS COMPLEXOS, 637

16.5 GLICOPROTEÍNAS, 638 16.6 PROTEOGLICANOS, 642 BIBLIOGRAFIA, 647 QUESTÕES E RESPOSTAS, 647 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 16.1 Glicose 6-Fosfato Desidrogenase:

Deficiência Genética ou presença de Variantes Genéticas em Eritrócitos, 629

16.2 Síndrome de Wernicke-Korsakoff: Deficiência ou Presença de Varian- tes Genéticos de Transcetolase, 629

16.3 Síndromes de Glicoproteínas Deficientes em Carboidratos

(CDGS), 632 16.4 Frutosúria Essencial e Intolerância

à Frutose: Deficiência de Frutoqui- nase e de Frutose 1-Fosfato Aldo- lase, 633

16.5 Galactosemia: Incapacidade de Transformar Galactose em Glicose, 634

BioQ.00 14 22.01.07 16:25:04

CONTEÚDO | XV

16.6 Pentosúria: Deficiência de Xilitol Desidrogenase, 635

16.7 Ácido Glucurônico: Significado Fisiológico da Formação de Glucuronídeos, 635

16.8 Substâncias dos Grupos Sangüí- neos, 638

16.9 Carboidrato Marcador Comum do Direcionamento Lisossomal e

Doença da Célula I, 640 16.10 Aspartilglicosilaminúria: Ausência

de 4-L-Aspartilglicosamina Amido- hidrolase, 641

16.11 Doenças de Glicolipídeos, 642 16.12 Heparina é um Anticoagulante,

643 16.13 Condrodistrofias Devidas a

Defeitos de Sulfatação, 645 16.14 Mucopolissacaridoses, 646

17 | METABOLISMO DE LIPÍDEOS I: SÍNTESE, ARMAZENAMENTO E UTILIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS E TRIACILGLICERÓIS, 650

17.1 VISÃO GERAL, 651 17.2 NATUREZA QUÍMICA DE ÁCIDOS

GRAXOS E ACILGLICERÓIS, 652 17.3 TRANSPORTE INTERÓRGÃOS DE ÁCIDOS

GRAXOS E SEUS PRODUTOS PRIMÁRIOS, 656

17.4 SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS: LIPOGÊNESE, 657

17.5 ARMAZENAMENTO DE ÁCIDOS GRAXOS COMO TRIACILGLICERÓIS, 665 17.6 UTILIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS PARA

PRODUÇÃO DE ENERGIA, 667 17.7 REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE

LIPÍDEOS, 679 BIBLIOGRAFIA, 680 QUESTÕES E RESPOSTAS, 681 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 17.1 Obesidade, 654 17.2 Papel do Metabolismo de Ácidos

Graxos em Diabetes Tipo 2, 655 17.3 Ciclo Triacilglicerol/Ácido Graxo,

668 17.4 Deficiências Genéticas no

Transporte por Carnitina ou na Carnitina Palmitoil Transferase, 670

17.5 Deficiências Genéticas das Acil-CoA Desidrogenases, 672

17.6 Doença de Refsum, 675 17.7 Corpos Cetônicos como Combustí-

veis: A Dieta Atkins, 677

18 | METABOLISMO DE LIPÍDEOS II: VIAS DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS ESPECIAIS, 683

18.1 VISÃO GERAL, 684 18.2 FOSFOLIPÍDEOS, 684 18.3 COLESTEROL, 694 18.4 ESFINGOLIPÍDEOS, 706 18.5 PROSTAGLANDINAS E TROMBOXANES,

714 18.6 LIPOXIGENASE E ÁCIDOS

OXIEICOSATETRAENÓICOS, 718 BIBLIOGRAFIA, 721 QUESTÕES E RESPOSTAS, 722 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 18.1 Síndrome do Desconforto

Respiratório, 687 18.2 Tratamento da Hipercolesterolemia,

703 18.3 Aterosclerose, 704 18.4 Diagnóstico da Doença de Gaucher

em um Adulto, 713

19 | METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS, 725

19.1 VISÃO GERAL, 726 19.2 INCORPORAÇÃO DE NITROGÊNIO EM

AMINOÁCIDOS, 727 19.3 TRANSPORTE DE NITROGÊNIO PARA

FÍGADO E RIM, 732 19.4 CICLO DA URÉIA, 733 19.5 SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DE

AMINOÁCIDOS INDIVIDUAIS, 736 BIBLIOGRAFIA, 766 QUESTÕES E RESPOSTAS, 767 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 19.1 Deficiências de Carbamoil Fosfato

Sintetase e N-Acetilglutamato Sintetase, 736

19.2 Deficiências de Enzimas do Ciclo da Uréia, 738

19.3 Doenças do Metabolismo de Prolina, 739

19.4 Selenoproteínas, 740 19.5 Hiperglicinemia Não-Cetótica, 741 19.6 Deficiência de Ácido Fólico, 743 19.7 Fenilcetonúria, 745 19.8 Doenças do Metabolismo de

Tirosina, 747 19.9 Mal de Parkinson, 748 19.10 Hiper-homocisteinemia e

Aterogênese, 751 19.11 Doenças de Aminoácidos

que Contêm Enxofre, 752 19.12 Acidúria Glutárica, 756 19.13 Esquizofrenia e Outras Doenças

Associadas a Neurotransmissores Derivados de Triptofano, 757

BioQ.00 15 22.01.07 16:25:04

XVI | CONTEÚDO

19.14 Doenças do Metabolismo de Aminoácidos de Cadeia Ramifi- cada, 757

19.15 Doenças do Metabolismo de Propionato e Metilmalonato, 760

19.16 Doenças Envolvendo Lisina e Ornitina, 762

19.17 Histidinemia, 762 19.18 Doenças do Metabolismo de

Folato, 764

20 | METABOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS, 770

20.1 VISÃO GERAL, 771 20.2 FUNÇÕES METABÓLICAS DOS

NUCLEOTÍDEOS, 771 20.3 METABOLISMO DE PURINA

NUCLEOTÍDEOS, 772 20.4 METABOLISMO DE PIRIMIDINA

NUCLEOTÍDEOS, 783 20.5 FORMAÇÃO DE DESOXIRRIBONUCLEO-

TÍDEOS, 786 20.6 NUCLEOSÍDEO E NUCLEOTÍDEO

QUINASES, 789 20.7 ENZIMAS QUE METABOLIZAM

NUCLEOTÍDEOS COM UMA FUNÇÃO EM CICLO CELULAR E TAXA DE DIVISÃO CELULAR, 790

20.8 SÍNTESE DE COENZIMAS NUCLEOTÍDEOS, 791

20.9 SÍNTESE E UTILIZAÇÃO DE 5-FOSFOR- RIBOSIL-1-PIROFOSFATO, 791

20.10 AGENTES QUIMIOTERÁPICOS QUE INTERFEREM COM METABOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS, 793

BIBLIOGRAFIA, 799 QUESTÕES E RESPOSTAS, 800 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 20.1 Gota, 777 20.2 Síndrome de Lesch-Nyhan, 779 20.3 Atividade Aumentada da 5’-

Nucleotidase Citosólica, 781 20.4 Doenças com Imunodeficiências

Associadas com Defeitos na Degradação de Purina Nucleo- sídeos, 782

20.5 Pacientes com Câncer em Tratamento por Radiações ou Quimioterapia, 783

20.6 Subclasses de Pacientes com Autismo, 783

20.7 Acidúria Orótica Hereditária, 785

21 | METABOLISMO DO HEME E DO FERRO, 803

21.1 METABOLISMO DO FERRO: VISÃO GERAL, 804

21.2 PROTEÍNAS QUE CONTÊM FERRO, 804 21.3 ABSORÇÃO INTESTINAL DE FERRO, 807 21.4 REGULAÇÃO MOLECULAR DA

UTILIZAÇÃO DE FERRO, 808 21.5 DISTRIBUIÇÃO E CINÉTICA DO FERRO,

811 21.6 BIOSSÍNTESE DE HEME, 813 21.7 CATABOLISMO DE HEME, 821 BIBLIOGRAFIA, 826 QUESTÕES E RESPOSTAS, 827 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 21.1 Sobrecarga de Ferro e Infecção,

805 21.2 Patogenicidade Microbiana e

Ferro, 805 21.3 Síntese do Grupo Ferro-Enxofre e

Doença Humana, 807 21.4 Ataxia de Friedreich, 807 21.5 Absorção Duodenal de Ferro, 809 21.6 Elementos de Resposta ao Ferro

Mutante, 811 21.7 Deficiência de Ceruloplasmina, 812 21.8 Anemia por Deficiência de Ferro,

812 21.9 Hemocromatose Tipo I: Genética Molecular e a Questão das Dietas

Enriquecidas em Ferro, 814 21.10 Hemocromatose Tipo III, 814 21.11 Porfiria Intermitente Aguda, 817 21.12 Papel Citoprotetor de Heme

Oxigenase, 822 21.13 Hemólise Isoimune Neonatal, 824 21.14 Deficiência de Bilirrubina UDP-

Glucuronosiltransferase, 824 21.15 Elevação de Bilirrubina Conjugada

no Soro, 825

22 | INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS, 829

22.1 VISÃO GERAL, 830 22.2 CICLO JEJUM-ALIMENTAÇÃO, 830 22.3 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA

MUDANÇA DO METABOLISMO HEPÁ- TICO ENTRE OS ESTADOS BEM-

ALIMENTADO E DE JEJUM, 843 22.4 INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS DE TECIDOS EM VÁRIOS ESTADOS

NUTRICIONAIS E HORMONAIS, 852 BIBLIOGRAFIA, 866 QUESTÕES E RESPOSTAS, 868

BioQ.00 16 22.01.07 16:25:05

CONTEÚDO | XVII

CORRELAÇÕES CLÍNICAS 22.1 Obesidade, 831 22.2 Subnutrição Protéica, 832 22.3 Jejum, 833 22.4 Síndrome de Reye, 837 22.5 Coma Hiperglicêmico,

Hiperosmolar, 841 22.6 Hiperglicemia e Glicação de

Proteínas, 841 22.7 Diabetes Mellitus Tipo 2, 855 22.8 Diabetes Mellitus Tipo 1, 857 22.9 Via do Poliol e Complicações do

Diabetes, 857 22.10 Caquexia do Câncer, 858

PARTE V | PROCESSOS FISIOLÓGICOS

23 | BIOQUÍMICA DE HORMÔNIOS, 870

23.1 VISÃO GERAL, 871 23.2 HORMÔNIOS E O SISTEMA DE CASCATA

HORMONAL, 872 23.3 SÍNTESE DE HORMÔNIOS

POLIPEPTÍDICOS E HORMÔNIOS DERI- VADOS DE AMINOÁCIDOS, 875

23.4 PROTEÍNAS DE SINALIZAÇÃO HORMONAL, 883

23.5 RECEPTORES DE HORMÔNIOS DE MEMBRANA, 891

23.6 CASCATA HORMONAL INTRACELULAR: PROTEÍNAS QUINASES, 894

23.7 HORMÔNIOS ESTERÓIDES, 902 23.8 RECEPTORES DE HORMÔNIOS

ESTERÓIDES, 914 BIBLIOGRAFIA, 921 QUESTÕES E RESPOSTAS, 922 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 23.1 Testando a Atividade da Pituitária

Anterior, 875 23.2 Hipopituitarismo, 879 23.3 Atividade Reduzida do Receptor

de Insulina Quinase no Diabetes Mellitus Gestacional, 897

23.4 Contracepção Oral, 913 23.5 Síndrome do Excesso Aparente de

Mineralocorticóide, 917 23.6 Mutação no Receptor de

Mineralocorticóide Resulta em Hipertensão e Toxemia da Gravidez, 919

24 | BIOLOGIA MOLECULAR DAS CÉLULAS, 925

24.1 VISÃO GERAL, 926 24.2 TECIDO NERVOSO: METABOLISMO E

FUNÇÃO, 926 24.3 OLHO: METABOLISMO E VISÃO, 938 24.4 MOTORES MOLECULARES E PROTEÍNAS

ASSOCIADAS, 952 24.5 MECANISMO DA COAGULAÇÃO DO

SANGUE, 967 BIBLIOGRAFIA, 983 QUESTÕES E RESPOSTAS, 984 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 24.1 Síndrome Miastênica de Lambert-

Eaton, 933 24.2 Miastenia Gravis: Uma Doença

Neuromuscular, 935 24.3 Degeneração da Mácula e Perda

de Visão, 942 24.4 Doença de Niemann-Pick e

Retinite Pigmentosa, 942 24.5 Retinite Pigmentosa por Mutação

do Gene da Periferina, 944 24.6 Amaurose Congênita de Leber:

Distrofia da Retina Levando a Cegueira, 949

24.7 Glicação e Estrutura e Função de Miosina, 956

24.8 Cardiomiopatias Hipertróficas Familiares e Mutações em Proteínas Musculares, 957

24.9 Cardiomiopatia Dilatada e Mutações em Actina, 958

24.10 Subunidades da Troponina como Marcadores de Infarto do Miocárdio, 961

24.11 Canelopatias de Íons Voltagem- Dependentes, 962

24.12 Canais Iônicos e Doença do Músculo Cardíaco, 962

24.13 Mutações Afetando Pigmentação: Existe uma Conexão com Motor Molecular?, 965

24.14 Defeitos da Via Intrínseca: Deficiência de Pré-calicreína, 970

24.15 Hemofilia Clássica, 974 24.16 Uso de Fator VIIa Recombinante

para Controlar Sangramento, 975 24.17 Trombose: Defeitos na Via da

Proteína C e Níveis Aumentados de Fatores da Coagulação, 979

BioQ.00 17 22.01.07 16:25:05

XVIII | CONTEÚDO

25 | CICLO CELULAR, MORTE CELULAR PROGRAMADA E CÂNCER, 987

25.1 VISÃO GERAL, 988 25.2 CICLO CELULAR, 988 25.3 APOPTOSE: MORTE CELULAR

PROGRAMADA, 993 25.4 CÂNCER, 997 BIBLIOGRAFIA, 1005 QUESTÕES E RESPOSTAS, 1007 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 25.1 Vírus Oncogênicos de DNA, 999 25.2 Droga Anti-Câncer Molecularmente

Dirigida, 1002 25.3 Causa Ambiental de Cânceres

Humanos, 1003

26 | DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CONSTITUINTES NUTRICIONAIS BÁSICOS, 1009

26.1 VISÃO GERAL, 1010 26.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS, 1012 26.3 TRANSPORTE EPITELIAL, 1016 26.4 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE PROTEÍNAS,

1024 26.5 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE

CARBOIDRATOS, 1028 26.6 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE LIPÍDEOS,

1031 26.7 METABOLISMO DE ÁCIDOS BILIARES,

1037 BIBLIOGRAFIA, 1040 QUESTÕES E RESPOSTAS, 1040 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 26.1 Cloridorréia Familiar Causa Alcalose

Metabólica, 1017 26.2 Fibrose Cística, 1020 26.3 Diarréias Toxigênicas Bacterianas e Terapia de Reposição de Eletrólitos,

1021 26.4 Aminoacidúria Neutra: Doença de

Hartnup, 1026 26.5 Deficiência de Dissacaridases, 1030 26.6 Intervenções Farmacológicas para Evitar Absorção de Gordura e

Obesidade, 1033 26.7 Cálculos de Colesterol, 1036 26.8 A-β-Lipoproteinemia, 1038

27 | PRINCÍPIO DE NUTRIÇÃO I: MACRONUTRIENTES, 1043

27.1 VISÃO GERAL, 1044 27.2 METABOLISMO ENERGÉTICO, 1044 27.3 METABOLISMO DE PROTEÍNAS, 1045 27.4 DESNUTRIÇÃO PROTÉICO-ENERGÉTICA,

1048 27.5 EXCESSIVA INGESTÃO PROTÉICO-

ENERGÉTICA, 1050 27.6 CARBOIDRATOS, 1051 27.7 GORDURAS, 1051 27.8 FIBRAS, 1052 27.9 COMPOSIÇÃO DOS MACRONUTRIENTES

DA DIETA, 1054 BIBLIOGRAFIA, 1059 QUESTÕES E RESPOSTAS, 1060 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 27.1 Dietas Vegetarianas e Necessidades

Protéico-Energéticas para Crianças, 1047

27.2 Ingestão de Proteínas na Dieta e Doença Renal, 1048

27.3 Oferecendo Proteínas e Calorias Adequadas a Pacientes Hospitali-

zados, 1049 27.4 Carga de Carboidratos e Resistência

Atlética, 1052 27.5 Dietas Ricas em Carboidratos Versus Dietas Ricas em Gorduras para

Diabéticos, 1053 27.6 Ácidos Graxos Poliinsaturados e

Fatores de Risco para Doença Cardíaca, 1055

27.7 Adaptação Metabólica: Relação entre Ingestão de Carboi- dratos e Triacilgliceróis no Soro, 1059

28 | PRINCÍPIO DE NUTRIÇÃO II: MICRONUTRIENTES, 1063

28.1 VISÃO GERAL, 1064 28.2 AVALIAÇÃO DE MÁ NUTRIÇÃO, 1064 28.3 INGESTÃO DIETÉTICAS DE REFERÊNCIAS,

1064 28.4 VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS, 1066 28.5 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS, 1073 28.6 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS

LIBERADORAS DE ENERGIA, 1074 28.7 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS

HEMATOPOIÉTICAS, 1079 28.8 OUTRAS VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS,

1082 28.9 MACROMINERAIS, 1084 28.10 MINERAIS TRAÇOS, 1084

BioQ.00 18 22.01.07 16:25:05

CONTEÚDO | XIX

28.11 DIETA AMERICANA: FATO E FALÁCIA, 1087

28.12 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL NA PRÁTICA CLÍNICA, 1087

BIBLIOGRAFIA, 1089 QUESTÕES E RESPOSTAS, 1091 CORRELAÇÕES CLÍNICAS 28.1 Considerações Nutricionais na

Fibrose Cística, 1068 28.2 Osteodistrofia Renal, 1069 28.3 Considerações Nutricionais em

Recém-Nascidos, 1073 28.4 Drogas Anticonvulsivantes e

Necessidades Vitamínicas, 1074

28.5 Considerações Nutricionais em Alcoólatras, 1076

28.6 Necessidades de Vitamina B6 em Usuários de Contraceptivos Orais, 1078

28.7 Polimorfirmos Genéticos e Necessidades de Ácido Fólico, 1081

28.8 Dieta e Osteoporose, 1085 28.9 Necessidades Nutricionais de

Idosos, 1089

APÊNDICE REVISÃO DE QUÍMICA ORGÂNICA, 1094GLOSSÁRIO, 1107ÍNDICE, 1134

BioQ.00 19 22.01.07 16:25:06

CAPÍTULO 1 ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA | 1

ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICAThomas M. Devlin

PARTE 1 ESTRUTURAS DE MACROMOLÉCULAS

104.5o�+ �+

O

�–

H H 1

1.1 VISÃO GERAL: CÉLULAS E COMPARTIMENTOS CELULARES, 2

1.2 ÁGUA, pH E SOLUTOS: O AMBIENTE AQUOSO DAS CÉLULAS, 3Pontes de hidrogênio formam-se entre moléculas

de água, 3Água tem propriedades singulares como solvente,

4Algumas moléculas dissociam-se formando cátions

e ânions, 5Água é um eletrólito fraco, 6Muitas moléculas biologicamente importantes são

ácidos ou bases fracos, 6 Ácido carbônico, 7Equação de Henderson-Hasselbalch define a rela-

ção entre pH e concentrações de ácido e base conjugados, 8

Tamponamento é importante para controlar o pH, 9

1.3 COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS: PAPÉIS FUNCIONAIS DE ORGANELAS SUBCE-LULARES E SISTEMAS DE MEMBRANAS, 11Composição química geral das células, 12Papel funcional de organelas subcelulares e siste-

mas de membranas, 13 Membrana Plasmática é a fronteira de uma

célula, 13 Núcleo é local de síntese de DNA e RNA, 13

Retículo endoplasmático participa da síntese protéica e de muitas vias de síntese, 13

Complexo de Golgi está envolvido na secreção de proteínas, 14

Mitocôndria fornece a maior parte do ATP de que a célula necessita, 14

Lisossomos são necessários para digestão intrace-lular, 15

Peroxissomos desempenham papel importante no metabolismo de lipídeos, 17

Citoesqueleto organiza o conteúdo intracelular, 18

Citosol contém componentes celulares solúveis, 18

1.4 INTEGRAÇÃO E CONTROLE DAS FUNÇÕES CELULARES, 19

BIBLIOGRAFIA, 20

QUESTÕES E RESPOSTAS, 20

CORRELAÇÕES CLÍNICAS1.1 Concentração Sangüínea de Bicarbonato na

Acidose Metabólica, 101.2 Doenças Mitocondriais, 151.3 Enzimas Lisossomais e Gota, 161.4 Deficiência de Lipase Ácida Lisossomal, 181.5 Doenças da Biogênese de Peroxissomos

(PBDs), 19

BioQ.01 1 22.01.07 16:09:40


1.3

| COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS: PAPÉIS FUNCIONAIS DE ORGANELAS SUBCELULARES E SISTEMAS DE MEMBRANAS

Células eucarióticas contêm organelas celulares bem definidas, como núcleo, mitocôndrias, lisossomos e peroxissomos, todos delimitados por uma membrana (Figura 1.9). Membranas formam uma rede tubular por toda a célula, o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, englobando um espaço interconectado ou cis-ternas, respectivamente. A natureza lipídeo-proteína das membranas celulares (ver p. 455) impede rápi-do movimento de muitas moléculas, incluindo água, de um compartimento para outro. Mecanismos específicos para deslocamento de moléculas pequenas e grandes, carregadas ou não-carregadas, permitem que as várias membranas modulem concentrações de substâncias em seus compartimentos. Citosol e compartimento fluido de organelas têm composição distinta em íons inorgâni-cos, moléculas orgânicas, proteínas e ácidos nucléicos.

Partição de atividades e componentes em espaços delimitados por membranas tem muitas vantagens para a economia da célula, incluindo (a) seqüestro de subs-tratos, cofatores e enzimas para maior eficiência me-tabólica e (b) ajuste de pH e composição iônica para máxima atividade de processos biológicos.

As atividades e a composição de estruturas e organe-las celulares são determinadas em células intactas por métodos histoquímicos, imunológicos e de coloração fluorescente. Observações contínuas em tempo real de eventos celulares em células intactas viáveis são possí-veis. Por exemplo, mudanças de pH e de concentração de íon cálcio podem ser estudadas no citosol pelo uso de indicadores íon-específicos. Organelas individuais, membranas e componentes do citosol podem ser isola-dos e analisados após rompimento da membrana plas-mática. Técnicas para romper membranas incluem uso de detergentes, choque osmótico ou homogeneização de tecidos, onde o atrito quebra a membrana plasmática. Em meios de isolamento apropriados, organelas celula-res e sistemas de membranas podem ser separados por centrifugação, graças a diferenças em tamanho e densi-dade. Essas técnicas permitiram isolamento de frações celulares da maioria dos tecidos de mamíferos. Além disso, componentes de organelas, como mitocôndrias e peroxissomos, podem ser isolados após rompimento da membrana da organela. Pelo uso dessas várias técnicas, as atividades e as funções dos vários compartimentos celulares foram estudadas.

Núcleo

Nucléolo

Membrana nuclear

Cromatina

Ribossomoslivres

Retículoendoplasmático

Lisossomos Membrana celular

Mitocôndria

Vacúolo

Complexode Golgi

Centríolos

(b)

(a)

Ly

G

ER

P

M

Núcleo

Nucléolo

ER

M

FIGURA 1.9(a) Micrografia eletrônica de uma célula de fígado de rato, marcada para indicar os principais componentes estruturais de células eucarióticas e (b) desenho esquemático de uma célula animal. Note o número e a variedade de organelas subcelulares e a rede de membranas interconectadas que delimitam canais ou cisternas. Nem todas as células eucarióticas são tão complexas em sua aparência, mas a maioria contém as principais estruturas mostradas. ER, retículo endoplasmático; G, zona do Golgi; Ly, lisossomo; P, peroxissomo; M, mitocôndria.Fotografia (a) reimpressa com permissão de Dr. K. R. Porter de Porter, K. R., e Bonneville, M. A. Em: Fine Structure of Cells and Tissues. Philadelphia: Lea & Febiger, 1972; esquema (b) reimpresso com permissão de Voet, D., e Voet, J. G. Biochemistry, 2ª ed., New York, Wiley, 1995. © (1995) John Wiley & Sons, Inc.

Núcleo

Nucléolo

Membrana nuclear

Cromatina

Ribossomoslivres

Retículoendoplasmático

Lisossomos Membrana celular

Mitocôndria

Vacúolo

Complexode Golgi

Centríolos

(b)

(a)

Ly

G

ER

P

M

Núcleo

Nucléolo

ER

M

BioQ.01 11 22.01.07 16:09:57


pendência mútua. Estima-se que esse evento possa ter ocorrido há cerca de três bilhões de anos. A herança mitocondrial ocorre por transmissão materna e tem sido possível estudar o movimento global humano por avaliação das variações em mtDNA. Mitocôndrias tam-bém têm os RNAs (ver p. 66) e enzimas necessárias para catalisar a síntese de algumas proteínas. A maioria das proteínas mitocondriais, entretanto, derivaram de genes presentes no DNA nuclear e são sintetizadas em ribossomos livres no citosol, depois importadas para a organela. Há várias centenas de doenças genéticas de atividades mitocondriais; algumas resultam de muta-ções no DNA nuclear que codifica proteínas mitocon-driais, enquanto outras resultam de mutações no DNA mitocondrial (ver Corr. Clín. 1.2).

Lisossomos São Necessários para Digestão Intracelular

Lisossomos são responsáveis pela digestão intrace-lular de substâncias extracelulares e intracelulares. Com uma única membrana delimitante, mantêm uma matriz com pH ácido de cerca de 5. Encapsulada nes-sas organelas está uma classe de enzimas glicoprotéi-cas – hidrolases – que catalisam clivagem hidrolítica de ligações carbono-oxigênio, carbono-nitrogênio, carbo-

no-enxofre e oxigênio-fósforo em proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucléicos. Uma lista parcial das enzimas lisossomais é apresentada na Tabela 1.7. Hi-drolases lisossomais são mais ativas em pHs ácidos e quebram moléculas complexas em compostos simples de baixo peso molecular que podem ser reutilizados. A relação entre pH e atividade enzimática é discutida na p. 368.

O conteúdo enzimático dos lisossomos varia em di-ferentes tecidos e depende das funções específicas do tecido. A membrana lisossomal contém mediadores e receptores protéicos específicos, bem como transporta-dores para deslocamento de substâncias através dela. Lisossomos isolados só catalisam hidrólise de subs-tratos adicionados quando a membrana lisossomal é rompida. Rompimento da membrana em células leva à digestão celular. Várias condições patológicas têm sido atribuídas à liberação de enzimas lisossomais, incluin-do artrite, respostas alérgicas, várias doenças muscula-res e destruição tecidual induzida por drogas (ver Corr. Clín. 1.3).

CORRELAÇÃO CLÍNICA 1.2

Doenças Mitocondriais

A primeira doença (doença de Luft) envolvendo es-pecificamente transdução de energia mitocondrial foi relatada em 1962. Uma paciente de 30 anos de idade apresentava fraqueza generalizada, transpi-ração excessiva, alta ingesta calórica sem ganho de peso e taxa de metabolismo basal muito elevada (uma medida da utilização de oxigênio). Ela tinha um defeito no mecanismo que controla a utilização de oxigênio pela mitocôndria (ver Capítulo 14). Desde então, várias centenas de anomalias gené-ticas foram identificadas que levam a alterações em enzimas, ácidos ribonucléicos, componentes do transporte de elétrons e sistemas de transporte de membranas mitocondriais. Mutações no mtDNA bem como no DNA nuclear levam a doenças gené-ticas mitocondriais. A primeira doença identificada que se deve a uma mutação no mtDNA foi Neuropa-

tia Óptica Hereditária de Leber, que leva a ceguei-ra súbita no início da idade adulta. Muitas doenças mitocondriais envolvem músculo esquelético e sis-tema nervoso central. Lesões no DNA mitocondrial podem ocorrer, devido a radicais livres (superóxi-dos) formados nas mitocôndrias. Anomalias nas mitocôndrias têm sido implicadas na patofisiologia de esquisofrenia, doença bipolar e doenças dege-nerativas relacionadas com idade, como a doença de Parkinson, de Alzheimer e cardiomiopatias. Re-centemente, sugeriu-se que uma única mutação em um tRNA mitocondrial levaria a uma constelação de sintomas, incluindo hipertensão, colesterol ele-vado no sangue e níveis baixos de Mg2+ no plasma. Ver as seguintes Correlações Clínicas para detalhes de doenças mitocondriais: 6.5, p. 217; 14.4, p. 564; 14.5, p. 564; 14.6, p. 565; e 14.7, p. 567.

Fonte: Luft, R. The development of mitochondrial medicine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8731, 1994; Chalmers, R.M. e Schapira, A.H.V. Clinical, biochemical and molecular genetic features of Leber’s hereditary optic neuropathy. Biochim. Biophys. Acta 1410:147, 1999; Wallace, D.C. Mitochondrial DNA in aging and disease. Sci. Am. 280:40, 1997; e Wallace, D.C. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283:1482, 1999.

BioQ.01 15 22.01.07 16:10:00


1.4 | INTEGRAÇÃO E CON-TROLE DAS FUNÇÕES CELULARES

Uma célula eucariótica é uma estrutura complexa que mantém um ambiente intracelular que permite que muitas reações complexas e funções ocorram com a máxima eficiência possível. Células de organismos mul-ticelulares também participam da manutenção do bem-estar de todo o organismo, exercendo influências umas sobre as outras para manter equilíbrio entre atividades tissulares e celulares. Processos intracelulares e vias metabólicas são muito bem controlados e integrados para conseguir esse equilíbrio. Pouquíssimas funções operam de modo totalmente independente; mudanças em uma função podem exercer uma influência, positiva ou negativa, sobre outras funções. Como será descrito ao longo deste livro, controles de função são mediados em muitos níveis, desde a expressão de um gene para alterar a concentração de uma enzima ou proteína efe-tora, até mudanças em níveis de substrato ou coenzi-ma para ajustar a velocidade de uma reação enzimática específica. A integração de muitos processos celulares é controlada por proteínas que funcionam como ativa-dores ou inibidores, que mantêm homeostase celular. Muitos processos celulares são programados para ocor-rerem em condições específicas; por exemplo, divisão

Peroxissomos são responsáveis por várias reações metabólicas importantes, incluindo síntese de glice-rol éteres, encurtamento de ácidos graxos de cadeia muito longa para que as mitocôndrias possam oxi-dá-los completamente, e oxidação da cadeia lateral do colesterol necessária à síntese de ácidos bilia-res. Doenças de biogênese de peroxissomos (PBDs) compreendem mais de 25 doenças genética e fenoti-picamente relacionadas que envolvem atividades en-zimáticas de peroxissomos. São doenças autossômi-cas recessivas raras que se caracterizam por níveis diminuídos de lipídeos glicerol-éteres (plasmalo-gênios), níveis aumentados de ácidos graxos de ca-deias muito longas (C24 e C26) e de derivados do áci-do colestanóico (precursores de ácidos biliares). As

Fonte: Wanders, R. J., Schutgens, R. B., e Barth, P. G. Peroxissomal disorders: A review. J. Neuropathol. Exp. Neu-rol. 54: 726, 1995; FitzPatrick, D. R., Zellweger syndrome and associated phenotypes. J. Med. Genet. 33:863, 1996; e Warren, D.S., Wolfe, B. D. e Gould, S. J. Phenotype-genotype relationships in PEX10-deficient peroxisome biogenesis disorder patients. Hum. Mutat. 15:509, 2000.


Doenças de Biogênese de Peroxissomos (PBDs)

doenças podem afetar fígado, rim, cérebro e sistema esquelético. A mais grave é síndrome de Zellweger, que se deve à ausência de peroxissomos funcionais; morte freqüentemente ocorre por volta dos 6 meses de idade. Nessa condição, o defeito genético está no mecanismo para importar enzimas para a matriz dos peroxissomos. Algumas condições PBD são cau-sadas por mutações de splice doador ou de sentido errado (missense) (ver p. 158); em algumas, há au-sência de uma única enzima metabólica ou defeito em um componente do transporte de membranas. Em alguns casos, a doença pode ser diagnosticada antes do nascimento por ensaio de enzimas de pero-xissomos ou de ácidos graxos em células do líquido amniótico.

celular em células normais só ocorre quando os pro-cessos necessários à divisão celular são ativados (ver p. 989). Então, e somente então, ocorre uma série de reações ordenadas e integradas, culminando na divisão de uma célula em duas células filhas. Um processo fas-cinante é apoptose, morte celular programada, tam-bém chamada suicídio celular (ver p. 993). Esse pro-cesso cuidadosamente regulado ocorre em células de todos os tecidos de mamíferos, mas etapas individuais do processo variam de tecido para tecido. Muitas doen-ças devem-se a erro em mecanismos específicos de con-trole. À medida que alguém amplia sua compreensão da complexidade de células biológicas, esse alguém fica admirado de que não ocorram muito mais erros e de que não existam muito mais indivíduos com condições anormais. Assim, à medida que prosseguimos para o es-tudo de componentes químicos separados e atividades de células em capítulos subseqüentes, é importante não esquecer as atividades concomitantes e vizinhas, limi-tações e influência do ambiente. Só conciliando todas as partes e atividades de uma célula – isto é, montando o quebra-cabeça – é que apreciaremos a maravilha das células vivas.

BioQ.01 19 22.01.07 16:10:03

CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA | 23

DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURAStephen A. Woski e Francis J. Schmidt


2

2.1 VISÃO GERAL, 24 Dogma central da biologia molecular, 24 DNA pode transformar células, 24 Capacidade de informação do DNA é enorme, 25

2.2 COMPONENTES ESTRUTURAIS DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS: NUCLEOBASES, NUCLEOSÍDEOS E NUCLEOTÍDEOS, 26

Propriedades físicas de nucleosídeos e nucleotí- deos, 26

Propriedades estruturais de nucleosídeos e nu- cleotídeos, 27

2.3 ESTRUTURA DO DNA, 28 Estrutura polinucleotídica, 28 Conformações dos polinucleotídeos, 29 Estabilidade do Esqueleto polinucleotídico,

30 DNA dupla-hélice, 31 Fatores que estabilizam DNA dupla-hélice,

34 Desnaturação e renaturação, 35 Hibridização, 36 Conformações do DNA dupla-hélice, 39 Estruturas não-canônicas de DNA, 40 DNA dobrado, 41 DNA cruciforme, 41 DNA tripla-fita, 43 DNA quatro-fitas, 44 DNA deslocado, 46

2.4 ORDEM SUPERIOR DA ESTRUTURA DO DNA, 47 DNA genômico pode ser linear ou circular, 47 DNA é super-hélice, 49 Topoisomerases, 50

Empacotamento do DNA procariótico, 51 Organização da cromatina eucariótica, 54 Nucleossomos e polinucleossomos, 55 Empacotamento de polinucleossomos em

estruturas superiores, 56

2.5 SEQÜÊNCIA E FUNÇÃO DO DNA, 57 Endonucleases de restrição e palíndromes, 57 A maior parte do DNA procariótico codifica pro-

teínas específicas, 58 Apenas uma pequena percentagem do DNA euca-

riótico consisde de genes funcionais, 59 Seqüências repetidas, 60

2.6 ESTRUTURA DO RNA, 61 RNA é um polímero de ribonucleosídeos 5-mono

fosfato, 61 Estrutura secundária do RNA envolve pareamen-

to de bases intramolecular, 61 Moléculas de RNA têm estruturas terciárias, 62

2.7 TIPOS DE RNA, 64 RNA transportador tem duas funções: ativar

aminoácidos e reconhecer códons no mRNA, 64

RNA ribossômico é parte do aparelho de síntese protéica, 65

RNAs mensageiros carregam a informação para a estrutura primária de proteínas, 66

Mitocôndrias contêm espécies peculiares de RNA, 66

RNA em partículas ribonucleoprotéicas, 67 RNA catalítico: ribozimas, 67 RNAs podem ligar outras moléculas, 68 RNAs controlam tradução, 69

BioQ.02 23 22.01.07 16:20:49

28 | PARTE 1 ESTRUTURA DE MACROMOLÉCULAS

os átomos de carbono desse arranjo lembram a letra S; por isso, essa conformação é às vezes chamada confor-mação-Sul. Na segunda torção comum, C3’ é deslocada em direção à face endo e é chamada C3’-endo. Os car-bonos da pentose desenham uma letra N, produzindo a conformação-Norte. É notável que os grupos ligados ao açúcar fiquem em orientações muito diferentes em cada uma dessas conformações. Por exemplo, grupos 5’- e 3’-fosfatos ficam muito mais afastados na torção C2’-endo do que na C3’-endo. A orientação da ligação glicosídica também muda significativamente nas duas conformações.

Conformações C2’-endo e C3’-endo estão em rápido equilíbrio. Um substituinte eletronegativo na posição 2’ da pentose favorece a conformação C3’-endo. Portan-to, ribonucleosídeos em RNA preferem essa torção do açúcar. Fatores adicionais como pontes de hidrogênio entre o grupo 2’-OH e o átomo O4’ do resíduo vizinho deslocam o equilíbrio para a conformação C3’-endo. Entretanto, os 2’-desoxinucleosídeos do DNA contêm um hidrogênio em lugar do grupo 2’-OH, e a conforma-ção C2’-endo é preferida.

As bases em nucleosídeos são planas. Embora rota-ção livre em torno da ligação glicosídica seja possível, duas orientações da base em relação ao açúcar predo-minam (Figura 2.7). Em purinas, a conformação anti coloca H8 sobre o açúcar, enquanto a conformação syn posiciona esse átomo longe do açúcar e a maior parte da purina bicíclica sobre o açúcar. Em pirimidinas, o áto-mo H6 fica acima do anel de pentose na conformação anti, e o átomo O2, maior, fica acima do anel na confor-mação glicosídica syn. Pirimidinas, portanto, mostram uma grande preferência pela conformação com menos impedimento estérico anti. Purinas rapidamente se interconvertem entre as duas conformações, mas favo-recem a orientação anti. Contudo, guanina 5’-nucleotí-deos são exceções. Nesses casos, interações favoráveis entre o grupo 2-NH2 e o grupo 5’-fosfato estabilizam a conformação syn. 2’-Desoxiguanosina 5’-monofosfato (dGMP), por exemplo, prefere a conformação glicosí-

dica syn. Essa preferência também foi observada em DNA fita-dupla com seqüências de Gs e Cs alternados. A conformação syn dos resíduos G nesses DNAs resulta na formação de uma hélice pouco usual, que gira para a esquerda (ver p. 40).

2.3 | ESTRUTURA DO DNA

Estrutura PolinucleotídicaÁcidos nucléicos são fitas de nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster (Figura 2.8). O comprimento dessas fitas varia consideravelmente, de dois resíduos a centenas de milhões de resíduos. Tipicamente, fitas de ácidos nucléicos contendo ≤50 nucleotídeos são chama-dos oligonucleotídeos, enquanto os mais longos são polinucleotídeos. A ligação fosfodiéster liga o grupo 5’-hidroxila de um resíduo ao grupo 3’-hidroxila do se-guinte. Ligações entre dois 5’-OHs ou dois 3’-OHs não são vistas em DNA de ocorrência natural. A direcio-nalidade dessa ligação significa que oligo- e polinu-cleotídeos lineares têm uma extremidade que termi-na em um 5’-OH e outra que termina em 3’-OH. Essas extremidades são extremidade 5’ e extremidade 3’, respectivamente. Em muitos polinucleotídeos, uma ou ambas as extremidades são quimicamente modificadas com resíduos de grupos fosfatos ou aminoácidos. Poli-nucleotídeos circulares não têm nenhuma extremidade livre, e são formados unindo-se a extremidade 5’ de um polinucleotídeo linear com sua própria extremidade 3’ por uma ligação fosfodiéster.

FIGURA 2.6Conformações preferenciais de açúcares pentoses.Duas conformações produzem variações na orientação relativa da base (com relação ao açúcar) e na distância entre os grupos 3’- e 5’-fosfato (P). Finalmente, essas diferenças afetam a conformação geral do complexo dupla-hélice.

FIGURA 2.7Conformações glicosídicas de purinas e pirimidinas.Em pirimidinas, fatores estéricos entre o açúcar e O2 da base desfavorecem fortemente a conformação syn. Em purinas, as conformações anti e syn se interconvertem facilmente, com anti sendo mais estável na maioria dos casos. A conformação syn é estabilizada em guanosina 5’-fosfato, devido a interações favoráveis entre o grupo 2-NH2 e os oxigênios do fosfato.

baseO

OP

OP

7.0 Å C-2� ��“Sul”

O baseOP

OP5.9 Å

C-3� ��“Norte”

NH

H

H

HO

OH

anti syn

HO

H 8

26

N

O

OO

NH2

NH2

H2N

NN

HO

anti

O ON

N

OH

HO

OH

O NN

N

N

HO

H

H

HHO

NH2

syn

OH

N

OH

O

N

BioQ.02 28 22.01.07 16:20:54


A estrutura local tridimensional do DNA é impor-tante em interações com proteínas envolvidas em reparo, transcrição, recombinação e condensação da cromatina. Foi proposto que antibióticos possam induzir formação de estruturas de DNA que podem recrutar essas proteínas com resultados citotóxicos. O exemplo melhor estudado é a droga antitumoral cisplatina, um complexo tetracoordenado de plati-na [cis-Pt(NH2)2CL2]. Cisplatina é usada sozinha ou em combinação com outros agentes antitumorais para tratar uma variedade de tumores, incluindo câncer testicular, ovariano, ósseo e pulmonar. For-ma ligações cruzadas inter- e intra-fitas em DNA dupla-fita com o último aducto compreendendo 90% das lesões do DNA. Essas ligações surgem do deslo-camento de cloretos ligados à platina por átomos N7 de duas guaninas vizinhas. Estudos estruturais de DNA com aducto fazendo ligação cruzada intra-fita mostra que a dupla hélice é fortemente dobrada em direção à fenda maior.

Estruturas dobradas de aductos DNA-cisplatina são reconhecidas especificamente por várias proteí-nas que se ligam ao DNA, tais como proteínas do re-paro por excisão de nucleotídeos (NER) e proteínas não-histonas que se ligam ao DNA como HMG-1. A

citotoxicidade da cisplatina é um processo compli-cado mediado por interações específicas com essas proteínas. Processos celulares como transcrição e apoptose são afetados e os complexos aducto-pro-teína provavelmente interferem com transcrição. Proteínas NER são recrutadas para reparar a lesão, mas reparo por excisão está sujeito a introduzir que-bras de fita no DNA. Acúmulo dessas quebras indu-zirá, finalmente, apoptose, quando o DNA se tornar danificado demais para funcionar. Mecanismos se-melhantes foram propostos como responsáveis pela citotoxicidade de outras drogas que ligam ao DNA, como ditercalinium, uma molécula bifuncional que forma aductos não-covalentes com DNA que tam-bém fica fortemente dobrado. Acredita-se que cito-toxicidade surja da indução da via de reparo aborti-vo, que leva a quebras da fita de DNA. Interações do aducto cisplatina-DNA com proteínas HMG também podem contribuir para sua citotoxicidade. Ligação de proteínas HMG pode sinalizar incorretamente que a região danificada do DNA é transcripcional-mente ativa e impedir condensação em estruturas de cromatina enovelada. Esses complexos também perpetuam a lesão, porque bloqueiam o aducto DNA-cisplatina impedindo reparo.

Fonte: Zamble, D.B. e Lippard, S.J. The response of cellular proteins to cisplatin-damaged DNA. In: B. Lippert (Ed.) Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug. New York: Wiley-VCH, 1999, pp. 73-134; e Lambert, B., Segal-Bendirjian, E., Esnault, C., Le Pecq, J.-B., Roques, B.P., Jones, B. e Yeunf, A.T. Recognition by the DNA repair system of DNA structural alterations induced by reversible drug-DNA interactions. Anti-Cancer Drug Des. 5:43, 1990.

��

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Antibióticos Antitumorais que Mudam a Forma do DNA

BioQ.02 42 22.01.07 16:21:15

CAPÍTULO 2 DNA E RNA: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA | 61

mente 300 pb de comprimento e são repetidas mais de 500.000 vezes. As estruturas das repetições dispersas curtas, incluindo família Alu, são remanescentes de transposons.

Aproximadamente 1-15% do DNA genômico eucari-ótico consiste de seqüências tipicamente menores do que 20 nucleotídeos reiteradas milhares ou milhões de vezes. A maioria das seqüências altamente reite-radas tem uma composição em bases característica, e elas podem ser isoladas fragmentando-se o DNA em segmentos de algumas centenas de nucleotídeos e se-parando-se os fragmentos por centrifugação em gra-diente de densidade. Esses fragmentos são chamados DNA satélite, porque aparecem como satélites das bandas que contêm a maior parte do DNA após centri-fugação. Outras seqüências altamente reiteradas, que não podem ser isoladas por centrifugação, podem ser identificadas por sua propriedade de rápido reanela-mento. Esses DNAs altamente reiterados são também chamados DNAs de seqüência simples. Seqüências simples estão tipicamente presentes no DNA da maio-ria dos eucariotos, se não de todos. Em algumas espé-cies, uma seqüência principal está presente, enquanto em outras, várias seqüências simples são repetidas até um milhão de vezes. DNAs de seqüência simples po-dem freqüentemente ser isolados, como DNA satélite. O encontrado no centrômero de eucariotos superiores consiste de milhares de cópias em seqüência de uma ou de algumas poucas seqüências curtas. Seqüências satélites têm apenas 5-10 pb de comprimento e são um constituinte dos telômeros, onde têm um papel bem definido na replicação do DNA. Alguns DNAs de se-qüência simples mais longos foram identificados. Por exemplo, no genoma do macaco verde africano, um segmento de 172 pb que contém algumas repetições de seqüências é altamente reiterado.

Repetições invertidas são motivos estruturais do DNA. Repetições invertidas curtas, consistindo de até seis nucleotídeos de comprimento (p. ex., a seqüência palindrômica GAATTC), ocorrem por acaso uma vez a cada 3.000 nucleotídeos. Tais repetições curtas não po-dem formar uma estrutura cruciforme estável, como a formada por seqüências palindrômicas mais longas. Se-qüências repetitivas invertidas que são suficientemente longas para formar cruciformes estáveis, é pouco prová-vel que ocorram por acaso, e deveriam ser classificadas como uma classe separada de seqüências eucarióticas. No DNA humano, cerca de dois milhões de repetições invertidas estão presentes, com um comprimento mé-dio de cerca de 200 pb; entretanto, seqüências inverti-das com mais de 1.000 pb já foram detectadas. A maio-ria das seqüências repetidas invertidas é repetida 1.000 ou mais vezes por célula.

2.6 | ESTRUTURA DO RNA

RNA é um Polímero de Ribonucleosídeo 5’-MonofosfatosRNA é um polímero linear de ribosídeos monofosfatos. As bases púricas do RNA são adenina e guanina; as piri-mídicas são citosina e uracil. Exceto por uracil, que subs-titui timina, são as mesmas bases encontradas no DNA. Nucleotídeos de A, C, G e U são incorporados no RNA durante transcrição. Muitos RNAs também contêm nu-cleotídeos modificados, que são produzidos por proces-samento. Nucleotídeos modificados são especialmente característicos de espécies de RNAs estáveis (i.é, tRNA e rRNA); contudo, alguns nucleotídeos metilados estão também presentes em mRNA eucariótico. Na sua maior parte, nucleotídeos modificados no RNA têm papel no “ajuste fino”, e não funções indispensáveis na célula.

As ligações 3’,5’-fosfodiéster do RNA formam um es-queleto, a partir do qual as bases se estendem (Figura 2.51). RNAs eucarióticos variam de aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento a mais de 200.000 nu-cleotídeos. Cada RNA é complementar à seqüência de bases de porções específicas de apenas uma das fitas do DNA. Portanto, ao contrário da composição em bases do DNA, as relações molares (A + U) e (G + C) no RNA não são iguais. RNA celular é linear e de fita-única, mas RNA fita-dupla está presente em certos genomas virais.

Quimicamente, RNA é semelhante a DNA. Ambos contêm ligações fosfodiéster carregadas negativamen-te, e as bases são quimicamente muito semelhantes. As diferenças químicas entre DNA e RNA devem-se prin-cipalmente a dois fatores. Primeiro, RNA contém ribose em lugar de 2’-desoxirribose como açúcar componente do nucleotídeo, e segundo, RNAs geralmente são fita-única em lugar de dupla-fita.

O grupo 2’-hidroxila torna as ligações fosfodiéster de uma molécula de RNA mais susceptível à hidrólise química, especialmente em soluções alcalinas, do que as do DNA. A instabilidade química do RNA reflete-se em sua instabilidade metabólica. Alguns RNAs, como mRNA bacteriano, são sintetizados, usados e degrada-dos em minutos. Outros, como rRNA humano, são mais estáveis metabolicamente, com tempo de vida medido em dias. Entretanto, mesmo os RNAs mais estáveis, são menos estáveis que o DNA.

Estrutura Secundária do RNA Envolve Pareamento de Bases Intramolecular Como moléculas de RNA são fita-única, geralmente não formam extensas duplas-hélices. Em vez disso, a estrutura secundária de uma molécula de RNA resul-ta de regiões relativamente curtas com pareamento de

BioQ.02 61 22.01.07 16:21:40

CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA | 73

PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURARichard M. Schultz e Michael N. Liebman


3

3.1 PAPÉIS FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS NO HO-MEM, 74

3.2 COMPOSIÇÃO EM AMINOÁCIDOS DE PROTEÍ-NAS, 75

Aminoácidos comuns, 75 Cadeias laterais definem a natureza química e

as estruturas de α-aminoácidos, 76 Cistina é um aminoácido derivado, 78 Aminoácidos têm um centro de assimetria,

78 Aminoácidos São Polimerizados em Peptídeos e

Proteínas, 78

3.3 PROPRIEDADES DE CARGAS E QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS, 81

Grupos ionizáveis de aminoácidos e proteínas são críticos para a função biológica, 81

Forma iônica de um aminoácido ou uma pro- teína pode ser determinada em dado pH, 82

Titulação de um ácido monoamino-monocar- boxílico: determinação do pH isoelétrico, 82

Titulação de um ácido monoamino-dicarboxí- lico, 83

Relação geral entre as propriedades de carga de aminoácidos e proteínas, e pH, 83

Aminoácidos e proteínas podem ser separados com base em valores de pI, 84

Cadeias laterais de aminoácidos têm propriedades polares e apolares, 84

Aminoácidos sofrem várias reações químicas, 87

3.4 ESTRUTURA PRIMÁRIA DE PROTEÍNAS, 88

3.5 NÍVEIS SUPERIORES DE ORGANIZAÇÃO PRO-TÉICA, 90

Estrutura secundária, 90 Estrutura em α-hélice, 91 Estrutura-β, 92 Motivos estruturais e dobras das proteínas,

92 Estrutura terciária, 93 Estrutura quaternária, 94 Bioinformática relaciona estrutura e função das

proteínas como produtos gênicos, 95 Estruturas de dobras homólogas são freqüente-

mente formadas a partir de seqüências de aminoácidos não-homólogas, 96

3.6 OUTROS TIPOS DE PROTEÍNAS, 97 Proteínas fibrosas: colágeno, elastina, queratina e

tropomiosina, 98 Colágeno, 98 Composição em aminoácido do colágeno, 98 Seqüência de aminoácido do colágeno, 98 Estrutura do colágeno, 99 Formação de ligações covalentes cruzadas no

colágeno, 100 Elastina é uma proteína fibrosa com ligações cru-

zadas geradas por alisina, 100 Queratina e tropomiosina, 102 Lipoproteínas plasmáticas são complexos de lipí-

deos com proteínas, 102 Glicoproteínas contêm carboidratos ligados cova-

lentemente, 107 Ligações covalentes carboidrato-proteína, 107

BioQ.03 73 22.01.07 16:30:59

CAPÍTULO 3 PROTEÍNAS I: COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA | 81

3.3 | PROPRIEDADES DE CARGAS E QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

Grupos Ionizáveis de Aminoácidos e Proteínas São Críticos para a Função BiológicaGrupos ionizáveis comuns a proteínas e aminoácidos são mostrados na Tabela 3.3. As formas ácidas estão à esquerda do sinal de equilíbrio, e as formas básicas do lado direito. Ao formar sua base conjugada, a forma áci-da libera um próton. Ao contrário, a forma básica asso-cia-se com um próton para formar o respectivo ácido. A dissociação de um ácido é caracterizada por uma cons-tante de dissociação ácida (Ka) e seu valor de pKa: pKa = log10 (1/Ka). Tabela 3.3 mostra a faixa de valores de pK ’a para cada grupo ácido, porque o pKa real depende do meio no qual o grupo ácido está colocado. Por exem-

plo, quando um grupo amônio carregado positivamente (−NH3

+) é colocado perto de um grupo carregado nega-tivamente em uma proteína, a carga negativa estabiliza a forma ácida carregada positivamente, tornando mais difícil a dissociação do seu próton. O pKa do −NH3

+ terá um valor maior do que o normal para um grupo amônio na ausência de uma estabilização por uma carga nega-tiva próxima.

Outros fatores, além da carga, que afetam o pKa incluem polaridade do meio, ausência ou presença de água e potencial para formação de pontes de hidrogê-nio. Além disso, grupos ácidos (α-COOH ou α-NH3

+) nas extremidades dos polipeptídeos tipicamente têm um valor de pKa mais baixo do que os mesmos tipos de grupos ácidos nas cadeias laterais (Tabela 3.4). Os ami-noácidos cujos grupos R contêm átomos de nitrogênio (Lys e Arg) são os aminoácidos básicos, uma vez que suas cadeias laterais têm valores relativamente altos de pKa e funcionam como bases em pH fisiológico. Eles estão geralmente em sua forma ácida e carregada posi-tivamente em pH fisiológico. Aminoácidos cujas cadeias laterais contêm um grupo carboxílico têm valores de pKa relativamente baixos que facilmente perdem seus prótons e são aminoácidos acídicos. Estão predomi-

TABELA 3.3 Valores de pKa característicos para os Grupos Ácidos Comuns em Proteínas

Onde o Grupo Ácido É Encontrado Forma Ácida Forma Básica Faixa Aproximada de pKa Para o Grupo

NH2-terminal ou cadeia lateral de lisina

R—NH3+

Amônia ↔ R—NH2 + H+

Amina 7,6–10,6

COOH-terminal ou cadeias laterais de glutamato e aspartato

R—COOHÁcido carboxílico ↔ R—COO– + H+

Carboxilato 3,0–5,5

Cadeia lateral de arginina R—NH—C+

—… NH2 |

NH2Guanidínio

↔

R—NH—C=NH + H | NH2

Guanidino

11,5–12,5

Cadeia lateral de cisteína R—SHTiol ↔ R—S– + H+

Tiolato 8,0–9,0

Cadeia lateral de histidina R—C=CH | | HN +NH C H

Imidazólio

↔

R—C=CH | | HN N+H+

C H

Imidazol

6,0–7,0

Cadeia lateral de tirosina

R— —OH

Fenol

↔R— —OH–+H+

Fenolato

9,5–10,5

TABELA 3. 4 pKa da Cadeia Lateral e Grupos Ácidos Terminais em Ribonuclease

—NH3+ —COOH

Cadeia lateral Lisina 10,2 Glu e Asp 4,6

Final da cadeia N-terminal = 7,8 C-terminal = 3,8

nantemente em sua forma desprotonada e carregada negativamente em pH fisiológico. Proteínas nas quais a razão (∑Lys + ∑Arg)/(∑Glu + ∑Asp) é maior do que 1 são proteínas básicas. Proteínas, nas quais a razão é menor do que 1, são proteínas ácidas.

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Proteínas Fibrosas: Colágeno, Elastina, Queratina e TropomiosinaProteínas fibrosas caracteristicamente têm quanti-dades maiores de estrutura secundária regular, uma forma cilíndrica longa (tipo bastão), baixa solubilidade em água e uma função estrutural em lugar de um papel dinâmico. Exemplos de proteínas fibrosas com essas ca-racterísticas são colágeno, queratina e tropomiosina.

Colágeno Colágeno é uma família de proteínas presente em to-dos os tecidos e órgãos e fornece o arcabouço que dá aos tecidos sua forma e resistência. A porcentagem de colágeno por peso para alguns tecidos e órgãos huma-nos representativos é: fígado 4%, pulmão 10%, aorta 12-24%, cartilagem 50%, córnea 64%, osso cortical to-tal 23% e pele 74% (ver Corr. Clín. 3.4).

Composição em Aminoácidos do ColágenoA composição do colágeno tipo I de pele e das proteí-nas globulares ribonuclease e hemoglobina são dadas na Tabela 3.10. Colágeno de pele é rico em glicina (33% de seus aminoácidos), prolina (13%) e aminoácidos de-rivados 4-hidroxiprolina (9%) e 5-hidroxilisina (0,6%) (Figura 3.37). Hidroxiprolina é exclusiva de colágenos, sendo formada enzimaticamente a partir de prolina. A maior parte das hidroxiprolinas tem o grupo hidroxila na posição 4 (carbono γ), embora uma pequena quanti-dade de 3-hidroxiprolina também seja formada (Tabela 3.10). Colágenos são glicoproteínas com carboidratos ligados a 5-hidroxilisina por uma ligação O-glicosídica por meio do grupo hidroxila do carbono-δ.

Seqüência de Aminoácidos do ColágenoA família colágeno é composta por polipeptídeos deriva-dos de 40 genes conhecidos de cadeias de colágeno, que produzem cerca de 20 tipos de colágeno. Cada molécula de colágeno maduro ou tropocolágeno contém três ca-deias polipeptídicas. Alguns tipos de colágeno contêm três cadeias polipeptídicas idênticas. No tipo I (Tabela 3.11), há duas cadeias α1(I) e uma α2(I). Colágeno tipo V contém α1(V), α2(V) e α3(V). Colágenos diferem em seqüência de aminoácidos, mas há grandes regiões de seqüências homólogas entre todos os diferentes tipos de colágeno. Em todos os tipos de colágeno há regiões com os tripeptídeos Gly-Pro-Y e Gly-X-Hyp (onde X e Y são quaisquer aminoácidos) repetidos em seguida vá-


Doenças de Síntese de Colágeno

Colágeno está presente em praticamente todos os tecidos e é a mais abundante proteína do cor-po. Certos órgãos dependem muito dele para funcionar fisiologicamente. Síntese ou estrutura anormal de colágeno causa disfunção em órgãos cardiovasculares (aneurisma da aorta e arterial e defeitos de válvulas cardíacas), ossos (fragilidade e fratura fácil), pele (cicatrização difícil e disten-sibilidade incomum), articulações (hipermobili-dade e artrite) e olhos (deslocamento do crista-lino). Doenças causadas por síntese anormal de colágeno incluem síndrome de Ehlers-Danlos, osteogênese imperfeita e escorbuto. Essas do-enças podem resultar de genes anormais de co-lágeno, modificações pós-tradução anormais do colágeno ou deficiência de cofatores necessários às enzimas responsáveis por modificações pós-tradução de colágeno.

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FIGURA 3.37Aminoácidos derivados encontrados no colágeno. Carboidrato é ligado a 5-OH de hidroxilisina por uma ligação glicosídica tipo III (ver Figura 3.45).

5-Hidroxilisina

OH NH2

COOH

NH2 CH2 CH2 CH2 C HCH

Alisina

NH2

COOH

CH2 CH2 C

H

CO HCH2

4-Hidroxiprolina 3-Hidroxiprolina

CH2HC

CH COOHH2CNH

OH

CHH2C

CH COOHH2CNH

OH

BioQ.03 98 22.01.07 16:31:51


tos de domínios e mudanças de estrutura quaternária, como os observados em hemoglobina após ligação de O2 (ver p. 344). O comportamento dinâmico de proteínas é a base para (a) mudanças conformacionais induzidas por substrato, inibidor ou droga quando se liga a uma enzima ou receptor, (b) geração de efeitos alostéricos em hemoglobinas, (c) transferência de elétrons em cito-cromos, e (d) a formação de montagens supramolecula-res como vírus. Os movimentos também podem ter um papel funcional na ação catalítica de enzimas.

3.9

| CARACTERIZAÇÃO, PU-RIFICAÇÃO E DETERMI-NAÇÃO DA ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

Separação de Proteínas com Base em CargaEm eletroforese, proteína dissolvida em uma solução tampão em um pH em particular é colocada num campo elétrico. Dependendo da relação entre o pH do tampão e o pI da proteína, a proteína move-se em direção ao cáto-do (–) ou ao ânodo (+) ou permanece estacionária (pH = pI). Suportes como géis poliméricos (p. ex., poliacri-lamida), amido ou papel são usados. Os suportes iner-tes são saturados com solução tampão, uma amostra de proteína é colocada sobre o suporte, um campo elétrico é aplicado ao suporte, e a proteína carregada migra no suporte em direção ao pólo de carga oposta.

Uma técnica de resolução extremamente alta é a fo-calização isoelétrica, na qual misturas de anfolitos poliamino-ácidos policarboxílicos com uma faixa defi-nida de valores de pI são usadas para estabelecer um gradiente de pH ao longo do campo elétrico aplicado. Uma proteína carregada migra pelo gradiente de pH no campo elétrico até alcançar uma região de pH no gradiente igual ao seu valor de pI. Nesse ponto, a pro-teína torna-se estacionária e pode ser visualizada (Fi-gura 3.55). Proteínas que diferem por tão pouco quanto 0,0025 em seus valores de pI são separadas no gradien-te apropriado de pH.

Cromatografia de troca-iônica em colunas é usada para separação preparativa de proteínas por carga. Re-sinas de troca-iônica consistem de materiais insolúveis (agarose, poliacrilamida, celulose e vidro) que contêm grupos carregados (Figura 3.56). Resinas carregadas negativamente ligam cátions fortemente e são resinas de troca catiônica. Resinas carregadas positivamente ligam ânions fortemente e são resinas de troca aniô-nica. O grau de retardo de uma proteína (ou um amino-ácido) por uma resina depende da magnitude da carga da proteína no pH particular do experimento. Moléculas

de mesma carga que a resina são eluídas primeiro, em uma única banda, seguidas das que têm carga oposta à da resina, em uma ordem baseada na densidade de car-gas da proteína (Figura 3.57). Quando é difícil remover uma molécula da resina, devido à força de interação atrativa entre a molécula ligada e a resina, mudanças sistemáticas no pH ou na força iônica são usadas para enfraquecer a interação.

Por exemplo, um gradiente crescente de pH em uma resina de troca catiônica reduz a diferença entre o pH da solução e o pI da proteína ligada. Essa diminuição entre pH e pI reduz a magnitude da carga final da prote-ína e diminui a força da interação de cargas entre a pro-teína e a resina. Um gradiente crescente de força iônica também diminui a interação de cargas e elui eletrólitos fortemente ligados à resina.

FIGURA 3.55Focalização isoelétrica de hemoglobinas de um paciente hete-rozigoto para HbS e β-talassemia. Figura mostra separação por focalização isoelétrica de HbA1c (HbA glicosilada na extremidade NH2, ver Corr. Clín. 3.7), HbA de adulto normal, HbF fetal, HbS de anemia falciforme (ver Corr. Clín 3.3) e HbA2 minoritária de adulto. (a) Focalização isoelétrica realizada por eletroforese capilar com anfólito na faixa de pH entre 6,7 e 7,7 e detecção de bandas a 415 nm. (b) Focalização isoelétrica realizada em gel com Pharmacia Phast System; anfólito na faixa de pH entre 6,7 e 7,7.De Molteni, S., Frischknecht, H. e Thormann, W. Electrophore-sis 15:22, 1994 (Figura 4, partes A e B).

FIGURA 3.56Dois exemplos de ligantes carregados usados em cromatogra-fia de troca-iônica.

14 15 16 17

Abso

rbân

cia

(415

nm

)

Tempo (min)

0.05

A1c

AFS

0

A2

A1c

AF

S

A2

(a) (b)

R CH2 COO–

Ligante carregado negativamente: carboximetil

Ligante carregado positivamente: dietilamino

C2H5

C2H5H

R N+

BioQ.03 116 22.01.07 16:32:44

132 | PARTE 2 TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO NO DNAHoward J. Edenberg

PARTE 2 TRANSMISSÃO DA INFORMAÇÃO

4

4.1 CARACTERÍSTICAS COMUNS DA REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO, 133

4.2 REPLICAÇÃO DO DNA, 133 O básico, 133 A química da elongação da cadeia, 134 DNA polimerases, 135 Separando as fitas parentais: a forquilha de replicação, 137 Resolvendo o problema da polaridade: síntese de

DNA semidescontínua, 138 Movimento da forquilha de replicação, 138 Início, 138 Elongação da fita, 138 Remoção do primer, 138 Preenchimento da falha, 138 Ligação, 139 Desenrolando as fitas parentais, 141 Braçadeiras corrediças (sliding clamps) e processividade, 142 Coreografia em três dimensões: o replissomo,

142 Enzimas procarióticas de replicação, 142 Enzimas eucarióticas de replicação, 144 Início da replicação, 146 O ciclo celular, 147 Término da replicação em genomas circulares,

150 Término da replicação em genomas lineares: telô-

meros, 150 Telomerase, 151 Replicação de genomas de RNA, 151

4.3 RECOMBINAÇÃO, 151 Modelos de recombinação homóloga, 152 Modelo Holliday, 152 Modelo de Meselson e Radding, 153 Modelo de quebra da dupla fita, 153 Enzimas-chaves da recombinação em E. coli,

153 RecA, 153 RecBCD, RuvA, RuvC, 155 Recombinação não-homóloga, 155 Recombinação sítio-específica, 155 Transposição, 155 Ligação de extremidades não-homólogas,

155

4.4 REPARO, 156 Lesão no DNA, 156 Mutações, 158 Reparo por excisão, 160 Reparo por excisão de base, 160 Reparo por excisão de nucleotídeo, 161 Reparo acoplado à transcrição, 162 Reparo de pareamento errado, 162 Desmetilação direta, 165 Fotorreativação, 165 Lesões podem bloquear a replicação, 165 Síntese bypass (translesão), 166 Reparo de falha na fita filha, 166 Enrolamento e reparo de forquilhas de replica-

ção, 167 Reparo de quebra na dupla fita, 167 Regulação do reparo do DNA: o regulon SOS,

168

BioQ.04 132 22.01.07 16:37:06

CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO NO DNA | 151

TelomeraseTelômeros são mantidos por telomerases, enzimas que adicionam novas repetições de seis nucleotídeos à extremidade 3’ dos telômeros. Telomerases são com-plexos ribonucleoprotéicos contendo um pequeno RNA que serve de molde para adição de uma nova repetição de seis nucleotídeos (Figura 4.18). Uma telomerase liga-se à extremidade da fita 3’, como parte do RNA da telomerase ligado por pontes de hidrogênio aos últimos nucleotídeos do cromossomo. Uma repetição de seis nucleotídeos é sintetizada, usando o RNA como molde. Então, a telomerase pode se dissociar e reassociar para adicionar outro hexâmero.

Telômeros não precisam permanecer exatamente do mesmo tamanho; algum encurtamento não é problema porque essas repetições não codificam proteínas. Telô-meros passam por ciclos de encurtamento das fitas tar-dias devido a incapacidade de síntese completa (Figura 4.17a) e adição de novas repetições de seis nucleotídeos à extremidade 3’ pela telomerase (Figura 4.18). Embo-ra o comprimento dos telômeros não permaneça cons-tante, encurtamento progressivo é evitado por adição de repetições. Telomerases também restabelecem os excessos 3’, característicos dos telômeros.

Células que diferenciaram e se dividirão apenas um número limitado de vezes, não expressam telomerase. Assim, os telômeros encurtam a cada divisão subse-qüente; isso limita o número de vezes que tais células podem se dividir antes que a perda dos telômeros dis-pare apoptose – isto é, morte celular programada (ver p. 1020). Expressão de telomerase é geralmente reativada em células tumorais, o que lhes permite continuar as divisões indefinidamente, sem encurtamento cromos-sômico. Isso torna a telomerase um alvo atraente para quimioterapia do câncer. Deve-se notar que inativação da telomerase em um tumor não levaria a uma parada rápida no crescimento do tumor; o efeito seria retarda-do por muitos ciclos celulares, até que as extremidades cromossômicas fossem encurtadas significativamente. Portanto, é provável que inibidores da telomerase sejam úteis apenas em combinação com outras terapias.

Replicação de Genomas de RNAAlguns vírus têm um genoma de RNA. Tais genomas são replicados com muito menor precisão e eles podem acumular variações em período relativamente curto. Um exemplo particularmente importante disso é o ví-rus da imunodeficiência humano (HIV), que cau-sa AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida). O RNA viral do HIV é reversamente transcrito em DNA e, depois, o DNA integra-se ao cromossomo. A trans-criptase reversa do HIV é um alvo para quimioterapia antiviral (Corr. Clín. 4.4).

Transcrição reversa do RNA genômico do HIV é mui-to menos precisa que síntese de DNA, e a precisão dimi-nuída leva à rápida geração de uma coleção de vírus va-riantes em um indivíduo. É provável que uma pequena fração desses variantes seja resistente a qualquer droga única que esteja sendo usada para tratar a infecção. Essa fração pode continuar a replicar na presença do agente terapêutico até se tornar a variante dominante, o que leva à perda de eficácia da droga. Atuais terapias combinadas são projetadas para reduzir a probabilida-de de um vírus ser resistente simultaneamente a todas as drogas da combinação. Terapias combinadas atuais têm como alvos tanto a transcriptase reversa do HIV como a protease do HIV.

4.3 | RECOMBINAÇÃO

Recombinação é a troca de informação genética. Há dois tipos básicos: recombinação homóloga e re-combinação não-homóloga. Recombinação homó-loga (também chamada recombinação geral) ocorre entre seqüências idênticas ou quase idênticas – por exemplo, entre os cromossomos paterno e materno de um par. Cromossomos não são passados intactos de ge-ração para geração (Figura 4.19); em vez disso, cada cromossomo que você herda de seu pai contém porções de ambos os pais e, da mesma forma para os cromosso-mos herdados de sua mãe. Esta é uma parte normal do processo de alinhamento cromossômico e segregação

FIGURA 4.18 Telomerase. Telomerase é um complexo ribonucleoprotéico com uma fita curta de RNA, como parte integral; catalisa a adição de novas repetições teloméricas de 6-nt à extremidade 3’ de uma cadeia de DNA. O RNA da telomerase pareia parcialmente pelas bases com a repetição telomérica e serve de molde para a reação, enquanto o componente protéico funciona como uma transcriptase reversa, sintetizando DNA usando o RNA como molde. Depois da adição de uma repetição de seis nucleotídeos, a enzima pode se dissociar e se ligar novamente e adicionar novas repetições de 6-nt.

FIGURA 4.19 Recombinação homóloga. (a) O cromossomo paterno é mostrado em cinza com os alelos mostrados por letras maiúsculas. O cromossomo homólogo materno é mostrado em preto com os alelos mostrados por letras minúsculas. (b) Depois da recombinação homóloga entre os genes j e k, ambos os cromossomos contêm DNA de ambos os pais. Houve uma troca igual, recíproca entre eles.

��

3��

��

�� – 5�

[TTAGGG]nTTAGGGTTAGGGTTAGGG 3�

[AATCCC]nAATCCC 5�

� � � � � � � � � � � � � � � � � �

� � � � � � � � � � � � � � � � � �

�

K LMNOPQR

k l m n o p q r� � � � � � � � � �

� � � � � � � � � �

�

BioQ.04 151 22.01.07 16:37:33


MutaçõesAs mutações são alterações hereditárias na seqüência do DNA. Podem resultar de erros na replicação, de le-sões no DNA ou de erros durante o reparo de lesões. Mutações que são trocas de um único par de bases são chamadas mutações puntuais. Mutações puntuais podem ser classificadas pela natureza das bases altera-das. Transições são mutações puntuais, nas quais uma purina é substituída por outra (p. ex., A por G ou G por A) ou uma pirimidina é substituída por outra (p. ex., T por C ou C por T). Deaminação de C, se não reparada, levaria a uma transição. A freqüência de transições é aumentada por análogos de bases, incluindo 2-amino purina (Corr. Clín. 4.7). Transversões são mutações puntuais, nas quais uma purina é substituída por uma pirimidina ou vice versa (p. ex., A por C ou C por A).

Mutações puntuais também podem ser caracteriza-das por seu efeito sobre uma seqüência codificadora. Mutações de sentido errado (missense) são mu-tações puntuais que trocam um único par de bases em um códon, de modo que o códon agora codifica um aminoácido diferente (Figura 4.24a). Mutações sem sentido (nonsense) são mutações puntuais que tro-cam um único par de bases em um códon para um có-don de terminação (stop codon) que termina a tradu-ção (Figura 4.24b). Mutações sem sentido geralmente têm efeitos mais graves do que mutações de sentido errado porque levam à síntese de polipeptídeos trun-cados (e geralmente instáveis). Mutações silenciosas ou sinônimos não alteram o aminoácido codificado; estas incluem muitas mudanças no terceiro nucleotí-deo de um códon.

Inserções ou remoções de um ou mais pares de ba-ses podem levar a mudanças na estrutura de leitu-ra ( frameshifts) (se o número de pares de bases não for múltiplo de 3), destruindo o código de uma pro-teína (Figura 4.24c,d). Tradução de um mRNA não tem pontuação; ao contrário, uma vez que o código de iniciação tenha sido determinado, tripletes sucessivos são lidos como códons. Portanto, adição (ou deleção) de um múltiplo de três pares de bases em uma região codificadora adicionaria (ou subtrairia) aminoácidos a uma proteína, mas adição de outros números de pares de bases deslocaria a estrutura da leitura daquele pon-to em diante. Mudança na estrutura de leitura ( fra-meshift) muda os aminoácidos codificados a partir do ponto de inserção ou remoção. Frameshifts geralmen-te levam à terminação prematura (ou, mais raramente, à elongação) da cadeia polipeptídica codificada, quan-do códons de terminação (stop codons) são gerados ou removidos pela mudança na estrutura de leitura. Alguns agentes químicos, incluindo acridinas e pro-flavina, intercalam-se no DNA; isto é, inserem-se en-tre pares de bases adjacentes. Isso geralmente leva a inserções ou remoções de um único par de bases. Mu-tações também podem resultar de alterações em lar-ga escala, incluindo inserção de transposons. Embora raras em uma geração qualquer, mutações acumula-ram-se em populações ao longo de milhões de anos, de modo que duas pessoas diferem em cerca de 1 pb por 1000 ao longo de seus genomas. Muitas dessas di-ferenças genéticas não têm efeito, mas outras afetam nossa fisiologia, susceptibilidade a doenças e resposta a tratamentos (Corr. Clín. 4.8).

6-Mercapto purina (6-MP) é um análogo de purina administrado oralmente que é útil na quimioterapia de leucemias agudas e para imunossupressão após transplante de órgãos. Age por vários mecanismos, incluindo inibição da biossíntese de purinas e toxi-cidade após incorporação no DNA. É metabolizado a 6-MP ribosina 5´-fosfato, que tem curta meia-vida, porque é degradada por xantina oxidase. A velocida-de de degradação é muito reduzida em pacientes que estão sendo tratados com alopurinol (um inibidor da xantina oxidase) para hiperuricemia relacionada à gota, de modo que a dose deve ser drasticamente re-duzida em tais pacientes.

Outra enzima que metaboliza 6-MP (e o anti-metabólito relacionado 6-tioguanina) é tiopurina metil transferase (TPMT). Alguns pacientes (cerca de 10% da população) são heterozigotos para um polimorfismo que inativa a enzima e, portanto, tem aproximadamente 50% da atividade, e 1/300 das pessoas não têm atividade de TPMT e têm risco ex-tremamente alto de imunossupressão grave e morte se forem tratadas com 6-MP. Por outro lado, pessoas que metabolizam as drogas mais rapidamente po-dem não chegar a ter dose terapêutica suficiente. Essa diferença farmacogenética, portanto, tem sé-rias implicações para o tratamento com tiopurinas.

Fonte: Sanderson, J., Ansari, A., Marinaki, T. e Duley, J. Thiopurine methyltransferase: Should it be measured before commencing thiopurine drug therapy? Ann. Clin. Biochem. 41:294, 2004.


Análogos de Nucleosídeos como Drogas: Tiopurinas

BioQ.04 158 22.01.07 16:37:40

CAPÍTULO 4 REPLICAÇÃO, RECOMBINAÇÃO E REPARO NO DNA | 169

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| BIBLIOGRAFIA |

| QUESTÕES | Carol N. Angstadt

Questões de Múltipla Escolha.1. Replicação:

A. é semiconservativa.B. requer apenas proteínas com atividade de DNA poli-

merase.C. usa atividade de polimerase 5’ para 3’ para sintetizar

uma fita, e atividade de polimerase 3’ para 5’ para sin-tetizar a fita complementar.

D. requer um primer em eucariotos, mas não em proca-riotos.

E. deve começar com uma etapa de quebra.2. Na replicação de DNA eucariótica:

A. só um replissomo se forma, porque há uma única ori-gem de replicação.

B. os fragmentos de Okasaki têm 1000 a 2000 nucleotíde-os de comprimento.

C. helicase se dissocia do DNA assim que as bolhas de iniciação se formam.

D. FEN 1 ( flap endonuclease 1) está envolvida na re-moção do primer.

E. o processo ocorre ao longo de todo o ciclo celular.3. Todas as afirmativas seguintes sobre a telomerase são

corretas, exceto:A. o componente RNA age como molde para a síntese de

um segmento de DNA.B. adiciona telômeros às extremidades 5’ das fitas de

DNA.C. fornece um mecanismo para replicar as extremidades

de cromossomos lineares.D. reconhece uma fita única do DNA rica em G.E. é uma transcriptase reversa.

4. Uma mutação por transição:A. ocorre quando uma purina é substituída por uma piri-

midina ou vice-versa.B. resulta da inserção de uma ou duas bases na cadeia de

DNA.

BioQ.04 169 22.01.07 16:37:56


PA

IID

IIB IIAIIE

IIF

IIHTATA INR DPE

Pol II

RNA: TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTOFrancis J. Schmidt e David R. Setzer


5

5.1 VISÃO GERAL, 173

5.2 MECANISMOS DE TRANSCRIÇÃO, 173 Processo inicial de síntese de RNA é transcrição,

173 Informação em seqüência de DNA sinaliza síntese

de RNA, 173 RNA polimerase catalisa o processo de transcri-

ção, 174 Etapas da transcrição em procariotos, 175 Reconhecimento do promotor, 175 Início da síntese, 176 Elongação, 177 Terminação, 178

5.3 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS, 178 Natureza da cromatina ativa, 178 Ativação da transcrição opera por recrutamento

de RNA polimerase, 179 Enhancers, 179 Transcrição por RNA polimerase II, 180 Promotores para a síntese de mRNA, 180 Transcrição por RNA polimerase I, 181 Transcrição por RNA polimerase III, 181 A base enzimática comum para ação de RNA

polimerases, 183

5.4 PROCESSAMENTO DE RNA, 184 RNA transportador é modificado por clivagem,

adição e modificação de bases, 184 Clivagem, 184 Adição na extremidade 3 ,́ 184 Nucleosídeos modificados, 184 Processamento de RNA ribossômico libera vários

RNAs de um precursor mais longo, 184 Processamento de RNA mensageiro garante a

seqüência codificadora correta, 185 RNA polimerase II recruta enzimas de processa-

mento durante transcrição em eucariotos, 186 Capping, 186 Remoção de íntrons de precursores de mRNA,

186 Poliadenilação, 188 Mutações em sinais de splicing causam doenças

humanas, 188 Splicing alternativo de pré-mRNA pode levar à

síntese de múltiplas isoformas de proteínas a partir de uma única seqüência codificadora no DNA, 190

5.5 EXPORTAÇÃO DO RNA E CONTROLE DE QUA- LIDADE, 191

5.6 RNAs PEQUENOS INIBITÓRIOS, 192

5.7 REPARO DO DNA ACOPLADO À TRANSCRI- ÇÃO, 192

5.8 NUCLEASES E TURNOVER DO RNA, 193

BIBLIOGRAFIA, 194


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 5.1 Antibióticos e Toxinas que Têm RNA Poli-

merase como Alvo, 176 5.2 Síndrome do X Frágil: Uma Doença de RNA-

Cromatina?, 179 5.3 Envolvimento de Fatores Transcripcionais

em Carcinogênese, 182 5.4 Talassemia Devido a Defeitos na Síntese de

RNA Mensageiro, 188 5.5 Auto-imunidade em Doença do Tecido Con-

juntivo, 189 5.6 Síndrome de Cockayne, 193

BioQ.05 172 22.01.07 16:40:55

CAPÍTULO 5 RNA: TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO | 179

Outras modificações de histonas que influenciam atividade gênica incluem metilação, fosforilação e ubi-quitinação. Combinações dessas modificações ocor-rendo em diferentes posições específicas em histonas podem constituir um “código histona” que acopla mo-dificação de histonas, compactação de cromatina, mo-dificação do DNA e atividade gênica (Corr. Clín. 5.2). A idéia geral é que cromatina parcialmente desdobrada seja necessária, mas não suficiente, para transcrição.

Ativação de Transcrição Opera por Recrutamento de RNA Polimerase

Fatores protéicos eucarióticos, independentemente da seqüência à qual se liguem, operam de modo funda-mentalmente diferente do fator σ de E.coli. Em vez de primeiro fazer parte de um complexo protéico e depois procurar a seqüência relevante no DNA, os fatores se ligam a um sítio específico (seqüência) do DNA e de-pois ligam RNA polimerase (com ou sem envolvimento de fatores intermediários). Esse mecanismo é chamado “recrutamento”. Recrutamento é um meio pouco impor-tante em ativação de genes em procariotos, e o princi-pal mecanismo em eucariotos.

Enhancers

Enhancers ou amplificadores aumentam muitas vezes a expressão de um gene. Fatores de transcrição

FIGURA 5.5Sítios hipersensíveis à DNase (HSS) antes do promotor do gene de lisozima de galinha, uma unidade transcripcional eucariótica típica. Sítios hiper-sensíveis – isto é, seqüências próximas ao gene da lisozima que são particularmente susceptíveis à digestão por nucleases mesmo quando empacotadas em cromatina – são indicados por setas. É provável que esses sítios fiquem livres de nucleossomos. Note que alguns sítios hipersensíveis são encontrados no promotor da lisozima tanto em oviduto maduro como imaturo. Indução da síntese de lisozima em ovi-duto maduro é acompanhada pelo aparecimento de um novo sítio hipersensível. Em contraste, nenhum sítio hipersensível está presente em eritrócitos nucleados que nunca sintetizam lisozima.Adaptado de Elgin, S. C. R. J. Biol. Chem. 263:1925, 1988.

Oviduto, imaturo

Oviduto, maduro

Eritrócitos

Sítios HSS(setas)

Distância no DNA do início da transcrição, em quilobases

-5

5� transcrito

0


Síndrome do X Frágil: Uma Doença de RNA-Cromatina?

Síndrome do X frágil é a forma individual mais comum de retardo mental hereditário, afetando 1/1250 homens e 1/2000 mulheres. Uma variedade de sintomas anatômicos e neurológicos resulta de inativação do gene FMR1, localizado no cromosso-mo X. A genética da síndrome é complexa, devido ao mecanismo molecular da mutação do X frágil.

A condição do X frágil resulta de expansão de uma seqüência repetida de um trinucleotí-deo, CGG, encontrado na região 5’ não-traduzi-da do gene FRM1. Normalmente, essa repetição está presente em 30 cópias, embora indivíduos normais possam ter até 200 cópias da repetição. Em indivíduos com síndrome do X frágil, o gene FRM1 contém muito mais cópias, de 200 a milha-res, da repetição CGG. A genética complexa da doença resulta do potencial da repetição CGG se expandir de geração para geração.

A presença de um número anormalmente ele-vado de repetições CGG induz extensa metilação do DNA de toda a região do promotor de FMR1. DNA metilado é transcripcionalmente inativo, de modo que mRNA de FMR1 não é sintetizado. Ausência da proteína FMR1 leva à patologia da doença. Proteína FMR1 normalmente se localiza no citoplasma de todos os tecidos do feto jovem e, mais tarde, especialmente no cérebro e tecido neural fetal. A proteína FMR afeta tradução de vários mRNAs e uma hipótese é que essa proteí-na ajude na tradução e localização de mRNAs es-pecíficos durante desenvolvimento. Uma possibi-lidade descoberta recentemente é que a proteína FMR1 esteja envolvida em RNA de interferência e sua perda possa causar ampla regulação gênica anormal (ver Seção 5.7). É provável que várias vias de sinalização estejam ligadas à patologia dessa doença muito complexa.

Fonte: Warren, S. L. e Nelson, D. L. Advance in molecu-lar analysis of Fragile X syndrome. JAMA 271:536, 1994. Caskey, C. T. Triple repeat mutations in human disease. Science 256:784, 1992. Jin, P., Zarnescu, D. C., Ceman, S., Nakamoto, M., Mowrey, J., Jongens, T. A., Nelson, D. L., Moses, K. e Warren, S. T. Biochemical and genetic interac-tion between the fragile X mental retardation protein and the micro RNA pathway. Nature Neurosci. 7:113, 2004. Miyashiro, K. e Eberwine, J. Fragile X syndrome: (What’s) lost in translation? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17329, 2004. Fragile Site Mental Retardation 1 Gene; FMR1 in Online Mendelian Inheritance in Man, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=309550

BioQ.05 179 22.01.07 16:41:05


Nucleotídeos entram e RNA sai por dois outros canais separados na molécula. A despeito das diferenças em seqüências e composição em subunidades, RNA polime-rases procarióticas e eucarióticas mantiveram estrutu-ras semelhantes para desempenhar os mesmos objeti-vos levando à síntese de uma nova cadeia de RNA. Estas incluem: (1) passagem do DNA molde por um canal na enzima; (2) separação das fitas de DNA para formar uma bolha na qual um híbrido RNA-DNA existe com a extremidade 3’ da cadeia de RNA posicionada no sítio ativo; (3) colocação de nucleotídeos no sítio ativo por um poro da enzima; (4) uso de um íon metálico para ajudar na catálise da formação de uma nova ligação és-ter fosfato entre o fosfato α do nucleosídeo trifosfato que está chegando e a extremidade 3’ da cadeia nascen-te de RNA; (5) exclusão do RNA produzido por outro poro; e (6) direção do re-pareamento das duas fitas de DNA, à medida que saem da enzima.

Lembre-se que a subunidade σ da holoenzima pro-cariótica é responsável por ligar as caixas –10 e –35 de promotores. Estudos estruturais demonstraram que sigma é uma molécula oblonga, composta por um feixe de resíduos em α-hélice, empacotados em uma forma de “V” aberto. Um braço do “V” contém resíduos críticos para reconhecimento do promotor e ligação com poli-merase core. Um lado desse braço contém uma α-hélice que se liga à seqüência “–10”, e a outra face liga polime-rase core por interações hidrofóbicas.

5.4 | PROCESSAMENTO DE RNA

Cópias em RNA de seqüências de DNA devem ser modi-ficadas em moléculas maduras, funcionais, em procario-tos e eucariotos. As reações de processamento do RNA podem incluir remoção de nucleotídeos extras, modifi-cação de bases, adição de nucleotídeos e separação de diferentes seqüências de RNA pela ação de nucleases es-pecíficas. Reações de processamento podem ocorrer co-transcripcionalmente (enquanto o RNA ainda está sen-do transcrito) ou pós-transcripcionalmente (depois do transcrito ter sido liberado pela RNA polimerase). Final-mente, em eucariotos, RNAs são exportados do núcleo.

RNA Transportador É Modificado por Clivagem, Adição e Modificação de Bases

Clivagem

O transcrito primário de um gene de tRNA contém se-qüências extras de nucleotídeos, tanto 5’ como 3’ da se-qüência do tRNA. Esses transcritos primários também podem conter íntrons na região do anticódon. Reações de processamento pós-transcripcional ocorrem em uma

ordem temporal bem definida, mas não necessariamen-te rígida. Primeiro, o transcrito primário é cortado de modo relativamente inespecífico para gerar uma molé-cula precursora com extensões 5’ e 3’ mais curtas. En-tão ribonuclease P, uma ribozima (ver p. 68), remove a extensão 5’ por clivagem endonucleolítica. A extre-midade 3’ é cortada exonucleoliticamente, seguida por síntese da terminação CCA. Síntese dos nucleotídeos modificados ocorre em qualquer ordem em relação à clivagem nucleolítica. Remoção de íntrons é determina-da pela estrutura secundária do precursor (ver Figura 5.10) e é executada por um sistema enzimático solúvel, com dois componentes; uma enzima remove o íntron e a outra sela novamente a cadeia nucleotídica.

Adição na Extremidade 3’

Todo tRNA funcional tem a seqüência CCA em sua ex-tremidade 3’. Essa seqüência é essencial para tRNA aceitar aminoácidos. Na maioria dos casos, é adicionada seqüencialmente pela enzima tRNA nucleotidiltransfe-rase. Nucleotidiltransferases usam ATP e CTP como substratos e sempre incorporam-nos em tRNA numa razão de 2C/1A. As extremidades CCA são encontradas tanto em tRNAs citoplasmáticos como mitocondriais.

Nucleosídeos Modificados

Nucleotídeos de RNA transportador são os mais modi-ficados de todos os ácidos nucléicos. Mais de 60 modifi-cações diferentes nas bases e na ribose, exigindo bem mais de 100 diferentes reações enzimáticas, foram en-contradas em tRNA. Muitas são simples, metilações de uma etapa, mas outras envolvem síntese com múltiplas etapas.

Formação de algumas bases modificadas na realida-de requer quebra da ligação β-glicosídica entre ribose e a base. Enzimas modificadoras produzem as mesmas modificações específicas em mais de uma espécie de tRNA; entretanto, as enzimas modificadoras são local-específicas. A maioria das modificações se completa an-tes de os precursores de tRNA terem sido clivados ao tamanho do tRNA maduro.

Processamento de RNA Ribossômico Libera Vários RNAs de um Precursor Mais LongoO produto primário da transcrição do gene de rRNA é um RNA longo, chamado 45S RNA, que contém as se-qüências dos rRNAs 28S, 5,8S e 18S. Processamento do 45S RNA ocorre no nucléolo, e é feito por grandes estruturas de ribonucleoproteínas, com múltiplas subu-nidades. Processamento dos rRNAs segue uma ordem seqüencial (Figura 5.11).

Processamento de pré-rRNA em procariotos também envolve clivagem de precursores de alto peso molecular

BioQ.05 184 22.01.07 16:41:13

CAPÍTULO 5 RNA: TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO | 193

5.8 | NUCLEASES E TURNOVER DO RNA

As diferentes funções de RNA e DNA em expressão gênica refletem-se em seus destinos metabólicos. O re-positório de informação genética de uma célula (DNA) deve ser preservado, explicando assim a existência dos múltiplos sistemas de reparo e edição do DNA no nú-cleo. Embora seqüências individuais de nucleotídeos no DNA possam ser recicladas, a molécula como um todo é metabolicamente inerte quando não está replicando. As várias moléculas de RNA, por outro lado, são individu-almente dispensáveis e podem ser substituídas por es-pécies recém-sintetizadas com a mesma especificidade. Não é surpreendente que sistemas de reparo de RNA não sejam conhecidos. Em vez disso, RNAs defeituosos são removidos das células por degradação a nucleotídeos, que depois são reutilizados em novas espécies de RNA.

Isso é mais claro para espécies de mRNA, que são classificadas como instáveis. Entretanto, mesmo os RNAs ditos estáveis são reciclados; por exemplo, a meia vida de espécies de tRNA no fígado é cerca de 5 dias. Uma meia vida bastante longa para um mRNA de ma-míferos é 30 h.

Remoção de RNAs do citoplasma é realizada por ri-bonucleases celulares. Nucleases são de vários tipos e especificidades. A distinção mais útil é entre exonuclea-ses, que degradam RNA a partir da extremidade 5’ ou 3’, e endonucleases, que clivam ligações fosfodiéster dentro de uma molécula. Produtos de ação de RNase contêm fosfatos 3’- ou 5’-terminal, e tanto endo- como exonucle-ases podem ser melhor caracterizadas pela posição (5’ ou 3’), na qual o monofosfato criado pela clivagem fica localizado. A estrutura do RNA também afeta a ação da nuclease. A maioria das nucleases é menos eficiente em regiões de RNA com estrutura muito ordenada.

Assim, tRNAs são preferencialmente clivados em regiões não-pareadas da seqüência. Por outro lado,


Síndrome de Cockayne

Síndrome de Cockayne (CS) é uma doença complexa autossômica recessiva causada por uma mutação em um de dois genes. Pacientes com CS apresentam alte-rações de desenvolvimento e neurológicas, anomalias esqueléticas e de retina, e uma deformidade facial “tipo pássaro”. Morte geralmente ocorre por volta dos 20 anos de idade e é causada por degeneração neural. A maioria dos pacientes com síndrome de Cockayne são também fotossensíveis e predispostos a câncer de pele.

Fotossensibilidade aponta para um defeito em reparo do DNA. Por exemplo, xeroderma pigmento-so (XP) resulta de mutações em vários dos compo-nentes da via de reparo do DNA. CS também é uma deficiência em reparo do DNA. Surpreendentemen-te, um dos dois genes responsáveis pela síndrome é uma subunidade da RNA polimerase II. A proteína codificada pelo gene da síndrome de Cockayne B aumenta a velocidade de elongação pela RNA poli-merase II.

Como pode uma deficiência de RNA polimerase causar um problema no reparo do DNA? A resposta é que os pacientes com CS são deficientes no repa-ro do DNA acoplado à transcrição. Reparo acoplado à transcrição ocorre quando RNA polimerase fica

parada por ter encontrado uma base alterada (p. ex., um fotodímero de timina). Transcrição pára, o transcrito parcial é degradado, e a fita molde do DNA é reparada. Aparentemente, aumento da trans-crição pela proteína CSB também estimula o reparo do DNA acoplado à transcrição.

Se esta fosse toda a história, síndrome de Co-ckayne seria uma variante do xeroderma pigmen-toso; entretanto, pacientes com XP têm desenvol-vimento normal e são neurologicamente normais, embora ainda sejam fotossensíveis. O que causa as outras características de CS? É provável que esses outros sintomas sejam devidos a uma deficiência primária na elongação da transcrição causada pelo fator de elongação CSB alterado pela mutação. Essa idéia expande nosso entendimento da relação entre mutação e doença. Geralmente, doenças genéticas são causadas por uma mutação em processos bio-químicos que ficam fora das vias centrais de infor-mação da célula. Isso faz sentido, porque inibição geral da síntese de DNA, RNA ou proteína seria letal num estágio precoce do desenvolvimento. Os defei-tos generalizados de CS devem se dever à mutação afetando a transcrição de alguns genes mais do que a de outros.

Fonte: Citterio, E., Vermeulen, W. e Hoeijmakers, J. H. J. Transcriptional healing. Cell 101:447, 2000; Selby, C. P. e Sancar, A. Cockayne syndrome group B protein enhances elongation by RNA polymerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:11205, 1997. van Gool, A. J., van der Horst, G. T. J., Citterio, E. e Hoeijmakers, J. H. J. Cockayne syndrome: defective repair of transcription? EMBO J. 16:4155, 1997. Cockayne Syndrome, Type I; CKN1 in Online Mendelian Inheritance in Man, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=216400

BioQ.05 193 22.01.07 16:41:25

CAPÍTULO 6 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO | 197

SÍNTESE DE PROTEÍNAS: TRADUÇÃO E MODIFICA-ÇÕES PÓS-TRADUÇÃODohn Glitz


6

6.1 VISÃO GERAL, 1986.2 COMPONENTES DO APARELHO DE TRADU-

ÇÃO, 198 RNA mensageiro transmite informação codifica-

da em DNA, 198 RNA transportador é uma molécula tradutora

bilíngüe, 199 O código genético usa um alfabeto de quatro

letras de nucleotídeos, 199 Códons em mRNA são palavras de três letras,

199 Pontuação, 199 Interações códon-anticódon permitem leitura de

mRNA, 199 “Decifrando” o código genético, 200 Mutações, 201 Aminoacilação de RNA transportador ativa aminoácidos para síntese protéica, 203 Especificidade e fidelidade de reações de aminoacilação, 205 Ribossomos são bancadas de trabalho para síntese protéica, 205

6.3 BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS, 209 Tradução é direcional e colinear com mRNA, 209 Iniciação da síntese de proteínas é um processo

complexo, 209 Elongação é a formação passo a passo de ligações

peptídicas, 211 Terminação da síntese do polipeptídeo requer um

códon de parada (stop codon), 215 Tradução tem custo energético significativo, 215 Síntese de proteínas em mitocôndrias difere

ligeiramente, 215

Alguns antibióticos e toxinas inibem biossíntese de proteínas, 215

6.4 AMADURECIMENTO DE PROTEÍNAS: DOBRA-MENTO, MODIFICAÇÃO, SECREÇÃO E DIRE-CIONAMENTO, 218

Chaperones ajudam em dobramento de proteínas 218

Proteínas para exportação seguem a via secretória, 218 Glicosilação de proteínas ocorre no retículo endo-

plasmático e no complexo de Golgi, 218

6.5 DIRECIONAMENTO PARA MEMBRANA E OR-GANELAS, 224

Seleção de proteínas na via secretória, 224 Importação de proteínas por mitocôndrias requer

sinais específicos, 227 Direcionamento para outras organelas requer

sinais específicos, 227

6.6 MAIS MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO, 227 Proteólise parcial libera insulina e ativa zimogênios, 227 Aminoácidos podem ser modificados após incorporação em proteínas, 228 Biossíntese de colágeno requer muitas modificações pós-tradução, 231 Formação de pró-colágeno no retículo endo-

plasmático e no complexo de Golgi, 231 Maturação de colágeno, 231

6.7 REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO, 234

BioQ.06 197 22.01.07 16:43:42


sintetizam proteínas que serão secretadas da célula ou seqüestradas e funcionam em retículo endoplasmáti-co, complexo de Golgi ou lisossomos. Em homogenatos celulares, fragmentos de membranas com ribossomos ligados constituem a fração microssomal; detergentes que destroem membranas liberam esses ribossomos.

6.3 | BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS

Tradução É Direcional e Colinear com mRNASeqüências de RNA mensageiro são escritas (e trans-critas) 5’→3’, e durante tradução são lidas na mesma direção. Seqüências de aminoácidos são tanto escritas como sintetizadas do resíduo amino-terminal para o carboxi-terminal. Um ribossomo permanece ligado a uma molécula de mRNA e se move ao longo do compri-mento do mRNA até que chegue a um códon de parada. Comparações de seqüências de mRNA com seqüências das proteínas que codificam mostraram uma corres-pondência perfeita, colinear, sem sobreposições e sem falhas entre a seqüência codificadora do mRNA e a do polipeptídeo sintetizado. (Para uma rara exceção, ver Corr. Clín. 6.4). De fato, é comum deduzir a seqüência de uma proteína, exclusivamente a partir da seqüência de seu mRNA ou do DNA de seu gene. Entretanto, a seqüência deduzida pode diferir da proteína genuína, devido a modificações pós-tradução.

Uma história pode ser analisada em função de seu início, seu desenvolvimento ou parte do meio e seu final. Biossíntese de proteínas será descrita num arcabouço semelhante: início do processo, elongação durante a qual a maior parte da proteína é formada, e terminação da síntese e liberação do polipeptídeo completo. Va-mos depois examinar modificações pós-tradução, pelas quais uma proteína pode passar.

Iniciação da Síntese de Proteínas É um Processo ComplexoIniciação requer aproximação de uma subunidade ribos-sômica pequena (40 S), um mRNA e um complexo tRNA do aminoácido amino-terminal, todos em uma orienta-ção correta. Segue-se associação da subunidade grande (60 S) para formar um complexo de iniciação completo em um ribossomo 80 S. Esse processo requer um grupo de proteínas ligadas transitoriamente, conhecidas como fatores de iniciação, que só atuam na iniciação. A fun-ção específica de alguns fatores de iniciação eucarióticos permanece pouco clara, mas síntese de proteínas pro-cariótica fornece um modelo mais simples para compa-ração. A iniciação da tradução é apresentada na Figura 6.7. Como primeira etapa, fator de iniciação eucarió-

tico 2a (eIF-2a) liga-se a GTP e ao tRNA iniciador, Met-tRNAi

met, para formar um complexo ternário. Nenhum outro aminoacil-tRNA pode substituir o Met-tRNAi

met iniciação-específico nessa etapa. Procariotos também utilizam um tRNA iniciador específico, cuja metionina é modificada por formilação de seu amino grupo. Só fMet-tRNAi

met é reconhecido pelo IF-2 procariótico.A segunda etapa requer subunidades ribossômi-

cas 40 S associadas a uma proteína muito complexa, eIF-3. eIF-3 de mamíferos contém oito polipeptídeos diferentes e tem uma massa de 600-650 kDa; liga-se à superfície da subunidade 40 S que fará contato com a subunidade 60 S e bloqueia fisicamente a associação das subunidades. Portanto, eIF-3 é um fator antias-sociação ribossômica – assim como eIF-6 que se liga a subunidades 60 S. Um complexo que inclui eIF-2a-GTP, Met-tRNAi

Met, eIF-3-40 S e fatores protéicos adicionais agora se forma. Na terceira etapa, o complexo de pré-iniciação é formado: mRNA, eIF-4f, também chamado complexo de ligação ao cap, eIF-4a, uma helicase que desenrola estrutura secundária da seqüência líder não-traduzida do mRNA, PAB, uma proteína de ligação a poliA que faz uma alça aproximando a extremidade 3’ do mRNA do 5’-cap, e várias outras proteínas são ne-cessárias. O mRNA é então percorrido 5´à3´ até que o primeiro triplete AUG seja encontrado. Raramente, o primeiro AUG não é usado e um AUG posterior, carac-terizado por sua estrutura secundária no mRNA, é se-lecionado para iniciação. GTP é hidrolisado por eIF-2a com a ajuda de eIF-5, e eIF-2a-GDP e outros fatores são liberados. O eIF-2a-GDP interage com fator trocador de nucleotídeo de guanina eIF-2b e GTP para regenerar eIF-2a-GTP para outro ciclo de iniciação.

A etapa final requer ligação desse complexo com uma subunidade 60S e um fator adicional, eIF-5b-GTP. GTP é hidrolisado, e eIF-5b-GDP e outros fatores são liberados. O complexo de iniciação completo é um ribossomo 80 S com o mRNA e tRNA iniciador correta-mente posicionados para começar tradução.

Procariotos usam menos fatores de iniciação para formar um complexo de iniciação similar. Suas subu-nidades 30 S, complexadas com um IF-3 mais simples, podem ligar mRNA ou um complexo ternário de IF-2, fMet-tRNAi

met e GTP. Orientação do mRNA depende, em parte, do pareamento de bases entre uma seqüência rica em pirimidinas de oito nucleotídeos no 16 S rRNA e uma seqüência “Shine-Dalgarno” rica em purinas, cer-ca de 10 nucleotídeos antes do códon AUG iniciador.

Complementaridade entre rRNA e mRNA pode in-cluir vários pares errados, mas maior complementari-dade geralmente leva a iniciação que é mais eficiente. Fator de iniciação IF1 também atua na formação do complexo de pré-iniciação. Finalmente, subunidade 50 S é ligada, GTP é hidrolisado a GDP e os fatores de iniciação são liberados. É interessante que procariotos usem pareamento de bases RNA-RNA para posicionar mRNA, enquanto eucariotos usam muitos fatores pro-téicos para chegar ao mesmo resultado.

BioQ.06 209 22.01.07 16:43:55


na nascente, a seqüência sinal hidrofóbica é inserida, e tradução e extrusão no, ou através do, translocon estão agora acopladas. Mesmo segmentos muito hidrofílicos ou carregados são direcionados através da membrana para o lúmen do ER. O peptídeo sinal é excisado pela pepti-dase sinal, uma proteína integral de membrana da face luminal do ER. A proteína pode dobrar, e componentes de proteínas formadas por múltiplas subunidades podem se organizar. Outras etapas podem incluir processamen-to proteolítico e glicosilação, que ocorre no lúmen do ER e durante trânsito da proteína pelo aparelho de Golgi e em vesículas secretórias.

Glicosilação de Proteínas Ocorre no Retículo Endoplasmático e no Complexo de GolgiGlicosilação de proteínas para formar glicoproteínas (ver p. 231) é importante por muitas razões. Glicosila-ção altera as propriedades de proteínas, modificando sua estabilidade, solubilidade e volume físico. Além disso, os resíduos de carboidratos atuam como sinais de reconhecimento que podem dirigir a distribuição de proteínas e influenciar interações célula-célula e

Fibrose cística é a doença autossômica recessiva mais comum em caucasianos, com uma freqüência de cerca de 1 por 2000. O gene CF tem 230 kb de comprimento e inclui 27 éxons que codificam uma proteína de 1480 aminoácidos. A proteína conhecida como regulador de condutância transmembrânica da fibrose cística ou CFTR (ver p. 474) é um membro de uma família de proteínas de transporte dependen-tes de ATP. Contém dois domínios que atravessam a membrana, cada um com seis regiões transmembrâ-nicas, dois domínios de ligação a ATP e um domínio regulatório que inclui vários sítios de fosforilação. CFTR funciona como um canal de cloreto regulado por AMP cíclico. Epitélios em CF caracterizam-se por transporte defeituoso de eletrólitos. Os órgãos mais afetados incluem pulmões, pâncreas e fígado, e os efeitos que mais oferecem risco de vida envol-

vem secreções mucosas viscosas que levam a doença pulmonar obstrutiva crônica e infecções persisten-tes nos pulmões.

Em cerca de 70% dos indivíduos afetados, há uma deleção dos três nucleotídeos que codificam fenila-lanina 508, normalmente localizada no domínio 1 de ligação ao ATP, no lado citoplasmático da membrana plasmática. Como em várias outras mutações CF, a proteína com deleção de Phe 508 não se dobra cor-retamente no ER e não é adequadamente glicosilada ou transportada para a superfície celular. Em vez disso, é devolvida ao citoplasma para ser degrada-da nos proteassomos. Uma abordagem terapêutica, ainda não aplicada em pacientes, usa drogas que mi-metizam interações chaperones com CFTR mutante e ajudam-nas em seu dobramento e transporte para a membrana.


Deleção de um Códon, Modificação Pós-Tradução Incorreta e Degradação Prematura de Proteína: Fibrose Cística

Fonte: Ward, C., Omura, S., e Kopito, R. Degradation of CFTR by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell 83:121, 1995. Plemper, R. K. e Wolf, D. H. Retrograde protein translocation: Eradication of secretory proteins in health and di-sease. Trends Biochem. Sci. 24:266, 1999. Egan, M. E., Pearson, M., Weiner, S. A., Rajendran, V., Rubin, D., Glockner-Pagel, J., et al. Curcumin, a major constituent of turmeric, corrects cystic fibrosis defects. Science 304:600, 2004.

FIGURA 6.12Retículo endoplasmático rugoso. Três setas paralelas indicam três ribossomos dentre os muitos ligados às membranas. Seta única indica uma mitocôndria, para comparação.Cortesia de Dr. U. Jarlfors, University of Miami.

BioQ.06 219 22.01.07 16:44:09


alça da seqüência líder 5’ do mRNA da ferritina (ver p. 807). Esse mRNA é seqüestrado para uso futuro. Ácido δ-aminolevulínico sintase, uma enzima da biossínte-se de heme, também é regulada por um 5’-IRE no seu mRNA. Em contraste, mais mRNA do receptor de fer-ritina é necessário se ferro estiver limitado; seu mRNA tem IREs em sua região 3’ não-traduzida. Ligação da proteína repressora estabiliza o mRNA e prolonga sua vida útil. Muitos mRNAs regulados por crescimento, in-cluindo os de proteínas ribossômicas, têm um encade-amento de polipirimidinas em sua seqüência líder. Uma proteína que se liga a polipirimidinas ajuda a regular sua tradução.

Moléculas pequenas de RNA regulam biossínte-se de proteínas em dois níveis. Micro-RNAs (miRNA) são RNAs de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento que são formados a partir de RNAs maiores dupla-fita ou grampo por uma endonuclease citoplasmática chama-da Dicer. Uma RNA helicase separa as fitas, uma das quais é ligada por um complexo silenciador induzi-do por RNA (RISC) que guia o miRNA para seqüên-cias complementares no mRNA. Formação de um du-plex mRNA-miRNA imperfeito reprime tradução, mas não afeta estabilidade do mRNA. Interação cooperativa de múltiplos miRNAs com um mRNA aumenta eficiên-cia de inibição. Dicer e RISC também geram duplexes perfeitamente complementares de moléculas pequenas de RNA com mRNA. Esses complexos de RNA peque-no de interferência (siRNA) resultam em clivagem e inativação do mRNA alvo por uma endonuclease RISC chamada slicer. RNAs de silenciamento e interferência são importantes no desenvolvimento normal e no de-senvolvimento de câncer.

6.8 | DEGRADAÇÃO E TURNOVER DE PROTEÍNAS

Proteínas têm tempos de vida que variam muito. Célu-las do cristalino não são substituídas e suas proteínas não são recicladas. Hemoglobina em eritrócitos dura o tempo de vida dessas células, cerca de 120 dias. Outras proteínas têm tempos de vida medidos em dias, horas ou até minutos. Algumas proteínas da coagulação do sangue sobrevivem apenas alguns dias, de modo que he-mofílicos só estão protegidos por um curto período após transfusão ou injeção de fatores necessários. Diabéticos requerem injeções de insulina regularmente uma vez que o hormônio é metabolizado. Enzimas metabólicas variam quantitativamente, dependendo de necessidade ou mudança de situação; por exemplo, a concentração de enzimas do ciclo da uréia muda em resposta à die-ta. Proteínas estão também sujeitas a danos por oxida-ção, proteólise, desnaturação ou outras modificações irreversíveis. Erros em tradução e dobramento levam a proteínas não-funcionais, e processamento proteolí-

tico gera peptídeos não-funcionais como o peptídeo-C da pró-insulina. Em todos os casos, um “tratamento do lixo” é necessário. Proteólise reduz as proteínas a peptí-deos e eventualmente a aminoácidos. A maioria desses aminoácidos é reciclada para sintetizar novas proteí-nas, mas alguns são metabolizados e seus produtos de degradação são excretados. Proteases digestivas como pepsina, tripsina, quimotripsina e elastase hidrolisam proteínas da dieta e não participam do turnover (reci-clagem) intracelular de proteínas, mas os aminoácidos que geram contribuem para a reserva metabólica usa-da na tradução. Isso é particularmente necessário para aminoácidos essenciais (ver Tabela 19.1, p. 726).

Proteólise Dependente de ATP Ocorre em ProteassomosUma via proteolítica bem descrita usa proteassomos, estruturas em forma de halteres que contêm cerca de 28 polipeptídeos (Figura 6.22). Um núcleo cilíndrico é tampado em ambas as extremidades por complexos em forma de V que ajudam a reconhecer e desdobrar po-lipeptídeos e transportá-los para o núcleo proteolítico em um mecanismo que depende de ATP. Direcionamen-to para proteassomos normalmente requer ubiquitina, uma proteína muito conservada de 76 aminoácidos. Proteínas são marcadas para degradação por poliubi-quitinação, como mostrado na Figura 6.23.

Ubiquitina é ativada por enzima E1 para formar um tioéster; ATP é necessário e um complexo transitório AMP-ubiquitina está envolvido. A ubiquitina é, então, passada para enzima E2 e, finalmente, via um grupo de complexos multiprotéicos E3, para uma proteína alvo. Ligação da ubiquitina ocorre por ligações iso-peptídicas entre ε-amino grupos de resíduos de lisina da proteína e o resíduo de glicina carboxi-terminal da ubiquitina. Várias moléculas de ubiquitina são ligadas à proteína e uma à outra, e a proteína poliubiquitinada é levada aos proteassomos e degradada; uma isopepti-dase libera ubiquitina intacta para ser reutilizada.

Proteínas danificadas, defeituosas, dobradas errone-amente ou mutadas são rapidamente degradadas pela via da ubiquitina. Uma mutação na fibrose cística que resulta em deleção de um aminoácido altera muito a es-tabilidade de CFTR (Corr. Clín. 6.6). Seleção de proteí-nas nativas para degradação depende da especificidade da enzima E3; tanto conformação como seqüência de aminoácidos são importantes. Seqüências desestabili-zadoras PEST (ricas em Pro, Glu, Ser e Thr) foram iden-tificadas em várias proteínas de vida curta, e um motivo de interação com ubiquitina, que liga ubiquitina e às ve-zes também promove poliubiquitinação, foi identificado. Outro determinante é a identidade do aminoácido ami-no-terminal. De acordo com a regra do N-terminal, proteínas com resíduos amino-terminais diferentes são degradadas a velocidades completamente diferentes, e o tempo de vida de uma proteína pode ser modificado pela incorporação de um resíduo N-terminal desestabi-

BioQ.06 235 22.01.07 16:44:26

CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA | 241

Plasmídeo

PromotorRestriçãoao sítio A

Restricçãoao sítio B

��Z

Generesistente àantibióticos

DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIAGerald Soslau


7


7.2 A REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA (POLYMERASE CHAIN REACTION), 243

7.3 ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO E MAPAS DE RESTRIÇÃO, 243

Endonucleases de restrição hidrolisam seletivamente DNA, 243

Mapas de restrição permitem preparação rotinei- ra de segmentos definidos de DNA, 245

7.4 SEQÜENCIAMENTO DE DNA, 245 Método de clivagem enzimática interrompida:

procedimento de Sanger, 246

7.5 DNA RECOMBINANTE E CLONAGEM, 248 DNAs de diferentes fontes podem ser ligados

para formar uma nova espécie de DNA: DNA recombinante, 248

Vetores de DNA recombinante são produzidos por clonagem, 249

Clonagem direcional: DNA inserido em DNA vetor em uma direção específica, 249

Bactérias transformadas com DNA recombinante e necessidade de um processo de seleção, 250

Moléculas de DNA recombinante em uma biblio- teca gênica, 250

PCR contorna a necessidade de clonar DNA, 251

7.6 SELEÇÃO DE UM DNA ESPECÍFICO CLONADO EM BIBLIOTECAS, 252

Seleção de bactéria transformada por perda de resistência a antibiótico, 252

α-Complementação para selecionar bactérias que carregam plasmídeos recombinantes, 254

7.7 DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NU-CLÉICOS E PROTEÍNAS QUE LIGAM DNA, 254

Ácidos nucléicos como sondas (probes) para seqüências específicas de DNA ou RNA, 254

Técnica de Southern blot para identificar fragmentos de DNA, 255

Polimorfismo de conformação de cadeia única, 256

Detecção de mRNA, 258 Detecção de proteínas que se ligam a seqüência

específica no DNA, 258

7.8 DNA COMPLEMENTAR E BIBLIOTECAS DE DNA COMPLEMENTAR, 260

mRNA como molde para síntese de DNA usando transcriptase reversa, 260

mRNA desejado pode ser enriquecido por técnicas de separação, 261

Síntese de DNA complementar, 261 RNA celular total como molde para síntese de

DNA usando RT-PCR, 262

7.9 BACTERIÓFAGOS, COSMÍDEO E VETORES DE CLONAGEM EM LEVEDURA, 262

Bacteriófagos como vetores de clonagem, 263 Examinando (screening) bibliotecas de bacte-

riófagos, 264 Clonando fragmentos de DNA em cosmídeos e

vetores cromossomos artificiais, 264

7.10 ANÁLISE DE LONGAS SEQÜÊNCIAS DE DNA, 265

Subclonagem permite definição de grandes segmentos de DNA, 265

Caminhar nos cromossomos (chromosome walking) define arranjo de genes em segmentos longos de DNA, 265

BioQ.07 241 22.01.07 16:48:30


α-Complementação para Selecionar Bactérias que Carregam Plasmídeos RecombinantesVetores foram construídos (a série pUC) de tal modo que bactérias selecionadas transformadas com esses veto-res carregando insertos de DNA estrangeiro, podem ser identificadas visualmente (Figura 7.10). Os plasmídeos pUC contêm as seqüências regulatórias e parte da seqü-ência 5’-codificadora (146 aminoácidos N-terminais) do gene da β-galactosidase (gene lacZ) do operon lac (ver p. 293). O fragmento traduzido N-terminal da β-galac-tosidase é um polipeptídeo inativo. E. coli mutante, que codifica a porção carboxi-terminal inativa que falta da β-galactosidase, pode ser transformada usando-se os plasmídeos pUC. A tradução das porções da β-galactosi-dase do plasmídeo e a da célula hospedeira em resposta a um indutor, isopropil tio-β-d-galactosídeo, se com-plementam mutuamente gerando uma enzima ativa. O processo é chamado α-complementação. Quando es-sas bactérias transformadas são crescidas em presença de um substrato cromogênico (5-bromo-4-cloro-3-in-dolil-β-D-galactosídeo [X-gal]) para a β-galactosidase, formam colônias azuis. Se, entretanto, um fragmento de DNA estrangeiro for inserido na seqüência da por-ção N-terminal da β-galactosidase, a enzima ativa não pode ser formada. Bactérias transformadas com esses plasmídeos recombinantes e crescidas em X-gal dão co-lônias brancas e podem ser selecionadas visualmente, das colônias azuis não transformadas.

7.7 | DETECÇÃO E IDENTIFI-CAÇÃO DE ÁCIDOS NU-CLÉICOS E PROTEÍNAS QUE LIGAM DNA

Ácidos Nucléicos como Sondas (Probes) para Seqüências Específicas de DNA ou RNASondas de DNA e RNA são usadas para seleção de bac-térias que abrigam DNA recombinante de interesse, para análise de mRNA expresso em uma célula ou para identificação de seqüências de DNA em um genoma. Contêm seqüências complementares ao ácido nucléico alvo e hibridizam com o ácido nucléico de interesse. O grau de complementaridade determina a força de liga-ção da sonda. A sonda não precisa conter a seqüência complementar inteira do DNA. A sonda pode ser marca-da, geralmente com 32P ou com marcas não-radioativas que dependem de substratos de enzimas acoplados a nucleotídeos que, quando incorporados ao ácido nuc-léico, podem ser detectados por uma reação catalisada por enzima.

Sondas marcadas podem ser produzidas por nick translation (tradução com corte) do DNA dupla-fita.

FIGURA 7.10α-Complementação para detecção de bactérias transformadas. Um vetor construído (pUC 18) expressa a seqüência codificadora N-terminal da enzima β-galactosidase do operon lac. Bactérias mutantes que codificam a região C-terminal da β-galactosidase são transformadas com pUC 18. Essas bactérias transformadas, crescidas em presença de um substrato especial para a enzima intacta (X-gal), resultam em colônias azuis, porque contêm a enzima para reagir com o substrato. As seqüências codificadoras funcionais N-terminal e C-terminal do gene complementam-se mutuamente, gerando uma enzima funcional. Se, entretanto, um fragmento de DNA estrangeiro for inserido, interrompe a seqüência codificadora N-terminal da β-galactosidase, bactérias transformadas com essa molécula recombinante não produzirão enzima funcional. Colônias de bactérias que contêm esses vetores recombinantes podem ser detectadas visualmente como colônias brancas.

pUC 182686 bp

ampr

Sítio de policlonagem

Promotor

SeqüênciacodificadoraN-terminaldo gene da -galactosidasedo operon-��

Transformação

pUC18

Cromossomo

Seqüência codificadoraN-terminal do gene da -galactosidasedo operon-��

A bactéria cresce em agarcontendo X-gal a um indutordo operon��

Colônias azuis contêm pUC18sem o DNA estrangeiro

pUC 182686 bp

ampr

N-terminalinterrompido

Transformação

Colônias azuis

DNA estranhoinserido

N-terminalinterrompido

pUC18recombinante

ColôniasbrancascontêmpUC18recombinante

A bactéria cresce em agarcontendo X-gal a um indutordo operon��

�

�

BioQ.07 254 22.01.07 16:48:41

CAPÍTULO 7 DNA RECOMBINANTE E BIOTECNOLOGIA | 259

A síndrome da morte súbita infantil (SIDS) é uma causa importante de morte durante o primeiro ano de vida nos Estados Unidos. Estudo prospectivo em mais de 34.000 recém-nascidos que foram monito-rados por eletrocardiografia indicou uma forte cor-relação entre risco aumentado de SIDS e intervalo QT prolongado em seu ECG. Com base nesse estudo, decidiu-se procurar uma mutação em um ou mais dos genes que se sabe estarem relacionados com a síndrome do QT longo em uma criança de 44 dias de idade, que se apresentou cianótica, apnéica e sem pulso ao pronto-socorro de um hospital. A arritmia da criança com um intervalo QT prolongado foi esta-bilizada com múltiplos eletrochoques DC, seguidos de tratamento com drogas. DNA genômico foi pre-parado a partir de linfócitos do sangue periférico da criança e de seus pais. Um gene associado com

a síndrome do QT longo continha a substituição de AAC para TCC na posição 2971 a 2972 (proteína as-sociada com o canal de sódio), por análise de poli-morfismo de conformação de cadeia-única (SSCP) na amostra de DNA da criança, mas não dos pais. A mutação substituiu um resíduo de serina por uma asparagina em uma região muito conservada da proteína, que se presume participe da função do ca-nal de sódio. A mutação não foi detectada em 200 indivíduos controles. A conclusão foi que a criança tinha uma mutação espontânea em um gene asso-ciado com intervalo QT prolongado e isso contribuiu para um evento tipo SIDS. Após tratamento, a crian-ça ficou sem nenhum sintoma por volta dos cinco anos de idade. Esse estudo indica o valor potencial do exame eletrocardiográfico neonatal para reduzir mortalidade infantil por SIDS.

FIGURA 7.13Ensaio de proteção de nuclease. mRNA celular total pode ser isolado de diferentes tecidos. Sondas de DNA fita-única que são complementares a seqüências conhecidas de diferentes genes transcritos (mRNAx, mRNAy, mRNAz) são hibridizadas com a mistura de RNAs. Digestão com uma ribonuclease hidrolisará as regiões de RNA fita-única de mRNA não-hibridizado com a sonda de DNA e todas as espécies de RNA que não hibridizaram. Só os híbridos DNA-RNA protegidos da nuclease permanecerão para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Expressão diferencial de genes em diferentes tecidos é, então, facilmente observada


Polimorfismo de Conformação de Cadeia-Única para Detecção de Mutações Espontâneas que Podem Levar a SIDS

Fonte: Schwartz, P. J., Priori, S. G., Dumaine, R. Napolitano, C., Antzelevitch, C., Stramba-Badiale, M., Richard, T. A., Berji, M. R. e Bloise, R. A molecular link between the sudden infant death syndrome and the long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 343:262, 2000.

Padr

ão

400 bp

300 bp250 bp

Cor

ação

Pulm

ão

Cér

ebro

Pele

(a) Solução de hidrização

Sonda X Sonda Y

Sonda Z

Híbrido X Híbrido Y Híbrido Z

mRNAX mRNAY

mRNAZ

250 bases 300 bases

400 basesOutros RNAs

e sondas nãohidridizadas

(b) Digestão com nuclease

(c ) Reações de amostras de RNA de diferentes tecidos analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.

+

+

+

++250 bp 300 bp 400 bp

BioQ.07 259 22.01.07 16:48:46


fita de M13 é transformado em uma E. coli tipo-selva-gem, a fita contendo uracil é destruída e a fita mutada (–)serve de molde para a progênese dos bacteriófagos, a maioria dos quais carregando a mutação de interesse.

O PCR também pode ser empregado para mutagêne-se sítio-dirigida. Estratégias foram desenvolvidas para incorporar uma base com pareamento errado em um dos oligonucleotídeos que servem de primer para o PCR. Alguns desses procedimentos empregam bacte-riófago M13 e seguem os princípios descritos na Figura 7.26. Uma variação desses métodos de PCR, mutagêne-se por PCR inverso, foi aplicada a pequenos plasmíde-os recombinantes (4-5 kb) (Figura 7.25).

O método é muito rápido, com 50-100% das colônias geradas contendo a seqüência mutante. Os dois pri-mers são sintetizados de modo que pareiem final-com-final com um primer contendo a base errada.

7.14 | APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Métodos de DNA recombinante são aplicáveis a nume-rosas disciplinas biológicas incluindo agricultura, estu-dos de evolução, biologia forense e clínica médica. En-genharia genética pode introduzir proteínas novas ou alteradas em grãos (p. ex., milho), de modo que eles contenham aminoácidos essenciais para o homem mas freqüentemente ausentes de proteínas vegetais. Toxi-nas letais a insetos específicos, mas inócuas ao homem, podem ser introduzidas em grãos para protegerem as plantas, evitando assim o uso de pesticidas que agridem o meio ambiente. O DNA isolado de células do líquido amniótico de uma mulher grávida pode ser analisado quanto a defeitos genéticos no feto. Quantidades mi-

FIGURA 7.25Mutagênese sítio-dirigida de um único nucleotídeo e detecção do DNA mutado. A figura é uma visão geral simplificada do método. Esse processo envolve a inserção de um fragmento de DNA amplificado puro em um vetor bacteriófago modificado, M13. E. coli susceptível, transformada com o DNA recombinante de M13, sintetiza a fita (+) de DNA, acondicionada nas proteínas do bacteriófago. Os bacteriófagos são isolados do meio de cultura, e o DNA do M13 recombinante fita-única é purificado. O DNA do M13 recombinante serve de molde para replicação do DNA por DNA polimerase, desoxinucleosídeos trifosfato (dNTPs), DNA ligase e um primer especial. O primer de DNA (oligômero com pareamento errado) é sintetizado de modo a ser exatamente complementar a uma região do DNA (gene) de interesse, exceto por uma base que se deseja alterar (mutar). O DNA do M13 recém-sintetizado, portanto, contém uma base especificamente mutada que, quando reintroduzida em E. coli susceptível, será fielmente replicada. A E. coli transformada é crescida em placas de agar com réplicas das colônias resultantes sendo feitas em filtro de nitrocelulose. DNA associado com cada colônia é desnaturado e fixado ao filtro com NaOH, e o DNA ligado ao filtro é hibridizado com uma sonda oligômero de DNA marcada com 32P, com pareamento errado. Os mutantes putativos são, então, identificados por exposição do filtro a filme de raio X.

RE

RE

Gene clonadoEndonucleosede restrição (RE)

Gene clonadoe purificado

PLASMÍDEO

Sítio depoliclonagem

Gene �� Z truncado

Elementoregulatóriode �� Z Vetor M13

Fitarecombinante(–) do M13

Transformar��susceptível

Isolar DNA fitaúnica de M13recombinantedo meio M13 RECOMBINANTE

DNA polimerasequatro dNTPs,DNA ligase

Oligômero comum único nucleotídeocom pareamento errado

Transformar ��suscetível e plaquearo bacteriófago resultantecontendo M13 tiposelvagem maisDNA mutadosobre o tapetede ��crescida em agar

DNA ligado a filtro de nitrocelulosecom NaOH, hibridizado com sonda marcadapara o oligômero com pareamento errado

Mutanteputativo

Auto-radiografia

Tocar a placa de agarcom filtro denitrocelulose

5�

3�

BioQ.07 272 22.01.07 16:49:01

CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA | 287

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICADaniel L. Weeks e John E. Donelson


8


8.2 UNIDADE DE TRANSCRIÇÃO EM BACTÉRIAS: O OPERON, 288

8.3 OPERON LACTOSE DE E. COLI, 288 Repressor do operon lactose é uma proteína difu-

sível, 290 Seqüência operador do operon lactose é contígua

a um promotor e três genes estruturais, 291 RNA polimerase e uma proteína reguladora reco-

nhecem seqüência do promotor do operon lactose, 292

Proteína ativadora de catabólito liga promotor lactose, 292

8.4 OPERON TRIPTOFANO DE E. COLI , 293 Operon triptofano é controlado por uma proteína

repressora, 293 Região atenuadora do operon triptofano, 295 Atenuação da transcrição controla outros ope-

rons de biossíntese de aminoácidos, 296

8.5 OUTROS OPERONS BACTERIANOS, 297 Síntese de proteínas ribossômicas é regulada de

modo coordenado, 297 Resposta estringente controla síntese de rRNAs e

tRNAs, 297

8.6 TRANSPOSONS BACTERIANOS, 299 Transposons são segmentos móveis do DNA, 299 Transposons TN3 contêm três genes estruturais,

299

8.7 EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS, 300 DNA eucariótico é ligado a histonas para formar

cromatina, 301 Metilação do DNA correlaciona-se com inativação

de genes, 302

8.8 COMPLEXO DE PRÉ-INICIAÇÃO EM EUCARIO-TOS: FATORES DE TRANSCRIÇÃO, RNA POLI-MERASE II E DNA, 303

Promotores eucarióticos e outras seqüências que influenciam transcrição, 305

Projeto modular de fatores de transcrição euca- rióticos, 305 Motivos comuns em proteínas que ligam DNA e regulam transcrição, 306

8.9 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EUCA- RIÓTICA, 308 Regulando os reguladores, 309 Ativação da transcrição do gene do receptor de

LDL ilustra muitas características encontradas na regulação gênica eucariótica, 309

BIBLIOGRAFIA, 312


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 8.1 Resistência Transmissível a Múltiplas Drogas,

300 8.2 Síndrome de Rubstein-Taybi, 302 8.3 Tamoxifeno e Receptor de Estrógeno como

Alvo, 309 8.4 Fatores de Transcrição e Doença Cardiovas- cular, 310

BioQ.08 287 22.01.07 16:52:32

CAPÍTULO 8 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA | 297

influencie a formação de alças em grampo alternativas, uma das quais lembrando um grampo de terminação seguido de vários resíduos U. Ao contrário do operon trp, transcrição do operon his é regulada primariamen-te por atenuação, uma vez que não possui um operador reconhecido por uma proteína repressora. Em vez dis-so, o ribossomo age como uma proteína reguladora po-sitiva, semelhante ao complexo cAMP-CAP no operon lac. Se o ribossomo estiver ligado (i.é., parado) no sítio atenuador, transcrição dos genes estruturais a seguir estará aumentada. Se o ribossomo não estiver ligado, transcrição desses genes estará muito reduzida.

Transcrição de alguns operons, mostrados na Figu-ra 8.11, pode ser atenuada por mais de um aminoácido. Por exemplo, o operon thr é atenuado por treonina ou isoleucina, enquanto o operon ilv é atenuado por leuci-na, valina ou isoleucina. Esse efeito pode ser explica-do em todos os casos por pausa do ribossomo no códon correspondente, o que interfere com formação de um grampo de terminação. É possível que em seqüências líderes mais longas, a pausa em mais de um códon seja necessária para atingir máxima transcrição pela região de atenuação.

8.5 | OUTROS OPERONS BACTERIANOS

Síntese de Proteínas Ribossômicas É Regulada de Modo CoordenadoMuitos operons bacterianos possuem os mesmos meca-nismos regulatórios gerais dos operons lac, trp e his. Entretanto, cada operon tem suas próprias característi-cas distintas. Um exemplo é dado pelos genes estrutu-rais das 70 ou mais proteínas que compõem os ribosso-mos (Figura 8.12). Cada ribossomo contém uma cópia de cada proteína ribossômica (exceto proteínas L7-L12, que provavelmente estão presentes em quatro có-pias). Portanto, todas as 70 proteínas são necessárias em quantidades equimolares, e faz sentido que sua sín-tese seja regulada de modo coordenado. Seis operons diferentes, contendo cerca de metade dos genes de pro-teínas ribossômicas, ocorrem em dois grupos principais de genes. Um grupo contém quatro operons adjacentes (Spc, S10, str e a) e o outro grupo tem dois operons (L11 e rif) localizados em outro ponto do cromossomo de E. coli. Não há nenhum padrão óbvio de distribuição dos genes entre esses operons. Alguns operons codifi-cam proteínas de uma subunidade ribossômica; outros codificam proteínas de ambas as subunidades. Esses operons também contêm genes de outras proteínas (re-lacionadas).

Por exemplo, o operon str contém genes de fatores de elongação de tradução solúveis, EF-Tu e EF-G, e ge-nes de algumas proteínas da subunidade ribossômica 30S. O operon a contém genes de proteínas de ambas

as subunidades ribossômicas e um gene da subunidade α da RNA polimerase. O operon rif tem os genes das subunidades β e β’ da RNA polimerase e de proteínas ribossômicas.

Uma característica comum aos seis operons de pro-teínas ribossômicas é que sua expressão é regulada por um dos produtos de seus próprios genes estruturais; isto é, são auto-regulados. Em alguns casos, regu-lação ocorre em nível de tradução, não de transcrição como discutido para operons lac e trp. Depois que o mRNA policistrônico é feito, a proteína ribossômica “re-gulatória” liga-se a esse mRNA e determina que região, se alguma, será traduzida. Em geral, a proteína ribos-sômica que regula expressão de seu próprio operon as-socia-se com RNA ribossômico (rRNAs) no ribossomo. Essa proteína tem uma alta afinidade por rRNA e uma afinidade menor por uma ou mais regiões de seu próprio mRNA. Portanto, competição ocorre entre rRNA e o operon do mRNA pela ligação com a proteína. À medida que a proteína se acumula, alcançando um nível mais alto que o de rRNA livre, liga-se a seu próprio mRNA e impede síntese protéica em uma ou mais das seqüên-cias codificadoras desse mRNA (Figura 8.13). Quando mais ribossomos são formados, o excesso dessa proteí-na ribossômica é usado e tradução de seu mRNA pode recomeçar.

Resposta Estringente Controla Síntese de rRNAs e tRNAsBactérias respondem de várias maneiras a extremo es-tresse geral. Uma dessas situações é quando há amino-ácidos insuficientes para manter síntese protéica. Nessas condições, a célula invoca a resposta estringente, que reduz síntese de rRNAs e tRNAs cerca de 20 vezes. Sín-tese de mRNAs também diminui cerca de três vezes.

FIGURA 8.12Operons contendo genes de proteínas ribossômicas de E. coli. Genes dos componentes protéicos das subunidades ribossômicas pequena (S) e grande (L) de E. coli ficam agrupados em vários operons. Alguns desses operons também contêm genes das subunidades α, β e β‘ da RNA polimerase e fatores de síntese protéica EF-G e EF-Tu. Pelo menos um dos produtos protéicos de cada operon geralmente regula expressão desse operon (ver texto).

Operon Proteínaregulatória

Proteínas especificadas pelo operon

��

��

��

�

��

��

S8

L4

S7

S4

L1

L10 L10-L7-��

L11-L1

S13-S11-S4-�-L17

S12-S7-EF•G-EF•Tu

S10-L3-L2-L4-L23-S19-L22-S3-S17-L16-L29

L14-L24-L5-S14-S8-L6-L18-S5-L15-L30

BioQ.08 297 22.01.07 16:52:44


transcritos de modo divergente a partir de uma região de controle de 163 pb, localizada entre eles, que liga o repressor. O repressor também participa da inserção do novo transposon, mas não afeta transcrição do gene de resistência à ampicilina.

Mutações em tnpA que inativam a transposase di-minuem a freqüência de transposição de Tn3. Muta-ções em tnpR que inativam o repressor aumentam a freqüência de transposição. Essas mutações desrepri-mem tnpA, resultando em mais moléculas de transposa-se; isso aumenta a formação de mais cópias duplicadas do transposon. Também desreprime tnpR, mas como o repressor é inativo, isso não tem efeito.

Transposons localizados em plasmídeos bacterianos são de importância crescente em uso clínico de antibi-óticos. Plasmídeos bacterianos que não foram alterados para uso experimental geralmente contêm genes que facilitam sua transferência de uma bactéria para outra. Quando esses plasmídeos se transferem entre diferen-tes cepas bacterianas infecciosas, seus transposons contendo genes de resistência a antibióticos são transportados para as novas cepas bacterianas. Uma vez dentro de uma nova bactéria, o transposon pode se duplicar no cromossomo e ficar permanentemente es-tabelecido naquela linhagem celular. O resultado é que mais e mais cepas de bactérias patogênicas tornaram-se resistentes a um número crescente de antibióticos.

8.7 | EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS

Transcrição de genes em organismos eucarióticos é também regulada para dar a resposta adequada a ne-cessidades biológicas. Além de modular a expressão de genes em resposta a condições nutricionais ou ambien-tais, organismos multicelulares regulam a expressão de genes especializados que direcionam diferenciação celular e caracterizam tipos celulares específicos. Al-guns genes (chamados genes zeladores ou housekee-ping) são expressos na maioria das células, outros são ativados sob demanda e outros, ainda, ficam perma-nentemente inativos em todos, exceto alguns poucos tipos de células. Em células eucarióticas, a membrana nuclear serve de barreira que permite seletivamente o acesso de algumas proteínas ao DNA, enquanto man-tém outras no citosol. Em bactérias, uma RNA polime-rase é responsável pela transcrição de todos os RNAs (tRNA, rRNA e mRNA). Em organismos eucarióticos, três RNA polimerases diferentes são usadas (ver p. 181). RNA polimerase I transcreve os genes de rRNA, RNA polimerase II transcreve os genes que codificam proteínas, cujos transcritos se tornam mRNAs, e RNA polimerase III transcreve os genes de tRNAs e a maio-ria dos outros RNAs pequenos. Embora alguns princí-pios de ativação gênica e controle eucarióticos se apli-quem a todas as três RNA polimerases, nesta seção o foco será transcrição por RNA polimerase II. RNA po-limerase II é composta por pelo menos 10 subunidades diferentes, com tamanhos entre 10 e 220 kDa. Algu-mas das subunidades são também parte dos comple-xos das RNA polimerases I e III, enquanto outras são exclusivas da RNA polimerase II. A subunidade maior da RNA polimerase II tem, dependendo da espécie, até 52 repetições da seqüência de aminoácidos PTSP-SYS em sua região C-terminal (CTD, C-terminal do-main). Uma característica própria dessas repetições é que treonina (T), serina (S) e tirosina (Y) podem ser fosforiladas.

Para entender melhor a regulação da transcrição em eucariotos, é útil relembrar a organização do DNA em cromatina e o papel de modificação no DNA, especial-mente metilação de citosina, sobre ativação gênica.

Além disso, vamos considerar como RNA polimerase II é posicionada no ponto correto do promotor de um gene para transcrever esse gene pela formação de um complexo de pré-iniciação, que envolve organização de fatores de transcrição gerais (TFs) com RNA poli-merase II. A seguir, vamos ver como atividade de genes específicos pode ser regulada pelo uso de enhancers, sítios de ligação de fatores de transcrição e sítios de organização de RNA polimerase. Finalmente, vamos discutir a ativação da transcrição por fatores de transcrição específicos, algumas de suas característi-cas gerais e como são regulados.


Resistência Transmissível a Múltiplas Drogas

Uma tendência alarmante é que bactérias pato-gênicas estão ficando cada vez mais resistentes a um grande número de antibióticos. Muitos casos foram documentados, nos quais uma cepa bacte-riana em um paciente que vinha sendo tratado com um antibiótico, subitamente torna-se resis-tente a esse antibiótico e, simultaneamente, a vários outros antibióticos, embora essa cepa bac-teriana nunca tenha sido exposta antes a esses outros antibióticos. Isso ocorre quando a bactéria subitamente adquire, de outra cepa bacteriana, um plasmídeo que contém vários transposons diferentes, cada um contendo um ou mais genes de resistência a antibióticos. Exemplos incluem: os genes que codificam β-lactamase, que inativa penicilina e cefalosporinas; a cloranfenicol ace-tiltransferase, que inativa cloranfenicol; e fosfo-transferases, que modificam aminoglicosídeos, como neomicina e gentamicina.

Fonte: Neu, H. C. The crisis in antibiotic resistance. Science 257:1064, 1992

BioQ.08 300 22.01.07 16:52:47


Proteínas bZIP têm um domínio de ligação ao DNA composto por uma região básica, definida pela presença de arginina e lisina, localizada a sete aminoácidos antes da primeira leucina e α-hélice. Os aminoácidos básicos estabilizam a associação DNA-proteína por interações eletrostáticas com o esqueleto carregado negativamen-te do DNA, além de formar pontes de hidrogênio na fen-da maior. Sítios de ligação de homodímeros têm sime-tria díade, enquanto essa simetria não é encontrada em sítios de ligação de heterodímeros.

A classe hélice-alça-hélice de fatores de transcrição inclui myoD, myc e max. Dois segmentos de α-hélice anfipática separados por uma alça interveniente carac-terizam proteínas hélice-alça-hélice.

As hélices não são responsáveis por ligação com DNA, como nas proteínas dedos de zinco, mas por di-merização com outra proteína. Como foi descrito para as proteínas bZIP, os dímeros formados podem ser homo ou heterodímeros. O domínio de ligação ao DNA é uma extensão de uma das α-hélices que formam o feixe de quatro-hélices gerado por dimerização (Figura 8.27).

8.9 | REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EUCARIÓTICA

Como indicado acima, uma região relativamente pe-quena de uma proteína regulatória pode ser dedicada à ligação seqüência-específica ao DNA, enquanto outros domínios estão envolvidos em interações proteína-pro-teína ou ligante. Vários domínios de ativação caracte-rísticos foram identificados, incluindo domínios ácidos (alta concentração de aminoácidos com cadeias laterais ácidas), domínios ricos em glutamina, e domínios ricos em prolina. Experimentalmente, superprodução de qualquer desses domínios por técnicas de recombina-ção, mesmo sem seus domínios de ligação ao DNA cor-respondentes, pode levar à ativação errônea de trans-crição de uma variedade de genes. Eles parecem ativar transcrição por meio do aumento da taxa de montagem do complexo de pré-iniciação. Alguns interagem dire-tamente com TFIID, aumentando ligação ao TATA box, enquanto outros interagem com TFIIB ou TAFs que são parte do complexo TFIID. Quando múltiplos fatores de transcrição se ligam a um promotor, eles podem ter um efeito combinatório sobre a ligação e a montagem do complexo de pré-iniciação. Domínios de ativação de muitos fatores de transcrição têm como alvos as mes-mas proteínas no complexo de pré-iniciação.

FIGURA 8.27Formação do fator de transcrição dimérico é mediada por interações hélice-alça-hélice. O motivo hélice-alça-hélice aproxima dois monômeros para formar um dímero que se liga ao DNA. (a) Cada monômero tem duas hélices unidas por uma alça. Uma hélice é usada para interação proteína-proteína, enquanto a outra é usada para ligar a fenda maior do DNA. Assim, o dímero consiste de um feixe de quatro hélices Se o dímero for formado por dois monômeros idênticos, então se espera que os sítios de ligação no DNA sejam muito semelhantes ou idênticos; entretanto, se os monômeros forem proteínas diferentes (formando heterodímeros), então os sítios de ligação no DNA podem ser não-relacionados. (b) Quando fatores de transcrição ligam-se como dímeros, a presença de um monômero truncado pode impedir ligação ao DNA, mesmo em presença de monômeros completos. Por exemplo, se a hélice de dimerização da proteína for feita sem o domínio de ligação ao DNA, a dimerização com um monômero completo produz um produto incapaz de se ligar eficientemente ao DNA.Modificado de Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. e Watson, J. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland, 1994.

��

�� Homodímero HLS ativo Heterodímero HLS inativo

DNA

BioQ.08 308 22.01.07 16:53:21

CAPÍTULO 9 PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO | 315

Fab 1 Fab 2

Prot–A

SS

CHO

C1qTuftsina

Prot–A

Fc

Sítio de ligaçãodo anticorpo (Ag) Sítio de ligação

do anticorpo (Ag)

PROTEÍNAS II: RELAÇÕES ESTRUTURA-FUNÇÃO EM FAMÍLIAS DE PROTEÍNASRichard M. Schultz

PARTE 3 FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

9


9.2 MOLÉCULAS DE ANTICORPOS: SUPERFAMÍLIA DE PROTEÍNAS IMUNOGLOBULINAS, 316

Moléculas de anticorpos contêm quatro cadeias polipeptídicas, 317

Regiões de seqüências constantes e variáveis da estrutura primária, 318

Imunoglobulinas de uma classe contêm regiões de seqüências homólogas comuns, 318

Seqüências repetitivas geram dobras homólo- gas tridimensionais em um anticorpo, 318

Há dois sítios de ligação de antígeno por molécula de anticorpo, 322

Genética das imunoglobulinas, 323 Dobra de imunoglobulina é encontrada em uma

grande família de proteínas com diferentes papéis funcionais, 323

9.3 PROTEÍNAS COM UM MECANISMO CATALÍTI-CO COMUM: SERINO PROTEASES, 324

Enzimas proteolíticas são classificadas por seu mecanismo catalítico, 324

Serino proteases apresentam notável especificidade em hidrólise de ligações peptídicas, 325

Serino proteases são sintetizadas como zimogê- nios, 329

Inibidores protéicos específicos para serino proteases, 330

Serino proteases têm relações estrutura-função semelhantes, 330

Homologia de seqüência em serino proteases, 331

Estruturas terciárias da família serino proteases são semelhantes, 332

9.4 HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA, 334 Hemoglobina humana ocorre em várias formas,

334 Mioglobina: uma cadeia polipeptídica única com

um sítio de ligação para O2, 334 Grupo prostético heme é sítio de ligação de O2,

334 Cristalografia de raios-X definiu a estrutura de

hemoglobina e mioglobina, 336 Estruturas primária, secundária e terciária de

mioglobina e cadeias de hemoglobina, 336 Um equilíbrio simples define ligação de O2 à mio-

globina, 337 Ligação de O2 à hemoglobina envolve cooperativi-

dade entre subunidades, 339 Mecanismo molecular de cooperatividade na

ligação de O2, 340 Hemoglobina facilita transporte de CO2 e NO, 342 Diminuição em pKa de grupos ácidos com mudan-

ça de conformação T para R leva à dissociação de prótons, 343

Transporte de CO2 e O2 é ligado por prótons de efeito Bohr, 344

2,3-Bisfosfoglicerato (BPG) em eritrócitos modula liberação de oxigênio de hemoglobina, 345

Hemoglobina entrega óxido nítrico (NO) para a parede capilar de tecidos onde promove liberação de O2, 345

BioQ.09 315 22.01.07 16:59:32

324 | PARTE 3 FUNÇÕES DE PROTEÍNAS

9.3 | PROTEÍNAS COM UM MECANISMO CATALÍ-TICO COMUM: SERINO PROTEASES

Serino proteases são uma família de enzimas que usam um resíduo de serina ativado de modo singular no sítio de ligação ao substrato, para hidrolisar catalitica-mente ligações peptídicas. Essa serina pode ser carac-terizada pela reação irreversível de seu grupo hidroxila de cadeia lateral com diisopropilfluorofosfato (DFP) (Figura 9.11). De todas as serinas da proteína, DFP re-age só com a serina cataliticamente ativa, formando um éster de fosfato.

Enzimas Proteolíticas São Classificadas por seu Mecanismo CatalíticoEnzimas proteolíticas são classificadas de acordo com seu mecanismo catalítico. Além das serino proteases, outras classes utilizam cisteína (cisteíno proteases), aspartato (aspartato proteases) ou íons metálicos (metalo proteases) para realizar sua função catalí-tica. As que hidrolisam ligações peptídicas no interior de um polipeptídeo são endopeptidases, e aquelas que quebram a ligação peptídica de aminoácidos COOH- ou NH2-terminais são exopeptidases.

Serino proteases freqüentemente ativam outras se-rino proteases a partir de sua forma precursora inativa, denominada um zimogênio, por clivagem de uma liga-ção peptídica específica. Esse mecanismo de ativação

FIGURA 9.9Seqüência de aminoácidos das regiões constantes de cadeias pesadas de genes de cadeia pesada de IgG 1, 2 e 4. Seqüências de CH1, região de articulação H (hinge), regiões CH2 e CH3 são apresentadas. Seqüência de γ1 está completa, e diferenças em γ2 e γ4 em comparação com seqüência γ1 são mostradas usando abreviações de uma letra dos aminoácidos. Linha tracejada (—) indica ausência de aminoácido na posição correspondente em γ1, com a finalidade de melhor alinhar as seqüências para mostrar a homologia máxima.Seqüência de cadeia γ1 de Ellison, J. W., Berson, B. J. e Hood, L. E. Nucleic Acid Res. 10:4071, 1982. Seqüências dos genes γ2 e γ4 de Ellison, J. e Hood, L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1984, 1984.

BioQ.09 324 22.01.07 16:59:43


Quatro ligações são com os átomos de nitrogênio pirró-lico da porfirina. Como os anéis pirrólicos e os carbonos de ligação fazem parte do mesmo sistema aromático, esses átomos ficam em um plano comum. O ferro ligado à porfirina tenderá a ficar no mesmo plano da porfiri-na. A quinta e a potencial sexta ligações com ferro são direcionadas ao longo de um eixo perpendicular ao pla-no do anel porfirínico (Figura 9.20). A quinta ligação é com um nitrogênio do imidazol de uma histidina. Esta

é designada como histidina proximal nas estruturas de hemoglobina e mioglobina (Figuras 9.20 e 9.21). O2 forma a sexta ligação; o O2 é colocado entre o átomo ferroso e um segundo imidazol de histidina, designada como histidina distal. Na desoxi-hemoglobina, a sex-ta posição está desocupada.

O heme é posicionado dentro de um bolsão hidrofó-bico de cada subunidade globina, com aproximadamen-te 80 interações fornecidas por cerca de 18 resíduos,


Hemoglobinopatias

Há mais de 800 hemoglobinas humanas mutantes diferentes. Mutações causam instabilidade na es-trutura da hemoglobina, afinidade aumentada ou diminuída por oxigênio, ou um aumento na taxa de oxidação do ferro ferroso do heme (Fe2+) para o es-tado férrico (Fe3+). Uma hemoglobina férrica, não-funcional, é chamada meta-hemoglobina e é simbo-lizada por HbM.

Hemoglobinas instáveis surgem por substituição de prolina por um aminoácido em uma região de α-hélice da dobra de globina. Prolinas não participam da estrutura em α-hélice e a quebra de um segmento de α-hélice gera uma hemoglobina instável (exem-plos são HbSaki

β14Leu→Pro e HbGenova β28Leu→Pro). Ou-

tras hemoglobinas instáveis surgem por substituição por um aminoácido que é muito grande ou muito pequeno para estabelecer contatos corretos, ou por colocação de um grupo carregado ou polar no lado de dentro de um domínio. Hemoglobinas instáveis desnaturam facilmente e precipitam, formando cor-pos de Heinz, que danificam a membrana do eritró-cito. Pacientes com hemoglobinas instáveis podem desenvolver anemia, reticulocitose, esplenomegalia e urobilinúria.

Algumas hemoglobinas mutantes têm afinida-de aumentada por oxigênio (P50 mais baixa). Um exemplo interessante é HbCowtown

β246His→Leu, na qual a histidina, que dissocia 50% dos prótons do efeito Bohr, é perdida. Essa mutação impede a regulação da dissociação de oxigênio por concentração de íons hidrogênio e desestabiliza a conformação T, em re-lação à conformação R, causando um aumento na afinidade por oxigênio e liberação diminuída de O2 para os tecidos. Mutações em hemoglobina que in-terferem com ligação de DPG também aumentam afinidade por oxigênio. Hemoglobinopatias com

afinidade aumentada por oxigênio são freqüen-temente caracterizadas por anemia hemolítica e formação de corpos de Heinz.

Hemoglobinas mutantes que formam meta-hemoglobina incluem HbMIwate

α87His→Tyr e HbMHydePark

β92His→Tyr, onde as histidinas pro-ximais F8 das cadeias α e β, respectivamen-te, estão mutadas. Na HbMBoston

α58His→Tyr e na HbMSaskatoon

β63His→Tyr, as histidinas distais E7 estão mutadas. Mutações de aminoácidos que fi-cam junto do heme ou formam o sítio de ligação com oxigênio freqüentemente levam a meta-he-moglobina. Pacientes com altas concentrações de meta-hemoglobina apresentam cianose (cor azulada na pele).

Duas das mutações mais prevalentes ocor-rem no aminoácido da mesma posição, o β6Glu. Quando esse glutamato é substituído por valina, o resultado é HbSβ6Glu→Val; enquanto substitui-ção por lisina gera HbCβ6Glu→Lys. Homozigotos com HbS expressam anemia falciforme, na qual as moléculas de hemoglobina precipitam como tactóides ou longas cadeias, o que produz a for-ma de foice dos eritrócitos (ver Corr. Clín. 3.3). HbC forma uma estrutura diferente de agregado consistindo de cristalóides de extremidades ce-gas. Isso reduz o tempo de vida dos eritrócitos, mas causa menos hemólise que HbS. Esta forma de hemoglobinopatia apresenta efeitos patológi-cos mais limitados. Como ambas HbS e HbC são comumente encontradas em certas populações negras da África, não é raro encontrar indivídu-os heterozigotos para ambos os genes mutantes nessas populações. Indivíduos com HbSC terão uma anemia intermediária entre as observadas para homozigotos de HbS e HbC.

Fonte: Dickerson, R. E. e Geis, I. Hemoglobin: Structure, Function, Evolution, and Pathology. Menlo Park, CA: Benjamin-Cummings, 1983. Arcasoy, M. O. e Gallagher, P. G. Molecular diagnosis of hemoglobinopathies and other red blood cell disorders. Semin. Hematol. 36:328, 1999.

BioQ.09 335 22.01.07 16:59:57


FIGURA 9.37Ligação e liberação de NO por hemoglobina durante o ciclo respiratório. O modelo mostra a ligação e a dissociação de NO, O2 e CO2 enquanto uma molécula de hemoglobina faz dois ciclos completos na circulação. O primeiro ciclo envolve intermediários 1-4, e o segundo ciclo, intermediários 5-8. As conformações T e R são mostradas e os grupos SH são da cadeia lateral de βCys93. O NO é ligado diretamente a um ferro-heme ou ao SH da βCys93. As etapas-chaves no transporte de NO são (i) sua ligação inicial a um heme no intermediário 3 e transferência do heme de uma subunidade β para βCys93 no intermediário 6 (conformação R) e (ii) sua transferência para uma molécula tiol pequena X-SH no intermediário 7 (conformação T), quando hemoglobina é convertida de R para T. A molécula de hemoglobina representada pode ser apenas 1 em 1.000 moléculas de hemoglobina circulantes, devido à relativamente baixa concentração molar de NO no sangue.Redesenhado de Gross, S. S. e Lane, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9967, 1999.

9.5 | O COMPLEXO PROTÉICO DA LÂMINA BASAL

Uma lâmina basal é um complexo muito estruturado de proteínas de matriz extracelular observado inicial-mente ao microscópio como uma região amorfa densa-mente empacotada de cerca de 50 a 100 nm de espes-sura circundando tecidos ou células (Figura 9.39). O termo membrana basal é usado para descrever a lâ-mina basal e os colágenos fibrilares ligados ao seu lado externo. A membrana basal dá suporte a tecidos e re-gula acesso de células ao estroma intersticial. Também participa da determinação de propriedades de células que estão ligadas a ela, incluindo os críticos processos

de divisão celular, morte (apoptose), diferenciação e migração. Todas as células produzem constituintes de membrana basal, e cada membrana basal tem caracte-rísticas do tipo celular, a partir do qual é sintetizada. Uma membrana basal sublinha camadas de células epi-teliais e endoteliais, e circunda outros tipos de células (Figura 9.39). Uma membrana basal separa duas cama-das de células no glomérulo renal, onde funciona como um filtro seletivo.

Uma lâmina basal é formada por associações não-covalentes entre sítios específicos localizados em domí-nios de ligação das proteínas associadas. Muitas prote-ínas de membrana basal também se ligam a células por meio de domínios de ligação a células nas proteínas e receptores celulares na membrana celular externa. A estrutura de muitas das proteínas é composta de uni-dades modulares com homologia de seqüência e de do-bras com superdobras comuns, como as dobras de imu-noglobulinas (Ig) e de fator de crescimento epidérmico (EGF). Essas dobras são encontradas repetitivamente e são os blocos construtores de proteínas de matriz extracelular. Enquanto módulos EGF nessas proteínas não parecem ter função de fator de crescimento, prote-ínas fatores de crescimento e citocinas são encontradas na lâmina basal, particularmente em associação com as partes carboidrato dos proteoglicanos componentes. Durante a reciclagem (turnover) da membrana basal induzida por proteases e heparanases, esses fatores de crescimento e citosinas são liberados para agirem sobre células vizinhas. Além disso, muitas proteínas de lâmi-na basal escondem atividades crípticas que são ativadas quando clivadas e removidas da seqüência completa por ação de proteases (ver endostatina, p. 1021). O pró-protease plasminogênio está ubiquamente presente na matriz extracelular e é ativado por secreção celular de ativadores de plasminogênio (ver p. 979).

Composição Protéica da Lâmina BasalA lâmina basal é composta de colágeno tipo IV, lami-nina, nidogem (também chamado entactina) e perle-cam, o proteoglicano de heparam sulfato. Além disso, pequenas quantidades de talvez 50 outras proteínas po-dem estar presentes, incluindo osteopontina (também chamada BM-40 ou SPARC), fibulina, colágeno tipo XV, colágeno tipo XVIII e o proteoglicano agrim. A diversi-dade e a tecido-especificidade de uma membrana basal é determinada pelas isoformas de colágeno tipo IV e la-minina e os tipos de proteínas minoritárias presentes. Isoformas de colágeno tipo IV são produzidas por sete genes diferentes de colágeno tipo IV. Essas isoformas compartilham homologia de estrutura de domínios, mas diferem em 30-50% de suas seqüências de amino-ácidos. Há pelo menos 12 isoformas de laminina. As isoformas de colágeno tipo IV e laminina expressas são características do tipo celular e do tecido que sintetiza a membrana basal associada.

T

1

5

8

4 3

7

6

2O2

CO2

CO2

3 O2 1 O2

4 O2

X-SNO

X-SNO

CO2

CO2

HS SH

VEIA ARTÉRIA

CAPILAR ARTERÍOLA

TO2

O2

O2O2

HSON SH

T

HSON SH

T

HS SH

T

HS

NO

SH

R

HS

NO

NO

SH

O2O2

O2O2

R

ONS SH

O2O2

O2O2

R

HS SH

BioQ.09 347 22.01.07 17:00:54


ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLEHenry Weiner


10


10.2 CLASSIFICAÇÃO DE ENZIMAS, 360 Classe 1: Óxido-redutases, 361 Classe 2: Transferases, 361 Classe 3: Hidrolases, 361 Classe 4: Liases, 362 Classe 5: Isomerases, 362 Classe 6: Ligases, 363

10.3 CONCEITOS GERAIS DE MECANISMOS ENZI-MÁTICOS, 363

Considerações termodinâmicas, 363 Ligação de substrato por uma enzima, 364 Estado de transição, 364 Ligação forte no estado de transição, 365 Reações iônicas não precisam envolver íons,

365 Ligações parcialmente carregadas, 366 Importância do grupo carbonila, 366 Oxidações, 367 Adição e remoção de prótons, 367 Ligação covalente de substrato à enzima, 367 pH afeta a reação por afetar ácidos e bases gerais,

368

10.4 SÍTIO ATIVO DE UMA ENZIMA, 368 Estereoquímica ajuda a explicar o mecanismo de

reações catalisadas por enzimas, 370 Influência de grupos sobre o substrato distal à

ligação a ser modificada, 370

10.5 COENZIMAS, CO-SUBSTRATOS E COFATORES, 371

Coenzimas, 371 NAD e NADP são formas coenzimas da niaci-

na, 372

FMN e FAD são formas coenzimas da riboflavina, 373

Piridoxal fosfato é a forma coenzima de piridoxal, 373

Adenosina trifosfato pode ser um segundo substrato ou um modulador de atividade, 374

Cofatores íons metálicos, 374 Papel de metais em oxidação e redução, 376

10.6 CINÉTICA DE REAÇÕES QUÍMICAS, 376 Velocidade de formação de produto, 376 Reações de primeira e segunda ordem, 377 Velocidade de desaparecimento de substrato, 377 Reações reversíveis, 378 Reações complexas , 378

10.7 CINÉTICA ENZIMÁTICA DE REAÇÕES DE UM SUBSTRATO, 379

Equação de Michaelis-Menten, 380 Concentração de enzima livre, 382 Significado de Km, 382 Número de turnover (kcat), 382 Significado de kcat na equação de Michaelis-Men-

ten, 383 Quando concentração de substrato é muito

maior que Km, 383 Quando concentração de substrato é muito

menor que Km, 383 Reações reversíveis, 384 Baixo Km versus alto kcat, 384 Calculando as constantes, 384 Substrato e produto ligam-se ao mesmo

sítio, 385 Efeito das condições de ensaio, 385 Temperatura, 385 pH, 385

BioQ.10 358 22.01.07 17:10:09

CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE | 371

10.5 | COENZIMAS, CO-SUBSTRATOS E

COFATORES

Muitas enzimas requerem a participação de uma coenzi-ma, um co-substrato ou cofator na reação catalítica. Co-enzimas são moléculas orgânicas pequenas, freqüente-mente derivados de vitaminas (ver p. 1074). Podem ser ou não modificadas (p. ex., oxidadas ou reduzidas) na reação. As que são alteradas são também chamadas co-substratos. Para algumas reações, a energia de hidróli-se de ATP é necessária sem incorporação de sulfato ao produto. ATP nessas reações é um co-substrato. Íons metálicos são freqüentemente necessários para reações enzimáticas e chamados cofatores.

CoenzimasTabela 10.2 lista as coenzimas e vitaminas a partir das quais são derivadas. Coenzimas participam de enzimas catalisadas por enzimas, mas não são os compostos pri-mários que estão sendo modificados. Algumas coenzi-mas participam da ação de muitas enzimas diferentes, enquanto outros participam apenas de um número li-mitado de reações. Podem ter afinidades pela enzima semelhantes ao substrato, podem ser fortemente liga-das ou podem ser covalentemente ligadas. Algumas são modificadas durante uma reação, mas estão no seu es-tado original no final da reação (modificação cíclica), enquanto outras permanecem modificadas no fim. Se estiverem modificadas no fim (p. ex., oxidadas ou redu-zidas), devem participar de outra reação para retornar ao seu estado original. Coenzimas estão presentes em células em uma concentração razoavelmente constante,

Cistationinúria é uma doença genética na qual γ-cis-tationase está deficiente ou inativa. A cistationase catalisa a reação:

Cistationina → cisteína + α-cetobutirato

Deficiência da enzima leva ao acúmulo da cista-tionina no plasma. Como cistationase é uma enzima dependente de piridoxal fosfato, vitamina B6 foi ad-ministrada a pacientes cujos fibroblastos continham material que apresentavam reação cruzada com an-ticorpos contra cistationase. Muitos responderam à terapia com B6 com uma queda nos níveis plasmá-


Mutação de um Sítio de Ligação de Coenzima Resulta em Doença Clínica

Fonte: Pascal, T. A., Gaull, G. E., Beratis, N. G., Gillam, B. M., Tallan, H. H. e Hirschhorn, K. Vitamin B6-responsive and unresponsive cystathionuria: two variant molecular forms. Science 190: 1209, 1975.

ticos de cistationina. Esses pacientes produzem a apoenzima, que reagiu com o anticorpo. Em um pa-ciente, a atividade enzimática era não-detectável em homogenatos de fibroblastos, mas aumentou para 31% do normal com a adição de piridoxal fosfato 1 mM à mistura de reação. Acredita-se que o Km para a ligação do piridoxal fosfato à enzima tenha aumen-tado, devido a uma mutação no sítio de ligação. Ati-vidade é parcialmente restaurada aumentando-se a concentração de coenzima. Aparentemente, esses pacientes requerem uma concentração de estado estacionário mais alta de coenzima para manter a atividade de γ-cistationase.

TABELA 10.2 Coenzimas

Coenzima Vitamina Reação Mediada

Biotina Biotina Carboxilação

Cobalamina (B12) Cobalamina (B12) Alquilação

Coenzima A Pantotenato Transferência de acil

Coenzimas flavina Riboflavina (B2) Oxidação-redução

Ácido lipóico Transferência de acil

Coenzimas nicotinamida Nicotinamida Oxidação-redução

Piridoxal fosfato Piridoxina (B6) Transferência de amino

Tetra-hidrofolato Ácido fólico Transferência de grupo de um carbono

Tiamina pirofosfato Tiamina (B1) Transferência de carbonila

BioQ.10 371 22.01.07 17:10:28

CAPÍTULO 10 ENZIMAS: CLASSIFICAÇÃO, CINÉTICA E CONTROLE | 383

geral, este termo representa a(s) etapa(s) mais lenta(s) da reação. Como Km, kcat é composta de várias constan-tes de velocidade individuais.

Significado de kcat na Equação de Michaelis-Menten

Quando Concentração de Substrato É Muito Maior do que Km

Equação 10.19 está na forma de uma equação hiperbóli-ca geral. Quando o valor de [S] é muito maior que o va-lor de Km, o valor do denominador aproxima-se do valor de [S], e a equação pode ser aproximada por

v

kk= =cat

cat

E S

SE

[ ][ ]

[ ][ ]

(10.26)

isto é, a velocidade torna-se independente da concentra-ção de S; a reação torna-se de ordem zero com relação a S. Isso é encontrado na parte da curva onde a veloci-dade essencialmente se nivela, e não aumenta quando a concentração de [S] aumenta (inclinação = 0) (Figura 10.47). A reação está acontecendo à sua velocidade má-

xima nessas condições porque praticamente 100% da enzima está no complexo ES. No instante em que uma molécula de produto é feita, ela deixa a enzima e outra molécula de S liga-se à enzima, mantendo sempre a en-zima saturada com S. Nessas condições, a velocidade é governada estritamente pelos termos que governam a reação de ES indo para produto (ES → E + P).

Quando Concentração de Substrato É Muito Menor do que Km

Quando [S] é muito baixa comparada com Km, Eq. 10.18 pode ser aproximada como

v

k

kv

V

Kt

m m

= =cat maxE Sou

S[ ][ ] [ ]

(10.27)

Um gráfico de v versus [S] seria linear, uma con-dição que existe só quando [S] << valor de Km. Como para qualquer reação química a velocidade de formação de produto é uma constante de velocidade multiplicada pela concentração de reagentes, o termo kcat/Km pode ser considerado como uma constante de velocidade de segunda ordem, uma vez que há dois termos de concen-

A sensibilidade incomum de asiáticos a bebidas alco-ólicas tem uma base bioquímica. Em alguns japone-ses e chineses, muito menos álcool é necessário para produzir vasodilatação, que resulta em rubor facial e aceleração dos batimentos cardíacos, do que o ne-cessário para causar o mesmo efeito em europeus. Os efeitos fisiológicos devem-se ao acetaldeído gera-do pela álcool desidrogenase hepática. Acetaldeído é normalmente removido por aldeído desidrogenase (ALDH), que converte acetaldeído em acetato. Um aminoácido na posição 487 na subunidade de 500 aminoácidos da enzima tetramérica está trocado em alguns dos indivíduos afetados. A enzima ativa tem um glutamato, enquanto a variante inativa tem uma lisina. Descobriu-se que a variante asiática tem ati-vidade muito baixa, e o Km para NAD+ aumentado de 30 μM para 7.000 μM. Embora a enzima esteja ativa, teria muito pouca atividade no fígado porque o Km é muito alto e kcat, muito baixa.

Além disso, indivíduos afetados eram heterozi-gotos, tendo genes para a enzima glutamato ativa e a enzima lisina essencialmente inativa. Esperar-se-ia


Efeito Fisiológico de Mudanças nos Valores de Km de Enzimas

Fonte: Zhou J. e Weiner, H. Basis for half-of-the-site reactivity and the dominance of the K487 oriental subu-nit over the E487 subunit in heterotetrameric human liver mitochondrial aldehyde dehydrogenase. Biochemistry 39:12019, 2000.

que sua enzima fosse 50% ativa, mas apresentava ati-vidade muito baixa. ALDH forma tetrâmeros com os dois monômeros (E4, E3K, E2K2, EK3 e K4), onde E4 e K4 são formas homotetraméricas das subunidades contendo glutamato e lisina, respectivamente, e as outras são heterotetrâmeros. E3K tinha 50% da ativi-dade total, não 75%, enquanto EK3 praticamente não tinha atividade, não os 25% que se poderia esperar com uma subunidade ativa. A subunidade K era do-minante e podia inativar a subunidade, à qual estava pareada, uma vez que o resíduo da posição 487 inte-rage com uma arginina da posição 475. Quando um glutamato estava na posição 487, uma ligação salina estável se formava, mas quando uma lisina estava na posição 487, causava um movimento da arginina. O movimento rompia o bolsão de ligação a NAD, em-bora o resíduo 487 não estivesse em contato com a dobra de Rossmann. Este exemplo ilustra o fato de uma mutação puntual em uma enzima poder afetar o sítio ativo, embora o resíduo não esteja em contato direto com essa região. Também mostra como uma subunidade pode ser dominante sobre outra.

BioQ.10 383 22.01.07 17:10:54


10.10 | REGULAÇÃO DE ATI-VIDADE ENZIMÁTICA

Modificação CovalenteCélulas têm capacidade de regular a atividade de en-zimas-chaves por modificação covalente ou ligação re-versível de ligantes. Muitos exemplos de modificação covalente, como fosforilação, serão descritos em outros capítulos. Há muitas proteínas quinases que catalisam fosforilação de resíduos de serina, treonina ou treoni-na em proteínas e enzimas específicas (ver p. 490) e proteína fosforilases que removem o fosfato por hidróli-se. Dependendo da proteína, fosforilação pode aumen-tar ou diminuir a atividade enzimática. Outros grupos além do fosfato podem ser adicionados a uma enzima para alterar sua atividade, incluindo sulfato e acetato. Modificação covalente de proteínas é um modo rápido e eficiente de controlar atividade de uma proteína ou enzima.

Controle Alostérico de Atividade EnzimáticaEmbora os sítios de ligação de substrato e ativo de uma enzima sejam estruturas bem definidas, a atividade de muitas enzimas pode ser modulada por ligantes agindo

de modos diferentes de inibidores competitivos ou não-competitivos. Ligantes podem ser ativadores, até mes-mo os substratos de enzimas. Os ligantes que mudam a atividade enzimática, mas não são modificados em con-seqüência da ação enzimática, são chamados efetores, modificadores ou moduladores. A maioria das enzimas sujeitas à modulação por ligantes são enzimas determi-nantes de velocidade de vias metabólicas.

Enzimas que respondem a moduladores têm sí-tios adicionais conhecidos como sítio(s) alostérico(s). Alostérico é derivado da raiz grega allo, significando “o outro”. Um sítio alostérico é uma região específica da enzima, bem diferente do sítio de ligação do substrato. A existência de sítios alostéricos é ilustrada na Corr. Clín. 10.10. Os ligantes que se ligam a sítios alostéricos são chamados efetores alostéricos ou moduladores. Li-gação de um efetor alostérico causa uma mudança con-formacional na enzima, de modo que a afinidade pelo substrato ou outros ligantes também muda. Efetores alostéricos positivos (+) aumentam a afinidade da enzi-ma por substrato ou outro ligante. O inverso é verdade para efetores alostéricos negativos (–). O sítio alostéri-co no qual o efetor positivo se liga é chamado um sítio ativador; o efetor negativo liga-se a um sítio inibitório.

Enzimas alostéricas são divididas em duas classes, com base no efeito do efetor alostérico sobre Km e Vmax. Na classe K, o efetor altera o Km, mas não Vmax, en-quanto na classe V, o efetor altera Vmax, mas não Km. Enzimas da classe K dão gráficos duplos-recíprocos como os de inibidores competitivos, e enzimas da classe

A descoberta de que sítios alostéricos inibitórios são separa-dos de sítios alostéricos ativadores, bem como dos sítios de ligação de substrato e catalítico, é ilustrada por um estudo de um paciente com gota, cujo nível de PRPP nos eritrócitos estava aumentando. Descobriu-se que a PRPP sintetase do paciente tinha valores normais de Km, Vmax, juntamente com sensibilidade à ativação por fosfato. Os níveis aumentados de PRPP e hiperuricemia surgiram porque os produtos finais da via (ATP, GTP) não eram capazes de inibir a sintetase no sítio alostérico inibitório (I). Sugeriu-se que uma mutação no sítio inibitório ou no mecanismo de acoplamento entre o sítio inibitório e catalítico levou ao defeito do mecanismo de controle por feedback.


Um Caso de Gota Demonstra a Diferença entre um Sítio Alostérico e um Sítio de Ligação de Substrato

Fonte: Sperling, O., Persky-Brosh, S., Boen, P. e DeVries, A. Human erytrocyte phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase mutationally altered in regulatory properties. Biochem. Med. 7: 389, 1973

A

C

I

ATPRibose

Pi

AMPGMP

ATPGTP

PRPPsintetase

–

+

PRPP

BioQ.10 394 22.01.07 17:11:17

CAPÍTULO 11 CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASES | 407

NADPH

Citocromo P450Redutase

Citocromo �5

Citocromo P450

FosfatoRibitolN ON

NNH3CH3C

AdeninaRiboseFosfatoFosfatoRibitolNO N

N NO

O

2e-

[FAD]

[FMN]

1e-

1e-

?

C

• •

C

CC

NN

NN

• •

CFe

C

CCN

NN

N

•

CH3CH3

CITOCROMOS P450 E ÓXIDO NÍTRICO SINTASESLinda J. Roman e Bettie Sue Siler Masters


11


11.2 CITOCROMOS P450: PROPRIEDADES E FUN-ÇÃO, 408

11.3 CICLO DE REAÇÃO DO CITOCROMO P450, 409

11.4 SISTEMAS DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS DOS CITOCROMOS P450, 410

NADPH-citocromo p450 redutase é a flavopro- teína doadora de elétrons no retículo endo-

plasmático, 410 NADPH-adrenodoxina redutase é a flavoproteína

doadora de elétrons em mitocôndrias, 411

11.5 CITOCROMO P450: NOMENCLATURA E ISO-FORMAS, 412

11.6 CITOCROMOS P450: SUBSTRATOS E FUN-ÇÕES FISIOLÓGICAS, 413

11.7 CITOCROMOS P450 PARTICIPAM DE SÍNTESE DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES E DE OXIGENA-ÇÃO DE COMPOSTOS ENDÓGENOS, 414

Citocromos P450 oxidam substratos lipofílicos exógenos, 417

11.8 INDUÇÃO E INIBIÇÃO DE CITOCROMO P450, 423

Interações droga-droga, 423 Polimorfismos genéticos de citocromo P450, 425 Inibição terapêutica de citocromo P450, 425

11.9 AS ÓXIDO NÍTRICO SINTASES: PROPRIEDA-DES E FUNÇÃO, 425

11.10 ISOFORMAS DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASES E FUNÇÕES FISIOLÓGICAS, 428

NOSI, 428 NOSII, 429 NOSIII, 430

BIBLIOGRAFIA, 432


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 11.1 Hiperplasia Adrenal Congênita: Deficiência

de CYP21A2, 416 11.2 Produção de Hormônios Esteróides Duran-

te a Gestação, 418 11.3 Inibição de Citocromo P450: Interações

Droga-Droga e Efeitos Adversos, 420 11.4 Papel de CYP2E1 em Toxicidade Hepática

Induzida por Acetaminofen, 422 11.5 Indução de Citocromo P450: Interações

Droga-Droga e Efeitos Adversos, 423 11.6 Polimorfismos Genéticos de Enzimas P450,

426 11.7 Mecanismo de Ação de Sildenafil, 430 11.8 Aspectos Clínicos da Produção de Óxido

Nítrico, 431 11.9 História da Nitroglicerina, 432

BioQ.11 407 22.01.07 17:15:52


11.5 | CITOCROMO P450: NOMENCLATURA E ISOFORMAS

Devido ao grande número de citocromos P450 que fo-ram identificados (mais de 4.500 em janeiro de 2005), um sistema de classificação das enzimas em grupos funcionais e nomenclatura foi desenvolvido. O sistema escolhido é baseado em classificação de acordo com a identidade relativa das seqüências de aminoácidos das enzimas. A superfamília dos citocromos P450 é assim dividida inicialmente em famílias, nas quais a identida-de da seqüência de aminoácidos dos membros é superior a 40%. A família é designada pelo prefixo “CYP”, em re-ferência a cytochrome P450, seguida por um numeral arábico (p. ex., CYP1, CYP2, CYP3, etc). As famílias são ainda divididas em subfamílias, nas quais a identidade

de seqüência de aminoácidos dos membros é superior a 55%. A subfamília é identificada por uma letra maiús-cula arábica (p. ex., CYP1A, CYP1B, CYP1C, etc.). Os membros individuais de cada subfamília são então nu-merados na ordem em que foram identificados (p. ex., CYP1A1, CYP1A2, CYP1A3, etc.). Embora citocromos P450 sejam enzimas, os termos “isoenzima” ou “isozi-ma” não são usados para descrever essas proteínas; em ver disso, o termo “forma”ou “isoforma” é usado.

Tabelas 11.1 e 11.2 relacionam as isoformas conheci-das de citocromos P450 humanos. Há 57 isoformas divi-didas em 18 famílias e 41 subfamílias. O genoma humano codifica 58 pseudogenes CYP que não formam proteína ativa. Tabela 11.1 lista as isoformas que utilizam prima-riamente compostos exógenos (p. ex., drogas e xenobió-ticos); cada isoforma metaboliza uma ampla variedade de substratos. Tabela 11.2 lista as isoformas envolvidas em metabolismo de compostos endógenos; essas isoformas geralmente reconhecem apenas um ou dois substratos específicos, e estes são apresentados na tabela.

TABELA 11.1 Citocromos P450 Humanos Envolvidos em Metabolismo Exógeno

Família CYP Isoformas Substrato(s)

Selecionado(s)Inibidor(es)

Selecionado(s)Indutor(es)

Selecionado(s)

1 1A1 Benzo(a)pireno, diclofenac Cetoconazol Benzo(a)pireno

1A2 Benzo(a)pireno, warfarina Ciprofloxin Erva de São João

1B1 Benzo(a)pireno, aflatoxina B1 Tamoxifen NCa

2 2A6 Acetaminofen, nicotina Canabidol Dexametasona

2A7 NC NC NC

2A13 Hexametilfosforamida NC NC

2B6 Diazepam, mefenitoína Cetoconazol Rifampicina

2C8 Taxol, ibuprofen, verapamil Quinina Fenobarbital

2C9 Amitriptilina, naproxen Sulfafenazol Rifampicina

2C18 Imipramina, metadona NC Rifampicina

2C19 Diazepan, omeprazol Isoniazida Rifampicina

2D6 Fluvastatina, codeína, risperidona Quinidona Dimetilsulfóxido

2E1 Acetaminofen, halotano Watercress Isoniazida, etanol

2F1 Naftaleno, estireno NC NC

2J2 Bufuralol NC NC

2R1, 2S1 NC NC NC

2U1, 2W1 NC NC NC

3 3A4 Eritromicina, nifedipina, codeína, warfarina, terfenadina

Troleandomicina, cetoconazol

Cortisol, rifampina, fenobarbital

3A5 Verapamil, prevastatina NC Dexametazona

3A7 Ácido retinóico, codeína, cortisol DHEA NC

3A43 Testosterona NC NC

a NC, não bem caracterizado.

BioQ.11 412 22.01.07 17:16:01


Acetaminofen, comumente usado como analgésico e antipirético, é convertido por CYP2E1 em N-acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQ1), um composto muito rea-tivo levando a aductos protéicos, estresse oxidativo e to-xicidade. Normalmente, acetaminofen é primariamente metabolizado por vias de glucuronidação e sulfatação em conjugados polares, inativos, que são facilmente ex-cretados (Figura 11.14, vias superior e inferior, respec-tivamente). Acetaminofen é também metabolizado por CYP2E1 em NAPQ1 muito reativo (Figura 11.14, via do meio). A quantidade de acetaminofen que é metaboliza-da por CYP2E1 é normalmente baixa, em comparação com glucuronidação e sulfatação. As pequenas quanti-dades de NAPQ1 formadas são rapidamente conjugadas por glutationa (ver p. 764) em um metabólito não-tóxico.

FIGURA 11.12O metabolismo de terfenadina em fexofenadina, o composto bioativo.

Os papéis que citocromos P450 desempenham no metabolismo de drogas e as sérias conseqüências das interações droga-droga foram demonstrados com clareza para duas drogas, terfenadina (Selda-ne) e cisapride (Propulside), quando seu metabolis-mo foi inibido por outras drogas. Uma pequena por-centagem dos usuários teve efeitos adversos graves, que forçaram seus fabricantes e o Food and Drug Administration (FDA) a divulgar avisos de que es-sas drogas não podem ser tomadas juntamente com outras drogas que inibem CYP3A4. A gravidade dos efeitos adversos forçou o FDA a remover ambas as drogas do mercado.

O FDA aprovou terfenadina, um anti-histamínico de segunda geração, em 1985, para tratar alergias sazonais. Terfenadina é rapidamente metabolizada no fígado por CYP3A4 em fexofenadina, como mos-tra a Figura 11.12, resultando em baixos níveis da droga original logo depois da ingestão, mas os efei-tos terapêuticos do terfenadina são realmente cau-sados por fexofenadina. Como muitas outras drogas são substratos ou inibidores de CYP3A4, o metabo-lismo de terfenadina é potencialmente passível de inibição. Indivíduos que tomaram terfenadina com o antibiótico macrolídeo eritromicina, ou com o agente antifúngico cetoconazol, ambos fortes inibidores de CYP3A4, apresentaram níveis plasmáticos significa-tivamente elevados de terfenadina. Numa pequena porcentagem de usuários de terfenadina, problemas


Inibição de Citocromo P450: Interações Droga-Droga e Efeitos Adversos

cardíacos sérios surgiram, porque a droga parental causou alteração nos canais cardíacos de potássio e aumentou o risco de uma taquicardia ventricular rara, chamada Torsade de Pointes. Alguns indiví-duos morreram de problemas cardíacos que se de-senvolveram depois que tomaram terfenadina com eritromicina ou cetoconazol. Como as propriedades terapêuticas da terfenadina estão associadas com seu metabólito não-tóxico fexofenadina, o fabrican-te testou fexofenadina como um novo medicamento e buscou aprovação do FDA para esse metabólito, agora comercializado como Allegra.

Cisapride foi aprovado em 1993 para pacientes que sofrem de azia noturna, que resulta de doença de refluxo gastro-esofágico ou GERD. A eliminação dessa droga do corpo depende do seu metabolismo por CYP3A4, e quando administrada sozinha ou com outras drogas que não inibem CYP3A4, a droga ori-ginal não se acumula no plasma. Entretanto, quan-do tomada com outras drogas que são substratos ou inibidores de CYP3A4, o metabolismo de cisapride é reduzido e acumula-se com administrações subse-qüentes. Em alguns indivíduos, níveis aumentados de cisapride causam arritmias cardíacas e, por volta do final de 1999, anomalias de ritmo cardíaco foram relatados em 341 pacientes que tomavam cisapride, resultando em 80 mortes. Então, o fabricante de ci-sapride parou de comercializar essa droga nos Esta-dos Unidos, após 2000.

Fonte: Terfenadine: proposal to withdraw approval of two new drugs applications and one abbreviated new drug application. Fed. Reg. 62:1889, 1997. (Esse documento pode ser visto na página da internet do Federal Register em http://www.access.gpo.gov/su_docs/aces/aces140.html); e Desta, Z., Soukhova, N., Mahal, S. K. e Flockhart, D. A. Interactions of cisapride with the human cytochrome P450 system: metabolism and inhibition studies. Drug Metab. Dispos. 28:789, 2000.

NOH

HO

NOH

CO2H

HO

Terfenadina

Metabolismo de Terfenadina

(Seldane)

Fexofenadina(Allegra)

CYP3A4

BioQ.11 420 22.01.07 17:16:08


11.10 | ISOFORMAS DE ÓXIDO NÍTRICO SINTASES E FUNÇÕES FISIOLÓGICAS

Há três isoformas principais de NOS – neuronal (NOSI ou nNOS), indutível (NOSII ou iNOS) e endotelial (NOSIII ou eNOS) – embora variações em cada um desses tipos ocorram em muitos organismos diferentes. Propriedades dessas isoformas são resumidas na Tabe-la 11.4.

Muitas das funções fi siológicas de NO são mediadas por ativação de guanilato ciclase solúvel, uma proteí-na heterodimérica (α/β) contendo heme que converte GTP em cGMP. cGMP é um segundo mensageiro envol-vido em muitas cascatas de transdução de sinal (ver p. 518). A forma inativa da guanilato ciclase solúvel tem um heme penta-coordenado, ligado por uma histidina à subunidade β. NO liga-se à sexta posição para formar um heme hexa-coordenado e causa quebra da ligação heme-histidina, gerando o complexo nitrosil ativo, pen-ta-coordenado, da guanilato ciclase solúvel (Figura 11.19). Ativação da guanilato ciclase solúvel causa au-mento de até 400 vezes na taxa de formação de cGMP. Os níveis de cGMP são regulados por um equilíbrio entre atividade de guanilato ciclase e fosfodiesterase (PDE), particularmente PDE5, que é específi ca para cGMP, que hidrolisa cGMP em 5’-GMP, desligando o sinal.

NOSINOSI é encontrada primariamente em músculo es-quelético e em neurônios tanto do sistema nervoso central como do periférico. É uma enzima solúvel, em-

bora se localize na membrana por interações proteí-na-proteína com uma gama de proteínas regulatórias e de localização. É expressa constitutivamente, o que signifi ca que não é normalmente induzida em nível transcripcional, e é ativada pelo infl uxo de cálcio. No caso de NOSI, e NOSIII, ver a seguir), calmodulina não está ligada à enzima nos níveis intracelulares basais de cálcio. Requer um infl uxo de cálcio para elevar a concentração de cálcio, permitindo ligação da calmo-dulina, assim ativando a formação de NO. A quantida-de de NO sintetizado no estado ativado é muito baixa – isto é, picomolar. O NO produzido funciona como um neurotransmissor nos sistemas nervosos central e pe-riférico. No músculo esquelético, NO também serve de mediador da força contrátil.

No sistema nervoso central, NO é produzido geral-mente por NOSI no neurônio pós-sináptico, mas difun-de de volta na sinapse para o neurônio pré-sináptico. Síntese de NO é regulada pelo infl uxo de cálcio por ca-nais dependentes de receptor – isto é, após estimulação pós-sináptica de receptores de N-metil-D-aspartado (NMDA) pelo neurotransmissor excitatório glutamato. Guanilato ciclase é ativada por NO, produzindo cGMP, que regula síntese dos neurotransmissores norepinefri-na e glutamato, aumentando assim a produção de NO (Figura 11.20). NO está implicado em sinalização neu-ral, neurotoxicidade, plasticidade neuronal, aprendiza-do e memória, e percepção de dor.

Além de seus domínios oxigenase e redutase, NOSI tem um domínio PDZ N-terminal de 300 aminoácidos, que medeia sua interação com outras proteínas. No sis-tema nervoso central, o domínio PDZ da NOSI interage com a proteína de densidade pós-sináptica PSD-95. O receptor NMDA também interage com PSD-95, aproxi-mando muito NOSI e o receptor NMDA, de modo que NOSI fi ca diretamente exposta ao cálcio entrando pelo canal iônico do receptor NMDA ativado.

TABELA 11.4 Propriedades das Isoformas de NOS

Propriedade NOSI NOSII NOSIII

Massa molecular 160 kDa 130 kDa 135 kDa

Expressão Constitutiva Indutível Constitutiva

Fração celular Citoplasmática Citoplasmática Ligada à membrana

Dependência de infl uxo de cálcio Dependente Independente Dependente

Ação fi siológica Neurotransmissão Citotoxicidade Vasodilatação

FIGURA 11.19Ativação da guanilato ciclase solúvel por NO.Redesenhado com base em fi gura de Bellamy, T. C. e Garthwaite, J. The receptor-like properties of nitric oxide-activated soluble guanylate cyclase in intact cells. Mol. Cell. Biochem. 230:165, 2002.

His β1α1

Fe2+

NO

Hisβ1α1

Fe2+

NO

Hisβ1α1

FFFeee

Fe2+

NO

FFeee2+2+2+2+

��

BioQ.11 428 22.01.07 17:16:19


MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA E TRANSPORTE EM MEMBRANASThomas M. Devlin


12


12.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE MEMBRANAS, 438

Lipídeos são importantes componentes de membranas, 438 Glicerofosfolipídeos são os lipídeos mais abundantes de membranas, 438 Glicerofosfolipídeos são anfipáticos, 441 Esfingolipídeos estão presentes em membranas,

441 Colesterol é um importante componente de

membranas plasmáticas, 443 Composição em lipídeos varia entre membranas,

443 Proteínas de membrana, 444 Carboidratos de membranas são parte de glicoproteínas ou glicolipídeos, 445

12.3 MICELAS, BICAMADAS LIPÍDICAS E LIPOS-SOMOS, 445

Lipídeos formam estruturas vesiculares, 445 Bicamadas lipídicas sintéticas e lipossomos, 445 Propriedades gerais de bicamadas lipídicas, 446

12.4 ESTRUTURA DE MEMBRANAS BIOLÓGICAS, 447

Modelo do mosaico fluido de membranas biológicas, 447 Lipídeos são distribuídos assimetricamente em

membranas, 448 Proteínas integrais de membrana ficam mergulhadas na bicamada lipídica, 449

Proteínas periféricas de membrana, 451 Proteínas de membrana ancoradas por lipídeos,

451 Proteínas e lipídeos difundem em lamelas da

membrana, 452 Microdomínios de complexos lipídeo-proteína

estão presentes em membranas, 454 Natureza dinâmica de membranas, 455

12.5 MOVIMENTO DE MOLÉCULAS ATRAVÉS DE MEMBRANAS, 456

Algumas moléculas difundem através de bicamadas lipídicas, 456 Classificação e nomenclatura de sistemas de

deslocamento por membrana, 457

12.6 CANAIS DE MEMBRANAS, 458 Classificação dos canais de membrana, 458 Características dos canais de membrana, 459 Aquaporinas e aquagliceroporinas, 459 Canais iônicos de Na+, Ca2+, K+ e Cl– controlados por voltagem, 460 Canal nicotínicos de acetilcolina (nAChR), 464 Junções comunicantes (gap junctions) e canais do poro nuclear, 465

12.7 TRANSPORTADORES DE MEMBRANA, 466 Quatro etapas no transporte de moléculas de

soluto, 466 Energética de sistemas de transporte de membrana, 467

12.8 TRANSPORTE PASSIVO, 468

BioQ.12 436 22.01.07 17:18:53

CAPÍTULO 12 MEMBRANAS BIOLÓGICAS: ESTRUTURA E TRANSPORTE EM MEMBRANAS | 445

Carboidratos de Membranas São Parte de Glicoproteínas ou GlicolipídeosCarboidratos estão presentes em membranas como oligossacarídeos covalentemente ligados a proteínas (glicoproteínas) e a lipídeos (glicolipídeos). Os açú-cares nos oligossacarídeos incluem glicose, galactose, manose, fucose, N-acetilgalactosamina, N-acetilglu-cosamina e ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) (Figura 12.18 e Apêndice, para estruturas). Estruturas de glicoproteínas e glicolipídeos são apresentadas nas páginas 638 e 708, respectivamente. O carboidrato fica na superfície extracelular da membrana plasmática e na superfície luminal do retículo endoplasmático. Fun-ções de carboidratos ligados a proteínas em membranas incluem reconhecimento célula-célula, adesão e ação como receptor. Há pouco ou nenhum carboidrato livre em membranas.

12.3 | MICELAS, BICAMADAS LIPÍDICAS E LIPOSSOMOS

Lipídeos Formam Estruturas VesicularesA característica estrutural básica das membranas deve-se às propriedades físico-químicas dos glicerofosfolipí-deos e esfingolipídeos. Esses compostos anfipáticos, com uma cabeça hidrofílica e uma cauda hidrofóbica (Figura 12.19a), interagem em sistemas aquosos in vitro para formar esferas, chamadas micelas (Figura 12.19b). Os grupos das cabeças polares ficam no lado de fora da es-fera, enquanto as caudas hidrofóbicas interagem para excluir água. Micelas têm apenas uma superfície polar, que fica no lado apresentado para a fase aquosa. Mice-las podem ser preparadas contendo um único lipídeo ou uma mistura de lipídeos. A concentração de lipídeos necessária para formação de micelas é a concentração micelar crítica. Formação de micelas também depen-de da temperatura e, se uma mistura de lipídeos estiver presente, da razão entre as concentrações dos diferen-tes lipídeos (ver p. 1062). A estrutura da micela é muito estável, graças às interações hidrofóbicas entre cadeias hidrocarbônicas e atração dos grupos polares de cabe-ça pela água. Micelas são importantes em digestão in-testinal e absorção de lipídeos (ver p. 1031).

Bicamadas Lipídicas Sintéticas e Lipossomos

Dependendo das condições experimentais, lipídeos anfipáticos como glicerofosfolipídeos formam uma es-

trutura em bicamada, com duas camadas de lipídeos formando uma estrutura na qual há contato mínimo das cadeias hidrocarbônicas com água. Os grupos da cabeça polar ficam na interface entre o meio aquoso e o lipídeo, e as caudas hidrofóbicas interagem, criando um ambiente interior hidrofóbico que exclui água (Fi-gura 12.19c). Esta conformação em bicamada é a estru-tura lipídica básica de todas as membranas biológicas. Bicamadas lipídicas são extremamente estáveis, sendo mantidas juntas por forças hidrofóbicas das cadeias hi-drocarbônicas e interações iônicas dos grupos carrega-dos das cabeças com água. Bicamadas lipídicas selam-se automaticamente, se rompidas.

Uma bicamada lipídica, em condições adequadas, fechar-se-á sobre si mesma para formar uma vesícula esférica que separa o ambiente externo de um com-partimento aquoso interno. Tais vesículas, chamadas lipossomos (Figura 12.19d), são preparadas usando lipídeos purificados e lipídeos extraídos de membranas

FIGURA 12.18Estruturas de alguns carboidratos de membrana.

CH2OHO

H

H HNCOCH3

HH

HOHOHHO

N-Acetil-�-D-glucosamina

CH2OHO

H

H HNCOCH3

HOH

HOHOHH

N-Acetil-�-D-galactosamina

Ácido N-Acetil-D-neuramínico

HO

H

OH H

HCH3

HOHOHHO

�-L-Fucose

H

OCOOH

OH H

HN HCOH

HCOHCH2OH

HH OHH

CCH3

O

II

BioQ.12 445 22.01.07 17:19:06


acessórias (β, γ ou δ) não têm uma estrutura comum; algumas têm vários segmentos transmembrânicos e ou-tras são proteínas periféricas localizadas inteiramente intra ou extracelularmente. Estão geralmente envolvi-das em regulação do canal; subunidades β podem inte-ragir com proteínas de citoesqueleto e de matriz extra-celular. Um modelo do canal de Na+ é apresentado na Figura 12.38. Um segmento transmembrânico tem um


O Rim de Mamíferos e Aquaporinas

O papel primário do rim é regular o pH do sangue, eliminar produtos tóxicos do metabolismo e regular equilíbrio de água do corpo. Cada rim contém cer-ca de um milhão de néfrons, as unidades funcionais multicelulares do tecido. Cada néfron tem várias re-giões distintas (ver diagrama), cada uma com fun-ções muito específicas no processamento do filtrado do sangue, que ocorre no glomérulo. Uma grande quantidade de sangue é filtrada (cerca de 150 L/dia), e a água deve ser reabsorvida no néfron e ductos co-letores, exceto cerca de 1,5 L/dia, que é excretado como urina. Aquaporinas são responsáveis pela re-cuperação de água do filtrado à medida que flue pelo lúmen do néfron. Como indicado no diagrama, pelo menos sete diferentes isoformas de aquaporinas, lo-calizadas em diferentes pontos ao longo do néfron e dos ductos coletores, são responsáveis pela reabsor-ção de água.

Existem várias doenças renais nas quais a reab-sorção de água é anormal e nas quais a expressão e a função das aquaporinas foi investigada. Vários mo-delos animais dessas condições foram úteis na de-terminação da causa de algumas dessas condições. Baixos níveis de AQP2 e poliúria (excreção excessi-va de urina) são encontrados em diabetes insipidus nefrogênica adquirida (NDI), hipocalemia adquirida (baixo K+ sangüíneo) e hipercalcemia (Ca2+ sangü-íneo aumentado). Em muitos casos, NDI é causada por incapacidade do rim responder a vasopressina (ver p. 897); considera-se que isso leve a uma ex-pressão diminuída e/ou incorporação de AQP2 na membrana. Em outros casos de NDI, há um defeito no gene da aquaporina; em alguns casos, este de-feito leva a uma incapacidade do monômero formar estruturas tetraméricas normais. Níveis de AQP1, AQP2 e AQP3 em modelos animais são reduzidos

em isquemia tissular. Em algumas condições, como insuficiência cardíaca congestiva, cirrose hepática e gravidez, há um aumento na quantidade de AQP2 no rim, levando a uma expansão no volume líquido ex-tracelular. Seres humanos sem atividade de AQP1 do rim aparentemente não têm problemas detectáveis em condições normais, mas podem ter em condições de estresse (desidratação). Espera-se que condições clínicas adicionais venham a ser atribuídas a altera-ções nas outras aquaporinas.

Urina final

Dutos coletoresAQP 2, 3, 4, 6, 8

Tubo proximalAQP 1, 7, 8

Alça descendentefina

AQP 1

Túbulo contornadodistal

Alçaascencente

fina

Túbulo deconexão

Glomérulo

Água

Água

+ADHágua

+ADHágua

Água

Água

Localização de aquaporinas em cada segmento do néfron e ductos coletores do rim.

Modificado a partir de figura das citações abaixo.

Fonte: King, L. S. e Yasui, M. Aquaporins and disease: Lessons from mice to humans. Trends Endocrinol. Metab. 13:355, 2002. Nielsen, S., Frokiaer, J., Marples, D., Kwon, T-H., Agre, P., e Knepper, M. A. Aquaporins in the kidney: From molecules to medicine. Physiol. Rev. 82: 205, 2002. King, L. S., Kozono, K., e Agre, P. From structure to disease: The evolving tale of Aquaporin biology. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 5:687, 2004.

resíduo carregado positivamente a cada terceira posi-ção, e pode servir como um sensor de voltagem; des-locamento mecânico deste segmento pode levar a uma mudança conformacional na proteína, resultando em abertura do canal. Dois mecanismos muito diferentes foram sugeridos, mas nenhum provado, para como o ca-nal e os domínios sensíveis a voltagem são acoplados e iniciam a abertura do canal. Canais iônicos voltagem-

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12.10 | IONÓFOROS

Um grupo interessante de compostos sintetizados e excretados por bactérias facilita a translocação de íons inorgânicos através de membranas de outras células. Essas moléculas, chamadas ionóforos, são membros dos canais sintetizados não-ribossomicamente (ver p. 459) e são compostos de peso molecular relativamente baixo (até alguns milhares de daltons). Há dois subgru-pos principais. (1) transportadores móveis, que ligam um íon e se difundem facilmente em uma membrana, e (2) formadores de canal. Alguns ionóforos importantes são listados na Tabela 12.11.

Cada transportador móvel tem uma especificidade definida para íons. Valinomicina (Figura 12.59) tem uma afinidade por K+ 1.000 vezes maior do que por Na+, e A23187 (Figura 12.60) tem uma afinidade por Ca2+ 10 vezes maior do que por Mg2+. Vários dos transpor-tadores móveis têm uma estrutura cíclica, e o íon fica coordenado com átomos de oxigênio no centro da es-trutura; a periferia da molécula consiste de grupos hi-drofóbicos. Quando um íon é quelado pelo ionóforo, sua capa de água é removida e o íon é envolvido pela capa hidrofóbica. O complexo ionóforo-íon difunde-se livre-mente através da membrana. Como interação de íon e ionóforo é uma reação de equilíbrio, uma concentração de estado estacionário (steady state) do íon se estabe-lece em ambos os lados da membrana.

Valinomicina transporta K+ por um mecanismo ele-trogênico uniporte que cria um gradiente eletroquímico através de uma membrana, visto que transporta um K+ carregado positivamente (Figura 12.61a). Nigericina é um antiporter eletricamente neutro; seu grupo carbo-xila, quando dissociado, liga um íon positivo, como K+, formando um complexo neutro que cruza a membrana. Transporta um próton de volta na difusão pela membra-na, levando a uma troca de K+ por H+ (Figura 12.61b).

Gramicidina A é um peptídeo de 15 resíduos com D- e L-aminoácidos alternados. Em membranas, forma uma β-hélice e pode dimerizar, formando um longo seg-mento transmembrânico (25 Å) e um canal de diâmetro estreito (5 Å) (Figura 12.62). Resíduos polares reves-

TABELA 12.11 Importantes Ionóforos

Composto Importantes Cátions Transportados Ação

Valinomicina K+ ou Rb+ Uniporte, eletrogênico

Nonactina NH4+, K+ Uniporte, eletrogênico

A23187 Ca2+/2 H+ Antiporte, elétron-neutro

Nigericina K+/H+ Antiporte, elétron-neutro

Monensina Na+/H+ Antiporte, elétron-neutro

Gramicidina H+, Na+, K+, Rb+ Forma canais

Alameticina K+, Rb+ Forma canais

L-Val

L-Val

L-Val

D-Val

D-Val

D-Val

H

HH

O

O

O

O O

O

OO

O

OOO

O

NN

N

NN

N

O

O

O

O

O

L

LLK+

CH3

CH3

CH3

CH3

NH

C

C

H3C

OH

O

O

O

OOH

H

NH

N

FIGURA 12.59Estrutura do complexo valinomicina-K+. Abreviaturas: D-Val, D-valina; L-Val: L-valina; L, L-lactato; H, D-hidroxiisovalerato.

FIGURA 12.60Estrutura de A23187, um ionóforo de Ca2+.

tem o canal e grupos hidrofóbicos ficam na periferia do canal, interagindo com a membrana lipídica. A estru-tura permite a passagem de água e cátions divalentes, mas não ânions. Associação e dissociação de monôme-ros controla a taxa de fluxo de íons.

Ionóforos têm atividade de antibiótico, porque rompem o equilíbrio iônico intracelular. São também valiosas ferramentas experimentais em estudos de translocação de íons em membranas biológicas e para manipulação da composição iônica de células.

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CAPÍTULO 13 FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINAL | 483

P P P P

FUNDAMENTOS DA TRANSDUÇÃO DE SINALGeorge R. Dubyak


13


13.2 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTERCELULAR, 485

Dois modos fundamentais de transdução de sinal intercelular, 485

Sinalização justácrina ou contato-dependente, 485

Sinalização endócrina, 486 Sinalização parácrina, 486 Sinalização sináptica ou neuronal, 486 Sinalização autócrina, 486 Moléculas sinalizadoras secretadas, 487

13.3 RECEPTORES PARA MOLÉCULAS SECRETA-DAS, 487

13.4 TRANSDUÇÃO DE SINAL INTRACELULAR POR RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR, 488

Ligantes, receptores e interações receptor-ligante, 488

Relações entre receptores, efetores e segundos mensageiros, 489

Fosforilação de proteínas na transdução de sinal, 490

Proteínas regulatórias que ligam GTP na trans- dução de sinal, 491

Outros componentes de complexos de sinaliza- ção mediada por receptor e cascatas, 491

Interação ligante-receptor e eventos subse- qüentes de sinalização, 492

Término da transdução de sinal por receptores de superfície celular, 492

13.5 RECEPTORES CANAIS IÔNICOS LIGANTE-DE-PENDENTES, 493

Receptores canais iônicos , 494 Término da sinalização por receptores canais

iônicos, 495 Regulação de canais iônicos por outros recep-

tores, 495

13.6 RECEPTORES LIGADOS A ENZIMAS, 496 Funções fisiológicas de ligantes extracelulares,

496 Receptores tirosina quinases (RTKs), 496 Ras GTPase e MAP quinase, 497 Receptores serina/treonina quinases, 499

13.7 RECEPTORES DE CITOCINAS, 500 Receptores de citocinas: estrutura e função,

500

13.8 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G, 500

Funções fisiológicas e ligantes extracelulares, 500

Estrutura de receptores acoplados a proteína G, 501

Proteínas G heterotriméricas, 503 O ciclo da proteína G, 505 Término da sinalização por receptores

acoplados a proteína G, 506 Efeitos de toxinas bacterianas sobre pro- teínas G heterotriméricas, 506

13.9 TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM AMP CÍCLICO, 506

Regulação da síntese e degradação de AMP cíclico, 506

Mecanismos intracelulares de sinalização por AMP cíclico, 508

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ou reprimir transcrição e, assim, alterar a expressão de proteínas codificadas por estes genes. Devido a seus efeitos sobre a expressão gênica, ativação de receptores intracelulares produz mudanças de longa duração (de horas a dias) na função das células-alvos. A estrutura e a função desses receptores são descritas em maiores detalhes na p. 488.

Receptores de superfície celular atuam como sítios de reconhecimento para a vasta maioria de mo-léculas sinalizadoras que são muito grandes (proteí-nas ou hormônios polipeptídicos) ou muito hidrofílicas para cruzar rapidamente a membrana plasmática da célula-alvo. Tais moléculas sinalizadoras interagem com a célula-alvo ligando-se a receptores de superfí-cie celular que são proteínas integrais de membrana (Figura 13.3b). Proteínas receptores de superfície são acopladas a uma variedade de reações bioquímicas in-tracelulares chamadas cascatas ou vias de transdu-ção de sinal.

O evento mais proximal ou precoce da transdução de sinal, desencadeado pela ligação de uma molécula sinalizadora a um receptor, é uma mudança conforma-cional do receptor que resulta no seguinte: (1) geração

de moléculas sinalizadoras intracelulares conhecidas como segundos mensageiros (a molécula secretada extracelular é o primeiro mensageiro); ou (2) uma mu-dança no potencial elétrico de membrana plasmática; e (3) ativação de cascatas enzimáticas envolvendo pro-teína quinases, proteína fosfatases ou proteases. Qua-tro superfamílias principais de receptores de superfície celular estrutural e funcionalmente relacionados são mediadores da imensa maioria de vias de comunicação intercelular (Figura 13.4); estas incluem receptores canais iônicos ligante-dependentes, receptores ligados a enzimas ou catalíticos; família de re-ceptores de citocinas; e receptores acoplados a proteína G ou GPCR.

13.4 | TRANSDUÇÃO DE SINAL INTRACELULAR POR RECEPTORES DE SUPERFÍCIE CELULAR

Ligantes, Receptores e Interações Receptor-LiganteUm ligante é qualquer molécula que se liga a uma re-ceptor protéico. Um agonista é um ligante que, ao se li-gar, ativa transdução de sinal, enquanto um antagonis-ta é um ligante que impede transdução de sinal quando se liga ao receptor. Um agonista ou antagonista fi-siológico é uma molécula de ocorrência natural (como um hormônio ou neurotransmissor) que atua como um ligante para um receptor. Um agonista ou antagonis-ta farmacológico é uma molécula sintética que atua como um ligante para um receptor. Muitas drogas tera-pêuticas são agonistas ou antagonistas de receptores.

Certos agonistas fisiológicos podem estimular múl-tiplos tipos de receptores que são chamados subtipos de receptores. O conceito-chave é que a mesma molé-cula extracelular sinalizadora pode se ligar a diferen-tes receptores protéicos que são produtos de diferentes genes. Por exemplo, acetilcolina pode interagir com um receptor canal iônico ligante-dependente (ver p. 465) que causa contração de músculo esquelético, ou com receptores acoplados a proteína G (ver p. 491) que cau-sam relaxamento do músculo cardíaco (Figura 13.5).

FIGURA 13.4Principais classes de receptores de superfície celular para moléculas sinalizadoras secretadas.Redesenhado com base em figura de Alberts, B., et al. Essential Cell Biology, 2nd ed. New York: Garland, 2004.

�� Receptor canal iônico ligante-dependente

Membranaplasmática

ReceptorCitosol

Íons

Neurotransmissor

�� Receptores acoplados a proteína G

�� Receptores ligados a enzimas

�� Receptores de citocinas

Proteína G

Neurotransmissor ou hormônio

Enzima Proteína G ativada Enzima ativada

Domínio catalítico inativo Domínio catalítico inativo

Enzima ativada

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transitoriamente e estimulam uma família de proteína serina/treonina quinases, que desencadeiam a cascata da proteína quinase ativada por mitógeno (mitogen-ac-tivated protein kinase) ou cascata da MAP quinase (Figura 13.17). Esta cascata de amplificação envolve ações em série de três proteína quinases; a primeira quinase, ativada por Ras (ou MAP quinase quinase qui-nase) ativa um conjunto intermediário de MAP quinase quinases, que ativam as MAP quinases finais efetoras.

Quando ativadas, as MAP quinases terminais fosfori-lam múltiplas proteínas-alvos no citosol e no núcleo, in-cluindo fatores de transcrição que regulam a expressão de genes necessários para divisão celular, sobrevivência celular ou diferenciação fenotípica.

O receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF) foi o primeiro com atividade intrínseca de ti-rosina quinase a ser identificado e caracterizado em detalhes. Este receptor catalítico é membro de uma família de quatro proteínas relacionadas, chamadas receptores ErbB/HER, devido à sua semelhança com o oncogene v-erbB de vírus de eritroblastose aviária, que induz leucemia eritróide em pássaros. Esta liga-ção entre proteínas ErbB/HER e câncer também se observa no homem. Superexpressão do gene ErbB1 humano, que codifica o receptor humano de EGF (HER1), caracteriza cânceres de bexiga, mama, rim, próstata e pulmão de célula não-pequena. Um gene ErbB1 mutante produz um receptor que não tem o domínio extracelular de ligação a EGF, e é muito expresso nos glioblastomas, que correspondem a 25% dos tumores de cérebro humano adulto. ErbB3 e ErbB4 humanos, respectivamente, codificam os receptores HER3 e HER4 que se ligam a proteínas extracelulares pertencentes à família NRG (neurre-gulina/herregulina/neu) de fatores de crescimento e diferenciação. ErbB3 é freqüentemente superex-presso em cânceres de mama, cólon, próstata e estô-mago, enquanto superexpressão de ErbB4 foi obser-vada em tumores de células da granulosa ovariana. O outro membro da família é o gene ErbB2, que co-difica a proteína HER2 a qual, surpreendentemente, não tem capacidade de se ligar a nenhum fator de crescimento extracelular conhecido. Em vez disso, receptores HER2 possuem uma conformação basal que permite a eles formarem homodímeros com ou-tras proteínas HER2 não-ligadas ou heterodímeros com receptores HER1, HER3 ou HER4 ocupados por fator de crescimento. Como dimerização é a etapa crítica para ativar a atividade intrínseca de tirosina quinase dessa proteína, mesmo modesta superex-pressão de HER2 pode alterar regulação normal de crescimento celular. Significativamente, expressão


Família de Receptores Tirosina Quinases ErbB/HER como Alvos para Quimioterapia do Câncer

do gene ErbB2 é amplificada em até duas ordens de grandeza em 20% dos seres humanos com câncer de mama invasivo.

A expressão aberrante de proteína ErbB/HER em múltiplos cânceres humanos tem levado ao desenvol-vimento de várias terapias por drogas que têm estes receptores como alvos. Um grupo de agentes tera-pêuticos inclui anticorpos monoclonais que se ligam a domínios extracelulares funcionalmente significa-tivos de diferentes subtipos de HER. Trastuzumab (Herceptin® da Genentech) é um anticorpo anti-HER2 que tem sido usado, desde 1998, para o trata-mento desses cânceres de mama caracterizados por superexpressão de ErbB2/HER2. O mecanismo por trás das ações antitumorais de Trastuzumab/Her-ceotin® envolve o recrutamento de fatores imunes anticorpo-dependentes que matam as células tumo-rais e a atenuação da proteólise do ectodomínio de HER2 (por metaloproteases nativas) que potencia-liza ainda mais a dimerização constitutiva desses receptores. Cetixumab (IMC-C225 ou Erbitux® da ImClone) é um anticorpo que interage com o domí-nio de ligação de EGF da proteína ErbB1/HER1 e, assim, impede ativação induzida por ligante do re-ceptor. Este agente está sendo testado em pacientes com cânceres de célula escamosa de cabeça e pes-coço ou cânceres de pulmão de célula não-pequena. Além dessas terapias baseadas em anticorpos, uma variedade de drogas que são moléculas pequenas foi projetada para atingir os domínios intracelula-res tirosina quinase das proteínas ErbB/HER. Esses reagentes são compostos baseados em 4-anilinoqui-nazolina, que atuam como inibidores competitivos dos sítios de ligação de ATP das quinases, particu-larmente do subtipo ErbB1/HER1. No momento, tais drogas estão sendo testadas em pacientes sofrendo de cânceres de pulmão de célula não-pequena que não responderam a outras quimioterapias.

Fonte: Roskowski, R., Jr. The ErbB/HER receptor protein-tyrosine kinases and cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319:1, 2004.

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nal) podem fosforilar uma ampla faixa de proteínas substratos. Alterar a atividade dessas proteínas é o mecanismo primário, pelo qual Ca2+ aumentado alte-ra o comportamento celular. CaM-quinase II também se autofosforila quando ligada a calmodulina. Embora Ca2+ citosólico seja só transitoriamente aumentado em resposta à ativação de receptores de superfície celular, esta autofosforilação de CaM-quinase II permite que permaneça ativa muito depois do Ca2+ citosólico ter voltado ao nível de linha basal. CaM-quinases podem fosforilar e modular uma ampla faixa de enzimas, ca-nais iônicos, proteínas contráteis e proteínas regulató-rias de genes.

13.12 | TRANSDUÇÃO DE SINAL BASEADA EM FOSFOLIPÍDEOS

Metabolismo Regulado de Fosfolipídeos como um Componente de Vias Intracelulares de SinalizaçãoTransdução de sinal por muitos receptores de super-fície celular envolve ativação de uma ou mais fosfoli-pases que catalisam a hidrólise de diferentes classes de fosfolipídeos (p. ex., fosfolipídeos de inositol ou colina). Várias importantes classes de enzimas efeto-ras fosfolipases catalisam a produção de diferentes produtos que atuam como segundos mensageiros ou reguladores de produção de segundos mensageiros (Figura 13.32). Enzimas fosfolipases C (PI-PLC) hidrolisam fosfolipídeos de inositol gerando inositol

fosfatos e diacilgliceróis como segundos mensagei-ros. Inositol fosfolipídeos podem ser mais fosforilados por fosfoinositídeo-3-quinase (PI-3K) para produ-zir fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato (PIP3), outro segundo mensageiro. Enzimas fosfolipases D (PLD) hidrolisam predominantemente fosfolipídeos de colina ou etanolamina para produzir ácido fosfatídico, que é subseqüentemente metabolizado por ácido fosfatídico fosfo-hidrolases (PAP) para gerar o segundo mensagei-ro diacilglicerol. Enzimas fosfolipases A2 (PLA2) atacam vários fosfolipídeos para produzir ácidos graxos livres, como ácido araquidônico e liso-fosfolipídeos.

Regulação de Fofolipase C e Fosfolipase DComo descrito anteriormente para transdução de sinal baseada em Ca2+, muitos receptores acoplados a pro-teína G e receptores tirosina quinases estimulam a li-beração de Ca2+ do retículo endoplasmático por meio de ativação da produção de 1,4,5-inositol trisfosfato (IP3). Este segundo mensageiro solúvel em água é deri-vado da hidrólise de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfa-to (PIP2), um fosfolipídeo de membrana relativamente minoritário que é gerado por múltiplas fosforilações do resíduo de inositol do fosfatidilinositol. Esta hidrólise de PIP2 é catalisada por uma família de fosfolipases tipo C (PLC) com alta seletividade para inositol fosfolipídeos (Figura 13.32). É importante apreciar que a hidrólise de PIPs por uma PLC gera dois segundos mensageiros di-ferentes: (1) o produto solúvel IP3 e (2) diacilglicerol (DAG), um segundo mensageiro hidrofóbico. Enzimas PI-PLCβ são ativadas por interação com subunidades α de proteínas G da família Gq/11 ou as subunidades βγ

Proteína quinasedependente decalmodulina

Domínio inibitórioProteína fosfatase

Autofosforilação

COOH

Inativa

Totalmenteativa

Domínio catalíticoNH2

+Ca2+

+Ca2+/calmodulina

Ca2+ independente(50-80% ativa)

Ca2+

Calmodulina

Pi

P

PAtivada

ATPADP

FIGURA 13.31Papel de calmodulina e proteína quinases reguladas por calmodulina nas cascatas de sinalização intracelular reguladas por Ca2+.Redesenhado com base em figura de Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland, 2002. Principais classes de fosfolipases usadas durante transdução de sinal mediada por receptor.

BioQ.13 514 22.01.07 17:43:19

CAPÍTULO 14 BIOENERGÉTICA E METABOLISMO OXIDATIVO | 521

P P P P

BIOENERGÉTICA E METABOLISMO OXIDATIVODiana S. Beattie

PARTE 4 VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

14

14.1 SISTEMAS DE PRODUÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DE ENERGIA, 522

ATP liga sistemas de produção e de utilização de energia, 522

NAD+ e NADPH em catabolismo e anabolismo, 523

14.2 RELAÇÕES TERMODINÂMICAS E COMPO-NENTES RICOS EM ENERGIA, 524

Energia Livre é energia disponível para trabalho útil, 525

Valor calórico de componentes da dieta, 526 Compostos são classificados com base em ener-

gia liberada na hidrólise de grupos específi- cos, 526

Variações de energia livre podem ser determinadas em reações enzimáticas acopladas, 527

Energias de ligações de alta energia de vários grupos podem ser transferidas de um composto para outro, 527

14.3 FONTES E DESTINOS DA ACETIL-COENZIMA A, 529

Fontes e destinos metabólicos do piruvato, 530

Piruvato desidrogenase é um complexo mul- tienzimático, 531

Piruvato desidrogenase é rigorosamente regulada, 531

Acetil-CoA é usado por várias vias diferentes, 534

14.4 CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS, 534 Reações do ciclo dos ácidos tricarboxílicos,

535

Conversão do grupo acetil de acetil-CoA a CO2 e H2O conserva energia, 537

Ciclo dos ácidos tricarboxílicos serve como uma fonte de intermediários biossintéticos, 537

Reações anapleróticas repõem intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos, 538

Atividade do ciclo dos ácidos tricarboxílicos é cuidadosamente regulada, 539

14.5 ESTRUTURA E COMPARTIMENTALIZAÇÃO POR MEMBRANAS MITOCONDRIAIS, 540

Membranas mitocondriais interna e externa têm diferentes composições e funções, 540

14.6 CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS, 542

Reações de oxidação-redução, 542 Variações da energia livre em reações redox,

544 Transporte mitocondrial de elétrons é um

sistema com múltiplos componentes, 544 Complexo I: NADH-ubiquinona óxido-redutase,

545 Complexo II: succinato-ubiquinona óxido-redu-

tase, 546 Outras desidrogenases flavoproteínas mito-

condriais, 546 Complexo III: ubiquinol-citocromo c óxido-re-

dutase, 547 Citocromos, 547 Ciclo Q para transferência de elétrons e

bombeamento de prótons no complexo III, 549

Movimento proposto das proteínas ferro- enxofre durante transferência de elé- trons no complexo III, 549

BioQ.14 521 22.01.07 17:50:31

524 | PARTE 4 VIA METABÓLICAS E SEU CONTROLE

14.2 | RELAÇÕES TERMO-DINÂMICAS E COM-PONENTES RICOS EM ENERGIA

Células podem interconverter diferentes formas de energia e também trocam energia com seu ambiente. Os princípios de termodinâmica governam reações desse tipo. Conhecimento desses princípios facilita uma per-cepção de como reações que produzem e que utilizam energia ocorrem dentro da mesma célula, e como um organismo é capaz de executar várias funções de tra-balho. A primeira lei da termodinâmica afirma que energia não pode ser criada nem destruída. Essa lei de conservação de energia estipula que, embora energia possa ser convertida de uma forma para outra, a energia total de um sistema permanece constante. Por exemplo, energia química disponível em um combustível metabó-lico, como glicose, é convertida na glicólise em energia química de ATP. No músculo esquelético, a energia quí-mica envolvida em ligações fosfato ricas em energia do ATP é convertida em energia mecânica, durante a con-tração muscular. A energia de um gradiente de prótons com eletropotencial osmótico através da membrana mi-tocondrial é convertida em energia química durante a síntese de ATP.

A segunda lei da termodinâmica diz respeito a entropia. Entropia, designada por S, é uma medida ou indicador do grau de desordem ou casualidade de um

FIGURA 14.5Transferência de equivalentes de redução durante catabolismo e anabolismo usando NADPH e NADH.

Oxidado

Lipídeo

Reduzido

Carboidrato

H OH

H

H OH

H

C

C O

C

H HC

H4

3

2

1+

5

6

C NH2

Íon híbrido,H:–

Nicotinamida(reduzida)

Nicotinamida(oxidada)

Nic

otin

amid

a ad

enin

a di

nucl

eotíd

eo (N

AD+ )

N

OH

H HH

OH OH

CH2O

O

O

–O

–OO

HH H

H

OH OH

NADP+ contém um grupo fosforilnessa 2�-hidroxila

CH2O

P

OP

NH2

N

NN

N

O H HC NH2 + H+

N..

...

O

AMP

FIGURA 14.3Estados de oxidação de átomos de carbono típicos em carboidratos e lipídeos.

FIGURA 14.4Estrutura de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+). Íon hidreto (H:-, um próton com dois elétrons) transferido para NAD+ forma NADH.

Substratoreduzido

Catabolismo

Anabolismo

NADP+ NADPH

Produtooxidado

Produtoreduzido

Precursoroxidado

sistema. Entropia é vista como a energia de um sistema que não está disponível para realizar trabalho útil. To-dos os processos, sejam químicos ou biológicos, tendem a progredir em direção a uma situação de máxima en-tropia. Portanto, sistemas vivos que são muito ordena-dos, nunca estão em equilíbrio com seu ambiente, visto que o equilíbrio em um sistema resulta quando acaso ou desordem (entropia) está no máximo. Em sistemas biológicos, entretanto, é quase impossível quantificar mudanças de entropia porque tais sistemas raramen-te estão em equilíbrio. Para maior simplicidade e por utilidade inerente nessas considerações, uma grandeza chamada energia livre é empregada.

BioQ.14 524 22.01.07 17:50:36


(200 kDa) e é estereoespecífica para a forma trans do substrato (a forma cis, maleato, não é substrato; Figura 14.21). A reação é livremente reversível em condições fisiológicas. Correlação Clínica 14.2 descreve uma defi-ciência genética de fumarase.

A reação final do ciclo TCA é catalisada pela mala-to desidrogenase, na qual os equivalentes de redução são transferidos para NAD+, para formar NADH + H+. O equilíbrio da reação é fortemente deslocado para a formação de L-malato, com um ΔGo’ = +7,0 kcal mol–1. Esta reação endergônica é deslocada no sentido para frente por ação da citrato sintase e de outras reações, que removem oxaloacetato.

O NADH produzido nas três desidrogenases NAD+-ligadas no ciclo TCA é rapidamente oxidado a NAD+ pela cadeia respiratória. Este é outro fator que favorece a direção para frente da malato desidrogenase.

Conversão do Grupo Acetil de Acetil-CoA a CO2 e H2O Conserva EnergiaO ciclo TCA (Figura 14.20) é a via oxidativa terminal para a maioria dos combustíveis metabólicos. Resíduos de dois carbonos na forma de acetil-CoA são completa-mente oxidados a CO2 e H2O, e quatro etapas oxidativas resultam na formação de 3 NADH + H+ e 1 FADH2, que são usados subseqüentemente para geração de ATP. Oxidação de cada NADH + H+ resulta em formação de 2,5 ATPs por fosforilação oxidativa, enquanto que oxi-dação do FADH2 formado na reação da succinato desi-drogenase gera 1,5 ATPs. Uma ligação de alta energia é formada como GTP, na reação da succinil-CoA sinteta-se. Assim, a geração líquida de ATP ou seus equivalen-tes (i. é, GTP) para a completa oxidação de um grupo acetil no ciclo de Krebs é 10.

Ciclo dos Ácidos Tricarboxílicos Serve como uma Fonte de Intermediários BiossintéticosA discussão do ciclo TCA até agora se concentrou em seu papel na quebra oxidativa de grupos acetil a CO2 e H2O, formação de coenzimas reduzidas e síntese de ATP. Em geral, o ciclo TCA é o mecanismo final comum para quebra de alimentos; entretanto, como resumido na Figura 14.22, os compostos de quatro, cinco e seis carbonos gerados nas reações do ciclo TCA são impor-tantes intermediários em processos biossintéticos. Succinil-CoA, malato, oxaloacetato, α-cetoglutarato e citrato são todos precursores da biossíntese de impor-tantes compostos celulares.

Transaminação converte α-cetoglutarato em glu-tamato, que pode deixar a mitocôndria e ser converti-do em vários outros aminoácidos. No tecido nervoso, α-cetoglutarato é convertido nos neurotransmissores glutamato e ácido γ-aminobutírico (GABA). Glutamato é também produzido a partir de α-cetoglutarato pela enzima mitocondrial glutamato desidrogenase, em pre-sença de NADH ou NADPH e amônia. O amino grupo incorporado em glutamato pode, então, ser transferido para formar vários aminoácidos, por diferentes amino-transferases. Estas enzimas e a relevância da incorpo-ração ou da liberação de amônia em ou de α-cetoácidos são discutidas no Capítulo 19.

Succinil-CoA representa um ponto de ramificação metabólico (Figura 14.23), porque pode ser formado a partir de α-cetoglutarato no ciclo ou a partir de me-tilmalonil-CoA, nas etapas finais da quebra de ácidos graxos de cadeia ímpar ou dos aminoácidos de cadeia ramificada valina e isoleucina, ou pode ser convertido


Deficiência de Fumarase

Deficiência de enzimas do ciclo TCA é rara, indi-cando a importância desta via para sobrevivên-cia. Vários casos, entretanto, foram descritos, de severa deficiência de fumarase em mitocôndrias e citosol de tecidos (p. ex., linfócitos do sangue). É caracterizada por severa deficiência neurológi-ca, encefalopatia e distonia, que se desenvolvem logo após o nascimento. Urina contém quantida-des anormais de fumarato e níveis elevados de succinato, α-cetoglutarato, citrato e malato. As isoenzimas mitocondrial e citosólica de fumara-se são derivadas de um único gene. Em pacientes afetados, ambos os pais têm a metade dos níveis normais de atividade enzimática, mas são clini-camente normais, como seria de se esperar em uma doença autossômica recessiva. A primeira mutação caracterizada no gene da fumarase con-tém uma glutamina substituída por um resíduo de glutamato 319.

Fonte: Bourgeron, T., Chreiten, D., Poggi-Bach, J., et. al. Mutation of the fumarase gene in two siblings with progressive encephalopathy and fumarase deficiency. J. Clin. Invest. 93:2514, 1994.

COO–

CH2

CH2

COO–

COO–

COO–

Succinato Maleato

COO–

CH2

COO–

Malonato

C

C

H

H

FIGURA 14.21Estruturas do succinato, um intermediário do ciclo TCA; malonato, um inibidor da succinato desidrogenase e do ciclo; e maleato, um composto não envolvido no ciclo.

BioQ.14 537 22.01.07 17:50:57


14.10 | ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS)

Oxigênio é essencial para a vida. A maioria das oxida-ções intracelulares resulta em transferência de dois elétrons para aceptores apropriados, como NAD+ ou FAD, que são então oxidados pela cadeia de transporte de elétrons. A etapa final desta cadeia é catalisada por citocromo c oxidase, que liga fortemente O2 ao centro binuclear, onde redução passo a passo do O2 ocorre, sem liberação de intermediários no processo de oxida-ção (ver Seção 14.6, p. 542). A estrutura eletrônica do O2, entretanto, favorece sua redução por adição de um elétron de cada vez, levando à geração de radicais de oxigênio que podem causar dano celular. Um radical é uma molécula com um elétron não-pareado muito reati-vo em um orbital externo, que pode iniciar uma cadeia de reações por remoção de um elétron de outra molé-cula para completar seu próprio orbital. A transferência passo a passo de elétrons para O2 resulta em formação de ânions superóxido (O2

-), depois peróxido de hi-drogênio (H2O2), e finalmente radical hidroxila li-vre (OH•) (Figura 14.61).

O radical hidroxila é, sem dúvida, o radical livre mais perigoso, uma vez que está envolvido em reações como peroxidação de lipídeos e geração de outros radicais tó-xicos. Peróxido de hidrogênio não é um radical livre, mas é convertido pelas reações de Fenton ou de Haber-Weiss no radical hidroxila, em presença de Fe2+ ou de Cu+, que são prevalentes em células (Figura 14.62).

Produção de Espécies Reativas de Oxigênio

Embora processos oxidativos em células geralmente resultem em transferência de elétrons para O2 para for-mar água, sem liberação de intermediários, um peque-no número de radicais de oxigênio é inevitavelmente formado devido a vazamento nas reações de transferên-cia de elétrons. A principal fonte intracelular de radi-cais de oxigênio é a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, onde superóxido é produzido por transfe-rência de um elétron para O2, a partir da semiquinona estável produzida durante a redução de ubiquinona pe-los complexos I e II (Figura 14.63). Superóxido também pode ser produzido por transferência de um elétron de uma flavina, como FMN. As espécies reativas de oxi-

Em 1993, uma mutação no citocromo b resultando em atividade diminuída do complexo citocromo bc1 foi encontrada em um homem de 25 anos de idade, que se apresentava com intolerância a exercício e fraqueza proximal. A mutação substituía um resíduo de aspartato, no lugar de uma glicina conservada na posição 290. Subseqüentemente, demonstrou-se que outros pacientes com sintomas semelhantes e atividade diminuída do complexo bc1 têm mutações nas quais um glutamato substituiu uma glicina con-servada na posição 339, e uma serina substituiu uma glicina conservada na posição 34. Mais recentemen-te, demonstrou-se que um paciente com severa car-diomiopatia hipertrófica tinha uma mutação na qual um glutamato substituiu uma glicina conservada na posição 166. As mutações de glicina para aspartato ou glutamato estavam localizadas no citocromo b próximo ao sítio QO para oxidação de ubiquinol, en-quanto a mutação glicina para serina localizava-se próxima do sítio Qi da redução de ubiquinona. Todas

Fonte: Andreu, A. L., et al. Exercise intolerance due to mutations in the cytochrome b gene of mitochondrial DNA. N. Engl. J. Med. 341:1037, 1999.


Intolerância a Exercício em Pacientes com Mutações no Citocromo b

essas mutações envolvem uma transição de guanina para adenina no mtDNA, sugerindo que a mutação pode ter resultado de dano oxidativo. Além disso, em todas as mutações de sentido errado (missen-se), uma glicina conservada foi substituída por uma molécula carregada maior; isto alterou a estrutura do citocromo b, resultando em atividade catalítica diminuída do complexo bc1. Mutações sem sentido (nonsense) resultando em citocromo b truncado e mutações envolvendo deleções de 4-24 pares de ba-ses do mtDNA foram identificadas. Estas mutações nonsense e por deleções freqüentemente levam a severa intolerância a exercício, acidose láctica no es-tado de repouso e ocasionalmente mioglobinúria. Em contraste com a maioria das mutações no mtDNA, as mutações identificadas no gene do citocromo b não são de herança materna. Além disso, a maioria foi ex-pressa apenas em tecidos musculares, sugerindo que sejam mutações somáticas, que ocorreram durante diferenciação de células troncos miogênicas.

BioQ.14 565 22.01.07 17:51:56


Glicogênio G C

METABOLISMO DE CAR-BOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLERobert A. Harris


15


15.2 GLICÓLISE, 574 Glicólise ocorre em todas as células humanas,

574 Glicose é metabolizada diferentemente em várias

células, 575

15.3 VIA GLICOLÍTICA, 577 Glicólise ocorre em três estágios, 578 Estágio um: preparação da glicose, 578 Estágio dois: quebra de um intermediário

fosforilado, 578 Estágio três: reações de óxido-redução e

síntese de ATP, 578 Rendimento em ATP e equação balanceada da

glicólise anaeróbica, 581 NADH gerado por glicólise deve ser oxidado no-

vamente a NAD+: papel da lactato desidrogenase e das lançadeiras de substrato, 582

Glicólise anaeróbica, 582 Glicólise aeróbica, 582 Lançadeiras são importantes em outras vias de

óxido-redução, 583 Oxidação de álcool, 583 Formação de glucuronídeo, 583 Reagentes sulfidrila e fluoreto inibem glicólise,

583 Arsenato impede síntese de ATP sem inibir gli-

cólise, 583

15.4 REGULAÇÃO DA GLICÓLISE, 584 Hexoquinase e glucoquinase têm propriedades

diferentes, 586 6-Fosfofruto-1-quinase é uma enzima regulatória

da glicólise, 589 Regulação da 6-fosfofruto-1-quinase por

ATP e AMP, 589 Regulação da 6-fosfofruto-1-quinase por pH

intracelular, 590 Regulação da 6-fosfofruto-1-quinase por

citrato, 592 Controle hormonal da 6-fosfofruto-1-quinase por

cAMP e frutose 2,6-bisfosfato, 592 A enzima bifuncional 6-fosfofruto-2-quinase/fru-

tose 2,6-bisfosfatase é regulada por fosforila- ção, 595

Coração contém uma isoenzima diferente da 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6-bisfosfa-

tase, 595 Piruvato quinase é também uma enzima regula-

tória da glicólise, 595

15.5 GLUCONEOGÊNESE, 597 Síntese de glicose é necessária para sobrevivên-

cia, 597 Ciclos de Cori e da alanina, 599 Síntese de glicose a partir de lactato, 600 Gluconeogênese usa muitas enzimas glicolí-

ticas na direção inversa, 601 Glicose é sintetizada a partir da maioria dos

aminoácidos, 602

BioQ.15 572 22.01.07 18:00:31


gulação é exercida em enzimas chaves será enfatizado ao longo do capítulo.

Isto será particularmente verdadeiro para síntese (glicogênese) e degradação (glicogenólise) de glicogê-nio. Muitas células armazenam glicogênio para suas pró-prias necessidades futuras. O fígado é menos egoísta, ar-mazenando glicogênio principalmente para manutenção da glicose sangüínea, para garantir que outros tecidos, em especial o cérebro, tenham um suprimento adequa-do. Regulação da síntese e da degradação de glicogênio é um modelo para nosso entendimento de como hormônios funcionam e como vias metabólicas são reguladas. Estes tópicos contribuem para nosso entendimento da condi-ção diabética, do jejum e de como os tecidos do corpo respondem a estresse, trauma severo e lesões.

A química e a nomenclatura dos carboidratos são apresentadas no Apêndice.

15.2 | GLICÓLISE

Glicólise Ocorre em Todas as Células HumanasA via de Embden-Meyerhof ou via glicolítica repre-senta um processo antigo, que ocorre em todas as célu-las do corpo humano, pelo qual ocorre degradação ana-eróbica de glicose em lactato, com liberação de energia como ATP. Este é um exemplo da fermentação ana-eróbica, um termo usado para vias metabólicas que organismos usam para extrair energia química de com-bustíveis ricos em energia, em ausência de oxigênio. Para muitos tecidos, glicólise é só uma via fornecedora de energia de emergência, capaz de produzir 2 moles de ATP a partir de 1 mol de glicose, em ausência de oxi-gênio (Figura 15.2). Quando o suprimento de oxigênio de um tecido é interrompido, os níveis de ATP ainda podem ser mantidos pela glicólise, pelo menos por um curto período. Muitos exemplos poderiam ser dados, mas a capacidade de utilizar glicólise como uma fon-te de energia é particularmente importante durante o nascimento natural de seres humanos. Com exceção do cérebro, a circulação do sangue diminui para a maioria das partes do corpo do bebê, durante o parto. Normal-mente, o cérebro não é privado de oxigênio durante o parto, mas outros tecidos passam a depender da glicóli-

se para seu suprimento de ATP, até que um suprimento normal de oxigênio esteja disponível. Isto economiza oxigênio para ser usado pelo cérebro, ilustrando um dos muitos mecanismos que evoluíram para assegurar a sobrevivência do tecido cerebral em momentos de es-tresse. Oxigênio não é necessário para glicólise; de fato, oxigênio pode, indiretamente, suprimir glicólise pelo efeito Pasteur, que será considerado mais tarde (p. 589). Contudo, glicólise ocorre em células com um su-primento abundante de oxigênio molecular. Desde que as células também contenham mitocôndrias, o produto final da glicólise em presença de oxigênio é piruvato, e não lactato. Piruvato é, então, completamente oxidado a CO2 e H2O pelo complexo piruvato desidrogenase e enzimas do ciclo TCA alojadas dentro de mitocôndrias (Figura 15.3). Glicólise, portanto, prepara para a oxida-ção aeróbica dos carboidratos. O processo completo de glicólise e oxidação mitocondrial do piruvato a CO2 e H2O tem a seguinte equação:

D-Glicose(C6H12O6) + 6 O2 + 32 ADP3- + 32 Pi 2- +

+ 32 H+ → 6 CO2 + 6 H2O + 32 ATP4 -

Muito mais ATP é produzido na oxidação comple-ta da glicose a CO2 e H2O (32 ATP/glicose) do que na conversão de glicose em lactato (2 ATP/glicose). Isto tem importantes conseqüências a serem consideradas em detalhes mais adiante. A importância da glicólise como uma via preparatória é melhor exemplificada pelo cérebro, que tem uma necessidade absoluta de glicose. O piruvato processado pela glicólise é oxidado a CO2 em mitocôndrias.

Um cérebro humano adulto usa aproximadamente 120 g de glicose por dia para suprir sua necessidade de ATP. Em contraste, glicólise com lactato como produto final é o principal mecanismo de produção de ATP em alguns outros tecidos. Glóbulos vermelhos não têm mi-tocôndrias e, portanto, são incapazes de converter piru-vato em CO2. A córnea, o cristalino e regiões da retina

GLICOGÊNIO

Glicogênese

GLICOSE

Glicogenólise

Glicólise Gluconeogênese

LACTATO

FIGURA 15.1Relação da glicose com as principais vias do metabolismo de carboidratos.

CH3

C

C

2 ADP3– + 2 Pi2–

2 ATP4–

OH

OH

HO

HO

O

O O–

H

H

H

H

CH2OH

�-D-Glicose

L-Lactato

OH H

2

FIGURA 15.2Equação geral balanceada da soma das reações da glicólise.

BioQ.15 574 22.01.07 18:00:33

CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE | 589

ína enzima glucoquinase no fígado. Portanto, uma pes-soa que está consumindo uma refeição grande e rica em carboidratos terá maiores quantidades de glucoquinase do que uma que não está. O fígado com glucoquinase induzida contribui mais para baixar os níveis elevados de glicose no sangue. A ausência de insulina torna o fígado de pacientes com diabetes mellitus deficiente em glucoquinase, a despeito dos altos níveis de glicose san-güínea, e diminui a capacidade de o fígado “tamponar” a glicose sangüínea (ver Corr. Clín. 15.4). Defeitos no gene que codifica glucoquinase, que alteram sua S0,5 e/ou Vmax causam diabetes do jovem com início na matu-ridade (MODY, maturity-onset diabetes of the young), uma forma de diabetes mellitus tipo 2.

6-Fosfofruto-1-quinase É uma Enzima Regulatória da Glicólise6-Fosfofruto-1-quinase seja um ponto regulatório muito importante da glicólise. Catalisa a primeira eta-pa de comprometimento da glicólise porque a reação catalisada pela fosfoglicose isomerase é reversível, e cé-lulas fazem uso de glicose 6-fosfato na via das pentoses fosfato e para síntese de glicogênio. Citrato, ATP e íons hidrogênio (baixo pH) são os efetores alostéricos ne-gativos importantes, enquanto AMP e frutose 2,6-bis-fosfato são importantes efetores alostéricos positivos (Figura 15.13). Estes compostos sinalizam a necessida-de de diferentes velocidades da glicólise em resposta a mudanças em (a) estado energético da célula (ATP e AMP), (b) ambiente interno da célula (íons hidrogênio), (c) disponibilidade de combustíveis alternativos, como ácidos graxos e corpos cetônicos (citrato), e (d) razão insulina/glucagon no sangue (frutose 2,6-bisfosfato).

Regulação da 6-Fosfofruto-1-quinase por ATP e AMP

O efeito Pasteur é a inibição da utilização de glicose e o acúmulo de lactato que ocorre quando respiração (consumo de oxigênio) é iniciada em células anaeróbi-cas. É perfeitamente compreensível em bases termodi-nâmicas, uma vez que a oxidação completa da glicose a CO2 e H2O rende muito mais ATP do que glicólise ana-eróbica:

Glicólise:D-Glicose + 2 ADP3– + 2 Pi2

– → 2 L-lactato– + 2 ATP4–

Oxidação completa:D-Glicose + 6 O2 + 32 ADP3- + 32 Pi2

– + 32 H+ → → 6 CO2 + 6 H2O + 32 ATP4–

Células usam ATP para fornecer a energia necessá-ria a seus processos de trabalho inerentes. Como muito mais ATP é produzido a partir de glicose em presença de oxigênio, muito menos glicose precisa ser consumida para satisfazer a demanda de energia. O efeito Pasteur


Diabetes Mellitus

Diabetes mellitus é uma doença crônica que se caracteriza por alterações no metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas. Dois tipos principais são identificados clinicamente: tipo 1 (ver Corr. Clín. 22.8, p. 857) e tipo 2 (ver Corr. Clín. 22.7, p. 855).

Em pacientes sem hiperglicemia em jejum, o teste de tolerância à glicose por via oral pode ser usado para diagnóstico. Consiste na determi-nação do nível de glicose sangüínea no estado de jejum e em intervalos de 30-60 min., por 2 h ou mais, após consumo de sobrecarga de 100 g de glicose. Em indivíduos normais, glicose san-güínea retorna aos níveis normais em 2 h após ingestão do carboidrato. No diabetes, glicose no sangue atinge um nível mais elevado e permane-ce elevada por períodos de tempo mais longos, dependendo da gravidade da doença. Entretanto, muitos fatores podem contribuir para um teste de tolerância a glicose anormal. O paciente deve ter consumido uma dieta rica em carboidratos nos 3 dias anteriores, presumivelmente para per-mitir indução de enzimas das vias de utilização de glicose, por exemplo, glucoquinase, acil graxo sintase e acetil-CoA carboxilase. Quase todas as infecções (até mesmo um resfriado) e “estresse” menos definido (presumivelmente por efeitos so-bre o sistema nervoso simpático) podem resul-tar em anormalidades transitórias no teste de tolerância à glicose. Devido a esses problemas, hiperglicemia de jejum seria, provavelmente, o teste sine qua non para o diagnóstico de diabe-tes. Captação de glicose por tecidos sensíveis a in-sulina – isto é, múscular e adiposo – é diminuída no estado diabético. O paciente diabético ou não tem insulina ou desenvolveu “resistência à insuli-na” nestes tecidos. Resistência à insulina resulta de anomalia no receptor de insulina ou em etapas subseqüentes, mediadoras dos efeitos metabólicos da insulina. Células do parênquima hepático não requerem insulina para captar glicose. Sem insu-lina, contudo, o fígado tem capacidade diminuída para remover glicose do sangue. Isto é explicado, em parte, por atividade diminuída de glucoquina-se e a perda de ação da insulina sobre enzimas-chaves da glicogênese e da via glicolítica.

Fonte: Taylor, S. I. Insulin action, insulin resistance and type 2 diabetes mellitus. Em: C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly e D. Valle (Eds.), The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th ed., New York: McGraw-Hill, 2001, p. 1433.

BioQ.15 589 22.01.07 18:00:57

CAPÍTULO 15 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS I: PRINCIPAIS VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE | 609

15.6 | GLICOGENÓLISE E GLICOGÊNESE

Glicogênio É a Forma de Armazenamento de GlicoseGlicogenólise refere-se à quebra de glicogênio em gli-cose ou glicose 6-fosfato; glicogênese refere-se à síntese de glicogênio. Estes processos ocorrem em quase todos os tecidos, mas especialmente em músculo e fígado. No homem bem alimentado, o conteúdo de glicogênio no fígado pode responder por até 10% do peso úmido des-se órgão. Músculo armazena menos glicogênio, quando expresso nas mesmas bases – um máximo de apenas 1-2% do seu peso úmido. Contudo, a maioria das pes-soas tem mais músculos do que fígado, com o total do glicogênio muscular chegando ao dobro da quantidade de glicogênio hepático.

Grânulos de glicogênio são abundantes no fígado de animais bem alimentados (Figura 15.46), mas estão virtualmente ausentes deste órgão após 24 h de jejum. Exercício pesado causa a mesma perda de grânulos de glicogênio em fibras musculares. Esses grânulos são grupos de moléculas individuais de glicogênio que têm uma massa de até 2 107 Da. Glicogênio é composto de resíduos glucosil, ligados principalmente por liga-ções glicosídicas α-1,4 (Figura 15.47). Ramificações surgem de ligações α-1,6 freqüentes. Um braço da

“árvore” do glicogênio (ver Figura 15.48) é caracteri-zado por ramos a cada quatro resíduos glucosil no es-queleto (core) mais central da molécula, e muito menos freqüentemente em regiões mais externas. Glicogênio contrasta com proteínas e ácidos nucléicos, devido a essa ramificação, mas, é claro, é uma forma de arma-zenamento de combustível e não catalisa reações nem contém informação em uma célula.

Glicogênio é estocado em músculo e fígado por razões bem diferentes. Glicogênio do músculo é uma reserva de combustível para a produção de ATP dentro daquele tecido, enquanto glicogênio hepático é uma reserva de glicose para a manutenção das concentrações de glicose no sangue. Os níveis de glicogênio hepático variam: são altos logo após uma refeição e, depois, diminuem lenta-mente à medida que é usado para ajudar a manter o nível de glicose no sangue (ver Figura 15.49) entre refeições e durante o jejum noturno. No homem como no rato, o

FIGURA 15.46Micrografia eletrônica mostrando grânulos de glicogênio (material corado escuro) no fígado de um rato alimentado. Micrografia generosamente cedida por Dr. Robert R. Cardell do Department of Anatomy da University of Cincinnati.

O O O

O OCH2OH CH2OH

Ligação glicosídica �-1,4

��

CH2OH

O O

O

O O

O

CH2

Ligação glicosídica �-1,6

��

FIGURA 15.47Dois tipos de ligações entre as moléculas de glicose estão presentes no glicogênio.

FIGURA 15.48Estrutura ramificada do glicogênio

BioQ.15 609 22.01.07 18:01:40


HOH

COO–

H

HH

H

OH

CH2OH

H

HHH

OH

O–

HNCOCH3Unidade repetitiva do condroitim 4-sulfato

�

–O3SOO O

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOSNancy B. Schwartz


16


16.2 VIA DAS PENTOSES FOSFATO, 627 Via das pentoses fosfato tem duas fases, 627 Glicose 6-fosfato é oxidada e descarboxilada

em uma pentose fosfato, 627 Interconversões de pentoses fosfato levam a

intermediários glicolíticos, 628 Glicose 6-fosfato pode ser completamente oxida-

da a CO2, 628 Via das pentoses fosfato produz NADPH, 630 16.3 INTERCONVERSÕES DE AÇÚCARES E FORMA-

ÇÃO DE NUCLEOTÍDEOS-AÇÚCAR, 631 Isomerização e fosforilação são reações comuns

para interconverter carboidratos, 631 Açúcares ligados a nucleotídeos são intermediários

em muitas transformações de açúcares, 633 Epimerização interconverte glicose e galactose,

633 Ácido glucurônico é formado por oxidação de

UDP-glicose, 634 Descarboxilação, óxido-redução e transaminação

de açúcares geram produtos necessários, 635 Ácidos siálicos são derivados de N-acetilglucosa-

mina, 637

16.4 BIOSSÍNTESE DE CARBOIDRATOS COMPLE-XOS, 637

16.5 GLICOPROTEÍNAS, 638 Glicoproteínas contêm quantidades variáveis de

carboidratos, 639 Carboidratos são ligados Covalentemente a glico-

proteínas por ligações N- ou O-glicosídicas, 639

Síntese de glicoproteínas N-ligadas envolve doli- col fosfato, 640

16.6 PROTEOGLICANOS, 642 Existem seis classes de proteoglicanos, 642 Hialuronato é um copolímero de N-acetilglu-

cosamina e ácido glucurônico, 642 Condroitim sulfatos são os glicosaminoglica-

nos mais abundantes, 642 Dermatam sulfato contém ácido L-idurônico,

643 Heparina e heparam sulfato diferem dos

outros glicosaminoglicanos, 643 Queratam sulfato existe em duas formas, 643 Biossíntese de condroitim sulfato é típica da

formação de glicosaminoglicanos, 643

BIBLIOGRAFIA, 647


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CAPÍTULO 16 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS II: VIAS ESPECIAIS E GLICOCONJUGADOS | 631

des, requerem equivalentes de redução de NADPH. No fígado, 20-30% do CO2 produzido pode ser proveniente da via das pentoses fosfato; o equilíbrio entre glicólise e via das pentoses fosfato depende das necessidades me-tabólicas do órgão. Em músculo estriado de mamíferos, que apresenta pouca síntese de ácidos graxos e esterói-des, todo catabolismo de G6P ocorre por glicólise e ciclo TCA, com nenhuma oxidação direta de glicose 6-fosfato pela via das pentoses fosfato.

16.3 | INTERCONVERSÕES DE AÇÚCARES E FOR-MAÇÃO DE NUCLEO-TÍDEO-AÇÚCAR

A maioria dos monossacarídeos encontrados em com-postos biológicos deriva da glicose. As transformações dos açúcares mais comuns em sistemas de mamíferos são resumidas na Figura 16.4.

Isomerização e Fosforilação são Reações Comuns para Interconverter CarboidratosFormação de alguns açúcares pode ocorrer direta-mente, começando com glicose, por reações de modi-ficações, como conversão de G6P em frutose 6-fosfato por fosfoglucose isomerase, na glicólise. Uma isomeri-zação aldose-cetose semelhante, catalisada por fos-fomanose isomerase, produz manose 6-fosfato. De-ficiência dessa enzima leva a uma forma de síndrome de glicoproteínas deficientes em carboidratos (CDGS, carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome) (ver Corr. Clín. 16.3).

Fosforilação e transferência interna de um grupo fosfato na mesma molécula de açúcar são também mo-dificações comuns. Glicose 1-fosfato, resultante da gli-cogenólise, é convertida em G6P pela fosfoglucomutase. Galactose é fosforilada a galactose 1-fosfato por galac-toquinase, e manose a manose 6-fosfato por manoqui-nase. Frutose livre, um importante constituinte da die-ta, é fosforilada no fígado a frutose 1-fosfato, por uma frutoquinase especial. Entretanto, nenhuma mutase in-terconverte frutose 1-fosfato e frutose 6-fosfato, nem a fosfofrutoquinase pode sintetizar frutose 1,6-bisfosfato a partir de frutose 1-fosfato. Em vez disso, frutose 1-fos-

Glicose (6) Glicose 6-fosfato 6-Fosfoglucono-lactona 6-Fosfogluconato

(6) CO2 (6) NADPH + (6)H+

(6) Ribulose 5-fosfato

(4) Xilulose 5-fosfato (2) Ribose 5-fosfato

(2) Frutose 6-fosfato

+ (2) Gliceraldeído 3-fosfato + (2) Sedo-heptulose 7-fosfato

Gliceraldeído 3-fosfato

(2) Eritrose 4-fosfato + (2) Frutose 6-fosfato

ATP ADP (6) NADPH(6) NADP+

(6) NADP+

+ (6) H+ H2O

FIGURA 16.3Via das pentoses fosfato.

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redutora de um açúcar aceptor. Uma glicosiltransferase é específica para o açúcar aceptor, o açúcar transferido e a ligação formada. Uma reação de glicosiltransferase é resumida como se segue:

Nucleosídeo-difosfato-

glicoseglico

(doador)

+ sse(aceptor)

glicosiltransferase glicosil

glicose1

2(glicosídeo)

−− −

+

O

nucleosídeo difosfato

Mais de 40 tipos de ligações glicosídicas foram iden-tificados em oligossacarídeos de mamíferos, e cerca de 15 mais em glicosaminoglicanos. A multiplicidade de ligações surge da diversidade de monossacarídeos envolvidos e da formação de ligações α e β com cada um dos grupos hidroxila disponíveis no açúcar aceptor. Isso sugere que oligossacarídeos tenham o potencial para grande conteúdo informacional. De fato, sabe-se que a bioatividade de muitas moléculas é determinada pela natureza dos resíduos de açúcares constituintes. Por exemplo, a especificidade antigênica dos principais tipos sangüíneos é determinada pela composição em açúcares (ver Corr. Clín. 16.8).

N-acetilgalactosamina é o imunodeterminante do sangue tipo A, e galactose, do sangue tipo B. Remoção de N-acetilgalactosamina de eritrócitos do tipo A, ou de galactose de eritrócitos do tipo B, converte ambos em eritrócitos do tipo O. Cada vez mais, outros exem-plos de açúcares como determinantes de especifici-dade de receptores de superfície celular e interações com lectinas, do direcionamento de células para cer-tos tecidos e da sobrevivência ou remoção da circula-ção de certas moléculas, têm sido reconhecidos. Todas as ligações glicosídicas identificadas em compostos biológicos são degradadas por enzimas hidrolíticas específicas, glicosidases. Além de serem instrumentos valiosos para a elucidação da estrutura de oligossa-carídeos, o interesse nessa classe de enzimas baseia-se nas muitas doenças genéticas do metabolismo de carboidratos complexos que resultam de defeitos em glicosidases (ver Corr. Clín. 16.10 e 16.11; p. 641 e 642, respectivamente).

16.5 | GLICOPROTEÍNAS

Glicoproteínas foram definidas como proteínas conjuga-das, que contêm um ou mais açúcares, sem uma unida-de repetitiva serial, e são ligados covalentemente a uma proteína. Esta definição exclui os proteoglicanos (ver p. 652). Glicoproteínas em membranas celulares podem ter um papel importante no comportamento de células e, especialmente, em funções biológicas da membrana. Glicoproteínas são constituintes do muco secretado por certas células epiteliais, onde medeiam lubrificação e proteção de tecidos que revestem os sistemas respira-tório, gastrointestinal e reprodutor feminino.

Muitas proteínas secretadas são glicoproteínas, e estas incluem (a) hormônios como hormônio folículo-estimulante, hormônio luteinizante e gonadotrofina coriônica e (b) proteínas plasmáticas como orosomu-cóides, ceruloplasmina, plasminogênio, protrombina e imunoglobulinas.


Substâncias dos Grupos Sangüíneos

A superfície dos eritrócitos humanos é coberta por um complexo mosaico de determinantes an-tigênicos específicos, muitos dos quais são polis-sacarídeos complexos. Há cerca de 100 determi-nantes de grupos sangüíneos, pertencentes a 21 sistemas de grupos sangüíneos independentes. Os mais estudados são os do sistema ABO de grupos sangüíneos e do sistema Lewis, estreita-mente relacionado. Variação genética é alcançada por glicosiltransferases específicas, responsáveis pela síntese dos determinantes heterossacarídi-cos. O gene H codifica uma fucosiltransferase, que adiciona fucose a uma galactose periférica do heterossacarídeo precursor. O alelo A codifica uma N-acetilgalactosamina glicosiltransferase, o alelo B codifica uma galactosiltransferase, e o alelo O codifica uma proteína inativa. Os açúca-res transferidos pelas enzimas A e B são adicio-nados ao oligossacarídeo H-específico. O gene Lewis (Le) codifica outra fucosiltransferase, que adiciona fucose a um resíduo periférico de N-acetilglucosamina do precursor. Ausência do produto do gene H dá origem ao determinante Lea específico, enquanto ausência de ambas as enzimas H e Le é responsável pela especificidade Leb. Elucidação das estruturas desses oligossa-carídeos determinantes representa um marco na química de carboidratos. Este conhecimento é essencial para práticas de transfusão de sangue e para propósitos legais e históricos. Por exem-plo, pó de tecidos contendo carboidratos com-plexos foi utilizado em análises sorológicas para estabelecer o grupo sangüíneo de Tutankhamen e de seus prováveis ancestrais.

Fonte: Yamamoto, F., Clausen, I., White, T., Mark, J. e Hakomori, S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature 345:229, 1990.

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16.6 | PROTEOGLICANOS

Esta é uma classe de macromoléculas complexas que pode conter 95% ou mais carboidratos, e lembra mais polissacarídeo do que proteína. Para distingui-los de outras glicoproteínas, eles são chamados proteoglica-nos. Suas cadeias de carboidratos são chamadas glico-saminoglicanos ou mucopolissacarídeos, especialmente em referência às doenças de acúmulo mucopolissacari-doses, que resultam de uma incapacidade de degradar essas moléculas (ver Corr. Clín. 16.13).

Existem Seis Classes de ProteoglicanosProteoglicanos consistem de muitas cadeias de glico-saminoglicanos diferentes, ligadas covalentemente a um esqueleto protéico. Seis classes são reconhecidas: condroitim sulfato, dermatam sulfato, queratam sul-fato, heparam sulfato, heparina e hialuronato. Certas características são comuns a todas as diferentes clas-ses de glicosaminoglicanos. As longas cadeias hetero-polissacarídicas não-ramificadas são compostas, em grande parte, por unidades dissacarídicas repetitivas, consistindo de uma hexosamina e um ácido urônico. Constituintes comuns dos glicosaminoglicanos são grupos sulfatos, ligados por ligações éster a certos mo-nossacarídeos, ou por ligações amida ao grupo amino de glucosamina. Só hialuronato não é sulfatado e não é covalentemente ligado a proteína. As carboxilas dos ácidos urônicos e os grupos sulfatos contribuem para a natureza fortemente carregada dos glicosaminoglica-nos. Sua carga elétrica e sua estrutura macromolecu-lar são importantes em seu papel como lubrificantes e como elementos de sustentação no tecido conjuntivo. Glicosaminoglicanos são componentes predominantes

das matrizes extracelulares e das superfícies celulares, e participam de adesão e sinalização celular.

Hialuronato É um Copolímero de N-Acetilglucosamina e Ácido Glucurônico

Hialuronato difere dos outros tipos de glicosaminogli-canos. É não-sulfatado, não é ligado covalentemente a proteína, e não está limitado a tecidos animais, sendo também produzido por bactérias. É classificado como glicosaminoglicano devido a sua similaridade estru-tural com esses polímeros, e consiste exclusivamente de unidades dissacarídicas repetitivas de N-acetilglu-cosamina e ácido glucurônico (Figura 16.12). Embora tenha a estrutura química menos complexa dos glicosa-minoglicanos, as cadeias podem alcançar 105-107 Da. A alta massa, o caráter polieletrolítico e o grande volume que ocupa em solução contribuem para as propriedades do hialuronato como um lubrificante e absorvente de choques. É encontrado predominantemente em líquido sinovial, humor vítreo e cordão umbilical.

Condroitim Sulfatos São os Glicosaminoglicanos Mais Abundantes

Os glicosaminoglicanos mais abundantes do corpo, os condroitim sulfatos, são ligados a resíduos específicos de serina em um esqueleto protéico por meio de uma região de ligação tetrassacarídica:

GluUA Gal Gla Xyl �-Ser1�3 1�3 1�4

As unidades dissacarídicas características consis-tem de N-acetilgalactosamina e ácido glucurônico, que são ligadas a essa região de ligação (Figura 16.12). Os dissacarídeos podem ser sulfatados na posição 4- ou 6- da N-acetilgalactosamina. Cada cadeia contém 30-

Defeitos Enzimáticos na Degradação de Glicolipídeos

Doença Deficiência Enzimática

Tay-Sachs β-Hexosaminidase Ade Sandhoff β-Hexosaminidases A e BGM1 gangliosidose β-GalactosidaseSialidose Sialidasede Fabry α-Galactosidasede Gaucher β-Glucoceramidasede Krabbe β-GalactoceramidaseLeucodistrofia metacro-mática

Arilsulfatase A (cerebro-sídeo sulfatase)


Doenças de Glicolipídeos

Um grupo de doenças genéticas humanas surge de deficiências em hidrolases, que agem predominan-temente em substratos glicolipídicos, resultando em acúmulo de produtos de glicolipídeos e gangliosíde-os. Os sintomas clínicos associados a cada um dos glicoconjugados podem variar muito. Entretanto, devido à preponderância de lipídeos no sistema ner-voso, tais doenças freqüentemente têm neurodege-neração associada e severa deterioração mental e motora.

Fonte: Beutler, E. e G. Garabowski. Gaucher disease. Em: C. R. Scriver, A. R. Beaudet, W. S. Sly e D. Valle (Eds.), The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Vol. III, 8th ed. New York: McGraw-Hill, 2001, p. 3635.

BioQ.16 642 22.01.07 18:09:43


Fígado

Ácidos graxos Glicose��

GlicerolCorposcetônicos

Acetil-CoA

METABOLISMO DE LIPÍDEOS I: SÍNTESE, ARMAZENAMENTO E UTILIZAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS E TRIACILGLICERÓISMartin D. Snider, J. Denis McGarry e Richard W. Hanson


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17.2 NATUREZA QUÍMICA DE ÁCIDOS GRAXOS E ACILGLICERÓIS, 652

Ácidos graxos são cadeias alquila terminando em um grupo carboxila, 652

A maioria dos ácidos graxos no homem ocorre como triacilgliceróis, 653

A hidrofobicidade dos triacilgliceróis é importante para suas funções, 653

17.3 TRANSPORTE INTERÓRGÃOS DE ÁCIDOS GRAXOS E SEUS PRODUTOS PRIMÁRIOS, 656

Transporte de lipídeos no estado alimentado, 656 Transporte de lipídeos no estado de jejum, 657

17.4 SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS: LIPOGÊNESE, 657

Glicose é o principal precursor para síntese de ácidos graxos, 657

Via de biossíntese de ácidos graxos, 658 Formação de malonil-CoA é a etapa de com-

prometimento na síntese de ácidos graxos, 658

Seqüência de reações para a síntese de ácido palmítico, 658

Ácido graxo sintase de mamíferos é um poli- peptídeo multifuncional, 659

Estequiometria da síntese de ácidos graxos, 659

Via de clivagem de citrato fornece acetil-CoA e NADPH para lipogênese no citosol, 660

Modificação de ácidos graxos, 662 Reações de elongação, 662 Formação de ácidos monoenóicos pela estea-

roil-CoA dessaturase, 662 Formação e modificação de ácidos graxos

poliinsaturados, 663 Formação de hidroxiácidos graxos no tecido

nervoso, 664 Ácido graxo sintase pode produzir outros ácidos

graxos além do palmitato, 664 Acil graxo-CoAs podem ser reduzidos a álcoois

graxos, 664

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17.3 | TRANSPORTE INTER-ÓRGÃOS DE ÁCIDOS GRAXOS E SEUS PRO-DUTOS PRIMÁRIOS

Em todos os mamíferos, o transporte e o armazenamen-to de ácidos graxos são regulados pelo estado dietético. Triacilglicerol é armazenado no estado alimentado, com deposição em tecido adiposo. Durante jejum, tria-cilglicerol do tecido adiposo é hidrolisado, e os produ-tos são distribuídos por todo o corpo para serem usados para produção de energia. Em jejum prolongado (mais de 2 dias), o fígado converte ácidos graxos em corpos cetônicos, acetoacetato e β-hidroxibutirato, que são liberados no sangue e são uma fonte importante de energia para muitos tecidos. Esses processos são resu-midos na Figura 17.6

Transporte de Lipídeos no Estado AlimentadoTriacilgliceróis da dieta são digeridos no estômago e intestino delgado por lípases gástrica e pancreática (ver p. 1031). Os principais produtos são 2-monoacilgli-ceróis e ácidos graxos livres, que são absorvidos pe-las células epiteliais que revestem o intestino delgado. Estas células ligam os ácidos graxos e monoacilglice-róis absorvidos em triacilgliceróis (ver p. 1031), que são então empacotados em quilomícrons, uma lipoproteí-na plasmática rica em triacilglicerol (ver p. 1035). Qui-lomícrons são secretados na linfa e, depois, circulam para a corrente sangüínea. O fígado é outra fonte de triacilgliceróis no estado alimentado. Ácidos graxos são sintetizados nesse tecido a partir do excesso de carboi-dratos e aminoácidos. Esses ácidos graxos são ligados em triacilgliceróis e acondicionados em lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), uma segunda li-

FIGURA 17.6Transporte interórgãos de ácidos graxos. (A) No estado alimentado, há deposição de triacilglicerol no tecido adiposo. As fontes são gordura da dieta e ácidos graxos sintetizados no fígado a partir de excesso de carboidratos e aminoácidos. (B) No estado de jejum, triacilgliceróis são hidrolisados, e ácidos graxos livres e glicerol são liberados no sangue.*Durante jejum prolongado, o fígado sintetiza corpos cetônicos, que se tornam um importante combustível no sangue.

FígadoEstado alimentado

Corrente sangüínea

MúsculoTecido adiposo

Glicose eoutros combustíveis

Acetil-CoA

Ácidos graxos

Triacilglicerol

Lipoproteínas dedensidade muito baixa

Quilomícrons

Triacilglicerol em quilomícronse lipoproteínas de densidade muito baixa

Ácidos graxos��

��

Ácidos graxos

Triacilglicero l

Triacilglicerol da dieta

Intestino delgado

Fígado

Estado de jejum

Corrente sangüínea

Músculo eoutros tecidos Tecido adiposo

Ácido graxo Glicose��

GlicerolCorpos

cetônicos

Corposceetônicos

Ácidos graxos = albumina Glicerol

Acetil-CoAAcetil-CoA

��

��

Ácidos graxos (+ corpos cetô-nicos) ��

��

Glicerol+

Ácidos graxos

Triacilglicerol

Corpos cetônicos

Cérebro

��

��

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repouso. A maioria dos tecidos pode usar ácidos graxos como combustível. Ácidos graxos são uma importante fonte de energia em músculos esquelético e cardíaco, mas o cérebro oxida pouco os ácidos graxos devido ao transporte limitado através da barreira hemato-encefá-lica. Eritrócitos são incapazes de oxidar ácidos graxos, porque não têm mitocôndrias, o local de oxidação de ácidos graxos. Durante jejum prolongado, o fígado con-verte acetil-CoA gerado por oxidação de ácidos graxos e quebra de aminoácidos em corpos cetônicos, que se tornam importantes combustíveis. A maioria dos teci-dos, incluindo o cérebro, adapta-se ao jejum pela utili-zação destes corpos cetônicos.

-Oxidação de Ácidos Graxos de Cadeia Linear É um Importante Processo de Produção de EnergiaÉsteres de CoA dos ácidos graxos são os substratos para oxidação. Na maior parte, a via de oxidação de ácidos graxos é semelhante, mas não idêntica, ao reverso do processo de síntese de palmitato. Isto é, fragmentos de dois carbonos são removidos seqüencialmente a partir da extremidade carboxila do ácido graxo por desidro-genação, hidratação e oxidação, para formar um β-cetoácido, que é então quebrado por tiólise.


Ciclo Triacilglicerol/Ácido Graxo

Triacilglicerol que é armazenado no tecido adiposo é hidrolisado a ácidos graxos livres (FFA) durante jejum para fornecer energia para tecidos como os músculos esquelético e cardíaco, e também indire-tamente para o cérebro, via corpos cetônicos. Hor-mônios, principalmente insulina, controlam este processo. À medida que o nível de insulina cai du-rante o jejum, a taxa de hidrólise de triacilglicerol (lipólise) aumenta, resultando em liberação de FFA do tecido adiposo. Um aspecto surpreendente deste processo é o destino de FFA; em seres humanos em jejum, até 65% destes FFA são reesterificados em triacilgliceróis no fígado e em outros tecidos peri-féricos. No fígado, aproximadamente 60% do FFA captado é reesterificado em triacilglicerol, liberado no sangue como VLDL, e enviado de volta para o tecido adiposo para deposição como triacilglicerol. Este processo foi chamado ciclo triacilglicerol/ácido graxo.

A síntese de triacilglicerol em tecidos de ma-míferos requer glicerol 3-fosfato, que é derivado da glicose da dieta via glicólise, no estado alimentado. Durante jejum, quando insulina baixa inibe a uti-lização de glicose, o glicerol 3-fosfato para a rees-terificação de FFA é gerado por gliceroneogênese, uma versão abreviada da gluconeogênese. Nesta via, piruvato, ou compostos que podem gerar piruvato, como alanina ou lactato, é convertido em glicerol 3-fosfato via di-hidroxiacetona fosfato (Figura 17.19). A enzima que controla a velocidade da via de gli-ceroneogênese é fosfoenolpiruvato carboxiquinase

(PEPCK), que tem alta atividade em tecido adiposo pardo e branco. Se a expressão do gene PEPCK for abolida no tecido adiposo de camundongos, glicero-neogênese é inibida e o estoque de triacilglicerol é reduzido. Ao contrário, superprodução do gene PEP-CK no tecido adiposo de camundongos transgênicos aumenta a taxa de gliceroneogênese, resultando em obesidade.

A lógica metabólica do ciclo triacilglicerol/ácido graxo reside provavelmente na importância dos áci-dos graxos como combustíveis durante jejum. Para garantir que exista FFA suficiente no sangue, mais FFA é liberado de células adiposas do que o necessá-rio; o que não é usado é reesterificado a triacilglice-rol e redepositado no tecido adiposo, com um custo energético mínimo. O ciclo triacilglicerol/ácido graxo consome 3-6% da energia em uma molécula de tria-cilglicerol. Aparentemente, é melhor ter o combustí-vel necessário disponível, e pagar por isso energeti-camente, do que ficar sem! A taxa de reesterificação de FFA no ciclo triacilglicerol/ácido graxo é, muito provavelmente, um fator-chave na determinação da concentração de estado estacionário de FFA no san-gue, um parâmetro que está diretamente envolvido na etiologia do diabetes Tipo 2. As glitazonas, uma classe de drogas antidiabéticas, induzem a atividade de PEPCK em tecido adiposo e fígado, e aumentam a taxa de reesterificação de FFA em triacilglicerol via gliceroneogênese nesses tecidos, suportando o importante papel deste processo na manutenção da homeostase lipídica.

Fonte: Reshef, L. Olswang, Y. Cassuto, H. Blum, B. Croniger, C. M. Kalhan S. C, Tilghman, S. M. e Hanson R. W. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. J. Biol. Chem. 278:30413, 2003. Jensen, M. D., Ekberg, K. e Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 281:E789 2001. Tordjman, J. Khazan, W. Antoine, B. Chauvet, G. Quette, J Fouque, F. Beale, E. G. Benelli, C. e Forest, C. Regulation of glycero-neogenesis and phosphoenolpyruvate carboxykinase by fatty acids, retinoic acid and thiazolidinediones. Biochimie 85:1213, 2003.

BioQ.17 668 22.01.07 18:12:07

CAPÍTULO 17 METABOLISMO DE LIPÍDEOS I: | 679

17.7 | REGULAÇÃO DO METABOLISMO DE LIPÍDEOS

Regulação no estado alimentadoO metabolismo de lipídeos no homem é controlado pelo estado dietético do indivíduo via um conjunto complexo de sinais hormonais. Depois de uma refeição que con-tém lipídeos, carboidratos e proteínas, o lipídeo da die-ta é depositado como triacilglicerol no tecido adiposo. Além disso, carboidrato e aminoácidos da dieta, em ex-cesso em relação ao necessário para energia ou síntese de proteínas, são convertidos em ácidos graxos e depo-sitados no tecido adiposo como triacilglicerol. O prin-cipal hormônio anabólico, insulina, é necessário para síntese de ácidos graxos e para formação de triacilgli-cerol no tecido adiposo. Um resumo destas regulações é apresentado nas Tabelas 17.2, p. 657, e 17.3, p. 661. Este hormônio age em dois níveis; induz a transcrição de ge-nes que codificam enzimas críticas das vias de síntese e armazenamento de lipídeos (regulação de longo prazo) e controla processos como captação de glicose e hidró-lise de triacilglicerol (regulação de curto prazo).

Insulina estimula síntese de ácidos graxos por au-mentar os níveis de enzimas-chaves, incluindo ácido graxo sintase, NADP-malato desidrogenase (enzima málica) e acetil-CoA carboxilase, no fígado, por induzir a transcrição de seus genes. Insulina também estimula a síntese de glicose 6-fosfato desidrogenase e 6-fosfoglu-conato desidrogenase, as duas enzimas da porção oxi-dativa da via das pentoses, que geram parte do NADPH que é necessário para síntese de ácidos graxos. O efeito de curto prazo da insulina na síntese hepática de ácidos graxos é exercido por ativação de uma fosfoproteína fosfatase específica, que remove fosfato da acetil-CoA carboxilase, ativando assim esta enzima. Fluxo aumen-tado pela glicólise é também importante para fornecer acetil-CoA para síntese de ácidos graxos.

No tecido adiposo, insulina é necessária no estado alimentado para captação de glicose via transportador GLUT 4. O metabolismo desta glicose via glicólise for-nece glicerol 3-fosfato para a síntese de triacilglicerol. Insulina também bloqueia um ciclo fútil. Como no fíga-do, insulina exerce seus efeitos de curto prazo por ati-var fosfoproteína fosfatases. Isso diminui a fosforilação de proteínas-chaves, incluindo lipase hormônio-sensí-vel e perilipina, levando à quebra diminuída de triacil-gliceróis.

Regulação no estado de jejumJejum resulta em uma alteração dramática do meta-bolismo de lipídeos. À medida que a concentração de glicose no sangue diminui, há um decréscimo paralelo da concentração de insulina na circulação. Há também

um aumento em epinefrina e glucagon, que elevam o nível de cAMP e ativam proteína quinase A. No tecido adiposo, há uma fosforilação aumentada de lipase hor-mônio sensível e perilipina, resultando em um aumento na quebra de triacilglicerol e liberação de ácidos gra-xos livres e glicerol deste tecido (ver Tabela 17.2, p. 657, para um resumo destes controles).

No fígado, essas alterações hormonais levam a uma diminuição na síntese de ácidos graxos, devido à redu-ção nos níveis de enzimas chaves (ver Tabela 17.3, p. 661). Há também inibição da enzima limitante da ve-locidade, acetil-CoA carboxilase, devido à fosforila-ção cAMP-dependente da enzima. Glicólise é também inibida, com diminuição no suprimento de acetil-CoA para lipogênese. O fígado começa a produzir corpos ce-tônicos, à medida que o jejum progride, devido a um aumento na taxa de oxidação de ácidos graxos e níveis aumentados de enzimas da síntese de corpos cetônicos. Durante jejum prolongado, cerca de metade dos ácidos graxos que entram no fígado são convertidos em corpos cetônicos e liberados no sangue para utilização por te-cidos como músculo, coração e (após 2 dias de jejum) o cérebro, economizando assim o uso de glicose.

Regulação da oxidação de ácidos graxos

A taxa de oxidação de ácidos graxos em mitocôndrias é controlada pela regulação da entrada de substratos nestas organelas. A enzima-chave é carnitina palmi-toiltransferase I (CPT I), que sintetiza acilcarnitina a partir de acil-CoA citosólico (Figura 17.20). No fígado, acetil-CoA carboxilase é ativada no estado alimenta-do, porque os níveis de enzima são altos, fosforilação cAMP-dependente é baixa e a enzima é ativada por ci-trato. A alta concentração de malonil-CoA resultante estimula síntese de ácidos graxos, mas bloqueia oxida-ção de ácidos graxos por inibir CPT I. Esta regulação impede um ciclo fútil. Ao contrário, no estado de jejum, a atividade de acetil-CoA carboxilase no fígado é baixa, porque os níveis de enzima são baixos, a enzima está fosforilada e oxidação de ácidos graxos ocorre em alta velocidade nessas condições, devido aos baixos níveis de malonil-CoA.

Oxidação de ácidos graxos em músculo é também regulada por malonil-CoA, embora este tecido não sin-tetize ácidos graxos. Músculo contém uma isoenzima da acetil-CoA carboxilase, que produz malonil-CoA exclu-sivamente para regulação de CPT I. A enzima é ativada por citrato e inibida por fosforilação. É fosforilada pela proteína quinase A e por uma quinase dependente de AMP. Fosforilação pela primeira enzima permite que a oxidação de ácidos graxos seja regulada pelo estado dietético. No estado alimentado, a alta concentração de insulina resulta em baixos níveis de fosforilação. A en-zima produz malonil-CoA, que inibe CPT I e bloqueia oxidação de ácidos graxos. Ao contrário, no estado de

BioQ.17 679 22.01.07 18:12:19

684 | PARTE 4 VIAS METABÓLICAS E SEU CONTROLE

18.5 PROSTAGLANDINAS E TROMBOXANES, 714 Prostaglandinas e tromboxanes são derivados de

ácidos monocarboxílicos, 714 Síntese de prostaglandinas envolve uma ciclooxi-

genase, 715 Produção de prostaglandinas é inibida por

agentes antiinflamatórios esteroídicos e não-esteroídicos, 717

Prostaglandinas têm muitos efeitos fisiológicos 718

18.6 LIPOXIGENASE E ÁCIDOS OXIEICOSATETRAE-NÓICOS, 718

Ácidos mono-hidroperoxieicosatetraenóicos são produtos da ação da lipoxigenase, 718

Leucotrienos e ácidos hidroxieicosatetraenóicos são hormônios derivados de HPETEs, 719

Leucotrienos e HETEs afetam vários processos fisiológicos, 719

BIBLIOGRAFIA, 721


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 18.1 Síndrome do Desconforto Respiratório, 687 18.2 Tratamento da Hipercolesterolemia, 703 18.3 Aterosclerose, 704 18.4 Diagnóstico da Doença de Gaucher em um

Adulto, 713

18.1 | VISÃO GERAL

Lipídeo é um termo geral que descreve substâncias que são relativamente insolúveis em água e que podem ser extraídas por solventes apolares. Lipídeos complexos do homem estão classificados em duas categorias am-plas: lipídeos não-polares, tais como triacilgliceróis e ésteres de colesterol, e lipídeos polares, que são anfipá-ticos pois contêm tanto uma região hidrofóbica, como uma região hidrofílica na mesma molécula. Este capí-tulo discute lipídeos polares, incluindo fosfolipídeos, esfingolipídeos e eicosanóides. As regiões hidrofóbicas e hidrofílicas são unidas por um resíduo de glicerol em glicerofosfolipídeos, e por esfingosina em esfingo-mielina e glicoesfingolipídeos. Triacilglicerol está con-finado, em grande parte, a locais de armazenamento no tecido adiposo, enquanto lipídeos polares ocorrem primariamente em membranas celulares. Membranas geralmente contêm 40% do seu peso seco como lipí-deo, e 60% como proteína.

Reconhecimento célula-célula, fagocitose, inibição por contato e rejeição de tecidos e órgãos transplanta-dos são todos fenômenos de importância médica, que envolvem sítios de reconhecimento muito específicos na superfície das membranas plasmáticas. Glicoes-fingolipídeos parecem desempenhar um papel nestes eventos biológicos. Sua síntese será descrita. Vários esfingolipídeos acumulam-se no fígado, no baço, no rim e no sistema nervoso em certas doenças genéti-cas chamadas esfingolipidoses. Glicolipídeos merecem estudo, porque os determinantes antigênicos dos gru-pos sangüíneos ABO são primariamente de natureza glicolipídica.

A via de biossíntese de colesterol e sua regulação, como colesterol funciona como um precursor de sais biliares e hormônios esteróides, e o papel da lipopro-teína de alta densidade (HDL, high density lipopro-tein) e da lecitina:colesterol aciltransferase (LCAT) no gerenciamento do colesterol plasmático são descritos. Finalmente, o metabolismo e a função de duas classes

de hormônios farmacologicamente potentes derivados do ácido araquidônico – a saber, prostaglandinas e leu-cotrienos – serão discutidos. Ver o Apêndice para uma discussão sobre nomenclatura e química dos lipídeos.

18.2 | FOSFOLIPÍDEOS

Duas classes principais de acilglicerolipídeos são triacilgliceróis e glicerofosfolipídeos, que têm em seu núcleo o poliol C3 glicerol. Os dois grupos álcool pri-mário do glicerol não são estereoquimicamente idên-ticos; no caso de fosfolipídeos, geralmente é o mesmo grupo hidroxila que é esterificado ao resíduo de fosfato. O sistema de numeração esteroespecífica é a melhor maneira de designar diferentes grupos hidroxila. Neste sistema, quando a estrutura do glicerol é desenhada na projeção de Fischer, com o grupo hidroxila C2 projetan-do-se para a esquerda da página, os átomos de carbono são numerados como mostra a Figura 18.1. Quando o sistema de numeração estéreo-específica (sn) é uti-lizado, o prefixo sn- é usado antes do nome do compos-to. Glicerofosfolipídeos geralmente contêm um resíduo de sn-glicerol 3-fosfato. Embora ambos contenham o resíduo de glicerol como um elemento estrutural fun-damental, triacilgliceróis neutros e fosfolipídeos iônicos carregados têm propriedades físicas e funções muito diferentes.

FIGURA 18.1Numeração estéreo-específica do glicerol.

CH2OH

CH2OH

CHO H

1

2

3

Númerodo carbono

BioQ.18 684 22.01.07 19:25:50


18.3 | COLESTEROL

Colesterol, um Composto Alicíclico, É Amplamente Distribuído nas Formas Livre e EsterificadaColesterol é um composto alicíclico, cuja estrutura in-clui (1) o núcleo peridrociclopentanofenantreno com seus quatro anéis fundidos, (2) um único grupo hidroxila em C3, (3) um centro insaturado entre C5 e C6, (4) uma cadeia hidrocarbônica ramificada de oito membros ligada ao anel D em C17 e (5) um grupo metil (designado por C19) ligado à posição C10, e outro grupo metil (designado por C18) ligado à posição C13 (Figu-ras 18.26 e 18.27).

Colesterol tem solubilidade muito baixa em água; a 25oC, o limite de solubilidade é aproximadamente 0,2 mg dL-1, ou 4,7 mM. A concentração real de colesterol no plasma de uma pessoa sadia é geralmente 150 a 200 mg dL-1. Este valor é quase duas vezes a concentração normal de glicose no sangue. Esta alta concentração de colesterol no sangue é possível graças às lipoproteínas plasmáticas (principalmente LDL e VLDL), que contêm grandes quantidades de colesterol (ver p. 698). Apenas cerca de 30% do total de colesterol no plasma está livre

C

H2COH

H2C

O

O

DHAP

CoA1

2

4

3

Pi H2O

5

6 Colina plasmalogênio

O–

P O–

O

R1C CoA

O

CR1

O

H2C

H2C

C

O–

O

O

O P O–

O

O

H2C

H2C

C O

OR2

O P O–

O

H2C

H2C

CH

O–

OR2

O P O–

O

H2C

H2C

HOCH

O–

OR2

O P O–

O

O

R2OH

R1CO–

R3C

O

H2C

H2C

CHO

OR2

OH

R3C

O

H2C

H2C

CHO

OR2

O

R3C

O NADPH + H+

NADP+

CoAR3C

CoA

CMP

CDP-colina

O–

P OCH2CH2

O

N(CH3)3+

O–

FIGURA 18.25Via de biossíntese de colina plasmalogênio a partir de DHAP. 1, acil-CoA:di-hidroxiacetona fosfato aciltransferase; 2, alquil-di-hidroxiacetona fosfato sintase; 3, NADPH:alquil-di-hidroxiacetona fosfato óxi-redutase; 4, acil-CoA:1-alquil-2-liso-sn-glicero-3-fosfato aciltransferase; 5, 1-alquil-2-acil-sn-glicerol-3-fosfato fosfo-hidrolase; 6, CDP-colina:1-alquil-2-acil-sn-glicerol colina fosfotransferase.

A B

C D1

2

3

45

10

6

7

8

9

11

1213

17

16

14 15

HO3

19

18 17

2120

23

22 2425

26

27

FIGURA 18.26O anel ciclopentanofenantreno.

FIGURA 18.27Estrutura do colesterol (5-colesteno-3-ol).

(não-esterificado); o restante é colesteril ésteres, nos quais um ácido graxo de cadeia longa, geralmente ácido linoléico, é esterificado ao C3 do anel A. Este resíduo de ácido graxo aumenta a hidrofobicidade do colesterol (Figura 18.28).

BioQ.18 694 22.01.07 19:26:07


Em tecidos especializados, como córtex adrenal e ovários, o colesterol derivado de LDL é o precursor de hormônios esteróides, como cortisol e estradiol, res-pectivamente. No fígado, o colesterol extraído de LDL e HDL é convertido em sais biliares, que funcionam na digestão intestinal de gordura.

Colesterol É Excretado Primariamente como Ácidos BiliaresÁcidos biliares são os produtos finais do metabolismo de colesterol. Ácidos biliares primários são sintetizados em hepatócitos, diretamente a partir de colesterol. Os

ácidos biliares são derivados de ácido colânico (Figu-ra 18.41). Ácido cólico e ácido quenodesoxicólico (Figura 18.42) são compostos C24, contendo três e dois grupos OH, respectivamente, e uma cadeia lateral C5 que termina em um grupo carboxila, que é ionizado a pH 7,0 (daí o nome sal biliar). O grupo carboxila é fre-qüentemente conjugado, por uma ligação amida, com glicina (NH2-CH2-COOH) (Figura 18.43) ou taurina (NH2-CH2-CH2-SO3H), para formar ácido glicocólico ou taurocólico, respectivamente.

Os ácidos biliares primários são modificados por microorganismos dos intestinos para ácidos biliares secundários: ácido desoxicólico e ácido litocólico são derivados do ácido cólico e do ácido quenodesoxicólico, respectivamente, por remoção de um grupo OH (Figura 18.42). Transformação de colesterol em ácidos biliares requer: (1) epimerização do grupo 3β-OH, (2) redução da dupla ligação C5, (3) introdução de grupos OH em C7 (ácido quenodesoxicólico) ou em C7 e C12 (ácido cólico), e (4) conversão da cadeia lateral C27 em um ácido carboxílico C24 por eliminação de um equivalen-te propil.

Ácidos biliares são secretados na bile, armazenados na vesícula biliar e depois secretados no intestino del-gado. Produção hepática de ácidos biliares é insuficien-te para atender as necessidades fisiológicas, de modo que o corpo depende de uma circulação êntero-hepáti-ca, que carrega os ácidos biliares do intestino, de volta para o fígado, várias vezes por dia.

Ácidos biliares e fosfolipídeos solubilizam colesterol na bile e, assim, impedem que colesterol se precipite na vesícula biliar. Ácidos biliares no intestino atuam como agentes emulsificantes para triacilgliceróis da dieta, fa-cilitando sua hidrólise pela lipase pancreática. Ácidos biliares desempenham um papel direto na ativação da lipase pancreática (ver p. 1031) e facilitam a absorção de vitaminas lipossolúveis, particularmente vitamina D, no intestino.


Aterosclerose

Aterosclerose é a principal causa de morte em países ocidentais industrializados. O risco de desenvolvê-la é diretamente relacionado com a concentração plasmática de LDL-colesterol e in-versamente proporcional ao nível de HDL-coles-terol. Isso explica por que o primeiro é freqüen-temente chamado colesterol “ruim”, e o último, colesterol “bom”, embora quimicamente não exis-ta diferença. Na aterosclerose, a parede arterial contém colesteril-ésteres acumulados em células derivadas da linhagem monócito-macrófago, há também proliferação de células musculares lisas e fibrose. A anomalia mais precoce é migração de monócitos do sangue para o subendotélio da artéria. Estas células então se diferenciam em macrófagos e acumulam colesteril-ésteres deri-vados de LDL plasmática. Parte da LDL pode ser captada por vias que não requerem receptor de LDL. Por exemplo, existem receptores que cap-tam LDL acetilada ou LDL complexada com dex-tran sulfato; entretanto, esta via não é regulada por conteúdo celular de colesterol. Distorção do subendotélio leva à agregação plaquetária na su-perfície do endotélio e liberação de mitógenos derivados de plaquetas, como o fator de cresci-mento derivado de plaquetas (PDGF, platelet de-rived growth factor), que estimula o crescimen-to de células musculares lisas. Morte das células esponjosas leva à deposição do lipídeo celular e fibrose. A placa aterosclerótica resultante estrei-ta o vaso sangüíneo e leva à formação de trombo, o que precipita o infarto do miocárdio (ataque cardíaco).

Fonte: Wick, G, Knoflach, M. e Xu, Q. B. Autoimmu-ne and inflammatory mechanisms in atherosclerosis. Annu. Rev. Immunol. 22:361,~2004.

12

34

5

10

67

89

1112

1317

16

14 15

CH3

H3C

COOH

CH2

H

19

18

2122

2023

24

FIGURA 18.41Estrutura do ácido colânico.

BioQ.18 704 22.01.07 19:26:18


Prostaglandinas Têm Muitos Efeitos FisiológicosProstaglandinas são mediadores naturais da inflama-ção. Reações inflamatórias freqüentemente envolvem as articulações (p. ex., artrite reumatóide), pele (p. ex., psoríase) e olhos, e são tratadas, freqüentemen-te, com corticosteróides que inibem síntese de prosta-glandinas. Administração de PGE2 e PGE1 induz rubor e calor (devido à vasodilatação arteriolar), juntamente com inchaço e edema resultantes de permeabilidade capilar aumentada característica da inflamação. PGE2 gerada no sistema imune (p. ex., macrófagos, mastó-citos, células B) evoca quimiotaxia de células T. PGE2 em quantidades que não causam dor, antes da admi-nistração de histamina e bradicinina, aumenta a in-tensidade e a duração da dor causada por esses dois agentes. Acredita-se que pirógenos (agentes indutores de febre) ativem a via de síntese de prostaglandinas com liberação de PGE2 no hipotálamo, onde a tempe-ratura do corpo é regulada. Aspirina, uma droga anti-pirética, inibe a ciclooxigenase. PGE2 e PGF2 têm sido utilizadas para induzir parto e para terminar gravidez não-desejada, especificamente no segundo trimestre. Também há evidências de que as prostaglandinas da série PGE possam ser efetivas no tratamento da infer-tilidade masculina.

Prostaglandinas sintéticas são muito eficientes na inibição de secreção ácida gástrica em pacien-tes com úlcera péptica. Parecem inibir a formação de cAMP em células da mucosa gástrica e acelerar a cicatrização de úlceras gástricas. PGE, PGA e PGI2 são vasodilatadores que baixam a pressão arterial sis-têmica, aumentando assim o fluxo sangüíneo local e diminuindo a resistência periférica. TXA2 causa con-tração da musculatura vascular lisa e do mesângio glomerular. No feto, PGE2 mantém a desobstrução do ductus arteriosus antes do nascimento. Se o ductus permanecer aberto após o nascimento, o fechamento pode ser acelerado por administração do inibidor de ciclooxigenase indometacina. Em bebês nascidos com anomalias congênitas, nos quais o defeito pode ser corrigido cirurgicamente, infusão de prostaglandinas manterá o fluxo sangüíneo através do ductus até que a cirurgia seja feita.

PGI2 inibe agregação plaquetária, enquanto PGE2 e TXA2 promovem esse processo de coagulação. TXA2 é produzido por plaquetas e é responsável por sua agre-gação quando em contato com alguma superfície es-tranha, colágeno ou trombina. Células endoteliais que revestem os vasos sangüíneos liberam PGI2, que pode responder pela não-aderência de plaquetas à parede do vaso sangüíneo sadio. PGE2 e PGD2 dilatam os vasos sangüíneos renais e aumentam o fluxo sangüíneo pelo rim. Elas também regulam a excreção de sódio e o rit-mo de filtração glomerular.

18.6 | LIPOXIGENASE E ÁCI-DOS OXIEICOSATE-TRAENÓICOS

Ciclooxigenase direciona ácidos graxos poliinsaturados para a via das prostaglandinas que tem ácido araquidô-nico como substrato. Lipoxigenase é uma dioxigenase que também atua sobre ácido araquidônico. Diferentes lipoxigenases são específicas para a dupla ligação do ácido araquidônico, na qual o ataque inicial do oxigê-nio ocorre (p. ex., posições 5, 12 ou 15). No homem, os leucotrienos mais importantes são os produtos da 5-lipoxigenase, que são mediadores de doenças inflama-tórias. Lipoxigenases ocorrem amplamente em plantas e fungos, bem como em animais, mas estão ausentes em leveduras e na maioria dos procariotos. Elas contêm ferro não-hemínico e são ativas quando este ferro está no estado férrico.

Ácidos Mono-Hidroperoxieicosate-traenóicos São Produtos da Ação da LipoxigenaseLipoxigenase adiciona um grupo hidroperóxido ao áci-do araquidônico para produzir ácidos mono-hidrope-roxieicosatetraenóicos (HPETEs) (Figura 18.71). Em contraste com a ciclooxigenase da prostaglandina endoperóxido sintase, que catalisa a bis-dioxigenação de ácidos graxos insaturados a endoperóxidos, lipoxi-genases catalisam a monodioxigenação de ácidos gra-xos insaturados a hidroperóxidos alílicos. Substituição hidroperoxi de ácido araquidônico por lipoxigenases pode ocorrer nas posições 5, 12 ou 15. Uma 15-lipoxige-nase (15-LOX) oxigena ácido araquidônico no carbono 15. 5-HPETE é o principal produto em basófilos, leu-cócitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, mas-tócitos e qualquer órgão passando por resposta infla-matória; 12-HPETE predomina em plaquetas, células das ilhotas pancreáticas, musculatura lisa vascular e células glomerulares; 15-HPETE é o principal produto em reticulócitos, eosinófilos, linfócitos T e células epite-liais da traquéia. As 5-, 12- e 15-lipoxigenases ocorrem principalmente no citosol. Como o átomo de carbono oxigenado em HPETEs é assimétrico, existem dois es-tereoisômeros possíveis do ácido hidroperoxi, (R) ou (S). Por exemplo, a estéreo-configuração é especifica-da 12R-LOX ou 12S-LOX. Os três principais HPETEs são da configuração (S). 5-LOX tem uma atividade de dioxigenase que converte ácido araquidônico em 5-HPETE, e uma atividade de desidratase que transforma 5-HPETE em LTA4.

A atividade 5-LOX é restrita a poucos tipos celu-lares, incluindo linfócitos B, mas não linfócitos T. É ativada por uma proteína acessória chamada proteína ativadora de 5-lipoxigenase (FLAP). Em leucócitos hu-

BioQ.18 718 22.01.07 19:26:40

CAPÍTULO 19 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS | 725

�-cetoglutarato

glutamato

glutamato

piruvatoNH4+

uréiaNH4+

glutamina

Fígado

METABOLISMO DE AMINOÁCIDOSMarguerite W. Coomes


19


19.2 INCORPORAÇÃO DE NITROGÊNIO EM AMI-NOÁCIDOS, 727

A maioria dos aminoácidos é obtida da dieta, 727

Grupos amino são transferidos de um aminoáci- do para formar outro, 728

Piridoxal fosfato é cofator de aminotransfera- ses, 729

Glutamato desidrogenase incorpora e produz amônia, 729

Amônia livre é incorporada em e produzida a partir de glutamina, 730

O grupo amida da asparagina é derivado de glutamina, 732

Aminoácido oxidases removem grupos amino, 732

19.3 TRANSPORTE DE NITROGÊNIO PARA FÍGADO E RIM, 732

Proteína é constantemente degradada, 732 Aminoácidos são transportados do músculo

após proteólise, 733 Amônia é liberada no fígado e no rim, 733

19.4 CICLO DA URÉIA, 733 Átomos de nitrogênios da uréia vêm de amônia e

aspartato, 733 Síntese de uréia requer cinco enzimas, 734 Síntese da uréia é regulada por um efetor alos-

térico e indução enzimática, 735 Doenças metabólicas da síntese da uréia têm

resultados sérios, 735

19.5 SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DE AMINOÁCIDOS INDIVIDUAIS, 736

Glutamato é o precursor de glutationa e γ-aminobutirato, 736

Arginina é também sintetizada em intestinos e rins, 737

Ornitina e prolina, 737 Serina e glicina, 738 Tetra-hidrofolato é um cofator em algumas rea-

ções de aminoácidos, 741 Treonina, 744 Fenilalanina e tirosina, 744 Metabolismo de tirosina produz fumarato e

acetoacetato, 744 Dopamina, epinefrina e norepinefrina são

derivados de tirosina, 746 Tirosina é necessária para síntese de melani-

na, hormônio tireoideano e quinoproteí- nas, 747

Metionina e cisteína, 747 Metionina primeiro reage com adenosina

trifosfato, 749 S-Adenosilmetionina é um doador de grupo

metil, 751 S-Adenosilmetionina é o precursor de esper-

midina e espermina, 752 Metabolismo de cisteína produz compostos que

contêm enxofre, 753 Triptofano, 754 Triptofano é um precursor de NAD, 755 Piridoxal fosfato é importante no metabolis-

mo de triptofano, 756 Serotonina e melatonina são derivadas do

triptofano, 756 Triptofano induz sono, 757 Aminoácidos de cadeia ramificada, 758 Reações iniciais do metabolismo de BCAA

são as mesmas, 758

BioQ.19 725 22.01.07 18:16:14


O Grupo Amida da Asparagina É Derivado de Glutamina

O grupo amida da asparagina vem da glutamina (Fi-gura 19.17), e não de amônia livre, como na síntese de glutamina. ATP é necessário para ativar o grupo β-car-boxila receptor. Asparagina é facilmente sintetizada na maioria das células, mas algumas células leucêmicas parecem ter perdido esta capacidade. Uma abordagem terapêutica que foi tentada em pacientes com tumores deficientes em asparagina sintetase é tratamento com asparaginase exógena, para hidrolisar a asparagina originária do sangue, da qual estas células dependem (Figura 19.18). Células normais sintetizam e degradam asparagina.

Aminoácido Oxidases Removem Grupos AminoMuitos aminoácidos são substratos para L-aminoácido oxidase (Figura 19.19). O significado desta reação no metabolismo é incerto, mas parece ser pequeno. A en-zima contém flavina mononucleotídeo (FMN) e produz peróxido de hidrogênio. Catalase metaboliza o peróxido de hidrogênio a oxigênio e água. Os produtos finais são um α-cetoácido, amônia e água, os mesmos produtos da reação da glutamato desidrogenase. Na reação da aminoácido oxidase, diferentemente da reação catali-sada pela glutamato desidrogenase, não há produção de NADH e, portanto, nenhuma produção de ATP.

Uma D-aminoácido oxidase ocorre em células humanas. Muito pouco dos isômeros D-aminoácidos é encontrado no homem, e a enzima pode degradar D-aminoácidos derivados de bactérias intestinais.

19.3 | TRANSPORTE DE NITROGÊNIO PARA FÍGADO E RIM

Proteína É Constantemente DegradadaCélulas morrem em uma base regular e programada, um processo chamado apoptose (ver p. 993), e suas mo-léculas componentes são metabolizadas. Proteínas indi-viduais também sofrem turnover regular em condições normais (ver p. 239). Embora muitas reações envolvidas

NH2

C O

COO–

CH2

HC

COO–

Aspartato

CH2

CH2+NH3 HC NH3

COO–

Glutamina

ATP

AMP + PPi

NH2

C O

CH2

HC NH3

COO–

Asparagina

CH2

CH2

HC NH3

COO–

COO–

Glutamato

+ +

+ ++

COO–

CH2

HC

COO––

Aspartato

+

NH3

NH2

C O

CH2

HC NH3

COO–

Asparagina

NH4+

H2O

+

FIGURA 19.18Reação catalisada pela asparaginase.

FIGURA 19.17Síntese de asparagina.

R

HC

COO–

C

NH4

COO–

FMN

FMNH2 O2

H2O2

R

H2O

C

COO–

R

O ++

NH2+

NH3+

FIGURA 19.19Reação da L-aminoácido oxidase, uma flavoproteína.

BioQ.19 732 22.01.07 18:16:32

CAPÍTULO 19 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS | 745

FIGURA 19.47Biopterina. A forma di-hidro- (quinonóide) é produzida durante oxidação de aminoácidos aromáticos e depois reduzida à forma tetra-hidro por uma desidrogenase, usando NADH.

Fonte: Scriver, C. R. e Clow, L. L. Phenylketonuria: Epitome of human biochemical genetics. N. Engl. J. Med. 303:1336,1980. Woo, S. L. C. Molecular basis and population genetics of phenylketonuria. Biochemistry 28:1, 1989. Shintaku, H. Disorders of tetrahydrobiopterin metabolism and their treatments. Curr. Drug. Metab. 3:123; 2002. Blau, N., Bonafe, L. e Thony, B. Tetrahydrobiopterin deficiencies without hyperphenylalaninemia diagnosis and gene-tics of dopa-responsive distonia and sepiapterin reductase deficiency. Mol. Genet. Metab. 74:172, 2001.


Fenilcetonúria

Fenilcetonúria (PKU) é a doença mais comum cau-sada por uma deficiência de uma enzima do meta-bolismo de aminoácidos. O nome vem da excreção do ácido fenilpirúvico, uma fenilcetona, na urina. Fenil-lactato (Figura 19.47), a forma reduzida do fe-nilpiruvato, e fenilacetato são também excretados. O último dá à urina um odor “murino”. Esses três metabólitos são encontrados em quantidades muito pequenas na urina de pessoas saudáveis. Os sinto-mas de retardo mental associados a esta doença po-dem ser evitados por uma dieta pobre em fenilalani-na. Teste de triagem de rotina é determinado pelos governos de muitas partes do mundo. PKU clássica é uma deficiência autossômica recessiva de fenila-lanina hidroxilase. Mais de 417 mutações no gene foram descritas. Em alguns casos, há sintomas neu-rológicos graves e QI muito baixo. Estes são geral-mente atribuídos aos efeitos tóxicos da fenilalanina, possivelmente devido ao transporte reduzido e me-tabolismo de outros aminoácidos aromáticos no cé-rebro, devido à competição das altas concentrações de fenilalanina. A cor clara característica da pele e dos olhos deve-se à falta de pigmentação, devido à deficiência de tirosina. Tratamento convencional é por uma dieta sintética, pobre em fenilalanina, mas incluindo tirosina, por cerca de quatro a cinco anos, seguida de restrição de proteínas na dieta por vários anos mais ou por toda a vida.

Cerca de 3% das crianças com altos níveis de fenilalanina têm hidroxilase normal, mas são defi-

cientes na síntese ou na redução de biopterina. Uma deficiência de BH4 pode ser causada por mutação na GTP ciclo-hidrolase (GTPCH), 6-piruvoiltetra-hidro-biopterina sintetase (PTPS) ou sepiapterina reduta-se (SPR), as três enzimas que convertem GTP em BH4. Duas enzimas são necessárias para regenera-ção de BH4: pterina-4a-carbinolamina desidratase (PCD) e di-hidropterina redutase (DHPR). Deficiên-cia de BH4 ocorre a uma taxa de um em um milhão. Screening para hiperfenilalaninemia sem redução de atividade de fenilalanina hidroxilase in vitro in-dica a possibilidade de uma deficiência de BH4. Se a condição não for tratada, pacientes apresentam sintomas de hiperfenilalaninemia, cabelo vermelho, retardo psicomotor e deterioração neurológica pro-gressiva. Estes últimos sintomas são um resultado da incapacidade de produzir melanina, catecolami-nas e serotonina. Tratamento é suplementação com BH4 e precursor de neurotransmissores. Distonia que responde a DOPA (DRD) e deficiência de SR não podem ser detectadas em testes de screening para PKU. Fibroblastos de pele são úteis para o diagnós-tico destas condições. A descoberta da deficiência de SR levou à descoberta de vias alternativas do metabolismo de BH4, incluindo um papel para di-hi-drofolato redutase (DHFR). Baixos níveis de DHFR no cérebro permitem que di-hidrobiopterina se acu-mule e iniba tirosina e triptofano hidroxilases. DHP também desacopla óxido nítrico sintase e pode levar à morte de célula neuronal.

CH2

NH3

CH COO–

+

CH2

NH3

CH COO–

+

HOFenilalanina Tirosina

O2 H2Otetra-hidrobiopterina di-hidrobiopterina

fenilalanina hidroxilaseCH3

H2N

OH OHO

HH H

H

HCH CH

N N

NHN

CH3

OH OHO

HH H

H

CH CH

N N

HN

HN

Tetra-hidrobiopterina

Di-hidrobiopterina

N

FIGURA 19.46Fenilalanina hidroxilase.

BioQ.19 745 22.01.07 18:16:49


ocorre, de maneira dependente de piridoxal. Reações subseqüentes levam a acetoacetil-CoA. Uma via mino-ritária começa com remoção do α-amino-grupo e pros-segue via o composto cíclico pipecolato (Figura 19.73), para se juntar à via principal no nível do intermediário semialdeído. Esta não substitui a via principal, mesmo em uma deficiência de enzimas na parte inicial da via (ver Corr. Clín. 19.16).

CH3

CH3

C CH CH2–OOCCO2 H2O

metilcrotonil-CoAcarboxilase

ATP ADP + PiC

O

SCoA(A partir de leucina)

�–Metilcrotonil-CoA

CH C

OCH3

SCoAC

�–Metilglutaconil-CoA

CH3 C

O

SCoA

Acetil-CoA

CH3 C CH2 C

O

O–

OAcetoacetato

hidroximetilglutaril-CoA liaseCH2–OOC C

O

SCoAC

H2Ometilglutaconil-CoA

hidratase

CH2

OH

CH3

�–Hidroxi–�–metilglutaril-CoA(HMG CoA)

FIGURA 19.70Reações finais na degradação de leucina.

CH3 C

CH–OOC

SCoA

O

C

CH2

CH3

CO2

SCoA

Propionil-CoA

propionil-CoAcarboxilase

O

CH2–OOC CH2 C SCoA

metilmalonil-CoAmutase

CH–OOC

O

C

CH3

SCoA

D–Metilmalonil-CoA

metilmalonil-CoAracemase

L–Metilmalonil-CoA

Succinil-CoAO

FIGURA 19.71Interconversão de propionil-CoA, metilmalonil-CoA e succinil-CoA. A mutase requer 5’-desoxiadenosilcobalamina para atividade.

Deficiência de qualquer das três enzimas mostradas na Figura 19.71 contribui para cetoacidose. Propiona-to é formado na degradação de valina, isoleucina, me-tionina, treonina, cadeia lateral do colesterol e ácidos graxos de cadeia ímpar. Os aminoácidos parecem ser os principais precursores, uma vez que diminuição ou eliminação de proteínas da dieta minimiza ime-diatamente a acidose. Um defeito na propionil-CoA carboxilase resulta em acúmulo de propionato, que é desviado para vias alternativas, incluindo incorpo-ração em ácidos graxos em lugar do primeiro grupo acetil, para formar ácidos graxos de cadeia ímpar. A extensão dessas reações é muito limitada. Em um caso, relatou-se que grandes quantidades de biotina produziram efeitos benéficos, sugerindo que mais de um defeito diminua a atividade da propionil-CoA carboxilase. As possibilidades são: uma perda de biotinidase intestinal, que libera biotina de alimen-to ingerido para absorção, ou uma perda de biotina holocarboxilase, que incorpora biotina de alimentos


Doenças do Metabolismo de Propionato e Metilmalonato

ingeridos para absorção, ou perda de biotina holocar-boxilase, que incorpora biotina em enzimas biotina-dependentes. Acidose em crianças pode ser causada por altos níveis de metilmalonato, que normalmente não é detectado no sangue. Fígado retirado de au-tópsia ou fibroblastos em cultura mostraram em al-guns casos, deficiência de metilmalonil-CoA mutase. Algumas amostras foram incapazes de converter metilmalonil-CoA em succinil-CoA em qualquer con-dição, mas outras amostras executaram a conversão quando 5’-adenosilcobalamina foi adicionada. É claro que aqueles com defeito no sítio ativo da enzima, não conseguem metabolizar metilmalonato, mas aqueles com defeito no manuseio da vitamina B12 respondem a altas doses da vitamina. Outros casos de acidúria metilmalônica têm uma incapacidade mais funda-mental de usar vitamina B12, que leva a deficiência de metilcobalamina (co-enzima da recuperação de me-tionina) e deficiência de 5’-adenosilcobalamina (co-enzima da isomerização de metilmalonil-CoA).

Fonte: Mahoney, M. J. e Bick, D. Recent advances in the inherited methylmalonic acidemias. Acta Paediatr. Scand. 76:689, 1987.

BioQ.19 760 22.01.07 18:17:07


N

N

N

N

65

4

7

8

93

2

1

Amida de glutamina

"C1"–H4folato"C1"–H4folato

Amina de aspartato

GlicinaHCO3–

METABOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOSJoseph G. Cory


20


20.2 FUNÇÕES METABÓLICAS DOS NUCLEOTÍ-DEOS, 771

Distribuição de nucleotídeos varia com o tipo de célula, 771

20.3 METABOLISMO DE PURINA NUCLEOTÍDEOS, 772

Síntese de purina nucleotídeos, 772 Síntese de IMP, 772 IMP é precursor de AMP e GMP, 774 Síntese de purina nucleotídeos é muito regu-

lada, 774 Purina bases e nucleosídeos são recuperados

para regenerar nucleotídeos, 775 Purina nucleotídeos são interconvertidos para

equilibrar níveis celulares de adenina e guanina nucleotídeos, 778

GTP é o precursor de tetra-hidrobiopterina , 778 Ácido úrico é o produto final da degradação

de purinas no homem, 778 Formação de ácido úrico, 781

20.4 METABOLISMO DE PIRIMIDINA NUCLEOTÍ-DEOS, 783

Síntese de pirimidina nucleotídeos, 783 Síntese de pirimidina nucleotídeos é regula-

da ao nível da carbamoil fosfato sintetase II, 784

Bases pirimídicas são recuperadas para regenerar nucleotídeos, 786

20.5 FORMAÇÃO DE DESOXIRRIBONUCLEOTÍDE-OS, 786

Desoxirribonucleotídeos são formados por redu- ção de ribonucleosídeos 5’-difosfatos, 786

Síntese de desoxitimidilato requer N5, N10-meti- leno H4folato, 788

Interconversões de pirimidinas com ênfase em desoxirribopirimidina nucleosídeos e nucleo- tídeos, 788

Pirimidina nucleotídeos são degradados a β-ami- noácidos, 789

20.6 NUCLEOSÍDEO E NUCLEOTÍDEO QUINASES, 789

20.7 ENZIMAS QUE METABOLIZAM NUCLEOTÍDE-OS COM UMA FUNÇÃO EM CICLO CELULAR E TAXA DE DIVISÃO CELULAR, 790

20.8 SÍNTESE DE COENZIMAS NUCLEOTÍDEOS, 791

20.9 SÍNTESE E UTILIZAÇÃO DE 5-FOSFORRIBOSIL-1-PIROFOSFATO, 791

20.10 AGENTES QUIMIOTERÁPICOS QUE INTER-FEREM COM METABOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS, 793

Inibidores do metabolismo de purina e pirimidina nucleotídeos, 794

Antimetabólitos são análogos estruturais de bases ou nucleosídeos. 794

Antifolatos inibem a formação de tetra-hidrofolato, 795

BioQ.20 770 22.01.07 18:22:07

CAPÍTULO 20 METABOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS | 783

causa de hiperuricemia/hiperuricúria pode ser defini-da como um defeito metabólico relacionado com a su-perprodução de purina nucleotídeos, e outras situações nas quais não há alterações metabólicas definidas (ver Corr. Clín. 20.1, 20.2, 20.5 e 20.6).

20.4 | METABOLISMO DE PIRIMIDINA NUCLEOTÍDEOS

A síntese de novo do anel pirimidínico em células de mamíferos utiliza aminoácidos como doadores de car-bono e nitrogênio, além de CO2. Uridina 5’-monofosfa-to (UMP) é sintetizado em uma via metabólica de seis

etapas. Hidrólise de ATP (ou equivalente) é necessária para direcionar diversas etapas da via.

Síntese de Pirimidina NucleotídeosEm contraste com a síntese de novo de purina nucle-otídeos, nem todas as enzimas para a síntese de novo de pirimidina nucleotídeos são citosólicas. Reações que levam à formação de UMP são apresentadas na Figura 20.13. Aspectos importantes da via devem ser observa-dos. O anel pirimidina é formado primeiro, e depois ri-bose 5-fosfato é adicionada com PRPP, sendo o doador


Pacientes com Câncer em Tratamento por Radiações ou Quimioterapia

Pacientes com câncer com tumores grandes, em tratamento por radioterapia ou quimioterapia também apresentam concentrações aumentadas de ácido úrico no soro e na urina. A fonte deste ácido úrico aumentado não é síntese aumentada de purina nucleotídeos, mas sim destruição de células tumorais que, por sua vez, liberam ácidos nucléicos degradados e nucleotídeos celulares, que são metabolizados a ácido úrico. Muitos dos protocolos de tratamento de câncer incluem alo-purinol como uma das drogas, com o único pro-pósito de limitar o acúmulo de ácido úrico nos pacientes. Uma nova droga uricolítica (Rasburi-case, uma enzima bacteriana) que converte ácido úrico em um composto hidrossolúvel está sendo usada em crianças e adultos para lidar com os níveis aumentados de ácido úrico formado após células tumorais terem sido destruídas. Embora o uso de uricase ter certas vantagens farmacoló-gicas sobre alopurinol, tem a desvantagem de ser mais caro.

Fonte: Smalley, R. V., Guaspari, A., Haase-\break Statz, S., Anderson, S. A., Cederberg, D. e Hohneker, J. A. Allopurinol: Intravenous use for prevention and tre-atment of hyperuricemia. J. Clin. Oncol. 18:1758, 2000. Ribeiro, R. C. e Pui, C. H. Recombinant urate oxidase for prevention of hyperuricemia and tumor lysis syn-drome in lymphoid malignancies. Clin. Lymphoma 3:252, 2003. Yim, B. T., Sims-McCallum, R. P. e Chong, P. H. Rasburicase for the treatment and prevention of hyperuricemia. Ann. Pharmacother. 37:1047, 2003.


Subclasse de Pacientes com Autismo

Recentemente demonstrou-se que uma subclas-se de crianças com autismo infantil excreta ácido úrico em mais de dois desvios padrões acima da média normal. Este grupo de crianças represen-ta aproximadamente 20% da população autis-ta. Com cultura de fibroblastos destas crianças autistas, descobriu-se que a síntese de novo de purina nucleotídeos, medida por incorporação de [14C]-formato em purina nucleotídeos, estava au-mentada quatro vezes, em relação ao observado em fibroblastos de controles normais. A razão de adenina nucleotídeos para guanina nucleotíde-os no pool estava alterada, sugerindo que a via de interconversão de purina nucleotídeos estava comprometida. Até o momento, a base molecular para a síntese de novo aumentada de purina nu-cleotídeos nestas crianças autistas não é conhe-cida. Um aspecto incomum da síntese aumentada de purina nucleotídeos nestas crianças é que a excreção de ácido úrico é elevada, mas a concen-tração de ácido úrico no soro está na faixa nor-mal. Em um relato recente, um paciente do sexo masculino foi tratado com uma dose oral de uridi-na por um período de dois anos. Como resultado, o paciente teve notável melhora no desempenho social, cognitivo, de linguagem e motor. Surpre-endentemente, quando a uridina foi descontinu-ada, os sintomas de autismo voltaram, mas com o reinício do tratamento com uridina, o comporta-mento do menino melhorou novamente.

Page, T. e Coleman, M. Purine metabolism abnorma-lities in a hyperuricosuric subclass of autism. Biochim. Biophys. Acta 1500:291, 2000. Page, T. e Moseley, C. Metabolic treatment of hyperuricosuric autism. Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry 26:397, 2002.

BioQ.20 783 22.01.07 18:22:20


O pool de desoxirribonucleotídeos é extremamen-te pequeno em células “em repouso” (inferior a 1 μM). Como resultado do aumento de atividade de ribonucleo-tídeo redutase, as concentrações de desoxirribonucleo-tídeos alcançam 10-20 μM durante síntese de DNA. En-tretanto, esta concentração suportaria síntese de DNA por alguns minutos, enquanto a replicação completa do DNA requer horas. Conseqüentemente, os níveis de atividade da ribonucleotídeo redutase não só devem aumentar, mas devem ser mantidos durante a fase S, para fornecerem os substratos necessários à síntese de DNA. Tecidos em crescimento, como o fígado em regeneração, tecidos embrionários, células da mucosa intestinal e células eritropoiéticas estão inclinados em direção à replicação de DNA e à síntese de RNA. Estes tecidos apresentarão níveis elevados das enzimas-cha-ves envolvidas com síntese e interconversões de purina e pirimidina nucleotídeos, juntamente com diminuição complementar na quantidade de enzimas que catalisam reações nas quais estes precursores são degradados. Estas mudanças refletem a proporção de células que estão na fase S.

Um padrão ordenado de alterações bioquímicas ocorre em células tumorais. A partir de uma série de tumores de fígado, cólon e rim, com diferentes velocida-des de crescimento, estas alterações foram identificadas como: (1) ligadas à transformação (significando que to-dos os tumores, independentemente da velocidade de crescimento, apresentam quantidades de certas enzi-mas aumentadas e, de certas enzimas, diminuídas), (2) ligadas à progressão (alterações que se correlacionam com a velocidade de crescimento dos tumores) e (3) alterações coincidentes (não ligadas ao estado malig-no). Os níveis de ribonucleotídeo redutase, timidilato sintase e IMP desidrogenase aumentam em função da velocidade de crescimento do tumor. PRPP amidotrans-ferase, UDP quinase e uridina quinase estão aumenta-das em todos os tumores, independentemente de serem de crescimento lento ou rápido.

Alterações de expressão gênica em células tumorais não são apenas alterações quantitativas em níveis enzi-máticos, mas também alterações qualitativas (troca de isozimas, isozyme shifts). Enquanto algumas enzimas estão aumentadas em tecido normal de crescimento rápido (p. ex., embrionário e fígado em regeneração) e em tumores, os padrões gerais quantitativo e qualitativo para tecidos normal e tumoral podem ser diferenciados.

20.8 | SÍNTESE DE COENZIMAS NUCLEOTÍDEOS

Nicotinamida adenina nucleotídeo (NAD+), fla-vina adenina nucleotídeo (FAD+) e coenzima A (CoA) são importantes coenzimas ou grupos prostéti-cos do metabolismo intermediário. Embora todas essas

coenzimas tenham um resíduo de AMP como parte de sua estrutura, o resíduo de AMP não está diretamente envolvido nas reações em que cada uma delas funciona. Em NAD e NADP, é o anel de nicotinamida que está envolvido na função de oxidação/redução; em FMN ou FAD, é o anel flavina que está envolvido na função de oxidação/redução; na coenzima A, é o grupo sulfidri-la que é parte funcional da molécula. São sintetizadas por uma variedade de tipos de células de mamíferos. Figuras 20.27, 20.28 e 20.29 apresentam as vias biossin-téticas para cada uma. Síntese de NAD requer niacina, síntese de FAD requer riboflavina, e CoA requer ácido pantotênico. NAD é sintetizado por três vias diferentes, começando com triptofano (ver p. 754), nicotinato ou nicotinamida, respectivamente. Quando triptofano está em excesso, em relação à quantidade necessária para síntese de proteínas e de serotonina (ver p. 773), ele pode ser usado para síntese de NAD. Esta situação não é provável na maioria das dietas normais; conseqüente-mente, niacina é necessária na dieta.

Síntese de NAD+ por qualquer uma das três vias re-quer PRPP como doador de ribose 5-fosfato. Nicotina-mida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) é deriva-do por fosforilação do NAD+. NAD+ é usado não só como cofator em reações de oxidação-redução, mas também como um substrato em reações de ADP-ribosilação (p. ex., reparo de DNA e envenenamento por toxina per-tussis; ver p. 514). Estas reações levam ao turnover de NAD+. O produto final da degradação de NAD+ é 2-piri-dona-5-carboxamida, que é excretado na urina.

Síntese de coenzimas nucleotídeos é regulada de maneira que existam concentrações essencialmente constantes destas coenzimas na célula. Quando se diz que uma certa condição metabólica é favorecida quan-do a concentração de NAD+ é baixa, a concentração de NADH é correspondentemente alta. Como um exemplo, para que a glicólise continue em condições anaeróbicas, NAD+ deve ser continuamente regenerado por redução de piruvato a lactato, catalisado pela lactato desidroge-nase (ver p. 582).

20.9 | SÍNTESE E UTILIZAÇÃO DE 5-FOSFORRIBOSIL-1-PIROFOSFATO

5-Fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) é uma molé-cula chave na síntese de novo de purina e pirimidina nucleotídeos, na recuperação de bases púricas e piri-mídicas, e na síntese de NAD+. PRPP sintetase catalisa a reação apresentada na Figura 20.30. Ribose-5-fosfato usada nesta reação é gerada a partir do metabolismo de glicose 6-fosfato, pela via das pentoses fosfato, ou da ribose 1-fosfato gerada por fosforólise de nucleosídeos, via nucleosídeo fosforilase. PRPP sintetase tem uma ne-cessidade absoluta de fosfato inorgânico e é fortemente regulada. A curva de velocidade versus concentração

BioQ.20 791 22.01.07 18:22:30


5. Síntese de NAD+

PRPP + nicotinato nicotinato mononucleotídeo + PP

PRPP +i

nicotinamidanico

ttinamida mononucleotídeo + PP

PRPP + quinoi

llinatonicoti

nnato mononucleotídeo + PPi

Deve-se lembrar que os níveis celulares de pirofos-fatase são muito altos em células, levando à hidrólise de pirofosfato a fosfato, e tornando as reações irrever-síveis.

20.10 | AGENTES QUIMIOTE-RÁPICOS QUE INTER-FEREM COM META-BOLISMO DE PURINA E PIRIMIDINA NUCLE-OTÍDEOS

Síntese de novo de purina e pirimidina nucleotídeos é crítica para replicação, manutenção e função da cé-lula normal. Regulação destas vias é importante, uma vez que foram identificadas doenças que surgem de defeitos nas enzimas regulatórias. Compostos sintéti-cos e produtos naturais de plantas, bactérias ou fun-gos, que são análogos estruturais das nucleobases ou dos nucleosídeos usados em reações metabólicas, têm

CH2 C CC

H3C

H3C

CH2OH

OHOH

H H H

OH

CH2 C CC CH2

OHOH

H H H

OH

O P O–

O

O–

CH2 C CC CH2

OHOH

H H H

OH

O P O

O

–O

P O O

HO OH

CH2

NH2

O

–O

N

N

N

NH

O

O

H3C

H3C

N

N

N

NH

O

O

H3C

H3C

N

N

N

NH

O

ATP

ADP

Riboflavina

Riboflavins fosfato (flavina mononucleotídeo, FMN)

Flavins adenina dinucleotídeo (FAD)

riboflavina quinase

ATP

PPiFAD - pirofosforilase

NN

N N

O

FIGURA 20.28Síntese de flavina adenina dinucleotídeo.

BioQ.20 793 22.01.07 18:22:33

CAPÍTULO 21 METABOLISMO DO HEME E DO FERRO | 803

N

N

N Fe NM

M

M

M

P

P

V

� �

� �

V

Heme

METABOLISMO DO HEME E DO FERROWilliam M. Awad, Jr.


21

21.1 METABOLISMO DO FERRO: VISÃO GERAL, 804

21.2 PROTEÍNAS QUE CONTÊM FERRO, 804 Transferrina transporta ferro no soro, 804 Lactoferrina liga ferro no leite, 805 Ferritina é uma proteína envolvida no armazena-

mento de ferro, 805 Proteínas que contêm ferro não-hemínico estão

envolvidas em processos enzimáticos, 806

21.3 ABSORÇÃO INTESTINAL DE FERRO, 807

21.4 REGULAÇÃO MOLECULAR DA UTILIZAÇÃO DE FERRO, 808

21.5 DISTRIBUIÇÃO E CINÉTICA DO FERRO, 811

21.6 BIOSSÍNTESE DO HEME, 813 Enzimas da biossíntese do heme ocorrem em

mitocôndrias e citosol, 818 Ácido δ-aminolevulínico sintase, 818 Ácido aminolevulínico desidratase, 818 Porfobilinogênio deaminase e uroporfirinogê-

nio III sintase, 818 Uroporfirinogênio descarboxilase, 819 Coproporfirinogênio oxidase, 820 Protoporfirinogênio oxidase, 820 Ferroquelatase, 820 ALA sintase catalisa a etapa limitante da veloci-

dade da biossíntese do heme, 821

21.7 CATABOLISMO DO HEME, 821 Bilirrubina é conjugada para formar bilirrubina

diglucuronídeo no fígado, 821 Hemólise intravascular requer remoção de ferro,

823BIBLIOGRAFIA, 826


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 21.1 Sobrecarga de Ferro e Infecção, 805 21.2 Patogenicidade Microbiana e Ferro, 805 21.3 Síntese do Grupo Ferro-Enxofre e Doença

Humana, 807 21.4 Ataxia de Friedreich, 807 21.5 Absorção Duodenal de Ferro, 809 21.6 Elementos de Resposta ao Ferro Mutante,

811 21.7 Deficiência de Ceruloplasmina, 812 21.8 Anemia por Deficiência de Ferro, 812 21.9 Hemocromatose Tipo I: Genética Mole-

cular e a Questão das Dietas Enriquecidas em Ferro, 814

21.10 Hemocromatose Tipo III, 814 21.11 Porfiria Intermitente Aguda, 817 21.12 Papel Citoprotetor de Heme Oxigenase,

822 21.13 Hemólise Isoimune Neonatal, 824 21.14 Deficiência de Bilirrubina UDP-Glucurono-

siltransferase, 824 21.15 Elevação de Bilirrubina Conjugada no

Soro, 825

BioQ.21 803 22.01.07 18:25:39


21.5 | DISTRIBUIÇÃO E CINÉTICA DO FERRO

Um homem normal de 70 kg contém 3-4 g de ferro, dos quais apenas 0,1% (3,5 mg) no plasma. Aproximada-mente 2,5 g estão na hemoglobina. Tabela 21.3 lista a distribuição de ferro no ser humano.

Normalmente, cerca de 33% dos sítios de transferri-na contêm ferro. Ferro absorvido do intestino é entre-gue primariamente à medula óssea, para incorporação em hemoglobina dos eritrócitos.

Mutações simples foram descritas no segmento de alça do elemento de resposta ao ferro do mRNA da cadeia leve da ferritina, com uma quantidade au-mentada de apoferritina sendo sintetizada, mas sem um aumento no ferro total do corpo. Esta mutação leva a uma afinidade 28 vezes menor para IRP-1, em um caso. O conteúdo de L-ferritina do cristalino pode aumentar nove vezes em comparação ao con-teúdo no cristalino de indivíduos controles. Como conseqüência, cristais de cadeias leves puras de fer-ritina aparecem no cristalino, levando a catarata. A

Fonte: Girelli, D., Corrocher, R., Bisceglia, L., et al. Molecular basis for the recently described hereditary hyperferriti-nemia-cataract syndrome: a mutation in the iron-responsive elements of ferritin L-subunit gene (the “Verona mutation”). Blood 86: 4050, 1995. Beaumont, C., Leneuve, P., Devaux, I., Scoazec, J.Y., et al. Mutation in the iron responsive element of the L ferritin mRNA in a family with dominant hyperferritinaemia and cataract. Nature Genet. 11: 444, 1995. Mumford, A. D., Cree, I. A., Arnold, J. D., et al. The lens in hereditary hyperferritinemia cataract syndrome contains crystalline deposits of L-ferritin. Br. J. Ophthalmol. 84:697, 2000. Kato, J., Fujikawa, K., Kanda, M., et al. A mutation in the iron-responsive element of H-ferritin mRNA, causing autosomal dominant iron overload. Am. J. Hum. Genet. 69:191, 2001.


Elemento de Resposta ao Ferro Mutante

síntese muito aumentada de ferritina no cristalino pode levar a uma quantidade aumentada de reações catalisadas por ferro, com dano lenticular oxidativo muito bem descrito. Uma mutação numa família ja-ponesa ocorre no IRE do mRNA da cadeia H da fer-ritina, com um marcado aumento na afinidade por IRP. O seqüestro de IRPs leva à síntese diminuída de cadeia H e síntese aumentada de cadeia L. Esta condição está associada com aumento significativo no conteúdo de ferro do corpo, mas aparentemente sem evidência de catarata.

TABELA 21.2 Síndromes de Sobrecarga de Ferro

Nome Gene Cromossomo Herança Ocorrência Proteína

Síndrome GRACILE BCS1L 2q33 Recessiva Muito rara Chaperone mitocondrial

Hemocromatose juvenil HFE2 1q21 Recessiva Incomum Hemojuvelina

Hemocromatose juvenil HFE2B 19q13 Recessiva Incomum Hepcidina

Hemocromatose HFE1 6p21 Recessiva Comum Proteína HFE

Hemocromatose HFE3 7q22 Recessiva Incomum Receptor 2 de transferrina

Hemocromatose HFE4 2q32 Dominante Rara Ferroportina

Sobrecarga de ferro FTH1 11q13 Dominante Muito rara Ferritina H

Aceruloplasminemia CP 3q23 Recessiva Rara Ceruloplasmina

Fonte: Fellman, V. The GRACILE syndrome, a neonatal lethal metabolic disorder with iron overload. Blood Cells Mol. Dis. 29:444, 2002. Ver Corr. Clín. 21.6, 21.7, 21.9 e 21.10 para maiores detalhes.

TABELA 21.3 Distribuição Aproximada de Ferro: Homem de 70 kg

g %

Hemoglobina 2,5 68

Mioglobina 0,15 4

Transferrina 0,003 0,1

Ferritina, tecido 1,0 27

Ferritina, soro 0,0001 0,004

Enzimas 0,02 0,6

Total 3,7 100

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Porfiria Intermitente Aguda

Uma mulher de 40 anos de idade procurou o pron-to-socorro em um estado agitado, chorando e recla-mando de intensa dor abdominal. Estava constipada há vários dias e notou marcada fraqueza nos braços e nas pernas e que “as coisas não parecem estar completamente corretas”. Exame físico revelou uma velocidade de batimento cardíaco ligeiramente ace-lerada (100/min) e hipertensão moderada (pressão sangüínea de 160/110 mmHg). Episódios anteriores de dor abdominal severa já haviam ocorrido; ope-rações realizadas em duas ocasiões não revelaram nenhuma anormalidade. Os testes laboratoriais co-muns são normais. As queixas neurológicas não são localizadas num foco anatômico. Decide-se que os sintomas presentes são amplamente de origem psi-quiátrica e têm uma base funcional, e não orgânica. A paciente é sedada com 60 mg de fenobarbital; um psiquiatra consultado concorda, por telefone, em ver a paciente em aproximadamente 4 h. O corpo clíni-co percebe uma piora notável; fraqueza generalizada surge rapidamente, progredindo para um comprome-timento da função respiratória. Esta evolução ruim leva à incorporação imediata de um regime de ven-tilação assistida, com transferência para unidade de terapia intensiva para monitoração fisiológica. Sua condição piora e ela morre 48 h depois. Uma amos-tra de urina da paciente é relatada mais tarde como apresentando um nível muito elevado de porfobili-nogênio. Esta paciente tinha porfiria intermitente aguda, uma doença pouco entendida da biossíntese de heme. Há um padrão de herança dominante as-sociado a uma superprodução de ALA e porfobilino-gênio, os precursores de porfirina. Três anomalias enzimáticas foram observadas em casos que foram estudados cuidadosamente. Estas incluem: (1) um grande aumento de ALA sintase, (2) uma redução à metade da atividade de porfobilinogênio deaminase, e (3) uma redução à metade da atividade da esterói-de 5α-redutase. A mudança no conteúdo da segunda enzima é consoante com uma expressão dominante. A mudança no conteúdo da terceira enzima é adqui-

Fonte: Meyer, U.A., Strand, L.J., Doss, M., et al. Intermittent acute porphyria: demonstration of a genetic defect in porphobilinogen metabolism. N. Engl. J. Med. 286: 1277, 1972. Stein, J.A. e Tscudy, D.D. Acute intermittent por-phyria: a clinical and biochemical study of 46 patients. Medicine (Baltimore) 49: 1, 1970.

rida, e aparentemente não existe expressão heredi-tária da doença. Acredita-se que uma diminuição na porfobilinogênio deaminase leve a uma pequena diminuição no conteúdo de heme do fígado. A con-centração menor de heme leva a uma insuficiência na repressão da síntese e na inibição da atividade da ALA sintase. Quase nunca manifestada antes da puberdade, acredita-se que a doença apareça ape-nas com a indução da 5β-redutase, na adolescência. Sem uma quantidade suficiente de 5α-redutase, o aumento observado nos 5β-esteróides é devido a um desvio de esteróides para a via da 5β-redutase. A im-portância de anomalias nesta última via metabólica na patogênese da porfiria é controversa. A doença é um grande enigma: o desarranjo do metabolismo da porfirina é confinado ao fígado, que anatomicamen-te parece normal, enquanto achados patológicos es-tão restritos ao sistema nervoso. No presente caso, envolvimento de (1) cérebro leva ao estado agitado e confuso e ao colapso respiratório, (2) sistema autô-nomo leva à hipertensão, aumento na velocidade de batimentos cardíacos, constipação e dor abdominal, e (3) sistema nervoso periférico e medula espinhal levam à fraqueza e distúrbios sensoriais.

Experimentalmente, nenhum intermediário me-tabólico conhecido da biossíntese do heme pode causar a patologia observada na porfiria intermi-tente aguda. Deveria ter havido uma suspeita maior da possibilidade de porfiria, logo após a chegada da paciente. O tratamento incluiria infusão de glicose, exclusão de qualquer droga que pudesse causar au-mento de ALA sintase (p.ex., barbituratos) e, se a doença não respondesse satisfatoriamente apesar destas medidas, administração de hematina intra-venosa para inibir a síntese e a atividade de ALA sin-tase. Porfiria hepática aguda é de interesse político histórico. A doença foi diagnosticada em dois des-cendentes do rei George III, sugerindo que o último tinha uma personalidade alterada antes e durante a Revolução Americana, que poderia talvez ser atri-buída à porfiria.

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sensível aos efeitos de metais pesados, especialmente chumbo, e, é claro, à deprivação de ferro. Nestes últi-mos casos, zinco é incorporado em lugar do ferro, for-mando um complexo zinco-protoporfirina IX. Em con-traste com heme, o complexo zinco-protoporfirina IX é muito fluorescente e facilmente detectável em pequenas quantidades. Ferroquelatase procariótica não contém um grupo prostético; enquanto a enzima de mamíferos contém um grupo Fe2S2.

ALA Sintase Catalisa a Etapa Limitante da Velocidade da Biossíntese do HemeALA sintase controla a etapa limitante da velocidade de síntese de heme em todos os tecidos. Succinil-CoA e glicina são substratos para uma variedade de reações. A modulação da atividade de ALA sintase determina a quantidade de substratos que será desviada para bios-síntese de heme. Heme e hematina agem como repres-sores da síntese de ALA sintase e como inibidores de sua atividade. Como heme não se assemelha nem com os substratos nem com o produto da ação da enzima, é provável que atue sobre um sítio alostérico. Quase 100 drogas e metabólitos diferentes podem causar indução de ALA sintase; por exemplo, um aumento de 40 vezes é observado em rato após tratamento com 3,5-dicar-betoxi-1,4-di-hidrocolidina. O efeito dos agentes far-macológicos levou a uma característica clínica impor-tante: alguns pacientes com certos tipos de porfiria tiveram exacerbação de sua condição após adminis-tração inadequada de certas drogas (p. ex., barbitu-ratos). ALA desidratase é também inibida por heme; mas isto tem poucas conseqüências fisiológicas, uma vez que a atividade de ALA desidratase é cerca de 80 vezes maior do que a de ALA sintase e, portanto, efei-tos inibitórios do heme refletem-se primeiro na ativi-dade de ALA sintase.

Glicose ou um de seus metabólitos proximais inibe biossíntese de heme por um mecanismo desconhecido. Isto é de relevância clínica, uma vez que alguns pa-cientes manifestam seu estado porfírico pela primei-ra vez quando colocados em dieta muito hipocalórica (e, portanto, de pouca glicose). Outros reguladores do metabolismo de porfirinas incluem certos esteróides. Hormônios esteróides (p. ex., pílulas contraceptivas orais) com uma dupla ligação no anel A entre os áto-mos C4 e C5 podem ser reduzidos por duas redutases diferentes. O produto da redução de 5α tem pouco efei-to sobre a biossíntese de heme; entretanto, o produto da 5β-redução serve com um estímulo para síntese de ALA sintase.

21.7 | CATABOLISMO DE HEME

Catabolismo de proteínas contendo heme apresenta duas necessidades para o mamífero hospedeiro: (a) um meio para processar os produtos hidrofóbicos de cliva-gem do anel porfirínico e (b) retenção e mobilização do ferro contido, de forma que possa ser reutilizado. Eritrócitos têm um tempo de vida de aproximadamente 120 dias. Células senescentes são reconhecidas por al-terações em suas membranas, e removidas pelo sistema retículoendotelial em locais extravasculares. As cadeias de globina desnaturam, liberando heme no citoplasma. A globina é degradada até seus aminoácidos constituin-tes, que são reutilizados para suprir necessidades me-tabólicas gerais.

Figura 21.12 mostra os eventos do catabolismo de heme. Heme é degradado primariamente por um siste-ma de enzimas do retículo endoplasmático em células retículoendoteliais, que requerem oxigênio molecular e NADPH. Heme oxigenase tem dois isômeros; tipo I é induzido por substrato e tipo II é constitutivo. A en-zima catalisa clivagem da ponte α-meteno, que une os dois resíduos pirrólicos contendo substituintes vinil. O carbono α-meteno é convertido, quantitativamente, em monóxido de carbono. Esta é a única fonte endóge-na de monóxido de carbono no homem. Uma fração do monóxido de carbono é liberada pelo trato respi-ratório. Assim, a medida de monóxido de carbono na respiração exalada fornece um índice da quantidade de heme que é degradada em um indivíduo. O oxigênio presente no monóxido de carbono e nos anéis lactâmi-cos recém-derivados é gerado totalmente a partir de oxigênio molecular. A estequiometria da reação requer 3 moles de oxigênio para cada clivagem de anel. Heme oxigenase só usará heme como substrato, com o ferro possivelmente participando no mecanismo de cliva-gem. Assim, protoporfirina IX livre não é substrato. O tetrapirrol linear biliverdina IX é formado por heme oxigenase. Biliverdina IX é reduzida por biliverdina redutase a bilirrubina IX. Descobriu-se que os pro-dutos de ação da heme oxigenase são citoprotetores (ver Corr. Clín. 21.12).

Bilirrubina É Conjugada para Formar Bilirrubina Diglucuronídeo no FígadoBilirrubina é derivada de glóbulos vermelhos senes-centes, mas também do turnover de outras proteínas que contêm heme, como os citocromos. Estudos, com glicina marcada como um precursor, revelaram que uma bilirrubina marcada precocemente, com um pico em 1-3 h, aparece muito rapidamente após uma administração em pulso do precursor marcado. Uma quantidade maior de bilirrubina aparece muito mais tarde, em aproxima-damente 120 dias, refletindo o turnover do heme em

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CAPÍTULO 22 INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS | 829

Fígado

Cérebro

Glicose GlicogênioAmino-ácidos

Sínteseprotéica

Sínteseprotéica

(todos ostecidos)

Piruvato

Lactato

Gordura

Uréia

+ H2OCO2

INTER-RELAÇÕESMETABÓLICASRobert A. Harris e David W. Crabb


22


22.2 CICLO JEJUM-ALIMENTAÇÃO, 830 No estado bem alimentado a dieta supre as ne-

cessidades energéticas, 830 No estado de jejum inicial, glicogenólise hepática

é uma importante fonte de glicose sangüínea, 834

O estado de jejum requer gluconeogênese a partir de aminoácidos e glicerol, 835

No estado de realimentação inicial, glicogênio é formado por uma via indireta, 837

Importantes interações metabólicas interórgãos, 838

Necessidades energéticas, reservas e homeostase calórica, 839

Homeostase da glicose tem cinco fases, 842

22.3 MECANISMOS ENVOLVIDOS NA MUDANÇA DO METABOLISMO HEPÁTICO ENTRE OS ES-TADOS BEM-ALIMENTADO E DE JEJUM, 843

Disponibilidade de substratos controla muitas vias metabólicas, 843

Efetores alostéricos regulam enzimas-chaves, 843 Modificação covalente regula enzimas-chaves,

845 Mudanças nas quantidades de enzimas-chaves

fornecem adaptação de longo prazo, 849

22.4 INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS DE TECIDOS EM VÁRIOS ESTADOS NUTRICIONAIS E HOR-MONAIS 852

Obesidade, 853 Fazendo dieta, 853 Diabetes mellitus tipo 2, 855 Diabetes mellitus tipo 1, 856 Câncer , 858 Exercícios aeróbico e anaeróbico, 858 Gravidez, 860 Lactação, 860 Estresse e trauma, 861 Doença hepática, 862 Doença renal, 863 Álcool, 863 Equilíbrio ácido-base, 864 Cólon, 866

BIBLIOGRAFIA, 866


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 22.1 Obesidade, 831 22.2 Subnutrição Protéica, 832 22.3 Jejum, 833 22.4 Síndrome de Reye, 837 22.5 Coma Hiperglicêmico, Hiperosmolar, 841 22.6 Hiperglicemia e Glicação de Proteínas, 841 22.7 Diabetes Mellitus Tipo 2, 855 22.8 Diabetes Mellitus Tipo 1, 857 22.9 Via do Poliol e Complicações do Diabetes,

857 22.10 Caquexia do Câncer, 858

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CAPÍTULO 22 INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS | 843

corpos cetônicos se acumularam até concentrações suficientemente elevadas para que entrem no cérebro e supram parte de suas necessidades energéticas. Glu-coneogênese renal também se torna significativa nesta fase. Fase V ocorre após jejum muito prolongado de in-divíduos extremamente obesos, e é caracterizada por dependência ainda menor da gluconeogênese. Nesta fase, as necessidades energéticas de quase todos os te-cidos são supridas, em grande parte, por oxidação de ácidos graxos ou de corpos cetônicos.

Enquanto as concentrações de corpos cetônicos es-tiverem elevadas e os níveis de glicose mantidos, prote-ólise será um tanto restrita, talvez por pequenas quan-tidades de insulina ainda produzidas pelo pâncreas, e preservação de proteínas musculares e enzimas ocor-rerá. Isto continua até que praticamente toda a gordura tenha sido consumida, e os níveis de corpos cetônicos caem. Depois que toda a gordura se esgotou, o corpo precisa usar proteína muscular para manter a glicose sangüínea. Antes que ela se acabe, você se acabou (ver Corr. Clín. 22.3).

22.3

| MECANISMOS ENVOL-VIDOS NA MUDANÇA DO METABOLISMO HEPÁTICO ENTRE OS ESTADOS BEM-ALI-MENTADO E DE JEJUM

O fígado de pessoas bem-alimentadas sintetiza ativa-mente glicogênio e triacilglicerol; tal fígado é glicogê-nico, glicolítico e lipogênico. Em contraste, o de uma pessoa em jejum é glicogenolítico, gluconeogênico, ce-togênico e proteolítico. A estratégia empregada é arma-zenar calorias quando alimento está disponível, e mobi-lizá-las quando o resto do corpo estiver precisando. O fígado muda entre estes extremos metabólicos por uma variedade de mecanismos regulatórios: suprimento de substratos, efetores alostéricos, modificação covalente e indução-repressão de enzimas.

Disponibilidade de Substratos Controla Muitas Vias MetabólicasEste mecanismo de controle é freqüentemente ignora-do. Entretanto, a concentração de ácidos graxos no san-gue que entra no fígado é um importante determinante da taxa de cetogênese. Síntese de glicose pelo fígado é afetada pela velocidade com que substratos gluconeogê-nicos fluem para o fígado. Entrega de aminoácidos para o fígado no diabetes, em virtude de proteólise acelerada e descontrolada, estimula gluconeogênese e exacerba hiperglicemia. Por outro lado, incapacidade de suprir o fígado adequadamente com substratos glucogênicos

explica alguns tipos de hipoglicemia, como as obser-vadas durante gravidez ou jejum avançado. Síntese de uréia também é regulada por suprimento de substratos. Metabolismo de aminoácidos no intestino fornece uma fração substancial da amônia usada pelo fígado para produção de uréia. O intestino libera citrulina, como discutido acima, o precursor metabólico de ornitina. Um pool maior de ornitina permite síntese aumentada de uréia após uma refeição rica em proteínas. Na defi-ciência de proteínas, a velocidade de formação de uréia diminui.

Podemos concluir que suprimento de substratos é um importante determinante da velocidade em que operam virtualmente todos os processos metabóli-cos do corpo. Entretanto, variações no suprimento de substratos não são suficientes para explicar as mudan-ças marcantes no metabolismo, que devem ocorrer no ciclo jejum-alimentação. Ajuste mais fino das vias é necessário.

Efetores Alostéricos Regulam Enzimas-ChavesFiguras 22.10 e 22.11 resumem os efeitos de efetores alostéricos no fígado, em estados bem-alimentado e je-jum, respectivamente. Como mostra a Figura 22.10, gli-cose ativa glucoquinase [indiretamente por promover seu deslocamento do núcleo para o citoplasma (p. 590)], promovendo assim fosforilação da glicose. Glicose tam-bém inativa glicogênio fosforilase e ativa glicogênio sin-tase indiretamente, dessa forma impedindo degradação e promovendo síntese de glicogênio. Frutose 2,6-bisfos-fato estimula 6-fosfofruto-1-quinase e inibe frutose 1,6-bisfosfatase, desta forma estimulando glicólise e inibindo gluconeogênese.

Frutose 1,6-bisfosfato ativa piruvato quinase, desta forma estimulando glicólise, e piruvato ativa o comple-xo piruvato desidrogenase [indiretamente, por inibição da piruvato desidrogenase quinase (ver p. 628)]. Citra-to ativa acetil-CoA carboxilase, desta forma esti-mulando síntese de ácidos graxos, e malonil-CoA inibe carnitina palmitoiltransferase I, desta forma inibindo oxidação de ácidos graxos. Como mostra a Figura 22.11, acetil-CoA estimula gluconeogênese em estado de je-jum por ativar piruvato carboxilase e inibir o complexo piruvato desidrogenase [diretamente por estímulo da piruvato desidrogenase quinase (ver p. 531)]. Ésteres de acil-CoA de cadeia longa inibem acetil-CoA carboxi-lase, o que diminui o nível de malonil-CoA e aumenta atividade de carnitina palmitoiltransferase I e oxi-dação de ácidos graxos. Frutose 6-fosfato inibe gluco-quinase [indiretamente por promover seu deslocamen-to do citoplasma para o núcleo (ver p. 590)]. Citrato, que está aumentado em concentração como conseqüência de maior oxidação de ácidos graxos, inibe 6-fosfofruto-1-quinase e 6-fosfofruto-2-quinase (não mostrado); e NADH, produzido pela oxidação de ácidos graxos, inibe o ciclo dos ácidos tricarboxílicos.

BioQ.22 843 22.01.07 18:27:34


22.22). Insulina se opõe a esta ação do glucagon. Vários mecanismos estão envolvidos, mas o mais importante envolve inibição da atividade de fatores de transcrição forkhead que são necessários para a transcrição dos genes contendo elementos de resposta à insulina (IRE) e codificando enzimas gluconeogênicas (Figura 22.21).

Deficiência de energia leva à inibição de síntese de gordura, colesterol e glicose pelas células do fígado. Ati-vação de AMPK por AMP reduz a transcrição de SREBP e inibe sua atividade transcripcional e, portanto, inibe síntese de gordura e de colesterol (Figura 22.21). Ativa-ção de AMPK também inibe a atividade transcripcional de fator nuclear hepático 4α (HNF-4α), que é neces-sário para transcrição de genes que codificam enzimas gluconeogênicas.

Receptor de peroxissomos proliferador-ativa-do α (PPARα), um membro da família de receptores nucleares, é um receptor de ácidos graxos, e é expresso em altos níveis em tecidos que oxidam ácidos graxos (fí-gado, rim e coração). Ácidos graxos poliinsaturados es-timulam o receptor para ativar transcrição de genes en-volvidos em utilização de ácidos graxos (Figura 22.23), que contém um elemento de resposta a prolifera-dor de peroxissomo (PPRE) em seus promotores, incluindo aqueles para enzimas dos sistemas de pero-xissomos, microssomos e mitocôndrias para oxidação de ácidos graxos (FOX), genes de apolipoproteínas necessárias para exportação de triacilgliceróis hepá-ticos como VLDL, e enzimas da cetogênese. No tecido adiposo, a isoforma PPARγ é expressa. Quando ativada (talvez por derivados de ácidos graxos, como prosta-glandinas), orquestra a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, aumentando a capacidade de armazenar triacilglicerol. A atividade de ambas as formas de PPAR é aumentada pelo PPARγ-coativador 1 (PGC-1), que é induzido por cAMP.

Estas mudanças adaptativas também influenciam a eficiência dos mecanismos regulatórios de curto pra-

zo. Por exemplo, no jejum prolongado ou no diabetes não-controlado, mudança na concentração de efetores alostéricos de acetil-CoA carboxilase terá pouco efeito quando a enzima estiver virtualmente ausente, devido à regulação negativa da expressão do seu gene. Uma pes-soa em jejum crônico não pode utilizar eficientemente uma carga de glicose devido à ausência de enzimas-chaves necessárias ao metabolismo de glicose. Isto é a intolerância a glicose do jejum. Uma carga de glicose, entretanto, colocará em ação as adaptações necessárias e o restabelecimento dos mecanismos regulatórios de curto prazo.

22.4

| INTER-RELAÇÕES METABÓLICAS DE TECIDOS EM VÁRIOS ESTADOS NUTRICIONAIS E HORMONAIS

Muitas mudanças que ocorrem nos diferentes estados nutricionais e hormonais são variações do ciclo jejum-alimentação. Alguns exemplos são dados na Figura 22.24. Outros são óbvios – por exemplo, o rápido cres-cimento de uma criança, quando aminoácidos são dire-cionados do catabolismo para síntese de proteínas. As mudanças que ocorrem em algumas situações fisiolo-gicamente importantes, entretanto, são bastante sutis e pouco conhecidas. Por exemplo, no envelhecimento parece haver uma sensibilidade diminuída dos prin-cipais tecidos do corpo a hormônios, com capacidade diminuída dos tecidos de responderem normalmente durante o ciclo jejum-alimentação. Se isso é um fator que contribui ou uma conseqüência do processo de en-velhecimento, não se sabe.

FIGURA 22.23Ativação de PPAR por ácidos graxos promove transcrição de genes de oxidação de ácidos graxos (FOX) e cetogênese.

Ácidos graxos

+

+ + +

Oxidação de ácidos graxos Cetogênese

Mitocôndriagenes FOX

PPREGenes de

cetogênese

PPRE

PPAR�

Peroxissomogenes FOX

PPRE

BioQ.22 852 22.01.07 18:27:50


excesso, de combustíveis provenientes do intestino. De fato, pacientes com diabetes tipo I ficam presos ao es-tado de jejum, sem o benefício da parada geralmente imposta, durante o jejum, pela baixa, mas constante, produção de insulina pelo pâncreas. Isto leva a severo desgaste dos tecidos do corpo e, no final, à morte, a me-nos que insulina seja administrada.

CâncerTumores são compostos de células cancerosas, que precisam se alimentar como todas as células, mas ao contrário da maioria dos tecidos normais, tumores fun-cionam independentemente do ciclo jejum-alimentação (ver Corr. Clín. 22.10). Sua demanda por glicose como fonte de energia e aminoácidos para síntese protéica é incessante. Geralmente, preferem glicose e raramente se adaptam, na fase de jejum do ciclo jejum-alimenta-ção, ao uso de ácidos graxos e corpos cetônicos para minimizar seu uso de glicose, para benefício do resto do corpo. A maioria dos tumores não responde a mudan-ças hormonais que alteram os processos metabólicos em tecidos normais. Estabelecem um ciclo de Cory com o fígado, mas ainda assim podem oxidar completamen-te quantidades substanciais de glicose, contanto que oxigênio esteja disponível (Figura 22.24e). Células do centro de um tumor estão freqüentemente em hipóxia porque cânceres muitas vezes ultrapassam o desenvol-vimento de vasos sangüíneos, que trazem oxigênio. Fal-ta de oxigênio em qualquer célula, normal ou cancero-sa, leva a um aumento em fator 1 hipóxia induzidoα (HIF-1α), um fator de transcrição excepcionalmente potente para ativação de genes que codificam trans-portadores de glicose e as enzimas da glicólise. HIF-1α também se torna constitutivamente ativo em algumas células cancerosas devido a mutações que ativam certos oncogenes. Como uma conseqüência da ação de HIF-1α, a maioria dos tumores de câncer tem excepcional capa-cidade de gerar ATP por glicólise. Glicólise não é um processo eficiente, em comparação com oxidação com-pleta de glicose, mas utilização eficiente dos recursos do corpo não é característica de um câncer. Capacidade excepcional de gerar ATP por glicólise permite às célu-las cancerosas sobreviverem e crescerem enquanto se espalham e dão metástases em regiões de baixa tensão de oxigênio.

Exercícios Aeróbico e AnaeróbicoExercício aeróbico é exemplificado por corrida de longa distância, exercício anaeróbico por corrida de velocida-de ou levantamento de peso. Durante exercício anaeró-bico, existe pouca cooperação interórgãos.

Os vasos sangüíneos do interior dos músculos são comprimidos durante o pico de contração, de modo que suas células ficam isoladas do resto do corpo e depen-dem muito de seu próprio glicogênio e fosfocreatina. Fosfocreatina é uma fonte de fosfato de alta energia

para síntese de ATP (Figura 22.6), até que glicogenó-lise e glicólise sejam estimuladas. Por falta de oxigê-nio, glicólise torna-se a fonte primária de ATP. Durante


Caquexia do Câncer

Perda de peso sem explicação pode ser um sinal de malignidade, e perda de peso é comum no cân-cer avançado. Isto não é completamente explica-do por perda de apetite e diminuição na ingestão de alimentos. A perda de peso deve-se principal-mente a músculo esquelético e tecido adiposo, sendo relativamente poupadas as proteínas vis-cerais (i.é, fígado, rim e coração). Embora tumo-res comumente apresentem velocidades altas de glicólise, a necessidade energética do tumor pro-vavelmente não explica a perda de peso, uma vez que pode ocorrer mesmo com tumores peque-nos. Anomalias endócrinas foram identificadas em pacientes com câncer. Os pacientes tendem a ser resistentes à insulina, têm níveis elevados de cortisol, e têm alta taxa de metabolismo basal. Alguns tumores sintetizam e secretam peptídeos biologicamente ativos como ACTH, fator de cres-cimento neural, e fator de crescimento tipo-insu-lina, que podem modificar o metabolismo ener-gético. A resposta do hospedeiro a um tumor, por analogia com infecção crônica, inclui liberação de interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral α (TNF-α) por células imunes. TNF-α é também chamado caquexina, porque produz depauperamento. TNF-α e IL-1 podem atuar de modo parácrino, uma vez que seus níveis plasmáticos não ficam elevados. Es-tas citocinas estimulam febre, proteólise, lipólise e secreção de reagentes de fase aguda pelo fíga-do. Estudos mais recentes identificaram o fator indutor de proteólise (PIF) e o fator mobilizador de lipídeo (LMF) como produtos de tumores que estimulam catabolismo de proteína esquelética e consumo do tecido adiposo, respectivamente.

Fonte: Beutler, B. e Cerami, A. Tumor necrosis, ca-chexia, shock, and inflammation: a common mediator. Annu. Rev. Biochem. 57:1505, 1988. Tracey, K. J. e Ce-rami, A. Tumor necrosis factor: A pleitropic cytokine and therapeutic target. Annu. Rev. Med. 45:491, 1994. Nitenberg, G. e Raynard, B. Nutritional support of the cancer patients: issues and dilemmas. Crit. Rev. On-col. Hematol. 34:137, 2000. Tisdale, M. J. Cancer ano-rexia and cachexia. Nutrition 17:438, 2001. Wray, C. J., Mammen, J. M. e Hasselgren, P. O. Catabolic response to stress and potential benefits of nutrition support. Nutrition 18:971, 2002.

BioQ.22 858 22.01.07 18:27:58

870 | PARTE 5 PROCESSOS FISIOLÓGICOS

1

2cAMP

PKA

ACTH

Proteína G

AC

R

ATP

PKAi

BIOQUÍMICADE HORMÔNIOSThomas J. Schmidt e Gerald Litwack

PARTE 5 PROCESSOS FISIOLÓGICOS

23


23.2 HORMÔNIOS E O SISTEMA DE CASCATA HORMONAL, 872

Sistema de cascata amplifica sinais específicos, 872

Principais hormônios polipeptídicos e suas ações, 874

Hormônios polipeptídicos e pituitária anterior, 874

23.3 SÍNTESE DE HORMÔNIOS POLIPEPTÍDICOS E HORMÔNIOS DERIVADOS DE AMINOÁCIDOS, 875

Hormônios polipeptídicos: codificação gênica, 875 Pró-opiomelanocortina é precursor de oito

hormônios, 875 Genes de hormônios polipeptídicos podem

codificar peptídeos adicionais, 880 Um gene pode codificar múltiplas cópias

de um hormônio, 881 Hormônios derivados de aminoácidos, 882 Epinefrina é sintetizada a partir de tirosina,

882 Síntese de hormônio da tireóide requer incor-

poração de iodo em tirosinas da tireoglo- bulina, 883

Inativação e degradação de hormônios derivados de aminoácidos, 883

23.4 PROTEÍNAS DE SINALIZAÇÃO HORMONAL, 883

Visão geral da sinalização, 883 Receptores de membrana, 883 Cascata de sinalização intracelular: se-

gundos mensageiros, 885

Sistemas hormonai s cíclicos, 887 Síntese de melatonina e serotonina é con-

trolada por ciclos claro/escuro, 887 Ciclo ovariano é controlado por secreção pulsátil

e cíclica de hormônio liberador de gonadotropina, 888

Ausência de fertilização, 888 Fertilização, 889

23.5 RECEPTORES DE HORMÔNIOS DE MEMBRA-NA, 891

Algumas interações hormônio-receptor envolvem múltiplas subunidades hormonais, 891

Receptor β-adrenérgico, 892 Internalização de receptores, 893 Clatrina direciona internalização de

complexos hormônio-receptor da membrana plasmática, 894

23.6 CASCATA HORMONAL INTRACELULAR: PRO-TEÍNAS QUINASES, 894

Receptor de insulina: transdução por tirosina quinase, 895

Atividade de vasopressina: proteína quinase A, 897

Hormônio liberador de gonadotropina (GnRH): proteína quinase C, 898

Atividade do fator natriurético atrial (ANF): proteína quinase G, 900

23.7 HORMÔNIOS ESTERÓIDES, 902 Estruturas e funções de hormônios esteróides,

902 Biossíntese de hormônios esteróides, 902 Metabolismo de hormônios esteróides, 905 Regulação da síntese de hormônios esteróides, 907

BioQ.23 870 22.01.07 18:32:35

CAPÍTULO 23 BIOQUÍMICA DE HORMÔNIOS | 875

dia), prolactina (PRL), hormônio folículo-estimulante (FSH) e hormônio luteinizante (LH). Todos são cadeias polipeptídicas únicas, exceto TSH, FSH e LH, que são dímeros que compartilham uma subunidade α seme-lhante ou idêntica. Como o lóbulo intermediário no ho-mem é rudimentar, os níveis circulantes de α e β-MSH livres são relativamente baixos. É de interesse, parti-cularmente no homem, o fato dos receptores de MSH reconhecerem e serem ativados por ACTH, já que os 13 primeiros aminoácidos do ACTH contêm a seqüên-cia do α-MSH. Por esta razão, ACTH pode ser um fator contribuinte importante para a pigmentação da pele e pode exceder a importância de MSH, especialmente em condições em que o nível circulante de ACTH é alto. As conseqüências clínicas do hipopituitarismo são apre-sentadas na Correlação Clínica 23.2.

23.3 | SÍNTESE DE HORMÔ-NIOS POLIPEPTÍDICOS E HORMÔNIOS DERI-VADOS DE AMINOÁCI-DOS

Hormônios Polipeptídicos: Codificação GênicaGenes de hormônios polipeptídicos contêm a seqüência codificadora do hormônio e os elementos de controles a montante (upstream) do gene estrutural. Em alguns casos, mais de um hormônio é codificado em um gene. Por exemplo, pró-opiomelanocortina gera pelo menos oito hormônios a partir de um único produto gênico. Ocitocina e vasopressina são codificados por genes se-parados, juntamente com suas respectivas proteínas neurofisinas. Neurofisinas são co-secretadas com seus respectivos hormônios, mas não têm ação endó-crina conhecida.

Pró-opiomelanocortina É Precursor de Oito Hormônios

Pró-opiomelanocortina é um precursor de hormônios para os seguintes hormônios: ACTH, β-lipotropina, γ-li-potropina, γ-MSH, α-MSH, CLIP, β-endorfina e poten-cialmente β-MSH e encefalinas (Figura 23.5). Nem to-dos estes produtos são expressos simultaneamente em um único tipo celular, mas são produzidos em células separadas com base em seu conteúdo de proteases es-pecíficas necessárias, controles metabólicos específicos e a presença de reguladores. Assim, enquanto pró-opio-melacortina é expressa em corticotropos da pituitária anterior e em células da pars intermedia, o estímulo e os produtos são diferentes (Tabela 23.3). Pars inter-media é uma estrutura anatômica discreta, localizada


Testando a Atividade da Pituitária Anterior

Hormônios liberadores e análogos químicos, par-ticularmente dos peptídeos menores, são hoje sintetizados rotineiramente. O hormônio libe-rador de gonadotropina, um decapeptídeo, está disponível para uso na avaliação da função da pituitária anterior. Isto é de importância quan-do uma situação de doença puder envolver o hi-potálamo, a pituitária anterior ou o órgão final. Esterilidade é um exemplo de tal situação. O que precisa ser avaliado é qual o órgão defeituoso na cascata hormonal. Isto pode ser conseguido por injeção do hormônio da pituitária anterior LH ou FSH. Se a secreção de hormônio sexual foi de-sencadeada, então a glândula final parece estar funcionando adequadamente. A seguir, a pituitá-ria anterior deveria ser analisada. Isto pode ser feito por administração i.v. de GnRH sintético; por esta via, GnRH pode chegar às células gona-dotrópicas da pituitária anterior e desencadear secreção de LH e FSH. Rotineiramente, os níveis de LH são medidos no sangue como uma função do tempo após a injeção. Estes níveis são medi-dos por radioimunoensaio (RIA), no qual LH ou hCG é deslocado da ligação com uma proteína de ligação ao LH na amostra de soro. A extensão da competição é proporcional à quantidade de LH no soro. Deste modo, uma progressão da respos-ta é medida e estará dentro dos limites normais ou claramente deficientes. Se a resposta for de-ficiente, as células da pituitária anterior não es-tão funcionando normalmente e são a causa da síndrome. Por outro lado, resposta normal da pi-tuitária a GnRH indicaria que o hipotálamo não está funcional. Tal descoberta sugeriria exame do hipotálamo, quanto a condições que levam à disponibilidade/produção insuficiente de hormô-nios liberadores. Obviamente, o conhecimento da estrutura do hormônio e a capacidade de sinteti-zar hormônios específicos permite o diagnóstico destas doenças.

Fonte: Marshall, J. C. e Barkan, A. L. Disorders of the hypothalamus and anterior pituitary. Em: W. N. Kelley (Ed.), Internal Medicine. New York: Lippincott, 1989, p. 2159. Conn, P. M. The molecular basis of gonadotro-pin-releasing hormone action. Endocr. Rev. 7: 3, 1986.

BioQ.23 875 22.01.07 18:32:42

CAPÍTULO 23 BIOQUÍMICA DE HORMÔNIOS | 897

tas seqüências de aminoácidos em torno de um resíduo de fosfotirosina. Várias vias diferentes são ativadas, e estas incluem ativação de PI3 quinase (fosfatidilinositol 3´-OH quinase), Ras (proteína pequena que liga GTP), a cascata da MAP quinase (proteína quinase ativada por mitose) e TC10 (proteína pequena que liga GTP). Uma vez ativada por troca de GTP por GDP, TC10 promove translocação de vesículas de GLUT4 para a membrana plasmática, talvez por estabilização de filamentos de actina corticais. Estas vias atuam de modo orquestra-do para coordenar a regulação do tráfego de vesículas [incorporação de transportador 4 de glicose (GLUT4) à membrana plasmática], síntese de proteínas, ativação e inativação de enzimas e expressão gênica. O resultado final destas diversas vias é regulação do metabolismo de glicose, lipídeos e proteínas, bem como crescimento e diferenciação celular. A importância da atividade da quinase do receptor de insulina e da via geral de trans-dução de sinal da insulina é enfatizada na Correlação Clínica 23.3.

Atividade de Vasopressina: Proteína Quinase AArginina angiotensina (AVP), ou hormônio antidiu-rético, causa reabsorção de água aumentada da urina no rim distal. Um mecanismo para este sistema é apre-sentado na Figura 23.30. Neurônios que sintetizam AVP (neurônios vasopressinérgicos) liberam AVP em res-posta a estímulos de barorreceptores que respondem a uma queda na pressão do sangue ou de osmorrecep-tores que respondem a um aumento na concentração extracelular de sal. VP liga-se a seu receptor de mem-brana cognato no rim distal, na pituitária anterior, em hepatócitos e, talvez, em outros tipos celulares, No rim, a ligação de AVP a seu receptor acoplado a proteína G estimula a atividade de adenilato ciclase e ativa proteí-na quinase A, que fosforila subunidades que se agregam para formar canais aquosos específicos, ou aquapori-nas (ver p. 459).

Água atravessa a célula do rim para o lado basolate-ral e depois entra na circulação geral, onde dilui a con-centração de sal. Mutações específicas nas seqüências

Durante a gravidez, uma importante adaptação me-tabólica materna é uma redução na sensibilidade à insulina. Esta adaptação ajuda a fornecer glicose adequadamente para o feto em desenvolvimento. Entretanto, em 3-5% das mulheres grávidas, de-senvolve-se intolerância a glicose. Diabetes mellitus gestacional (GDM) é caracterizada por um decrés-cimo adicional na sensibilidade a insulina e uma in-capacidade de compensar com secreção aumentada de insulina. Embora ambos resistência à insulina induzida pela gravidez e GDM sejam geralmente re-versíveis após a gravidez, aproximadamente 30-50% das mulheres com história de GDM desenvolvem diabetes tipo 2 mais tarde na vida, especialmente se forem obesas. Embora os mecanismos celulares responsáveis pela resistência à insulina em GDM não sejam totalmente conhecidos, a resistência ao transporte de glicose mediado por insulina pare-ce ser maior em músculo esquelético de indivíduos com GDM do que em mulheres grávidas que não têm

GDM. Dados recentes indicam que defeitos na ação da insulina, e não diminuição na afinidade da insuli-na pelo receptor, podem contribuir para a patogêne-se de GDM. Mais especificamente, células de múscu-lo esquelético de sujeitos com GDM aparentemente expressam excesso de glicoproteína-1 de membrana plasmática (PC-1), que se verificou inibir a atividade de tirosina quinase do receptor de insulina, por inte-ragir diretamente com as subunidades α e bloquear a mudança conformacional induzida por insulina. Além disso, excessiva fosforilação de resíduos de se-rina/treonina localizados nos receptores de insulina do músculo parece regular negativamente (down-regulate) a atividade de tirosina quinase em GDM. Assim, uma superexpressão de PC-1 e um decrés-cimo na atividade quinase do receptor, acoplados com expressão e fosforilação (resíduos de tirosina) diminuídas do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1; ver Figura 20.29), podem estar por trás da resistência à insulina em GDM.

Fonte: Shao, J., Catalono, P. M., Hiroshi, Y., Ruyter, I., Smith, S., Youngreen, J. e Friedman, J. E. Decreased insulin receptor tyrosine kinase activity and plasma cell membrane glycoprotein-1 overexpression in skeletal muscle from obese women with gestational diabetes mellitus (GDM). Diabetes 49(4): 603, 2000. Maddux, B. A. e Goldfine, I. D. Membrane glycoprotein PC-1 inhibition of insulin receptor function occurs via direct interaction with the receptor alpha-subunit. Diabetes 49(1): 13, 2000.


Atividade Reduzida do Receptor de Insulina Quinase no Diabetes Mellitus Gestacional

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Transporte de Hormônios Esteróides: Proteínas de LigaçãoQuatro proteínas plasmáticas principais respondem pela ligação dos hormônios esteróides no sangue. Elas são globulina de ligação a corticoesteróides, proteína de ligação a hormônios sexuais, proteína de ligação a andrógenos e albumina. A maior parte do cortisol cir-culante (75-80%) ocorre ligado a uma α2-globulina de ligação a corticosteróide (CBG) específica, também conhecida como transcortina. Cada molécula desta glicoproteína liga uma única molécula de cortisol, com Ka de 2,4 107 M-1. A concentração normal de transcor-tina no plasma é 3 mg/dl, e sua capacidade de ligação é 20 μg de cortisol/dl. Cerca de 15% do cortisol do plas-ma ocorre ligado a albumina, com uma afinidade muito mais baixa (Ka = 103 M-1). Portanto, embora albumina esteja presente em concentração 1.000 vezes superior à de CBG, cortisol vai preencher primeiro os sítios de ligação em CBG. A concentração de transcortina, e por-tanto de cortisol, está aumentada durante a gravidez e administração de estrógeno. Durante o estresse, quan-do os níveis de cortisol são altos, os sítios de ligação de CBG estarão saturados, e o excesso de cortisol se ligará a albumina. Apenas 5-10% do cortisol plasmático está normalmente livre (não-ligado). Cortisol livre difunde-se através da membrana plasmática, liga-se aos recep-tores intracelulares de cortisol, e medeia uma resposta biológica. Em contraste com cortisol, apenas 50-70% da aldosterona circulante fica ligada com baixa afinidade a albumina e transcortina. Portanto, aldosterona tem uma meia-vida mais curta no plasma (20 minutos) em comparação com cortisol (70 minutos).

Globulina de ligação a hormônios sexuais (SHBG) liga andrógenos com uma constante de afini-dade de cerca de 109 M-1. Cerca de 65% da testostero-na são ligados a esta glicoproteína derivada do fígado. Apenas 1-2% da testosterona circulante está na forma livre, e o andrógeno restante está ligado a albumina e a outras proteínas. As frações ligadas a SHBG servem, portanto, como reservatórios circulantes de testoste-rona. Cerca de 60% dos estrógenos são transportados ligados a SHBG, 20% são ligados a albumina , e 20% na forma livre. Entretanto, estradiol liga-se a SHBG com uma afinidade muito mais baixa do que testosterona. Assim, estradiol ligado a SHBG dissocia-se muito rapi-damente e é captado pelos tecidos alvos. Por esta ra-zão, mudanças nos níveis de SHBG no homem podem alterar a razão de andrógenos para estrógenos livres. A concentração plasmática de SHBG antes da puberdade é aproximadamente a mesma em homens e mulheres. Entretanto, na puberdade, há um pequeno decréscimo em mulheres e um decréscimo maior em homens, ga-rantindo uma quantidade relativamente maior de tes-tosterona circulante não-ligada em homens. Homens adultos têm cerca da metade da SHBG circulante de mulheres, de modo que testosterona livre é cerca de 20 vezes mais alta em homens do que em mulheres. Além

disso, a concentração total (ligada mais não-ligada) de testosterona é cerca de 40 vezes maior em homens. A própria testosterona reduz os níveis de SHBG (au-menta a porcentagem de testosterona livre) no sangue, enquanto 17β-estradiol e hormônio da tireóide elevam os níveis de SHBG no sangue. Durante a gravidez e no hipertireoidismo, as porcentagens de testosterona e de 17β-estradiol não-ligados estariam reduzidas.

Proteína de ligação a andrógeno (ABP) é produ-zida pelas células de Sertoli em resposta a testosterona e FSH, que estimulam síntese de proteínas nessas cé-lulas. ABP é também chamada globulina de ligação a testosterona-estrógeno (TeBG). Esta proteína é semelhante a SHBG, exceto que se localiza no testículo e ajuda a manter níveis locais elevados de andrógeno no testículo e no líquido seminal. Estes níveis locais de an-drógeno elevados são importantes no desenvolvimento e maturação dos espermatozóides. Progesterona liga-se fracamente a transcortina e albumina, e sua meia-vida circulante é apenas cerca de 5 minutos.

23.8 | RECEPTORES DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES

Hormônios Esteróides Ligam-se a Proteínas Receptores IntracelularesReceptores de hormônios esteróides e receptores de não-esteróides (i. é, hormônio da tireóide, ácido retinói-co, vitamina D3) localizam-se intracelularmente. O re-ceptor de glucocorticóide não-ligado e, possivelmente, o receptor de aldosterona parecem residir no citoplas-ma, enquanto os outros receptores não-ligados locali-zam-se dentro do núcleo, provavelmente em associação com a cromatina. Na Figura 23.48, a Etapa 1 mostra um hormônio esteróide se dissociando de uma proteína plasmática transportadora. O esteróide livre entra na célula por difusão, através da bicamada lipídica (Etapa 2). Cortisol liga-se a seu receptor com uma constante de afinidade de 109 M-1, comparada a uma constante de afinidade de cerca de 107 M-1 para CBG. O receptor não-ligado (neste caso, receptor de glucocorticóide) é um complexo (~300 kDa) que contém outras proteínas associadas, incluindo um dímero de uma proteína de choque térmico 90 kDa, que mascara o domínio de li-gação ao DNA do receptor (Figura 23.49), e outra prote-ína de choque térmico designada por Hsp56, que é uma imunofilina que liga várias drogas imunossupressoras. Ligação do ligante esteróide (Etapa 3) causa uma mu-dança conformacional, chamada “ativação”, da própria proteína do receptor, resultando em liberação das prote-ínas associadas, incluindo o dímero Hsp90, e exposição dos resíduos de aminoácidos carregados positivamente localizados no domínio de ligação ao DNA (Etapa 4).

BioQ.23 914 22.01.07 18:34:18

CAPÍTULO 24 BIOLOGIA MOLECULAR DAS CÉLULAS | 925

��

BIOLOGIA MOLECULARDAS CÉLULASThomas E. Smith


24


24.2 TECIDO NERVOSO: METABOLISMO E FUN-ÇÃO, 926

ATP e potencial elétrico transmembrânico em neurônios, 928

Interação neurônio-neurônio ocorre por meio de sinapses, 929

Síntese, armazenamento e liberação de neurotransmissores, 930

Terminação de sinais em junções sinápticas, 934 Acetilcolina, 934 Catecolaminas, 935 5-Hidroxitriptamina (serotonina), 936 γ-Aminobutirato (GABA), 936 Neuropeptídeos são derivados de proteínas pre-

cursoras, 937

24.3 OLHO: METABOLISMO E VISÃO, 938 Córnea deriva ATP de metabolismo aeróbico, 938 Cristalino consiste principalmente de água e

proteína, 939 Retina deriva ATP de glicólise anaeróbica, 941 Transdução visual envolve eventos fotoquímicos,

bioquímicos e elétricos, 941 Bastonetes e cones são células fotorreceptoras, 943 Visão de cores origina-se nos cones, 951 Visão de cores é tricromática, 951 Outras diferenças entre bastonetes e cones, 952

24.4 MOTORES MOLECULARES E PROTEÍNAS AS-SOCIADAS, 952

Contração muscular, 953 Contração do músculo esquelético, 953 Organização estrutural dos componentes do

músculo esquelético, 953

Estrutura e caracterização de algumas proteínas envolvidas nos processos contráteis, 956

Miosina forma filamentos grossos do múscu- lo, 956

Actina, tropomiosina e troponina são proteí- nas de filamentos finos, 957

Contração muscular requer Ca2+, 961 Reservatórios de energia para contração muscu-

lar, 961 Modelo de contração do músculo esquelético: o

golpe de força, 963 Cálcio Regula a Contração do Músculo Liso, 963 Envolvimento de óxido nítrico e monóxido de

carbono na contração muscular, 964 Outras classes de miosinas e motores molecula-

res, 965 Miosinas não-convencionais e suas funções,

965 Cinesinas, 966 Dineína, 967

24.5 MECANISMO DA COAGULAÇÃO DO SANGUE, 967

Processos bioquímicos da hemostasia, 967 Fase pró-coagulante da hemostasia (fase 1),

969 Via extrínseca e início da coagulação, 969 Formação de trombina, 970 Reações da via intrínseca, 970 Algumas propriedades das proteínas envolvi-

das na formação do coágulo, 971 Formação da rolha de plaquetas, 975 Fase anticoagulante da hemostasia (fase 2), 975 Inibição da via extrínseca, 975 Inativação de FVa e FVIIIa, 978

BioQ.24 925 22.01.07 19:35:10


Cinesinas e miosinas, proteínas motores molecula-res (ver p. 966), facilitam este processo de transporte.

Neuropeptídeos são mediadores de respostas senso-riais e emocionais, tais como as associadas com fome, sede, sexo, prazer, dor e assim por diante. Incluídas nes-ta categoria estão encefalinas, endorfinas e substân-cia P. Substância P é um neurotransmissor excitatório que desempenha um papel na percepção de dor. Está em uma classe de neuropeptídeos chamados neuroci-ninas. Seu receptor, NK-1 (ou neurocinina-1), é uma proteína tipo-G consistindo de sete elementos de héli-ces transmembrânicas. Endorfinas e opióides ligam-se a receptores que também têm sete elementos de hélices transmembrânicas. Endorfinas desempenham papéis na eliminação da sensação de dor. Alguns dos peptí-deos encontrados no tecido cerebral são apresentados na Tabela 24.3. Note que Met-encefalina é derivada da região N-terminal da β-endorfina. Os aminoácidos da extremidade N-terminal ou de ambas as extremidades N- e C-terminal de muitos neuropeptídeos transmisso-res são modificados.

24.3 | OLHO: METABOLISMO E VISÃO

O olho, nossa janela para o mundo exterior, nos permite ver as belezas da natureza, as belezas da vida e, consi-derando o conteúdo deste livro, as belezas da bioquími-ca. Uma vista através de qualquer janela ou de qualquer lente de câmera é mais clara quando não obstruída. O olho evoluiu de tal modo que um objetivo semelhante foi alcançado. É composto de tecidos vivos que reque-

rem nutrição contínua obtida pelo uso de metabólicas convencionais apropriadas a suas necessidades espe-cíficas. Estruturas pigmentadas, como citocromos e mitocôndrias, ou não estão presentes em algumas es-truturas ou estão arranjadas e distribuídas de modo a não interferirem com o processo visual. Além disso, o cérebro desenvolveu um sistema de filtro enormemente eficiente que torna objetos dentro do olho invisíveis, os quais poderiam levar a distorção visual. Um diagrama esquemático de um corte transversal do olho é apresen-tado na Figura 24.16.

A luz que entra no olho passa progressivamente por (a) a córnea, a câmara anterior que contém humor aquoso, (b) o cristalino, e (c) o corpo vítreo, que con-tém humor vítreo; finalmente focaliza na retina, que contém o aparelho sensor visual. Lágrimas banham o exterior da córnea, enquanto o interior é banhado pelo humor aquoso, um fluido isosmótico contendo sais, al-bumina, globulina, glicose e outros constituintes.

O humor aquoso traz nutrientes para a córnea e para o cristalino, e remove produtos finais do metabolismo deles. O humor vítreo é uma massa gelatinosa que ajuda a manter a forma do olho, enquanto o mantém um tanto flexível.

Córnea Deriva ATP de Metabolismo AeróbicoO olho é uma extensão do sistema nervoso e, como ou-tros tecidos do sistema nervoso central, seu principal combustível metabólico é glicose. A córnea não é um tecido homogêneo e obtém uma porcentagem relativa-mente alta do seu ATP de metabolismo aeróbico. Cer-

TABELA 24.3 Peptídeos Encontrados no Tecido Cerebrala

Peptídeo Estrutura

β-Endorfina Y G G F M T S E K S Q T P L V T L F K N A I I K N A Y K K G E

Met-encefalina Y G G F M

Leu-encefalina Y G G F L

Somatostatina A G C K N F F W | | C S T F T K

Hormônio liberador de hormônio luteinizante p-E H W S Y G L R P G NH2

Hormônio liberador de tirotropina p-E H P-NH2

Substância P R P K P E E F F G L M-NH2

Neurotensina p-E L Y E N K P R R P Y I L

Angiotensina I D R V Y I H P F H L

Angiotensina II D R V Y I H P F

Peptídeo intestinal vasoativo H S D A V F T D N Y T R L R K E M A V K K Y L N S I L N-NH2

a Peptídeos com “p” precedendo a estrutura indicam que o N-terminal é piroglutamato. Aqueles com NH2 na extremidade indicam que o C-terminal é uma amida.

BioQ.24 938 22.01.07 19:35:53


Estrutura e Caracterização de Algumas Proteínas Envolvidas nos Processos Contráteis

Miosina Forma Filamentos Grossos do Músculo

Miosina, uma molécula fibrosa longa com duas cabe-ças globulares em uma extremidade, consiste de duas cadeias pesadas de cerca de 230 kDa cada. Ligada perto de cada grupo de cabeça está um par não-semelhante de cadeias leves, cada uma das quais com aproxima-damente 20 kDa. As cadeias leves são proteínas “tipo-calmodulina” e estão envolvidas em vários aspectos da regulação do processo, sendo que nem todos foram de-finidos com clareza. Elas ligam motivos IQ em miosinas, que estão localizados próximos dos grupos de cabeça e têm a seqüência consenso IQXXXRGXXXR.

A extremidade carboxila de cada cadeia de miosi-na localiza-se na região da cauda, onde as duas cadeias pesadas são enroladas uma na outra, num arranjo es-piral-espiral (Figura 24.29m). Tripsina cliva a cauda em cerca de um terço do seu comprimento a partir da cabeça para produzir meromiosina pesada (o grupo da cabeça e uma cauda curta) e meromiosina leve (o restante da região da cauda). Só a meromiosina leve pode agregar em condições fisiológicas in vitro, suge-rindo que agregação seja um dos seus papéis na forma-ção da cadeia pesada in vivo. A região da cabeça pode ser clivada do restante da região de cauda por papaí-na (Figura 24.29n), resultando em um fragmento do grupo de cabeça chamado Subfragmento 1 ou S-1. A ação destas proteases também demonstra que a molé-cula tem pelo menos duas regiões de articulação, perto da junção cabeça-cauda.

Análise de cDNAs de miosinas de muitas espécies diferentes e tipos diferentes de músculos indicam que existe um grau muito alto de homologia entre miosinas de diferentes fontes, particularmente na re-gião da cabeça. Existe um pouco menos de homologia de seqüência na região da cauda, mas homologia fun-cional existe em um grau extraordinariamente alto, independentemente do comprimento, que vai de cer-ca de 86 a cerca de 150 nm para espécies diferentes. A cabeça da miosina contém quase metade (cerca de 839 a cerca de 850) dos resíduos de aminoácidos da molécula inteira, em mamíferos (ver Corr. Clín. 24.7). Miosina forma um agregado simétrico cauda-cau-da em torno da linha M da zona H dos sarcômeros. Regiões de cauda são alinhadas de modo paralelo em ambos os lados da linha M, com os grupos de cabeça apontando para a linha Z. Cada filamento grosso con-tém cerca de 400 moléculas de miosina. A proteína C (Tabela 24.7) está envolvida em sua montagem. A proteína M também está envolvida, presumivelmen-te, na manutenção das regiões de cauda juntas e em sua ancoragem na linha M.

A cabeça da miosina contém atividade de ATPase, que fornece energia para contração, e sítios de ligação de actina. O fragmento S-1 também contém sítios de ligação para a cadeia leve essencial e a cadeia leve regulatória que se liga nos motivos IQ, como mencio-nado anteriormente. Um modelo da estrutura tridimen-sional do fragmento S-1 da miosina é apresentado na Figura 24.31. A região de ligação à actina localiza-se no canto inferior direito, na região da fenda visível.

O fragmento S-1 tem várias regiões estruturais tipo-domínio com massas de 25, 50 e 20 kDa, coloridos em verde, vermelho e azul, respectivamente. A cadeia leve essencial (ELC) e a cadeia leve regulatória (RLC) são mostradas em amarelo e lilás, respectivamente (ver Corr. Clín. 24.8).

O sítio de ligação ao ATP, logo acima da fenda visível, também é uma fenda aberta de cerca de 13 Å de profun-didade e 13 Å de largura. É separada do sítio de ligação


Glicação e Estrutura e Função de Miosina

Hiperglicemia prolongada afeta a função de mui-tos sistemas. Glicose pode formar bases de Schiff com amino grupos livres em proteínas e alterar sua função. Experimentos in vitro usando es-pectroscopia de massa demonstram que miosina também poderia ser glicada. A importância desta observação em envelhecimento e diabetes ainda não foi determinada.

Fonte: Ramamurthy, B., Hook, P., Jones, A. D. e Larsson, L. Changes in myosin structure and function in response to glycation. FASEB J. 15:2415, 2001.

FIGURA 24.31Um modelo de preenchimento de espaço dos resíduos de aminoácidos no fragmento S-1 da miosina. Os domínios de 25, 50 e 20 kDa da cadeia pesada são cinza-escuro, cinza e cinza quase preto, respectivamente. As cadeias leves essencial e regulatória são cinza-claro e cinza-médio, respectivamente.Reimpresso com permissão de Rayment, I., Rypniewski, W. R., Schmidt-Base, K., Smith, R., et al. Science 261:50, 1993. Direitos autorais (1993) AAAS.

BioQ.24 956 22.01.07 19:36:31

CAPÍTULO 24 BIOLOGIA MOLECULAR DAS CÉLULAS | 967

Cinesina-13 também é uma cinesina cromossômica e está provavelmente envolvida no movimento mitótico dos cromossomos.

Cinesina-14 está entre os motores de extremidade-menos como a cinesina mitótica Ncd em Drosophila, que funciona nos estágios iniciais da mitose. Localiza-se nos fusos de oócitos.

Cinesinas-1 e -2 estão mais relacionadas com o ma-terial discutido neste capítulo, embora as outras este-jam associadas com aspectos mais gerais da divisão ce-lular e do movimento associado de vários componentes associados com este processo.

Dineína

Existem duas classes de motores dineínas: (a) axonê-mica, que funciona na realização do movimento de fla-gelos e cílios, e (b) citoplasmática, que efetua a distri-buição e a organização de estruturas citoplasmáticas. Estas funções incluem seleção e movimento de prote-ínas; organização dos cromossomos durante vários es-tágios de sua função; distribuição e/ou redistribuição de organelas como endossomos, lisossomos e outros; e transporte axonal retrógrado – isto é, transporte de carga na direção oposta à da maioria das cinesinas.

A estrutura da dineína é muito mais complexa do que as das outras duas classes de motores. Dineína tem uma estrutura em anel plano de seis membros que tem, no total, aproximadamente 10 vezes a massa molecular das cinesinas. Uma representação esquemática de sua estrutura é mostrada na Figura 24.39.

ATP liga com um motivo AAA no domínio 1. Sua liga-ção e hidrólise induz mudanças conformacionais que são transmitidas pelos domínios 2-4 para a haste que intera-ge com microtúbulos e causa movimentos de passos de 24-32 nm para uma dineína descarregada. O movimento de dineína responde à carga de modo parecido com mu-dança para marcha mais lenta e, com carga pesada, dá passos de aproximadamente 8 nm. Essa mudança pare-ce estar associada com mudanças conformacionais em vários de seus outros domínios e com a disponibilidade de ATP. Em condições de carga pesada, ATP também pa-rece ligar motivos AAA no domínio 3. Motivos AAA são regiões conservadas de 220-230 resíduos de aminoácidos que existem em uma família de proteínas que participam em várias atividades celulares diferentes, que dependem de energia de hidrólise de ATP para afetar suas fun-ções, que podem incluir proteólise, dobramento e des-dobramento de proteínas, metabolismo de íon de metal, e outras atividades, além das associadas com dineína. O nome do motivo AAA refere-se a “ATPase Associada com diversas Atividades celulares”.

Note que (1) dineínas como motores são estrutural-mente mais complexas do que miosinas ou cinesinas, (2) estão geralmente envolvidas em movimento retrógrado de material celular, (3) estão envolvidas em vários outros aspectos de organização estrutural, e (4) seu movimento de passo ao longo dos microtúbulos é carga-dependente.

FIGURA 24.39Dineína funciona como uma molécula motora. Redesenhado de Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J. e Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature 427:649, 2004.

24.5 | MECANISMO DA COAGULAÇÃO DO SANGUE

A circulação do sangue ocorre em um tipo muito es-pecializado de sistema fechado no qual o volume do lí-quido circulante é mantido quase constante. Múltiplas funções do sistema tornam a transferência de solutos através de seus limites uma função necessária. Como em qualquer sistema de canos e tubos, vazamentos po-dem ocorrer como resultado de vários tipos de agres-sões e devem ser reparados para manter um estado de hemostasia, isto é, sem sangramento.

Processos Bioquímicos da HemostasiaHemostasia implica em que o processo de formação do coágulo (pró-coagulação, designada como Fase 1) esteja em equilíbrio com processos de parada de formação do coágulo (anticoagulação, Fase 2) e de dissolução do coágulo (fibrinólise, Fase 3). Pró-co-agulação leva à produção de fibrina a partir de fibrino-gênio e agregação em uma rede insolúvel, ou coágulo, que recobre a área da ruptura e impede maior perda de sangue. Concomitantemente, agregação de plaquetas do sangue ocorre no local da lesão. Agregação plaquetária forma uma rolha física para ajudar a parar o vazamento. Plaquetas também sofrem alterações morfológicas que liberam (a) alguns compostos químicos que ajudam em outros aspectos do processo todo, como vasoconstrição para reduzir o fluxo de sangue para a área e (b) enzi-

ADP + Pi

ADP + Pi

ATP or ADP

Golpe de força

Microtúbulo �1

�2

(sem carga)

1

AA

A

2

3

456

Golpe de força

(sob carga)

CargaATP

ATP

(+) (–)

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CAPÍTULO 25 CICLO CELULAR, MORTE CELULAR PROGRAMADA E CÂNCER | 987

(Duplicação do DNA)S

G2 G1 G0

M

(Separação de cromátides e divisão celular)

CICLO CELULAR, MORTE CELULAR PROGRAMADA E CÂNCERRichard M. Schultz


25


25.2 CICLO CELULAR, 988 Regulação do ciclo celular, 989 Regulação de Rb, 990 Regulação de p53, 991 Transdução de sinal de fator de crescimento,

991

25.3 APOPTOSE: MORTE CELULAR PROGRAMADA, 993 Principais vias, 994 Via do receptor de morte, 994 Vias mitocondriais, 995 Apoptose induzida por p53, 996 Regulação de apoptose por MAPK, 996

25.4 CÂNCER, 997 Oncogenes e genes supressores de tumor, 997 Propriedades de células de câncer, 998 Imortalidade das células de câncer, 999

Metástase de células de câncer, 999 Angiogênese induzida por células de câncer,

1000 Múltiplas mutações são necessárias para formar

um câncer, 1001 Heterogeneidade genética e bioquímica de cân-

ceres, 1001 Agentes mutagênicos e promotores causam cân-

cer, 1004 Análise bioquímica de cânceres, 1004

BIBLIOGRAFIA, 1005


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 25.1 Vírus Oncogênicos de DNA, 999 25.2 Droga Anti-Câncer Molecularmente Dirigi-

da, 1002 25.3 Causa Ambiental de Cânceres Humanos,

1003

BioQ.25 987 22.01.07 18:41:43


te um sinal por meio de uma mudança conformacional e associações proteína-proteína.

Grb2 contém ambos os domínios SH2 e SH3. Liga-ção de Grb2 ao receptor de PDGF por seu domínio SH2 induz uma mudança conformacional que abre seus do-mínios SH3 para ligar uma região de hélice poliprolina na proteína GEFRas, que depois se liga a Ras e catali-sa a troca de seu GDP ligado por GTP (Figura 25.8). GPT-Ras é a forma ativa de Ras. Ras é uma enzima GTPase e se inativa por catalisar a hidrólise do GTP ligado em GDP.

Mutações no gene Ras que resultam em Ras consti-tutivamente ativo ocorrem em aproximadamente 30% dos cânceres humanos. As mutações comumente en-contradas são nos resíduos de aminoácidos 12, 13 e 61, que participam da atividade de Ras GTPase, de modo que Ras mutado não pode se desativar e permanece em uma conformação GTP-Ras ativa.

No Ras normal, a atividade de Ras GTPase é aumen-tada 100 a 1000 vezes pela ligação de Ras a GAPRas (GAP, proteína ativadora de GTPase). Entretanto, a li-gação de GAPRas ao Ras mutado cataliticamente inerte não tem efeito, porque sua atividade de GTPase está ausente.

Ras também precisa se associar com a membra-na plasmática para ser ativado. Isto é conseguido por modificações pós-tradução que incluem remoção por uma protease do tetrapeptídeo C-terminal, metilação do novo grupo ácido carboxílico C-terminal e adição de um grupo ácido graxo farnesil a uma cadeia lateral de cisteína na extremidade COOH-terminal. Em algumas isoformas de Ras, um segundo grupo acil graxo é adi-cionado, perto da extremidade COOH-terminal.

Três genes Ras diferentes existem no homem – H-ras, N-ras e K-ras – que produzem proteínas homólo-gas de 21 kDa. As seqüências de aminoácidos de seus primeiros 85 resíduos são idênticas, e os seguintes 80 resíduos mostram 85% de homologia, mas as ex-tremidades C-terminais diferem mais dramaticamen-te. Embora existam diferenças em alguns dos sinais posteriores entre as isoformas de Ras, em geral seus sinais se sobrepõem. Estas isoformas são caracteris-ticamente expressas em diferentes tipos celulares, e mutações nos resíduos 12, 13 e 61 ativam constitutiva-mente todas elas.

Como ativação da atividade de Ras promove o fe-nótipo câncer, genes Ras são conhecidos como proto-oncogenes. Proto-oncogenes são transformados em oncogenes por uma mutação ativadora que promove ou mantém uma célula cancerosa. O oncogene ras dá continuamente um sinal de fator de crescimento que promove divisão celular, em ausência de ativação an-terior.

GTP-Ras transmite seu sinal de divisão celular por ativação de MAP quinase quinase quinase (MAPKKK) (Figura 25.9). MAPKKK inicia uma cascata de quina-ses que inclui MAPKK e MAPK. MAPK ativada (fosfo-rilada) se desloca para o núcleo, onde fosforila e ativa

fatores de transcrição, como Jun e Fos, aumentando as-sim a transcrição de genes como o fator de transcrição Myc e as ciclinas de G1 envolvidas na divisão celular. Myc aumenta a expressão de muitos genes envolvidos na fase S, incluindo as S-ciclinas e o fator de transcri-ção E2F (ver p. 211). Entretanto, se as condições não forem adequadas para divisão celular, Myc pode iniciar um processo levando à morte celular.

25.3 | APOPTOSE: MORTE CELULAR PROGRAMADA

Apoptose é a palavra grega para “folhas que caem”, e apoptose descreve um processo bioquímico freqüente natural de morte celular. Morte apoptótica é necessá-ria durante processos de desenvolvimento, bem como para manter a homeostase de um organismo inteiro. À medida que novas células são geradas no homem, mor-te de um número semelhante de células é necessária na mesma escala de tempo para manter um estado es-tacionário. Morte apoptótica difere da morte celular necrótica. Na última, lise de uma membrana celular leva à liberação dos conteúdos celulares no espaço ex-tracelular e a uma resposta inflamatória, como freqüen-temente acontece em infecções bacterianas ou virais e em trauma. Em contraste, apoptose é freqüentemente

FIGURA 25.9GTP-Ras ativa uma cascata de quinases. Ras-GTP ativa uma cascata de quinases resultando na fosforilação e ativação da quinase terminal MAPK. MAPK ativada entra no núcleo e fosforila fatores de transcrição que regulam a expressão de proteínas envolvidas na fase S. MAPK é mitógeno-ativada proteína quinase, MAPKK é MAP quinase quinase, e MAPKKK é MAP quinase quinase quinase.

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BioQ.25 993 22.01.07 18:42:05


sobrevivência. Os resultados dos sinais são dependen-tes do tipo celular. Em algumas circunstâncias, JNK promove morte por fosforilação de Bcl-2 para promo-ver sua dissociação da membrana mitocondrial (Figura 25.15), o que aumenta as concentrações mitocondriais de Bak e Bax livres e promove morte celular. JNK tam-bém pode fosforilar p53, tornando-a mais resistente a Mdm-2, resultando em um aumento na concentração de p53 e morte celular. Também a MAPK ERK, a MAPKKK Raf, e a quinase Akt promovem sobrevivência celular por fosforilação da proteína facilitadora pró-apoptótica Bad ou por ativação da expressão dos genes anti-apop-tóticos tipo-Bcl-2 (Figura 25.15). Portanto, diferentes

quinases ativadas por Ras transmitem sinais opostos de vida e morte, e o resultado depende do contexto celular e do tipo de célula.

25.4 | CÂNCER

Oncogenes e Genes Supressores de TumorO ciclo celular e a apoptose são críticos para um enten-dimento do câncer. Genes que codificam proteínas que promovem divisão celular ou que promovem resistên-cia a apoptose são proto-oncogenes (Tabela 25.2). Suas mutações ativadoras ou super-expressão resultam em atividade aumentada, o que leva a divisão celular des-regulada ou resistência a apoptose. Mutações em um proto-oncogene podem convertê-lo em um oncogene. Duas cópias (ou alelos) de cada gene autossômico (i.é, aqueles em cromossomos que não os cromossomos X e Y) estão presentes no genoma de toda célula somática [cada célula somática tem um alelo derivado da mãe e outro do pai para cada gene autossômico]. Uma muta-ção ativadora em um único alelo de um proto-oncoge-ne é suficiente para causar um efeito pró-proliferativo ou anti-apoptótico em uma célula. Tais mutações são portanto autossômicas dominantes para progressão do câncer.

Proto-oncogenes, cujos produtos promovem di-visão celular ou resistência a apoptose incluem genes de fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento, moléculas adaptadoras tipo-Grb, tirosina quinases tipo-Src, quinases das cascatas MAPK, Cdks, ciclinas, CAKs, Cdc25, e fatores de transcrição (como Jun, Fos, Myc e E2F) que aumentam a expressão de

FIGURA 25.14Múltiplas vias podem ser reguladas por Ras. MAPKKK são MAPK quinase quinases. MAPKs, após ativação por uma MAPKK, podem se deslocar para o núcleo para fosforilar fatores de transcrição. As quinases também podem fosforilar proteínas outras, além dos fatores de transcrição. Alvos alternativos para as quinases incluem proteínas tipo-Bcl-2 e p53.

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FIGURA 25.15Interação de quinases ativadas por Ras com proteínas que regulam apoptose. S, sobrevive (via promove sobrevivência celular); D, morre (die) (via promove morte celular apoptótica). ERK, JNK, Raf e Akt são quinases Pi3K, 1-fosfatidilinositol-3 quinase.

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Fatores ambientais e culturais são as causas predomi-nantes do câncer humano. Se estes fatores puderem ser regulados, a incidência de câncer pode ser redu-zida em mais de 75%. Fumar cigarros é responsável por aproximadamente 30% das mortes por câncer nos EUA Além disso, estima-se que dieta pode pre-venir o desenvolvimento de aproximadamente 30% dos cânceres nos EUA (estimativas variam entre 10 e 70%). Estes números são baseados primariamente em dados epidemiológicos da incidência de tipos de câncer em diferentes localizações geográficas, cultu-ras e ambientes (ver tabela anexa). Na migração de uma cultura ou localização para outra, a incidência de um tipo de câncer freqüentemente se aproxima à da população na nova cultura, à medida que os in-divíduos ou seus descendentes assimilam. Também rápidas mudanças de dieta ou estilo de vida ao longo do tempo em um país mostram a importância destes fatores na incidência de câncer.

A quarta parte da população americana que tem maior quantidade de frutas e vegetais na dieta tem uma incidência 30-40% menor de muitos tipos de câncer. Entretanto, os constituintes destes alimen-tos que inibem a formação do câncer não foram de-terminados. Níveis inadequados de ácido fólico na dieta americana foram implicados como um fator de risco para cânceres de cólon e de mama. A inges-tão de ácido fólico pode ser particularmente crítica em indivíduos com um polimorfismo em seu gene da

metilenotetra-hidrofolato redutase, uma enzima en-volvida no metabolismo de ácido fólico, que resulta em atividade diminuída. Deficiência de folato causa incorporação excessiva de uracil no DNA e quebras cromossômicas. Deficiência de folato é comum em alcoólatras e pode ser a razão para um aumento na incidência de certos cânceres com álcool. A dieta e o estilo de vida de pré-adolescentes afetam o início da menarca, e início precoce de menarca e extensão do período de tempo entre menarca e menopausa estão associados com risco aumentado de câncer de mama em mulheres. Obesidade correlaciona-se inversa-mente com risco de câncer de mama em mulheres pré-menopausa, e correlaciona-se positivamente na pós-menopausa. Muita gordura animal na dieta foi associada com risco aumentado de câncer de có-lon, mas os dados são inconsistentes. Ao contrário da gordura animal total na dieta, os dados podem sugerir que é a razão entre gordura poliinsaturada e saturada que se correlaciona com risco de câncer cólon-retal. A incidência de câncer de cólon também tem sido inversamente correlacionada com falta de atividade ou exercício.

Estudos ambientais e dietéticos são difíceis, uma vez que grandes populações devem ser estudadas ao longo do tempo de uma geração, e múltiplas variáveis devem ser controladas. Entretanto, avanços no nosso conhe-cimento e controle destes fatores podem ter enormes efeitos na diminuição da incidência de câncer.

Variação na Incidência de Tipo de Câncer em uma Comparação de Dois Locais

Comparação de Localização Incidência na Localização 1

Incidência na Localização 2

Diferença em Vezes a Incidência

Pulmão New Orleans (negros) – Madras (Índia) 110 5,8 19

Mama Hawaii (havaianos) – Israel (não-judeus) 94 14 7

Próstata Atlanta (negros) - China (Tianjin) 91 1,3 70

Colo uterino Brasil (Recife) – Israel (não-judeus) 83 3,0 18

Fígado China (Xangai) – Canadá (Nova Escócia) 34 0,7 49

Cólon Estados Unidos (Connecticut, brancos) – Índia (Madras)

34 1,8 19

Melanoma Austrália (Queensland) – Japão (Osaka) 31 0,2 155

* Incidência em número de novos casos por ano por 100.000 pessoas, ajustado para variação de idade com a população específica. Dados retirados de Alberts, B., Johnson, A.,. Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., e Watson, J. D. Molecular Biology of the Cell, 4th ed. New York: Garland, 2002, Tabela 24-2, que foi adaptada de DeVita, V. T., Hellman, S., e Rosenberg, S. A. (Eds.). Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4th ed. Philadelphia: Lippincott, 1993; baseado em dados de C. Muir et al. Cancer Incidence in Five Continents, Vol. 5, Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1987. Referências Gerais: Shibuya, K., Mathers, C. D., Boschi-Pinto, C., Lopez, A. D., e Murray, C. J. L. Global and regional estimates of cancer mortality and incidence by site: II. Results for the global burden of disease 2000. BMC Cancer 2:37, 2002. Pisani, P., Parkin, D. M., Bray, F. e Ferlay, J. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int. J. Cancer 93:18, 1999.


Causa Ambiental de Cânceres Humanos

(continua na página seguinte)

BioQ.25 1003 22.01.07 18:42:17

CAPÍTULO 26 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CONSTITUINTES NUTRICIONAIS BÁSICOS | 1009

2Na+

GLUT5

SGLT1

Frutose

Galactose

Glicose

DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CONSTITUINTES NUTRICIONAIS BÁSICOSUlrich Hopfer


26

26.1 VISÃO GERAL, 1010 Vários órgãos gastrointestinais contribuem para a

digestão de alimentos, 1010

26.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS, 1012 Diferentes locais de digestão intestinal, 1012 Enzimas digestivas são secretadas como pró-en-

zimas, 1013 Secreção é regulada por muitos secretagogos, 1014

26.3 TRANSPORTE EPITELIAL, 1016 Transporte de solutos pode ser transcelular ou

paracelular, 1016 Absorção de NaCl tem componentes ativos e pas-

sivos, 1017 Secreção de NaCl depende da ATPase trocadora

de Na+/K+ contraluminal, 1019 Gradientes de concentração ou potenciais elétri-

cos dirigem transporte de nutrientes, 1021 Células gástricas parietais secretam HCl, 1023

26.4 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE PROTEÍNAS, 1024 Peptidases garantem digestão eficiente de proteí-

nas, 1024 Pepsinas catalisam digestão gástrica de proteí-

nas, 1024 Zimogênios pancreáticos são ativados no intesti-

no delgado, 1024 Peptidases da borda em escova e citoplasmáticas

digerem peptídeos pequenos, 1025 Transportadores de aminoácidos e di e tripeptí-

deos, 1026

26.5 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CARBOIDRATOS, 1028

Dissacarídeos e polissacarídeos requerem hidróli- se, 1028

Transportadores de monossacarídeos, 1030

26.6 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE LIPÍDEOS, 1031 Digestão de lipídeos requer vencer sua solubilida-

de limitada em água, 1031 Lipídeos são digeridos por lipases gástrica e pan-

creática, 1031 Micelas de ácidos biliares solubilizam lipídeos

durante a digestão, 1032 A maior parte dos lipídeos absorvidos é incorpo-

rada a quilomícrons, 1037

26.7 METABOLISMO DE ÁCIDOS BILIARES, 1037 Química e síntese de ácidos biliares, 1037 Transporte de ácidos biliares, 1038

BIBLIOGRAFIA, 1040


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 26.1 Cloridorréia Familiar Causa Alcalose Meta-

bólica, 1017 26.2 Fibrose Cística, 1020 26.3 Diarréias Toxigênicas Bacterianas e Terapia

de Reposição de Eletrólitos, 1021 26.4 Aminoacidúria Neutra: Doença de Hartnup,

1026 26.5 Deficiência de Dissacaridases, 1030 26.6 Intervenções Farmacológicas para Evitar

Absorção de Gordura e Obesidade, 1033 26.7 Cálculos de Colesterol, 1036 26.8 A-β-Lipoproteinemia, 1038

BioQ.26 1009 22.01.07 18:43:16


funções, o trato gastrointestinal contém glândulas es-pecializadas e superfícies epiteliais:

Órgão Função Principal em Digestão e Absorção

Glândulas salivares Elaboração de fluido e enzimas digestivas

Estômago Elaboração de HCl e enzimas digestivas

Pâncreas Elaboração de NaHCO3 e enzimas para a digestão intraluminal

Fígado Elaboração dos ácidos biliares

Vesícula biliar Armazenamento e concentração da bile

Intestino delgado Digestão terminal dos alimentos, absorção de nutrientes e eletrólitos

Intestino grosso Absorção de eletrólitos

O pâncreas e o intestino delgado são essenciais para digestão e absorção de todos os nutrientes básicos. Felizmente, ambos os órgãos têm grandes capacidades de reserva. Assim, má digestão devido a insuficiência pancreática torna-se um problema clínico só quando a taxa de secreção pancreática de enzimas digestivas cai abaixo de um décimo da taxa normal. Secreção de bile pelo fígado é importante para digestão e absorção eficientes de lipídeos, que dependem de ácidos biliares. Em contraste, a digestão gástrica de alimentos é não-essencial para nutrição adequada, e perda desta função pode ser compensada pelo pâncreas e pelo intestino delgado. No entanto, digestão gástrica normal aumenta muito a facilidade e a eficiência do processo digestivo total. O estômago ajuda a digestão por sua função de re-servatório, sua capacidade de misturar, e pelo início da hidrólise de proteínas e lipídeos que, embora pequena, é importante para estimular a secreção pancreática e biliar. Peptídeos, aminoácidos e ácidos graxos liberados no estômago estimulam a liberação coordenada do suco pancreático e da bile no lúmen do intestino delgado, as-segurando assim digestão eficiente dos alimentos.

26.2 | CONSIDERAÇÕES GERAIS

Diferentes Locais de Digestão IntestinalAs primeiras etapas da quebra dos alimentos são catali-sadas por enzimas solúveis e ocorrem dentro do lúmen do estômago e do intestino delgado. Enzimas digestivas são secretadas pelas glândulas salivares, estômago e pâncreas, sendo que o pâncreas faz as contribuições maiores e mais importantes. Enzimas secretadas che-

gam a 30 g de proteínas por dia, pelo menos, em um adulto saudável. Enzimas pancreáticas, juntamente com a bile, são derramadas no lúmen da segunda parte (descendente) do duodeno, de modo que a maior parte da digestão intraluminal ocorre na porção distal, em relação a este ponto. Entretanto, mesmo após exausti-vo contato com enzimas gástricas e pancreáticas, uma parte substancial dos carboidratos e aminoácidos per-manece como dímeros e oligômeros, e depende, para continuar a quebra, de enzimas digestivas das células epiteliais intestinais (enterócitos).

A membrana plasmática luminal dos enterócitos é aumentada por uma matriz organizada de projeções, chamadas microvilosidades, o que lhe confere a apa-rência de uma escova e que levou ao nome borda em escova. Esta borda em escova fornece uma grande área, que é coberta em sua superfície mais externa por muitas di- e oligossacaridases, amino- e dipeptida-ses, e esterases (Tabela 26.2). Muitas destas enzimas projetam-se a até 100 Å em direção ao lúmen, ligadas à membrana plasmática por um polipeptídeo de anco-ragem. Este arranjo permite eficiente digestão na su-perfície, gerando moléculas nutrientes que podem ser absorvidas pelos enterócitos. Uma questão interessante é como as enzimas de superfície, que são elas próprias proteínas, escapam da digestão por proteases solúveis. Parece que sua grande glicosilação confere alguma pro-teção, impedindo o acesso de proteases a ligações pep-tídicas relevantes.

TABELA 26.2 Enzimas Digestivas da Superfície do Intestino Delgado

Enzima (Nome Comum) Substrato

Maltase Maltose

Sacarase/isomaltase Sacarose/dextrina α-limite

Glucoamilase Amilose

Trealase Trealose

β-Glucosidase Glucosilceramida

Lactase Lactose

Endopeptidase Proteína (clivagem de aminoácidos hidrofóbicos internos)

Aminopeptidase A Oligopeptídeo com NH2 terminal acídico

Aminopeptidase N Oligopeptídeo com NH2 terminal neutro

Dipeptidil aminopeptidase IV

Oligopeptídeo com X-Pro ou X-Ala na extremidade NH2 terminal

Leucina aminopeptidase Peptídeos com aminoácido neutro na extremidade NH2 terminal

γ-Glutamiltransferase Glutationa + aminoácido

Enteropeptidase (enteroquinase)

Tripsinogênio

Fosfatase alcalina Fosfatos orgânicos

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duz aminoácidos livres e di e tripeptídeos, que são ab-sorvidos por sistemas transportadores específicos de aminoácidos e peptídeos, respectivamente. Di e tripeptídeos transportados são geralmente hidrolisados dentro da célula epitelial intestinal, antes de saírem da célula. Isto explica por que praticamente só aminoáci-dos livres são encontrados no sangue portal após uma refeição. A ausência virtual de peptídeos era tida como evidência de que a digestão luminal de proteínas pros-seguia até aminoácidos livres antes de ocorrer absor-ção. Entretanto, agora está estabelecido que uma gran-de parte do nitrogênio amino da dieta é absorvida na forma de pequenos peptídeos, com subseqüente hidróli-se intracelular. Exceções são di e tripeptídeos contendo prolina, hidroxiprolina ou aminoácidos incomuns, como β-alanina na carnosina (β-alanil-histidina) ou anserina (β-alanil-1-metil-histidina). Estes peptídeos são absor-vidos e liberados intactos no sangue portal, Embora in-comum, β-alanina é parte da dieta, porque está presen-te, por exemplo, em carne de frango.

Transportadores de Aminoácidos e Di e Tripeptídeos

O intestino delgado tem uma alta capacidade de absor-ver aminoácidos livres e di e tripeptídeos. A maior par-te dos L-aminoácidos pode ser transportada através do epitélio contra um gradiente de concentração, embora a necessidade de transporte concentrador in vivo não seja óbvia, uma vez que as concentrações luminais são geralmente mais altas do que os níveis plasmáticos de 0,1-0,2 mM. A captação para dentro das células é media-da por vários transportadores diferentes na membrana luminal, enquanto a liberação no sangue é mediada por vários transportadores adicionais, diferentes, na mem-brana contraluminal (Tabela 26.7).

É notável que várias mutações com perda de função em transportadores de aminoácidos foram descobertas, porque o intestino delgado e os túbulos proximais renais compartilham tipos de transportadores, e perda renal de qualquer transportador de aminoácidos em particu-lar produz um resultado facilmente detectável, a saber, a excreção do aminoácido na urina (aminoacidúria). De mesma forma, a importância da absorção de di e tripeptí-deos para a nutrição foi descoberta quando uma mutação com perda de função no principal transportador de ami-noácidos neutros (aminoacidúria neutra) não foi acom-panhada por uma deficiência esperada nos aminoácidos correspondentes, sugerindo pelo menos um transporta-dor adicional mediando captação (ver Corr. Clín. 26.4).

O mecanismo de absorção ativa de aminoácidos neu-tros parece ser semelhante à discutida para a D-glicose (ver Figura 26.18). Um co-transportador Na+-depen-dente da família SLC6 (também chamado NBB para aminoácido neutro da borda em escova ou B0AT), e transportador facilitador, Na+-independente (SLC3A2/SLC7A8 ou sistema L para preferência a leucina) foram

funcionalmente caracterizados nas membranas luminal e contraluminal, respectivamente.

O transporte da borda em escova para outros ami-noácidos, não os neutros, é energizado de modos mais complicados. Por exemplo, aminoácidos ácidos podem ser concentrados por co-transporte com 2 íons Na+ e contra-transporte com 1 íon K+ (SLC12A1), enquanto aminoácidos básicos dependem do co-transporte de uma carga positiva e do potencial negativo do interior da célu-la (SLC3A1/SLC7A9). Conclusões sobre transportadores envolvidos em absorção dos aminoácidos alanina, serina e cisteína estão associadas com alguma incerteza porque estes aminoácidos são substratos de vários transporta-dores, um dos quais parece catalisar uma troca obrigató-ria aminoácido/aminoácido (SLC1A5).


Aminoacidúria Neutra: Doença de Hartnup

Doença de Hartnup é um defeito genético no transportador Na+-acoplado que normalmen-te medeia absorção de aminoácidos neutros do lúmen do intestino delgado e dos túbulos proxi-mais. Foi assim denominada pela família na qual a anomalia foi identificada pela primeira vez, e o homólogo em camundongo foi recentemente clonado (família gênica SLC6). No rim, a inca-pacidade de reabsorver aminoácidos neutros do ultrafiltrado leva à sua excreção na urina (ami-noacidúria neutra). No intestinal, o defeito re-sulta em má absorção de aminoácidos neutros da dieta. Os sintomas clínicos são os que se espe-rariam para uma deficiência de triptofano, com características semelhantes às da pelagra (ver p. 1074), que é uma expressão da disponibilidade diminuída de triptofano para conversão em nico-tinamida. Entretanto, os sintomas são variáveis e mais brandos do que os esperados no bloqueio total de reabsorção de aminoácidos neutros. In-vestigações de pacientes com doença de Hart-nup revelaram a existência de transportadores intestinais para di ou tripeptídeos, que são dife-rentes daqueles para aminoácidos livres. PEPT1 (SLC5A1) é o principal transportador intestinais para absorção de produtos peptídicos pequenos da digestão.

Fonte: Broer, A., Klingel, K., Kowalczuk, S., Rasko, J. E., Cavanaugh, J. e Broer, S., Molecular cloning of mou-se amino acid transport system B0, a neutral amino acid transporter related to Hartnup disease. J. Biol. Chem. 279:24467, 2004. Daniel, H. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport. Annu. Rev. Physiol. 66:361, 2004.

http://www.emedicine.com/derm/topic713.htm

BioQ.26 1026 22.01.07 18:44:07

CAPÍTULO 26 DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE CONSTITUINTES NUTRICIONAIS BÁSICOS | 1037

Micelas de ácidos biliares contornam este problema para os lipídeos, por aumentarem sua concentração efe-tiva na camada não-misturada. O aumento na veloci-dade de transporte é quase proporcional ao aumento na concentração efetiva e pode ser 1000 vezes superior à de ácidos graxos individuais solubilizados, de acordo com as diferentes solubilidades em água dos ácidos gra-xos como micelas e como moléculas individuais. Esta relação entre fluxo e concentração efetiva permanece, porque a constante de difusão é só um pouco menor para micelas do que para moléculas de lipídeos em solu-ção. Em ausência de ácidos biliares, a absorção de tria-cilgliceróis não pára completamente, mas a eficiência é drasticamente reduzida. Absorção residual depende da baixa solubilidade em água dos ácidos graxos li-vres e dos monoacilgliceróis. Lipídeos não-absorvidos chegam ao intestino inferior, onde uma pequena par-te pode ser metabolizada por bactérias. A maior parte dos lipídeos não-absorvidos, entretanto, é excretada nas fezes (esteatorréia).

Micelas também transportam colesterol e as vita-minas lipossolúveis A, D, E e K através das camadas fluidas não-misturadas. Secreção de ácidos biliares é essencial para sua absorção.

A Maior Parte dos Lipídeos Absorvidos É Incorporada a QuilomícronsCaptação de lipídeos por células epiteliais intestinais ocorre por difusão através da membrana plasmática. Além disso, captação de ácidos graxos de cadeia longa é aumentada por um transportador (FATP4 ou SLC27A4) e de colesterol por um canal (proteína tipoC1 de Nie-mann-Pick ou NPC1L1) na membrana luminal. Esteróis também podem ser bombeados de volta para fora por um transportador ABC (ver p. 479) consistindo de dois meios-transportadores (ABCG5 e ABCG8) e uma parte do colesterol é realmente devolvida ao compartimento luminal. Exportação de esteróis por transportador ABC é particularmente importante para rejeitar esteróis de plantas; normalmente, esteróis de plantas não são en-contrados no soro. Mutações com perda de função em qualquer dos meios-transportadores estão associadas com uma elevação no soro do esterol de planta sintoste-rol (fitosterolemia ou sitosterolemia).

Absorção é virtualmente completa para ácidos gra-xos e monoacilgliceróis, que são ligeiramente solúveis em água. É menos eficiente para lipídeos insolúveis em água. Por exemplo, apenas 30-40% do colesterol da die-ta é geralmente absorvido.

Dentro das células epiteliais que fazem absorção, o destino dos ácidos graxos absorvidos depende do com-primento da cadeia. Ácidos graxos de cadeias curtas ou médias (≤10 átomos de carbono) ou seus monoacil-gliceróis são ligados a uma proteína citosólica que liga ácido graxo (FAB intestinal o I-FABP) e são transporta-

dos para o retículo endoplasmático, onde são converti-dos em triacilgliceróis. Glicerol para este processo é de-rivado dos 2-monoacilgliceróis absorvidos e, em menor grau, da glicose. Colesterol é esterificado pela colesterol aciltransferase. Os triacilgliceróis recém-sintetizados e os colesteril ésteres formam glóbulos lipídicos aos quais fosfolipídeos e apolipoproteínas adsorvem. Os glóbu-los são chamados quilomícrons porque podem crescer até vários micrômetros e diâmetro, e deixam o intesti-no pelos vasos linfáticos (quilo = linfa leitosa derivada do grego chylos, que significa suco). passam através da célula para o sangue portal, sem modificação. Ácidos graxos de cadeia longa (>12 átomos de carbono) são ligados a uma proteína citoplasmática de ligação a ácidos graxos (FABP intestinal ou I-FABP, intestinal fatty-acid binding protein) e são transportados para o retículo endoplasmático, onde são convertidos novamente em triacilgliceróis. Quilomícrons são sintetizados no lúmen do retículo endoplasmático, de onde migram pelo Golgi e depois para vesículas e para a membrana contraluminal. São liberados no espaço intercelular por fusão destas ve-sículas com a membrana plasmática. É interessante que quilomícrons não entram no espaço capilar e na veia por-ta, mas sim viajam pelos vasos linfáticos intestinais (ou lacteals) e o ducto torácico para o sistema venoso sistê-mico. As apolipoproteínas intestinais são designadas por A-1 e B48 (ver Corr. Clín. 26.8); são diferentes daquelas do fígado, com funções semelhantes (ver p. 698).

Enquanto ácidos graxos de cadeia média da dieta chegam ao fígado diretamente com o sangue portal, áci-dos graxos de cadeia longa chegam primeiro ao tecido adiposo e ao músculo via circulação sistêmica, antes de entrarem em contato com o fígado. Células adiposas e musculares captam grandes quantidades de lipídeos da dieta para armazenamento ou metabolismo. Um atalho sem passar pelo fígado pode ter evoluído para proteger este órgão da sobrecarga lipídica após uma refeição.

O manuseio diferencial de ácidos graxos de cadeia média e longa por células intestinais pode ser explorado para fornecer ao fígado nutrientes altamente calóricos, na forma de ácidos graxos. Ácidos graxos de cadeia cur-ta e média têm cheiro e gosto rançoso, e não são muito palatáveis; entretanto, triacilgliceróis que contêm estes ácidos graxos são bastante palatáveis e podem ser usa-dos como parte da dieta. Ácidos graxos de cadeia curta são produzidos fisiologicamente, particularmente no cólon, por bactérias, a partir de carboidratos residuais. Estes ácidos graxos são absorvidos no sangue portal.

26.7 | METABOLISMO DE ÁCIDOS BILIARES

Química e Síntese de Ácidos BiliaresÁcidos biliares são sintetizados em células do fígado (hepatócitos) a partir de colesterol, secretados na bile juntamente com fosfolipídeos, e modificados por enzi-mas bacterianas no lúmen intestinal.

BioQ.26 1037 22.01.07 18:44:59

CAPÍTULO 27 PRINCÍPIOS DE NUTRIÇÃO I: MACRONUTRIENTES | 1043

PRINCÍPIOS DE NUTRIÇÃO I:MACRONUTRIENTESStephen G. Chaney


27

27.1 VISÃO GERAL, 104427.2 METABOLISMO ENERGÉTICO, 1044 Conteúdo energético dos alimentos é medido em

quilocalorias, 1044 Gasto energético é influenciado por quatro fato-

res, 1044

27.3 METABOLISMO DE PROTEÍNAS, 1045 Proteínas da dieta cumprem muitas funções

incluindo produção de energia, 1045 Balanço de nitrogênio relaciona ingestão com

excreção de nitrogênio, 1045 Aminoácidos essenciais devem estar presentes

na dieta, 1045 Economia de proteínas está relacionada com o

conteúdo de carboidratos e gorduras, 1046 Necessidades de proteína para adulto normal,

1046 Necessidades de proteína aumentam durante

crescimento e doenças, 1047

27.4 DESNUTRIÇÃO PROTÉICO-ENERGÉTICA, 1048

27.5 EXCESSIVA INGESTÃO PROTÉICO-ENERGÉTICA, 1050

Obesidade tem componentes dietéticos e genéti- cos, 1050

Obesidade tem implicações significativas para a saúde, 1050

27.6 CARBOIDRATOS, 1051

27.7 GORDURAS, 1051

27.8 FIBRAS, 1052

27.9 COMPOSIÇÃO DOS MACRONUTRIENTES DA DIETA, 1054

Composição da dieta afeta colesterol do soro, 1054

Carboidratos, índice glicêmico e carga glicêmica, 1056

Mistura de proteínas vegetais e animais satisfaz as necessidades nutricionais de proteína, 1056

Fibra de fontes variadas é desejável, 1057 Recomendações dietéticas, 1057

BIBLIOGRAFIA, 1059


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 27.1 Dietas Vegetarianas e Necessidades Protéi-

co-Energéticas para Crianças, 1047 27.2 Ingestão de Proteínas na Dieta e Doença

Renal, 1048 27.3 Oferecendo Proteínas e Calorias Adequadas

a Pacientes Hospitalizados, 1049 27.4 Carga de Carboidratos e Resistência Atléti-

ca, 1052 27.5 Dietas Ricas em Carboidratos Versus Dietas

Ricas em Gorduras para Diabéticos, 1053 27.6 Ácidos Graxos Poliinsaturados e Fatores de

Risco para Doença Cardíaca, 1055 27.7 Adaptação Metabólica: Relação entre In-

gestão de Carboidratos e Triacilgliceróis no Soro, 1059

BioQ.27 1043 22.01.07 18:46:45


correr mais de uma hora para queimar as calorias pre-sentes em um pedaço de torta de maçã.

Exercício regular aumenta a taxa de metabolismo basal, permitindo que calorias sejam queimadas mais rapidamente, 24 horas por dia. Um programa de exer-cícios regulares deve ser planejado para aumentar a massa muscular magra e deve ser repetido 3-5 dias por semana, mas não precisa ser exercício aeróbico para ter efeito sobre a taxa de metabolismo basal. Para um indi-víduo idoso ou enfermo, mesmo caminhada diária pode ajudar a aumentar a um pouco a taxa de metabolismo basal.

Níveis hormonais também são importantes, uma vez que tiroxina, hormônios sexuais, hormônio de cresci-mento e, em menor grau, epinefrina e cortisol aumen-tam BMR. Os efeitos da epinefrina e do cortisol prova-velmente explicam, em parte, porque estresse severo e trauma importante aumentam significativamente as necessidades energéticas. Finalmente, a própria inges-tão energética tem uma relação inversa com o gasto, porque durante períodos de jejum ou semijejum, BMR pode cair a até 50%. Isto é de grande valor para sobrevi-vência em casos de genuína falta de alimento, mas não ajuda muito a pessoa que quer perder peso com uma dieta de restrição calórica.

27.3 | METABOLISMO DE PROTEÍNAS

Proteínas da Dieta Cumprem Muitas Funções Incluindo Produção de EnergiaProteína carrega certa mística como alimento de “construção do corpo”. Embora seja componente es-trutural essencial de todas as células, é também im-portante para manutenção de secreções essenciais, como enzimas digestivas e hormônios peptídicos e pro-téicos. Proteína também é necessária para síntese de proteínas plasmáticas, que são essenciais para manter equilíbrio osmótico, transporte de substâncias no san-gue e manutenção da imunidade. Entretanto, o adulto norte-americano médio consome muito mais proteína do que o necessário para desempenhar estas funções essenciais. O excesso de proteína é tratado como uma fonte de energia, com aminoácidos glucogênicos sendo convertidos em glicose e aminoácidos cetogênicos, em ácidos graxos e cetoácidos. Ambos os tipos de aminoá-cidos são eventualmente convertidos em triacilglicerol no tecido adiposo, se os suprimentos de gordura e car-boidratos já forem adequados para suprir as necessida-des energéticas. Assim, para a maioria de nós, a única construção corporal obtida com dietas ricas em proteí-nas é no tecido adiposo.

Tem sido comum dizer que o corpo não tem depósitos para armazenamento de proteína e, portanto, proteína

adequada na dieta deve ser fornecida em todas as refei-ções. Entretanto, na realidade, isto não é muito correto. Embora não exista uma classe separada de proteínas de “armazenamento”, existe certa percentagem da proteí-na do corpo que sofre um processo constante de quebra e síntese. No estado de jejum, a quebra desta proteína aumenta, e os aminoácidos resultantes são utilizados para produção de glicose, síntese de outros compostos nitrogenados não-proteínas, e das proteínas plasmáti-cas e secretórias essenciais mencionadas acima. Mes-mo no estado alimentado, parte destes aminoácidos é utilizada para produção de energia e como precursores biossintéticos. Assim, o turnover de proteínas do corpo é um processo normal – e uma característica essencial do assim chamado balanço de nitrogênio.

Balanço de Nitrogênio Relaciona Ingestão com Excreção de NitrogênioBalanço de nitrogênio (Figura 27.2) é uma relação entre ingestão de nitrogênio (principalmente na forma de proteínas) e excreção de nitrogênio (principalmen-te na forma de proteína não-digerida nas fezes e uréia e amônia na urina). Um adulto normal está em equilíbrio de nitrogênio, com perdas exatamente equilibradas por ingestão. Balanço de nitrogênio negativo resulta de in-gestão inadequada de proteína, uma vez que os amino-ácidos utilizados para energia e reações de biossínte-se não são substituídos. Isto também ocorre em lesão quando há destruição dos tecidos, e em traumas graves ou doenças, quando resposta adaptativa do corpo causa catabolismo aumentado de proteína. Balanço de nitro-gênio positivo ocorre quando há um aumento final na proteína do corpo, como em crianças em crescimento, mulheres grávidas ou adultos convalescentes.

Aminoácidos Essenciais Devem Estar Presentes na DietaVários fatores devem ser considerados, além da quan-tidade de proteína na dieta. Um é o complemento de aminoácidos essenciais ingeridos. Aminoácidos es-senciais são aminoácidos que não podem ser sintetiza-dos pelo corpo (Tabela 27.2). Se apenas um destes ami-noácidos essenciais estiver faltando na dieta, o corpo não poderá sintetizar novas proteínas para substituir a perdida no turnover normal, e balanço de nitrogênio negativo resulta (Figura 27.2).

Obviamente, o complemento de aminoácidos essen-ciais na proteína da dieta determina o quanto ela pode ser usada pelo corpo.

A maioria das proteínas animais contém todos os aminoácidos essenciais, mais ou menos nas quantida-des necessárias ao corpo humano. Proteínas vegetais, por outro lado, freqüentemente não têm um ou mais aminoácidos essenciais e podem, em alguns casos, ser

BioQ.27 1045 22.01.07 18:46:50


de ácidos graxos essenciais é uma dermatite com des-camação. Deficiência de EFAs é muito rara nos Estados Unidos, ocorrendo primariamente em bebês prematuros em peso alimentados com fórmulas artificiais desprovi-das de EFA e em pacientes hospitalizados mantidos em alimentação totalmente parenteral por longos períodos. Na outra extremidade, há preocupação de que excesso de gordura na dieta cause elevação de lipídeos do soro e, assim, risco aumentado de doença cardíaca.

Estudos recentes sugerem que dietas ricas em gor-dura estejam associadas com risco aumentado de cân-cer de cólon, mama e próstata, mas não está claro se o risco de câncer está associado com ingestão de gordura per se ou com o excesso de calorias associado a uma dieta rica em gorduras. Estudos em animais sugerem

que ácidos graxos poliinsaturados da série ω-6 possam ser mais tumorigênicos do que outros ácidos graxos in-saturados. A razão para isso é desconhecida, mas suge-riu-se que prostaglandinas derivadas de ácidos graxos ω-6 possam estimular progressão de tumores.

27.8 | FIBRAS

Fibras da dieta compreendem os componentes do ali-mento que não podem ser quebrados por enzimas di-gestivas humanas. É incorreto, entretanto, assumir que fibras são não-digeridas, uma vez que algumas fibras são, de fato, quebradas, pelo menos parcialmente, por bactérias intestinais. Nosso conhecimento atual das

A prática de dar uma carga de carboidratos vem de observações feitas no início da década de 1960 de que a resistência durante exercício vigoroso era limitada primariamente pelos estoques de glicogê-nio muscular. Claro, glicogênio não é a única fon-te de energia para o músculo. Ácidos graxos livres aumentam no sangue durante exercício vigoroso e são utilizados pelo músculo, juntamente com seus estoques de glicogênio. Uma vez que o glicogênio tenha se esgotado, entretanto, o músculo não pode depender inteiramente de ácidos graxos livres sem se cansar rapidamente, provavelmente porque o músculo fica cada vez mais hipóxico durante exer-cício vigoroso. Enquanto glicogênio é utilizado ae-robicamente e anaerobicamente, ácidos graxos só podem ser utilizados aerobicamente. Em condições anaeróbicas, ácidos graxos não podem fornecer ATP em velocidade suficiente para servir como úni-ca fonte de energia.

A prática de dar uma carga de carboidratos para aumentar as reservas de glicogênio foi introduzida para atletas de enduro e outras provas de resistên-cia. O regime de carga de carboidratos original con-sistia de um período de 3 a 4 dias de exercício pesa-do com uma dieta pobre em carboidratos, seguidos por 1-2 dias de exercício leve com dieta rica em carboidratos. O período inicial de baixo carboidra-to e alta demanda energética causava uma depleção das reservas musculares de glicogênio. A mudança subseqüente para uma dieta rica em carboidratos resultava na produção de níveis acima do normal de

insulina e hormônio de crescimento, e as reservas de glicogênio chegavam a quase duas vezes as quan-tidades normais. Esta prática realmente aumentava significativamente a resistência. Em um estudo, in-divíduos em teste com dieta rica em gordura e prote-ína tinham menos do que 1,6 g de glicogênio por 100 g de músculo e conseguiam realizar uma carga de trabalho padronizado por apenas 60 min. Quando os mesmos indivíduos consumiram uma dieta rica em carboidratos por 3 dias, suas reservas de glicogênio aumentaram para 4 g por 100 g de músculo, e a mes-ma carga de trabalho pôde ser realizada por até 4 h.

Embora a técnica evidentemente funcionasse, os atletas freqüentemente se sentiam letárgicos e irritáveis durante a fase pobre em carboidratos do regime, e a dieta rica em gordura estava em desa-cordo com as recomendações atuais para saúde. Estudos recentes indicam que o consumo regular de uma dieta rica em carboidratos complexos e po-bre em gordura durante o treinamento aumenta as reservas de glicogênio, sem mudanças súbitas de dieta. Recomendações atuais são de que atletas de provas de resistência consumam uma dieta rica em carboidratos (com ênfase em carboidratos comple-xos) durante o treinamento. Depois, a ingestão de carboidratos é aumentada ainda mais (para 70% das calorias) e o exercício é diminuído durante os 2-3 dias que antecedem um evento atlético. Isto au-menta as reservas de glicogênio muscular até níveis comparáveis aos descritos anteriormente no regime de carga de carboidratos.

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Carga de Carboidratos e Resistência Atlética

BioQ.27 1052 22.01.07 18:46:56


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Quando se avalia a literatura de nutrição, é importante lembrar que a maioria dos testes clínicos é de duração re-lativamente curta (2-6 semanas), enquanto algumas adap-tações metabólicas podem ser consideravelmente mais demoradas. Portanto, mesmo estudos clínicos aparente-mente bem projetados podem levar a conclusões erradas, que serão repetidas na literatura popular por anos a fio. Por exemplo, vários estudos realizados nas décadas de 1960 e 1970 tentaram verificar os efeitos de ingestão de carboi-dratos sobre os níveis de triacilglicerol no soro. Tipicamen-te, jovens estudantes do sexo masculino receberam uma dieta na qual até 50% de suas calorias em gordura foram substituídas por sacarose ou outro açúcar simples por um período de 2-3 semanas. Na maioria dos casos, os níveis de triacilglicerol no soro aumentaram muito (até 50%). Isto levou à conclusão de que alta ingestão de açúcares sim-ples, particularmente sacarose, poderia aumentar o risco

de doença cardíaca, uma noção que se popularizou por meio de best sellers nutricionais como “Sugar Blues” e “Sweet and Dangerous”. Infelizmente, enquanto as conclusões originais eram promovidas na imprensa lei-ga, os experimentos propriamente ditos eram questio-nados. Estudos subseqüentes demonstraram que se es-tes testes fossem continuados por períodos mais longos (3-6 meses), os níveis de triacilglicerol geralmente se normalizavam. A natureza desta adaptação metabólica lenta é desconhecida. Também é importante considerar o tipo de carboidrato da dieta. Para muitos americanos, uma dieta rica em carboidratos significa uma dieta que é rica em açúcares simples. Os níveis de triacilgliceróis nestes indivíduos respondem dramaticamente a dietas que substituem alimentos contendo ou gordura ou car-boidratos complexos e fibras por alimentos contendo açúcares simples como fonte de carboidrato.


Adaptação Metabólica: Relação entre Ingestão de Carboidratos e Triacilgliceróis no Soro

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| BIBLIOGRAFIA |

BioQ.27 1059 22.01.07 18:47:02

CAPÍTULO 28 PRINCÍPIOS DE NUTRIÇÃO II: MICRONUTRIENTES | 1063

Necessidadesnutricionaisaumentadas

Má-absorção

Ingestãoinadequada

da dieta

PRINCÍPIOS DE NUTRIÇÃO II:MICRONUTRIENTESStephen G. Chaney


28


28.2 AVALIAÇÃO DE MÁ NUTRIÇÃO, 1064

28.3 INGESTÃO DIETÉTICAS DE REFERÊNCIAS, 1064

28.4 VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS, 1066 Vitamina A é derivada de carotenóides de plan-

tas, 1066 Síntese de vitamina D requer luz do sol, 1068 Vitamina E é uma mistura de tocoferóis e toco-

trienóis, 1071 Vitamina K É um derivado de quinona, 1072

28.5 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS, 1073

28.6 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS LIBERADO-RAS DE ENERGIA, 1074

Tiamina forma a coenzima tiamina pirofosfato, 1074

Riboflavina forma as coenzimas FAD e FMN, 1075

Niacina forma as coenzimas NAD e NADP, 1075 Piridoxina (vitamina B6) forma a coenzima

piridoxal fosfato, 1076 Ácido pantotênico e biotina formam coenzimas

envolvidas no metabolismo energético, 1079

28.7 VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS HEMATOPOI-ÉTICAS 1079

Ácido fólico (folacina) funciona como tetra-hidrofolato no metabolismo de um carbono, 1079

Vitamina B12 (cobalamina) contém cobalto em um anel tetrapirrólico, 1080

28.8 OUTRAS VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS, 1082

Ácido ascórbico funciona em reações de redu- ção e hidroxilação, 1082

Colina e carnitina desempenham várias fun- ções, 1083

28.9 MACROMINERAIS, 1084 Cálcio tem muitas funções fisiológicas, 1084 Magnésio é requerido por muitas enzimas, 1084

28.10 MINERAIS TRAÇOS, 1084 Deficiência de ferro causa anemia e imunocom-

petência diminuída, 1084 Iodo é incorporado a hormônios da tireóide,

1086 Zinco é requerido por muitas proteínas, 1086 Cobre é um cofator de enzimas importantes,

1086 Cromo é um componente da cromodulina, 1086 Selênio é encontrado em selenoproteínas, 1087 Manganês, molibdênio, fluoreto e boro são ele-

mentos traços essenciais, 1087

28.11 DIETA AMERICANA: FATO E FALÁCIA, 1087

28.12 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL NA PRÁTICA CLÍNICA, 1087

BIBLIOGRAFIA, 1089


CORRELAÇÕES CLÍNICAS 28.1 Considerações Nutricionais na Fibrose

Cística, 1068

BioQ.28 1063 22.01.07 18:48:29


28.5 | VITAMINAS HIDROSSOLÚVEIS

Vitaminas solúveis em água diferem das vitaminas li-possolúveis em vários aspectos. A maioria é facilmente excretada, uma vez que sua concentração ultrapasse o limite renal, de modo que toxicidade é rara. Suas re-servas metabólicas são lábeis, e depleção pode ocorrer freqüentemente em questão de semanas ou meses, de modo que deficiências ocorrem relativamente rápido, com uma dieta inadequada. Como vitaminas hidrosso-lúveis são coenzimas para muitas reações bioquímicas comuns, freqüentemente é possível ensaiar o estado vitamínico medindo-se uma ou mais atividades enzi-máticas em eritrócitos isolados. Estes ensaios são es-pecialmente úteis se se medir a atividade endógena e o estímulo desta atividade por adição da coenzima ativa derivada da vitamina.

A maior parte das vitaminas hidrossolúveis é conver-tida em coenzimas, que são usadas em vias de geração de energia ou hematopoiese. Deficiências das vitaminas que liberam energia produzem vários sintomas sobre-postos e aparecem primeiro em tecidos de crescimento rápido. Sintomas típicos incluem dermatite, glossite (edema e vermelhidão da língua), queilite dos cantos dos lábios e diarréia. Em muitos casos, o tecido ner-voso também está envolvido devido à sua alta demanda energética ou efeitos específicos da vitamina. Sintomas neurológicos comuns incluem neuropatia periférica (formigamento dos nervos nas extremidades), depres-são, confusão mental, falta de coordenação motora e in-disposição. Desmielinização e degeneração do tecido nervoso também podem ocorrer. Estes sintomas de de-ficiências são tão comuns e sobrepostos que podem ser considerados como propriedades das vitaminas libera-doras de energia como uma classe, e não como sendo específicos para cada uma.

Bebês recém-nascidos correm risco nutricional es-pecial devido ao crescimento muito rápido e por-que as necessidades de muitos nutrientes são altas. Alguns micronutrientes (tais como vitaminas E e K) não atravessam bem a membrana placentária e as reservas teciduais são baixas no recém-nas-cido. O trato gastrointestinal (GI) pode não estar completamente desenvolvido, levando a problemas de má absorção (particularmente com respeito às vitaminas lipossolúveis). O trato GI também é esté-ril ao nascer, e a flora intestinal, que normalmente fornece quantidades significativas de certas vita-minas (especialmente vitamina K), demora vários dias para se estabelecer. Se o bebê for prematuro, o risco nutricional é um pouco maior, uma vez que o trato GI será menos desenvolvido e as reservas teciduais serão ainda menores.

A complicação nutricional mais séria parece ser doença hemorrágica. Recém-nascidos, especialmen-te bebês prematuros, têm baixas reservas teciduais de vitamina K e não têm a flora intestinal necessá-ria para sintetizar a vitamina. Leite materno é uma fonte relativamente pobre de vitamina K. Aproxima-damente 1 em cada 400 nascidos vivos apresentam alguns sinais de doença hemorrágica, que pode ser evitada por 0,5 a 1 mg da vitamina, dada ao nascer.

A maioria dos bebês recém-nascidos tem reser-vas de ferro suficientes para durar 3-4 meses. Como leite de vaca e leite materno contêm pouco ferro, suplementação com ferro geralmente é iniciada em idade relativamente precoce, pela introdução de cereal enriquecido com ferro. Níveis de vitamina D também são baixos no leite materno, e suplemen-tação com 200 UI/dia de vitamina D é geralmente recomendada. Quando bebês precisam ser manti-dos em ventilação assistida com altas concentra-ções de oxigênio, suplementação com vitamina E pode reduzir o risco de displasia broncopulmonar e fibroplasia retrolental, complicações em potencial da terapia por oxigênio. A anemia da prematurida-de pode responder a suplementação com folato e vitamina B12.

Em resumo, vitamina K suplementar é dada ao nascer para evitar doença hemorrágica. Bebês amamentados pela mãe geralmente recebem um suplemento de vitamina D, com ferro sendo intro-duzido juntamente com alimentos sólidos. Bebês alimentados com mamadeira recebem uma suple-mentação de ferro. Se o bebê precisar ser manti-do em oxigênio, vitamina E suplementar pode ser benéfica.

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Considerações Nutricionais em Recém-Nascidos

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um dentre vários ligantes diferentes (Figura 28.15). As formas cristalinas de B12 usadas em suplementação são geralmente hidroxicobalamina ou cianocobalamina. B12 em alimentos geralmente ocorre ligada a proteína, em forma metil ou 5’-desoxiadenosil. Para ser utilizada, B12 deve ser liberada da proteína por hidrólise ácida no es-tômago, ou por digestão por tripsina no intestino. Em seguida, combina com fator intrínseco, uma proteína secretada pelo estômago, que a transporta até o íleo para absorção.

Vitamina B12 só participa de duas reações no homem (Figura 28.16). O metil derivado de B12 é requerido pela metionina sintase, na qual homocisteína é metilada a metionina. O 5-desoxiadenosil derivado é requerido pela metilmalonil-CoA mutase, que converte metilma-lonil-CoA em succinil-CoA, uma reação-chave no ca-tabolismo de valina, isoleucina, metionina, treonina, ácidos graxos de cadeia ímpar, timina e a cadeia lateral do colesterol. Como poderia ser esperado, deficiência de B12 causa acúmulo de homocisteína e ácido metil-malônico.

Suplementação com ácido fólico reduz o risco de defeitos no tubo neural e diminui os níveis de homocisteína no soro, o que pode baixar o risco de doença cardíaca. Estes dados levaram a um aumento na RDA para ácido fólico e ao enriqueci-mento de produtos de grãos com ácido fólico. En-tretanto, mesmo com uma dieta marginal, nem todos os adultos têm níveis elevados de homocis-teína e nem todas as mães dão à luz bebês com defeitos de tubo neural. O que determina estas respostas individuais à ingestão inadequada de folato? Existe um polimorfismo genético comum no gene da 5,10-metilenotetra-hidrofolato redu-tase (MTHFR) que produz o 5-metiltetra-hidro-folato necessário à conversão de homocisteína em metionina (ver Figura 28.15). Uma substitui-ção C→T no bp 677 resulta em uma substituição de valina por alanina que baixa a atividade es-pecífica e reduz a estabilidade da enzima. Apro-ximadamente 12% dos caucasianos e asiáticos são homozigotos (T/T) e 50% são heterozigotos

(C/T) para este polimorfismo. As concentrações plasmáticas de folato são significativamente mais baixas e os níveis de homocisteína plasmática são significativamente mais altos em indivíduos T/T consumindo dietas pobres em folato. Quando acoplado com baixa ingestão de folato, o genótipo T/T pode responder por 15% dos defeitos de tubo neural. Além disso, indivíduos mais velhos com o genótipo T/T e baixa ingestão de folato parecem ter risco aumentado de câncer de cólon.

Uma investigação ativa de polimorfismos ge-néticos nos outros genes envolvidos no metabolis-mo de folato está em andamento. Polimorfismos foram descritos em metionina sintetase e recep-tor alfa de folato, que é necessário para captação de 5-metiltetra-hidrofolato. Ambos parecem ser benignos. Entretanto, a absorção de folato pelo intestino pode ser mais baixa em mães com uma história de gestações com defeito no tubo neural do que em mães controles. A genética deste de-feito ainda não foi determinada.

Fonte: Bailey, L. B. e Gregory, J. F. Polymorphisms and methylenetetrahydrofolate reductase and other enzymes: metabolic significance, risks, and impact on folate requirement. J. Nutr. 129:919, 1999. Barber, R. C., Lammer, E. J., Shaw, G. M., Greer, K. A. e Finnell, R. H. The role of folate transport and metabolism in neural tube defect risk. Mol. Genet. Metab. 66:1, 1999. Fang, J. Y. e Xiao, S. D. Folic acid, polymorphism of methyl-group metabolism genes, and DNA methylation in relation to GI carcinogenesis. J. Gastroenterol. 38:821, 2003.


Polimorfismos Genéticos e Necessidades de Ácido Fólico

FIGURA 28.15Estrutura da vitamina B12 (cobalamina).

CH3

CH3

CH2

CH

O

O

O–

H

HHOCH2

O OHP

CH3 CH3

CH3

CH3HNOCCH2CH2 CH3

CH3CH3

R1 R1R2

R2

R2

R1

CH3CH3

N

N N

NCo

X

N

N

N

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Referências de Ingestão na DietaFood and Nutrition Board, Institute of Medicine of the National

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Se as tendências atuais continuarem, um a cada cin-co americanos terá mais de 65 anos no ano 2030. Com este envelhecimento projetado da população americana, tem havido interesse crescente na de-finição das necessidades nutricionais dos idosos. Pesquisa recente demonstra necessidades alteradas de pessoas idosas para vários nutrientes essenciais. Por exemplo, absorção e utilização de vitamina B6 diminuem com a idade. Levantamentos dietéticos mostraram consistentemente que B6 é um proble-ma nutricional para muitos americanos, e os idosos não são exceções. Muitos americanos mais velhos obtêm menos de 50% da RDA para B6 em sua die-ta. Deficiência de vitamina B12 também é mais pre-valente entre os idosos. Muitos adultos mais velhos desenvolvem gastrite atrófica (produção diminuída de ácido no estômago) e produção diminuída de fa-tor intrínseco, o que leva a pouca absorção de B12. O nível sangüíneo de homocisteína, um possível fa-tor de risco de aterosclerose, demência e doença de Alzheimer, está freqüentemente elevado no idoso. Homocisteína é um produto colateral da metilação do DNA e é normalmente metabolizada a metionina ou cisteína em reações que requerem ácido fólico, B12 e B6 (ver Figura 28.14). Suplementação simples com estas vitaminas B é geralmente suficiente para normalizar os níveis de homocisteína. Vitamina D pode ser um problema também. Muitos idosos não passam muito tempo expostos ao sol, e a conversão


Necessidades Nutricionais de Idosos

de 7-desidrocolesterol em vitamina D na pele e de 1,25-(OH)D em 1,25-(OH)2D no rim diminui com a idade. Estes fatores levam a deficiências significati-vas de 1,25-(OH)2D no idoso, o que pode causar um balanço negativo de cálcio. Estas alterações podem contribuir para osteoporose.

Existe alguma evidência de necessidade aumen-tada de cromo e zinco também. Muitos idosos pare-cem ter dificuldade em converter o cromo da dieta em cromodulina biologicamente ativa. Deficiência de cromo pode contribuir para diabetes tipo 2. De modo semelhante, a maioria dos idosos consome en-tre metade e dois terços da RDA para zinco, e con-dições como gastrite atrófica podem interferir com absorção de zinco. Sintomas de deficiência de zinco incluem perda de acuidade do paladar, dermatite e sistema imune enfraquecido. Todos estes sintomas são comuns na população idosa, e deficiência de zin-co pode contribuir.

Nem todas as notícias são más, entretanto. Ab-sorção de vitamina A aumenta com a idade e sua re-moção pelo fígado diminui, de modo que vitamina A permanece em circulação por um tempo maior. Não apenas a necessidade de vitamina A diminui com a idade, mas o idoso também precisa ser particular-mente cuidadoso para evitar toxicidade de vitamina A. Embora isto não restrinja sua escolha de alimen-tos ou de suplementos multivitamínicos, geralmente devem evitar suplementos de vitamina A isolada.

Fonte: Russell, R. M. e Suter, P. M. Vitamin requirements of elderly people: An update. Am. J. Clin. Nutr. 58:4, 1993. Ubbink, J. B., Vermoak, W. J., van der Merne, A. e Becker, P. J. Vitamin B12, vitamin B6 and folate nutritional status in men with hyperhomocysteinemia. Am. J. Clin. Nutr. 57:47, 1993. Joosten, E., van der Berg. A., Riezler, R. Neurath, H. J., Linderbaum, J., Stabler, S. P. e Allen, R. H. Metabolic evidence that deficiencies of vitamin B12, folate and vitamin B6 occur commonly in elderly people. Am. J. Clin. Nutr. 58:468,1993. Wood, R. J., Suter, P. M. e Russell, R. M. Mineral requirements of elderly people. Am. J. Clin. Nutr. 62:493, 1995. Johnson, K. A., Bernard, M. A. e Fun-derburg, K. Vitamin nutrition in older adults. Clin. Geriatr. Med. 18:773, 2002.

| BIBLIOGRAFIA |

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