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Resistência bacteriana as
drogas antimicrobianas
1. População de uma bactéria
em processo de multiplicação
minutos , horas, dias, meses
tempo
2. Processo de crescimento e divisão
produzem naturalmente células
mutantes
3. População continua multiplicação, e
originando ocasionalmente, mais
células mutantes
Células são expostas a um
composto antimicrobiano
Pressão seletiva
4. Células são mortas ou impedidas de
multiplicação pela antimicrobiano com exceção
dos mutantes resistentes ao antimicrobiano
específico.
5. Os mutantes continuam com o crescimento
na presença do antimicrobiano e iniciam
dispersão pelo ambiente
Variação permanente resultante de Mutação
Variação permanente resultante de Recombinação Genética
1. Duas populações bacterianas A e B
crescem em um mesmo ambiente. A
espécie B é resistente a droga X.
2. Troca de DNA (elementos genéticos móveis)
ocorre entre células em baixa frequência.
3. Células da espécie A recebem o gen de
resistência a droga X, presente no elemento
genético móvel da espécie B.
Pressão seletiva
Bactérias são expostas a
droga X. 4. Na presença da droga X, as células da
espécie A que receberam gen da resistência
da espécie B são capazes de multiplicar-se
enquanto que as células originalmente
sensíveis não multiplicam-se.
Síntese de
lipídeos
Streptomyces platensis
Platensimicina
Azitromicina
Claritromicina
Estreptograminas
(Quinopristina/
Dalfopristina)
Tigeciclina
Sítios de ação de drogas antibacterianas
Sensível: Quando não cresce
nestas condições
Resistente: É aquela capaz de crescer “in vitro”
em presença da concentração média que a droga
atinge no sangue do hospedeiro durante o
tratamento, quando administrada por via oral
DEFINIÇÕES
Ex. Ausência do sítio de ação
(Drogas que atuam na parede; Macrolídeos e ausência de
receptores nos ribossomos de Gram negativas)
Natural: Todos os indivíduos da espécie são
resistentes
TIPOS DE RESISTÊNCIA
Adquirida: Linhagens resistentes e
sensíveis na mesma espécie
Mecanismos genéticos - Mutações e
Recombinação Genética
Resistência é vantajosa só na presença da droga
(não provoca inibição ou morte de possíveis
competidores da bactéria resistente)
Resistência
Natural ou intrínseca: Bactéria está fora do
espectro de ação da droga
Adquirida: Por mecanismos genéticos diversos,
surgem numa população bacteriana amostras que
não sofrem mais a ação da droga, que é
eficaz contra o resto da população
EXEMPLOS:
Penicilina G Bactérias Gram negativas
Penicilinas Micoplasma
Vancomicina Bactérias Gram negativas
Aminoglicosídeos Bactérias anaeróbias
Resistência Cromossômica (Mutação)
Resistência Simples (uma única droga)
É possível a transferência desta resistência
Tipos de Resistência Cromossômica
Perda do fator de resistência (“Cura”)
(Repiques frequentes, uso de substâncias químicas)
Resistência Extra-Cromossômica
Plasmídeos
Plasmídeo R (possuir o segmento FTR
Plamídeo F)
Expressão Bioquímica da Resistência
Bomba de Efluxo
Alteração ou destruição da droga
por enzimas (ex. β-lactamase,
fosfotransferases, adenilase,
acetilase, acetiltransferase)
Redução na permeabilidade
para a droga.
Mecanismos de resistência Mecanismos de ação
Drogas que agem sobre
os ribossomos e síntese
protéica:
Aminoglicosídeos,
Tetraciclinas,
Macrolídeos,
Clindamicina,
Cloranfenicol, Linezolida.
Drogas que inibem
a formação da
parede bacteriana:
Penicilinas,
Cefalosporinas,
Manobactâmicos,
Carbapenem,
Vancomicina,
Parede
bacteriana
Modificação no sítio
de ação da droga.
(PBP, DNA girase,
ribossomos)
Drogas que
inibem a RNA
Polimerase:
Rifampicina
Drogas que inibem
a síntese do DNA:
Fluoroquinolonas.
Drogas que agem
sobre a membrana
plasmatica
alterando sua
estrutura
:Polimixinas,
Daptomicina.
Kirby&Bauer
Testes de sensibilidade aos antimicrobianos --lactamaseslactamases do Grupo 1 (do Grupo 1 (AmpCAmpC))
E Teste
Determinação de
sensibilidade bacteriana
aos antimicrobianos Prof. Ary Fernandes Junior
Departamento de Microbiologia e
Imunologia
Instituto de Biociências - UNESP
Distrito de Rubião Júnior s/n
CEP 18618-000/ Botucatu/ SP /Brasil
Tel. 14 3880.0412/0413
O diagnóstico laboratorial das doenças
infecciosas começa com a indicação clínica
adequada do exame microbiológico, o que
requer conhecimento da epidemiologia e da
fisiopatologia do processo infeccioso.
Diagnóstico microbiológico
requer o conhecimento e a colaboração
de vários profissionais
A coleta e o transporte da amostra são
etapas críticas na execução do exame
microbiológico.
A suspeita clínica do processo
infeccioso determinará o tipo de
amostra clínica que deve ser enviada
ao laboratório para confirmar,
estabelecer ou complementar o
diagnóstico clínico
Representação esquemática do fluxograma da
amostra clínica enviada para o exame
microbiológico
Identificação laboratorial de patógenos clínicos
(Fase analítica)
Antibiograma
Auxiliar o clínico com a escolha do
antimicrobiano a prescrever para o
paciente
pois verifica se a bactéria pesquisada é
sensível ou resistente aos antimicrobianos
testados.
Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI),
Princípio da Diluição Princípio da Difusão
1.Métodos baseados na diluição da
droga
Diluição em caldo Concentração
Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM)
Diluição em meio de cultura sólido
CIM
Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio)
Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos
agentes antimicrobianos e envolve a preparação de
diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por
exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/mL) em um meio de cultura líquido,
o qual permitirá o crescimento bacteriano.
Determinação da CIM pelo método da diluição em
caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.
Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)
Apresentação de uma
placa utilizada no
teste de microdiluição,
após sua inoculação e
incubação.
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 µg/mL
Controles
positivos
2.Métodos baseados na difusão da
droga
Princípio do método de Kirby - Bauer
Parâmetros a serem padronizados: meio
de cultura, discos, inoculação do germe
no meio, incubação das placas, leitura e
interpretação
a.Controle de qualidade
Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão)
Permite crescimento satisfatório da maioria dos
germes não fastidiosos;
Não interfere com a atividade da droga
(Ex.: peptonas – sulfas; Mg++ - gentamicina; Ca++,
Fe++, Mg++ - tetraciclinas)
São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico)
com camada do meio de 6 mm de espessura
Método de Kirby-Bauer
Inóculo (Padronizado)
Preparo: Transferir para um tubo com BHI
(Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria
em estudo; incubar a 37oC; obter densidade
equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5
(1,5 x 108 UFC/mL)
Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o
correspondente a turvação mostrada em
solução contendo 0,5 mL de BaCl2 a 1% em
99,5 mL de solução de ácido sulfúrico a 1%)
0,5 1,0 2,0 3,0
Tubos da escala de McFarland
posicionados em frente do cartão de
Wickerham. Comparação da escala 0,5 de McFarland com
suspensão bacteriana
(E. coli ATCC 25922)
Semeadura: Swab estéril; retirar excesso
de caldo e semear na superfície do meio
uniformemente; secar em temperatura
ambiente por 3 a 5 minutos.
Importante: número de colônias
utilizadas (várias); material contaminado
com flora normal (não usar colônias
provenientes de meios de
enriquecimento); variações na densidade
do inóculo possibilitam variações também
no tamanho do halo de inibição
Discos
Aplicação: pressionar levemente contra a
superfície do meio e pelo menos 2 cm da
borda da placa e a pelo menos 3 cm um
do outro (evitar halos de inibição em
fusão); usar apenas um disco de cada
grupo de drogas (concentração única)
Características: papel de filtro adequado;
concentração de droga suficiente; prazo
de validade; controle de eficiência
Incubação das Placas
Em temperatura (37oC) e atmosfera
adequada para o crescimento da
bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10%
de CO2)
Atmosfera influi na atividade das drogas:
tetraciclina, meticilina e novobiocina –
CO2; estreptomicina e canamicina -
anaerobiose
Leitura das Placas
Após 18-24 horas de incubação; usar
compasso ou régua para determinar o
diâmetro do halo de inibição; colônias
dentro do halo sugerem mutantes
resistentes ou contaminantes.
Halo de
leitura em
mm
Interpretação
resistente, moderadamente resistente ou
sensível, de acordo com o halo de
inibição;
há correlação inversa entre concentração
inibitória mínima e diâmetro do halo de
inibição.
Curva de regressão linear da correlação entre a
CIM e o halo de inibição.
Kirby e Bauer – Método dos discos
Halo de inibição (mm)
Resistente Intermediário Sensível
CIM
(µ
g/m
L)
Etest® ( teste da elipse = Episilometer test)
--lactamaseslactamases do Grupo 1 (do Grupo 1 (AmpCAmpC))
Apresentação do Etest® para avaliação da CIM após
incubação
Área de
Crescimento
bacteriano
Fita graduada
de material
impermeável
“Elipse de
inibição”
Concentração
Inibitória Mínima
(CIM)
Muito obrigado!!!!