roteiro da prática 2 - aminoacidos e proteinas

Universidade Federal de São Carlos - Prof. Dr. Iran Malavazi/ Profa. Dra. M. Teresa M. Novo

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Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar

Prática 2- AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

A - REAÇÕES GERAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEINAS E AMINOÁCIDOS A.1. Reação de ninidrina – Identificação de aminoácidos

Adicione a um tubo de ensaio, 2 mL da solução de glicina 0,1 M e 5 gotas de ninidrina em álcool. Fazer um tubo como branco: 2 mL H2O, 5 gotas de ninidrina em álcool.

TUBO Glicina 0,1 M Ninidrina em álcool água Cor observada

1 (amostra) 2 mL 5 gotas -

2 (branco) - 5 gotas 2 mL

Ferva os tubos durante 1 ou 2 minutos. Observe e explique o aparecimento de coloração azul na solução por meio de

reação química.

A.2. Prova do biureto – Pesquisa da ligação peptídica

Proceder segundo o protocolo a seguir:

TUBO Soro (1:3) Gelatina

2% Glicina 0,1 M água

NaOH 2 mol/L

CuSO4 0,5%

Cor observada

3 2,0 mL -- -- -- 2,0 mL 8 gotas

4 -- 2,0 mL -- -- 2,0 mL 8 gotas

5 -- -- 2,0 Ml -- 2,0 mL 8 gotas 6

(branco) -- -- -- 2,0 mL 2,0 mL 8 gotas

Misture bem a solução após a adição de cada gota. O aparecimento de uma

coloração violeta indica a presença de ligações peptídicas. Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação

química.

A.3. Reação de Folin-Ciocalteau


TUBO Solução de tirosina

NaOH 2 mol/L

H2O destilada

Soro 1:3

Reagente de Folin

Cor observada

7 0,2 mL 0,6 mL 8 mL - 0,3 mL 8 - 0,6 mL 8 mL 0,2

mL 0,3 mL

9 (branco) - 0,6 mL 8,2 mL - 0,3 mL

Adicionar o reagente de Folin a todos os tubos lentamente. Discutir as cores

observadas em cada tubo.


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Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação química. A reação de Folin funciona para qualquer aminoácido? Explique.

A.4. Reação Xantoprotéica


TUBO Amostra

Soro (1:3) Tirosina (0,1 M)

Glicina (0,1 M) água

HNO3

concentrado Cor

observada

A 2 mL - - - 0,25 mL

B - 2 mL - - 0,25 mL

C - - 2 mL - 0,25 mL

D (branco) - - - 2,0 mL 0,25 mL Ferver com cuidado cada tubo por dois minutos em banho-maria;

Após resfriar, adicione, gota a gota o 0,25 mL da solução de NaOH 12 M; Misture,observe e anote os resultados.

Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação química.

B – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS B.1. PRECIPITAÇÃO IRREVERSÍVEL B.1.1. Desnaturação pelo calor

No tubo de ensaio 10, pipetar 2 mL de solução de plasma bovino 1:3. e aquecer diretamente na chama. Observar e explicar.

OBSERVAÇÃO: preparar 15 mL dessa diluição pois ela será utilizada outras vezes

ao longo do roteiro. Para tanto utilize 5 mL de soro e 10 mL de água destilada.

B.1.2. Desnaturação por ácidos

Montar os tubos conforme a tabela: TUBO 11 TUBO 12

Plasma diluído 1:3 1 mL 1 mL TCA (20%) 1 mL - HNO3 (1 mol/L) - 1 mL

Observar a formação do coágulo e explicar. B.1.3. Desnaturação por metais pesados

TUBO 13

Soro diluído 1:3 1 mL

AgNO3 1 mol/L 1 ml Observar a formação do coágulo e explicar.


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B.1.4. Desnaturação por solventes orgânicos

TUBO 14 TUBO 15

Soro diluído 1:3 1 mL 1 mL

Acetona 100% --- 1 ml

Etanol absoluto 1 mL --- Observar a formação do coágulo e explicar o seu aparecimento. B.1.5. Precipitação fracionada pelas soluções salinas concentradas

Adicione 5 mL de solução saturada de (NH4)2SO4 em 5 mL de plasma diluído 1:3 (TUBO 16). O precipitado formado deve ser tratado de acordo com o fluxograma a seguir:

* A saturação é atingida quando não é mais possível dissolver o sal adicionado. ** Filtar utilizando papel de filtro colocado sobre um tubo falcon de 50 mL. Nos tubos de ensaio 19 e 20, coloque 2,0 mL de água destilada e dissolva no primeiro tubo o precipitado I e no segundo o precipitado II. Faça o teste do biureto nos três tubos (18, 19 e 20). Para o teste do tubo 18 (filtrado II), retire uma alíquota de 2,0 mL. Para cada tubo teste adicione 2,0 mL de NaOH 2 mol/L e 500 µL de CuSO4 0,5%.

Descrever porque ocorreu a precipitação fracionada das proteínas. Explique quais proteínas podem estar presentes no precipitado I e no precipitado II.

B.2. PRECIPITAÇÃO REVERSÍVEL B.2.1. Salting-in- solubilização

Pipetar 3 mL de clara de ovo no béquer. Adicionar 10 mL de H2O e agitar com um bastão de vidro até a precipitação. Juntar NaCI 1 mol/L até redissolução do precipitado. B.2.2. Salting-out- precipitação

Da solução de proteína obtida no item (a), pipetar 3 mL para o tubo 21. Adicionar 3 mL de (NH4)2SO4 e observar o precipitado formado de proteínas não-desnaturadas. Em

Filtrar ** (TUBO 17)

Precipitado Filtrado + (NH4)2SO4 sólido

Filtrar **

Precipitado Filtrado

(até saturação)* (I) (I) (TUBO 19)

(II) (TUBO 18)

Soro (1:3) + (NH4)2SO4 (sol. saturada)

(II) (TUBO 20)


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seguida, adicionar 5 mL de H20 destilada. Fazer a inversão do tubo lentamente, observando a re-dissolução do precipitado de proteínas.

Discutir os resultados e o fundamento das técnicas de salting in e salting out.

C. DETERMINAÇÃO DO pH DA CASEÍNA por precipitação isoelétrica

Preparar 5 tubos de ensaio contendo caseína (0.5% em pH 8,5), de acordo com a tabela:

Tubo Água (mL) Caseína, pH 8,5

(mL) Ácido Acético 0,1 M (µL) pH

1 4,5 0,5 10 2 4,45 0,5 50 3 4,35 0,5 150 4 4,0 0,5 500 5 - 0,5 4500

Agitar bem os tubos e medir o pH (com papel indicador universal). Observar se

ocorre precipitação e registrar os resultados de maneira comparativa, em uma escala de 4 sinais positivos para o tubo de precipitação máxima. Resultados: Verificar a precipitação considerando os sinais +;++;+++;++++, quanto maior for a precipitação. Determinar o pH que correponde ao provável pI da caseína e comparar com os valores da literatura.

Questões para o relatório Nesta aula você realizou a quantificação de proteínas pelo método do biureto. Agora

pesquise e descreva como funcionam os seguintes métodos também amplamente utilizados para a quantificação de proteínas:

� Método de Lowry � Método do ácido Bicinchônico � Método de Bradford

Descreva para cada um desses métodos a metodologia empregada para cada um, os reagentes utilizados e a sensibilidade de cada teste. Pesquise também sobre a sensibilidade do método do Biureto.

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