• Alto campo magnético externo cria uma magnetização (alinha os spins) quebra a degenerescência dos níveis de energia • Campo eletromagnético oscilante gira a magnetização provoca transições entre os níveis de energia • Interações deslocamento químico; dipolar; escalar; núcleo-elétron; quadrupolar) deslocamento e/ou desdobramento dos níveis de energia definem as posições das linhas de ressonância no espectro • Relaxação longitudinal; transversal decaimento da magnetização retorno ao equilíbrio FID (Free Induction Decay) linhas de largura não nula e intensidade finita

Relembrando - RMN

Núcleo (relativo) 0 em 14 T abundância sensibilidade natural (relativa)

Núcleos de spin ½

Bo

E

2

0BhE

14T

1H = 600 MHz

13C = 150 MHz

14T

Núcleos de spin ½

Experimento 1D mais simples Parâmetros:

• número de repetições – aumentar relação sinal/ruído • número de repetições “dummy” – equilibrar a amostra • largura espectral (ppm) • centro do espectro (ppm) • resolução espectral (pontos) – define tempo da aquisição (acq) • tempo morto (d1) entre as repetições (ms) – para sistema relaxar • duração (p1) e potência do pulso de 90 (us, dB) • ganho do sinal

Relaxação

Relaxações Induzidas por processos a nível molecular Interações dos spins nucleares com sua vizinhança (trocas de energia) Processos dependentes do tempo (movimento Browniano molecular) Flutuações do campo magnético local

• Relaxação longitudinal ou spin-rede (R1,T1) Troca de energia entre spin e rede Sistema dissipa excesso de energia aos arredores Volta ao equilíbrio térmico (mínima entalpia) T1 mede o tempo para que a magnetização longitudinal (em z) seja recuperada Determina, predominantemente, a intensidade do sinal observado

• Relaxação transversal (R2, T2) Troca de energia entre spin e spin Sem mudança da energia total do sistema Processos independentes do tempo também irão contribuir Difusão dos spins sobre o cone (máxima entropia) T2 mede o tempo para que a magnetização transversal (em xy) seja perdida Determina a largura do sinal observado

http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/other/t1t2/t1t2.html

Medida de T1 (longitudinal; spin-rede)

Após pulso de (180)x: Após : Após um novo pulso de (90)x é feita a aquisição. A intensidade do sinal será nula em:

http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/other/t1t2/t1t2.html

Medida de T2 (transversal; spin-spin)

Após pulso de (90)x:

A magnetização começa a perder a coerência no plano xy:

Após é dado um novo pulso de (180)y que irá refocalizar a magnetização. Após a refocalização estará completa, e é feita a aquisição. Variar =2 e obter os espectros. Simular seus máximos pela equação acima.

Mecanismos de relaxação

Cinco mecanismos de relaxação são relevantes em RMN de sistemas biológicos: • Relaxação pela anisotropia de descolamento químico (desprezível em 1H) Campo magnético local causado pela núvem eletrônica é anisotrópico, variando com o movimento Browniano molecular.

• Relaxação dipolar (predominante em 1H) Interação dipolar é promediada a zero em líquidos, porém a rápida reorientação molecular origina campos flutuantes que estimulam a relaxação.

• Relaxação via acoplamento escalar JAX pode ser dependente do tempo (relaxação escalar do primeiro tipo); campo magnético em X na posição de A pode ser modulada pela relaxação de X (relaxação escalar do segundo tipo).

• Relaxação paramagnética (presença de elétrons desemparelhados) Predomina sobre relaxações de spin nuclear

• Relaxação quadrupolar (núcleos com spin > ½)

As taxas de relaxação serão função das probabilidades de relaxação W1

I, W1S, W0

IS e W2IS.

W1

I, W1S : single quantum

SINAL W0

IS : zero quantum W2

IS : double quantum

não são observadas normal- mente, porém podem estar presentes em mecanismos de relaxação

bI bS

I S

bI S

I bS

W1S

W1S

W1I

W1I

W2IS

W0IS

Caminhos de relaxação

Considerando um sistema I S (por exemplo 15N 1H). sistema em equilíbrio aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações)

bI bS

I S

bI S

I bS

bI bS

I S

bI S

I bS

Relaxação longitudinal

sistema relaxando, caso sistema relaxando, caso W0

IS e W0IS forem nulos W0

IS e W0IS forem não-nulos

A intensidade de ressonância do spin S vai depender essencialmente da diferença de população entre os níveis de energia envolvendo transições S (no exemplo, = 2).

bI bS

I S

bI S

I bS

W1S

W1S

bI bS

I S

bI S

I bS

W1S

W1S

W2IS

W0IS

Analisando as diferenças de população intensidade do sinal

• Sistema em equilíbrio (N = 4; = 2).

Diferença de população entre os níveis de transição W1

I 2 = W1

S 2 = W0

IS 0 W2

IS 4 = 2

bI bS

I S

bI S

I bS

N

N

N+

N-

• aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações).

Diferença de população entre os níveis de transição W1

I 2 = W1

S 0 W0

IS 2 = W2

IS 2 =

bI bS

I S

bI S

I bS

N+/2

N-/2

N+/2

N-/2

• o sistema vai relaxar, tentando retornar às diferenças de população entre os níveis de transição.

No equilíbrio Fora do equilíbrio Diferença W1

I 2 = W1I 2 = = 0 (em equilíbrio)

W1S 2 = W1

S 0 = 2 = (transições) Caso o caminho de relaxação W1

S for possível, o sistema retornará ao equilíbrio sem a necessidade de utilizar os caminhos W0

IS e W2IS .

Mas se o caminho de relaxação W1

S estiver impedido, por exemplo, por uma saturação continuamente aplicada? O sistema terá de utilizar os caminhos W0

IS e W2IS para

relaxar EXPERIMENTO NOE (Nuclear Overhauser Enhancement). • Relaxação cruzada (): Ocorre quando dois spins estão próximos no espaço Obtida através da medida do NOE

Experimento NOE

Considerando um sistema I S (por exemplo 15N 1H). sistema em equilíbrio aplicando a RF: saturando S (equalizando suas populações)

bI bS

I S

bI S

I bS

bI bS

I S

bI S

I bS

Mantendo a saturação em S "ligada", o caminho W1S não poderá ser utilizado para

relaxar. O sistema só tem duas maneiras de relaxar:

No equilíbrio Fora do equilíbrio Diferença

W1I 2 = W1

I 2 = = 0 (em equilíbrio) W1

S 2 = W1S 0 = 2 = (fixa pela saturação)

W0IS 0 W0

IS 2 = = 2 = (transições) W2

IS 4 = 2 W2IS 2 = = 2 = (transições)

W0IS

bI bS

I S

bI S

I bS

W2IS

bI bS

I S

bI S

I bS W1I

W1I

W1I

W1I

Devido ao caminho W0IS teremos:

W0

IS aumenta a população no topo de uma transição I diminui a população na base da outra transição I

diminui a diferença de população entre os níveis I

diminui o sinal das transições I

N+/2-d

N-/2+d

N+/2

N-/2

W0IS

W1I

W1I

Devido ao caminho W2IS teremos:

W2

IS diminui a população no topo de uma transição I aumenta a população na base da outra transição I

aumenta a diferença de população entre os níveis I

aumenta o sinal das transições I

N+/2

N-/2

N+/2+d

N-/2-d

W1I

W1I

W2IS

Tendência de W0IS diminuir o sinal das transições I devido à saturação em S

Tendência de W2IS aumentar o sinal das transições I devido à saturação em S

Essas tendências são contrabalanceadas por W1

I (que já está em equilíbrio). Resultado líquido depende do balanço W0

IS /W1I e W2

IS /W1I

W0

IS dominante sobre W1I NOE NEGATIVO (moléculas grandes)

W2IS dominante sobre W1

I NOE POSITIVO (moléculas pequenas) Origem das transições W0

IS e W2IS : campos flutuantes devido aos dipolos nucleares.

NMR em soluções:

• movimento molecular rápido interação dipolar é promediada a zero • rápida reorientação molecular origina campos flutuantes estimulam relaxação

NOE irá depender da distância internuclear (NOE d-6) NOE fornecerá informações de distância!!

http://nmr.wvu.edu/manuals/1_d_experiments/1d_noe_difference