relatório de química aplicada (1).docx

ESCOLA SECUNDÁRIA DO MONTE DE CAPARICA CPTAL – NÍVEL 4

ANO LETIVO 2012/2013

QUÍMICA APLICADAMÓDULO 8

Identificação do Aluno:Carina Silva 12ºG

Escola Secundária do Monte de CaparicaCPTAL - nível 4

Ano letivo 2012/2013

Índice

Objetivos................................................................................................................................................3

Fundamento teórico...............................................................................................................................3

Materiais................................................................................................................................................5

Reagentes...............................................................................................................................................5

Procedimento experimental...................................................................................................................6

Registo de resultados.............................................................................................................................7

Tratamento de resultados......................................................................................................................8

Discussão/Conclusão..............................................................................................................................9

Bibliografia...........................................................................................................................................11

Webgrafia …………………………………………………………………………………..……………………………………………………11

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Objetivos

Efetuar a contagem das colónias e de bactérias cultiváveis. Compreender a necessidade de se efetuarem procedimentos específicos como diluições

decimais. Preparar meios de cultura. Utilizar técnica de sementeira à superfície e por incorporação.

Fundamento teórico

A cultura de bactérias em laboratório é a técnica de base de muitos estudos de bacteriologia. As exigências de crescimento são, contudo, muito variáveis. As bactérias aeróbicas podem ser quantificadas por sementeira a superfície ou incorporadas em meios sólidos.

Sementeira à superfície - operação que consiste em distribuir uniformemente o inóculo em meio de cultura apropriado.

Incorporadas – a amostra diluída é pipetada diretamente sobre a placa de Petri e só depois é adicionado o meio de cultura apropriado.

O solo contém uma grande variedade de microrganismos, incluindo bactérias, fungos, protozoários, algas e vírus. Apesar desta diversidade, os microrganismos cultiváveis predominante entre a microflora do solo são fungos e bactérias heterotróficas do domínio Bacteria.

É contudo de ter em consideração que a flora microbiana presente numa amostra de solo particular depende de várias características do solo (por exemplo, humidade, pH, temperatura, conteúdo em oxigénio gasoso, composição em material orgânico e inorgânico) e que, alguns destes parâmetros ambientais podem variar, por exemplo, ao longo do ano ou em função do tipo de utilização que é dada ao solo (p. ex. tipo de cultura agrícola, pastoreio, etc.).

Estima-se que somente 1 a 9% das células viáveis de microrganismos presentes no solo são capazes de formar colónias em meios de cultura laboratoriais, como é o caso dos meios PDA a usar neste

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Ano letivo 2012/2013trabalho laboratorial.

Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo correspondem principalmente a células viáveis mas não cultiváveis.

Os microbiologistas têm chegado a esta conclusão, com base, por exemplo, na comparação, relativamente a uma mesma amostra de solo, entre o número de células que formam colónias em meios de cultura laboratoriais, e o número total de células observáveis com o microscópio de fluorescência após a coloração das células presentes nessa amostra com compostos fluorescentes (como, por exemplo, o “acridine orange” que cora todas as células e permite distinguir células viáveis e células mortas).

Esta situação resulta, frequentemente, dos microrganismos estarem sujeitos a formas variadas de stresse e nos seus ambientes naturais (p. ex. devido a limitação de nutrientes, seca, extremos de temperatura ou pH, presença de compostos tóxicos), o que pode levar a que as suas células vegetativas percam a capacidade de se multiplicar apesar de terem sinais vitais de atividade fisiológica.

Para tal, proceder-se-á ao isolamento e contagem, a partir de uma amostra de solo, de colonias de isolados pertencentes ao grupo das bactérias heterotróficas e dos fungos.

Recorrer-se-á a diluições sucessivas de uma suspensão em água da amostra de solo, e espalhamento de um volume conhecido (0,1 mL) das suspensões diluídas em meios de cultura agarizados com composição apropriada: meio PDA (Potato Dextrose Agar) para fungos filamentosos que é um meio não-seletivo, para o isolamento de bactérias heterotróficas diversas.

Os meios de cultura sólidos são preparados a partir da adição, ao meio liquido correspondente, de um agente solidificante (o agar – com uma concentração de cerca de 1,5-2% p/v), antes da esterilização do meio.

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Materiais

Placas de Petri (esterilizadas) Tubos de vidro rolhados (esterilizados) Frasco Schott com água destilada (esterilizada) Pipeta graduada de 1 mL, 10 mL, (esterilizadas) Contador de colónias Erlenmeyers 150 mL Vareta de vidro em L Vareta de vidro Vidro de relógio Lamparina Autoclave Fósforos Balança analítica Proveta graduada 50 mL

NOTA: Todos os materiais devem ser previamente esterilizados na autoclave. Ter cuidado de agitar vigorosamente a suspensão obtida após cada diluição, antes de

proceder à diluição seguinte. Após a passagem da vareta pela chama para queimar o álcool, não esquecer de a deixar

arrefecer convenientemente antes de a utilizar para espalhar a suspensão celular na superfície do meio sólido.

Reagentes

Amostra de solo Meio de cultura PDA Solução salina 0,9% (p/v) em NaCl Álcool etílico Água destilada

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Procedimento experimental

1. “Pesar” 1 grama de amostra de solo.2. Junto à chama do bico de Busen, transferir 1 grama da amostra de solo para o frasco

contendo 100 mL de água destilada esterilizada.3. Agitar vigorosamente a suspensão de solo preparada no passo anterior, de modo a obter

uma suspensão homogénea da amostra de solo e a facilitar a suspensão na água da maior parte das células dos microrganismos adsorvidas nas partículas de solo.

4. Junto à chama do bico de Busen, transferir 1 mL da suspensão para tubos de ensaio contendo 9 mL de água destilada esterilizada, de modo a diluir a suspensão de 10-1 (1:10). Faça diluições sucessivas até 10-4 (1:10000).

A. Sementeira à superfície

1. Proceder ao espalhamento das suspensões diluídas, sobre o meio sólido adequado contido em placas de Petri. Para tal, junto à chama bico de Busen, transferir 0,1 ml da suspensão original e de cada uma das suspensões diluídas, para a superfície de meio PDA (até diluição 10-3) contidos em placas de Petri convenientemente identificadas.

2. Espalhar as suspensões diluídas sobre o meio sólido com uma vareta de vidro em forma de “L” (esterilizada) por imersão de álcool etílico e passada pela chama do bico de Busen.

3. Incubar as placas à temperatura ambiente – 3 a 5 dias. 4. Conte as colónias isoladas em cada placa. Com base nessa contagem, faça estimativas do

número de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de cada um dos dois grupos de microrganismos presentes muna grama de solo.

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B. Sementeira por incorporação: Se o meio de cultura do frasco de Shott estiver sólido, colocá-lo em banho-maria a 100 ºC para fundir o meio.

1. Com uma pipeta esterilizada retirar 2 mL de diluição 10-3 e colocar 1 mL em cada uma das caixas de Petri.

2. Com a mesma pipeta proceder de modo idêntico para diluição de 10-2, 10-1 e solução-mãe.3. Retirar o frasco, confirmar que o meio está fundido e deixar arrefecer até 45ºC (o agar

solidifica a 44ºC). Pode manter-se no banho a 50ºC.4. Verter nas caixas cerca de 15-20 mL (2 mm de espessura) de meio de cultura. O meio não

deve estar muito quente para que ao arrefecer não acumule água na tampa.5. Agitar rodando as caixas para que as bactérias fiquem bem incorporadas e

uniformemente distribuídas com o meio de cultura.6. Deixar solidificar o meio e incubar as placas em posição invertida a 36ºC durante 3 dias.7. Contar as colónias (UFC’s/mL)8. Para calcular a abundância de bactérias lêem-se as caixas que apresentam de 30 a 300

colónias. Faz-se a média das colónias das duas caixas e aplica-se a seguinte fórmula:

Registo de resultados

Sementeira à superfície

Caixas de Petri Concentração Nº de fungos Nº de bactérias

1 10-2 17 1452 10-2 8 221

3 10-2 19 ----

Média UFC de fungos = 17+8+19

3 = 14,7

Média UFC de bactérias = 145+221

2 = 183

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Nº de bactérias = valor da média × valor da diluição



Sementeira por incorporação

Não registado qualquer valor de UFC nas placas de Petri relativas à sementeira por incorporação visto que não foram contadas as colónias isoladas em cada placa de Petri.

Tratamento de resultados

Sementeira à superfície

UFC de Fungos UFC de Bactérias

Fator de diluição 10-2

14,7 Colónias

14,7 UFC --- 1 mL suspensão 10-2

14,7 x 102 UFC / mL suspensão

2g solo ---- 100 mL (102)

14,7 x 102 x 102 UFC = 1,47 x 105 UFC/2g solo

2g solo ---- 1,47 x 105 UFC1g solo ----- x

x = 7,35 x 104 UFC fungos/g solo

Fator de diluição 10-2

183 Colónias

183 UFC --- 1 mL suspensão 10-2

183 X 10-2 UFC/mL suspensão

2g solo ---- 100 mL (102)

183 x 102 x 102 = 1,83 x 106 UFC/2g solo

2g solo ----- 1,83 x 106 UFC1g solo ----- y

y = 9,15 x 105 UFC bactérias/g solo

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Discussão/Conclusão

Nesta atividade experimental todos os passos do procedimento foram realizados em condições de assepsia (implica a ausência de microrganismos), nomeadamente junto à chama do Bico de Bunsen mas uma vez que não tínhamos bicos de bunsen tivemos que utilizar uma lamparina de álcool.

Antes de iniciarmos a atividade experimental tivemos que esterilizar todo o material a ser utilizado nomeadamente as pipetas graduadas entre outros na estufa – esterilização por calor seco, visto que para transferir as suspensões diluições, meios e soluções estéreis devem utilizar-se pipetas graduadas ou pipetas de Pasteur estéreis para não contaminar o meio.

Além disso tivemos que esterilizar os meios de cultura utilizando o calor húmido sob pressão na autoclave - esterilização pelo calor (autoclavagem), durante aproximadamente 15 minutos durante de modo a assegurar a morte de todos os microrganismos.

Os erlenmeyers (que continham o meio de cultura) a esterilizar foram tapados com rolhas de algodão.

Na preparação da amostra de solo a ser analisada após juntarmos 100 mL de água destilada a 1 g de solo tivemos que agitar vigorosamente a suspensão de solo preparada de modo a obter uma suspensão homogénea da amostra de solo e a facilitar a suspensão na água da maior parte das células dos microrganismos adsorvidas nas partículas de solo.

De seguida, fizemos diluições sucessivas até 10-4 (1:10000) o que permitem-nos obter, em placas com PDA, colónias perfeitamente isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor.

Após preparadas as suspensões diluídas tivemos que espalhar essas mesmas suspensões sobre o meio sólido (PDA) com uma vareta de vidro em forma de “L” previamente esterilizada por imersão de álcool etílico e passada pela chama da lamparina de álcool. Após passagem da vareta pela chama para queimar o álcool, devemos deixar arrefecer convenientemente antes de se utilizar para espalhar a suspensão na superfície do meio sólido – esterilização por calor seco.

Terminado o espalhamento das suspensões diluídas pelo meio sólido PDA deixamos incubar as placas à temperatura ambiente durante 1 semana.

Na sementeira por incorporação tivemos que agitar lentamente as caixas de Petri para que as bactérias fiquem bem incorporadas e uniformemente distribuídas com o meio de cultura.

De seguida, tivemos que incubar as placas em posição invertida a 36ºC durante 1 semana.

Passada 1 semana fomos ver as placas de Petri e fizemos a contagem de UFC fungos e UFC bactérias existentes. Relativamente à qualificação de UFC das placas de Petri da sementeira à superfície escolhemos as de fator de diluição 10-2.

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Escolhemos as placas com o fator de diluição 10-2 visto que é fundamental que o número de colónias desenvolvidas nas placas não seja demasiado grande porque algumas células poderão não formar colónias e a contagem não será correta. O número de UFC também não deve ser demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatístico da contagem. Devemos escolher as placas que tenham de 30 a 300 colónias.

Não efetuámos a contagem de UFC nas placas da sementeira por incorporação.

Depois de contadas as UFC de fungos e UFC de bactérias e feitas as médias realizamos os respetivos cálculos para sabermos o número de UFC de bactérias e UFC de fungos existentes por grama de solo.

Conclui que existia 7,35 x 104 UFC fungos/g solo e 9,15 x 105 UFC bactérias/g solo na placa de Petri utilizada com o fator de diluição 10-2.

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Ano letivo 2012/2013Bibliografia

Apontamentos fornecidos pelo professor Fernando Ferreira

Webgrafia

http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=276 (visto a 25 de Novembro de 2012) http://www.infopedia.pt/$assepsia (visto a 04 de Dezembro de 2012) http://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/2241/1/U1.pdf (visto a 04 de

Dezembro de 2012) http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=276&ordem=2 (visto a 04 de Dezembro de 2012) http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=365 (visto a 04 de Dezembro de 2012)

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