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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DEPARTAMENTO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC CNPq e PIBIC UFPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : 08/2004 a 07/2005. ( ) PARCIAL ( .X. ) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Biotecnologia Aplicada em Humanos: Diagnóstico de Doenças Genéticas e o Processo de Identificação Cível e Criminal Resolução CONSEP OU NÚMERO DE PORTARIA DE APROVAÇÃO: PPQ/CCB/0045/1998

Nome do Orientador: Ândrea Kely Campos Ribeiro dos Santos Titulação do Orientador: Doutorado Departamento: Patologia Unidade: Centro de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Genética Humana e Médica Título do Plano de Trabalho : Modulação Genética na Resposta ao Tratamento da Aids. Nome do Bolsista: Sérgio Alexandre Barros Monteiro Tipo de Bolsa : ( ) CNPq ( X ) PIBIC/UFPA

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1. INTRODUÇÃO A AIDS é uma pandemia causada por em retrovírus (HIV), que infecta linfócitos CD4+

(auxiliares), destruindo o sistema imune. Tida como uma doença crônica e progressiva, uma vez

que a sua evolução se caracteriza por uma elevada taxa de replicação viral. O indivíduo infectado,

normalmente, vai a óbito devido a infecções oportunistas e/ou outras afecções, como neoplasias. O

tratamento busca reduzir essas taxas de reprodução proporcionando à esses individuos uma maior

sobrevida e uma melhora na qualidade de vida (Wigg, 2002).

A utilização de uma terapia anti-retroviral, como o uso de inibidores da transcriptase reversa

de nucleosídeos (NRTIs), tem reduzido a morbidade e a mortalidade ocasionada pela doença

(Kakuda, 2000), no entanto, para uma efetiva erradicação do vírus se requer, obrigatoriamente, um

tratamento a longo-termo. O aparecimento de efeitos colaterais adversos (toxidade) decorrente do

uso desses fármacos na terapia atual torna-se um obstáculo significante para esse tipo de tratamento.

Uma vez iniciada a terapia com os NRTIs, esse medicamento atuará diretamente na redução

da duplicação da carga viral, quer seja pela (1) competição para incorporação com ácidos nucleícos

endógenos e/ou (2) prematura terminação do enlongamento da cadeia genética. Nos últimos anos

diferentes estudos têm demonstrado um grau de similaridade entre o amplo espectro de sintomas da

toxidade induzida pelo uso prolongado do fármaco, como neuropatia periférica, miopatias

esqueléticas, doenças hepáticas, acidose lática, lipodistrofia e a cardiomiopatias; e manifestações

clínicas decorrentes de defeitos geneticamente herdados do DNA mitocondrial (para uma revisão

atualizada ver Lewis et al.,2003; Lim et al., 2003; Dagan et al., 2002).

As mitocôndrias são a única organela de eucariotos que apresentam DNA próprio e herança

exclusivamente materna. A molécula de DNA mitocondrial (mtDNA) tem 16.569pb e está

localizada dentro da matriz mitocondrial (Anderson et al., 1981; Andrews et al., 1999). Apresenta

uma única região não codificante, denominada de alça-D, responsável pelo inicio da replicação do

mtDNA. A ausência de enzimas de reparo para a retirada de possíveis erros na replicação deste

genoma, a falta de histonas protetoras e a proximidade do mtDNA em relação à agentes

oxidantes, são fatores que podem contribuir para o surgimento de mutações somáticas, diminuição

da replicação do genoma mitocondrial e stress oxidativo (o aumento de radicais livres no estroma

mitocondrial). Desta forma; os fatores mencionados acima podem ser responsáveis pelo menos em

parte, pelos efeitos colaterais observados mediante a terapia prolongada.

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2. JUSTIFICATIVA

A terapia anti-retroviral recomenda (na maioria dos casos) o uso de dois inibidores da

transcriptase reversa de nucleosideos (NRTIs), mais um inibidor da protease e/ou inibidor não-

nucleosídeo da transcriptase reversa. O uso desses agentes, como parte de uma ação efetiva na

terapia anti-retroviral tem reduzido a morbidade e mortalidade ocasionada pela doença do HIV,

assim como, a incidência de infecções oportunistas (Kakuda, 2000).

As NRTIs são derivados de adenosina, citidina, guanosina e timidina, desta forma elas são

substratos alternativos para a DNA polimerase. Esses componentes apresentam uma importante

modificação química no composto 3’- OH do açúcar, que impede o ataque de subseqüentes de

ácido nucléicos (Dagan et al., 2002). Desta forma os NRTIs podem impedir a transcrição por duas

vias: i) Pela competição para incorporação, com ácidos nucléicos endógenos; e ii) Pela prematura

terminação do enlogamento da cadeia. Sabe-se que a transcriptase reversa do HIV, assim como,

DNA polimerase dependente de RNA, são particularmente sensíveis aos efeitos de NRTIs

(Lewis,2003).

A utilização contínua dos NRTIs em pacientes infectados pelo HIV está associada diretamente

aos sintomas clínicos observados em indivíduos, que apresentam distúrbios genéticos herdados do

DNA mitocondrial. Estes sintomas podem ocorrer em função à diminuição da replicação do

mtDNA e do acúmulo de mutações somáticas no genoma mitocondrial em diferentes tecidos. Todas

as possíveis causas acima citadas parecem fazer parte de um ciclo metabólico defeituosos em que a

ação de cada uma das variáveis ainda não esclarecida.

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3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

O presente estudo pretende investigar o genoma mitocondrial (mtDNA) de pacientes

infectados pelo HIV, em tratamento com NRTIs, assim como, de portadores do vírus sem

tratamento, em relação à modulação da resposta à terapia anti-retroviral e das anti-patologias

oportunistas, atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) pelo Hospital Universitário João de

Barros Barreto ( HUJBB).

3.1.1 Objetivos Específicos

i) Investigação das alterações mitocondriais (variabilidade genética) de 30 pacientes

portadores de HIV-1, virgens de tratamento com NRTIs (esses pacientes serão

investigados em relação as alterações mitocondriais referentes a região controladora

responsável pela replicação do genoma mitocondrial).

i i ) Na segunda etapa investigaremos as alterações mitocondriais somáticas em três

momentos diferentes, os mesmos 30 pacientes da etapa anterior, já em terapia com

NRTIs (durante esta etapa o paciente deverá ser acompanhado de perto por um clínico

o qual será o responsável pela descrição dos efeitos colaterais – toxidade mitocondrial

– apresentado por cada paciente em cada uma das três etapas da

pesquisa).Levantamento estatístico das freqüências das mutações herdadas, obtidas na

primeira etapa do trabalho, com amostras de pacientes virgens de tratamento;

iv) Levantamento estatístico das freqüências das mutações somáticas, obtidas a partir da

segunda etapa, com amostras de pacientes que iniciaram a terapia ou já se encontram

em tratamento prolongado com NRTIs.

v) Comparação dos dois grupos a amostras e a verificação (estatística) da existência ou

não de um limite, a partir do qual as alterações somáticas mitocôndrias começam

(acima descritas) a ocasionar efeitos colaterais prejudiciais sobre a replicação e o

funcionamento das mitocôndrias.

vi) Levantamento dos principais quadros clínicos observados durante as diferentes etapas

da pesquisa, associadas às alterações observadas.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Populações-Alvo:

Pacientes portadores de HIV-1 e tratados com terapia anti-retroviral (NRTIs – Inibidores de

Nucleosídeos da Transcriptase Reversa; Inibidor da Protease e/ou Inibidor Não-Nucleosídeo da

Transcriptase Reversa), atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) na Casa Dia, CTA/COAS e

no Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB).

4.2. Esclarecimento

O presente projeto foi apresentado para os profissionais de saúde que trabalham diretamente

com os pacientes. Nesta apresentação, foram esclarecidos os objetivos do presente trabalho às

diferentes Instituições envolvidas, como Casa Dia, COAS e HUJBB. Estes profissionais,

transmitiam o objetivo do projeto para cada paciente, que ao aceitar assinavam o “Termo de

Consentimento Livre Esclarecido”.

4.3. Obtenção das amostras

O DNA para análise foi obtido a partir de 5 mL de sangue periférico, utilizando como

anticoagulante o EDTA. Em seguida, o sangue foi centrifugado a 2.000 rpm, durante 10 minutos,

para separação total de hemácias e leucócitos, sendo a camada leucocitária utilizada no processo de

extração de DNA pelo método de extração fenol-clorofórmio.

Para análise molecular, técnicas básicas de biologia molecular, como PCR, Purificação e

Reação de Seqüenciamento foram utilizadas com a finalidade de identificar os pontos de mutações

no DNA mitocondrial por meio do seqüenciamento direto do DNA.

4.4. Extração de DNA

O material genético foi extraído a partir da fração celular pelo método convencional com

fenol-clorofórmio e precipitação com etanol descrito por Sambrook et.al.,(1989), com adaptações

(Figura 01).

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Figura 01: Visualização em gel de agarose a 0,8% da extração de DNA com fenol-

clorofórmio.

4.5. Reação de Cadeia em Polimerase (PCR)

Para a análise dos segmentos estudados foi empregada a técnica de PCR (Polymerase chain

reaction) que usa iniciadores (primers) específicos para o mtDNA, inicialmente descritos por

Torroni et al.,(1992) e Stone e Stoneking (1993). As reações de amplificação das regiões analisadas

tiveram solução final de 25 µL contendo de 100 a 200 ng de DNA (dependendo do segmento).

4.6. Purificação

A purificação dos produtos da amplificação será feita utilizando colunas de Sephadex

medium 50 para purificar o produto da PCR, proporcionando um melhor desempenho para a reação

de sequenciamento.

4.7. Reação de Sequenciamento

O sequenciamento utiliza a amplificação do segmento alvo de 424pb (Sanger et al., 1977).

Essa reação foi realizada com o kit Big DyeTM Terminator que utilizou como enzima a AmpliTaq

DNA Ploymerase (Perkin Elmer) segundo protocolo do kit, sofrendo algumas modificações para

obtenção de melhores resultados.

4.8. Sequenciamento direto do DNA:

O sequenciamento realizou-se segundo a metodologia (Ribeiro-dos-Santos et al., 2002) que

empregou kit DNA sequence kit – BigDyeTM Termination Cycle Sequence no Sequenciados

Automático ABI-PRISM 377 (Apllied Biosytem), pertencentes ao Laboratório de Genética Humana

e Médica.

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5. RESULTADOS

No presente estudo analisamos uma amostra de 30 indivíduos portadores de HIV-1

tratados com terapia anti-retroviral (NRTIs – Inibidores de Nucleosídeos da Transcriptase Reversa;

Inibidor da Protease e/ou Inibidor Não-Nucleosídeo da Transcriptase Reversa), atendidos pelo

Sistema Único de Saúde (SUS) na Casa Dia, CTA/COAS e no Hospital Universitário João de

Barros Barreto (HUJBB). Os indivíduos coletados no CTA/COAS (8 indivíduos) serviram como

amostras controles que apresentavam o vírus, mas não estavam em tratamento com NRTIs.

Nossos resultados não apresentaram diferenças significantes entre os dois grupos de

amostras (CTA/COAS e SUS/HUJBB). Em relação à presença de novas mutações associadas com

prolongamento do tratamento com NRTIs também não observamos nenhuma diferença. Entretanto,

observamos uma grande instabilidade genômica mitocondrial, quando analisamos o seqüenciamento

direto dos pacientes infectados pelo vírus HIV-1 em tratamento no SUS/HUJBB em relação ao

controle CTA/COAS (X2: 13,42 e Grau de Liberdade: 1).

5.1. ANÁLISE DO SEQÜENCIAMENTO DIRETO

A análise da primeira região controladora do DNA mitocondrial, na etapa inicial da

investigação (pacientes portadores de HIV-1 virgens de tratamento com NRTIs) mostra, por meio

do seqüenciamento direto, as mutações existentes no genoma mitocondrial (mtDNA) dos 30

pacientes investigados.

Essa primeira etapa da análise (paciente virgem de tratamento) tem como finalidade

quantificar e criar uma base de dados de mutações do mtDNA, que estão presentes por herança

nesses pacientes. Esse conjunto de dados servirá, em um segundo momento, de base para o

levantamento numérico das mutações somáticas, adquiridas por meio do tratamento em longo prazo

com NRTIs, a partir da segunda etapa (Tabela 01).

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TABELA 01: Resultados do seqüenciamento direto de 25 pacientes portadores de HIV-1. Análise comparativa dos pacientes virgens de tratamento e com o tratamento para o levantamento númerico das mutações somáticas adquiridas a longo prazo com o uso de NRTIs. Os pacientes virgens de tratamento estão representados com a terminalização “1” (_ _ _.1), enquanto os pacientes em tratamento estão representados com a terminalização “2” (_ _ _.2), e os pacientes oriundos do CTA/COAS estão representados pela letra “C”.

M

utaç

ão

1602

9 16

051

1608

6

1608

7

1609

3 16

110

1612

6 16

129

1617

2 16

173

1618

2.1

1618

2.2

1618

3.1

1618

3.2

1618

4 16

187

1618

9 16

209

1621

3 16

217

1622

3

1623

4

1624

1

1624

8.1

1625

5 16

256

1626

0 16

274

1627

8

1628

4 16

287

1629

0 16

291

1629

2 16

294

1629

8 16

311

1631

2

1632

5 16

327

1634

2 16

355

1636

2 16

367.

1

1639

0

1639

1.1

1639

9

1642

2

Bases G A T A T C T G T C A A A A C C T T G T C C A G C C G C A C C C C C T T A T C T C T G A T

P 001.1 . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . C . A/T Het C T . . . . . . . .

A 001.2 . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . C . . C T . . . . . . . . C 002.1 . . . . . . . . . T . . . - - . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I 002.2 . . . . . . . . . T . . . - - . . . C . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E 003.1 . G . . . . . . . . . . . . T . . . . . T . . . . . . . . . T . . . . C C . C T . . . . . . . . N 003.2 . G . . . . . . . . . . . . T . . . . . T . . . . . . . . . T . . . . C C . C T . . . . . . . .

T 004.1 . . . . . . . . . . . . - C Ins . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

E 005.1 . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . .

S 006.1 . . C A/T Het . . . . . . . . . . . T C . . . T C/G

Het G . . . . . T . . . T . T . . . . . . . . . . . . .

008.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . T . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . A . . . 009.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . T . . . . . . . C . . . . . . . A . . . 010.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . T . . . . . . . . . . . C . . . A . G . 011.1 . . . . . . . A . . . . - C

Ins . . . . . . T . . . . . . . T . . . . . T . . . . . . . . . . . . .

012.1 . . . . . . . . . T - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 013.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 014.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 015.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 017.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G

Ins . .

018.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . 020.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . T . . C

Ins A . . . T G . . . . . . . . . . . T C . A . . C

020.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . T . . C Ins A . . . T G . . . . . . . . . . . T C . A . . C

C1 . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . T . . . . . T . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . C2 A . . . . . . C . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . C3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . T . . . . . . . . . . . . C . . . C . . . . . C4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . G . . . . A . . . . . . . C . . C T . . . G

Ins . . . .

C6 . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . C . . . . . C7 . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . A . . . . . T . . C . . . . . . . . . . . C8 . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . . A . . . . . T . . C . . . . . . . . . . .

A comparação da análise de seqüenciamento por indivíduo, entre a primeira e a

segunda etapa de investigação, teve como resultado:

Paciente 001 – No seqüenciamento direto foi observado cinco mutações na primeira

etapa. Com três meses de tratamento as mesmas mutações estavam presentes, não sendo possível a

detecção de novas mutações, como conseqüência do uso do medicamento. Essas mutações foram:

16126 T◊ C, 16223 C◊ T, 16298 T◊ C, 16325 T◊ C e 16327 C◊ T; provavelmente mutações

herdadas, uma vez que representam uma linhagem específica dentro do grupo indígena (Haplogrupo

C). Adicionalmente, observou-se no ponto 16312 uma mutação de ponto do tipo heteroplasmia

(Figura 02), que estava presente durante a primeira etapa e ausente na segunda (Figura 03).

Figura 02: Seqüenciamento antes do tratamento. A mutação de ponto do tipo heteroplasmia

16312 (A/T).

Figura 03: Seqüenciamento com 3 meses de tratamento. Observa-se claramente a ausência da

base Timina, no ponto16312, ou seja não se verifica a heteroplasmia nesse ponto.

Paciente 002 – No seqüenciamento direto foi observado cinco mutações na primeira

etapa. Com três meses de tratamento as mesmas mutações estavam presentes, não sendo possível a

detecção de novas mutações, como conseqüência do uso do medicamento. Essas mutações foram:

16173 C◊ T, 16183.1 e 16183.2 deleção de A, 16209 T◊ C e 16217 T◊ C; provavelmente

mutações herdadas, uma vez que apresentam pontos de linhagens específicas dentro do grupo

indígena (Haplogrupo B).

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Paciente 003 – No sequenciamento direto foi observado oito mutações na primeira

etapa. Com três meses de tratamento as mutações estavam presentes, não sendo detectado nenhuma

nova mutação como conseqüência do uso do medicamento. Essas mutações foram: 16051 A◊ G,

16184 C◊ T, 16223 C◊ T, 16287 C◊ T, 16298 T◊ C, 16311T◊ C, 16325 T◊ C e 16327 C◊ T;

provavelmente pertencentes ao haplogrupo C de povos indígenas.

Paciente 020 – No seqüenciamento direto foi observado nove mutações na primeira

etapa. Com nove meses de tratamento as mesmas mutações se repitiram. Essas mutações foram:

16213 G◊ A, 16223 C◊ T, 16235 G◊ A, 16278 C◊ T, 16284 A◊ G, 16355 C◊ T, 16362 T◊ C,

16390 G◊ A e 16422 T◊ C. Chama-nos atenção neste paciente a presença, nas duas etapas

analisadas, de uma mutação do tipo inserção (evento raro) no ponto 16248.1 (Figura 04 e 05).

Figura 04: Sequenciamento antes do tratamento. A mutação no ponto 16248 do tipo inserção

(Ins C).

Figura 05: Seqüenciamento com 9 meses de tratamento. A mutação no ponto 16248 do tipo

inserção (Ins C).

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5.2. ANÁLISE DOS ASPECTOS CLÍNICOS

Em relação aos quadros clínicos dos pacientes após doze meses de tratamento,

observaram-se quadros clínicos típicos relacionados ao tratamento com NRTIs, tais como: náuseas,

vômitos, diarréias, cefaléias, tonturas, dores abdominais e vertingens. Em alguns casos, constatou-

se que alguns pacientes obtiveram inclusive ganho de peso (Tabela 02).

Tabela 02: Aspectos clínicos apresentados pelos pacientes antes do tratamento e após o início do

tratamento. Em alguns casos não obtivemos dados referentes aos sintomas observados nos pacientes

naquele determinado estágio da investigação.

Pacientes Alterações clínicas antes do tratamento

Alterações clínicas durante a pesquisa

001 asma, sífilis. cefaléia, astenia, náuseas, amenorréia por 2 meses, dores cintura escapular

002 astenia monilíase, tonturas, mal estar geral, queda de cabelo, anorexia, insônia

003 hérnia distal, astenia ---------

004 Dermatite seborréia exofagite de refluxo, gastrite crônica, dengue, palpitações.

008 --------- ---------

009 ITU de repetição, perda de peso, perda visual ---------

010 Toxoplasmose cerebral, S. diarréica ganho de peso

011 --------- H. Zoster, S. diarréica com colúria e febre

012 S. Fournier ganho de peso

013 D.M., HAS, hipercolesterolemia, Anemia ---------

016 --------- Icterícia, Ganho de Peso

020 Diarréia para Isospora, dor abdominal, furunculose Condiloma, Furunculos

021 Monilíase oral Gastrite, Epigastrologia, Aftas

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6. DISCUSSÃO

Nossos resultados demonstraram que o tratamento com a terapia anti-retroviral, que

variou de 5 a 9 meses, não ocasionaram o aparecimento de mutações somáticas na molécula de

DNA mitocondrial. Apesar do tempo limitado de tratamento, nossos resultados não confirmam as

sugestões propostas por Lewis et al., 2003 e Dagan et al., 2002 em relação aos sintomas de toxidade

induzidos pelo uso prolongado do fármaco e sua manifestações clínicas, relacionados a defeitos

genéticos do mtDNA.

Independentemente do tempo curto de tratamento dos pacientes, em 2005

McComsey et al. investigando o genoma mitocondrial de 87 indivíduos infectados com HIV, entre

tratados e não-tratados com NRTIs, por um intervalo de tempo de 14 a 52 meses; não observaram o

aparecimento de sintomas clínicos relacionados a toxidade mitocondrial. Após a análise completa

do genoma mitocondrial, somente em dois indivíduos tratados com esses fármacos mostraram

desenvolvimento de mutações durante o período de estudo. Os autores sugerem estudos mais

extensivos do genoma mitocondrial para correlacionar as disfunções deste genoma com os defeitos

moleculares pelo uso dos NRTIs.

Na população de Belém, nossa população controle (não infectada pelo vírus)

Marinho et al, em 2003, descreve ao comparar as mutações da região controle do DNA

mitocondrial em uma amostra de indivíduos jovens e idosos da população de Belém-PA, a presença

em três das 31 mulheres idosas investigadas (9,7% do total) de mutações somáticas, quando

comparadas suas seqüências com as de seus descendentes. Realizando um paralelo com o nosso

estudo, a investigação de mutações revela uma instabilidade genômica mitocondrial, medida pelo

seqüenciamento direto dos pacientes, em oito dos 25 pacientes seqüenciados, apresentaram uma

freqüência de 26,7%, ou seja, quase três vezes o valor observado na população controle do presente

estudo de Marinho et al, 2003.

Durante a análise laboratorial no que se refere ao seqüenciamento da região

controladora da molécula de mtDNA, tivemos uma grande dificuldade para seqüenciar as amostras

dos pacientes que se encontravam em tratamento com NRTIs, principalmente àqueles com mais de

7 meses de tratamento. O seqüenciamento apresentava irregularidades na identificação das bases

nucléicas, nos levando a uma reavaliação desde o processo inicial. Apesar de não podermos avaliar

neste momento a razão pelo ocorrido, levantamos duas hipóteses para explicar o fato: a) O tempo

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prolongado de utilização do fármaco pode está relacionado com a dificuldade de amplificação; ou

alternativamente b) A presença de níveis elevados do vírus pode está ocasionando este descontrole.

Independente da alternativa adotada, sabemos que o mecanismo de ação de ambas hipóteses

envolve a disputa pelo controle da transcrição, quer seja pela competição para incorporação, com

ácidos nucléicos endógenos; quer seja pela prematura terminação do enlogamento da cadeia. Sabe-

se que a transcriptase reversa do HIV, assim como, DNA polimerase dependente de RNA, são

particularmente sensíveis aos efeitos de NRTIs (Lewis,2003).

Na análise do seqüenciamento referente as duas etapas de investigação, ou seja, antes

do tratamento e após o início da terapia, observamos que 26,7% das amostras apresentaram em suas

seqüências, da alça-D do mtDNA, mutações do tipo heteroplasmia e inserções, que podem ser

resultantes de stress oxidativo gerado, possivelmente, por anormalidades na atividade enzimática na

fosforilação oxidativa (OXPHOS), que levaram ao acúmulo de mudanças no mtDNA (Gerschenson

and Poirier, 2000; Gerschenson et al., 2000). A ocorrência destas mutações é agravada pela

ausência de enzimas de reparo desse material genético, na presença elevada de radicais livres de

oxigênio e na total falta de proteínas (histonas), que normalmente protegeriam o mtDNA. Assim,

sugerimos que a instabilidade genômica no mtDNA pode está intimamente envolvida com a

presença do vírus HIV-1, uma vez que a heteroplasmia foi observada, na sua grande maioria, em

indivíduos ainda sem o tratamento com inibidores de nucleosídeo de transcriptase reversa.

Estudos realizados demonstraram que a DNA polimerase ã (pol ã) está diretamente

l igada no processo de toxicidade mitocondrial, uma vez que a pol ã é a polimerase exclusiva dentro

da mitocôndria que é responsável pela replicação e conserto da molécula de mtDNA. Essa

polimerase é altamente sensível a inibição através de NRTIs como zidovudina, estavudina e

lamivudina (Lim and Copeland, 2001). A toxidade NRTI-mitocondrial é causado por inúmeros

mecanismos: (1) inibição direta de pol atividade de ã sem incorporação; (2) terminação da

replicação da molécula de DNA por incorporação destes análogos terminalizadores; (3) alteração da

fidelidade de síntese de DNA de pol ã; (4) a persistência destes análogos em mtDNA devido ao

corte ineficiente; ou (5) uma combinação de quaisquer destes efeitos (Bienstock e Copeland, 2004;

Lewis et al., 2003). Dessa forma, a dificuldade no sequeciamento também pode está relacionada

com a inibição da ação da polimerase ã na replicação e reparo da molécula de mtDNA, ocasionando

problemas na leitura do cromatograma durante o seqüenciamento.

14

A análise dos aspectos clínicos demonstrou que os sinais apresentados pelos

pacientes após doze meses de tratamento com NRTIs são resultados de efeitos secundários pelo uso

prolongado desses fármacos, e não manifestações clínicas decorrentes de defeitos geneticamente

herdados do DNA mitocondrial.

8. CONCLUSÃO:

Neste trabalho investigamos o genoma mitocondrial (mtDNA) de pacientes

infectados pelo HIV, em tratamento com NRTIs, assim como, de portadores do vírus sem

tratamento, em relação à modulação da resposta à terapia anti-retroviral e das anti-patologias

oportunistas. Da mesma forma que conflitamos estes resultados com os já investigados por outro

membro do LGHM (Marinho, 2003), em relação a população de Belém (população controle sem o

vírus).

Durante o intervalo de tempo compreendido de nove meses a partir do início do

tratamento, não se observou o aparecimento de mutações na molécula de DNA mitocondrial, sendo

necessário uma investigação que considere uma exposição com estes fármacos, com um intervalo

de tempo maior para que os medicamentos possam ou não ocasionar o aparecimento de efeitos

colaterais adversos (toxicidade) no mtDNA.

Nossos resultados sugerem ainda, que a instabilidade genômica no mtDNA pode está

intimamente envolvida com a presença do vírus HIV-1, ao invés do tratamento em si, ou de ambos

os fatores.

15

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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18

10. DIFICULDADES

O presente trabalho apresentou como dificuldades a obtenção das amostras dos pacientes em

tratamento e por conseqüência, a recoleta dos mesmos. Muitos mudavam de endereço (contato), ou

não voltavam a dar continuidade do presente tratamento. Desta forma, foi necessário redimensionar

o tamanho da amostra para 30 indivíduos.

11. PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das

atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.

O referido aluno tem demonstrado grande aplicação no desenvolvimento do presente

trabalho. È um aluno exemplar, dedicado e assíduo em todas as atividades estabelecidas no presente

projeto. Sua perseverança e disponibilidade para o desenvolvimento deste trabalho foi exemplar. As

conclusões ou sugestões propostas no presente estudo podem servir de parâmetro para uma melhor

conduta médica, apesar de entender que devam ser realizadas outras investigações. Este trabalho

será em breve enviado para publicação em revista científica relacionada com a área.

DATA : 25/agosto/2005

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

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ASSINATURA DO ALUNO