RMN no Desenvolvimento

de fármacos

José Daniel Figueroa-Villar

Grupo de Química Medicinal

Departamento de Química

Instituto Militar de Engenharia

Rio de Janeiro, Brasil

figueroa@ime.eb.br

Definição da Doença Definição de alvos

Estrutura e função do alvo

Mecanismo de ação Planejamento de Inibidores (in cerebro)

Modelos virtuais Bibliotecas

QSAR

“Screening” in silico

Projeto de novo

Potenciais antagonistas Testes de ligação

Síntese

Aplicações Comuns da RMN

em Química Medicinal

• Determinação da estrutura e dinâmica do receptor

(proteínas, DNA)

• Determinação da estrutura, dinâmica e

conformação dos ligantes (agonistas e

antagonistas)

• Estudos da interação ligante-receptor e ligante-

ligante

• Avaliação e seleção de ligantes de media e baixa

afinidade

Vantagens da RMN em Química

Medicinal

•É uma técnica universal para a detecção de

interações inter-moleculares. •Grande sensibilidade para interações fracas (afinidade da ordem

milimolar) que é importante para o seleção de fragmentos

moleculares para o planejamento de fármacos.

•Não é necessário o conhecimento da estrutura

ou função do alvo biomolecular. •Fornece informação estrutural detalhada sobre a forma de

interação dos ligantes.

•Pode ser feita a observação do alvo (biomolécula) ou do ligante

(fármaco).

•Os métodos por RMN testam diretamente a interação entre o

alvo e o ligante, minimizando a possibilidade de falsos positivos.

Métodos por observação dos ligantes

• Apropriados para seleção primária:

– Eficiência da seleção normalmente alto.

– Uso de espectros 1D de rápida aquisição.

– Pode ser usado para a seleção de ligantes em misturas sem a

necessidade de deconvolução.

– Já que o alvo molecular (enzima ou DNA) não é detectado:

• O alvo não precisa ser enriquecido isotopicamente.

• Podem ser usadas baixas concentrações do alvo.

• Não há problemas com o tamanho (massa) do alvo molecular.

– Existem limitações com relação ao nível de afinidade.

– A interação não específica do ligante com o alvo pode levar a

falsos positivos.

• É necessário realizar metodologias competitivas com ligantes que

interagem com o sítio ativo.

• Características do ligante para métodos com

detecção do ligante usando sondas convencionais:

– Necessário obter soluções com pelo menos concentração de

100 M em água (tampão).

– Para seleção através de detecção do ligante a concentração de

proteína deve ser entre 1 e 50 M.

– Para seleção através de detecção do alvo a concentração de

proteína marcada deve ser entre 100 e 300 M.

– Para proteínas até de 50 kDa simples marcação com 15N é

normalmente suficiente.

– Para proteínas com massa acima de 50 kDa marcação com 15N

e per-deuteração é necessário (TROSY), o que permite o uso de

proteínas com massa maior que 70 kDa.

– Uso de grupos metila marcados com 13C também permite o uso

de proteínas acima de 70 kDa.

– Marcação específica do sítio de interação.

• Métodos necessários para obter informação detalhada

sobre o sítio de ligação da macromolécula:

– Ampla faixa de afinidade sem limite superior.

– Utiliza espectros multidimensionais que precisam de muito tempo

para sua obtenção (baixa velocidade de avaliação).

– Necessário usar deconvolução para avaliação de misturas de

ligantes.

– Distinção direta entre ligação específica e não específica.

– Informação direta sobre o modo de ligação.

– Detecção direta do efeito do pH.

– Já que o alvo (enzima ou DNA) é detectado:

• O alvo precisa estar enriquecido isotopicamente (15N e 13C).

• Concentrações bem altas do alvo devem ser usadas.

• Há problemas com o tamanho do alvo (<100 kDa).

– Crio-sondas e o baixo custo de marcação isotópica com 13C

permite avaliação prática de cerca de 100.000 compostos.

Propriedades dos métodos de RMN para screening

Murray Coles, Markus Heller and Horst Kessler, Drug Discovery Today, 8(17),803-810, 2003.

Estudos de Interação

Ligante-Receptor por RMN

• Métodos Diretos:

– Deslocamento Químico

– Acoplamento Spin-Spin

– Relaxação Nuclear

• Tempos de Relaxação

• Efeito Overhauser Nuclear (NOE)

– Difusão Molecular

• Métodos Indiretos:

– Método de Dalvit

L + P LP

Kd = klig/kdes

obs = ( livre x flivre) + ( complexo x fcomplexo)

SAR (Structure-activity

Relationships) by NMR

Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.

mM ou M

nM

Deslocamento Químico

15N-HSQC: FKBP e FKBP con ligante

" 2

" 9

" ambos

Shuker, S. B., Hajduk, P. J., Meadows, R. P., Fesik, S. W. Science 1996, 274, 1531-1534.

Molecular modeling:

• GH minimization using AM1

• B-DNA DD dodecamer minimized with CVFF:

d(CGCGAATTCGCG)

• Docking followed by minimization of the

assembly with CVFF (Insight Discover)

Santos-Filho et col. Bioorg. Med. Chem. Lett.,

1997, 7(13), 1797-1802.

O

ON

H

N

H

NH2

NH2+

Br H

N

-O2C

CH3

O

d(CGCGAATTCGCG)2

Drew-Dickerson Dodecamer (DDD)

X-Ray and NMR structure: R. E. Dickerson, H. R. Drew, J. Biol. Chem., 23, 1981, 761-786.

A. Y. Denisov, E. V. Zamaratski, T. V. Maltseva, A. Sandstrom, S. Bekiroglu, K. H. Altmann, M. Egli, J. Cattopadhayaya, J.

Biomol. Struct. Dyn., 16, 1998, 547.

GHBP

Messeder et col.Bioorg. Med. Chem Lett., 1995, 5(24), 3079-3084.

Borges et col. European Journal of Medicinal Chemistry, 2004

7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8

5.4

5.6

5.8

6.0

6.2

H6 – T7

H1´-T7

H1´–T8

H6-T8

H6-C9

H2

H1´-T8

H2-A6

NOESY (50 ms mixing time)

Red: Pure DDD; Black: DDD + GHBP

NMR

(NOESY)

MM

1997

Tamanho molecular

T1 e T2 como função do tempo

de correlação c

Figueroa-Villar et col. Curr. Top. Med. Chem., 2009

Excitação Nuclear

Efeito do campo magnético B1 estático

Efeito do campo magnético B1 girando na

frequência Larmor

Origem de B1

z z

x

y

Mz

M-z

Mxy=0

M0

y

x

z

= =

Magnetização Líquida Mo

e

Magnetização Líquida

Representação clássica de um pulso de 90o

x

y

z

Mo Mo

z

y

x

90x0

z

y

x

z

y

x

Mxy=Mo

Mxy=0

t

t

DETECÇÃO E TRANSFORMADA DE FOURIER

FID

Tempo

Transformada

de Fourier

Frequência

Pulso de RF

• Relaxação Transversal: T2

– Relaxação Spin-Spin

– Troca de energia entre os núcleos

– Determina a largura (resolução) dos sinais de RMN

2

21Tπ

1SW /

SW1/2

h

h/2

Mxy = Mo

Mxy = -Mo

t

a

b

c

d

e.

..

x

y

z

-x

-y

-z

Det Det

-z

-y

-x

z

y

x

ab

x

z

-x

-y

-z

Det

-z

-y

-x

z

y

x

d e

..

.

t

Mxy = -Mo

Mxy = Mo

2T

t

oxy eMM

Equação para relaxação no plano xy

y'

x'

z

x'

z

y'

x'

z

y'

MB1

y'

z

x'

y'

z

x'

y'

z

x'

z

x'

y'

Pulso Defasamento ( Pulso ( Eco

Defasamento (3 Pulso ( Eco

B1

B1

180°90°x y

n

Carr-Purcell-Meiboom-Gill

CPMG

N

H

N

H

NH2

NH2+Cl

-

NO2

N

H

N

H

NH2

NH2+Cl

-

O2N N

H

N

H

NH2

NH2+Cl

-

O2N

10 mM

25 mM

50 mM

75 mM

BSA

Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286

PPM 7.92 7.84 7.76 7.68 7.60 7.52 7.44 7.36 7.28 7.20 7.12

PPM 8.70 8.60 8.50 8.40 8.30 8.20 8.10 8.00 7.90

N

CH3

NOH

S

N OH

2-PAM (35 mM)

2-PAM (27 mM) + AChE (0.9 u/650 L)

ThioOx (47 mM)

ThioOx (36 mM) + AChE (0.9 u/650 L)

Relaxação Longitudinal ou Spin-Rede

180x t

x

y

z z

y

x

x

y

z

z

y

x

t

z

y

x

t

z

y

x

t

Mz=-Mo

Mz=0Mz=Mo

Mz=Mo

Mo

-Mo

0Mxyt

to

1T

t

oz e21MM

2ln

tT o

1

180x

x

y

z z

y

x

z

y

x

z

y

x

z

y

x

Mz=-Mo

Mz=0

Mz=Mo

90x

90x

90x

90x

x

y

z

z

y

x

z

y

x

z

y

x

t

t

t

Inversão-Recuperação

D1-180x- -90x-Detecção

180 [NS]o

o

90 [NS]

d1

Espectros para medição de T1

Relaxação:

Variações de T1 com concentração

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

10 30 50 70 mM

T1 (

s)

H7 H3 H6 H5 H4GH2NB

NO2

H

NN NH2

NH2

H

3

6

5

4

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

10 30 50 70 mM

T1 (

s)

H2 H4 H7 H6 H5

GH3NB

7

6

5

4 2

+

HH

NN NH2

NH2

NO2

Cl-

Molecular modeling and docking

9.40 55.9 4NBGH

0.00 182.6 3NBGH

4.99 87.5 2NBGH

Erel (kcal/mol) ID50 ( M) Compound

NGHAs Rns

/Rs

purac pura R

ns/R

s

BSAc BSA c pura

/ c BSA

ID50

( m)

GH2NB 1,2 5,3x10-10

0,3 4,2x10-9

0,13 87,5

GH3NB 1,1 6,6x10-10

0,7 1,5x10-9

0,43 182,6

GH4NB 1,3 0,1x10-10

0,5 1,8x10-9

0,06 55,9

Tinoco et col. J. Braz. Chem. Soc., 1999, 10(4), 281-286

Determinação do

Tempo de Correlação

Molecular: c

Variação de T1 na interação

de guanil-hidrazonas com micelas

0

0.5

1

1.5

2

2.5

2 3 4

PURO

SDS

CTABT1 (s)

Posição

OCH3

+

H

NH2

NH2

H

NN

M. N. Borges et col. Biopolymers, 2001, 62(1), 9-14.

Messeder et col. 2009

NN

H

NH2

NH2

OCH3

H3CO

IC50 3.1 M (T. cruzi)

IC50 59.1 M (T. cruzi)

21

N

O

H3C

CH3

COONa

COOH

OH

3

CH3

COOH

H3C

CH3

G. Bai, Y. Cui, Y. Yang, C. Ye, M. Liu, A competitive low-affinity binding model for determining the mutual

and specific sites of two ligands on protein, The Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38,

588-593, 2005

Exemplo com anti-inflamatórios não esteroidais

(Ibuprofeno, Tolmetina e Ácido salicílico)

32

4 28

2

N

CH3

N

H

OH

H

H

H

H

2.2

1.4

2.9

1.3

1.7

1.6

T1

1.15

0.94

0.79

1.16

1.44

1.01

N

CH3

N

H

OH

H

H

H

H

BSA AChE

S

N OH

HH

H H

5.48

4.18

4.55

6.17S

N OH

HH

H H

2.23

2.11

3.05

1.97

Comparação da ancoragem de pirimetamina

Com a DHFR nativa e a mutante S108N

N

N NH2

NH2

C2H5

Cl

O N

N

NH2

NH2

R. T. Delfino et col. Biophys. Chem., 2002, 98(3), 287-300.

Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)

H8/12 1,8 2,1 0,3H9/11 1,3 1,7 0,4H13 0,5 0,4 -0,1H14 1,0 1,1 0,1

Pyrimethamine HCl

14

13

12

11

10

9

8

7

6

2

54

3

1

Cl-

+N

N

ClNH2

NH2

H

H3C

O N

N

NH2

NH2

H

12

3

45

7

8

9 10

64a5a

9a 10a+

Cl-

Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)

H8 5,0 2,9 -2,1H6 4,4 3,7 -0,7H7 4,4 3,7 -0,7H9 4,5 3,6 -0,9

O N

N

NH2

NH2

H

O2N

12

3

45

8

9 10

64a5a

9a 10a+

Cl-

7

Hydrogens T1(Free Compound) T1(Compound + DHFR) T1(s)

H8 1,54 1,78 0,24H9 1,45 1,48 0,03

T1 na comparação da interação de inibidores

com a DHFR de Plasmodium falciparum

IC50 16.10 M

IC50 8.34 M

IC50 >2500 M

Interação da 2,4-diamino-benzopiranpirimidina

com DHFR-NADPH por T1 Seletivo

O N

N

NH2

NH2

1

3

2

4567

8

9

Hidrogênio T1 Livre (s) T1 DHFR (s) T1 (s)

H-9 6.52 1.72 -4.80

H-8 4.78 1.80 -2.98

H-6 4.95 3.26 -1.69

O N

N

NH2

NH

HH

H6

H9

H8

O O

Asp54

NCONH2NADPH

+

-

44

Pirimetamina (45)

Amostra Branco:

DMSO

LQB/2003

42

44

Pirimetamina (45)

Amostra Branco:

DMSO

LQB/2003LQB/2003

42

O N

N

NH2

NH2

H

O2N

12

3

45

8

9 10

64a5a

9a 10a+

Cl-

7

O N

N

NH2

NH2

H

12

3

45

7

8

9 10

64a5a

9a 10a+

Cl-

N

N

ClNH2

NH2

H

H3C

+Cl

-

1

34

5

2

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Pirimetamina HCl

N

N NH2

NH2

H2N

R

Inhibition of P. falciparum DHFR by Novel Flexible Ligands

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0 5 10 15 20 25 30 35

Concentration (ng/mL)

Su

rviv

al (%

)

PirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3BPirimetaminaMGS-2-31-1MGS-2-23-1DA-3ADA-3CDA-3B

MR1-X: IC50 80 nM

MR1-D: IC50 100 nM

MR3-F: IC50 150 nM

Inibidores da

Tirosinase como

potenciais agentes

para tratamento de

melanoma

CHO

R

O

O

OR

OOO+

EtOH

Reflux

R = NO2, H, OCH3

1 2

3

4

5

6

78

9

10

11 O O

OO H

HAr

H

H

NN

H

NH2

NH.HClOH

H

H-7

BA

H

NN

H

NH2

NH2.HClOCH3

H H

NN

H

NH2

NH2.HClOH

H

A B

DH-7-H6 (Å) com SDS 3.86 3.68

DH-7-H6 (Å) sem SDS 2.80 3.58

H6-H7 distância 2.80 Å

Ângulo diedro -3.81o

R1iNULL = j i ij + j i,k jk

R1iNS = j i ij + j i,k jk + ik

ik = R1iNS – R1i

NULL

c2c

2

c

6ij

2H

2

ij41

6

r10

1

O método NULL

d1

90 [NS]o

o

180 [NS]

180 [S]o

Gibbs et col. J. Magn. Reson. 1991, 93, 395-402.

Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.

• Distância entre os hidrogênios H-2 e H-1’(r21’ Ao) por RMN e Modelagem

molecular

Carvalho et col. J. Magn. Reson. 2003, 164 (2), 197-204.

Complexos Fenol-Piperazina como Anti-helminticos

N

N

H

O

H

H

O

H

R2

R1

R2

R1

H

H

1: R1 = H; R2 = CH32: R1 = R2 = CH3

11'

2'

5' 6'