QUÍMICA ANALÍTICA AVANÇADA – 1S 2017

MÓDULO 2

Estatística Aplicada à Química Analítica

- Conceitos básicos

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

Prof. Rafael Arromba de Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br

Estatística Aplicada à Química Analítica

Aula anterior:

Conceitos e definições básicos

Não existe um valor absoluto para um resultado analítico

Forma correta de expressar os resultados

Definição de exatidão e precisão

Importância de rejeitar resultados anômalos

Exercícios:

Exerc. 1 Algarismos significativos

Exerc. 2 Precisão e rejeição de resultados 3

Estatística Aplicada à Química Analítica

Aula anterior:

Conceitos e definições básicos

Não existe um valor absoluto para um resultado analítico

Forma correta de expressar os resultados

Definição de exatidão e precisão

Importância de rejeitar resultados anômalos

Nessa aula:

- Conceitos básicos (continuação)

- Noções de Quimiometria (?)

3

RELAÇÃO ENTRE EXATIDÃO E PRECISÃO

A Exatidão e a Precisão se relacionam de 3 formas principais:

Método de análise

C B A

preciso e exato ! preciso mas inexato impreciso e inexato

Conc. do analito valor verdadeiro

EXEMPLOS PRÁTICOS ?? 4

Algumas formalidades... TERMINOLOGIAS

Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. Guidelines on Analytical Terminology (CAC/GL72 – 2009)

1) Boa precisão = Boa repetibilidade ≠ reprodutibilidade

5

6

TERMINOLOGIAS

2) Precisão intermediária

(Semelhante ao apresentado na Rev. 05 – Ago 2016)

1. Definição do problema analítico 2. Escolha do método de análise 3. Amostragem 4. Tratamento da amostra (e separação da espécie de interesse) 5. Calibração 6. Medida analítica RESULTADO (MÉDIA ± INCERTEZA)

7. Avaliação dos resultados : RESULTADO OBTIDO x RESULTADO ESPERADO

8. Ação

A ESTATÍSTICA NA ANÁLISE QUÍMICA

Comparação de Resultados:

7

Comparação Precisões (Teste F) Médias (Teste t de Student)

Teste F (ou Teste de Snedecor)

F = SA

2

SB2

SE Fcalculado Ftabelado para a confiabilidade desejada

Existe diferença significativa entre os conjuntos de dados

SE Fcalculado < Fcrítico para a confiabilidade desejada

Não existe diferença significativa entre os conjuntos de dados em termos de precisão…

Comparar precisões (ou variâncias)

de duas médias (A e B)

“A” refere-se à média com o maior desvio

8

Ex: Valores críticos para F ao nível de 5%*

* A tabela indica as probabilidades dos valores serem diferentes (confiabilidade de 95% para não haver diferença significativa entre os resultados)

3 4 5 6 12 20 Numer. 3 9,28 9,12 9,01 8,94 8,74 8,64 4 6,59 6,39 6,26 6,16 5,91 5,80 5 5,41 5,19 5,05 4,95 4,68 4,56 6 4,76 4,53 4,39 4,28 4,00 3,87 12 3,49 3,26 3,11 3,00 2,69 2,54 20 3,10 2,87 2,71 2,60 2,28 2,12 Denom.

Graus lib.

9

Tabelas para os valores críticos de F

EXERCÍCIO Exercício 3- Comente sobre a diferença na precisão obtida nos laboratórios A e B para a determinação de Mg em uma mesma amostra de leite considerando um nível de confiança de 95%. Dados: Lab. A : 34,97; 34,85; 34,94 e 34,88 mg L-1 e Lab. B : 35,02; 34,96; 34,99; 35,07 e 34,85 mg L-1

(Precisões semelhantes, comparáveis) 10

MAS para avaliar os parâmetros precisão e exatidão: entender que erros afetam esses

parâmetros ?

TIPOS ERROS: - SISTEMÁTICOS (rastreáveis e pode ser evitados) - ALEATÓRIOS (sempre presentes... )

11

Erros de Método : surgem do comportamento químico ou físico não ideal de sistemas analíticos Erros Pessoais : resultam da falta de cuidado, falta de atenção ou limitações pessoais do analista Erros Instrumentais: causados pelo comportamento não ideal de um instrumento, por calibrações falhas ou pelo uso de condições inadequadas

1) Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados)

afetam a exatidão

12

Como detectar um erro sistemático?

• Materiais de Referência Certificados (CRM) • Método de adição e recuperação de analito (“spike”) • Métodos comparativos • Testes interlaboratoriais

Erros Sistemáticos ou Determinados (Podem ser conhecidos e rastreados)

13

CRM - Adquirir de empresas especializadas (NIST*)

• Amostras com certificado de análise (resultado ± incertza)

Substâncias comumente encontradas em amostras:

AMBIENTAIS – CLÍNICAS – BIOLÓGICAS – FORENSES

(*) National Institute and Technology

Erros Sistemáticos ou Determinados

14

Exercício 4-

PESQUISAR PARA A PRÓXIMA AULA - Se existem CRMs disponíveis comercialmente para as suas matrizes de estudo (ou interesse)

Erros Sistemáticos ou Determinados

15

afetam a precisão

Variam de acordo com uma distribuição normal

Medidas flutuam aleatoriamente

ao redor da média

2) Erros Indeterminados (aleatórios ou randômicos)

Não podem ser localizados…

16

Ex de uma Distribuição Normal (Calibração de uma pipeta)

50

9.969 9.971

9.981 9.983

9.993 9.995

9.987 9989

9.975 9.977

% d

as m

edid

as

30

10

Curva de Gauss (Perfil da distribuição)

OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

volume (mL)

Histograma mostrando a distribuição de 50 medidas do volume escoado por uma pipeta de 10,00 mL

17

Característica de uma Distribuição Normal

Os resultados são alterados ora para menos, ora para mais, por erros que parecem se dar ao acaso (aleatórios), que é um

comportamento esperado e, por isso, “normal”

Karl F. Gauss

18

Y = 1

2 exp -

1 2

(Xi - )2

2

Probabilidade de ocorrência de um resultado (Y)

Distribuição Normal de Gauss

µ corresponde a média da população (situação de várias medidas)

OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp)

Assim, pode-se calcular uma faixa para um resultado R supondo que os desvios observados seguem uma distribuição normal

19

Distribuição Normal e a Estatística Clássica

Para a estatística clássica os desvios da normalidade não afetam os resultados do ponto de vista estatístico (métodos robustos) e esta ideia é apresentada no “Teorema do Limite Central”:

20

“Se a flutuação total numa certa variável aleatória for o resultado da soma das flutuações de muitas variáveis independentes e de

importância mais ou menos igual, a sua distribuição tenderá para a normalidade, não importa qual seja a natureza das distribuições das

variáveis individuais”

W S Gossett (1868 – 1937): Desenvolveu a distribuição de Student para analisar resultados do teor de álcool em cerveja

0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

+ _

+1 +2 -2 -1

= x z

N

Fre

quên

cia

rela

tiva

Limites de confiança para a media de um resultado

Níveis de

Confiança para Z %

50 0,67

68 1,00

80 1,28

90 1,64

95 1,96

95,4 2,00

99 2,58

99,7 3,00

99,9 3,29 Distribuição Normal de Gauss

OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 21

= x t S

N

Limites de confiança da média quando não se tem µ

= x z

N

Graus de liberdade 95% 99%

1 12,71 63,66

2 4,30 9,93

3 3,18 5,84

4 2,78 4,60

5 2,57 4,03

6 2,45 3,71

7 2,36 3,50

8 2,31 3,36

9 2,26 3,25

10 2,23 3,17

. . .

. . .

1,96 2,58

OBS: Transparência preparada a partir de material do Prof Célio Pasquini (IQ-Unicamp) 22

Exemplo 4 (aplicação do conceito na expressão de um resultado): Um indivíduo fez quatro determinações de ferro em uma liga metálica, encontrando um valor médio de 31,40% m/m e uma estimativa do desvio padrão de 0,11% m/m. Qual o intervalo em que deve estar a média da população, com um grau de confiança de 95%? µ = ? µ = 31,40 ± (3,18 x 0,11) / 4 µ = 31,40 ± 0,17 C Fe = (31,23 – 31,57)% m/m

= x t S

N

23

24

Comparação de médias

Situação 1

Resultado ± incerteza

Valor de referência

Situação 2

Resultado ± incerteza

Valor de referência ± incerteza

Exemplo de aplicação – SITUAÇÃO 1 (Exp. de amostragem)

Ex: Comparação da distribuição de cores de confeitos M&M com a especificação do fabricante

Com base na amostragem e análise (contagem) dos analistas

diferentes

média (X) e estimativa do desvio (S) para cada cor Média do fabricante (µ)

Calcula-se t com a confiança desejada e compara-se com o valor tabelado:

Se o t calc < t tab não existe diferença significativa entre as médias 25

- x

S N t =

Outro modo de usar o Limite de confiança da média pra esse mesmo tipo de comparação

Comparação de uma média com um valor de referência quando não se tem o desvio do valor de referência

= x t S

N 26

IC para o resultado “R”

Valor referência Ex de situação em que o resultado

obtido concorda com o

valor de referência

ν t tabelado = N-1

PARA A SITUÃO 2: Se as precisões forem comparáveis, compararam-se as médias:

Teste t, de Student

(n1-1) S12 + (n2 -1) S2

2

n1 + n2 - 2 Sp=

SE tcalculado < tcrítico para o nível de confiança desejado: não existe diferença significativa entre as médias e as

diferenças observadas se devem a erros aleatórios

n é o número das medidas para cada média Sp corresponde a S “agrupado”

x1 - x2

Sp

t = n1 + n2

n1 . n2

27

ν t tabelado = n1+n2-2

MAS se as precisões não forem comparáveis:

(n1-1) S12 + (n2 -1) S2

2

n1 + n2 - 2 Sp=

x1 - x2

Sp

t = n1 + n2

n1 . n2

28

ν t tabelado = n1+n2-2

ν t tabelado: FÓRMULAS ESPECÍFICAS (Pesquisar...)

n1 = n2

n1 ≠ n2

Graus de liberdade 95% 99%

1 12,71 63,66

2 4,30 9,93

3 3,18 5,84

4 2,78 4,60

5 2,57 4,03

6 2,45 3,71

7 2,37 3,50

8 2,31 3,36

9 2,26 3,25

10 2,23 3,17

. . .

. . .

1,96 2,58

Valores críticos para t nos níveis de 95 e 99% (P= 0,025 e P= 0,005)

Testes estatísticos são válidos quando os erros envolvidos são aleatórios Mais confiáveis serão os testes quanto maior o ν (graus de liberdade)

29

Outras formas de utilizar o teste-t

Comparação de dados em pares (teste-t pareado)

d Sd N

t =

30

Amostras diferentes (do mesmo tipo ou de lotes diferentes) analisadas por métodos diferentes ou analistas diferentes

Procedimento: 1) Organizar os dados em pares 2) Calcular o “desvio padrão” entre as diferenças das médias (dos pares) 3) Calcular o valor de t:

ν t tabelado = N-1

ν= número de graus de liberdade

EXERCÍCIO

Exercício 5-

No seu trabalho de pós-graduação você fará comparação de resultados? Em caso afirmativo, qual teste será usado? Por quê?

31

32

Testes estatísticos para comparação de resultados

- Precisão - Exatidão

Testes de hipóteses - Hipótese nula (H0)

H0: µ = µ0 (µ0 é o valor verdadeiro ou de referência) - Hipótese alternativa (Ha)

Ha: µ ≠ µ0

33

Alguns Exemplos de Propagação de “Erros”

Leva-se em consideração as incertezas de cada etapa do processo

Para erros indeterminados (situação mais usual)

Para um resultado “R”:

34

R = A + B – C (soma e sub.) SR =

SA2 + SB

2 + SC2

R = AB

C

SR

R =

SA

A

2 SB

B

2 SC

C

2

+ +

(multiplicação e divisão)

Propagação de Erros Para “casa”

Exerc. 6: Considerando que o S de uma balança seja de 0,0001 g, calcule a estimativa do desvio-padrão de uma pesagem feita nesta balança.

(SR= 0,0001g)

35

CASO DE MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE O TRATAMENTO ESTATÍSTICO INCLUE TAMBÉM: Regressão linear Curva de calibração (ou analítica) Tipos: - univariada (“convencional”) - multivariada (métodos quimiométricos) Estimativa dos Limites de detecção e quantificação

Cálculos baseados na Estimativa do desvio padrão do branco para prever a detectabilidade do instrumento e método

36

REGRESSÃO LINEAR

É a reta que melhor representa a relação entre a propriedade medida (Abs, p. ex) e a concentração dos

padrões

Concentração (mg L-1) 0 1

Ab

sorb

ân

cia

Padrões

Branco

Abs= 48,3x + 0,24 r= 0,9987

- O coeficiente de correlação (r) varia entre -1 e +1 - Quanto mais próximo da “unidade”, melhor é a correlação

37

REGRESSÃO LINEAR Uma Curva analítica linear nem sempre é possível e uma Regressão não-linear pode ser usada desde que apresente “boa correlação” As Regressões lineares são as mais usuais e podem ser obtidas por meio de softwares, que usam o “Método dos mínimos quadrados”:

n= no de pontos (x1;y1) da calibração

Para y= ax + b, com coef. correlação “r”:

a = ______________ n Σxiyi – ΣxiΣyi

n Σxi2 – (Σxi)

2 b = y - x

r = _______________________________ n Σxiyi – ΣxiΣyi

{ [nΣxi2 – (Σxi

2)] [nΣyi2 – (Σyi )

2] } 1/2 38

REGRESSÃO LINEAR O “Método dos mínimos quadrados” minimiza os “resíduos” (erros) que a reta de regressão gera para cada um dos pontos

Nos pontos centrais de uma curva de calibração os resíduos são sempre menores

Implicações ...

39

REGRESSÃO LINEAR

“Para casa”:

Vide ex. 4.9 e 4.10 do “Vogel – Análise Química Quantitativa”, 6ª Ed: Para determinar quitina por fluorescência molecular utilizou-se padrões de quitina nas seguintes concentrações: 0,10; 0,20; 0,30 e 0,40 µg mL-1 e que resultaram nos seguintes valores de emissão, respectivamente: 5,20; 9,90; 15,30 e 19,10, Cps sendo que o branco gerou leitura de 0,00 Cps. Considerando-se que um coeficiente de correlação linear superior a 0,99 é satisfatório, calcule a concentração de quitina de uma amostra cujo sinal analítico foi de 16,10 Cps.

(r= 0,9987 e C quitina = 0,32 µg mL-1)

40

REGRESSÃO LINEAR

Para se obter uma “boa calibração” é preciso que:

a) Os únicos erros nas medidas sejam devidos a flutuações na variável dependente “y”

b) Os pontos tenham comportamento homocedástico (erros aleatórios com média zero e variância constante) Testes: Cochran (Q) ou Levene Regressão “normal” ou ponderada c) Garantir que os erros não sejam correlacionados Preparar todos os padrões do mesmo jeito e realizar as medidas experimentais de forma aleatória d) Os erros sigam uma distribuição normal Teste de Shapiro Wilk e) O modelo obtido não apresente falta de ajuste (ANOVA)

41

REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Sendo a Regressão linear uma reta “média” pode-se calcular a incerteza dos seus coeficientes angulares e lineares As incertezas desses coeficientes podem ser usadas para avaliar a própria regressão bem como outros parâmetros

Avaliação do efeito matriz no desenvolvimento de um método analítico * (comparação dos coef. angulares, “a”):

0 2 4 6 8 10

-0.002

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

0.020

AI

Concentração de Pb (ug/L)

Curva de adição de padrão

Curva analítica em meio ácido a

meio alcalino

a

meio ácido

1,60 10-3 ± 0,05 10 -3 1,78 10-3 ± 0,03 10-3

Comparação para um nível de 95% de confiança para saber se a calibração

poderia ser feita em meio ácido !

( y= ax + b )

42 (*) R.A.de Sousa et al. / Talanta 104 (2013) 90–96

REGRESSÃO LINEAR E EFEITO MATRIZ Cálculo das incertezas de a e b :

S y/x = [ Σ(yi – y )2 / (n-2) ] 1/2 ^

Obtido usando a própria equação de regressão

S a = ______________ S y/x

[ Σ(xi – x )2 ]1/2

S b = S y/x [ Σxi2 / nΣ(xi- x )

2 ]1/2

Uma observação cuidadosa dos valores de yi - y mostram que o erro da regressão é menor nas vizinhanças do centro da curva de calibração !

^

43

REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ)

Representam a DETECTABILIDADE DO MÉTODO

“LEMBRAR”: LOD instrumental é diferente do LOD método

Exemplo Para quantificar 0,02 mg.kg-1 Pb em uma amostra de peixe por GF AAS o LOQ deve ser consideravelmente menor que 0,02 mg.kg-1 Pb

Análise elementar = Amostra é digerida Na solução final a amostra fica diluída (10x p. ex) C Pb sol. amostra= 0,02 mg kg-1 / 10 = 0,002 mg kg-1

LOQ instrumental ≤ 0,002 mg.kg-1 Pb e não 0,02 mg kg-1 44

REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO Estimativa dos LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) e LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ)

Definições Limite de detecção: É a menor concentração ou massa de analito que pode ser detectado com uma certa confiança Depende da magnitude do sinal analítico em relação à flutuação do branco: 3 Sbranco

LOD= m m= inclinação curva analítica

45

REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO

CÁLCULO do LIMITE DE DETECÇÃO (LOD)

CONSIDERAÇÃO: LOD concentração correspondente ao Menor sinal detectável Menor sinal detectável = Sinal branco + 3 S branco Para que se tenha 99% de confiança SE Curva analítica: (1) Y= m X + b b= Sinal branco Na concentração limite Y = Menor sinal detectável (2) X = LOD Substituindo (2) em (1): Sinalbranco + 3 Sbranco = m LOD + Sinalbranco 3 Sbranco = LOD m

46

REGRESSÃO LINEAR E OS PARÂMETROS DE MÉRITO O LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) No nível do LOD a medida é significativamente afetada pelo ruído instrumental (baixa precisão)

As medidas quantitativas devem ser feitas num nível superior ao LOD, geralmente:

PODE ser determinado experimentalmente (em função da precisão) ou considerado igual ao primeiro ponto da curva analítica

10 Sbranco

LOQ= m

47

48

Sabemos calcular (estimar) ? Dúvidas ? Comentários ? OBS: Existem outras formas de calcular os valores

de LOD e LOQ, dependendo da técnica e objetivo do método/análise

Outros Usos da Estatística no Laboratório ...

Métodos quimiométricos para planejamento e otimização de experimentos, análise multivariada de dados e calibração multivariada “A quimiometria pode ser definida como sendo a aplicação de métodos matemáticos e estatísticos no planejamento ou na otimização de procedimentos e na obtenção de informações químicas através da análise de resultados relevantes”

49

50

Recomendação Literatura básica para estudos iniciais

Bruns, RE; Faigle, FG. “Quimiometria”, Quím. Nova, 8 (1985) 84 Gemperline, PJ. Practical Guide to Chemometrics (2nd Ed), CRC Press Taylor and Francis, New York (2006)

1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Conhecer como os diferentes parâmetros experimentais afetam o resultado do experimento (ou análise).

51 Tpyr Tat tpyr Mod

Seleção das condições instrumentais para determinar Se por GF AAS em adoçantes dietéticos

Alguns exemplos:

1- Planejamento fatorial e otimização multivariada - Estabelecer condições experimentais (instrumentais) otimizadas

52

Seleção das condições instrumentais para análise de leite por ICP OES

Sousa, RA; Silva, JCJ; Teófilo, RF; Cadore, S.; Baccan, N.

“Study of Instrumental Parameters for the Analysis of Milk by

ICP OES Employing Factorial Design”,

Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, 2004.

-1,2

-0,72

-0,24

0,24

0,72

1,2

1,2

0,96

0,72

0,480,24

0

-0,24-0,48

-0,72-0,96

-1,2

0

2

4

6

8

10

12

14

16M

g II / M

g I

N

P

y= 6.74 + 1.89 P – 4.34 N – 0.59 A – 0.69 PN – 0.34 PA + 0.34 NA

2- Análise multivariada de resultados

Um exemplo na área de Química analítica:

ACP ACN

Ca (mg L-1) 178 - 232 107 – 237

Mg 87 - 129 50 – 88

Mn 1,8 – 2,8 1,0 – 4,8

Fe 0,08 – 0,18 0,04 – 0,18

Zn 0,20 – 0,36 não detectado

Cu 0,09 – 0,19 não detectado

Dados experimentais obtidos para as diferentes amostras:

53

2- Análise multivariada de resultados

Considerando as variações para cada parâmetro (analito), busca-se as possíveis similaridades entre as amostras

UTILIZAR: Recursos para Análise exploratória, como PCA

Gráfico de scores: Amostras num espaço multidimensional

PCA: Análise de Componentes Principais 54

Na PCA realizada compara-se o Gráfico de scores com o de loadings para se entender as “separações” encontradas

Verificação de correlações entre dados

55

3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos, medicamentos, fluidos biológicos, ... - Utiliza-se um único método analítico para detectar e quantificar vários parâmetros em uma mesma análise

56

3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos

57

TABLE I: Correlation Coefficient Values for Both Calibration and Validation Models Obtained via PLSR 1 for All Inorganic Elements

Element

Correlation Coefficient

Element

Correlation Coefficient

Calibration Validation Calibration Validation

Ca 0.99992 0.84705 K 0.99751 0.99558

P 0.98802 0.96488 Mg 0.96973 0.90379

Na 0.99367 0.98957 Cl 0.99982 0.99275

3- Calibração multivariada para análise de solos, alimentos e medicamentos

58

TABLE II: Correlation Coefficient Values for Calibration and Validation

Models Obtained via PLSR 1 for the Organic Compounds

Compounds

Correlation Coefficient

Calibration Validation

Glucose 0.99165 0.94337

Urea 0.99925 0.95103

Creatinine 0.99093 0.96018

59

Outros exemplos importantes podem ser encontrados na literatura Trata-se de um área em constante desenvolvimento

OBS: Várias ferramentas além destas exemplificadas podem ser usadas com finalidades

analíticas (desenvolvimento do método, avaliação de resultados e na própria calibração)

Estudem quimiometria !!

BIBLIOGRAFIA

1) D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Stanley R. Crouch Fundamentos de Química Analítica, 8a Ed., CENGAGE Learning, 2009 2) J. Mendham, R. C. Denney, J. D. Barnes, M. Thomas Vogel - Análise Química Quantitativa, 6a ed., LTC, 2002 3) D. C. Harris, Análise Química Quantitativa, 7a ed., LTC, 2008 4) B. B. Neto, I. E. Scarminio, R. E. Bruns, Como Fazer Experimentos, Editora da Unicamp, 2001 5) J. N. Miller, J. C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th Ed, Pearson Education Limited, 2005

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