purificao das proteinas
TRANSCRIPT
Purificação de proteínas
ETAPAS PRÉVIAS – DECIDIR:
Fonte de proteína
Método para dosar a atividade biológica
Método para dosar a quantidade total de proteínas
Extrato bruto
Extrato bruto
Centrifugação
Centrifugação
Centrifugação
Purificação de proteínas
solubilidadetamanhocargaafinidade de ligação
Purificação de proteínas
CADA ETAPA DA PURIFICAÇÃO:
TESTAR A ATIVIDADE BIOLÓGICA
DETERMINAR CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDADE
Solubilidade
Força iônica (M)
“Salting in”
“Salting out”
Exemplos de fracionamento “salting out”
Fibrinogênio = 0,8 M de (NH4)2SO4- Albumina = 2,4 M de (NH4)2SO4
“Salting out”
Diálise
Liofilização
Cromatografia= separação de componentes de uma mistura com base nas
diferenças de adsorção à uma matriz insolúvel
Cromatografia em coluna
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Cromatografia de GEL FILTRAÇÃO
Gel filtração : Sephadex - Agarose
Gel filtração : colunas
GEL FILTRAÇÃO
GEL FILTRAÇÃO- calibraçãoGlucagon
Citocromo c
Ribonucleasa
Seroalbúmina
IgGTiroglobulina
Volumen
Peso molecular
280
240
200
160
120
80
40
103
104
105
106
GEL FILTRAÇÃO
Purificação de proteínasCromatografia
Equipamentos, soluções e resinas• Coluna de vidro com filtro
• Coletor de frações
• Bomba peristáltica
• Soluções tampão de pH
Espectrofotômetros
GEL FILTRAÇÃO
• Baseia-se no peso molecular das proteínas da amostra
GEL FILTRAÇÃO
TROCA-IÔNICA
O
OH
HOCH2
OHH
H
HOO
O
OH
HOCH2
OHO
H
H
H
H
nCelulosa
O
O
H
H
OHCH2
O
H
O
O
OH
OH
HOCH2
HO
H
H
n
Agarosa
O
OH
CH2
OH
H
HOH
O
OH
OH
H
H
CH2O
H
O
H
H
OH
H
O
n
Dextrano
SUPORTES CROMATOGRÁFICOS
CH2 COO-
Carboximetil (CM)
CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfoetil (SE)
CH2 CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfopropil (SP)
O P
OO-
O-
Fosfo (P)
TROCADOR CATIÔNICO
CH2 CH2 NH+CH2
CH2 CH3
CH3
Dietilaminoetil (DEAE)
CH2 CH2 N+ CH2 CH3CH2CH3
CH2
CH3
Trietilaminoetil (TEAE)
CH2 CH2 N+ CH2CH2CH3
CH2
CH3
CHOH CH3
Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)
TROCADOR ANIÔNICO
+
+++
+++++
---
-
----
--
+
+++
+++++
-
--
--
--
---
- -- -
-
---
-
+
+++
+++++
-
-
--
--
---
-
-
---
-
- -
--
-
Proteínas ligadas
ao trocadoriônico
Baixas [SAL]Desprendem-se
as proteínas menoseletronegativas
Maiores [SAL]Desprendem-se
as proteínas maiseletronegativas
TROCA-IÔNICA
Cromatografia de troca- iônica
Bomba peristáltica
Generadorde gradiente
Columna
Colector defracciones
Resina deintercambioiónico
Baseia-se na AFINIDADE pelo suporte acoplado à resina
AFINIDADE
1 2 3
Cromatografia de afinidade
ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA COM SDS
SDS-PAGE
+
-
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA COM SDS
SDS-PAGE
Coloração com Coomassie Blue
Coloração por prata
