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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

Renata Dalcol Mazaro

SÍTIOS ANATÔMICOS INCOMUNS E APRESENTAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS POUCO FREQUENTES

DO LINFOMA EM CÃES

Santa Maria, RS 2018

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Renata Dalcol Mazaro

SÍTIOS ANATÔMICOS INCOMUNS E APRESENTAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS POUCO FREQUENTES DO LINFOMA EM CÃES

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Patologia e Patologia Clínica Veterinária.

Orientador: Prof. Dr. Rafael Almeida Fighera

Santa Maria, RS 2018

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Renata Dalcol Mazaro

SÍTIOS ANATÔMICOS INCOMUNS E APRESENTAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS POUCO FREQUENTES DO LINFOMA EM CÃES

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Patologia e Patologia Clínica Veterinária.

Aprovado em 05 de fevereiro de 2018:

__________________________________ Rafael Almeida Fighera, Dr. (UFSM)

(Presidente/Orientador)

__________________________________ Alexandre Krause, Dr. (UFSM)

__________________________________ Eduardo Kenji Masuda, Dr. (Axys Análises)

Santa Maria, RS 2018

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AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha família pelo apoio incondicional e por entender a minha ausência.

Ao meu orientador, professor e amigo Rafael Fighera, obrigada pela amizade,

paciência, dedicação, orientação, exemplo de Médico Veterinário e por estar sempre

disposto a ensinar.

À equipe Fighera, Alana Herbichi, Douglas Lorensetti e especialmente à Flavia

Serena da Luz, obrigada pela parceria de sempre, pela amizade e pela ajuda na

“famigerada imuno-histoquímica”.

Ao Professor Bruno Cogliati e sua orientada Isis Rizkallah, obrigada pela

hospitalidade e pela disponibilidade para comigo, foi uma bela parceria e,

certamente, mais “frutos virão”.

Ao Professor Flávio De La Corte, obrigada pela amizade, pelo apoio e exemplo

profissional.

E a todos que de alguma forma contribuíram para que esse trabalho fosse realizado,

o meu mais sincero agradecimento.

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“Algumas pessoas acham que foco

significa dizer sim para “a coisa” em que

você irá se focar, mas não é nada disso.

Significa dizer não às centenas de outras

boas idéias que existem. Você precisa

selecionar cuidadosamente.”

(Steve Jobs)

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RESUMO

SÍTIOS ANATÔMICOS INCOMUNS E APRESENTAÇÕES ANATOMOPATOLÓGICAS POUCO FREQUENTES DO LINFOMA EM CÃES

AUTORA: Renata Dalcol Mazaro ORIENTADOR: Rafael Almeida Fighera

Esta dissertação envolveu o estudo retrospectivo de diferentes tipos anatomopatológicos de linfoma que foram diagnosticados no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria entre os anos de 1965 e 2017. De um total de 100 cães com linfoma, em 16 (16% dos casos) os achados macroscópicos e/ou histopatológicos permitiram admitir, a partir da literatura internacional, que se tratavam de casos não tradicionalmente descritos, incluindo: linfoma folicular (5/100 [5%]), linfoma de células T periférico inespecífico (2/100 [2%]), linfoma angiocêntrico (2/100 [2%]), linfoma intravascular de grandes células T (2/100 [2%]), granulomatose linfomatoide (2/100 [2%]), linfoma de grandes células anaplásicas (1/100 [1%]), linfoma hepatoesplênico de células T (1/100 [1%]) e linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário (1/100 [1%]). O objetivo desta dissertação foi estudar mais detalhadamente esses casos, para que com os resultados aqui expressos, patologistas veterinários venham a reconhecer tais formas atípicas de linfoma. Este estudo resultou em quatro trabalhos científicos (dois artigos e dois relatos de caso) intitulados: 1) Sítios anatômicos incomuns e apresentações anatomopatológicas pouco frequentes do linfoma em cães, 2) Aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do linfoma folicular em cães, 3) Linfoma intravascular de grandes células T em dois cães, e 4) Reticulose pagetoide em um cão. Palavras-chave:linfomas raros, linfomas não tradicionais, linfomas atípicos

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ABSTRACT

UNCOMMON ANATOMICAL SITES AND NON-TRADITIONAL ANATOMOPATHOLOGICAL PRESENTATIONS OF LYMPHOMA IN DOGS

AUTHOR: Renata Dalcol Mazaro ADVISOR: Rafael Almeida Fighera

This dissertation involved the retrospective study of different anatomopathological types of lymphoma that were diagnosed in the Laboratório de Patologia Veterinária of the Universidade Federal de Santa Maria between 1965 and 2017. Of a total of 100 dogs with lymphoma, 16 (16% of cases), the macroscopic and/or histopathological findings allowed us to admit, from the international literature, that they were cases not traditionally described: follicular lymphoma, (5/100 [5%]), peripheral T-cell lymphoma, nonspecific (2/100 [2%]), angiocentric lymphoma (2/100 [2%]), intravascular large T-cell lymphoma (2/100 [2%]), lymphomatoid granulomatosis (1/100 [1%]), anaplastic large cell lymphoma (1/100 [1%]), hepatosplenic T-cell lymphoma (1/100 [1%]) and small lymphocytic lymphoma – intermediate type (1/100 [1%]).Further study of these cases was the objective of this dissertation, so that with the results expressed herein, veterinary pathologists will recognize such “atypical lymphomas". This study resulted in four scientific papers (two articles and two case reports) that are part of this dissertation: 1) Uncommon anatomical sites and non-traditional anatomopathological presentations of lymphoma in dogs, 2) Epidemiological, clinical and pathological aspects of follicular lymphoma in dogs, 3) Intravascular large T-cell lymphoma in two dogs, and 4) Pagetoid reticulosis in a dog.

Keywords: rare lymphomas, non-traditional lymphomas, atypical lymphomas.

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SUMÁRIO

1 APRESENTAÇÃO............................................................................................. 9 1.1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 9 1.2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 13 2 ARTIGO 1 – Sítios anatômicos incomuns e apresentações anatomopatológicas pouco frequentes do linfoma em cães..........................

16

3 ARTIGO 2 – Aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do linfoma folicular em cães..............................................................................

53

4 ARTIGO 3 – Linfoma intravascular de grandes células T em dois cães 69 5 ARTIGO 4 – Reticulose pagetoide em um cão.............................................. 86 6 DISCUSSÃO...................................................................................................... 97 7 CONCLUSÕES.................................................................................................. 99 8 REFERÊNCIAS................................................................................................. 100

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1 APRESENTAÇÃO

1.1 INTRODUÇÃO

O linfoma, previamente linfossarcoma, é um neoplasma maligno originário de

linfócitos B, de linfócitos T ou de células nulas (linfócitos não B e não T [células

natural killer{NK}]), que, com exceção da medula óssea, emerge mais comumente

de órgãos/tecidos hematopoiéticos, incluindo os linfonodos, o baço, e o tecido

linfoide associado à mucosa (MALT) (FIGHERA et al., 2002; VALLI, 2007;

SWERDLOW et al., 2008; VEZALLI et al., 2009; PONCE et al., 2010). Em cães, a

prevalência anual do linfoma nos Estados Unidos é de 13 a 24 casos para cada

100.000 cães por ano (DORN et al., 1987). Na Europa, o linfoma perfaz 20,1% dos

cânceres em machos e 8,4% dos cânceres em fêmeas (MERLO et al., 2008). No

Brasil, o linfoma representa 8,8% de todos os cânceres que acometem cães, vistos à

necropsia, e perfaz 1% das causas de morte ou razões para eutanásia nessa

espécie animal (FIGHERA, 2008), sendo mais importante em machos (13% dos

tumores responsáveis por morte espontânea ou eutanásia) do que em fêmeas (6%

dos tumores responsáveis por morte espontânea ou eutanásia) (FLORES, 2016).

Em cães, o linfoma pode ser classificado segundo diferentes critérios, no

entanto, a classificação anatômica é uma das mais reconhecidas em medicina

veterinária, pois os sinais clínicos e os achados macroscópicos de necropsia

refletem a forma anatômica das massas tumorais, permitindo relacioná-los

diretamente às disfunções específicas de cada órgão afetado (COUTO, 2010;

FIGHERA & GRAÇA, 2016; RODRIGUES, 2014; VAIL et al., 2013). Quanto à

histopatologia, atualmente, a classificação para o linfoma em cães obedece às

normas da Organização Mundial da Saúde (OMS) fundamentada nos critérios

histológicos da Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms

(REAL) (VALLI et al. 2002).

A forma mais comum de apresentação do linfoma em cães é caracterizada pelo

acometimento generalizado dos linfonodos superficiais e/ou profundos

(linfadenopatia generalizada), concomitante ou não ao envolvimento do baço, do

fígado e, menos frequentemente, das tonsilas e da medula óssea (linfoma

multicêntrico) (VAIL, 2004; COUTO, 2010; HELFAND & KISSEBERTH, 2010; FRY &

MCGAVIN, 2012; VAIL et al., 2013; FIGHERA & GRAÇA, 2016).

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Macroscopicamente, nessa forma de apresentação, os linfonodos estão difusamente

aumentados de volume (linfadenomegalia), brancacentos ou variavelmente

avermelhados, macios e suculentos, não permitindo a delimitação corticomedular à

superfície de corte (padrão difuso) (VAIL, 2004; COUTO, 2010; HELFAND &

KISSEBERTH, 2010; FRY & MCGAVIN, 2012; VAIL et al., 2013; FIGHERA &

GRAÇA, 2016). O baço e o fígado demonstram aumento de volume de forma difusa

(hepatoesplenomegalia difusa) (HELFAND & KISSEBERTH, 2010; FRY &

MCGAVIN, 2012; FIGHERA & GRAÇA, 2016). Quando as tonsilas são afetadas,

perdem sua conformação pregueada e se destacam como massas bilateralmente

simétricas e não ulceradas (tonsilomegalia difusa) (FIGHERA & GRAÇA, 2016).

Evidenciando o estádio final do linfoma, linfócitos neoplásicos liberados a partir dos

órgãos afetados podem colonizar a medula óssea, dando origem ao acometimento

medular (FIGHERA & GRAÇA, 2016).

A segunda forma de apresentação do linfoma mais frequentemente vista em

cães ocorre quando há aumento difuso dos linfonodos do trato gastrointestinal (TGI),

mais frequentemente, mas não somente, dos linfonodos mesentéricos

(linfadenomegalia localizada), com padrão de lesão macroscópica semelhante ao o

que foi descrito anteriormente, e/ou quando segmentos do TGI apresentam nódulos

de infiltração transmural (da mucosa em direção à serosa) ou espessamento

segmentar a difuso da mucosa ou da submucosa (linfoma alimentar) (VAIL, 2004;

COUTO, 2010; HELFAND & KISSEBERT, 2010; FRY & MCGAVIN, 2012; VAIL et

al., 2013; FIGHERA & GRAÇA, 2016). Secundariamente, devido à progressão do

neoplasma, o fígado e os linfonodos regionais podem ser afetados (FRY &

MCGAVIN, 2012).

A terceira forma de apresentação do linfoma em cães, envolve os linfonodos

mediastínicos e/ou o timo (VAIL, 2004; COUTO, 2010; HELFAND & KISSEBERTH,

2010; FRY & MCGAVIN, 2012; VAIL et al., 2013; FIGHERA & GRAÇA, 2016). Os

linfonodos aparecem difusamente aumentados de volume com padrão macroscópico

idêntico ao o que já foi descrito ou há apenas uma grande massa tumoral

homogeneamente branco-amarelada e macia ocupando o mediastino e, por vezes,

grande parte ou toda a cavidade torácica (linfoma mediastínico) (HELFAND &

KISSEBERTH, 2010; FRY & MCGAVIN, 2012; VAIL et al., 2013; FIGHERA &

GRAÇA, 2016).

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A quarta forma de apresentação do linfoma, todavia, menos observada em cães,

acomete a pele na forma de um quadro eritrodérmico e esfoliativo que evolui para

máculas ou manchas, placas ou nódulos múltiplos, disseminados pelo tronco ou

localizados na cabeça concomitante ou não à ulceração da cavidade oral e

despigmentação mucocutânea (linfoma cutâneo epitelitrópico [linfoma extranodal

cutâneo]) (FONTAINE et al. 2010; MOORE et al. 2009; RISSE & BAUMGARTNER,

2000). Menos frequentemente há uma forma cutânea caracterizada pela presença

de placas, pápulas, nódulos ou massas, solitárias, vermelhas ou arroxeadas,

frequentemente ulceradas e crostosas, com distribuição aleatória pela superfície

corporal (linfoma cutâneo não epiteliotrópico [linfoma extranodal cutâneo]) (DAY,

1995; BOSSCHERE & DECLERCQ, 2008;MOORE et al. 2013).

Quanto à histopatologia do linfoma canino, o padrão arquitetural difuso é

predominante sobre o padrão nodular, representando entre 87,7% e 98,8% dos

casos diagnosticados na literatura, permitindo afirmar que o linfoma folicular, tão

comum em humanos, é uma raridade em cães (SUEIRO et al., 2004;

ARESPACOCHAGA et al., 2007; VEZZALI et al., 2009; PONCE et al., 2010).

Baseando-se nos diferentes sistemas de classificação para o linfoma, uma grande

variedade microscópica de tipos e subtipos tem sido descrita (VALLI et al., 2017).

Porém,a maior parte dos linfomas já diagnosticados em cães é representada por

cinco tipos e/ou subtipos de linfomas reconhecidos, segundo os critérios histológicos

estabelecidos pela OMS para a classificação dos tumores hematopoiéticos em

animais (VALLI et al., 2002), como: 1) linfomas difusos de grandes células B (47%

[PONCE et al., 2010] a 54,4% [VEZZALI et al., 2009]), que incluem os linfomas

centroblástico, imunoblástico e de células B rico em células T/histiócitos, 2) linfoma

de células T periférico inespecífico (6,8% [VEZZALI et al., 2009] a 13,6% [PONCE et

al., 2010]), 3) linfomas da zona marginal (10,8% [PONCE et al., 2010]), 4) linfomas

linfoblásticos (2,8% [PONCE et al., 2010] a 10,7% [VEZZALI et al., 2009]), que

podem ser oriundos de célulasB ou T, e 5) linfomas linfocíticos de pequenas células

B (1,8% [PONCE et al., 2010] a 7,8% [VEZZALI et al., 2009]), que incluem o linfoma

linfocítico crônico e o linfoma linfoplasmocítico (“imunocitoma”).

Baseado nas informações previamente descritas, patologistas veterinários que

atuam na área de diagnóstico de doenças de cães irão frequentemente deparar-se

com casos de linfoma, principalmente multicêntrico, e ocasionalmente alimentar,

mediastínico e extranodal cutâneo. Entretanto, mais raramente, esses mesmos

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patologistas poderão encontrar em suas rotinas casos inusitados de linfoma, nos

quais: 1) apenas um único órgão linfoide, que não o linfonodo, é afetado (linfoma

solitário), 2) um ou mais órgãos não linfoides são acometidos (linfoma extranodal), 3)

uma combinação pouco comum de órgãos linfoides e não linfoides (linfoma misto) é

observada, ou 4) uma apresentação macroscópica do linfoma diferente do que tem

sido tradicionalmente descrito na literatura, ou seja, linfomas que não ocorrem como

“organomegalias difusas”. Geralmente, esses casos refletem uma microscopia

distinta, que nada lembra os tradicionais padrões histopatológicos anteriormente

considerados como frequentes para a espécie (linfoma difuso de grandes células B,

linfoma de células T periférico inespecífico, linfoma da zona marginal, linfoma

linfoblástico, linfoma linfocítico de pequenas células. Assim, linfomas que ocorrem

em sítios anatômicos incomuns e/ou que se apresentam anatomopatologicamente

(macroscopicamente e/ou histopatologicamente) de forma infrequente são descritos

na literatura médica e veterinária, de acordo com cada autor, pelos adjetivos “não

tradicionais”, “raros” ou “atípicos”. Dessa forma, o objetivo deste trabalho é

demonstrar aos patologistas veterinários interessados em oncopatologia canina que,

embora tais linfomas não sejam muito prevalentes, eles ocorrem, e seu

reconhecimento é fundamental para uma boa condução diagnóstica em suas rotinas

de necropsia ou patologia cirúrgica.

A metodologia, resultados, discussão e conclusões que fazem parte desta

Dissertação são apresentados a seguir na forma de quatro trabalhos científicos (dois

artigos e dois relatos de caso).

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1.2 REVISÃO DE LITERATURA

O linfoma canino pode ser classificado segundo a localização anatômica

(COUTO, 2010; FIGHERA & GRAÇA, 2016; VAIL, 2004), o estadiamento clínico

(VAIL, 2004), o fenótipo microscópico (histopatológico ou citopatológico) (CARTER

et al., 1986; MESSICK & MAYS, 2000; PONCE et al., 2010; VEZZALI et al., 2009) e

o imunofenótipo (VALLI et al. 2002). A classificação anatômica é bastante utilizada

em medicina veterinária, pois os sinais clínicos e os achados macroscópicos de

necropsia refletem a forma anatômica das massas tumorais, permitindo relacioná-los

diretamente às disfunções específicas de cada órgão afetado (COUTO, 2010;

FIGHERA & GRAÇA, 2016; RODRIGUES, 2014; VAIL et al., 2013). A classificação

fenotípica segue critérios pré-estabelecidos para os linfomas de humanos (VALLI et

al., 2002).

Alguns autores classificam o linfoma, conforme os sítios anatômicos

propostos pela OMS, incluindo as formas multicêntrica, alimentar, tímica, cutânea e

uma denominada como “outras regiões” (RODRIGUES, 2014; VAIL et al., 2013).

Outros autores utilizam uma variação dessa classificação, que reconhece quatro

apresentações, ou seja, multicêntrica, alimentar, mediastínica e extranodal; nesse

caso, a apresentação extranodal é vista como um tumor solitário que pode afetar

qualquer órgão ou tecido não hematopoiético, mas ocorrendo principalmente na

pele, nos rins e no canal vertebral (COUTO, 2010; FIGHERA & GRAÇA, 2016).

Fighera & Graça (2016) e Jain (1986) incluem ainda a apresentação leucêmica, não

como uma forma anatômica, mas como o estádio final do linfoma de qualquer uma

das formas anatômicas. Primeiramente ocorre a colonização da medula óssea por

linfócitos neoplásicos, liberados a partir dos órgãos afetados, dando origem ao

acometimento medular; a partir da medula linfomatosa, linfócitos neoplásicos podem

ganhar a circulação, tal fenômeno é descrito como linfoma leucêmico, leucemia das

células do linfoma, linfoma em fase leucêmica ou leucemização do linfoma e difere

essencialmente da leucemia linfoide verdadeira por não ter se originado inicialmente

da medula óssea (FIGHERA & GRAÇA, 2016).

O linfoma canino apresenta similaridades ao linfoma humano, referentes à

morfologia, comportamento biológico e resposta à terapia (VALLI et al., 2002). Por

este motivo, classificações microscópicas do linfoma humano tem sido adaptadas

para o linfoma canino (CARTER et al., 1986; MESSICK & MAYS, 2000; PONCE et

14

al., 2010; VEZZALI et al., 2009), dentre elas destacam-se a de Rappaport

(RAPPAPORT et al., 1956), a de Lukes-Collins (LUKES & COLLINS, 1974), o

sistema Kiel (LENNERT et al., 1975), a Working Formulation of Non-Hodgkin’s

Lymphomas for Clinical Usage (WF) (ROSENBERG et al., 1982) e a Revised

European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL) (HARRIS et al.,

1994).

Modernamente a classificação da OMS tanto para o linfoma em humanos,

como para o linfoma em animais obedece às normas do sistema REAL

(SWERDLOW et al., 2008; VALLI et al., 2016). Essa classificação divide os linfomas

em entidades clínicas agrupadas de acordo com as manifestações clinicopatológicas

e com a origem dos linfócitos neoplásicos (HARRIS et al., 1994; VALLI et al., 2002).

Atualmente, a classificação utilizada pela maioria dos patologistas veterinários é

baseada em uma modificação da WF (ROSENBERG et al., 1982), que subdivide os

linfomas de acordo com o índice mitótico, o padrão de distribuição do neoplasma

nos linfonodos, o tamanho das células e a forma do seu núcleo (FIGHERA &

GRAÇA, 2016; MESSICK & MAYS, 2000).

Inúmeras são as teorias propostas para o desenvolvimento do linfoma em

cães, no entanto, sua etiologia ainda permanece indeterminada (GROSS et al.,

2005; HAYES et al., 1991; MOORE & OLIVRY, 1994; SAFRAN et al., 1992;

SANTORO et al., 2007). A possibilidade de uma origem viral já foi descrita, todavia,

nenhuma prova substancial que pudesse comprovar tal associação foi até hoje

encontrada (SAFRAN et al., 1992). Na medicina humana a associação entre o

linfoma cutâneo e a inflamação crônica da pele tem sido frequentemente relatada,

especialmente nos casos de dermatite atópica (VAN HASELEN et al., 1999). Uma

análise retrospectiva realizada em 19 cães com linfoma cutâneo sugere essa mesma

associação, contudo, a fim de confirmar este achado e de investigar os mecanismos

patogênicos envolvidos nesta associação, um estudo prospectivo que inclua um

maior número de indivíduos se faz necessário (SANTORO et al., 2007). Ainda neste

contexto, em cães, semelhantemente ao o que ocorre em humanos, a exposição aos

agrotóxicos é uma possível explicação para o desenvolvimento do linfoma (HAYES

et al., 1991). Contrariamente a essa teoria, outro estudo realizado pelo mesmo grupo

de pesquisadores revelou a ausência de efeitos carcinogênicos em cães, após

exposição a um herbicida, cujo princípio ativo é o 2,4 diclorofenoxiacético (HAYES et

al., 1995). Assim, mais estudos são necessários para elucidar o papel potencial dos

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agrotóxicos no desenvolvimento do linfoma cutâneo, pois tanto em cães como em

humanos, os resultados são bastante controversos.

Os gases e aerossóis presentes no ar têm sido estudados como fatores

contribuintes ao desenvolvimento de linfoma em humanos e, mais recentemente, em

cães (KIMURA, 2012; RAMIS et al., 2009). A aspiração com consequente absorção

desses compostos pode levar ao acúmulo de mutações nas células e uma

transformação celular maligna (COCHRANE, 1991). Porém, novas investigações são

indispensáveis para esclarecer a suposta relação entre a poluição atmosférica e o

desenvolvimento de linfoma.

Há alguns anos, a imuno-histoquímica tem sido aplicada no auxílio ao

diagnóstico de neoplasmas hematopoiéticos, tanto em humanos, como em cães

(DAY, 1995; HARRIS et al., 1994; RISBON et al., 2006). Os anticorpos mais

frequentemente utilizados para determinar a origem das células neoplásicas que

compõe os linfomas em cães são CD3 para linfócitos T e CD79 para linfócitos B

(GOCKE, 2006; RISBON et al., 2006). Em algumas circunstâncias, CD4 e CD8 são

utilizados para comprovar uma origem T para os linfócitos neoplásicos (VAIL et al.,

2013).

16

2 ARTIGO 1 –

Artigo a ser submetido para a revista Pesquisa Veterinária Brasileira

Sítios anatômicos incomuns e apresentações anatomopatológicas pouco frequentes do linfoma em cães1

Renata D. Mazaro2, Flávia S. da Luz2, Alana P. Herbichi3, Douglas M. Lorensetti3, Rafael A. Fighera4

ABSTRACT.-Mazaro R.D., Luz F.S., Herbichi A., Lorensetti D.M & Fighera R.A. 2018. [Uncommon anatomical sites and non-traditional anatomopathological presentations of lymphoma in dogs]. Sítios anatômicos incomuns e apresentações anatomopatológicas pouco frequentes do linfoma em cães. Pesquisa Veterinária Brasileira 00 (0): 00-00. Departamento de Patologia, Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima 1000, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: anemiaveterinaria@yahoo.com.br Lymphomas in dogs are the most associated tumors to death or euthanasia of dogs in most of the world. In this animal species they occur almost always as a disseminated disease (multicentric lymphoma), gastrointestinal (alimentary lymphoma) or nodal mediastinal (mediastinal lymphoma), however, occasionally, other presentations much less common can be found. Thus, the purpose of this article is to establish the prevalence of these unusual types of lymphoma and to demonstrate to veterinary pathologists how they present pathologically. From a total of 100 cases of lymphoma in dogs diagnosed between 1965 and 2017, 16 cases (16/100 [16%]) were considered by us as non-traditional presentations of the disease: follicular lymphoma, (5/100 [5%]), peripheral T-cell lymphoma, nonspecific (2/100 [2%]), angiocentric lymphoma (2/100 [2%]), intravascular large T-cell lymphoma (2/100 [2%]), lymphomatoid granulomatosis (1/100 [1%]), anaplastic large cell lymphoma (1/100 [1%]), hepatosplenic T-cell lymphoma (1/100 [1%]) and small lymphocytic lymphoma – intermediate type (1/100 [1%]). We hope that the results demonstrated here will help veterinary pathologists to recognize such cases of "atypical lymphomas" in their anatomopathological routines. INDEX TERMS: rare lymphomas, non-traditional lymphomas, atypical lymphomas.

1Recebido em .................................................... Aceito para publicação em .............................................. 2Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, área de concentração em Patologia e Patologia Clínica Veterinária, Centro de Ciências Rurais (CCR), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900, Brasil. 3Curso de Medicina Veterinária, CCR-UFSM, Santa Maria, RS. Bolsista PROBIC/FAPERGS/UFSM e PIBIC/CNPq/UFSM, respectivamente 4Departamento de Patologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS), UFSM, Av. Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900. Autor para correspondência: anemiaveterinaria@yahoo.com.br

RESUMO.-Linfomas em cães são os tumores mais associados a morte ou eutanásia de cães na maior parte do mundo. Nessa espécie animal ocorrem quase sempre como uma doença disseminada (linfoma multicêntrico), gastrointestinal (linfoma alimentar) ou nodal mediastinal (linfoma mediastínico), entretanto, ocasionalmente, outras apresentações bem menos comuns podem ser encontradas. Dessa forma, o objetivo deste artigo é estabelecer a prevalência desses pouco usuais tipos de linfoma e demonstrar aos patologistas veterinários como eles se apresentam anatomopatologicamente. De um total de 100 casos de linfoma em cães diagnosticados entre os anos de 1965 e 2017, 16 casos (16/100 [16%]) foram considerados como apresentações não tradicionais da doença: linfoma folicular (5/100 [5%]), linfoma de células T periférico inespecífico (2/100 [2%]), linfoma angiocêntrico (2/100 [2%]), linfoma intravascular de grandes células T (2/100 [2%]), granulomatose linfomatoide (2/100 [2%]), linfoma de grandes células anaplásicas (1/100 [1%]), linfoma hepatoesplênico de células T (1/100 [1%]) e linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário (1/100 [1%]). Esperamos que os resultados aqui demonstrados auxiliem patologistas veterinários a reconhecerem tais casos de “linfomas atípicos” em suas rotinas anatomopatológicas.

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TERMOS DE INDEXAÇÃO: linfomas raros, linfomas não tradicionais, linfomas atípicos.

INTRODUÇÃO O linfoma é um neoplasma maligno originário de linfócitos B, de linfócitos T ou de células nulas (linfócitos não B e não T [células natural killer {NK}]), que, com exceção da medula óssea, emerge mais comumente de órgãos/tecidos hematopoiéticos, incluindo os linfonodos, o baço, e o tecido linfoide associado à mucosa (MALT) (Fighera et al., 2002, Valli 2007, Swerdlow et al. 2008, Vezzali et al. 2009, Ponce et al. 2010). Em cães, a prevalência anual do linfoma nos Estados Unidos é de 13 a 24 casos para cada 100.000 cães por ano (Dorn et al. 1987). Na Europa, o linfoma perfaz 20,1% dos cânceres em machos e 8,4% dos cânceres em fêmeas (Merlo et al. 2008). No Brasil, o linfoma representa 8,8% de todos os cânceres que acometem cães, vistos à necropsia, e perfaz 1% das causas de morte ou razões para eutanásia nessa espécie animal (Fighera 2008), sendo mais importante em machos (13% dos tumores responsáveis por morte espontânea ou eutanásia) do que em fêmeas (6% dos tumores responsáveis por morte espontânea ou eutanásia) (Flores 2016).

Em cães, o linfoma pode ser classificado segundo diferentes critérios, no entanto, a classificação anatômica é uma das mais reconhecidas em medicina veterinária, pois os sinais clínicos e os achados macroscópicos de necropsia refletem a forma anatômica das massas tumorais, permitindo relacioná-los diretamente às disfunções específicas de cada órgão afetado (Couto 2010, Fighera & Graça 2016, Vail et al. 2013). Quanto à histopatologia, atualmente a classificação para o linfoma em cães obedece às normas da Organização Mundial da Saúde (OMS) fundamentada nos critérios histológicos da Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL) (Valli et al. 2002).

A forma mais comum de apresentação do linfoma em cães é caracterizada pelo acometimento generalizado dos linfonodos superficiais e/ou profundos (linfadenopatia generalizada), concomitante ou não ao envolvimento do baço, do fígado e, menos frequentemente, das tonsilas e da medula óssea (linfoma multicêntrico) (Vail 2004, Couto 2010, Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Vail et al. 2013, Fighera & Graça 2016). Macroscopicamente, nessa forma de apresentação, os linfonodos estão difusamente aumentados de volume (linfadenomegalia), brancacentos ou variavelmente avermelhados, macios e suculentos, não permitindo a delimitação corticomedular à superfície de corte (padrão difuso) (Vail 2004, Couto 2010, Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Vail et al. 2013, Fighera & Graça 2016). O baço e o fígado demonstram aumento de volume de forma difusa (hepatoesplenomegalia difusa) (Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Fighera & Graça 2016). Quando as tonsilas são afetadas, perdem sua conformação pregueada e se destacam como massas bilateralmente simétricas e não ulceradas (tonsilomegalia difusa) (Fighera & Graça 2016). Evidenciando o estádio final do linfoma, linfócitos neoplásicos liberados a partir dos órgãos afetados podem colonizar a medula óssea, dando origem ao acometimento medular (Fighera & Graça 2016).

A segunda forma de apresentação do linfoma mais frequentemente vista em cães ocorre quando há aumento difuso dos linfonodos mesentéricos (linfadenomegalia localizada), com padrão de lesão macroscópica semelhante ao o que foi descrito anteriormente, e/ou quando segmentos do trato gastrointestinal (TGI) apresentam nódulos de infiltração transmural (da mucosa em direção à serosa) ou espessamento segmentar a difuso da mucosa ou da submucosa (linfoma alimentar) (Vail 2004, Couto 2010, Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Vail et al. 2013, Fighera & Graça 2016). Secundariamente, devido à progressão do neoplasma, o fígado e os linfonodos regionais podem serafetados (Fry & McGavin 2012).

A terceira forma de apresentação envolve os linfonodos mediastínicos e/ou o timo (Vail 2004, Couto 2010, Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Vail et al. 2013, Fighera & Graça 2016). Os linfonodos aparecem difusamente aumentados de volume com padrão macroscópico idêntico ao o que já foi descrito ou há apenas uma grande massa tumoral homogeneamente branco-amarelada e macia ocupando o mediastino e, por vezes, grande parte da cavidade torácica (linfoma mediastínico) (Helfand & Kisseberth 2010, Fry & McGavin 2012, Vail et al. 2013, Fighera & Graça 2016).

A quarta forma de apresentação do linfoma, todavia, menos observada em cães, acomete a pele como um quadro eritrodérmico e esfoliativo, que evolui gradativa e sequencialmente para máculas ou manchas, placas ou nódulos múltiplos, disseminados pelo tronco ou localizados na cabeça, concomitante ou não à ulceração da cavidade oral e despigmentação mucocutânea (linfoma cutâneo epitelitrópico [linfoma extranodal cutâneo]) (Fontaine et al. 2010, Moore et al. 2009, Risse & Baumgartner 2000). Menos frequentemente, há uma forma cutânea caracterizada pela presença de placas, pápulas, nódulos ou massas, solitárias, vermelhas ou arroxeadas, frequentemente ulceradas e crostosas, com distribuição aleatória pela superfície corporal (linfoma cutâneo não epiteliotrópico [linfoma extranodal cutâneo]) (Day 1995, Bosschere & Declercq 2008, Moore et al. 2013).

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Quanto à histopatologia do linfoma canino, o padrão arquitetural difuso é predominante sobre o padrão nodular, representando entre 87,7% e 98,8% dos casos diagnosticados na literatura, permitindo afirmar que o linfoma folicular, tão comum em humanos, é raro em cães (Sueiro et al. 2004, Arespacochaga et al. 2007, Vezzali et al. 2009, Ponce et al. 2010). Baseando-se nos diferentes sistemas de classificação para o linfoma, uma grande variedade microscópica de tipos e subtipos tem sido descrita (Valli et al. 2017). Porém, a maior parte dos linfomas já diagnosticados em cães é representada por cinco tipos e/ou subtipos de linfomas reconhecidos, segundo os critérios histológicos estabelecidos pela OMS para a classificação dos tumores hematopoiéticos em animais (Valli et al. 2002), como: 1) linfoma difuso de grandes células B (47% [Ponce et al. 2010] a 54,4% [Vezzali et al. 2009]), que incluem os linfomas centroblástico, imunoblástico e de células B rico em células T/histiócitos, 2) linfoma de células T periférico inespecífico (6,8% [Vezzali et al. 2009] a 13,6% [Ponce et al. 2010]), 3) linfoma da zona marginal (10,8% [Ponce et al. 2010]), 4) linfoma linfoblástico (2,8% [Ponce et al. 2010] a 10,7% [Vezzali et al. 2009]) que pode ser oriundo de células B ou T, e 5) linfoma linfocítico de pequenas células B (1,8% [Ponce et al. 2010] a 7,8% [Vezzali et al. 2009]), que inclui o linfoma linfocítico crônico e o linfoma linfoplasmocítico (“imunocitoma”).

Baseado nas informações previamente descritas, patologistas veterinários que atuam na área de diagnóstico de doenças de cães irão frequentemente deparar-se com casos de linfoma, principalmente multicêntrico, e ocasionalmente alimentar, mediastínico e extranodal cutâneo. Entretanto, mais raramente, esses mesmos patologistas poderão encontrar em suas rotinas casos inusitados de linfoma, nos quais: 1) apenas um único órgão linfoide, que não o linfonodo, é afetado (linfoma solitário), 2) um ou mais órgãos não linfoides são acometidos (linfoma extranodal), 3) uma combinação pouco comum de órgãos linfoides e não linfoides (linfoma misto) é observada, ou 4) uma apresentação macroscópica do linfoma diferente do que tem sido tradicionalmente descrito na literatura, ou seja, linfomas que não ocorrem como “organomegalias difusas”. Geralmente, esses casos refletem uma microscopia distinta, que nada lembra os tradicionais padrões histopatológicos anteriormente considerados como frequentes para a espécie (linfoma difuso de grandes células B, linfoma linfoblástico, linfoma linfocítico de pequenas células B, linfoma da zona marginal e linfoma de células T periférico inespecífico). Assim, linfomas que ocorrem em sítios anatômicos incomuns e/ou que se apresentam anatomopatologicamente (macroscopicamente e/ou histopatologicamente) de forma pouco frequente são descritos na literatura médica e veterinária, de acordo com cada autor, pelos adjetivos raros, não tradicionais ou atípicos. Dessa forma, o objetivo deste artigo é demonstrar aos patologistas veterinários interessados em oncopatologia canina que, embora tais linfomas não sejam muito prevalentes, eles ocorrem, e seu reconhecimento é fundamental para uma boa condução diagnóstica em suas rotinas de necropsia ou patologia cirúrgica.

MATERIAL E MÉTODOS

Para a obtenção dos casos de linfoma, foram revisados os laudos de necropsias realizadas em cães no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria (LPV-UFSM), entre os anos de 1965 e 2017. Para este estudo, foram considerados apenas casos em que a forma de apresentação do linfoma não era a observada classicamente, ou seja, incluía 1) sítios anatômicos incomumente afetados; 2) padrões macroscópicos pouco ou não descritos na literatura; e/ou 3) tipos ou subtipos histológicos de linfoma apenas ocasionalmente relatados em cães. Dos laudos selecionados para o estudo, foram coletadas informações macroscópicas e histopatológicas a cerca de cada caso. Quando possível, os casos foram reavaliados macroscopicamente por meio das imagens provenientes do Arquivo de Imagens do LPV-UFSM. Posteriormente, todos os casos foram reavaliados histologicamente, através da confecção de lâminas a partir do recorte dos tecidos embebidos em parafina com coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). O diagnóstico definitivo do tumor foi realizado com base nos critérios histológicos da OMS para a classificação dos tumores hematopoiéticos em humanos (Swerdlow et al. 2008), e para a classificação dos tumores hematopoiéticos em animais domésticos, publicados pelo Armed Forces Institute of Pathology (AFIP) (Valli et al. 2002).

A fim de determinar a origem dos linfócitos neoplásicos e com propósito de classificação, pelo menos um tecido acometido de cada um desses casos foi selecionado e submetido à técnica de imuno-histoquímica (IHQ). A técnica empregada foi a imunomarcação para linfócitos B, utilizando-se anticorpo para CD79(Clone JCB117, Dako Cytomatic, produzido em camundongo) ou para CD20 (RB9013-P, Thermo Scientific, produzido em coelho) e imunomarcação para linfócitos T, utilizando-se anticorpo para CD3 (Clone F7.2.38, Dako Cytomatic, produzido em camundongo). A técnica de imuno-histoquímica foi realizada conforme o protocolo descrito a seguir. Após a desparafinização e reidratação dos tecidos foi realizada a recuperação antigênica com solução de Tris-EDTA (pH 9,0) no forno de micro-ondas, em alta potência, por 10 minutos. Para realizar o bloqueio da peroxidase endógena foi utilizado peróxido de hidrogênio a 3% por 20 minutos. O bloqueio das reações inespecíficas foi realizadocom Protein Block por

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10 minutos em temperatura ambiente. Como anticorpo primário foram utilizados os anticorpos monoclonal anti-CD79 (pré-diluído) ou policlonal anti-CD20 (diluído 1:800 em diluente de anticorpo) (Scy Tek – ATG 125), e anticorpo monoclonal anti-CD3 (pré-diluído). Ambos os anticorpos foram incubados por 60 minutos em estufa a 37°C ou por 16 horas em geladeira a 7°C (overnight). O anticorpo secundário e o Polímero Reveal Complement e Reveal HRP Conjugate HRP foram utilizados consecutivamente, incubados a 25°C por 30 minutos e revelados através da adição do cromógeno tetracloreto de 3-3’ diaminobenzidina (DAB) por cinco minutos. A contra-coloração foi realizada com Hematoxilina de Harris. Linfonodos e tonsilas de cães foram utilizadas como controle positivo e negativo. O controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário, utilizando-se apenas o diluente de anticorpo ou solução de Tris-EDTA.

RESULTADOS

Todos os casos incluídos neste estudo ocorreram no Município de Santa Maria, localizado na Mesorregião do Centro Ocidental Rio-Grandense, 29°32’52’’ e 53°42’10’’ WGR, conhecida popularmente como Região Central do RS. Entre os anos de 1965 e 2017, foram necropsiados 9.020 cães no LPV-UFSM. Destes, 100 morreram ou foram submetidos à eutanásia e na necropsia foi diagnosticado linfoma. Dos 100 cães necropsiados, 16 casos (16/100 [16%]) foram considerados como apresentações incomuns ou raras de linfoma, caracterizando nove tipos e/ou subtipos histológicos de linfoma denominados como: linfoma folicular (5/100 [5%]), linfoma de células T periférico inespecífico (2/100 [2%]), linfoma angiocêntrico (2/100 [2%]), linfoma intravascular de grandes células T (2/100 [2%]), granulomatose linfomatoide (2/100 [2%]), linfoma de grandes células anaplásicas (1/100 [1%]), linfoma hepatoesplênico de células T (1/100 [1%]) e linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário (1/100 [1%]) (Quadro 1). Os achados anatomopatológicos acerca de cada caso são descritos a seguir.

Linfoma folicular

De todos os cães diagnosticados com linfoma (n=100), cinco (5/100 [5%]) corresponderam ao linfoma folicular. Todos os cães necropsiados apresentavam linfonodos superficiais e profundos difusa e acentuadamente aumentados de volume (linfadenomegalia generalizada), brancacentos a levemente avermelhados e macios ao toque. Ao corte, eram igualmente macios e deixavam fluir mínima quantidade de um líquido translúcido. A superfície de corte era úmida, brilhante, branca ou mosqueada de branco e vermelho, mas caracteristicamente pontilhada por dezenas a centenas de nódulos brancos, de tamanhos variáveis, multifocais ou coalescentes (padrão nodular), que não permitiam a delimitação corticomedular (Figura 1). Em todos os casos, o baço estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (esplenomegalia difusa), o que era evidenciado pelo arredondamento de suas bordas e pelo deslocamento em sua posição anatômica na cavidade abdominal. Três padrões macroscópicos foram identificados na superfície natural. Em um deles, observado em três dos cinco casos, a superfície era vermelha, lisa e repleta por miríades de pontos brancos, multifocais ou coalescentes, de tamanhos variáveis (padrão nodular). Em outro padrão, visto em um dos cinco casos, a superfície era homogeneamente vermelha e lisa, porém sem os pontos brancos descritos nos três casos anteriores. No último padrão, visto também em um dos cinco casos, a superfície era marcadamente irregular, salpicada de pontos brancos elevados hemisfericamente. Apesar desses três padrões distintos, à superfície de corte, o baço era sempre caracterizado por um pontilhado brancacento ou branco-rosado, brilhante ou vítreo, aleatório, multifocal ou coalescente, macroscopicamente semelhante ao descrito para hiperplasia difusa da polpa branca (Figura 1).

Na histopatologia, todos os casos apresentaram, tanto nos linfonodos como no baço, uma população densamente celular, com padrão de organização caracterizado por nódulos de dimensões variáveis, moderada ou marcadamente definidos, não encapsulados, com zona do manto ausente e sem estroma perceptível (Figura 2). Nos linfonodos, esses nódulos invadiam a cápsula e obliteravam os seios subcapsulares e peritrabeculares. Nódulos neoplásicos dispostos intimamente, septados ou não por finas trabéculas de tecido conjuntivo, se estendiam desde a região cortical até a região medular, substituindo quase que totalmente o parênquima, não sendo possível visualizar os folículos linfoides, incluindo a sua “polarização”, bem como as células hematopoiéticas componentes dos cordões medulares. No baço, o parênquima foi igualmente substituído por nódulos idênticos e proximamente relacionados. Tais nódulos eram compostos por linfócitos neoplásicos distribuídos na forma de um manto e separados por trabéculas esplênicas, por vezes, por discretos segmentos remanescentes da polpa vermelha. Predominantemente, os linfócitos neoplásicos apresentavam moderada quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Núcleos redondos a ovais, constituídos por cromatina frouxa ou vesicular, contendo um a quatro nucléolos grandes, eosinofílicos, proeminentes e localizados, em sua maioria, perifericamente, com frequência em contato com a membrana nuclear (Figura 3). Na IHQ, as células neoplásicas imunomarcaram para linfócitos B (anti-CD20) (Figuras 4 e 5)e pequenos grupos de linfócitos normais, distribuídos

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aleatoriamente pelo tecido remanescente, evidenciaram positividade para o marcador de linfócitos T (anti-CD3). Linfoma de células T periférico inespecífico

Dois casos de linfoma de células T periférico inespecífico foram encontrados neste estudo (2/100 [2%]). Em um dos casos (1/100 [1%]), ocorreu o acometimento concomitante dos pulmões, do estômago, do fígado e dos linfonodos (linfonodos hepáticos, gástricos e pancreáticos). Na necropsia, o acometimento pulmonar se destacou diante dos demais órgãos afetados. Ambos os pulmões não colapsaram quando da abertura da cavidade torácica. Estavam pesados, úmidos, brilhantes, avermelhados e macios. O lobo médio do pulmão direito estava homogeneamente avermelhado, opaco e firme ao toque (“hepatização pulmonar”). Adicionalmente, foram observadas, distribuídas multifocalmente pela superfície natural dos lobos pulmonares, com exceção do lobo consolidado, diversas áreas anelares brancacentas, não elevadas do parênquima, por vezes, umbilicadas e macias que variavam de 0,1 a 1,5 cm de diâmetro (Figura 6). Ao corte, os pulmões eram macios, com superfície de corte homogeneamente vermelha junto ou não a nódulos hemisféricos brancacentos multifocais ou coalescentes (Figura 7). O lobo consolidado (lobo médio) era firme ao corte, de consistência semelhante à carne (“carnificação pulmonar”).

No outro caso (1/100 [1%]), o coração foi o único órgão afetado. Macroscopicamente, existiam áreas branco-amareladas, não elevadas, distribuídas de forma multifocal ou coalescente no epicárdio, tanto na face esquerda (auricular) como direita (atrial) do coração, mas poupando os vasos. Após o corte transversal, ao nível dos ventrículos, pode ser notado que as áreas observadas externamente possuíam superfície de corte igualmente branco-amarelada e se estendiam pelo miocárdio, incluindo o músculo papilar de ambos os ventrículos, e, em alguns locais, atingiam o endocárdio (acometimento transmural) do átrio e do ventrículo direitos (Figura 8). Esse tecido proliferado provocou moderado espessamento difuso do átrio esquerdo.

Histologicamente, nos dois casos, o linfoma de células T periférico inespecífico foi caracterizado por uma densa proliferação de linfócitos neoplásicos, organizados em manto que infiltrava, dissecava e/ou substituía difusamente os tecidos afetados. Nos pulmões, a proliferação celular ainda obliterava parcialmente ou totalmente os espaços alveolares (Figura 9), as junções bronquíolo-alveolares e os bronquíolos, apresentando, para este caso, discreta angiocentricidade. No coração, células contendo o núcleo na forma de uma massa homogênea, condensada e hipercromática (apoptose) junto a fibras cardíacas (Figura 10), por vezes fragmentadas, marcadamente eosinofílicas e circundadas por macrófagos contendo detritos celulares (necrose), foram observadas em grande quantidade. Os linfócitos neoplásicos tinham volume intermediário e eram compostos por pequena quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Os núcleos eram predominantemente redondos, formados por cromatina frouxamente arranjada, contendo nucléolos múltiplos (dois a quatro), basofílicos, inconspícuos e localizados, em sua maioria, perifericamente. Moderado pleomorfismo nuclear e diversas figuras de mitose, considerando algumas atípicas, foram notadas. Ambos os casos evidenciaram intensa imunomarcação para linfócitos T (anti-CD3) (Figuras 11 e 12) e ausência de imunomarcação para linfócitos B (anti-CD79). Linfoma angiocêntrico

Dos cães diagnosticados com linfoma (n=100), dois (2/100 [2%]) foram classificados como linfoma angiocêntrico. Em um desses casos, os órgãos afetados incluíram o fígado, o baço e os linfonodos submandibulares, pré-escapulares, axilares, inguinais, mesentéricos e poplíteos (linfadenopatia generalizada). Macroscopicamente, o fígado estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (hepatomegalia difusa), com as bordas dos lobos arredondadas, e se projetava além do arco costal. À superfície natural era repleto por inúmeros e discretos pontos amarelados. Ao corte era firme, com superfície de corte vermelha contendo pontos amarelos multifocais. O baço também estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (esplenomegalia difusa), macio ao toque e ao corte. A superfície de corte era homogeneamente vermelha. Todos os linfonodos, estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume (linfadenomegalia generalizada), levemente vermelhos, suculentos, brilhantes e macios. Ao corte eram igualmente macios, com superfície de corte úmida, vermelha e repleta por diversos pontos brancos, não sendo possível realizar a delimitação corticomedular. No outro caso, macroscopicamente, o fígado foi o único órgão afetado, mas histologicamente a medula óssea também foi acometida. Na necropsia, o fígado estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (hepatomegalia difusa), acastanhado, com as bordas dos lobos e superfície natural intensamente irregular, incluindo marcada evidenciação do padrão lobular (Figura 13), notada tanto à superfície natural como à superfície de corte, assemelhando-se ao o que em patologia é denominado como “fígado de noz-moscada”. Áreas vermelho-escuras foram vistas multifocalmente em alguns lobos (áreas de necrose) (Figura 14). Moderada quantidade de um material filamentoso na forma de uma película amarela e friável estava aderida à

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superfície diafragmática (fibrina). Áreas de colapso do parênquima podiam ser notadas aleatoriamente em todos os lobos (Figura 13).

Histologicamente, em ambos os casos, havia uma densa proliferação de linfócitos neoplásicos formando grandes aglomerados celulares, predominantemente em torno de vasos (padrão angiocêntrico), provocando compressão luminal, mas com ausência ou mínima invasão da parede vascular. No fígado, essas células circundavam principalmente os espaços-porta, dissecavam e substituíam completamente o tecido conjuntivo existente por entre as estruturas (Figura 15). Por vezes, as células neoplásicas se estendiam de um espaço-porta ao centro do lóbulo, envolvendo a veia centrolobular. Na região subcapsular, ao longo de toda a sua extensão, também foram observadas células neoplásicas agrupadas, formando uma banda celular. Foram vistas, ocasionalmente, pelos lóbulos hepáticos, áreas compostas por um material grosseiramente flocular e marcadamente eosinofílico junto a detritos celulares (áreas de necrose). No baço e nos linfonodos, o padrão angiocêntrico foi mantido, no entanto, devido à acentuada proliferação celular, grande parte do parênquima tecidual foi substituído. Adicionalmente, nos linfonodos, os seios subcapsulares e peritrabeculares estavam completamente obliterados pelas células neoplásicas. Na medula óssea, capilares circundados por agrupamentos celulares foram mais facilmente identificados quando estavam entremeados por áreas de necrose (Figura 16). Os linfócitos neoplásicos tinham volumes intermediários e moderada quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Continham núcleos redondos ou ovais, raramente reniformes, localizados na região central da célula e constituídos por cromatina frouxa. No interior desses núcleos foram notados nucléolos únicos ou múltiplos, em sua maioria, pequenos, eosinofílicos e variavelmente evidentes. Tais células foram positivas para o marcador de linfócitos T (anti-CD3) e negativas para o marcador de linfócitos B (anti-CD79). Linfoma intravascular de grandes células T

Em nosso estudo, foram diagnosticados dois casos (2/100 [2%]) de linfoma intravascular de células T. Desses casos, um evidenciou envolvimento exclusivamente renal e o outro acometimento hepático, nodal (linfonodos periportais) e cutâneo (pele da bolsa escrotal). Na necropsia do primeiro caso, quando da abertura da cavidade abdominal, os rins sobressaíram diante dos demais órgãos, pois estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume (nefromegalia difusa), homogeneamente amarelados e firmes ao toque. Ao corte eram igualmente firmes, de superfície amarela, com marcada dissociação corticomedular na qual a medular era pelo menos cerca de cinco vezes mais espessa que a cortical (Figura 17).

No outro caso, macroscopicamente, o fígado estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (hepatomegalia difusa), o que era evidenciado pelo deslocamento em sua posição anatômica na cavidade abdominal, projetando-se além do arco costal, pelo arredondamento das bordas dos lobos hepáticos e pela impressão das costelas na superfície diafragmática. À superfície natural, era discretamente mosqueado de branco e vermelho-enegrecido (Figura 18), liso e macio. A superfície de corte era homogeneamente vermelha. Os linfonodos periportais estavam igualmente aumentados de volume (linfadenomegalia), vermelhos, brilhantes, suculentos e macios ao toque. Ao corte eram macios com superfície de corte úmida, friável e homogeneamente vermelha, não permitindo realizar a delimitação corticomedular. A bolsa escrotal apresentava acentuado aumento de volume e, ao corte, deixava fluir grande quantidade de um líquido fracamente avermelhado (edema hemorrágico [hidrocele]).

Na histopatologia, de ambos os casos, havia uma densa proliferação de células redondas que obliterava parcialmente ou totalmente o lúmen de vasos de pequeno e/ou médio calibre, mas poupava o parênquima tecidual hepático e renal, respectivamente. Nos rins, a proliferação de linfócitos neoplásicos no lúmen dos vasos intersticiais, exclusivamente da região medular, provocou distensão vascular e, consequentemente, colapso por compressão de grande parte dos túbulos renais, restando, em muitos locais, apenas alguns poucos túbulos coletores colapsados como referência para a identificação do órgão. Nos linfonodos, essas células obliteravam também os seios subcapsulares e peritrabeculares, no entanto, apesar de, macroscopicamente, não ser possível realizar a delimitação corticomedular, histologicamente, essa delimitação foi preservada. As células neoplásicas eram redondas, tinham limites celulares distintos, com moderada quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Os núcleos eram redondos, ovais ou clivados, localizados centralmente e constituídos por cromatina frouxamente arranjada. Os nucléolos eram, predominantemente, únicos, grandes, eosinofílicos e conspícuos. Havia apenas anisocitose e anisocariose. No caso hepático/nodal/cutâneo o pleomorfismo e a atipia eram acentuados; muitas células tinham núcleos chanfrados, em forma de ferradura ou multilobulados (Figura 19). Células multinucleadas eram frequentes. Na IHQ os linfócitos neoplásicos foram acentuadamente positivos para o marcador de linfócitos T (anti-CD3) (Figura 20) e negativos para o marcador de linfócitos B (anti-CD79).

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Granulomatose linfomatoide A granulomatose linfomatoide correspondeu a dois (2%) dos 100 casos de linfoma canino em nosso

estudo. Nos dois cães necropsiados, os pulmões, os linfonodos, o baço e o fígado foram juntamente acometidos. Os pulmões não colapsaram quando da abertura da cavidade torácica. Estavam pesados, úmidos, brilhantes, levemente avermelhados ou vermelho-enegrecidos (Figura 21) e macios ao toque. Ao corte eram macios, e deixavam fluir pequena quantidade de um líquido levemente avermelhado junto à espuma (edema hemorrágico). A superfície de corte era homogeneamente rósea ou vermelha. Dos linfonodos, foram acometidos, variavelmente, os submandibulares, os retrofaríngeos, os pré-escapulares, os axilares, os inguinais, os mesentéricos e os poplíteos (linfadenopatia generalizada). Todos os linfonodos estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume, vermelhos ou branco-amarelados, suculentos, brilhantes e macios. Ao corte eram igualmente macios, úmidos, com superfície de corte homogeneamente amarela ou vermelho-enegrecida, não permitindo a delimitação corticomedular. Em ambos os casos, o baço estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (esplenomegalia difusa), ocupando quase toda a porção central da cavidade abdominal. Ao corte era macio, homogeneamente vermelho e opaco com protrusão do parênquima sobre a cápsula. O fígado também estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (hepatomegalia difusa) e firme, se projetando além do arco costal. Tanto à superfície natural como à superfície de corte, era homogeneamente acastanhado. Em um dos dois casos (1/100 [1%]), outros dois sítios anatômicos foram envolvidos, incluindo as tonsilas e o esôfago. As tonsilas estavam difusa e acentuadamente aumentadas de volume (tonsilomegalia difusa), branco-amareladas, úmidas e brilhantes, com perda de sua conformação pregueada, obstruindo parcialmente a faringe. No esôfago, existiam alguns nódulos hemisféricos, brancacentos, de 0,3 cm de diâmetro, distribuídos multifocalmente pela mucosa esofágica, principalmente ao nível do esôfago torácico. Ao corte tais nódulos eram homogeneamente brancos.

Nos pulmões de ambos os casos (2/100 [2%]), microscopicamente, havia uma densa proliferação de células redondas dispostas na periferia de vasos (padrão angiocêntrico) (Figura 22) e bronquíolos (padrão peribronquiolar) (Figura 23), mas também livres, em menor quantidade, no interior dos espaços alveolares, dos brônquios e dos bronquíolos. Essas células proliferadas caracterizavam uma população mista, composta por pequenos linfócitos maduros (citoplasma escasso com núcleos redondos formados por cromatina densa), por linfócitos neoplásicos de tamanho intermediário (Figura 24) e por histiócitos e/ou macrófagos contendo um pigmento granular e amarronzado (hemossiderina). Células com dois ou mais núcleos (binucleadas ou multinucleadas, respectivamente) eram ocasionais. Os linfócitos neoplásicos possuíam moderada quantidade de citoplasma, homogêneo e eosinofílico. Núcleos redondos ou ovais, localizados centralmente e formados por cromatina frouxa. Nucléolos únicos, pequenos, basofílicos e variavelmente evidentes. Em alguns locais, as células proliferadas invadiam a parede dos vasos (padrão angioinvasivo), provocando a condensação da mesma em um material homogêneo e marcadamente eosinofílico, caracterizando necrose fibrinoide. Nos dois casos, os outros órgãos afetados estavam infiltrados pela mesma população de células observada nos pulmões, no entanto, nos linfonodos, nas tonsilas, no baço e no esôfago, as células proliferaram intensamente, coalesceram e substituíram o parênquima tecidual, dando a impressão de uma proliferação em manto. Diferente do que foi visto no fígado, quando o padrão angiocêntrico foi mantido, originando nódulos multifocais, especialmente nos espaços-porta. Na IHQ, os linfócitos neoplásicos foram acentuadamente positivos para o marcador de linfócitos B (anti-CD79) (Figura 25) e negativos para o marcador de linfócitos T (anti-CD3). Os pequenos linfócitos maduros imunomarcaram para linfócitos T (anti-CD3) e não imunomarcaram para linfócitos B (anti-CD79).

Linfoma de grandes células anaplásicas

Do total de cães com linfoma (n=100), apenas um (1/100 [1%]) foi diagnosticado com linfoma anaplásico de grandes células T. Nesse caso, o fígado, a pele e o linfonodo axilar esquerdo foram afetados concomitantemente. Na necropsia, foram notadas, distribuídas multifocalmente pela superfície natural de todos os lobos hepáticos, algumas áreas anelares, não elevadas do parênquima, brancacentas e brilhantes, que variavam de 0,3 a 3 cm de diâmetro (Figura 26). Eram macias ao toque e ao corte, com superfície de corte homogeneamente branca. Na pele da região abdominal ventral, à esquerda do plano mediano e craniolateral à abertura do prepúcio, havia uma massa, irregular, de 6 x 4 x 2,5 cm. Na pele da região inguinal direita havia uma massa semelhante à anterior, de 5 x 2 x 1,5 cm. Ambas as massas eram macias ao toque e ao corte, com superfície de corte homogeneamente branca. O linfonodo axilar esquerdo estava difusa e acentuadamente aumentado de volume, suculento, brilhante e macio. Ao corte era igualmente macio, com superfície de corte multilobulada, branca com áreas multifocais amareladas (áreas de necrose) e pontos vermelhos (hemorragia), não permitindo realizar a delimitação corticomedular.

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As áreas brancacentas observadas na superfície natural do fígado, as massas cutâneas e o linfonodo axilar esquerdo eram constituídos, histologicamente, por uma densa proliferação de linfócitos neoplásicos organizados em manto. No fígado, esses linfócitos formavam nódulos delineados por hepatócitos, na pele substituíam grande parte da derme superficial e profunda, incluindo os anexos cutâneos, mas poupando a epiderme e, no linfonodo, obliteravam os seios subcapsular e peritrabecular, substituindo totalmente o parênquima, provocando “apagamento nodal”. Os linfócitos neoplásicos caracterizaram a variante de pequenas células, representada predominantemente por pequenos linfócitos neoplásicos denominados como “células em ovo frito”. Tais linfócitos eram compostos por citoplasma escasso, homogêneo e eosinofílico. Possuíam núcleos redondos, localizados centralmente, formados por cromatina frouxa, com nucléolos múltiplos, pequenos, basofílicos e inconspícuos (Figura 27). Entremeados a esses pequenos linfócitos neoplásicos, mas com maior intensidade circundando vasos, existiam linfócitos grandes, com núcleos excêntricos, em forma de ferradura ou reniformes, conferindo, por vezes à célula um aspecto de embrião (“células com marca registrada” [do inglês hallmark cells]). Essas células eram caracterizadas por citoplasma abundante, homogêneo e eosinofílico, contendo núcleos, constituídos por cromatina frouxa. Os nucléolos eram múltiplos, de tamanho médio, eosinofílicos e mais facilmente notados quando comparados aos visualizados nos pequenos linfócitos neoplásicos (Figura 28). Ocasionais células em que o núcleo em formato de ferradura havia se unido nas extremidades, dando um aspecto de uma rosquinha foram visualizadas (“células em rosquinha” [do inglês doughnut cells]). Algumas células neoplásicas grandes eram binucleadas, outras eram multilobuladas ou até mesmo multinucleadas (Figura 29). Em algumas células binucleadas, os núcleoseram idênticos e intimamente relacionados, dispostos como “imagem em espelho”, e nucléolos grandes e conspícuos, na “forma de olhos de coruja”, lembrando muito as células de Reed-Sternberg (Figura 30). Dependendo da incidência de corte, algumas das hallmarkcells demonstravam estruturas intranucleares irregulares e eosinofílicas, caracterizando falsas inclusões (pseudoinclusões). Células com o núcleo rechaçado para a periferia devido à presença de um grande vacúolo citoplasmático (“células em anel de sinete”), também foram observadas aleatoriamente (Figura 31). Na IHQ os linfócitos neoplásicos imunomarcaram para linfócitos T (anti-CD3) (Figura 32) e não evidenciaram imunomarcação para linfócitos B (anti-CD79). Linfoma hepatoesplênico de células T

O linfoma hepatoesplênico de células T correspondeu a um caso (1/100 [1%]) neste estudo. Nesse caso, as mucosas ocular, oral e genital, bem como a pele e o tecido subcutâneo estavam acentuadamente amareladas (icterícia) (Figura 33) e, além do envolvimento concomitante do baço e do fígado, ocorreu o acometimento dos linfonodos duodenais e pancreáticos (linfadenopatia profunda localizada). Macroscopicamente, o baço estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (esplenomegalia difusa), ocupando grande parte da cavidade abdominal. Foram observadas, distribuídas multifocalmente pela superfície diafragmática, diversas áreas enegrecidas, variavelmente elevadas do parênquima e de dimensões variáveis (áreas de necrose) (Figuras 34 e 35). Ao corte, o baço era macio, com superfície de corte homogeneamente vermelha, incluindo aquelas áreas enegrecidas. O fígado também estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (hepatomegalia difusa), com as bordas dos lobos marcadamente abauladas, com superfície natural acastanhada e intensamente irregular (Figuras 34 e 35). Ao corte era macio, com superfície de corte igualmente acastanhada. Os linfonodos (duodenais e pancreáticos) estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume (linfadenomegalia), avermelhados, compreendendo algumas áreas enegrecidas elevadas do parênquima (hemorragia), suculentos, brilhantes (Figura 35), macios ao toque e ao corte. À superfície de corte eram igualmente suculentos e brilhantes, mosqueados de branco e vermelho, não permitindo realizar a delimitação corticomedular.

Na histopatologia de ambos os órgãos havia uma densa proliferação de linfócitos neoplásicos que infiltrava difusamente o parênquima tecidual. No baço, os sinusoides e cordões esplênicos (polpa vermelha), bem como os nódulos linfoides, as bainhas linfoides periarteriolares (polpa branca) e os capilares embainhados por macrófagos, foram completamente substituídos por um manto de células neoplásicas. Áreas multifocais ou coalescentes compostas por um material grosseiramente flocular e eosinofílico junto a detritos celulares e eritrócitos (áreas de necrose), foram aleatoriamente observadas. No fígado, os sinusoides estavam difusamente distendidos por grande quantidade de linfócitos neoplásicos, formando, em diversos locais, grandes áreas compostas exclusivamente por células neoplásicas. Grande quantidade dessas células circundava também os espaços-porta e dissecava o tecido conjuntivo existente por entre suas estruturas (Figuras 36 e 37). O parênquima nodal foi difusamente substituído pela proliferação neoplásica, semelhante ao o que foi observado no baço, caracterizando o “apagamento nodal”. A avaliação microscópica da medula óssea e dos pulmões revelou a presença de células neoplásicas em ambos os órgãos. Na medula óssea, uma pequena população de linfócitos neoplásicos foi observada entremeada à população hematopoiética normal (Figura 38). E nos pulmões,

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moderada quantidade dessas células foi notada no interior dos capilares septais alveolares, permitindo concluir que ocorreu a leucemização do linfoma. A população de linfócitos neoplásicos era classicamente monomórfica, composta por linfócitos de volume intermediário, com citoplasma escasso, homogêneo e eosinofílico. Os núcleos dessas células eram redondos, localizados centralmente e constituídos por cromatina densa. Os nucléolos eram únicos, pequenos, basofílicos e inconspícuos. Na IHQ, tais células imunomarcaram para linfócitos T (anti-CD3) (Figura 39) e não imunomarcaram para linfócitos B (anti-CD79). Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário

O linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário correspondeu a um caso em nosso estudo (1/100 [1%]). À necropsia, as pálpebras superiores e inferiores que recobrem a superfície livre de ambos os bulbos oculares, estavam difusamente espessadas em toda a sua extensão, mas com maior intensidade sobre o olho esquerdo, não permitindo a sua visualização. A face posterior (conjuntiva) da pálpebra inferior esquerda estava exposta devido ao acentuado aumento de volume. A pele que recobria as pálpebras, especialmente ao nível do ângulo medial do olho esquerdo, apresentava rarefação pilosa (hipotricose), incluindo a ausência dos cílios. Moderada quantidade de uma secreção mucopurulenta recobria parcialmente ambas as pálpebras e condensava os pelos da região periocular inferior esquerda (Figura 40). Após o corte transversal do crânio, ao nível das órbitas, pode ser observado que a periórbita, o corpo adiposo intra-orbitário, as fáscias e os músculos extrínsecos do bulbo ocular, em ambos os olhos, foram difusamente substituídos por um tecido homogeneamente branco, suculento e macio ao toque. Ao corte esse tecido era igualmente macio e com superfície de corte homogeneamente branca (Figura 41). Nesse mesmo paciente, outros três locais foram acometidos, incluindo a cavidade nasal, a língua e as tonsilas. Quanto à cavidade nasal, pode ser observado, após o corte transversal do crânio ao nível das órbitas, que as conchas nasais, especialmente as pertencentes ao lado esquerdo da cavidade, foram parcialmente substituídas por um tecido semelhante ao que foi visto nas pálpebras (Figura 42). Em relação à língua, na superfície dorsal, notou-se moderado aumento de volume unilateral ao nível da raiz, próximo à tonsila esquerda (Figura 43), e na superfície de corte, grande quantidade do tecido mencionado anteriormente, substituía amplamente a musculatura lingual.

Microscopicamente, esse tecido brancacento, em ambos os locais (pálpebras, língua, cavidade nasal e tonsilas), era caracterizado por uma densa proliferação de linfócitos neoplásicos, organizados em manto que infiltrava e substituía difusamente os tecidos afetados. Embora macroscopicamente a arquitetura ocular tenha sido mantida, microscopicamente, restaram apenas a esclera e poucas porções da coróide, a última, representada por algumas células pigmentadas. Na língua, a proliferação celular dissecou grande parte da musculatura, mas poupou o epitélio. E nas conchas nasais, o epitélio respiratório foi substituído em grande parte, mas a base óssea das conchas nasais (endoturbinados) foi mantida. Nas tonsilas, as células neoplásicas formavam um extenso manto que comprimia e atrofiava, mas não invadia, o epitélio de revestimento. Os linfócitos neoplásicos eram pequenos e compostos por citoplasma escasso, homogêneo e eosinofílico. Os núcleos eram predominantemente redondos, excêntricos e formados por cromatina densa. Nucléolos não foram observados (Figura 44). Na IHQ, os linfócitos neoplásicos foram positivos para o marcador de linfócitos B (anti-CD79) (Figura 45) e negativos para o marcador de linfócitos T (anti-CD3).

DISCUSSÃO A maior parte da literatura considera o linfoma folicular em cães como uma condição incomum ou rara, pois perfaz apenas 6,6% (4/60) a 7,5% (5/66) dos linfomas não Hodgkin nos Estados Unidos (EUA) (Valli et al. 2006, Flood-Kinapik et al. 2012) e entre 0,5% (3/608) e 1,2% na Europa (Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010), perfazendo um total de 13 casos descritos na literatura. Estes dados são semelhantes à prevalência encontrada em nosso estudo, quando correspondeu a tão somente 5% das apresentações de linfoma observadas em cães. Quanto aos órgãos afetados, uma diferença significativa foi observada entre os nossos resultados e os dados já publicados na literatura consultada. Segundo alguns autores (Valli et al. 2006, Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010, Flood-Kinapik et al. 2012), os linfonodos foram os únicos órgãos afetados em todos os casos diagnosticados como linfoma folicular, diferentemente de nossos achados, considerando que todos os casos também apresentaram envolvimento esplênico, visto macroscopicamente como esplenomegalia difusa, incluindo três diferentes padrões de apresentação macroscópica. Em humanos, linfomas foliculares também afetam baço, medula óssea, o anel linfático de Waldeyer (formado pelas tonsilas faríngea, palatina e lingual) e o sangue periférico, manifestando-se como linfocitose, em aproximadamente 10% dos pacientes (Harris & Ferry 1992, Harris et al. 2008). O envolvimento do TGI e dos tecidos moles pode ocorrer como parte de um linfoma folicular multicêntrico e, raramente, outros órgãos não hematopoiéticos podem ser primariamente afetados, incluindo pele, TGI (particularmente o duodeno), anexos do globo ocular, mama e testículos (Harris et al 2008). Além do

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evidente envolvimento do baço e linfonodos no linfoma folicular, as demais alterações não foram observadas nos cães incluídos neste estudo.

O linfoma de células T periférico inespecífico corresponde a um grupo de linfomas originários de células T que ainda não puderam ser totalmente classificados e caracterizados (Valli et al. 2002, Swerdlow et al. 2008, Valli 2007). Na medicina humana, subtipos de linfoma pertencentes a esse grande grupo têm sido caracterizados(padrões anatomopatológicos, comportamento biológico e características moleculares) reduzindo o número de linfomas dessa categoria ditos inespecíficos (Swedlow et al. 2008), no entanto, em medicina veterinária, isso tem sido realizado lentamente através de perfis imuno-histoquímicos, diante da limitada disponibilidade de recursos econômicos para a realização de tal caracterização em animais (Valli et al. 2017). Em humanos, a maioria dos pacientes apresenta uma doença generalizada caracterizada pelo envolvimento nodal, hepático, esplênico e cutâneo, mas qualquer órgão pode ser afetado (Swerdlow et al. 2008). Em cães, o envolvimento é descrito basicamente como cutâneo e/ou subcutâneo, existindo uma ampla variedade histológica (Valli 2007, Vezzali et al. 2009). Em nosso estudo, o linfoma periférico de células T inespecífico correspondeu a apenas 2% das apresentações de linfoma diagnosticadas em cães da nossa rotina, afetando sítios anatômicos semelhantes ao o que é observado na literatura humana, mas ainda não descritos na literatura veterinária, caracterizando um linfoma misto (envolvimento concomitante dos pulmões, do estômago, do fígado e dos linfonodos) e um linfoma solitário (acometimento exclusivamente cardíaco).

A classificação dos tumores hematopoiéticos em animais, estabelecida pela OMS e chancelada pela AFIP (Valli et al. 2002), caracteriza o linfoma angiocêntrico como um neoplasma originário de linfócitos T, constatando o que foi observado com a técnica de IHQ em nossos dois casos. Entretanto, apenas a granulomatose linfomatoide e os linfomas que se desenvolvem após injeções cutâneas, foram estabelecidos pela OMS como angiocêntricos (Valli et al. 2002). Além disso, as classificações mais atuais sugeridas para os tumores hematopoiéticos em cães incluem unicamente a granulomatose linfomatoide como um linfoma angiocêntrico (Valli 2007, Valli et al. 2016, Valli et al, 2017), igualmente aos casos relatados em cães (Berry et al. 1990, Fitzgerald et al. 1991, Shimazaki et al. 2010, Hatoia et al. 2011). Tendo em vista que os pulmões e a pele não foram acometidos em nenhum dos dois casos de linfoma angiocêntrico descritos por nós, o que possibilitaria o diagnóstico de granulomatose linfomatoide ou de um linfoma “pós-vacinal”, respectivamente, e que, a população de linfócitos neoplásicos não é mista como a classicamente observada na granulomatose linfomatoide, mas sim monomórfica, é descrito nesse estudo, sítios anatômicos do linfoma angiocêntrico de células T ainda não relatados na literatura veterinária. Em humanos, o linfoma extranodal de células T/NK do tipo nasal corresponde, microscopicamente (Swerdlow et al. 2008), ao linfoma angiocêntrico descrito em nossos dois casos.

Conforme a classificação proposta pela OMS para os tumores hematopoiéticos em animais domésticos (Valli et al. 2002) que tem como base os critérios para classificação dos tumores hematopoiéticos em humanos (Jaffe et al. 2001), o linfoma intravascular em cães é originalmente classificado como um subtipo do linfoma de grandes células B. Em humanos, o linfoma intravascular é predominantemente uma doença de linfócitos B (Swerdlow et al. 2008), diferente do que tem sido observado em cães, em que a maioria dos casos relatados é derivada de linfócitos T (McDonough et al. 2002, Kent et al. 2001, Machado et al. 2011, Ridge et al. 2004), a exemplo de nosso trabalho, onde ambos os casos imunomarcaram intensamente para linfócitos T. Diante dessa diferença imunofenotípica, inúmeras maneiras de classificar essa condição em cães têm sido propostas e utilizadas atualmente por diferentes grupos de autores (Valli 2007, Valli et al. 2016, Valli et al. 2017), particularmente classificando o linfoma intravascular como um dos neoplasmas originários de células T maduras ou de células nulas (Valli 2007, Valli et al. 2017), pois embora linfoma intravascular de linfócitos T seja mais frequente, casos provenientes de células não B e não T (células nulas) têm sido relatados (McDonough et al. 2002). Desse modo, a classificação do linfoma intravascular em cães permanece inconsistente e até o momento, nenhuma das classificações sugeridas foi reconhecida pela OMS.

A granulomatose linfomatoide é uma desordem linfoproliferativa primariamente pulmonar, caracterizada histologicamente por um padrão de proliferação celular angiocêntrico e angioinvasivo (Berry et al. 1990, Fitzgerald et al. 1991, Park et al. 2007, Swerdlow et al. 2008, Song et al. 2015). É considerada, tanto em humanos como em cães, uma rara apresentação de linfoma, visto que, os pulmões não representam um dos sítios anatômicos classicamente acometidos por esse neoplasma (Swerdlow et al. 2008, Fry & Mcgavin 2012, Fighera & Graça 2016, Valli et al. 2017). Corroborando com a raridade de sua ocorrência, em nosso estudo, a granulomatose linfomatoide correspondeu a 2% das apresentações de linfoma em cães. O padrão macroscópico observado nos pulmões dos casos aqui descritos, assim como a localização das metástases, é semelhante ao o que tem sido relatado na literatura veterinária (Berry et al. 1990, Fitzgerald et al. 1991, Park et al. 2007, Hatoya et al. 2011), contudo, apesar dos linfonodos, do fígado e do baço compreenderem os principais sítios de metástase, qualquer órgão ou tecido pode ser afetado

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(Shimazaki et al. 2010, Valli et al. 2017), a exemplo do que foi visto em um dos casos relatados, quando o esôfago e as tonsilas foram sítios de metástase, além dos linfonodos, do fígado e do baço. Fundamentando-se na classificação dos tumores hematopoiéticos em animais domésticos, estabelecida pela OMS (Valli et al. 2002), a caracterização histológica da granulomatose linfomatoide está um tanto ultrapassada, pois está ainda classificada como um linfoma angiocêntrico originário de células T. Estudos mais recentes acerca do assunto (Park et al. 2007, Valli 2007, Toit et al. 2011, Song et al. 2015, Valli et al. 2017), incluindo a atual classificação dos tumores hematopoiéticos em humanos (Swerdlow et al. 2008), comprovam a origem B dos linfócitos neoplásicos e a origem T de pequenos linfócitos maduros reativos, considerando a granulomatose linfomatoide uma forma de linfoma composta por uma população mista de células neoplásicas e não neoplásicas, semelhante ao o que foi histologicamente observado em nossos casos.

Em nossa rotina, o linfoma de grandes células anaplásicas representou apenas 1% das apresentações de linfoma diagnosticadas em cães. Essa é uma rara manifestação de linfoma, caracterizada, tanto em humanos como em cães, por uma forma primariamente cutânea e por uma forma sistêmica (Valli et al. 2017). Na forma sistêmica, os linfonodos geralmente estão afetados concomitantemente a outros locais, incluindo os ossos, os pulmões e o fígado, contudo a pele parece ser o sítio extranodal mais frequentemente envolvido (Valli 2007, Swerdlow et al. 2008, Valli et al. 2017). Talvez o caso de linfoma de grandes células anaplásicas apresentado nesse estudo represente a forma sistêmica desse neoplasma, semelhante ao que é descrito na literatura veterinária e humana, afetando concomitantemente o linfonodo axilar, a pele e o fígado, entretanto, não pode ser definido com base nos achados se o neoplasma poderia ter iniciado na pele e posteriormente envolvido o linfonodo axilar e o fígado.

O linfoma hepatoesplênico, tanto em humanos como em cães, é uma condição rara, caracterizada pelo envolvimento concomitante do fígado e do baço na forma de hepatoesplenomegalia difusa e, frequentemente da medula óssea, mas com ausência de acometimento nodal periférico (linfadenopatia superficial) (Weidmann 2000, Swerdlow et al. 2008, Keller et al. 2012). Em nosso estudo, essa apresentação de linfoma correspondeu a 1% das formas de linfoma diagnosticadas em cães da nossa rotina, a semelhança do que é observado na literatura veterinária, existindo apenas oito casos descritos em cães (Fry et al. 2003, Cienava et al. 2004, Keller et al. 2012). Quanto aos órgãos afetados, o caso descrito por nós foi idêntico ao que é observado na literatura, pois em sete dos oito casos relatados (Cienava et al. 2004, Keller et al. 2012), o linfoma hepatoesplênico foi caracterizado, invariavelmente, por hepatoesplenomegalia difusa junto ao acometimento microscópico da medula óssea e dos pulmões. Baseando-se na literatura humana (Weidmann 2000, Swerdlow et al. 2008), o acometimento pulmonar ocorreu, possivelmente, em razão do avançado estádio da doença e de seu comportamento agressivo. Mais raramente, icterícia devido à infiltração difusa do fígado por linfócitos neoplásicos e linfadenopatia localizada profunda foram descritas, respectivamente, em apenas um caso (Keller et al. 2012), similar ao o que foi visto à necropsia em nosso caso, quando acentuada icterícia do cadáver e linfadenomegalia profunda localizada dos linfonodos pancreáticos foram notadas.

O linfoma linfocítico crônico de pequenas células B corresponde a um dos cinco tipos e/ou subtipos histológicos de linfoma mais frequentemente relatados em cães, perfazendo entre 1,8% (Ponce et al. 2010) e 7,8% (Vezzali et al. 2009) dos casos. Entretanto, sua variante denominada “tipo intermediário”, que se caracteriza pela presença de linfócitos com diferenciação plasmocitária, é bem menos comum que a forma clássica (Valli et al. 2002). Em nossa rotina, esse tipo de linfoma, considerada por muitos autores, tanto em humanos como em cães, como uma forma indolente da doença (Valli 2007, Swerdlow et al. 2008, Valli et al. 2017), representou apenas 1% das apresentações incomuns de linfoma diagnosticadas em cães. Seu curso lentamente progressivo se deve a uma proliferação de linfócitos muito mais acumulativa do que progressiva, proporcionando maior tempo de sobrevida ao pacientes com essa condição (Valli et al. 2002, Valli 2007, Swerdlow et al. 2008, Valli et al. 2017). Geralmente, os locais acometidos incluem os linfonodos, o baço e o fígado. Raramente outros locais podem ser afetados, como os rins, as adrenais, o sistema nervoso central e os olhos e os anexos do bulbo ocular (Valli 2007, Swerdlow et al. 2008, Valli et al. 2017). Diante disso, o caso de linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário apresentado em nosso estudo, representa um dos sítios anatômicos incomuns ou raros desse tipo de linfoma, ademais, descrevemos outros três locais ainda não descritos na literatura veterinária como possíveis sítios desse neoplasma (tonsilas, língua ecavidade nasal [conchas nasais]).

CONCLUSÕES Apesar do linfoma ser um neoplasma facilmente reconhecido entre patologistas veterinários, incomumente (16% das vezes) casos não tradicionais dessa importante forma de câncer poderão ser encontrados. Esses casos correspondem não apenas a linfomas solitários, extranodais e mistos, mas também a apresentações microscópicas distintas. Esperamos que os resultados aqui demonstrados

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auxiliem patologistas veterinários a reconhecerem tais casos de “linfomas atípicos” em suas rotinas anatomopatológicas.

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29

Quadro 1. Classificação e anatomopatologia dos linfomas incomuns em cães

*Organização Mundial da Saúde (OMS)/Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms (REAL). 1Apresentações anatomopatológicas. Macro: padrão macroscópico e Histo: padrão histopatológico. 2Sítios anatômicos incomuns.

Classificação histológica (OMS/REAL)*

IHQ

Casos Órgãos afetados

Apresentação anatômica

Motivo(s) para inserção no estudo

Linfoma folicular

CD20+ CD3-

Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5

Baço e linfonodos Baço e linfonodos Baço e linfonodos Baço e linfonodos Baço e linfonodos

Multicêntrico Multicêntrico Multicêntrico Multicêntrico Multicêntrico

AA1 (macro e histo) AA1 (macro e histo) AA1 (macro e histo) AA1 (macro e histo) AA1 (macro e histo)

Linfoma de células T

periférico inespecífico

CD3+ CD79-

Caso 1 Caso 2

Pulmões, estômago, fígado e linfonodos Coração

Misto Extranodal solitário

SAI2 (pulmão) SAI2 (coração)

Linfoma angiocêntrico

CD3+ CD79-

Caso 1 Caso 2

Fígado, baço e linfonodos Fígado e medula óssea

Multicêntrico Extranodal

AA1 (macro e histo) AA1 (histo)

Linfoma intravascular de

grandes células T

CD3+ CD79-

Caso 1 Caso 2

Fígado, bolsa escrotal e linfonodos Rins

Misto Extranodal solitário

SAI2 (bolsa escrotal) e AA1 (histo) SAI2 (rins) e AA1 (macro e histo)

Granulomatose linfomatoide

CD79+ CD3+

Caso 1 Caso 2

Pulmões, baço, fígado e linfonodos Pulmões, baço, fígado, esôfago, tonsilas e

linfonodos

Misto Misto

SAI2 (pulmões)e AA1 (histo) SAI2 (pulmões e esôfago)e AA1 (histo)

Linfoma de grandes células anaplásicas

CD3+ CD79-

Caso 1 Fígado, pele (hirsuta) e linfonodo Misto AA1 (macro e histo)

Linfoma hepatoesplênico de células T

CD3+ CD79-

Caso 1 Fígado, baço, medula óssea e linfonodos Multicêntrico AA1 (macro e histo)

Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B –

tipo intermediário

CD79+ CD3-

Caso 1 Pálpebras, cavidade nasal, língua, tonsilas e olhos

Extranodal SAI2 (pálpebras e língua)

30

Fig.1. Linfoma folicular, baço e linfonodo (superfície de corte), cão. Presença de um pontilhado brancacento e brilhante multifocal e coalescente.

Fig.2. Linfoma folicular, linfonodo, cão. Parênquima substituído por grandes nódulos linfoides coalescentes. HE, obj.4x.

31

Fig.3. Linfoma folicular, linfonodo, cão. Há um pequeno número de centrócitos distribuídos esparsamente por entre uma população predominante de centroblastos. Hematoxilina de Harris, obj.40x.

Fig.4. Linfoma folicular, baço, cão. Nódulo linfoide acentuadamente imunomarcado. Método da estreptavidina-biotina (CD20), obj.4x.

32

Fig.5. Linfoma folicular, baço, cão. Linfócitos neoplásicos demonstrando marcada imunomarcação citoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD20),obj.40x.

Fig.6. Linfoma de células T periférico inespecífico, pulmão, cão. Ausência de colapso (“pulmões armados”) e avermelhamento intenso dão ao órgão um aspecto hepatizado. Observe as diversas áreas anelares brancacentas, não elevadas do parênquima, algumas semelhante a um alvo.

33

Fig.7. Linfoma de células T periférico inespecífico, pulmão (superfície de corte), cão. Múltiplos nódulos brancacentos e multifocais.

Fig.8. Linfoma de células T periférico inespecífico, coração (superfície de corte ao nível dos ventrículos), cão. Tecido branco-amarelado substitui grande parte do miocárdio de ambos os ventrículos e do septo ventricular.

34

Fig.9. Linfoma de células T periférico inespecífico, pulmão, cão. Espaços alveolares completamente obliterados por uma população mista de linfócitos de volume intermediário. HE, obj.20x.

Fig.10. Linfoma de células T periférico inespecífico, coração, cão. Marcado infiltrado de linfócitos que disseca as cardiomiofibras. HE, obj.20x.

35

Fig.11. Linfoma de células T periférico inespecífico, pulmão, cão. Linfócitos neoplásicos intra-alveolares demonstrando marcada imunomarcação citoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD3), obj.40x.

Fig.12. Linfoma de células T periférico inespecífico, coração, cão. Linfócitos neoplásicos entre as cardiomiofibras demonstrando marcada imunomarcaçãocitoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD3), obj.40x.

36

Fig.13. Linfoma angiocêntrico, fígado, cão. Superfície natural marcadamente irregular, acentuação do padrão lobular, áreas de colapso do parênquima e deposição de películas de fibrina.

Fig.14. Linfoma angiocêntrico, fígado (superfície de corte), cão. Área de necrose caracterizada por um centro amarelado circundado por um halo vermelho. Note a marcada acentuação do padrão lobular.

37

Fig.15. Linfoma angiocêntrico, fígado, cão. Proliferação linfoide perivascular que destrói completamente o espaço-porta. HE, obj.4x.

Fig.16. Linfoma angiocêntrico, medula óssea, cão. Proliferação de linfócitos neoplásicos formando um aglomerado ao redor de um capilar arterial. Há extensa necrose e hemorragia ao redor dessas áreas. Note o acúmulo de macrófagos repletos de corpúsculos tingíveis. HE, obj.20x.

38

Fig.17. Linfoma intravascular de grandes células T, rim (superfície de corte), cão. Dissociação corticomedular devido à acentuada distensão da medular

Fig.18. Linfoma intravascular de grandes células T, fígado, cão. Hepatomegalia com descoloração e mosqueamento. Observe as múltiplas áreas de impressão costal.

39

Fig.19. Linfoma intravascular de grandes células T, fígado, cão. Proliferação intraluminal de linfócitos neoplásicos acentuadamente anaplásicos. HE, obj.20x.

Fig.20. Linfoma intravascular de grandes células T, rim, cão. Linfócitos neoplásicos intraluminais demonstrando marcada imunomarcação citoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD3), obj.20x.

40

Fig.21. Granulomatose linfomatoide, pulmão, cão. Ausência de colapso (“pulmões armados”) e acinzentamento intenso dão ao órgão um aspecto hepatizado.

Fig.22. Granulomatose linfomatoide, pulmão, cão. Infiltrado linfoide perivascular (padrão angiocêntrico). HE, obj.10x.

41

Fig.23. Granulomatose linfomatoide, pulmão, cão. O infiltrado perivascular é constituído na sua maioria por pequenos e médios linfócitos, com núcleos redondos formados por cromatina agregada com um único nucléolo inconspícuo, e por pequena quantidade de grandes linfócitos, com núcleos redondos a reniformes formados por cromatina frouxa com um ou mais nucléolos conspícuos. HE, obj.20x.

Fig.24. Granulomatose linfomatoide, pulmão, cão. Infiltrado linfoide peribronquiolar. HE, obj.10x.

42

Fig.25. Granulomatose linfomatoide, pulmão, cão. Grandes linfócitos neoplásicos demonstrando marcada imunomarcação citoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD79), obj.40x.

Fig.26. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Manchas brancas e não elevadas aleatoriamente distribuídas pela superfície natural dos lobos hepáticos.

43

Fig.27. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Linfócitos com citoplasma escasso, contendo núcleos intensamente condensados e localizados centralmente (“células em ovo frito”). HE, obj.20x.

Fig.28. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. No centro do campo, em meio aos linfócitos variavelmente anaplásicos, um linfócito composto por citoplasma abundante e núcleo na forma de ferradura, caracterizando “células com marca registrada” (do inglês hallmark cells). HE, obj.40x.

44

Fig.29. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Algumas células multilobuladas e outras multinucleadas. HE, obj.40x.

Fig.30. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Ao centro do campo, uma célula semelhante à célula de Reed-Sternberg. Hematoxilina de Harris, obj.40x.

45

Fig.31. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Ao centro do campo, uma “célula em anel de sinete”. HE, obj.40x.

Fig.32. Linfoma de grandes células anaplásicas, fígado, cão. Linfócitos marcadamente pleomórficos demonstrando forte imunomarcação citoplasmática. Método da estreptavidina-biotina (CD3), obj.20x.

46

Fig.33. Linfoma hepatoesplênico de células T, pênis, cão. Acentuado amarelamento da mucosa (icterícia).

Fig.34. Linfoma hepatoesplênico de células T, cavidade abdominal, cão. Acentuada hepatoesplenomegalia. No baço podem ser observadas múltiplas areas de necrose.

47

Fig.35. Linfoma hepatoesplênico de células T, fígado, baço e linfonodo, cão. Os três órgãos afetados demonstrando organomegalia difusa. Note as áreas de necrose hemorrágica em baço e linfonodo.

Fig.36. Linfoma hepatoesplênico de células T, fígado, cão. Infiltrado linfoide que distende os sinusoides, oblitera os espaços-porta e dissocia os cordões de hepatócitos. HE, obj.10x.

48

Fig.37. Linfoma hepatoesplênico de células T, fígado, cão. População linfoide monomórfica e de volume intermediário que disseca os hepatócitos. HE, obj.40x.

Fig.38. Linfoma hepatoesplênico de células T, medula óssea, cão. Infiltrado linfoide causando mieloptise. HE, obj.20x.

49

Fig.39. Linfoma hepatoesplênico de células T, medula óssea, cão. Linfócitos demonstrando forte imunomarcação citoplasmática. Os espaço vazios correspondem a adipócitos. Método da estreptavidina-biotina (CD3), obj.20x.

Fig.40. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, cabeça, cão. Marcado espessamento palpebral bilateral com exposição conjuntival e perda dos cílios.

50

Fig.41. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, cabeça (superfície de corte ao nível das órbitas), cão. Massa brancacenta que substitui a periórbita, o tecido adiposo intra-orbitário, as fáscias e os músculos extrínsecos do bulbo ocular causando compressão e infiltração ocular bilateral.

Fig.42. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, cavidade nasal (superfície de corte), cão. As conchas nasais estão parcialmente substituídas por um tecido brancacento de forma bilateral, porém assimetricamente, com maior gravidade do lado esquerdo.

51

Fig.43. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, língua e tonsila esquerda, cão. Massa unilateral esquerda ao nível da raiz e tonsilomegalia difusa.

Fig.44. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, pele (pálpebra), cão. Proliferação linfoide constituída por pequenas células com núcleos redondos e um pouco excêntricos formados por cromatina agregada sem nucléolo. HE, obj.40x.

52

Fig.45. Linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário, pele (pálpebra), cão. Linfócitos monomórficos demonstrando forte imunomarcação citoplasmática. Método estreptavidina-biotina (CD79), obj.20x.

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3 ARTIGO 2 –

Artigo aceito para publicação na revista Pesquisa Veterinária Brasileira

Aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do linfoma folicular em cães1

Renata D. Mazaro2, Isis P.J. Rizkallah4, Flávia S. da Luz2, Douglas M. Lorensetti3, Bruno Cogliati4, Rafael A. Fighera5

ABSTRACT.- Mazaro R.D., Rizkallah I.P.J., Luz F.S., Lorensetti D.M., Cogliati B. & Fighera R.A. 2017. [Epidemiological, clinical and pathological aspects of follicular lymphoma in dogs.] Aspectos epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos do linfoma folicular em cães. Pesquisa Veterinária Brasileira 00 (0): 00-00. Departamento de Patologia, Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima 1000, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: anemiaveterinaria@yahoo.com.br Follicular lymphomas are a rare form of lymphoproliferative disorder described in veterinary medicine. Together with the probable non-existence of Hodgkin's lymphomas in dogs, this is the biggest difference about lymphoma between humans and dogs. The aim of this article is to describe the epidemiological, clinical and anatomopathological findings observed in five dogs with follicular lymphoma. Of the five dogs with follicular lymphoma, two were male (40%) and three were female (60%). The age of affected dogs ranged from 11 to 13 years. Four of the five (80%) dogs were purebred and one (20%) had no defined breed. All dogs presented generalized lymphadenomegaly and splenomegaly, which included cases as multicentric lymphoma. At necropsy, the lymph nodes and the spleen demonstrated a nodular pattern at the cut surface, characterized by tens to hundreds of white nodules of variable size, multifocal or coalescing. On the natural surface of the spleen, often (4/5 [80%]), there were myriads of white, multifocal or coalescing dots of varying sizes. In histopathology, the tumors were confirmed as follicular lymphomas. All cases were Grade III, two (40%) included as IIIa and three (60%) as IIIb. In one case (1/5 [20%], follicular lymphoma was considered as a IIIb variant of small centroblasts similar to the neoplastic lymphocytes seen in Burkitt's lymphoma. Lymphomas were validated as having origin in B cells through immunohistochemistry, using anti-CD20 antibody. The cases of follicular lymphomas described behaved aggressively and led the patients to death.

INDEX TERMS: follicular lymphoma, indolent lymphoma, multicentric lymphoma, dogs.

1 Recebido em 21 de agosto de 2017 Aceito para publicação em 24 de agosto de 2017 2 Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, área de concentração em Patologia e Patologia Clínica Veterinária, Centro de Ciências Rurais (CCR), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900, Brasil. 3 Curso de Medicina Veterinária, CCR-UFSM, Santa Maria, RS. Bolsista PIBIC/CNPq/UFSM. 4 Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular (LAPMOL), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade de São Paulo (USP), Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva 87, Cidade Universitária, Butantã, São Paulo, SP, 05508-270, Brasil. 5 Departamento de Patologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS), UFSM, Av. Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900. Autor para correspondência: anemiaveterinaria@yahoo.com.br

RESUMO.- Linfomas foliculares são uma rara forma de distúrbio linfoproliferativo descrita em medicina veterinária. Juntamente com a não reconhecida ocorrência dos linfomas de Hodgkin em cães, essa é a maior diferença acerca de linfoma entre humanos e cães. O objetivo deste artigo é descrever os achados epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos vistos em cinco cães com linfoma folicular. Destes, dois eram machos (40%) e três eram fêmeas (60%). A idade dos cães afetados variou de 11 a 13 anos. Quatro dos cinco (80%) cães eram de raça pura e um (20%) não tinha raça definida. Todos os cães apresentaram linfadenomegalia generalizada e esplenomegalia, o que incluiu os casos como linfoma multicêntrico. Na necropsia, os linfonodos e o baço demonstraram um padrão nodular à superfície de corte, caracterizado por dezenas a centenas de nódulos brancos, multifocais ou coalescentes e de tamanhos variáveis. Na superfície natural do baço, frequentemente (4/5 [80%]), havia miríades de pontos brancos, multifocais ou

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coalescentes, de tamanhos variáveis. Na histopatologia, os tumores foram confirmados como linfomas foliculares. Todos os casos eram Grau III, sendo dois (40%) incluídos como IIIa e outros três (60%) como IIIb. Em um caso (20%), o linfoma folicular foi considerado como IIIb variante de pequenos centroblastos semelhantes aos linfócitos neoplásicos vistos no linfoma de Burkitt. Os linfomas foram validados como tendo origem em células B através da imuno-histoquímica, utilizando anticorpos anti-CD20. Os casos de linfomas foliculares descritos comportaram-se de forma agressiva e levaram os pacientes à morte.

TERMOS DE INDEXAÇÃO: linfoma folicular, linfoma indolente, linfoma multicêntrico, cães.

INTRODUÇÃO Linfoma folicular (Working Formulation of Non-Hodgkin’s Lymphomas for Clinical Usage), também denominado linfoma nodular (Classificação de Rappaport), linfoma das células do centrofolicular (Classificação de Lukes-Collins), linfoma centroblástico-centrocítico (Sistema Kiel), linfoma centrofolicular (Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms [Sistema REAL]), linfoma centro germinativo ou doença de Brill-Symmers (Ioachim 1994), é um distúrbio linfoproliferativo originário de linfócitos B, o qual se caracteriza anatomopatologicamente por um padrão arquitetural nodular e que envolve, predominantemente, os linfonodos (Harris & Ferry 1992, Valli et al. 2002, Harris et al. 2008). Em humanos é considerado um dos linfomas mais diagnosticados, representando 14,2% a 20,1% de todos os linfomas não Hodgkin (Morton et al. 2006, Aoki et al. 2008, Van Leeuwen et al. 2014, Mohammed et al. 2015). Por outro lado, essa é uma das formas de linfoma mais raras em cães, perfazendo apenas 0,6% a 7,5% dos casos (Valli et al. 2006, Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010, Food-Kinapik et al. 2012). Por serem animais de companhia e, por consequência, sofrerem as mesmas influências ambientais que os humanos, os cães têm sido frequentemente considerados como um modelo para estudo dos linfomas não Hodgkin, em especial no que se refere à etiologia e à terapia (Vezzali et al. 2009, Ponce et al. 2010, Kimura 2012). A fim de entender melhor essa marcante diferença na prevalência do linfoma folicular entre humanos e cães, características epidemiológicas, clínicas, morfológicas, fenotípicas e genéticas desse tumor devem ser estudadas. Assim, o objetivo deste trabalho foi descrever os achados epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos observados em cães com linfoma folicular, a fim de fornecer dados para o estudo comparativo da doença e, adicionalmente, auxiliar Médicos Veterinários Patologistas no diagnóstico dessa condição em cães.

MATERIAL E MÉTODOS Os casos incluídos neste estudo ocorreram entre os anos de 1965 e 2017, no Município de Santa Maria, localizado na Mesorregião do Centro Ocidental Rio-Grandense, 29°32’52’’ e 53°42’10’’ WGR. Foram considerados apenas casos diagnosticados como linfomas foliculares (sinônimo: linfomas centrofoliculares) (n=5). Para isso, os laudos de necropsias de cães realizadas no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria (LPV-UFSM), no referido período, foram revisados em busca de casos de linfoma com padrão nodular. Posteriormente, todos os casos (n=5) foram reavaliados macroscopicamente por meio das imagens provenientes do arquivo de imagens do LPV-UFSM e, histologicamente, através da confecção de lâminas a partir do recorte dos tecidos embebidos em parafina com coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). O diagnóstico definitivo do tumor foi realizado com base nos critérios histológicos da Organização Mundial da Saúde (OMS) para a classificação dos tumores hematopoiéticos em humanos (Swerdlow et al. 2008), e para a classificação dos tumores hematopoiéticos em animais domésticos, publicados pelo Instituto de Patologia das Forças Armadas (AFIP) (Valli et al. 2002). Com base nisso, foram selecionados apenas aqueles casos que apresentaram achados anatomopatológicos reconhecidos na literatura como linfomas foliculares (n=5). E, fundamentando-se nessa mesma literatura, tais casos foram classificados em três graus (I, II ou III). Para isso, foi considerada a quantidade absoluta de centroblastos, contada no interior de diferentes nódulos neoplásicos, expressa em 10 campos de grande aumento (CGA [400x]). Para ser classificado como grau I, II ou III era necessário que fossem observados, respectivamente, 0-5 centroblastos/CGA, 6-15 centroblastos/CGA e >15 centroblastos/CGA. O grau III ainda foi subclassificado em graus IIIa ou IIIb. O critério utilizado para essa subclassificação foi a presença ou ausência de centrócitos. Casos diagnosticados como IIIa apresentavam uma pequena população de centrócitos distribuída esparsamente por entre os centroblastos. Casos diagnosticados como IIIb evidenciavam uma população monomórfica de centroblastos.

A fim de determinar a origem dos linfócitos neoplásicos, pelo menos um tecido acometido de cada um desses casos foi selecionado e submetido à técnica de imuno-histoquímica (IHQ) enzimática. A técnica empregada foi a imunomarcação para linfócitos B, utilizando-se anticorpo para CD20. Como de rotina, IHQ visando negatividade para linfócitos T, também foi realizada utilizando-se o anticorpo para CD3.

A técnica de imuno-histoquímica foi empregada seguindo o protocolo padronizado no Laboratório de Patologia Morfológica e Molecular (LAPMOL) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

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Universidade de São Paulo (FMVZ-USP). Após a desparafinização e reidratação dos tecidos foi realizada a recuperação antigênica com solução de Tris-EDTA (pH 9,0) no forno de micro-ondas, em alta potência, por 10 minutos. Para realizar o bloqueio da peroxidase endógena foi utilizado peróxido de hidrogênio a 3% por 20 minutos. O bloqueio das reações inespecíficas foi realizado com Protein Block por 10 minutos em temperatura ambiente. Como anticorpo primário foram utilizados os anticorpos policlonal anti-CD20 (RB9013-P, Thermo Scientific) produzido em coelho, diluído 1:800 em diluente de anticorpo (Scy Tek – ATG 125), e anticorpo monoclonal anti-CD3 (Clone F7.2.38, Dako Cytomatic; pré-diluído) produzido em camundongo. Ambos os anticorpos foram incubados por 60 minutos em estufa a 37°C. O anticorpo secundário e o Polímero Reveal Complement e Reveal HRP Conjugate HRP foram utilizados consecutivamente, incubados a 25°C por 30 minutos e revelados através da adição do cromógeno tetracloreto de 3-3’ diaminobenzidina (DAB) por cinco minutos. A contra-coloração foi realizada com Hematoxilina de Harris. Tonsilas de cães foram utilizadas como controle positivo e o controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário. Para a obtenção do último, foi utilizado apenas o diluente de anticorpo. A imunomarcação para o CD20 foi classificada como leve, moderada ou acentuada, conforme estudos prévios (Maes et al. 2000).

Os dados clínicos e epidemiológicos a cerca de cada caso, foram obtidos a partir da revisão dos laudos e, quando possível, das fichas de atendimento pertencentes ao Serviço de Arquivos Veterinário (SAVE) do Hospital Veterinário Universitário da UFSM (HVU-UFSM).

RESULTADOS

Epidemiologia Entre os anos de 1965 e 2017 foram necropsiados 8.899 cães. Destes, 100 morreram ou foram

submetidos à eutanásia devido a complicações relacionadas ao linfoma. Do total de cães com linfoma, apenas 5% foram diagnosticados com o padrão nodular. Dos cinco cães com linfoma folicular, dois eram machos (40%) e três eram fêmeas (60%). A idade dos cães afetados variou de 11 a 13 anos. Quatro dos cinco (80%) cães eram de raça pura e um (20%) não tinha raça definida (SRD). As raças puras incluíam Pastor Alemão (2/5), Pastor Belga (1/5) e Pinscher (1/5). Os cinco cães afetados foram submetidos à eutanásia devido ao avançado estadiamento da doença e encaminhados ao LPV-UFSM para a realização de necropsia (Quadro 1).

Sinais clínicos

Todos os cães demonstraram uma doença caracterizada, invariavelmente, por apatia, anorexia ou inapetência, dependendo do momento, esplenomegalia e linfadenomegalia superficial generalizada, ambas observadas através da palpação dos respectivos órgãos ao exame físico realizado na primeira consulta. Emagrecimento progressivo (3/5 [60%]), febre (2/5 [40%]) e edema subcutâneo (2/5 [40%]), especialmente em membros pélvicos (1/5 [20%]) e região cervical ventral (1/5 [20%]), foram ocasionalmente descritos.

Achados de necropsia

Todos os cães necropsiados apresentavam linfonodos superficiais e profundos difusa e acentuadamente aumentados de volume (linfadenomegalia generalizada), brancacentos a levemente avermelhados (Fig.1) e macios ao toque. Ao corte, eram igualmente macios e deixavam fluir mínima quantidade de um líquido translúcido. A superfície de corte era úmida, brilhante, branca ou mosqueada de branco e vermelho, mas caracteristicamente pontilhada por dezenas a centenas de nódulos brancos, de tamanhos variáveis, multifocais ou coalescentes (padrão nodular), que não permitiam a delimitação corticomedular (Fig.2).

Em todos os casos, o baço estava difusa e acentuadamente aumentado de volume (esplenomegalia difusa), o que era evidenciado pelo arredondamento de suas bordas e pelo deslocamento em sua posição anatômica na cavidade abdominal (Fig.3). Três padrões macroscópicos foram identificados na superfície natural. Em um deles, observado em três dos cinco casos (60%), a superfície era vermelha, lisa e repleta por miríades de pontos brancos, multifocais ou coalescentes, de tamanhos variáveis (padrão nodular) (Fig.4). Em outro padrão, visto em um dos cinco casos (20%), a superfície era homogeneamente vermelha e lisa, porém sem os pontos brancos descritos nos três casos anteriores (Fig.5). No último padrão, visto também em um dos cinco casos (20%), a superfície era marcadamente irregular, salpicada de pontos brancos elevados hemisfericamente (Fig.6). Apesar desses três padrões distintos, à superfície de corte, o baço era sempre caracterizado por um pontilhado brancacento (Fig.7) ou branco-rosado (Fig.8), brilhante (Fig.7) ou vítreo (Fig.8), aleatório, multifocal ou coalescente, macroscopicamente semelhante ao descrito para hiperplasia difusa da polpa branca. Edema do tecido subcutâneo da região cervical ventral e de

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ambos os membros pélvicos foi visualizado em dois dos cinco casos (40%). Outros achados de necropsia incluíam: broncopneumonia supurativa, doença articular degenerativa (“artrose”) coxofemoral, endocardite valvar (valva mitral) bacteriana, degeneração mixomatosa valvar (“endocardiose”) (valva mitral), infartos esplênicos, hiperplasia nodular linfoide esplênica e cicatrizes esplênica e renais. Esses achados ocorreram em casos distintos ou em um mesmo caso. Alguns foram interpretados como relacionados ao linfoma ou a quimioterapia, enquanto outros como achados incidentais (Quadro 1). Achados histopatológicos

Na histopatologia, todos os casos apresentaram uma população densamente celular em linfonodos e baço, com padrão de organização caracterizado por nódulos de dimensões variáveis, moderada ou marcadamente definidos, não encapsulados, com zona do manto ausente e sem estroma perceptível (Fig.9). Nos linfonodos, esses nódulos invadiam a cápsula e obliteravam os seios subcapsulares e peritrabeculares. Nódulos neoplásicos dispostos intimamente, septados ou não por finas trabéculas de tecido conjuntivo, se estendiam desde a região cortical até a região medular, substituindo quase que totalmente o parênquima, não sendo possível visualizar os folículos linfoides, incluindo a sua “polarização”, bem como as células hematopoiéticas componentes dos cordões medulares. No baço, o parênquima foi igualmente substituído por nódulos idênticos e proximamente relacionados. Tais nódulos eram compostos por células redondas distribuídas na forma de um manto (Fig.10) e separados por trabéculas esplênicas, por vezes, por discretos segmentos remanescentes da polpa vermelha. Graus variados de invasão da cápsula esplênica e trabéculas também foram observados em todos os cães.

Predominantemente, os linfócitos neoplásicos eram semelhantes a blastos (centroblastos [células blásticas-like]), correspondendo duas a três vezes o tamanho de um pequeno linfócito. Apresentavam moderada quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Núcleos redondos a ovais, constituídos por cromatina frouxamente arranjada ou vesicular, contendo um a quatro nucléolos grandes, eosinofílicos, proeminentes e localizados, em sua maioria, perifericamente, com frequência em contato com a membrana nuclear. Mais raramente, células menores que um centroblasto, no entanto, maiores que um pequeno linfócito maduro, foram observadas, configurando a presença de centrócitos. Essas células eram caracterizadas por citoplasma escasso ou moderado, homogêneo e eosinofílico, núcleos redondos clivados ou reniformes, formados por cromatina frouxa, todavia, mais densamente arranjada quando comparada à de um centroblasto. Os nucléolos eram definidos como únicos, pequenos, basofílicos, inconspícuos e centrais. Com base na proporção de centroblastos, todos os casos (n=5 [100%]) foram classificados como Grau III. Baseado na heterogeneidade populacional, dois (40%) dos cinco casos foram classificados como IIIa (Fig.11) e outros três (60%) casos como IIIb (Fig.12). Em um caso (1/5 [20%], classificado como IIIb, o padrão de distribuição celular e a morfologia dos centroblastos era distinta. Apesar de se dispor como um manto, semelhantemente aos outros, havia grande quantidade de macrófagos com citoplasma repleto de corpúsculos apoptóticos (corpos linfoglandulares ou corpos tingíveis), o que em menor aumento dava ao tecido um “padrão tipo céu estrelado” (Fig.13). Tais células tinham volumes intermediários, citoplasma homogêneo e eosinofílico e núcleos redondos a ovais, centrais, formados por cromatina moderadamente agregada, com nucléolos, múltiplos, pequenos e basofílicos, caracterizando pequenos centroblastos semelhantes aos linfócitos neoplásicos vistos no linfoma de Burkitt (Fig.14). Este caso foi classificado como IIIb variante (1/3 [33,3%]). Em todos os casos, tanto no baço quanto nos linfonodos, havia variável quantidade de macrófagos dispersos aleatoriamente, contendo um pigmento granular castanho-dourado. Esse pigmento era fortemente positivo na marcação pelo Azul da Prússia e foi interpretado como hemossiderina. Em pelo menos um linfonodo de cada caso revisado, os seios medulares e, ocasionalmente, os seios corticais, mostravam-se repletos de eritrócitos (congestão). No baço, em alguns casos avaliados (2/5 [40%]), eram notadas manchas amarelo-ouro livres nas trabéculas, mas também no citoplasma de macrófagos epitelioides e de células gigantes multinucleadas (hematoidina).

Achados imuno-histoquímicos

Na imuno-histoquímica, as células neoplásicas foram positivas para o marcador de linfócitos B (anti-CD20) em todos os casos analisados, tanto nos tumores nodais quanto esplênicos (Fig.15). Quanto à intensidade da imunomarcação, a maior parte dos casos foi considerada como acentuada (4/5 [80%]). Imunomarcação moderada ocorreu em um caso (1/5 [20%]) e imunomarcação discreta não foi observada. Quanto ao padrão morfológico de imunomarcação, as células positivas possuíam citoplasma finamente granular, com maior intensidade na região próxima à membrana citoplasmática (Fig.16). O marcador para linfócitos T (CD3) apresentou reatividade apenas em pequenos grupos de linfócitos normais, distribuídos aleatoriamente pelo tecido remanescente.

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DISCUSSÃO A maior parte da literatura considera o linfoma folicular em cães como uma condição incomum ou rara, pois perfaz 6,6% (4/60) a 7,5% (5/66) dos linfomas não Hodgkin nos Estados Unidos (EUA) (Valli et al. 2006, Flood-Kinapik et al. 2012) e entre 0,5% (3/608) e 1,2% na Europa (Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010), perfazendo um total de 13 casos descritos na literatura. Estes dados são semelhantes à prevalência encontrada neste estudo (5% dos casos nessa espécie). Assim como cães, os gatos, equinos, bovinos e ratos, são também raramente acometidos pelo linfoma folicular, representando, respectivamente, 0,5%, 0,49%, 0,33% e 0,22% de todos os linfomas nessas espécies (Frith 1988, Vernau et al 1992, Valli et al 2000, Durham et al 2012). Dessemelhante, o linfoma folicular é o segundo linfoma mais comum em humanos, atingindo cerca de 20% dos casos de linfoma não Hodgkin tanto nos EUA como na Europa (Al-Hamadani et al. 2015). Entretanto, em alguns países do Leste e do Sudeste Asiático, a prevalência do linfoma folicular é muito similar à observada em cães, equivalendo 2,9% a 5,9% dos casos de linfoma não Hodgkin (Kim et al. 2011). Tendo como base estudos realizados na medicina humana (Anderson et al. 1998, Intragumtornchai et al. 2017), uma possível explicação para essa diferença nas prevalências poderia ser a complexa inter-relação existente entre a suscetibilidade genética e diferentes fatores ambientais.

Quanto aos órgãos afetados, uma diferença significativa foi observada entre os nossos resultados e os dados já publicados na literatura consultada. Segundo alguns autores (Valli et al. 2006, Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010, Flood-Kinapik et al. 2012), os linfonodos foram os únicos órgãos afetados em todos os casos diagnosticados como linfoma folicular, diferentemente de nossos achados, sendo que todos os casos também apresentaram envolvimento esplênico, visto macroscopicamente como esplenomegalia difusa, incluindo três diferentes padrões de apresentação macroscópica. Em humanos, linfomas foliculares também afetam baço, medula óssea, o anel linfático de Waldeyer (formado pelas tonsilas faríngea, palatina e lingual) e o sangue periférico, manifestando-se como linfocitose, em aproximadamente 10% dos pacientes (Harris & Ferry 1992, Harris et al. 2008). O envolvimento do trato gastrointestinal (TGI) e dos tecidos moles pode ocorrer como parte de um linfoma folicular multicêntrico e, raramente, outros órgãos não hematopoiéticos podem ser primariamente afetados, incluindo pele, TGI (particularmente o duodeno), anexos do globo ocular, mama e testículos (Harris et al 2008). Além do evidente envolvimento do baço e linfonodos no linfoma folicular, as demais alterações não foram observadas nos cães incluídos neste estudo.

A aparência histológica dos linfomas foliculares varia consideravelmente de acordo com o grau de diferenciação das células neoplásicas e com o estádio de desenvolvimento tumoral (Harris & Ferry 1992, Valli 2007, Harris et al. 2008). Linfomas foliculares em estádio avançado de desenvolvimento apresentam um padrão de organização celular caracterizado por nódulos neoplásicos intimamente relacionados, não sendo possível visualizar com clareza os folículos linfoides, contudo, em estádios iniciais da doença, os folículos ainda são mantidos, incluindo sua “polarização” (Valli 2007, Harris et al. 2008). Dos tumores incluídos neste estudo, todos se apresentavam em estádio avançado de desenvolvimento. Embora seja mais comum o diagnóstico de linfomas foliculares em estádios avançados (Valli et al. 2006, Ponce et al. 2010, Flood-Kinapik 2012), tumores em fase inicial podem, ocasionalmente, ocorrer e ser um desafio ao diagnóstico com base apenas na histopatologia, considerando a hiperplasia folicular linfoide, o principal diagnóstico diferencial para o tumor nessa fase (Nathwani et al. 1981, Valli 2007). Nestes casos, para diferenciação entre linfoma folicular e hiperplasia folicular os seguintes critérios deverão ser incluídos: 1) menor quantidade de nódulos por unidade de área, 2) diminuição ou ausência de área interfolicular, o que dá, em menor aumento, um padrão multinodular do tipo “back-to-back”, 3) formatos e diâmetros semelhantes entre os nódulos, que se tornam geralmente redondos, 4) perda parcial ou total da “polarização”, principalmente perda da zona do manto, 5) obliteração nodal, ou seja, não restrição da proliferação ao córtex, com evidente invasão medular, 6) maior uniformidade celular e, geralmente, 7) grau mitótico menos elevado (Nathwani et al. 1981).

Em relação ao subtipo histológico, dos 13 casos publicados na literatura (Valli et al. 2006, Arespacochaga et al. 2007, Ponce et al. 2010, Flood-Kinapik et al. 2012), a maioria (10/13 [76,9%]) foi classificada como Grau III, enquanto os demais como Grau II (3/13 [23,1%]). Estes dados foram semelhantes aos nossos resultados. Dessemelhante, em humanos, linfomas foliculares de Grau I ocorrem mais frequentemente, correspondendo a 36,3% dos casos, seguido dos linfomas de Grau II (33,6%) e de Grau III (30,1% [27,6% Grau IIIa e 2,5% Grau IIIb) (Cabanillas et al. 2016).

Na medicina humana, o linfoma folicular de Grau III, principalmente Grau IIIb, apresenta comportamento biológico mais agressivo, com menor resposta à terapia e, consequentemente, um curto período de sobrevida (Harris & Ferry 1992, Federico et al. 2000). Isso difere do que ocorre com os linfomas foliculares de graus I e II, que exibem melhor resposta ao tratamento, proporcionando maior sobrevida (entre cinco e 10 anos) e, por isso, denominados por alguns autores como “linfomas indolentes”

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(Federico et al. 2000, Campo et al. 2008, Cabanillas et al 2016). Apesar disso, existem variações entre pacientes no que tange a resposta ao tratamento, assim, linfomas foliculares de graus I e II podem, às vezes, apresentar comportamento biológico inconsistente com o diagnóstico histopatológico (Harris & Ferry 1992, Cabanillas et al. 2016). Em nosso estudo, 40% dos casos foram incluídos como IIIa e 60% como IIIb, no entanto, não há dados na literatura veterinária a respeito do real comportamento biológico do linfoma folicular em cães, principalmente quanto aos seus diferentes graus. Por esse motivo, é difícil realizar um estudo comparativo com humanos, além disso, alguns autores consideram o linfoma folicular, independentemente do seu grau, como um linfoma indolente (Valli et al. 2006, Flood-Kinapik et al. 2012). Fundamentando-se na literatura humana (Harris & Ferry 1992, Campo et al. 2011, Cabanillas et al. 2016), acreditamos que o comportamento biológico do linfoma folicular em cães, possa ser semelhante ao o que ocorre em humanos, todavia, em medicina veterinária, a denominação de “linfoma indolente” deve ser cuidadosamente aplicada, particularmente no que se refere aos linfomas foliculares de Grau III, à exemplo de nosso estudo, uma vez que todos os cães afetados apresentaram disseminação esplênica e morte associada ao tumor.

CONCLUSÕES

Linfomas foliculares demonstraram ser uma rara forma de distúrbio linfoproliferativo em cães também em nossa região (Região Central do RS, Brasil) e, diferentemente do que ocorre em humanos e de como vem sendo relatado em cães (“linfomas indolentes”), todos os casos evoluíram de forma agressiva e com desfecho fatal, assemelhando-se muito, do ponto de vista do comportamento biológico, aos linfomas difusos não Hodgkin.

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60

Quadro 1. Achados epidemiológicos e anatomopatológicos do linfoma folicular canino

Caso Gênero Raça Idade (anos)

Órgãos afetados

Apresentação anatômica

Grau histológic

o

Intensidade na IHQ

(CD20)*

Lesões relacionadas ao linfoma

Lesões incidentais

Canino 1

Fêmea Pastor Belga

11 Linfonodos e baço

Multicêntrico IIIb variante

+++ Broncopneumonia

supurativa

HNLEa

Canino 2 Fêmea Pastor Alemão

12 Linfonodos e baço

Multicêntrico IIIa ++ Endocardite valvar e infartos

esplênicos

-

Canino 3 Fêmea Pinscher

12 Linfonodos e baço

Multicêntrico IIIb +++ - Cicatriz esplênica

Canino 4 Macho Pastor Alemão

11 Linfonodos e baço

Multicêntrico IIIb +++ - “Artrose” coxofemoral “Endocardio

se mitral” Canino 5 Macho SRD 13 Linfonodos e

baço Multicêntrico IIIa +++ - HNHb

Cicatrizes renais

*Todos os casos descritos são CD20 positivos e CD3 negativos. Intensidade na IHQ: leve (+), moderada (++) ou acentuada (+++). aHNLE: hiperplasia nodular linfoide esplênica. bHNH: hiperplasia nodular hepatocelular.

61

Fig.1. Linfoma folicular, linfonodos superficiais e profundos, cão. Acentuado aumento de volume (linfadenomegalia generalizada) e superfície natural moteada de branco e vermelho.

Fig.2. Linfoma folicular, linfonodos (superfície de corte), cão. Centenas de nódulos brancos, de tamanhos variáveis, multifocais ou coalescentes, não permitindo a delimitação corticomedular (padrão nodular).

62

Fig.3. Linfoma folicular, baço, cão. Acentuado aumento de volume (esplenomegalia difusa) evidenciado pelo arredondamento de bordas e deslocamento da posição anatômica na cavidade abdominal.

Fig.4. Linfoma folicular, baço (superfície natural), cão. Miríades de pontos brancos, multifocais ou coalescentes, de tamanhos variáveis (padrão nodular).

63

Fig.5. Linfoma folicular, baço (superfície natural), cão. Padrão homogêneo, não caracteristicamente nodular, mimetizando aquele visto no linfoma difuso. Observe o infarto focalmente extenso na extremidade ventral.

Fig.6. Linfoma folicular, baço (superfície natural), cão. Cápsula salpicada de pontos brancos e elevados hemisfericamente.

64

Fig.7. Linfoma folicular, baço (superfície de corte), cão. Presença de um pontilhado brancacento e brilhante distribuído multifocalmente.

Fig.8. Linfoma folicular, baço (superfície de corte), cão. Presença de um pontilhado branco-rosado, vítreo e coalescente. Essa apresentação lembra muito féculas de mandioca granulada em formato de pequenas pérolas (“sagu”).

65

Fig.9. Linfoma folicular, baço, cão. Parênquima parcialmente substituído por grandes nódulos linfoides coalescentes. HE, obj.4x.

Fig.10. Linfoma folicular, baço, cão. Maior aumento da Fig.9. Observe o padrão monótono disposto como um manto de células e a ausência quase absoluta de estroma fibrovascular. HE, obj.10x.

66

Fig.11. Linfoma folicular, linfonodo, cão. Há um pequeno número de centrócitos distribuídos esparsamente por entre uma população predominante de centroblastos, o que caracteriza o Grau IIIa. HE, obj.40x.

Fig.12. Linfoma folicular, linfonodo, cão. População monomórfica de centroblastos na ausência de centrócitos (Grau IIIb). HE, obj.40x.

67

Fig.13. Linfoma folicular, linfonodo, cão. Grande quantidade de áreas claras em meio a um fundo celular escuro, o que dá ao tecido, em baixa magnitude, um “padrão tipo céu-estrelado”. HE, obj.10x.

Fig.14. Linfoma folicular, linfonodo, cão. Maior aumento da Fig.13. Observe que a população linfoide é composta de pequenos centroblastos, caracterizados por núcleos constituídos por cromatina mais densamente arranjada. Tais células são semelhantes aos linfócitos neoplásicos vistos no linfoma de Burkitt. A presença dessas células caracteriza uma variante do Grau IIIb. Macrófagos vacuolizados e com corpúsculos linfoglandulares localizados ao centro da figura. HE, obj.40x.

68

Fig.15. Linfoma folicular, baço, cão. Nódulos linfoides acentuadamente imunomarcados para CD20. Imuno-histoquímica, obj.4x.

Fig.16. Linfoma folicular, baço, cão. Linfócitos neoplásicos com padrão de imunomarcação caracterizado por citoplasma finamente granular, com maior intensidade na região próxima à membrana citoplasmática. Imuno-histoquímica, obj.40x.

69

4 ARTIGO 3 –

Artigo a ser submetido para a revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e

Zootecnia

Linfoma intravascular de grandes células T em dois cães

[Intravascular large T-cell lymphoma in two dogs]

R.D. Mazaro1, F.S. Luz1, A.P. Herbichi2, R.A. Fighera3* 1Aluna do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Universidade Federal de

Santa Maria – UFSM – Santa Maria, RS 2Aluna de graduação em Medicina Veterinária - Universidade Federal de Santa Maria –

UFSM – Santa Maria, RS 3Professor do Laboratório de Patologia Veterinária – Universidade Federal de Santa Maria –

UFSM - Santa Maria, RS

*Autor para correspondência: Rafael Almeida Fighera, Laboratório de Patologia Veterinária,

Departamento de Patologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS), UFSM, Av. Roraima 1000,

Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900.

E-mail: anemiaveterinaria@yahoo.com.br

RESUMO

Linfoma intravascular é uma das mais raras formas de linfoma descritas em cães e humanos.

Esse linfoma, em humanos, pode emergir de linfócitos B, T ou de células nulas. No cão, foi

originalmente descrito como sendo oriundo de linfócitos B e quase sempre afeta o SNC,

particularmente o encéfalo. Descrevem-se aqui dois casos de linfoma intravascular de células

T em cães com acometimento incomum do fígado e dos rins. Em um dos casos, o cão (Pastor

Belga, macho, de 11 anos de idade) demonstrou, à necropsia, marcada hepatomegalia difusa

junto à linfadenomegalia periportal e edema da bolsa escrotal. No outro caso, o cão (SRD,

macho, idoso, mas de idade desconhecida) apresentou na necropsia nefromegalia difusa

bilateral. Histologicamente, em ambos os casos, os órgãos afetados apresentavam uma

proliferação linfoide exclusivamente intraluminal. Os linfócitos neoplásicos, células T

confirmadas através da imunomarcação positiva para CD3 e negativa para CD79, eram

70

grandes células redondas e anaplásicas, frequentemente multinucleadas. Apesar de raro, o

linfoma intravascular é um distúrbio linfoproliferativo de fácil suspeita com base apenas na

morfologia celular. Esse neoplasma deverá ser lembrado sempre que um padrão linfoide

intravascular estiver presente.

Palavras-chave: linfomas raros, linfomas de células T, linfomas intravasculares.

ABSTRACT

Intravascular lymphoma is one of ther are forms of lymphoma described in dogs and humans.

These lymphomas, in humans, can emerge from B or T lymphocytes or natural killer cells. In

the dog, it was originally described as emerging from B lymphocytes and almost always

affects the CNS, particularly the brain. Two cases of intravascular T-cell lymphoma are

described in dogs with an common involvement of the liver and kidneys. In one case, the dog

(a Belgian Shepherd, male, 11 years old) demonstrated at the necropsy a marked and diffuse

hepatomegaly associated with periportal lymphadenomegaly and edema of the scrotum. In

theother case, thedog (a mongrel, male, elderly, but of unknown age) presented at the

necropsy bilateral diffuse nephromegaly. Histopathologically, in both cases, the affected

organs presented exclusively intraluminal lymphoid proliferation. Neoplastic lymphocytes, T-

cells confirmedby CD3-positive and CD79-negative immunolabeling, were large, round, and

anaplastic cells, often multinucleated. Although rare, intravascular lymphoma is an easily

suspected lymphoproliferative disorder based only once morphology.

Thisneoplasmshouldberememberedwhenever a intravascularlymphoidpatternis presente.

Key-words: rare lymphomas, T-cell lymphomas, intravascular lymphomas.

INTRODUÇÃO

Linfoma intravascular (Organização Mundial da Saúde [OMS]), também denominado linfoma

angioendoteliotrópico (Sistema Kiel), linfoma angiotrópico de grandes células (Classificação

de Lukes-Collins) (Jaffe et al., 2001), angioendoteliomatose maligna (Zuckerman et al., 2006)

e angioendoteliomatose proliferativa sistêmica (Pfleger & Tappeiner, 1959), é um raro

distúrbio linfoproliferativo, originalmente classificado como um linfoma difuso de grandes

células B (Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms [Sistema

71

REAL]), que se caracteriza pela proliferação intraluminal de linfócitos neoplásicos em veias

de pequeno ou médio calibre, poupando os tecidos adjacentes dos órgãos afetados ou os

infiltrando discretamente (Valli et al., 2002; Valli, 2007; Valli et al., 2016; Valli et al., 2017).

O diagnóstico dessa forma de linfoma é estabelecido com base nos achados histopatológicos e

imuno-histoquímicos diante da ausência de envolvimento da medula óssea e do sangue

periférico, bem como da inexistência de massas extravasculares primárias (McDonough et al.,

2002).

Segundo a classificação proposta pela OMS para os tumores hematopoiéticos em animais

domésticos (Valli et al., 2002), originalmente, o linfoma intravascular em cães foi descrito

como sendo um tumor linfoide de células B. Na maioria dos casos relatados na literatura,

tanto em humanos como em cães, esse tipo de linfoma possui uma forte predileção pelo

sistema nervoso central (SNC), principalmente pelo cérebro, e os sinais clínicos primários

manifestados pelos pacientes refletem, geralmente, lesão tálamo-cortical (McDonough et al.,

2002; Lane et al., 2002; Machado et al., 2011; Zuckerman et al., 2006). Adicionalmente,

diversos órgãos ou tecidos podem estar afetados concomitantemente e, por isso, essa condição

tem sido considerada, por alguns autores (McDonough et al., 2002), como uma doença

disseminada ou multissistêmica.

O objetivo deste relato é descrever dois casos de linfoma intravascular de grandes células T

em cães, que afetaram concomitantemente o fígado, os linfonodos periportais e a pele da

bolsa escrotal no Caso 1 e exclusivamente os rins no caso 2.

CASUÍSTICA

Os dois casos descritos são provenientes da rotina de necropsias do Laboratório de Patologia

Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Durante a necropsia

fragmentos de diversos órgãos foram coletados, fixados em solução de formol tamponado a

10%, processados rotineiramente para histopatologia e corados pela Hematoxilina-Eosina

(HE). A fim de determinar a origem para os linfócitos neoplásicos, fragmentos de tecidos de

cada um desses casos foram selecionados e submetidos à técnica de imuno-histoquímica

(IHQ) enzimática. A técnica foi empregada seguindo o protocolo padronizado no LPV-

UFSM, realizando imunomarcação para linfócitos T e B, utilizando, respectivamente, o

anticorpo para CD79 e para CD3.

72

Após a desparafinização e reidratação dos tecidos foi realizada a recuperação antigênica com

solução de Tris-EDTA (pH 9,0) no forno de micro-ondas, em alta potência, por 10 minutos.

Para realizar o bloqueio da peroxidase endógena foi utilizado peróxido de hidrogênio a 3%

por 20 minutos. O bloqueio das reações inespecíficas foi realizado com Protein Block por 10

minutos em temperatura ambiente. Como anticorpo primário foram utilizados os anticorpos

monoclonal anti-CD79 (Clone JCB117, Dako Cytomatic; pré-diluído) e monoclonal anti-CD3

(Clone F7.2.38, Dako Cytomatic; pré-diluído) produzidos em camundongo. Ambos os

anticorpos foram incubados por 60 minutos em estufa a 37°C. O anticorpo secundário e o

Polímero Reveal Complement e Reveal HRP Conjugate HRP foram utilizados

consecutivamente, incubados a 25°C por 30 minutos e revelados através da adição do

cromógeno tetracloreto de 3-3’ diaminobenzidina (DAB) por cinco minutos. A contra-

coloração foi realizada com Hematoxilina de Harris. Linfonodos de cães foram utilizados

como controle positivo e o controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário.

Para a obtenção do último, foi utilizada apenas a solução de Tris-EDTA (pH 9,0).

Caso 1 – cão, Pastor Belga, macho, de 11 anos de idade chegou para atendimento no Hospital

Veterinário Universitário (HVU) da UFSM com histórico de claudicação (diagnóstico prévio

de displasia coxofemoral) e aumento de volume da bolsa escrotal, com evolução de dois

meses. O exame ultrassonográfico da cavidade abdominal revelou alteração do parênquima

hepático. O paciente morreu durante a internação e o cadáver foi encaminhado ao LPV-

UFSM para a realização de necropsia.

O fígado estava difusa e acentuadamente aumentado de volume, o que era evidenciado pelo

deslocamento de sua posição anatômica na cavidade abdominal, projetando-se além do arco

costal, pelo arredondamento das bordas dos lobos hepáticos e pela impressão das costelas na

superfície diafragmática (Figura 1). À superfície natural, era mosqueado de branco e

vermelho-enegrecido, liso, macio ao toque e ao corte. A superfície de corte era

homogeneamente vermelha, mas levemente irregular. Macroscopicamente, os linfonodos

periportais estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume, vermelhos (Figura 2),

macios ao toque e ao corte. A superfície de corte era suculenta, friável e homogeneamente

vermelha, não permitindo realizar a delimitação corticomedular. A bolsa escrotal apresentava

acentuado aumento de volume e, ao corte, deixava fluir grande quantidade de um líquido

avermelhado, demonstrando edema gelatinoso que comprimia os testículos (Figura 3).

73

Caso 2 – cão, sem raça definida (SRD), macho, idoso, chegou para atendimento no Hospital

Veterinário Universitário da UFSM com histórico de atropelamento prévio (cerca de dois

meses). Ao exame físico havia uma ferida lacerada no membro pélvico direito com exposição

óssea ao nível dos metatarsos. Por ser um cão de abrigo, idoso e, devido à necessidade de

amputação, o tutor optou pela eutanásia; o cadáver foi encaminhado ao LPV-UFSM para a

realização da necropsia. Os rins estavam difusa e acentuadamente aumentados de volume,

homogeneamente amarelados, levemente irregulares e firmes ao toque e ao corte. À superfície

de corte demonstrou marcada dissociação corticomedular, na qual a medular era pelo menos

cerca de cinco vezes mais espessa do que a cortical (Figura 4).

Os achados histopatológicos observados no fígado, nos linfonodos periportais e na pele da

bolsa escrotal do Caso 1 e em ambos os rins do Caso 2, eram caracterizados por uma

proliferação densamente celular que obliterava parcialmente ou totalmente o lúmen de veias

de pequeno e médio calibre, poupando o parênquima tecidual (Figuras 5 a 8). Nos linfonodos,

essas células obscureciam também os seios subcapsulares e peritrabeculares, no entanto,

apesar de macroscopicamente não ser possível realizar a delimitação corticomedular,

histologicamente, essa delimitação foi mantida. Nos rins, a distensão vascular causada pelo

grande número de células intravascular provocou colapso de grande parte dos túbulos,

restando, em muitas áreas, apenas alguns túbulos coletores como referência para a

identificação do órgão (Figuras 7 e 8). Essa lesão era vista em toda a medular, até a junção

corticomedular, porém, não afetava o córtex.

As células proliferadas eram redondas, tinham limites celulares distintos e moderada

quantidade de citoplasma homogêneo e eosinofílico. Os núcleos eram redondos, ovais ou

clivados, localizados centralmente e constituídos por cromatina frouxamente arranjada. Os

nucléolos eram únicos ou múltiplos, grandes, eosinofílicos e conspícuos (Figuras 9 e 10). No

Caso 2 havia apenas anisocitose e anisocariose. No Caso 1 o pleomorfismo e a atipia eram

acentuados; muitas células tinham núcleos chanfrados, em forma de ferradura ou

multilobulados (Figura 10). Células multinucleadas foram frequentes. Fundamentando-se na

inexistência de massas extravasculares, na ausência de envolvimento da medula óssea e do

sangue periférico e nas características histopatológicas das células proliferadas, o linfoma

intravascular foi definido como principal diagnóstico diferencial para ambos os casos. A fim

de confirmar o diagnóstico de linfoma e determinar a origem dos linfócitos neoplásicos, IHQ

74

para CD79 e CD3 foi realizada. A IHQ revelou intensa imunomarcação para linfócitos T

(anti-CD3) (Figuras 11 e 12) e ausência de imunomarcação para linfócitos B (anti-CD79), o

que nos permitiu estabelecer o diagnóstico de linfoma intravascular de grandes células T para

ambos os casos.

DISCUSSÃO

O linfoma intravascular foi primariamente descrito em humanos na década de 1950 como

angioendoteliomatose proliferativa sistêmica (Pfleger & Tappeiner, 1959). Quase três décadas

depois foi reconhecido em cães como angioendoteliomatose cerebral (Summers & De La

Hunta, 1985), pois inicialmente acreditava-se tratar-se de uma proliferação de células

endoteliais. Posteriormente, com o advento da IHQ, contatou-se que essa condição era

originária de linfócitos e não de células endoteliais, o que validou a denominação de linfoma

angiotrópico de grandes células (Sheibani et al., 1986).

Conforme a classificação proposta pela OMS para os tumores hematopoiéticos em animais

domésticos (Valli et al., 2002), que tem como base os critérios da classificação dos tumores

hematopoiéticos em humanos (Jaffe et al., 2001), o linfoma intravascular em cães foi

originalmente classificado como um subtipo do linfoma difuso de grandes células B. Isso se

deve ao fato de, em humanos, o linfoma intravascular ser predominantemente uma doença de

linfócitos B (Swerdlow et al., 2008). Entretanto, pelo menos em cães, a maioria dos casos

descritos na literatura é derivada de linfócitos T (McDonough et al., 2002; Kent et al., 2001;

Machado et al., 2011; Ridge et al., 2004), semelhantemente aos casos aqui descritos, os quais

imunomarcaram intensamente para linfócitos T, mas não para linfócitos B.

Diante dessa diferença imunofenotípica, inúmeras maneiras de classificar essa condição em

cães têm sido propostas e utilizadas atualmente por diferentes grupos de autores (Valli, 2007;

Valli et al., 2016; Valli et al., 2017), particularmente classificando o linfoma intravascular

como um dos neoplasmas originários de células T maduras ou de células nulas (Valli, 2007;

Valli et al., 2017), pois embora linfoma intravascular de linfócitos T seja mais frequente,

casos provenientes de células não B e não T têm sido também relatados (McDonough et al.,

2002). Desse modo, a classificação do linfoma intravascular em cães permanece inconsistente

e até o momento, nenhuma das classificações sugeridas foi reconhecida pela OMS para esses

tumores caninos.

75

Baseado em um número considerável de descrições (McDonough et al., 2002; Kent et al.,

2001; Lane et al., 2002; Machado et al., 2011; Oliveira et al., 2015), o linfoma intravascular

é, em cães, comprovadamente uma condição que possui alta predileção pelo SNC, afetando-o

exclusivamente ou concomitante a diversos outros órgãos. Apesar disso, nos casos aqui

descritos, o SNC foi poupado, existindo acometimento concomitante do fígado, dos

linfonodos periportais e da bolsa escrotal no Caso 1 e unicamente dos rins no Caso 2.

Os achados anatomopatológicos vistos no fígado e nos linfonodos do cão do Caso 1 foram

semelhantes aos descritos na literatura, todavia, o acometimento cutâneo apresentou uma

diferença significativa quando comparado ao o que já foi relatado. Há apenas um relato em

cães de linfoma intravascular envolvendo concomitantemente a pele e o SNC (McDonough et

al., 2002; Vangessel et al., 2000). Nesse caso, as lesões cutâneas eram caracterizadas

macroscopicamente por múltiplas massas, semelhantes a placas, firmes e vermelho-

enegrecidas, diferentemente do que foi visto no Caso 1, no qual o edema foi o único achado

da bolsa escrotal.

O acometimento dos rins pelo linfoma intravascular é descrito como parte de uma doença

multissistêmica (McDonough et al., 2002), não existindo relatos de envolvimento

exclusivamente renal. À vista disso, o Caso 2 é, possivelmente, a primeira descrição de um

linfoma intravascular afetando bilateral e unicamente os rins de um cão.

Os principais diagnósticos diferenciais para o linfoma intravascular incluíram linfomas

angiotrópicos, como a granulomatose linfomatoide, e sarcomas histiocíticos. Essas duas

condições foram excluídas como prováveis diagnósticos basicamente devido ao padrão de

proliferação celular. Nos linfomas angiotrópicos, os linfócitos neoplásicos formam

aglomerados celulares perivasculares (padrão angiocêntrico), frequentemente com infiltração

transmural da parede vascular (padrão angioinvasivo) (Park et al., 2007; Fitzgerald et al.,

1991). Adicionalmente, a população de linfócitos neoplásicos é mista, compostas por

pequenas células T e por grandes células B entremeadas a histiócitos e menor quantidade de

neutrófilos e eosinófilos (Valli et al., 2016), diferente da população puramente linfoide T

observada em nossos casos. O sarcoma histiocítico é caracterizado por uma densa proliferação

de células organizada em manto que substitui difusamente o tecido afetado, incluindo os

vasos (Valli et al., 2016; Moore, 2014). Portanto, as únicas semelhanças entre os casos

76

relatados por nós e o sarcoma histiocítico foram a acentuada atipia e a presença de células

neoplásicas multinucleadas, que diante da intensa imunomarcação para linfócitos T

permitiram descartar esse diagnóstico.

77

Figura 1. Fígado, linfoma intravascular de grandes células T. Hepatomegalia difusa. Observe o deslocamento do fígado para além do arco costal e o arredondamento das bordas.

Figura 2. Linfonodos periportais, linfoma intravascular de grandes células T. Linfadenomegalia acentuada que circunda e comprime extraluminalmente a veia porta.

78

Figura 3. Bolsa escrotal, linfoma intravascular de grandes células T. Superfície de corte demonstrando marcado edema escrotal. O testículo foi seccionado para dar uma ideia comparativa de volume e para mostrar que não está afetado.

Figura 4. Rim, linfoma intravascular de grandes células T. Perda da relação corticomedular devido à acentuada distensão da medular.

79

Figura 5. Fígado, linfoma intravascular de grandes células T. Infiltrado intravascular de grandes células redondas. HE. Obj.4x.

Figura 6. Fígado, linfoma intravascular de grandes células T. Maior aumento da figura anterior (Fig. 5). Observe que as células neoplásicas não afetam o parênquima, limitando-se apenas ao lúmen vascular. HE. Obj.20x.

80

Figura 7. Rim, linfoma intravascular de grandes células T. Vasos sanguíneos da medular externa completamente obliterados pelas células neoplásicas. Note a ausência quase completa de túbulos. HE. Obj.10x.

Figura 8. Rim, linfoma intravascular de grandes células T. Maior aumento da figura anterior (Fig. 7). Observe que as células neoplásicas não afetam o parênquima, limitando-se apenas ao lúmen vascular. HE. Obj.20x.

81

Figura 9. Rim, linfoma intravascular de grandes células T. Padrão monomórfico formado por células redondas com citoplasma abundante, núcleos redondos ou ovais, constituídos por cromatina frouxa, por vezes vesicular, e nucléolos conspícuos. HE. Obj.40x.

Figura 10. Fígado, linfoma intravascular de grandes células T. Padrão pleomórfico formado por células redondas de diferentes dimensões e padrões nucleares. A anaplasia é intensa e a quantidade de nucléolos por células impressiona. HE. Obj.40x.

82

Figura 11. Rim, linfoma intravascular de grandes células T. Forte imunomarcação citoplasmática confirmando a origem linfoide T das células. Método da estreptavidina-biotina (CD3). Obj.40x.

Figura 12. Fígado, linfoma intravascular de grandes células T. Forte imunomarcação citoplasmática confirmando a origem linfoide T das células. Método da estreptavidina-biotina (CD3). Obj.40x.

83

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86

5 ARTIGO 4 –

Artigo a ser submetido para a revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e

Zootecnia

Reticulose pagetoide em um cão

[Pagetoid reticulosis in a dog]

R.D. Mazaro1, F.S. Luz1, D.M. Lorensetti2, G. Hartmann2, R.A. Fighera3*

1Aluna do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Universidade Federal de

Santa Maria – UFSM – Santa Maria, RS 2Aluno de graduação em Medicina Veterinária - Universidade Federal de Santa Maria –

UFSM – Santa Maria, RS 3Professor do Laboratório de Patologia Veterinária – Universidade Federal de Santa Maria –

UFSM - Santa Maria, RS

*Autor para correspondência: Rafael Fighera, Laboratório de Patologia Veterinária,

Departamento de Patologia, Centro de Ciências da Saúde (CCS), UFSM, Av. Roraima 1000,

Camobi, Santa Maria, RS, 97105-900.

E-mail: anemiaveterinaria@yahoo.com.br

RESUMO

Reticulose pagetoide é uma das mais raras formas de linfoma descritas em cães. Trata-se de

um distúrbio linfoproliferativo cutâneo que emerge de linfócitos T intraepidérmicos.

Descreve-se aqui um caso de reticulose pagetoide com apresentação localizada, que acometeu

um cão, Boxer, fêmea, de 10 anos de idade, muito semelhante a doença de Woringer-Kolopp

dos humanos. O paciente foi atendido devido ao aparecimento de um nódulo na região

nasolabial com evolução clínica de cerca de 30 dias. Histologicamente, esse nódulo era

composto por uma proliferação linfoide intraepidérmica e anexal. Os linfócitos neoplásicos,

células T confirmadas através da imunomarcação positiva para CD3 e negativa para CD79,

eram grandes células redondas e monomórficas. Apesar de raro, a reticulose pagetoide é um

distúrbio linfoproliferativo de fácil suspeita com base apenas na morfologia celular. Esse

87

neoplasma deverá ser lembrado sempre que um padrão linfoide intraepidérmico estiver

presente.

Palavras-chave: linfoma cutâneo, linfoma epiteliotrópico, doença de Woringer-Kolopp.

ABSTRACT

Pagetoid reticulosis is an expression used one of ther are forms of lymphoma described in

dogs. It is a cutaneous lymphoproliferative disorder that emerge from intraepidermal T-cells.

We describe a case of pagetoide reticulosis with localized presentation, very similar to

Woringer-Kolopp's disease in humans, which affected a 10-year-old Boxer female. The

patient was attended due to the appearance of a nodule in the nasolabial region with clinical

evolution of about 30 days. Histologically, it was composed of an intraepidermal and anexal

lymphoid proliferation. Neoplastic lymphocytes, T-cells confirmed by CD3-positive and

CD79-negative immunolabeling, were large, round, and monomorphic cells. Although rare,

pagetoid reticulosisis an easily suspected lymphoproliferative disorder based only on cell

morphology. This neoplasm should be remembered whenever an intraepidermal lymphoid

pattern is present.

Key-words: cutaneous lymphomas, epitheliotropic lymphomas, Woringer-Kolopp's disease.

INTRODUÇÃO

A reticulose pagetoide, também conhecida como doença de Woringer-Kolopp, foi

primeiramente descrita na França, na década de 1930, por Frederick Woringer e Pierre

Kolopp, em um menino de 13 anos que apresentava uma placa eritematosa na região do

antebraço. Em 1973 Braun-Falco designou essa condição como reticulose pagetoide devido à

distribuição intraepidérmica das células linfoides, semelhante à doença de Paget do mamilo

(Steffen, 2005).

Reticulose pagetoide ocorre raramente em cães, o que corrobora com o pequeno número de

casos relatados nessa espécie (Shadduck et al., 1978; Johnson & Patterson, 1981). É

considerada uma desordem cutânea linfoproliferativa benigna originária de linfócitos T,

especialmente um tipo de linfoma cutâneo epiteliotrópico, que se caracteriza pela presença de

88

pápulas, nódulos ou placas solitárias, eritematosas e/ou queratóticas, ulceradas ou não

(Shadduck et al., 1978; Johnson & Patterson, 1981; Valli et al., 2002), localizadas

principalmente nas junções mucocutâneas e nas extremidades dos membros, especialmente

nos coxins digitais (Gross et al., 2005). Além de cães, as únicas outras espécies animais em

que a doença já foi descrita incluem, até o momento, alpaca (Vicugna pacos) (Hasbach &

Stern, 2016), camundongo (Abbott et al., 1991) e porquinho-da-índia (Martorell et al., 2011).

Em dermatopatologia humana, diferente do que ocorre em cães, a reticulose pagetoide é

considerada uma variação da micose fungoide (Willemze et al., 2005; Swerdlow et al., 2016),

existindo duas apresentações clínicas que incluem, lesões cutâneas solitárias (doença de

Woringer-Kolopp) ou múltiplas (doença de Ketron-Goodman). Histologicamente, essas duas

apresentações são idênticas, a diferença está no comportamento biológico. Para alguns autores

(Swerdlow et al. 2016, Willemze et al. 2005), a doença de Ketron-Goodman, devido à sua

agressividade, com a possibilidade de envolvimento sistêmico, deve ser reconhecida como

uma variante de micose fungoide e o termo reticulose pagetoide deve ser empregado,

unicamente, para a forma solitária da doença (doença de Woringer-Kolopp).

Baseando-se na raridade com que essa forma de linfoma cutâneo é descrita na medicina

veterinária, este relato tem como objetivo descrever um caso de reticulose pagetoide

localizada em um cão, abordando os achados macroscópicos, histopatológicos e imuno-

histoquímicos e, com isso, auxiliar patologistas veterinários na condução de seu diagnóstico,

incluindo a reticulose pagetoide como um possível diagnóstico diferencial de tumores

cutâneos que ocorrem na forma de nódulo em cães.

CASUÍSTICA

O caso descrito é proveniente da rotina de patologia cirúrgica do Laboratório de Patologia

Veterinária (LPV) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). O espécime de biópsia

foi fixado em solução de formol tamponado a 10%, processado rotineiramente para

histopatologia e corado pela Hematoxilina-Eosina (HE). A fim de determinar a origem para os

linfócitos neoplásicos, secções dos mesmos fragmentos de tecido corados pela HE foram

submetidos à técnica de imuno-histoquímica (IHQ) enzimática. A técnica foi empregada

realizando imunomarcação para linfócitos T e B, utilizando, respectivamente, o anticorpo para

CD79 e para CD3, seguindo o protocolo padronizado no LPV-UFSM descrito a seguir.

89

Após a desparafinização e reidratação dos tecidos foi realizada a recuperação antigênica com

solução de Tris-EDTA (pH 9,0) no forno de micro-ondas, em alta potência, por 10 minutos.

Para realizar o bloqueio da peroxidase endógena foi utilizado peróxido de hidrogênio a 3%

por 20 minutos. O bloqueio das reações inespecíficas foi realizado com Protein Block por 10

minutos em temperatura ambiente. Como anticorpo primário foram utilizados os anticorpos

monoclonal anti-CD79 (Clone JCB117, Dako Cytomatic; pré-diluído) e monoclonal anti-CD3

(Clone F7.2.38, Dako Cytomatic; pré-diluído) produzidos em camundongo. Ambos os

anticorpos foram incubados por 60 minutos em estufa a 37°C. O anticorpo secundário e o

Polímero Reveal Complement e Reveal HRP Conjugate HRP foram utilizados

consecutivamente, incubados a 25°C por 30 minutos e revelados através da adição do

cromógeno tetracloreto de 3-3’ diaminobenzidina (DAB) por cinco minutos. A contra-

coloração foi realizada com Hematoxilina de Harris. Linfonodos de cães foram utilizados

como controle positivo e o controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário.

Para a obtenção do último, foi utilizada apenas a solução de Tris-EDTA (pH 9,0).

Um canino, Boxer, fêmea, com 10 anos de idade, chegou para atendimento no Hospital

Veterinário Universitário (HVU) da UFSM por apresentar um nódulo, de 3 cm de diâmetro,

em região nasolabial. Segundo o proprietário, a evolução da lesão era de cerca de 30 dias. Foi

realizada biópsia excisional com posterior encaminhamento para avaliação histopatológica no

LPV-UFSM.

Macroscopicamente, o nódulo era recoberto por pele parcialmente ulcerada, macio ao toque e

ao corte. A superfície de corte era homogeneamente branca. Histologicamente, era composto

por uma proliferação densamente celular, bem demarcada, não encapsulada e infiltrativa,

restrita à epiderme (Figuras 1 e 2) e ao epitélio anexal (Figura 3). O padrão de organização

celular era caracterizado por ninhos de dimensões variáveis separados por queratinócitos

remanescentes. Nas áreas mais afetadas, em que a quantidade de células neoplásicas era

maior, restavam poucos e achatados queratinócitos circundando esses ninhos (Figura 4). As

células eram redondas, de limites celulares distintos, compostas por moderada quantidade de

citoplasma claro, que lhes dava um aspecto de “vazio citoplasmático”. Os núcleos eram

redondos, ovais ou reniformes, localizados centralmente e constituídos por cromatina

frouxamente arranjada, por vezes, vesicular. Os nucléolos eram, em sua maioria, únicos,

grandes, basofílicos e variavelmente evidentes (Figura 5). A fim de confirmar o diagnóstico

90

de linfoma e determinar a origem dos linfócitos neoplásicos, IHQ para CD79 e CD3 foi

realizada, e revelou intensa imunomarcação para linfócitos T (anti-CD3) (Figura 6) e ausência

de imunomarcação para linfócitos B (anti-CD79), o que nos permitiu estabelecer o

diagnóstico de reticulose pagetoide.

DISCUSSÃO

Em humanos, a reticulose pagetoide (doença de Woinger-Kolopp) é classicamente uma

condição localizada, caracterizada macroscopicamente pela presença de lesões cutâneas,

solitárias, na forma de pápulas, nódulos ou placas, eritematosas e/ou queratóticas, localizadas

geralmente nas extremidades dos membros (Haghighi et al., 2000; Lee et al., 2008; Ledet et

al., 2016). O padrão macroscópico (nódulo) e a localização da lesão cutânea (junção

mucocutânea) observada neste caso são similares ao que é descrito para a reticulose pagetoide

(doença de Woringer-Kolopp) na literatura veterinária (Gross et al., 2005; Martorell et al.,

2011; Hasbach & Stern, 2016). No entanto, uma diferença importante entre este caso e os

casos descritos em animais foi encontrada. Lesões cutâneas numerosas distribuídas

multifocalmente pela superfície corporal, exsudativas ou não, lembrando dermatopatias

fúngicas ou imunomediadas, foram relatadas (Shadduck et al., 1978; Martorell et al., 2011;

Hasbach & Stern, 2016). Uma possível explicação para essa diferença no padrão de

distribuição das lesões cutâneas poderia ser um maior período de evolução das lesões, bem

como o tempo necessário para a realização do diagnóstico definitivo.

Apesar das variações macroscópicas mencionadas anteriormente, tanto em humanos como em

animais, a reticulose pagetoide (doença de Woringer-Kolopp) é histologicamente sempre

caracterizada por uma proliferação de linfócitos neoplásicos confinados à epiderme e ao

epitélio anexal e, quando submetidos à técnica de imuno-histoquímica, são intensamente

positivos para o marcador de linfócitos T (anti-CD3) e negativas para o marcador de linfócitos

B (anti-CD79) (Haghighi et al., 2000; Gross et al., 2005; Martorell et al., 2011; Hasbach &

Stern, 2016, Ledet et al., 2016), a exemplo do caso aqui relatado.

Como diagnósticos diferenciais macroscópicos foram incluídos todos aqueles tumores de pele

que ocorrem na forma de nódulos cutâneos solitários em cães, porém quanto à histopatologia,

a micose fungoide e o linfoma cutâneo não epiteliotrópico foram os principais diferenciais

considerados. Na micose fungoide, a proliferação de linfócitos neoplásicos ocorre a partir da

91

porção superior da derme, comprimindo e invadindo a epiderme difusamente ou na forma

pequenos agregados celulares denominados como microabscessos de Darier-Pautrier (Moore

et al. 2009). Isso é diferente da forma de linfoma apresentada aqui, em que os linfócitos

neoplásicos estão restritos à epiderme e ao epitélio anexal, poupando a derme, provocando o

seu espessamento, enão apenas sua compressão, reforçando o diagnóstico de reticulose

pagetoide. No linfoma cutâneo não epiteliotrópico, a derme e o tecido subcutâneo são

infiltrados por linfócitos neoplásicos organizados na forma de manto ou como agregados

perivasculares, não ocorrendo epiteliotropismo (Gross et al., 2005; Moore et al., 2013). A

presença do epiteliotropismo e o não acometimento subcutâneo foram, para este caso, os

critérios fundamentais para a exclusão do diagnóstico de linfoma cutâneo não epiteliotrópico.

Ainda que a reticulose pagetoide seja uma condição rara em cães, ela deve ser incluída no

plano diagnóstico de tumores cutâneos que ocorrem na forma de nódulos solitários nessa

espécie, principalmente para aqueles casos em que acomete junções mucocutâneas.

92

Figura 1. Pele, reticulose pagetoide. Infiltrado intraepidérmico de grandes células redondas que causa espessamento na forma de “cristas de rede”. HE. Obj.4x.

Figura 2. Pele, reticulose pagetoide. Maior aumento da figura anterior (Fig. 1). Observe que as células neoplásicas não afetam a derme superficial, limitando-se apenas à epiderme. HE. Obj.10x.

93

Figura 3. Pele, reticulose pagetoide. Mesmo padrão epiteliotrópico visto nas figuras anteriores, nesta imagem acometendo a parede do folículo piloso. HE. Obj.20x.

Figura 4. Pele, reticulose pagetoide. Ninhos formados pelo “aprisionamento” de grandes células redondas entre os queratinócitos. HE. Obj.20x.

94

Figura 5. Pele, reticulose pagetoide. Ninhos de células redondas com citoplasma abundante e de aspecto “vazio” com núcleos redondos ou reniformes, constituídos por cromatina frouxamente arranjada, por vezes vesicular, e nucléolo variavelmente evidente. HE. Obj.20x.

Figura 6. Pele, reticulose pagetoide. Forte imunomarcação citoplasmática confirmando a origem linfoide T das células. Método da estreptavidina-biotina (CD3). Obj.20x.

95

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97

6 DISCUSSÃO

Nesta Dissertação são incluídos quatro artigos referentes às descrições

anatomopatológicas de apresentações incomuns ou raras do linfoma em cães.

Todos os casos incluídos neste estudo são pertencentes à rotina de necropsias do

LPV-UFSM e ocorreram entre os anos de 1965 e 2017. Nesse período, 9.020 cães

foram necropsiados. Destes, 100 cães foram diagnosticados, à necropsia, com

linfoma, a partir dos quais foram diagnosticados oito tipos e/ou subtipos histológicos,

incluindo linfoma folicular (5/100 [5%]), linfoma de células T periférico inespecífico

(2/100 [2%]), linfoma angiocêntrico (2/100 [2%]), linfoma intravascular de grandes

células T (2/100 [2%]), granulomatose linfomatoide (2/100 [2%]), linfoma de grandes

células anaplásicas (1/100 [1%]), linfoma hepatoesplênico de células T (1/100 [1%])

e linfoma linfocítico crônico de pequenas células B – tipo intermediário (1/100 [1%]).

O Artigo 1 foi elaborado com o objetivo de demonstrar aos Médicos Veterinários

Patologistas interessados em oncopatologia canina que, embora tais linfomas não

sejam muito prevalentes, eles ocorrem, e seu reconhecimento é fundamental para

uma boa condução diagnóstica em suas rotinas de necropsia ou patologia cirúrgica.

O Artigo 2 é referente aos achados epidemiológicos, clínicos e

anatomopatológicos dos cinco casos de linfoma folicular incluídos em nosso estudo.

Esse trabalho foi elaborado diante da seguinte problemática: o cão é utilizado como

um modelo para o estudo dos linfomas não Hodgkin em humanos, no entanto, o

linfoma folicular tão comum em humanos, representando entre 14,2% e 20,1% de

todos os linfomas não Hodgkin, é raramente descrito em cães. Diante disso, o

objetivo principal desse trabalho foi fornecer dados para o estudo comparativo da

doença e, adicionalmente, auxiliar Médicos Veterinários Patologistas no diagnostico

dessa condição em cães.

O Artigo 3 descreve dois casos de linfoma intravascular de grandes células T em

dois cães, esse trabalho foi realizado devido à diferença imunofenotípica

encontrada, considerando que o linfoma intravascular é originalmente classificado

em cães, segundo critérios estabelecidos pela OMS, como um linfoma originário de

células B, diferente do que foi observado em nossos dois casos, quando intensa

imunomarcação para linfócitos T foi encontrada.

O Artigo 4 descreve um caso de reticulose pagetoide em um cão. Tal doença é

considerada uma rara forma de apresentação do linfoma cutâneo epiteliotrópico, que

98

talvez por desconhecimento, tem sido diagnosticada erroneamente como micose

fungoide, a forma clássica e mais frequente da doença.

99

7 CONCLUSÕES

Artigo 1

Apesar do linfoma ser um neoplasma facilmente reconhecido entre patologistas

veterinários, incomumente (16% das vezes) casos não tradicionais dessa importante

forma de câncer poderão ser encontrados. Esses casos correspondem não apenas

a linfomas solitários, extranodais e mistos, mas também a apresentações

microscópicas distintas. Esperamos que os resultados aqui demonstrados auxiliem

patologistas veterinários a reconhecerem tais casos de “linfomas atípicos” em suas

rotinas anatomopatológicas.

Artigo 2

Linfomas foliculares demonstraram ser uma rara forma de distúrbio linfoproliferativo

em cães também em nossa região (Região Central do RS, Brasil) e, diferentemente

do que ocorre em humanos e de como vem sendo relatado em cães (“linfomas

indolentes”), todos os casos evoluíram de forma agressiva e com desfecho fatal,

assemelhando-se muito, do ponto de vista do comportamento biológico, aos

linfomas difusos não Hodgkin.

Artigo 3

Apesar de raro, o linfoma intravascular é um distúrbio linfoproliferativo de fácil

suspeita com base apenas na morfologia celular. Esse neoplasma deverá ser

lembrado sempre que um padrão linfoide intravascular estiver presente.

Artigo 4

Apesar de raro, a reticulose pagetoide é um distúrbio linfoproliferativo de fácil

suspeita com base apenas na morfologia celular. Esse neoplasma deverá ser

lembrado sempre que um padrão linfoide intraepidérmico estiver presente.

100

8 REFERÊNCIAS

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